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ES2350430B1 - Conjugado polimerico para el tratamiento de infecciones bacterianas - Google Patents

Conjugado polimerico para el tratamiento de infecciones bacterianas Download PDF

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ES2350430B1
ES2350430B1 ES200930218A ES200930218A ES2350430B1 ES 2350430 B1 ES2350430 B1 ES 2350430B1 ES 200930218 A ES200930218 A ES 200930218A ES 200930218 A ES200930218 A ES 200930218A ES 2350430 B1 ES2350430 B1 ES 2350430B1
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Enrique Pérez Payá
Maria Jesus Vicent Docon
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Fundacion de la Comunidad Valenciana Centro de Investigacion Principe Felipe
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Abstract

La presente invención se refiere a un conjugado polimérico amfifílico que comprende la fórmula general I, a la síntesis del mismo y al uso como medicamento para el tratamiento de infecciones bacterianas.

Description

Conjugado polimérico para el tratamiento de infecciones bacterianas.
Campo de la invención
La presente invención se encuadra en general dentro del campo de la química médicay en particular se encuadra dentro del campo de los polímeros terapéuticos.
Antecedentes de la invención
Las endotoxinasolipopolisacáridos(LPS)son constituyentesdela membranaexternade bacteriasGramnegativas. Cuando se liberan como resultado de la división celular o el tratamiento con antibióticos, los LPS son reconocidos como patrones moleculares asociadosa patógenos(PAMP)por receptorestipo toll (TLR; siendoel TLR4 específico para LPS) (Poltorak, A. et al. Science 282, 2085-2088 (1998). Poltorak, A., Ricciardi-Castagnoli,P., Citterio, S.& Beutler,B. Proc Natl AcadSciUSA97,2163-2167. (2000)). Estos receptores retransmitenla señaldelosLPSa los núcleosde células inmunes innatas, dando como resultado su activaciónyla secreción subsiguientede citoquinas proinflamatorias. La presencia continua de LPS en la corriente sanguínea de los mamíferos induce la desregulación de citoquinas, dando lugar al choque séptico (Heine, H., Rietschel, E.T.&Ulmer, A.J. Mol Biotechnol 19, 279-296. (2001)), la causa principal de mortalidad en pacientes sépticos.
La sepsis es la décima causa principal de muerte en general, así como la causa más importante de muerte en las unidadesde cuidados intensivos (Minino, A.M., Heron, M.P., Murphy, S.L.&Kochanek, K.D. NatlVital StatRep55, 1-119 (2007)).Apesardela incidenciadela sepsis, solo seha aprobado como tratamiento un agente,la drotrecogina alfa (Xigris®), (Vincent, J.L. Expert Opin Biol Ther. 7, 1763-1777. (2007)).
Recientemente, las investigaciones en este campo se han centrado en terapias extracorpóreas contra endotoxinas dirigidas a reducir los niveles en circulación de LPS (Burns, M.R. et al.JMed Chem 50, 877-888 (2007); Cruz, D.N. et al. Crit Care11,R47 (2007); Nguyen,T.B. et al.BioorgMedChem15, 5694-5709(2007)ySil,D. et al. Antimicrob Agents Chemother 51, 2811 -2819 (2007)).
La polimixina B, es un péptido que neutraliza LPS pero es demasiado tóxico para el uso sistémico, se ha desarrollado como un dispositivo médico de purificación de sangre basado en diálisis en el que se inmoviliza en fibras de poliestireno (PMX-F); estedispositivo ha sido utilizado desde 1994por el programa de seguro sanitario nacional japonés (Shoji, H. Ther Apher Dial 7, 108-114 (2003)).
En investigaciones previas,los autores identificaron una molécula pequeña neutralizante de LPS, el peptoide7 (PTD7) (Mora,P. et al.JMed Chem 48, 1265-1268. (2005)) (Fig. 1). Sin embargo, el PTD7 tiene una escasa solubilidad en aguay una toxicidad no específica,de tal forma que su uso como terapia quedalimitado.
Existe pues una necesidad apremiante de desarrollar medicamentos efectivos contra las endotoxinas útiles en el tratamientoyprevencióndelas infecciones bacterianasycontrala sépsis.
Descripción de la invención
La presenteinvenciónse refiereaun conjugado polimérico amfifílicoque neutralizaypromuevela eliminación sistémicade endotoxinas,siendo útil enel tratamientode infecciones bacterianasy evitandola sépsis.
Así pues, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a conjugado polimérico amfifílico que comprende la fórmula general I:
PTD7-(L1)n-(L2)m-(PEG)-(L2)m-(L1)n-PTD7
donde:
L1 es una secuencia peptídicade entre unoa cinco aminoácidos cuyos aminoácidos son igualeso diferentesy son seleccionadosde entreelgrupo formadoporGly,Val,Leu,Ile,Phe,Arg,Lys,Asp,Glu,preferentementeesGly
n = 1-5
L2 es ácido láctico
m = 0-1
PTD7 comprendela siguientefórmula generalII
En un aspecto más en particular, el conjugado polimérico de la presente invención comprende la fórmula general III, donde L1 es Gly, n = 2, L2 es ácido láctico, m = 0.
En otro aspecto en particular, el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula generalIV, dondeL1esGly,n =2,L2es ácido lácticoy m=1.
En otro aspecto particularla presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de la presente invención para su uso como medicamento. En un aspecto más en particular el medicamento comprende el conjugado polimérico descrito en la fórmula general I, en un aspecto más en particular, el medicamento comprende el conjugado polimérico descrito en la fórmula general III. En otro aspecto en particular, el medicamento comprende el conjugado polimérico descrito en la fórmula general IV.
En otro aspecto en particular, la presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de la presente invención para uso en diálisis intracorpórea. En un aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula general I. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula general IV.
En la presente invención se entiende por diálisis intracorpórea la eliminación del torrente sanguíneo de contaminantes o toxinas que puedan desencadenar cuadros de enfermedad tales como infecciones graves e incluso inducir shock séptico. Los nanoconjugados descritos actúan como “scavengers”.
Estoes posible debidoalafarmacocinética asociadaalos conjugados polímero-fármaco comolos conjugadosde PEG descritos en la presenta invención. Estos nanoconjugados son administrados de forma intravenosa, distribuidos porel torrente sangíneoyeliminadosde forma renal (Duncan,R. Nat.Rev. Cáncer6, 688-701 (2006);Webster,R. et al Drug Metabol. Disp. 35, 9-16 (2007)) una vez han ejercido su actividad, en este caso la interacción con la endotoxina LPS.
En un aspecto más en particular la presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de la presente invención para el tratamiento de infecciones bacterianas, en otro aspecto más en particular la presente invención se refiere al conjugado polimérico de la presente invención para el tratamiento de las infecciones bacterianas producidas por endotoxinas de bacterias Gram negativas, en particular se refiere a las infecciones producidas por endotoxinas bacterianasde naturalezalipídica,másenparticulara infeccionesproducidasporLPS.Enunaspectomásenparticular el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula generalI. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugadopolimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula general
IV.
En otro aspecto más en particular, la presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de la presente invención para el tratamiento de la sepsis bacteriana. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula general I. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula generalIV.
En la presente invención se entiende por sepsis al síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) provocado por una infección causada por la presencia de microorganismos en sangre o por la presencia de sus toxinas.
Enunsegundo aspecto,la presenteinvenciónse refierea una composiciónfarmacéuticaque comprendeel conjugado polimérico amfifílico de la presente invención. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula general I. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de la presente invención comprende la fórmula generalIV.
Enun tercer aspecto,la presenteinvenciónse refiereaun procedimientoparala síntesisdeunconjugado polimérico amfifílico de la presente invención, que comprende las siguientes reacciones:
a) Incorporar mediante síntesis enfase sólidadeal menos dos aminoácidosal PTD7 unidoa una resina para darlugaral compuesto PTD7-(L1)n, dondelos aminoácidos(L1) son igualeso diferentesy sonseleccionadosde entreel grupoformadoporGly,Val,Leu,Ile,Phe,Arg,Asp,Glu.
b) Eliminar la resina unida al compuesto obtenido en el paso anterior.
c) Conjugación del compuesto obtenido en b) con PEG funcionalizado con -COOH.
En otro aspectoen particular,enel procedimientodela presenteinvención entrela etapaa)yla etapab)hay otra etapa que comprende la incorporación de un ácido láctico al compuesto PTD7-2G para dar lugar al compuesto PTD72GLact.
Descripción de las figuras
La figura1muestrala estructura químicaycaracterísticasde los nanoconjugados sintetizadosa partirde Peptoide 7(PTD7).a: PTD7,b: PEG-2G-PTD7,c: PEG-Lact2G-PTD7,d: PGA-4G-PTD7ye: PGA-Lact4G-PTD7.
Lafigura2muestrala síntesisdelosconjugadosPEG-PTD7.a:petoidil-resina,b: PTD7-2GLact,c:PTD7-2G,d: PEG-COOH, e: conjugados PEG-PTD7.
La figura 3 muestra el perfil de liberación de PTD7 a partir de conjugados PEG-PTD7 tras la incubación con catepsinaBy en condiciones hidrolíticas.
La figura4muestrala liberación del PTD7 del conjugado en plasma despuésde1y24hde incubacióna 37ºC.
La figura5muestrael análisisde dispersión dinámicadeluz(DLS)delos nanoconjugadosa: PEG-2G-PTD7yb: PEG-Lact2G-PTD7 en presencia o ausencia de LPS.
La figura6muestra los ensayosde viabilidad celular con MTT.
La figura7muestrala inhibiciónde TNF-α inducida por LPS.
Lafigura8muestralos efectosdelos nanoconjugados PEG-2G-PTD7yPEG-Lact2G-PTD7enlasupervivenciay en losnivelesde citoquinasinducidas por LPS en un modelo murinode sepsis.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un nanoconjugado polimérico amfifílico que supera las desventajas de toxicidad e insolubilidaddel PTD7 de tal forma que se proporciona un medicamento útil en el tratamientoyprevención de las infecciones bacterianasy contrala sépsis.
Ejemplo1
Síntesis de nanoconjugados
El conector polímero-fármaco fue clavepara controlar la cinética de liberación del fármaco de los nanoconjugados. Las moléculas de carga pueden conjugarse a través de conectores de amida hidrolíticamente estables o a través de conectores de éster hidrolíticamente lábiles. Los autores sintetizaron cuatro conjugados de polímero-PTD7 (Fig.1), dos basados en poli-(ácidoL-glutámico) (PGA) (resultados no mostrados): PGA-4G-PTD7 (PTD7 unidoa travésde enlacesde amidaal polímero)y PGA-Lact4G-PTD7 (PTD7 unidoa travésde un enlace éster), que enmascaran la actividadde PTD7 hastala liberación intracelular lisosomotrópica;ydos basadosen Polietilenglicol (PEG): PEG-2GPTD7yPEG-Lact2G-PTD7, que permitenla actividadde PTD7 prolongada enla corriente sanguínea.
En primer lugar se realizó la síntesis de derivados de PTD7, (Fig. 2) para ello se usó la síntesis de péptidos en fase sólidaconFmocse incorporarondosycuatro residuosdeglicina(G)enlapeptoidil 7-resina preensamblada(una resinadepoliestireno funcionalizadaconpeptoide7(PTD7)(f =0,71mmol/g).ParaLact-derivados,seintrodujoácido L-láctico en la última etapa usando las mismas condiciones. El derivado de PTD7 se segmentó de la resina mediante tratamientoconácido trifluoroacético(TFA,95%)ysepurificómedianteunaRP-HPLCpreparativa(Lichrospher®100 C18,250x10mm) usandoun gradientede acetonitriloenTFAacuosoal0,1%(de30a90%de acetonitriloen25min). La identidadyla pureza (90-95%)se confirmaron mediante HPLCyespectrometríade masasde desorción/ionización lasérica asistida por matriz-tiempo de vuelo que dieron los siguientes resultados:
PTD7-2G: 1HNMR: (CDCl3, 300MHz) δ 7.80 (1H, -NH-), 7.09-7.27 (m, 20H, Ar), 6.87 (d, J=9 Hz, 2H), 6.70 (d, J=9 Hz, 2H), 4.19-3.93 (m, 6H, COCH2N), 3.99 (m, 1H, CHPh2(Nt)), 3.93 (m, 1H, CHPh2(Ct)), 3.82-3.66 (m, 4H, COCH2N(2G)), 3.59 (s, 3H,OCH3), 3.48 (m, 2H,NCH2CH2), 3.42-3.33 (m, 2H,NCH2CH2CH), 2.82 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.56 (m, 2H,NCH2CH2), 2.33 (m, 2H, CH2CHPh2 (Nt)), 1.94 (m, 2H, CH2CHPh2 (Ct)). 13C NMR: (CDCl3, 300MHz) δ 169.1, 158.7, 143.4, 143.3, 130.1, 129.7, 128.9, 128.5, 127.6, 127.5, 126.9, 126.8, 126.4, 114.3, 55.12, 51.2, 51.2, 48.2, 47.4, 42.4, 34.2, 33.5. MALDI-TOF MS:m/z 825,4 [M].
PTD7-2GLact: 1H NMR: (CDCl3, 300 MHz) δ 7.80 (2H, -NH-), 7.09-7.27 (m, 20H, Ar), 6.87 (d, J=9 Hz, 2H),
6.70(d,J=9Hz,2H), 4.19-3.93(m,6H,COCH2N),3.99(m,1H, CHPh2(Nt)),3.93(m,1H, CHPh2(Ct)),3.88(m,1H, CH3-CH-OH), 3.82-3.66 (m, 4H, COCH2N(2G)), 3.59 (s, 3H,OCH3), 3.48 (m, 2H,NCH2CH2), 3.42-3.33 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.82(m,2H,NCH2CH2CH), 2.56(m,2H,NCH2CH2), 2.33(m,2H, CH2CHPh2(Nt)), 1.94(m,2H, CH2CHPh2 (Ct)), 1.30 (dd, 3H, CHCH3). 13CNMR: (CDCl3, 300 MHz) δ 171.4, 169.1, 158.7, 143.4, 143.3, 130.1, 129.7, 128.9, 128.5, 127.6, 127.5, 126.9, 126.8, 126.4, 114.3, 68.2, 55.2, 51.2, 51.2, 48.2, 47.4, 42.4, 34.2, 33.5, 20.2. MALDI-TOF MS:919,4[M+Na]+ .
A continuación se realizó la funcionalización con Polietilenglicol (PEG), para ello se preparó un compuesto de PEG bifuncional (Mw 4000 Da) que contenía grupos extremos carboxilo (PEG-COOH). En primer lugar, PEG-OH (320mg,0,08mmol)se destilóen tolueno,a continuación,se añadió una solución1Mde terc-butóxido potásicoen alcohol terc-butílicoyla mezclade reacciónse dejó reposar durante1h a 50ºCydurantela nochea 37ºC.La mezcla de reacciónen brutose filtróy se trató conTFAal45,4%/CH2Cl2al 54,5%/H2Oal0,1% durante3ha temperatura ambiente.El compuesto carboxilado esperadose precipitóen terc-butil-metil-éter fríoyse filtró. 1HNMR(δ, CDCl3): 10,9ppm(s,COOH)yFT-IR(u,cm−1): 1710 (s, COOH) confirmaban la presencia de la funcionalidad -COOH.
Posteriormente se realizó la síntesis del conjugado de PEG-2G-PTD7, para ello a una solución de PEG-COOH (65 mg, Mw 4000 Da) en DMF anhidra (4 ml) se añadió DIC (10 µl, 0,064 mmol)y, después de5min, HOBt (8,8 mg, 0,064 mmol)yla mezcla se agitó durante15 min.Acontinuación, se añadióel 2G-PTD7(26,8mg, 0,032 mmol, relación molar PEG/peptoide =2)y elpHse ajustó hasta8 con DIEA.Sedejóquela reacción avanzara durante 24h a temperatura ambiente.Laverificación mediante cromatografía encapafina(TLC,gelde sílice) mostrabala conversión completade PTD7-2G(Rf =0,4)en conjugadode polímero(Rf =0,CH2Cl2/MeOH = 90:10).Para detener la reacción,laDMFse retiróbajovacío;el residuosealmacenóa -20ºC hastala purificación,se redisolvióen agua,se
centrifugó para retirarla ureayel sobrenadante se purificóa travésde una columna G10. Las fracciones recogidasse liofilizarona continuaciónpara dar un polvo blanco (70%).El producto purificado se caracterizó mediante 1HNMR, cuyos resultados fueron los siguientes.
1HNMR:(CDCl3, 300 MHz) δ 7.92 (br, -NH-), 7.49 (br, -NH), 7.15-6.81 (m, Ar), 6.72 (m, Ar), 6.63 (m, Ar), 4.80 (m,2H,COCH2N), 4.60-4.03(2H,COCH2N),3.95-3.41(m,PEG+COCH2N+ CHPh2+COCH2N(2G)+OCH3+ NCH2CH2+NCH2CH2CH),2.99(m,2H,NCH2CH2CH),2.53(m,PEG, -CH2CO-+NCH2CH2+CH2CHPh2(Nt)),
1.94(ca,2H, CH2CHPh2(Ct)). 13CNMR:(CDCl3, 300 MHz) δ 169.8, 158.6, 144.6, 143.6, 143.4, 135.1, 130.1, 128.8, 128.6, 127.8, 126.9, 126.4, 114.3, 114.1, 75.5, 72.4, 72.2, 71.4, 70.0 (m), 62.0, 57.4, 55.47, 41.2, 38.2, 35.0, 33.8, 32.6, 31.2, 30.6, 29.7,28.1,26.6.
ParalasíntesisdelconjugadoPEG-Lact2G-PTD7,aunasoluciónde PEG-COOH(55mg,Mw4000Da)enDMF anhidra (4 ml) se añadió DIC (9 µl,0,055mmol)y,despuésde5 min,HOBt(7,4mg,0,055mmol)yla mezclase agitó durante15min.Acontinuación,seañadióel PTD7-2GLact(24,5mg,0,027mmol, relaciónmolar PEG/peptoide =2)yelpHseajustóhasta8 conDIEA.Sedejóquela reacciónavanzara durante24h atemperatura ambiente.La verificación por cromatografía en capa fina (TLC, gel de sílice) mostraba la conversión completa de PTD7-2GLact (Rf= 0,5)enconjugadodepolímero(Rf =0,CH2Cl2/MeOH=90:10).Lamezclade reacciónenbrutosetratóy se purificó según se describe anteriormente. Las fraccionesse liofilizarona continuación para dar un polvo blanco (60%). El producto purificado se caracterizó mediante 1HNMR, cuyos resultados fueron los siguientes:
1H NMR: (CDCl3, 300 MHz) δ 7.92 (br, -NH-), 7.49 (br, -NH), 7.15-6.81 (m, Ar), 6.72 (m, Ar), 6.63 (m, Ar),
5.29(m,2H,CH3-CH-O-), 4.80(m,2H,COCH2N), 4.60-4.03(ca,2H,COCH2N), 3.95-3.41(m,PEG+COCH2N+ CHPh2+COCH2N(2G)+OCH3+NCH2CH2+NCH2CH2CH),2.99(m,2H,NCH2CH2CH),2.53(m,PEG, -CH2CO
+NCH2CH2+CH2CHPh2(Nt)), 1.94(2H, CH2CHPh2(Ct)), 1.30(m,6H,CHCH3). 13C NMR: (CDCl3, 300 MHz) δ 174.4, 169.8, 158.6, 144.6, 143.6, 143.4, 135.1, 130.1, 128.8, 128.6, 127.8, 126.9, 126.4, 114.3, 114.1, 90.4, 83.8, 75.5, 72.4, 72.2, 71.4, 70.0 (m), 62.0, 57.4, 55.4, 41.2, 38.2, 35.0, 33.8, 32.6, 31.2, 30.6, 29.7, 28.1,26.6, 18.1, 15.3.
Ejemplo2
Evaluacióndela estabilidadyla biosensibilidaddelos nanoconjugadosen diferentes ambientes fisiológicos (plasma, condiciones hidrolíticasycondiciones lisosómicas)
Estabilidadde los conjugados enpresenciade catepsinaB
Se añadió catepsinaB(5U)a una soluciónde3mgde conjugado en1mlde un tampóndepH6 compuesto por acetato sódico20mM,EDTA2mMy DTT5mMy la mezclase incubóa 37ºC.Se tomaron alícuotas(150 µl) en tiemposde hasta72h, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquidoy se almacenaron congeladas en la oscuridad hasta que se ensayaban mediante HPLC (análisisde alícuotas de 100 µldespués del procedimiento de extracción) y/o SEC (análisis directo de alícuotas de 50 µl). En experimentos de control, los polímeros se incubaron en tampón solo (sin adiciónde catepsinaB) para determinarla segmentación hidrolítica no enzimática.
Estabilidad de los conjugados en condiciones hidrolíticas (diferentes valores de pH)
Losconjugados(3mg/ml)se incubarona37ºCen solución tamponadoradefosfato(PBS)apH5,5y7,4 durante72 horas. Se recogieron muestras de 100 µlen tiempos predeterminadosyse analizaron mediante RP-HPLC, usando una columna C18 LiChroSpher 100(5 µm),conel detectorUVa480nm.ComoeluyenteAse utilizóaguaycomoeluyente Bse utilizó acetonitrilo, conteniendo ambos TFAal 0,1%. La elución se realizó mediante el siguiente gradiente: de 25%deB a30%deBdurante10min,de30%deB a80%deBdurante5min,de80%deB a90%deBdurante5 minutosyde 90%deBa 25%deBdurante5min.El caudal fuede1ml/min.
Los resultados (Fig. 3) mostraron que los conjugados de PGA eran estables en tampones acuosos. Los dos nanoconjugados se degradaban en presencia de enzimas lisosómicas (catepsina B), permitiendo laliberación del fármaco de un modo dependiente del tiempo.
Estabilidad de los conjugados en plasma
Los conjugados(3 mg/ml) se incubaron durante1y24horasa 37ºC en plasmade ratón obtenido despuésdela centrifugaciónde sangrea 1500xgdurante10 minutosa 4ºC.Seextrajeron muestrasde 100 µlen tiempos predeterminadosy se añadieron 300 µlde acetonitrilo para precipitar las proteínas. Las muestras se centrifugarona15000xg yel sobrenadante se secó. El residuo se redisolvió con 100µlde acetonitriloyseanalizó medianteRP-HPLCsegún se ha descrito anteriormente.
Los resultados (Fig.4) mostraron que los nanoconjugados eran estables en plasmayquela liberaciónde PEGLact2G-PTD7fuemásrápidaqueladePEG-2G-PTD7,sinembargo,existíaalguna liberacióndePTD7desdePEG-Lact2G-PTD7 en plasma (40% de liberación de fármaco en 24 h).
Ejemplo3
Caracterización biofísica detallada de conjugados de polímero-PTD7
Estudios de NMR
Losexperimentos homonucleares incluían2D 1H, 1H NOESYyTOCSY con anchuras espectralesde8 kHz en ambas dimensiones, usando un esquemaWATERGATE para suprimir la señal de agua para elH2O. Los tiempos de mezcladura eran 400y80 ms para losexperimentosde NOESYyTOCSY, respectivamente.La espectroscopiade NMR ordenadapor difusión bidimensional (DOSY) (Barjat,H., Morris,G.A., Smart,S.,Swanson,A.G.,Williams,
S.C. R. J. Magn. Reson, Ser.B 108, 170-172 (1995)), se realizó con una ecosecuencia estimulada usando impulsos de gradiente bipolares(Brand,T.; Cabrita,E.J.;Berger,S.Prog. NMR Spectrosc. 46, 159-196 (2005))ycon un esquema WATERGATEpara suprimirla señaldel agua.Las longitudesdelos impulsosylos retrasosse mantuvieron constantes yse adquirieron16 espectrosde24exploracionescada uno conla fuerzadelgradientede difusiónvariando entre5%y 100%. Las longitudes del gradientede difusiónyel eco estimulado se optimizaron para cada muestra.Valores típicos eran δ =6-7 ms,Δ = 160-170 ms.El procesamientoyel análisisde los datos se realizaron conel protocolode DOSY incluido enel paquetede softwareTopspin.
Estudios de dispersión dinámica de luz (DLS)
Las medidas de DLS se realizaron a 25ºC usando un instrumento Malvern Zetasizer NanoZS, equipado con un láser de 532 nm con un ángulo de dispersión fijo de 90º. Se prepararon por duplicado soluciones micelares acuosas de LPS(E. Coli 0111:B4;1,2 mg/mlde soluciónde reserva)y cada polímero(1 mg/ml) usando agua destiladay una solucióndetampóndefosfato(PBS)0,1M apH7,4(Na2HPO4,KH2PO4,NaCl).Las soluciones micelaresse sometierona ultrasonidosdurante10mina4ºCyse filtraronatravésdeun filtrode membranade celulosade0,45 µm antes del análisis. No se observaban diferencias significativas en las diferentes soluciones. La distribución del tamaño de las micelas por volumen se midió (diámetro, nm) para cada polímero en ausencia o presencia de una concentración creciente de solución micelar de LPS (0,02-0,1 mg/ml) (n ≥ 3).
Los análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) mostraron que las micelas de LPS en de 0,2 a 0,1 mg/ml (muy por encima de la concentración micelar crítica, CMC (Santos, N.C., Silva, A.C., Castanho, M., Martins-Silva, J. & Saldanha,C. Chembiochem4,96-100(2003)) tenían un tamaño promediode6 nm (figura4: Fig. 1c), mientras que los conjugados de PEG-PTD7 producían micelas de diferentes tamaños, dependiendo del conector polímerofármaco(Fig.5).De forma interesante, cuando PEG-2G-PTD7yPEG-Lact2G-PTD7,que tienendiámetros micelares promediode12 nmy6nm, respectivamente, sevaloraban con concentraciones crecientesde LPS micelar,el tamaño promediodelas micelasse incrementabahasta20nm,Portanto,losconjugados PEG-PTD7producenla estabilización de complejos comicelares disminuyendo de este modo la toxicidad del LPS al evitar su interacción con receptores celulares específicosyfacilitando su eliminación del torrente sanguíneode forma renal, por tanto los nanoconjugados PEG-PTD7 sirven para la diálisis intracorpórea.
Ejemplo4
Viabilidad celular
Evaluación biológica de con ¡upados de PTD7 en cultivo celular
Se obtuvieron macrófagos de ratón (RAW264.7) deATCC (AmericanType Culture Collection, EE. UU. de A). Lascélulas sehicieron crecer en Mediode Eagle Modificadode Dulbecco (DMEM, Gibco BRI) complementado con suerobovinofetal(FBS-GibcoBRI)al10%yL-glutaminaal1%.Loscultivosse incubarona37ºCenuna atmósfera humidificadadeCO2al 5%-aireal95%.Se prepararonsubcultivosde macrófagoscada2-3días raspandolas células en medio reciente.
Ensayos de viabilidad celular con MTT
La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo del bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT). Células RAW264.7 se sembraron en placas de microvaloración de 96 pocillos estériles a una densidad de siembrade6 x104 células/mlen DMEM complementado conFBSal10%y sedejaron sedimentar durante24h. Diversasconcentracionesdelos compuestosse añadieronalas placasylas célulasse incubaron durante24h. Después de la retirada del medio, los cristales de formazano precipitados se disolvieron en DMSO de calidad óptica (100 µl)y las placas seleyerona 570 nm usando unaWallac 1420Workstation.
Losconjugadosde PGA-PTD7 eranalgo menos tóxicosqueelPTD7soloenun ensayo basadoenlíneas celulares de macrófagos RAW264.722: los valores de IC50 eran 10 µMequiv. de fármaco para PGA-4G-PTD7y2µMequiv. de fármaco para PTD7(resultados no mostrados). En contraste, ni PEG-2G-PTD7 ni PEG-Lact2G-PTD7 mostraban (Fig6) toxicidad celular hasta 30 µMequiv. de fármaco, más de 20 veces menos tóxicos que el fármaco libre original.
Evaluación de la expresión de TNF-α
Se sembraron células RAW 264.7 en placas de 96 pocillos a una densidad de 100.000 células/ml en DMEM complementado conSBFal1%yse dejaron sedimentar durante24h.Acontinuación,se añadióLPS(E. Coli 055:B5; 0,5 ng/ml) en ausenciao presenciade PTD7ylos conjugadosa diferentes concentraciones.
Despuésde24h,los sobrenadantesse recogieronyse centrifugaron durante10mina400xgyse almacenarona 20ºC hasta la determinacióndel contenido de citoquina. El contenido de TNF-α en el sobrenadante celular se determinó usandounkit ELISA comercial(BD Bioscience) siguiendoel protocolodelfabricante.Las muestrasse diluyeron10 vecescon tampón. Los cambiosde colora 450 nm se midieron usando un lectorde placasde microvaloración.Los nivelesde citoquinasseexpresaron como picogramospor mililitro.El intervalode deteccióndelkitde ELISA era01000 pg/ml.El contenidodeTNF-α de cada muestra se ensayó tres veces.
Los resultados mostraron quela presenciade PEG-2G-PTD7o PEG-Lact2G-PTD7disminuía casi cuantitativamente la producción de TNF-α inducida por LPS (Fig 7).
Ejemplo5
Estudios in vivo
Gruposde ratonesBALB-cde8-10 semanasde edad fueroninyectados intraperitonealmente (i.p.) con 500 µgde LPS(E. Coli 055:B5) en PBS solo o en combinación con PTD7 (60 µg), conjugados de PEG-PTD7 (60 µg, equiv. de fármaco)o 100 µgde polimixinaB(PMB).Se analizóuntotalde11 grupos.ElLPSseinyectóenellado izquierdode la cavidad peritoneal mientras que el PTD7 (disuelto en PEG200), los conjugados de PEG-PTD7 (en PBS) o la PMB seinyectaronenellado derechodelacavidad peritoneal.Seextrajo sangredelos animales90miny180mindespués delainyecciónde LPS desdelavena safena.Se llevóa cabo un análisisde supervivenciade Kaplan-Meier usandoel software GraphPad.
Se obtuvo suero de cada muestra recogida después de la centrifugación de sangre a 1500 x g durante 10 min a 4ºC.Losnivelesde citoquinas inducidosporLPSen suero seexaminaron alos90y180min despuésde tratamientos en diferentes diluciones (1:0, 1:10, 1:40) mediante un ensayo múltiple de citoquinas LINCOplex de ratón, incluyendo interferón-γ (IFN-γ), interleuquina-1β (IL-1β), interleuquina-6 (IL-6),factorde necrosis tumoral-α (TNFα), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-4 (IL-4),factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) e interleuquina-12(p70) (IL-12(p70)). El ensayo múltiple se llevó a cabo por duplicado en dos ocasiones diferentesde acuerdo con las especificacionesdelfabricante.Se generaron curvas estándar para cada citoquina usandolas concentracionesde citoquinasde referencia suministradasporelfabricante.Se analizaron datos aleatorios (intensidad de fluorescenciamedia) medianteel MasterPlexQuantification Software para obtenervaloresde concentración.Los datos de las gráficas se expresan en pg/ml como media ± E.E.M.(n ≥ 3).
Para el análisis estadísticoin vivo de citoquinas se usó el ANOVAbidirecccional para consignar la significación estadística. Se usó análisis retrospectivo de Bonferroni-Holm para corregir con respecto a múltiples comparaciones. En todos los casos, se consideraba quep < 0,05 representaba la significación estadística.
Los resultados mostraron que los niveles en plasma de IL-2, IL-4, IL-12 (p70)yGM-CSF no se incrementaban significativamente en respuesta a LPS. Las concentraciones de TNF-α eran las más altas 90 min después de la estimu-laciónconLPS,yPTD7yPMB reducíanlosnivelesenplasmadeesta citoquinamás eficazmenteque PEG-2G-PTD7 yPEG-Lact2G-PTD7 (probablemente debidoalafarmacocinética;Fig.8).Sinembargo,losnivelesdeIL-1β, IL-6 e IFN-γ eran superiores180mindespuésdelainyección,yPEG-2G-PTD7yPEG-Lact2G-PTD7 reducíansignificativamente los niveles en plasma de IL-1β,IL-6e IFN-γ. Estas tres citoquinas proinflamatorias median en muchas de las características inmunopatológicasdelchoqueinducidoporLPS (Cohén, J. Nature420, 885-891 (2002)). Sus actividades biológicas se solapanyestán notablemente incrementadas en pacientes que desarrollan choque séptico letal(Sil,
D. et al. Antimicrob Agents Chemother 51, 2811-2819 (2007); Hack, C.E. et al. Blood 74, 1704-1710 (1989); Netea,
M.G. et al. EurJImmunol 31, 2529-2538 (2001);Yan, J.J. et al. Nat Med 10, 161-167 (2004)). Los datos demuestran una supervivencia mejoradade ratones estimuladosconLPS tratados conPEG-2G-PTD7yPEG-Lact2G-PTD7que se debió, al menos en parte, a niveles en plasma significativamente reducidos de citoquinas proinflamatorias.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Conjugado polimérico amfifílico que comprende la fórmula general I: PTD7-(L1)n-(L2)m-(PEG)-(L2)m-(L1)n-PTD7
    donde
    L1 es una secuencia peptídicade1a5aminoácidos donde dichos aminoácidos son seleccionadosde entreGly,
    Val, Leu, Ile, Phe,Arg,Lys,Asp, Glu.
    n = 1-5
    L2 es ácido láctico
    m = 0-1
    PTD7 comprende la siguiente fórmula general II
  2. 2. Conjugado polimérico amfifílico según la reivindicación 1, caracterizado porque L1 es Gly n =2 L2 es ácido láctico m =0
  3. 3.Conjugadopolimérico amfifílicosegúnlareivindicación1,dondeelconjugadopoliméricocomprendelafórmula general IV. L1 es Gly n =2
    L2 es ácido láctico m =1
  4. 4.
    Conjugado polimétrico amfifílico según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso como medicamento.
  5. 5.
    Conjugado polimérico amfifílico según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en diálisis intracorpórea.
  6. 6.Conjugado polimérico amfifílico según cualquieradela reivindicaciones1-3 paraeltratamientode infecciones bacterianas.
  7. 7.Conjugado polimérico amfifílicosegúnlareivindicación6dondela infecciónbacterianaes producidaporendotoxinas de bacterias Gram negativas.
  8. 8.Conjugado polimérico amfifílico segúnla reivindicación7donde las endotoxinas bacterianas sonde naturaleza lipídica.
  9. 9. Conjugado polimérico amfifílico segúnla reivindicación8dondela endotoxina bacteriana es LPS.
  10. 10.Conjugadopolimérico amfifílicosegún cualquieradelasreivindicaciones1-3parael tratamientodelasepsis bacteriana.
  11. 11.
    Composiciónfarmacéutica que comprende un conjugado polimérico amfifílico según cualquierade las reivindicaciones 1-3.
  12. 12.
    Procedimientoparala síntesisdeunconjugado polimérico amfifílicosegúnlareivindicación1que comprende las siguientes reacciones:
    a) Incorporar mediante síntesis enfase sólidadeal menos1aminoácidoal PTD7 unidoa una resina para dar lugaral compuesto PTD7-(L1)n, dondeL1 es una secuencia peptídicade1a5aminoácidos dondedichos aminoácidos son seleccionadosde entreGly,Val, Leu, Ile, Phe,Arg, Asp, Glu
    b) Eliminar la resina unida al compuesto obtenido en el paso anterior
    c) Conjugación del compuesto obtenido en b) con PEG funcionalizado con -COOH
  13. 13. Procedimientosegúnlareivindicación12 donde entrela etapaa)yla etapab) comprendela incorporaciónde un ácido láctico al compuesto PTD7-2G para dar lugar al compuesto PTD7-2GLact.
    10 11 12 13 14 15 16 17 18
    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS N.º solicitud: 200930218 ESPAÑA
    Fecha de presentación de la solicitud: 28.05.2009
    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
    Fecha de prioridad: 00-00-0000 00-00-0000 00-00-0000
    51 Int. Cl. :
    Ver hoja Adicional
    DOCUMENTOS RELEVANTES
    Categoría
    56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas
    A
    I. M. PUIG MORA et al., &quot;Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins&quot;, J. Med. Chem., 2005, vol. 48, nº 4, páginas 1265-1268. 1-13
    A
    M. HIRATA et al., &quot;Endotoxin-binding synthetic peptides with endotoxin-neutralizing, antibacterial and anticoagulant activities&quot;, Prog. Clin. Biol. Res., 1994, vol. 388, páginas 147-159. 1-13
    A
    CN 101148470 A (FAMING ZHUANLI SHEQ. GONG. SHUOM.) 26.03.2008 (resumen), Chemical Abstracts [en línea] [recuperado el 17.08.2010]. Recuperado de: STN International, Columbus, Ohio (EE.UU.), Nº de acceso: 2008:398338. 1-13
    A
    US 20040049011 A1 (P. R. ABRAHAM et al.) 11.03.2004, todo el documento. 1-13
    A
    US 5371186 A1 (M. PORRO) 06.12.1994, todo el documento. 1-13
    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:
    Fecha de realización del informe 16.09.2010
    Examinador E. Dávila Muro Página 1/4
    Nº de solicitud: 200930218
    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA
    CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD
    C07K 5/04 (2006.01) C07K 7/04 (2006.01) C07K 17/08 (2006.01) A61K 38/04 (2006.01)
    Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)
    C07K, A61K
    Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)
    INVENES, EPODOC,WPI,CAPLUS,XPESP
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 200930218
    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 16.09.2010
    Declaración
    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
    Reivindicaciones 1-13 SÍ
    Reivindicaciones _____________________________________
    NO
    Actividad inventiva
    Reivindicaciones 1-13 SÍ
    (Art. 8.1 LP11/1986)
    Reivindicaciones _____________________________________ NO
    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).
    Base de la Opinión.-
    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como ha sido publicada.
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 200930218
    1. Documentos considerados.-
    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.
    Documento
    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
    D01
    J. Med. Chem., 2005, vol. 48, nº 4, páginas 1265-1268 2005
    D02
    Prog. Clin. Biol. Res., 1994, vol. 388, páginas 147-159 1994
    D03
    CN 101148470 A 2008
    D04
    US 2004/0049011 A1 2004
    D05
    US 5371186 A1 1994
  14. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración
    La invención reivindicada se refiere a un conjugado polimérico amfifílico de fórmula I que comprende una secuencia peptídica de 1 a 5 aminoácidos (Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Arg, Lys, Asp, Glu), un resto de ácido láctico, un peptoide PTD7 neutralizante de LPS y un resto de polietilenglicol PEG funcionalizado. La invención también se refiere al procedimiento de obtención del conjugado mediante síntesis en fase sólida, a la composición farmacéutica que lo contiene y al uso de dicho conjugado como medicamento, para diálisis extracorpórea y para tratamiento de infecciones y sepsis bacterianas.
    El documento D01 se considera el más próximo al objeto de la invención y divulga la utilización de varios peptoides neutralizantes de LPS con estructura de oligómeros de N-alquilglicinas con aminas primarias como fenetilamina, tetrahidrofurfurilamina, difenilpropilamina, 4-metoxi fenetilamina, etc., obtenidos a partir de bibliotecas químicas. Entre ellos se divulga el peptoide PTD7 (ver Fig. 1, página 1266), pero no se menciona la asociación de éste u otros peptoides con conjugados poliméricos de tipo PEG.
    El documento D02 divulga unos péptidos sintéticos CAP7 enlazantes y neutralizantes de endotoxinas LPS y con actividad antibacteriana y anticoagulante. No se menciona la asociación de estos péptidos con conjugados poliméricos de tipo PEG.
    El documento D03 divulga la síntesis en fase sólida o líquida de un peptoide conjugado con PEG de fórmula Y-BNEP-Z-amPEG, siendo BNEP un péptido bactericida y neutralizante de endotoxinas cuya estructura no se especifica en el resumen proporcionado por la base datos de Chemical Abstracts. Se menciona que este conjugado puede utilizarse para tratamiento de infecciones bacterianas, sepsis y choque séptico.
    El documento D04 divulga unos conjugados peptídicos anfifílicos enlazantes de LPS con una estructura que incluye al menos 12 aminoácidos básicos (Lys, Arg, His), aromáticos (Phe, Trp, Tyr) e hidrofóbos (Leu, Ile), que se obtienen mediante síntesis en fase sólida. No se hace referencia a la asociación de estos péptidos con estructuras poliméricas de tipo PEG.
    Similar al anterior, el documento D05 también divulga unos péptidos síntéticos anfifílicos enlazantes de endotoxinas que se utilizan para el tratamiento y prevención del choque séptico y detección de endotoxinas. La estructura de estos péptidos incluye aminoácidos como Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp, Leu, Ile y Val, asociados con restos de ácidos grasos.
    A la vista de lo divulgado en los documentos D01-D05, no resultaría evidente para un experto en la materia la formación específica de un conjugado polimérico anfifílico que incluya una secuencia peptídica determinada, un peptoide de tipo PTD7 y una estructura polimérica de tipo PEG funcionalizado, así como tampoco resultaría evidente el empleo de dicho conjugado en procesos de diálisis extracorpórea y tratamiento de infecciones y sepsis bacterianas.
    En consecuencia, el objeto de la invención recogido en las reivindicaciones 1-13 se considera nuevo, con actividad inventiva y aplicación industrial (Arts. 6.1 y 8.1 LP 11/1986).
    Informe sobre el Estado de la Técnica (Opinión escrita) Página 4/4
ES200930218A 2009-05-28 2009-05-28 Conjugado polimerico para el tratamiento de infecciones bacterianas Withdrawn - After Issue ES2350430B1 (es)

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US5371186A (en) * 1991-02-11 1994-12-06 Biosynth S.R.L. Synthetic peptides for detoxification of bacterial endotoxins and for the prevention and treatment of septic shock
EP0988314B1 (en) * 1997-07-31 2006-07-19 Philip Richard Abraham Synthetic peptides with antimicrobial and endotoxin neutralizing properties for management of the sepsis syndrome
CN101148470B (zh) * 2007-09-14 2011-12-07 西南大学 聚乙二醇修饰的抗菌/中和内毒素变构肽分子、其合成方法及医学用途

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