ES2350323T3 - Nuevo procedimiento de lucha biológica contra la proliferación de legionella pneumophila, y nuevo agente desinfectante que contiene prozoos amebianos del género willaertia. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de lucha biológica contra la proliferación de Legionella pneumophila, con la excepción de los procedimientos de tratamiento aplicados al cuerpo humano o animal, caracterizado porque usa protozoos amebianos de la especie Willaertia magna, que corresponde a la cepa depositada con el número PTA-7824 en la ATCC o a la cepa depositada con el número PTA-7825 en la ATCC.
Description
Nuevo procedimiento de lucha biológica contra la
proliferación de Legionella pneumophila, y nuevo agente
desinfectante que contiene protozoos amebianos del género
Willaertia.
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La presente invención se refiere a un
procedimiento de lucha biológica contra la proliferación de
Legionella pneumophila, y constituye así un procedimiento
original para luchar contra la proliferación de la bacteria
patógena.
Legionella pneumophila, responsable en el
hombre de la legionelosis, es una bacteria
gram-negativa, que se caracteriza por una
replicación intracelular facultativa en el interior de los
macrófagos pulmonares. La legionelosis es una enfermedad que ha
afectado a 1.200 personas en Francia en 2004, causando la muerte de
130 enfermos. Además, la vigilancia y la prevención de la
legionelosis constituyen una preocupación cada vez más importante.
Más allá del problema de salud pública, la presencia de la bacteria
en las aguas de instalaciones industriales impone una vigilancia
restrictiva e importantes pérdidas de explotaciones en caso de
parada de estas instalaciones impuesta en el marco
reglamentario.
En el medio ambiente, L. pneumophila
presenta una distribución hídrica ubicua asociada a una relativa
termofilia, características que comparte con las amebas libres.
ROWBOTHAM en 1980 (ROWBOTHAM, T.J. J. Clin. Pathol. (1980) 33:
1179-1183), por analogía con lo que se observa en el
hombre, ha sido el primero en suponer y demostrar la existencia de
una multiplicación intracelular de Legionella pneumophila en
el interior de células de protozoos como las amebas libres.
Posteriormente, numerosos ensayos de cocultivos realizados en medio
líquido han demostrado una proliferación muy importante de
legionelas en presencia de amebas. Otros argumentos de tipo
indirecto acuden asimismo a reforzar la existencia de interacciones
entre amebas libres y legionelas. Así, durante las epidemias de
legionelosis, han podido aislarse legionelas y amebas libres
simultáneamente a partir de las aguas implicadas (BARBAREE y col.
Appl. Environ. Microbiol. (1986) 51: 422-424;
BREIMAN y col. JAMA (1990) 263: 2924-2926). SANDEN
y col. en Environ. Microbiol. (1992) 58: 2001-2004
indican que el aislamiento de las legionelas a partir del agua se
mejora acusadamente mediante una simple incubación de las muestras
de agua en presencia de amebas. Finalmente,
STEINERT y col. (STEINERT y col. Appl. Environ. Microbiol. (1997) 63: 2047-2053) muestran que la adición de amebas es capaz incluso de provocar la reviviscencia de cepas de legionelas no detectables en las condiciones habituales ya que se vuelven no cultivables, aunque siempre viables (VBNC), debido a una estancia demasiado prolongada en un medio empobrecido como agua destilada.
STEINERT y col. (STEINERT y col. Appl. Environ. Microbiol. (1997) 63: 2047-2053) muestran que la adición de amebas es capaz incluso de provocar la reviviscencia de cepas de legionelas no detectables en las condiciones habituales ya que se vuelven no cultivables, aunque siempre viables (VBNC), debido a una estancia demasiado prolongada en un medio empobrecido como agua destilada.
FIELDS (Trends Microbiol. (1996) 4:
286-290) ha enumerado 13 especies de amebas libres y
2 especies de ciliados susceptibles de asegurar la multiplicación
de L. pneumophila. Pero en la práctica, los estudios
realizados in vitro han llevado, en la inmensa mayoría de
los casos, a sólo tres géneros amebianos: Acanthamoeba
(ANAND y col. J. Hyg. Camb. (1983) 91: 167-178;
HOLDEN y col. Neff. Infect. Immun. (1984) 45: 18-24;
VANDENESCH y col. Zbl. Bakt. (1990) 272: 265-275;
MOFFAT y TOMPKINS Infect. Immun. (1992) 60: 296-301;
BOZUE y JOHNSON, Infect. Immun. (1996) 64: 668-673;
GAO y col. Infect. Immun. (1997) 65: 4738-4746;
NEUMEISTER y col. Appl. Environ. Microbiol. (1997) 63:
1219-1224), Hartmannella (KING y col. Infect.
Immun. (1991) 59: 758-763; ABU KWAIK, Appl.
Environ. Microbiol. (1996) 62: 2022-2028; ABU KWAIK
y col. Infect. Immun. (1994) 62: 1860-1866 y Appl.
Environ. Microbiol. (1998) 64: 3134-3139) y
Naegleria (NEWSOME, Infect. Immun. (1985) 50:
449-452). Con estos géneros, las legionelas se
multiplican en gran número en el interior de las amebas en el que se
observan en el interior de vacuolas fagocitarias.
Además, mientras se sospecha que las amebas
libres favorecen el mantenimiento y la multiplicación de legionelas
en medio hídrico, sobre todo en las biopelículas, ningún estudio ha
abordado hasta la actualidad las repercusiones en la multiplicación
de las legionelas, de las interrelaciones complejas que pueden
existir (fenómenos de competencia, de fagocitosis
inter-amebiana) entre los diferentes géneros
amebianos que cohabitan en el seno de la microfauna amebiana.
Hoy se reconoce que las amebas libres desempeñan
el papel de vectores gracias a los cuales las legionelas se
desarrollan y se propagan en el medio ambiente. Actualmente, las
técnicas usadas para luchar contra las legionelas hacen uso de
tratamientos térmicos, de tratamientos físicos (rayos UV) o incluso
de tratamientos químicos. No obstante, estos tratamientos no dan
entera satisfacción ya que permiten sólo eliminar provisionalmente
las bacterias planctónicas de L. pneumophila presentes en
estado libre en el medio tratado, pero se revelan ineficaces frente
a las bacterias presentes y protegidas en el interior de los
protozoos.
En este contexto, los autores de la invención
han puesto de relieve, de forma totalmente original, que ciertas
cepas del género amebiano Willaertia detienen la
proliferación de las bacterias L. pneumophila y que estas
cepas presentan igualmente un poder fagocitario frente a otras
especies amebianas susceptibles de estar, ellas mismas, infestadas
por la bacteria.
La presente invención tiene así por objeto
cualquier procedimiento de lucha biológica que usa amebas del género
Willaertia contra la proliferación de Legionella
pneumophila. Los procedimientos según la invención no incluyen
los procedimientos de tratamiento aplicados al cuerpo humano o al
animal. En el procedimiento según la invención, lo más frecuente es
un flujo gaseoso o líquido que se trata con protozoos del género
Willaertia, y en particular con la especie Willaertia
magna.
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El procedimiento según la invención encuentra,
en particular, aplicaciones, en la desinfección de las redes de
distribución de agua potable o de aguas industriales, de circuitos
de refrigeración de instalaciones industriales, o de redes de
climatización. En particular, el procedimiento según la invención
podrá implementarse, mediante el añadido de amebas
Willaertia, para luchar en el seno de biopelículas contra la
proliferación de L. pneumophila en las canalizaciones de
aguas, siendo estas biopelículas un lugar de desarrollo de
diferentes especies de amebas. Las amebas Willaertia podrán
añadirse directamente, en forma de una suspensión de formas
vegetativas o de quistes, a las aguas o líquidos que circulan en las
canalizaciones o redes para tratar. Igualmente es posible plantear
pulverizarlas en aerosol, por ejemplo en forma de una suspensión de
quistes, en las torres aerorrefrigerantes y en las instalaciones
industriales para desinfectar.
En particular, el agente biológico usado
corresponde a una de las dos cepas amebianas que pertenecen a la
especie Willaertia magna depositadas en la ATCC (American
Type Cultive Collection - Depositario de Patente - 10801 University
Boulevard - Manassas, VA 20110 - Estados Unidos) y registradas con
los números nº PTA-7824 y nº
PTA-7825, el 21 de agosto de 2006. Estas cepas nº
PTA-7824 y nº PTA-7825 forman parte
integrante de la invención. Estas cepas son de la familia de las
Vahlkampfiidae. Se caracterizan por la expresión de seudópodos
lobulados, redondeados y emitidos de forma brusca durante el
desplazamiento de los individuos. Los individuos en forma
vegetativa tienen un tamaño comprendido entre 45 y 100 \mum y
entre 18 y 25 \mum para la forma de quiste. Estos quistes son
redondeados, de forma ovoide o a veces muy deformados y poseen de 7
a una decena de poros en su pared. El modo de división es la
promitosis.
Dichas amebas, que presentan una actividad
especialmente interesante, podrán ser así usadas en agentes
desinfectantes, en particular destinados a la eliminación de las
bacterias Legionella pneumophila y a luchar contra la
proliferación y la contaminación por legionelosis.
Según otro de sus aspectos, la invención tiene
por objeto un agente desinfectante que contiene amebas que
corresponden como preferidas a la cepa depositada con el número
PTA-7824 en la ATCC o a la cepa depositada con el
número PTA-7825 en la ATCC. De forma ventajosa, el
agente desinfectante según la invención se presenta en la forma de
una solución o de una suspensión acuosa, por ejemplo en agua
destilada. El agente desinfectante podrá presentarse en una forma
pulverizable, por ejemplo en aerosol.
La actividad inhibidora de estos protozoos
amebianos del género Willaertia, y en particular de la
especie Willaertia magna, frente a L. pneumophila ha
sido puesta de relieve por los autores de la invención comparando
la replicación de la bacteria en los géneros Acanthamoeba y
Hartmannella usados como modelos amebianos de referencia con
la observada en el género amebiano Willaertia. Además, se ha
demostrado igualmente la existencia de un proceso fagocitario de
los protozoos del género Willaertia frente a otros géneros
amebianos.
Dado el papel esencial desempeñado por las
amebas libres en la proliferación y el mantenimiento de L.
pneumophila en el medio exterior, elementos que condicionan la
epidemiología de la legionelosis ya que no existe transmisión
interhumana, el procedimiento y el agente desinfectante planteado
según la invención presentan numerosas ventajas, en términos de
coste, de eficacia y de respeto del medio ambiente.
Los ejemplos dados a continuación permiten
ilustrar la invención pero no tienen ningún carácter limitativo.
La Figura 1 muestra las cinéticas comparadas del
desarrollo de L. pneumophila obtenido en cocultivo con
diferentes géneros amebianos, entre ellos el género
Willaertia.
La Figura 2 muestra el efecto de L.
pneumophilla en las diferentes especies de amebas y la
resistencia particular de Willaertia con respecto a
Hartmannella y a Acanthamoeba.
La Figura 3 muestra la resistencia de
Willaertia frente a la citotoxicidad inducida por L.
pneumophilla. Por el contrario, debe notarse el efecto
citotóxico pronunciado que se observa en Acanthamoeba.
La Figura 4 muestra la fagocitosis de las amebas
Hartmannella por las amebas Willaertia observada en
microscopía de contraste de fase en vivo (x1200).
La Figura 5 muestra la evolución espontánea de
las poblaciones respectivas de amebas Hartmannella (H) y
Willaertia (W) después de la aparición según una proporción
inicial H/W de aproximadamente 15.
La Figura 6 representa las evoluciones
respectivas de las poblaciones de amebas Hartmannella (serie
"testigo" y "ensayo") y Willaertia en los
cocultivos encajados de L. pneumophila.
La Figura 7 representa las cinéticas comparadas
del desarrollo de L. pneumophila en cocultivo monoamebiano
(sólo Hartmannella) y en cocultivo tripartito
(Hartmannella + Willaertia).
- Legionelas: la cepa usada es la cepa de
Legionella pneumophila serogrupo 1 depositada con el número
107 629T en el Instituto Pasteur de París (CNCM). Se mantiene en
gelosa en pendiente BCYE con un trasplante cada tres semanas. La
cepa se siembra en estrías grandes en caja de gelosa BCYE (AES®) y
se incuba de 3 a 4 días a 37ºC antes de la realización de los
cocultivos de manera que se disponga de bacterias en fase
postexponencial.
- Amebas: las cepas usadas pertenecen a
tres géneros amebianos diferentes:
- Hartmannella vermiformis,
- Acanthamoeba castellanii,
- Willaertia magna (nº PTA-7824).
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Estas tres cepas se cultivan axénicamente, en
presencia del 10% de suero de ternera fetal, en medio SCGYEM (véase
composición en anexo), distribuido en tubos FALCON® (3033) a razón
de 3 ml por tubo. En mantenimiento, las formas vegetativas se
trasplantan cada 8-9 días. Para los cocultivos, se
usan trasplantes de 3 a 4 días de manera que se disponga de
trofozoítos en fase de crecimiento exponencial.
- Medio SCGYEM
- Composición:
- Caseína (MERCK 1.02244.010) 10 g
- Na_{2}HPO4 1,325 g
- KH_{2}PO4 0,8 g
- Glucosa 2,5 g
- Extracto de levadura (DIFCO 0127-17-9) 5 g
- Agua destilada 900 ml
- Suero de ternera fetal 100 ml
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A los 900 ml de agua destilada, se añaden 2,5 ml
de NaOH (1N), y después Na_{2}HPO4 y KH_{2}PO4. Se calienta
ligeramente en placa calefactora, y después se añade progresivamente
la caseína en agitación magnética. Después de disolución de la
caseína, se incorporan la glucosa y el extracto de levadura.
Después de disolución completa, se filtra
sucesivamente en fibra de vidrio (SARTORIUS SM 6513400), y después
en membrana de 1 \mum (WHATMAN 7190 004). A continuación se añade
el medio en partes alícuotas en frascos de vidrio. Los frascos se
esterilizan en el autoclave 20 minutos a 120ºC. Antes del uso
definitivo y la distribución del medio, se añade de forma estéril
bajo campana de flujo laminar el suero de ternera fetal a razón del
10% del volumen final.
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A partir de un cultivo de 3 a 4 días en gelosa
BCYE, se prepara una suspensión de L. pneumophila en agua
destilada estéril de forma que se obtenga 1 unidad de Densidad
Óptica a 550 nm, o bien una concentración de 10^{9} UFC/ml.
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Los cocultivos se realizan en tubos para
cultivos celulares (FALCON® 3033) que contienen 3 ml de medio
SCGYEM. La siembra de los tubos se hace a razón de aproximadamente
7\cdot10^{4} amebas/ml, a partir de una suspensión amebiana
axénica previamente sometida a recuento en cámara THOMA. La
infestación de las amebas por L. pneumophila se realiza
fijando una proporción L. pneumophila/ameba de 50,
aproximadamente 3,5\cdot10^{6} bacterias/ml. Inmediatamente
después de la infestación, se centrifugan los tubos de cocultivos a
baja velocidad (760 g durante 5 min) para favorecer el contacto
entre amebas y bacterias. Al cabo de 10 min, se vuelven a poner los
tubos en suspensión manualmente y se incuban, en posición inclinada,
en estufa a 37ºC.
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Los cocultivos se continúan durante al menos 5
días (D0 a D+4) después de la infestación bacteriana. En cada
intervalo de tiempo, se toma un tubo y se examina a la vez desde el
punto de vista amebiano y bacteriano después de agitación vigorosa
en vórtice con el fin de despegar las amebas de las paredes. Para
cada tubo examinado:
- La numeración de las amebas se efectúa
directamente en la cámara THOMA o MALASSEZ.
- A la vista de los resultados obtenidos a
continuación de los ensayos preliminares de lisis amebiana, el
recuento de legionelas totales se efectúa por exposición directa del
medio de cultivo en gelosa BCYE (AES®) después de dilución de 10 en
10 en agua destilada estéril, en microtubos Eppendorf. Cada dilución
se expone en triplicado en gelosa BCYE a razón de 100 \mul por
caja. Las cajas se ponen entonces en incubación a 37ºC durante 6
días como mínimo. Se efectúa una primera lectura de las exposiciones
a partir del 4º día mediante recuento de las colonias; se sigue de
una segunda lectura al 6º día para confirmación. El número de L.
pneumophila se expresa en UFC/ml teniendo en cuenta el factor
de dilución y suponiendo que cada colonia corresponde a 1 bacteria
inicialmente presente en la suspensión diluida.
Para cada género amebiano, las curvas de
crecimiento de L. pneumophila se representan en función del
tiempo y corresponden a la media de al menos tres ensayos
independientes con las desviaciones típicas correspondientes.
A la vista de la lentitud del desarrollo de las
colonias de L. pneumophila en cultivo en BCYE, la obtención
del conjunto de los resultados para una manipulación de este tipo
requiere un plazo de al menos 11 días.
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Se han realizado igualmente cocultivos de tres
géneros amebianos en microplacas de 24 pocillos que contienen
5\cdot10^{4} amebas/pocillo, infestadas con una proporción L.
pneumophila/ameba de 50, con el fin de observar
microscópicamente las monocapas celulares y de suministrar una
evaluación cualitativa del efecto citopatógeno de la bacteria frente
a la ameba.
Se ha determinado igualmente la citotoxicidad al
cabo de 48 y de 72 h de cocultivo mediante una prueba de exclusión
con azul de triptano en los géneros Acanthamoeba y
Willaertia. Las amebas son recuperadas por centrifugado
suave del contenido de los tubos de cocultivos, y después se vuelven
a suspender en 200 \mul de medio SCGYEM antes de la mezcla con el
azul de triptano según una proporción de 4/1. Las células se
examinan en el hematímetro y para cada género amebiano se determina
el porcentaje de células muertas que aparecen coloreadas de
azul.
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Se han estudiado las repercusiones posibles de
las interacciones entre diferentes géneros amebianos, y sobre todo
de la fagocitosis interamebiana, en la replicación y la transmisión
de legionelas. En un primer momento, se ha estudiado la cinética
del proceso de fagocitosis interamebiana entre Hartmannella y
Willaertia, y después se han realizado cocultivos
tripartitos de L. pneumophila que hacen participar dos
hospedadores amebianos sucesivos.
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A partir de los cultivos axénicos respectivos,
se prepara una serie de tubos de medio SCGYEM que contienen a la
vez amebas Hartmannella y amebas Willaertia según una
proporción fijada aproximadamente en 20 Hartmannella por 1
Willaertia. El proceso fagocitario se observa
microscópicamente in vivo en contraste de fase, y, gracias a
las diferencias pronunciadas de tamaño y de aspecto entre los dos
géneros amebianos, su evolución puede seguirse por numeración de
las dos poblaciones amebianas que aparecen en diferentes intervalos
de tiempo.
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Para este fin se ha usado un protocolo
experimental en dos tiempos:
- la primera etapa corresponde, como en los
cocultivos monoamebianos, a la infestación en cocultivo del primer
hospedador amebiano por L. pneumophila;
- la segunda etapa consiste, después de la
eliminación de las legionelas extracelulares, en introducir en el
cocultivo un segundo género amebiano.
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Esta etapa corresponde a la infestación de la
ameba H. vermiformis por L. pneumophila. Se realiza
en tubos FALCON en condiciones análogas a las indicadas
anteriormente en el apartado 1.2.2. Las únicas diferencias se dan
en la concentración amebiana de partida que es del orden de
2\cdot10^{5} Hartmannella/ml y en la proporción de
infestación L. pneumophila/Hartmannella que es de 20. Los
tubos se incuban en posición inclinada durante 24 H a 37ºC.
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Transcurrido el tiempo de incubación destinado a
asegurar la infestación del primer hospedador amebiano, las
legionelas extracelulares se eliminan por tratamiento de los
cocultivos con gentamicina a razón de 50 \mug/ml durante 1 H a
37ºC (Moffat, J.F, and Tompkins, L.S. Immun. (1992) 60:
296-301). Después de centrifugado a 2000 g durante
10 min, se elimina el antibiótico por decantación del medio de
cultivo y se lava el residuo celular de Hartmannella en dos
extractos con 2 ml de medio SCGYEM sin suero para eliminar todo
rastro de antibiótico. Después del último lavado, se vuelve a poner
en suspensión el residuo amebiano de cada tubo, por paso en
vórtice, en su volumen inicial de medio SCGYEM (3 ml). Se procede a
una numeración (D0), a la vez de Hartmannella y de
legionelas.
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En paralelo, se prepara una suspensión amebiana
del segundo hospedador Willaertia a partir de un cultivo
axénico. Después de recuento en la cámara THOMA, se calcula el
volumen necesario de suspensión que se introducirá en los tubos de
cocultivos que constituyen la serie "ensayo" de forma que se
obtenga una relación celular entre 1^{er} hospedador amebiano/2º
hospedador amebiano (Hartmannella/Willaertia) cercana a 20.
Los tubos que corresponden a la serie "testigo" se tratan
exactamente de la misma manera, aunque sin recibir amebas
Willaertia después del tratamiento con gentamicina.
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Cada día, se examina un tubo de cocultivo de la
serie "ensayo" y "testigo", después de agitación en
vórtice, a la vez desde el punto de vista amebiano y bacteriano:
- La numeración de los trofozoítos para cada
género amebiano se efectúa en cámara THOMA o MALASSEZ.
- El recuento de las legionelas totales se
efectúa como en el caso de los monococultivos por exposición en
gelosa BCYE de las diluciones del medio de cultivo en agua destilada
estéril. Una única manipulación exige así un plazo de una docena de
días para ser interpretada.
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La Figura 1 muestra el crecimiento comparado de
L. pneumophila en cocultivo con los tres géneros amebianos,
realizándose los cocultivos según se describe anteriormente en la
sección material y procedimiento, es decir: las amebas axenizadas
en medio SCGYEM son cocultivadas en presencia de L.
pneumophila a partir de D0 según una proporción de infestación
L. pneumophila/ameba de 50. Los resultados corresponden a la
media \pm desviación típica de 6 (Hartmannella) a 8
(Acanthamoeba y Willaertia) ensayos
independientes.
Los cocultivos de L. pneumophila
realizados en presencia de amebas que pertenecen a los géneros
Hartmannella y Acanthamoeba confirman una clara
multiplicación de la bacteria en presencia de estos dos géneros
amebianos ya que se observa un aumento que alcanza respectivamente
1,3 y 1,4 log en D+3 (Figura 1). Por el contrario, mientras las
condiciones experimentales son estrictamente idénticas, los
cocultivos de L. pneumophila en presencia de amebas
Willaertia sp., no sólo no conducen a un desarrollo
significativo de la bacteria, sino que conducen incluso a una
disminución de 1 log de la población bacteriana y finalmente la
diferencia de desarrollo de L. pneumophila entre los
cocultivos en presencia de Hartmannella sp. o de
Acanthamoeba sp. y los cocultivos en presencia de amebas
Willaertia sp. alcanzó 2,3 log en D+2 (Figura 1).
Simultáneamente, la observación microscópica de
los cocultivos muestra importantes modificaciones morfológicas que
afectan exclusivamente a las amebas de los géneros
Hartmannella y Acanthamoeba: sus trofozoítos se
redondean progresivamente, se encogen y pierden su capacidad de
adherencia de D2 a D4. En estas condiciones, el recuento exacto de
las amebas para estos dos géneros se hace difícil e incierto debido
a que una mayoría de las células sometidas a recuento está ya, en
realidad, necrótica y en el punto de experimentar una lisis; no
obstante, el recuento muestra que el crecimiento de estos dos
géneros se ralentiza a partir de D+1 con una clara disminución en
D+2 (Tabla 1). Los cocultivos en presencia de Willaertia sp.
no presentan esta involución y se caracterizan, por el contrario,
por una proliferación de amebas (Tabla 1).
Los resultados presentados en la Tabla 1 se
obtienen del modo siguiente:
Las diferentes especies amebianas son
cocultivadas en presencia de L. pneumophila según una
proporción de infestación de 50 (L. pneumophila/ameba) y las
amebas se recuentan cotidianamente con un hematímetro. Los
resultados en número de amebas/ml de medio corresponden a la media
de 6 (Hartmannella) a 8 (Acanthamoeba y
Willaertia) experimentos independientes. Se indican las
diferencias estadísticamente significativas entre el número de
Willaertia y las otras dos especies amebianas (*: P <
0,05; **: P < 0,001).
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El efecto citotóxico inducido por L.
pneumophila en las amebas ha sido examinado por la observación
en microscopia de contraste de fase de los cocultivos en
microplacas. La Fig. 2 muestra las imágenes obtenidas en
microscopia de contraste de fase de las diferentes especies
amebianas cultivadas en ausencia (arriba) y en presencia (abajo) de
L. pneumophila durante 72 H según una proporción de
infestación de 50. En estas condiciones, se constata que L.
pneumophila destruye completamente las monocapas de las cepas de
Hartmannella sp. y de Acanthamoeba sp. al cabo de 72
H de infección con aparición de células sueltas y redondeadas
(Figura 2), mientras que, para la misma proporción de infestación y
en el mismo lapso de tiempo, las monocapas de Willaertia sp.
permanecen intactas y proliferan de igual modo que en el pocillo
testigo desprovisto de legionelas (Figura 2). Estas observaciones
han sido confirmadas por la realización de una prueba de exclusión
con azul de triptano en los cocultivos de Acanthamoeba y de
Willaertia. La Fig. 3 ilustra la citotoxicidad comparada de
L. pneumophila frente a Acanthamoeba y a
Willaertia. Las amebas son cultivadas en presencia de L.
pneumophila y el porcentaje de células positivas al azul de
triptano después de 2 y 3 días de cocultivo se determina
microscópicamente. Los datos presentados Fig. 3 corresponden a los
resultados obtenidos después de 5 ensayos independientes.
Los resultados muestran que el 28,4 \pm 8% de
las raras células de Acanthamoeba sp. todavía presentes al
cabo de 72 H es destruido. En cambio, el efecto citopatógeno de
L. pneumophila para las Willaertia sp. es de menos
del 4% después del mismo tiempo de infección (Figura 3). Así pues,
morfológicamente, los trofozoítos de Willaertia en cocultivo
parecen resistir mucho mejor la infección por L. pneumophila
que los de Hartmannella o de Acanthamoeba.
\vskip1.000000\baselineskip
La fagocitosis de las amebas Hartmannella
por las amebas del género Willaertia comienza en los minutos
que siguen al inicio de la presencia de los dos géneros amebianos.
El fenómeno se desencadena por los encuentros aleatorios que se
producen entre los dos géneros amebianos; su evolución depende así
de las proporciones respectivas de los dos géneros que empiezan a
presentarse.
Microscópicamente, es perfectamente posible
seguir in vivo la ingestión de las Hartmannella por
las Willaertia y no es raro observar una célula de
Willaertia que encierra varios de Hartmannella en
estadios más o menos avanzados de digestión según se ilustra en la
Figura 4. La Figura 4 que representa vistas en microscopia de
contraste de fase (x1200) pone de relieve la fagocitosis de las
amebas Hartmannella por las amebas Willaertia
observada in vivo. Las flechas negras indican la presencia de
trofozoítos de Hartmannella fagocitados en el interior del
citoplasma de las amebas Willaertia. La punta de flecha
blanca indica una ameba Hartmannella presa simultánea de dos
Willaertia.
El estudio cinético del fenómeno muestra que
después de este proceso fagocitario, se asiste a un decrecimiento
muy rápido de la población de Hartmannella que cae al 14% de
su valor inicial en 3 días, mientras que paralelamente, la
población de Willaertia aumenta 1 log en dos días. Sigue una
inversión total de la relación H/W que pasa de 14,4 a 0,24 de D0 a
D+3 (Figura 5 que muestra la evolución respectiva de las poblaciones
de Hartmannella (H) y de Willaertia (W) mezcladas en
cultivo axénico según una proporción H/W de 15).
\vskip1.000000\baselineskip
La introducción de la ameba Willaertia en
los cocultivos tripartitos a partir de D0, es decir, 24 H después de
la infestación del primer hospedador amebiano Hartmannella
por L. pneumophila, se acompaña de dos fenómenos
concomitantes y confirma el efecto observado anteriormente durante
la realización de los cocultivos monoamebianos:
1. La Figura 6 muestra los crecimientos
respectivos de especies amebianas en presencia de L.
pneumophila según las condiciones de cocultivo descritas
anteriormente en la sección material y procedimiento, es decir: las
amebas del género Hartmannella han sido infectadas
previamente en D-1 durante 24 H por L.
pneumophila según una proporción de infestación de 20. En D0,
después de la eliminación de las legionelas extracelulares por un
tratamiento con gentamicina (1H) y un lavado cuidadoso, las amebas
Hartmannella (H) preinfectadas se vuelven a poner en
suspensión en su volumen inicial de medio SCGYEM y reciben amebas
del género Willaertia (W), en la serie "ensayo", según
una proporción H/W = 20 (cocultivo tripartito). La serie
"testigo" evoluciona en ausencia de Willaertia y
corresponde a un cocultivo monoamebiano. Las poblaciones amebianas
se recuentan cada día en cada una de las series "testigo" y
"ensayo". Se asiste, de manera lógica, a una disminución más
rápida de las amebas Hartmannella en la serie "ensayo",
que alcanza el 86% en el curso de las primeras 24 H, a continuación
del desencadenamiento del proceso fagocitario interamebiano, que en
la serie "testigo" en la que la desaparición de las
Hartmannella se debe a la única lisis necrótica inducida por
L. pneumophila (Figura 6). Paralelamente, se constata un
aumento regular de las Willaertia que ven su número
multiplicado por 6,5 en la duración del experimento y como
anteriormente la relación H/W se invierte completamente pasando de
19,8 a 0, 08. Como ya se ha constatado durante los cocultivos
monoamebianos, la presencia de las legionelas no parece así afectar
a la apariencia morfológica y al desarrollo de las
Willaertia.
2. La Figura 7 muestra el crecimiento comparado
de L. pneumophila en cocultivo monoamebiano con
Hartmannella sola y en cocultivo tripartito en presencia de
Hartmannella y de Willaertia añadida a partir de D0.
Las modalidades operatorias son las indicadas anteriormente para la
Figura 6. Se observa una parada del desarrollo de L.
pneumophila con respecto al que se obtiene en los cocultivos
"testigos" en presencia de las amebas Hartmannella en
solitario (Figura 7). La inhibición del desarrollo de L.
pneumophila a continuación de la introducción de
Willaertia alcanza 2 log al cabo de 48 H de cocultivo
tripartito. Visiblemente, el proceso de fagocitosis de las
Hartmannella por las Willaertia no permite así tomar
el relevo y amplificar la replicación de la bacteria en el seno del
nuevo hospedador.
En conclusión, la tendencia observada durante la
realización de los cocultivos monoamebianos de L. pneumophila
con Willaertia se confirma plenamente por los resultados de los
cocultivos tripartitos. Se constata que la fagocitosis por
Willaertia del primer hospedador amebiano, infestada
previamente durante 24 H, tiene como efecto el bloqueo total del
desarrollo de legionelas con respecto a la evolución constatada en
los cocultivos testigos de Hartmannella que no contienen
Willaertia. Visiblemente, el aumento de la población de
Willaertia y el proceso fagocitario que lo acompaña no
permiten la transmisión de la infestación del primer hospedador
celular al segundo hospedador potencial. La estabilidad relativa de
la tasa de legionelas de valores cercanos a los del inicio puede
mantenerse mediante Hartmannella todavía no fagocitadas. El
conjunto de estos resultados muestra una ausencia de desarrollo de
L. pneumophila en presencia de amebas del género
Willaertia.
Se obtienen igualmente resultados conformes con
el conjunto de los resultados presentados anteriormente, obtenidos
con la cepa nº PTA-7824, con la cepa nº
PTA-7825.
Claims (7)
1. Procedimiento de lucha biológica contra la
proliferación de Legionella pneumophila, con la excepción de
los procedimientos de tratamiento aplicados al cuerpo humano o
animal, caracterizado porque usa protozoos amebianos de la
especie Willaertia magna, que corresponde a la cepa
depositada con el número PTA-7824 en la ATCC o a la
cepa depositada con el número PTA-7825 en la
ATCC.
2. Procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado por que implementa el tratamiento de un flujo
líquido o gaseoso con los protozoos amebianos.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2
caracterizado por que se implementa para la desinfección de
redes de distribución de agua potable o de aguas industriales,
circuitos de refrigeración y torres aerorrefrigerantes de las
instalaciones industriales, o redes de climatización.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2
caracterizado por que se implementa para luchar contra la
proliferación de Legionella pneumophila en el seno de
biopelículas en las canalizaciones de aguas.
5. Agente desinfectante que contiene protozoos
amebianos de la especie Willaertia magna, que corresponde a
la cepa depositada con el número PTA-7824 en la ATCC
o a la cepa depositada con el número PTA-7825 en la
ATCC.
6. Agente desinfectante según la reivindicación
5 caracterizado por que se presenta en la forma de una
solución o de una suspensión acuosa.
7. Protozoos amebianos que pertenecen a la
especie Willaertia magna que corresponde a la cepa depositada
con el número PTA-7824 en la ATCC o a la cepa
depositada con el número PTA-7825 en la ATCC.
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