ES2349033T3

ES2349033T3 - Procedimientos para la medida de la actividad del acetato de glatiramer.

Info

Publication number: ES2349033T3
Application number: ES02790028T
Authority: ES
Inventors: Ety Klinger
Original assignee: Teva Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Teva Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 2001-12-04
Filing date: 2002-12-04
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2022-12-04
Also published as: CN1308683C; MXPA04005433A; JP4369234B2; US7923215B2; US20090053253A1; CA2469393A1; IL162127A0; PT1459065E; CN1618018A; JP2005511060A; US7429374B2; SI1459065T1; EP1459065B1; IL198285A0; EP1459065A2; WO2003048735A3; AU2002353059A1; US20120309671A1; US20110189706A1; IL198285A

Abstract

Un procedimiento para medir la actividad de un lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con la actividad conocida de un lote de referencia que comprende: a) inmunizar ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 entre 8 y 12 semanas de edad con una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de referencia; b) preparar un cultivo primario de células de nódulos linfáticos de los ratones de la etapa (a) 9-11 días después de la inmunización; c) incubar separadamente al menos cinco muestras de referencia, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer entre 1 µg/ml y 25 µg/ml de un lote de referencia; d) incubar al menos dos muestras, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba; e) determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de interleuquina-2 segregada por las células en cada muestra después de 18-21 horas de incubación de tal muestra; f) correlacionar las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia de acetato de glatiramer. donde en cada muestra de las etapas (c) y (d) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica de acetato de glatiramer del lote de referencia.

Description

A lo largo de esta solicitud se mencionan diversas referencias usando citas abreviadas entre paréntesis. Citas completas para estas referencias se pueden encontrar al final de la especificación, inmediatamente antes de las reivindicaciones.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a métodos para normalizar la medida de la actividad de acetato de glatiramer basada en el reconocimiento específico del acetato de glatiramer por células T.

ANTECEDENTES

Es deseable normalizar la medida de la actividad de composiciones farmacéuticas porque hay una actividad y calidad óptimas de componente activo que es eficaz al tratar la enfermedad para la que se administra.

El acetato de glatiramer (GA, conocido también como Copolymer-1 (Guía de Referencia Médica), Copolymer 1, Cop-1 o COPAXONE¡) es un fármaco autorizado para el tratamiento de esclerosis múltiple (MS). El acetato de glatiramer consiste en sales acetato de polipéptidos sintéticos que contienen cuatro aminoácidos naturales (Guía de Referencia Médica): ácido L-glutámico, L-alanina, L-tirosina, y L-lisina (Guía de Referencia Médica) con una fracción molar media de ácido L-glutámico: 0,129-153; L-alanina: 0,392-0,462; L-tirosina: 0,086-0,100; L-lisina: 0,300-0,374, respectivamente. El peso molecular medio del acetato de glatiramer es 4.700-11.000 daltons (Guía de Referencia Médica). Químicamente, el acetato de glatiramer se denomina acetato (sal) de polímero de ácido L-glutámico con L-alanina, L-lisina y L-tirosina (Guía de Referencia Médica). Su fórmula estructural es:

(Glu, Ala, Lys, Tyr)x∇xCH3COOH (C5H9NO4∇C3H7NO2∇C6H14N2O2∇C9H11NO3)X∇xC2H4O2

CAS – 147245-92-9 (Guía de Referencia Médica). El acetato de glatiramer se escribe también como sigue:

poli(L-Glu13-15, L-Ala39-46, L-Tyr8,6-10, L-Lys30-37)∇nCH3COOH.

Se demostró que el acetato de glatiramer elimina la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) – un modelo experimental para la esclerosis múltiple (MS) en diversas especies animales (Lando et al., 1979; Aharoni, 1993). Estudios de EAE en roedores murinos sugirieron que la protección frente a la EAE está mediada por la actividad de las células T (Aharoni, 1993). Esta protección frente a la inducción activa de EAE por homogeneizado de médula espinal de ratón, en la que están implicados varios autoantígenos, se pudo transferir adoptivamente a receptores normales por inyección de células T supresoras específicas de acetato de glatiramer (Aharoni, 1993). En ensayos clínicos de fase III se descubrió que inyecciones diarias subcutáneas de acetato de glatiramer retardan el avance del problema y reducen la frecuencia de recidivas en el agravamiento-remisión de la esclerosis múltiple (Johnson, 1987). Procedimientos de fabricación de acetato de glatiramer se describen en las Patentes de U.S. Nos. 3.849.550 y 5.800.808. y en la Publicación Internacional PCT No. WO 00/05250.

Se acepta normalmente que un alto nivel de especificidad antigénica es una característica de la activación de células T. Las células T del sistema inmune reconocen péptidos inmunológicos complejados con moléculas de clase I o II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), expresadas en células presentadoras de antígenos (APCs). La especificidad del reconocimiento de antígenos por células T se define por varios parámetros: 1) afinidad del receptor de células T por el complejo peptídico MHC; 2) secuencia primaria del péptido antigénico; y 3) efectos sinérgicos de ciertas combinaciones de aminoácidos en el péptido antigénico. Sobre la base del conocimiento actual del mecanismo de acción del acetato de glatiramer, se cree que la actividad biológica del acetato de glatiramer en la MS está mediada por inmunomodulación de la actividad de células T.

SUMARIO DE LA INVENCION

La invención derivada de contrato de financiación proporciona un procedimiento para medir la actividad de un lote de pruebas de acetato de glatiramer respecto a la conocida actividad de un lote de referencia de acetato de glatiramer que comprende

a.: inmunizar ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 entre 8 y 12 semanas de edad con una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de referencia;

b.: preparar un cultivo primario de células de nódulos linfáticos de los ratones de la etapa (a) 9-11 días después de inmunizar;

c.: incubar separadamente al menos cinco muestras de referencia, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer entre 1 µg/ml y 25 µg/ml de un lote de referencia;

d.: incubar al menos dos muestras, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba;

e.: determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de interleuquina-2 segregada por las células en cada muestra después de 1821 horas de incubación de tal muestra;

f.: correlacionar las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia de acetato de glatiramer,

donde en cada muestra de las etapas (c) y (d) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica de acetato de glatiramer del lote de referencia.

La invención derivada de contrato de financiación proporciona también un procedimiento para medir la actividad de un lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con la actividad conocida de un lote de referencia de acetato de glatiramer que comprende

a.: inmunizar un mamífero de prueba con una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de referencia;

b.: preparar un cultivo primario de células del mamífero de prueba de la etapa

(a) en un momento predeterminado después de inmunizar;

c.: incubar separadamente al menos dos muestras de referencia, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer de un lote de referencia;

e.: determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de una citoquina segregada por las células de cada muestra después de un periodo de tiempo predeterminado de incubación de tal muestra;

f.: correlacionar las cantidades de la citoquina segregada por las muestras incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades de la citoquina segregada por las muestras incubadas con el lote de referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del

lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia

de acetato de glatiramer, donde en cada muestra de las etapas (c) y (d) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra de inmunización que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica de acetato de glatiramer del lote de referencia.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Inmunización con GA RS (Patrón de Referencia). Cultivo primario de células LN (de Nódulos Linfáticos). Detección de IL-2 por ELISA.

Figura 2: Inducción de células T específicas de GA. Cultivos primarios de células LN derivadas de ratones inmunizados con 250 µgdeGARS+CFA oconCFA solamente, se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de GA RS. Tras incubación durante una noche a 37ºC, se recogieron los medios de cultivo y se analizaron por ELISA para la IL-2.

Figura 3: Diagrama de hemocitómetro.

Figura 4: Optimización del protocolo de inmunización – efecto de la fuente de cultivo y de la dosis del Patrón de Referencia (RS) GA. Se obtuvieron cultivos primarios de células de nódulos linfáticos (LN) y bazo de ratones inmunizados con 10 ó 250 µg de GA RS + adyuvante de Freund completo (CFA). Las células se cultivaron con cantidades crecientes de GA RS. Tras incubación durante una noche a 37ºC, los medios de cultivo se recogieron y estudiaron por ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) para la IL-2.

Figura 5: Optimización del protocolo de inmunización – efecto del adyuvante y de la dosis. Cultivos primarios de células LN obtenidas de ratones inmunizados con 250 µg de GA RS + CFA o con 10 mg de GA RS + adyuvante de Freund incompleto (ICFA) se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de GA RS. Tras incubación durante una noche a 37ºC, los medios de cultivo se recogieron y analizaron por ELISA para la interleuquina-2 (IL-2).

Figura 6: Efecto del periodo de inmunización. Se inmunizaron ratones con 250 µg de GA RS en CFA y se separaron LN (nódulos linfáticos) después de 9, 10 y 11 días. La respuesta de las células LN de diferentes grupos a diversas concentraciones de GA RS se analizó in vitro midiendo por ELISA la secreción de IL-2.

Figura 7: Efecto de los medios de cultivo sobre la respuesta de células T específicas de GA. Cultivos primarios de células LN se cultivaron con diferentes medios que contenían, o suero normal de ratón (NMS) al 1%, suero de bovino fetal (FBS) al 1% o medios de cultivo celular definidos (DCCM1). Las células se incubaron con concentraciones crecientes de GA RS durante 21 horas a 37ºC. Posteriormente, los medios de cultivo se recogieron y analizaron por ELISA para la IL-2.

Figura 8: Cinética de secreción de IL-2 en respuesta al GA RS. Se preparó un cultivo primario de células LN de ratones inmunizados con 250 µg de GA RS + CFA. Las células se incubaron con 0, 0,5, 2,5 y 5 µg/ml de GA RS a 37ºC durante los intervalos indicados. En cada tiempo se centrifugó una alícuota de 5x106 células y el sobrenadante se guardó a –20ºC. Todas las muestras se analizaron simultáneamente por ELISA para la IL-2.

Figura 9: Estabilidad de IL-2 en medios de cultivo. Se preparó un cultivo primario de células LN de ratones inmunizados con 250 µg de GA RS + CFA. Las células se incubaron con diversas concentraciones de GA RS a 37ºC. Tras incubación durante una noche, los sobrenadantes se recogieron y dividieron en dos alícuotas. Inmediatamente se analizó por ELISA una alícuota, y la segunda se guardó durante 7 días a –20ºC antes de ser analizada.

Figura 10: Estabilidad de disolución de GA RS a –20ºC. Se preparó disolución de GA RS de 1 mg/ml, se dividió en alícuotas y se guardaron a –20ºC. La respuesta a la dosis de las células específicas de GA a disolución de GA RS se analizó a tiempo cero (Fecha 1) y después de 5 meses a –20ºC.

Figura 11: Efecto del peso molecular medio (MW) sobre la respuesta de células T específicas de GA RS. Se preparó un cultivo primario de células LN de ratones inmunizados con 250 µg de GA RS + CFA. Las células se cultivaron en presencia de 2 concentraciones diferentes de GA RS y de Sustancia Farmacológica (DS) GA de diferentes pesos moleculares. Tras incubación durante una noche a 37ºC los medios de cultivo se recogieron y se analizaron por ELISA para la IL-2.

Figura 12 (A y B): Reactividad cruzada de células T específicas de GA RS con lotes de GA DS y producto farmacológico (DP). Se preparó un cultivo primario de células LN de ratones inmunizados con 250 µg de GA RS + CFA. La respuesta de las células T específicas de GA RS a otro lote de GA DS (Fig. 12A), a un lote de GA DP y a manitol (Fig. 12B) se comparó con la respuesta al lote de GA RS. Se midieron por ELISA niveles de IL-2 en los medios de cultivo.

Figura 13: Cinética de proteolisis de GA RS por la tripsina. Se proteolizó GA RS para los tiempos indicados. La actividad de las muestras proteolizadas se examinó mediante la prueba de actividad in vitro.

Figura 14: Cromatografía Líquida de Alta Presión en Fase Reversa (RP-HPLC) de GA antes y después de la proteolisis por tripsina. Se proteolizó GA RS por tripsina y el perfil cromatográfico de las muestras se analizó por RP-HPLC.

Figura 15: Cinética de proteolisis de GA RS por quimotripsina. Se proteolizó GA RS por quimotripsina para los tiempos indicados. La actividad de las muestras proteolizadas se analizó mediante la prueba de actividad in vitro.

Figura 16: RP-HPLC de GA antes y después de la proteolisis por quimotripsina. Se proteolizó GA RS por quimotripsina y el perfil cromatográfico de las muestras se analizó por RP-HPLC.

DESCRIPCION DETALLADA

La invención derivada de contrato de financiación proporciona un procedimiento para medir la actividad de un lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con la actividad conocida de un lote de referencia de acetato de glatiramer que comprende

a.: inmunizar ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 entre 8 y 12 semanas de edad

con una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de

referencia.

b.: preparar un cultivo primario de células de nódulos linfáticos de los ratones

de la etapa (a) 9-11 días después de inmunizar;

c.: incubar separadamente al menos cinco muestras de referencia, cada una

de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo

primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de

glatiramer entre 1 µg/ml y 25 µg/ml de un lote de referencia;

d.: incubar al menos dos muestras, cada una de las cuales contiene un número

predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una

cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba;

e.: determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de

interleuquina-2 segregada por las células en cada muestra después de 18

21 horas de incubación de tal muestra;

f.: correlacionar las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras

incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades

de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de

referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del lote de

prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia de

acetato de glatiramer,

En una realización, se incuban separadamente seis muestras de referencia en la etapa (d).

(a) en un tiempo predeterminado después de inmunizar;

e.: determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de una citoquina segregada por las células en cada muestra después de un periodo de tiempo predeterminado de incubación de tal muestra;

f.: correlacionar las cantidades de la citoquina segregada por las muestras incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades de la citoquina segregada por las muestras incubadas con el lote de referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia de acetato de glatiramer,

donde en cada muestra de las etapas (c) y (d) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra de inmunización que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica de acetato de glatiramer del lote de referencia.

En una realización, la citoquina es una interleuquina.

En una realización preferida, la interleuquina es interleuquina-2.

En otra realización, la interleuquina es interleuquina-6.

En una realización más, la interleuquina es interleuquina-10.

En una realización añadida, la citoquina es interferón-gamma.

En una realización, el mamífero produce células T específicas del acetato de glatiramer patrón de referencia.

En otra realización, el mamífero es un roedor.

En otra realización más, el roedor es un ratón.

En una realización adicional, el ratón es un ratón hembra (SJLXBALB/C)F1.

En una realización más, la edad del mamífero es de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 semanas.

En otra realización más, las células son células de nódulos linfáticos.

En una realización, las células son células de bazo.

La invención derivada de contrato de financiación proporciona además un procedimiento para preparar un lote de acetato de glatiramer aceptable para uso farmacéutico que comprende

a.: preparar un lote de acetato de glatiramer;

b.: medir la actividad relativa del lote de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 1; y

c.: calificar el lote como aceptable para uso farmacéutico si la actividad relativa así medida es entre 80% y 125% del lote de referencia de acetato de glatiramer.

Además, la invención derivada de contrato de financiación proporciona un procedimiento para preparar acetato de glatiramer para uso farmacéutico que comprende

a.: preparar un lote de acetato de glatiramer;

b.: medir la actividad relativa del lote de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 3, y

Así, la presente invención proporciona la normalización de la medida de la actividad del GA. La prueba de actividad determina cuantitativamente la actividad biológica del GA. Esta es la primera demostración de tal prueba. Este método de normalización es fundamental para demostrar reproducibilidad lote a lote respecto a actividad y calidad de DS y DP. En el contexto de esta solicitud, DS indica el ingrediente activo, es decir, GA. Se usa DP para indicar el producto acabado, es decir, Copaxone¡. RS significa un lote de acetato de glatiramer que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 7000 Da.

La invención derivada de contrato de financiación hace uso de la observación de que células T incubadas con una citoquina, por ejemplo IL-2, proliferan en respuesta a esa citoquina (Lisak et al., 1974).

Los ejemplos que siguen describen la invención con detalle respecto a mostrar cómo se pueden hacer ciertas realizaciones específicas y representativas de la misma, siendo los materiales, aparatos y etapas de procedimiento considerados como ejemplos que están destinados a ser ilustrativos solamente. En particular, la invención no está hecha para estar limitada a los métodos, materiales, condiciones, parámetros de procedimientos, aparatos y similares específicamente referidos en el presente documento.

EJEMPLOS EXPERIMENTALES ESQUEMA DEL PROCEDIMIENTO GENERAL

Se inmunizaron ratones con 250 µg de GA RS en CFA. Se obtuvo GA RS como se describe en la Patente de U.S. No. 5.800.808 o Publicación Internacional PCT No. WO 00/05250. Se eligió GA RS basado en las propiedades químicas y biológicas que están en el alcance medio de Copaxone¡ como se ha descrito anteriormente. Después de 9-11 días se preparó un cultivo primario de células LN, y las células se incubaron con diversas concentraciones de GA RS y con muestras de prueba. Tras 18-21 horas de incubación a 37ºC en un incubador humidificado de CO2, los medios de cultivo se recogieron y se midió por ELISA el nivel de IL-2. La respuesta de células T a cada lote DS se evaluó a dos concentraciones (dentro del intervalo lineal), y el porcentaje de actividad del lote DS se calculó en relación con el del lote de GA RS.

EJEMPLO 1: PROCEDIMIENTO ESTANDAR Finalidad

La finalidad de este procedimiento fue determinar la actividad relativa de lote de GA DS in vitro, usando células T específicas de GA RS.

Equipo

Campana de flujo laminar, hemocitómetro, cubreobjetos desechables después de su uso, centrífuga, contador de células, incubador vibrante con temperatura controlada, incubador humidificado de CO2 al 5% con temperatura controlada, microscopios óptico e invertido, lector de ELISA (filtro de 450 nm), frigorífico, tijeras,

fórceps, regulador electrónico a pasos, pipetas Pipettman de 40-200 µl, Pipettman de 200-1000 µl, Pipettman de 5-40 µl, pipeteador Powerpette, jeringas de vidrio estériles, y conectores Luer.

Desechables

Criotubos, placa para ELISA de adsorción mejorada con 96 pocillos (Nunc, Cat. # 143982), placa de microprueba no estéril de 96 pocillos (Falcon Cat. # 3911), placa de cultivo de tejidos esterilizada de fondo plano con 24 pocillos (Nunc, Cat. # 143982), placas petri, tubos Eppendorf (poli(propileno)), puntas de pipeta esterilizadas de 2001000 µl, pipetas: 2, 5 y 10, bata de laboratorio, guantes, filtro de acetato de celulosa de 0,2 µ, sistema de filtración de 200 ml (Corning, Cat. # 430767), paños Kim, plataforma soporte, jeringas de 10 ml, agujas 21Gx1 ½”, jeringas de insulina y combitips (dosificadores volumétricos) de 5 ml.

Materiales y reactivos

Para el procedimiento de inmunización

Etanol al 95% (Bio Lab, Cat. # 13680605, o equivalente), etanol al 70% preparado a partir de etanol al 95% por dilución con agua destilada, tampón fosfato salino (PBS)x1 (SIGMA, Cat. # 3813, o equivalente), CFA que contiene 1 mg de mycobacterium tuberculosis (MT) (H37Ra, ATCC 255177), (SIGMA, Cat. # F-5881, o equivalente), y lote de GA RS.

Para el procedimiento de bioensayos in vitro

Etanol al 95% (Bio Lab, Cat. # 13680605, o equivalente), etanol al 70% preparado a partir de etanol al 95% por dilución con agua destilada, azul Tripán (BDH, Cat. # 3497), DCCM1 (Medio de Cultivo Celular Definido) (Beit Haemek, Cat. # 05-0101A o equivalente), RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) (Beit Haemek, Cat. # 01-100-1A), L-glutamina esterilizada 2 mM x 100 (Bio Lab, Cat. # 13.015), MEM esterilizado (Medio Mínimo Esencial) – aminoácidos no esenciales x 100 (Bio Lab, Cat. # 11.080), piruvato sódico esterilizado 1 mM x 100 (Bio Lab, Cat. # 13.016), Disolución 1 de antibiótico/antimicótico (Bio Lab, Cat. # 13.020), 2-mercaptoetanol (SIGMA, Cat. # M-7154), PBS (SIGMA, Cat. # 3813), concavalina A (Con A) (SIGMA, Cat. # C-5275), péptido (87-99) de MBP (Proteína Básica de Mielina) (BACHEM, Cat. # H-1964, o equivalente), y GA RS.

Para el ELISA Se midió IL-2 mediante estuche de ELISA: OptEIATM Set: IL-2 de ratón (Pharmingen, Cat. # 2614KI, o equivalente).

5 Animales

Se usaron ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 de entre 8-12 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), aunque se pueden usar ratones hembra (BALB/C)F1 de entre 8-12 semanas de edad de otras fuentes. Las condiciones de alojamiento y cuidado de los animales se mantuvieron en condiciones específicas

10 libres de patógenos (SPF).

Disoluciones

Tabla 1: Procedimientos para preparar disoluciones

PBS esterilizado: El contenido de un envase de PBS se disolvió en 1 litro de agua doblemente destilada (ddH2O). El tampón se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 µ y se guardó en frigorífico (2-8ºC) hasta una semana.

Azul Tripán al 2% (p/v) en PBS: Se disolvieron aproximadamente 0,5 g de azul Tripán en 25 ml de PBS filtrado y se guardaron en frigorífico hasta 6 meses.

Azul Tripán al 0,1% (v/v) en PBS: Se preparó disolución de azul Tripán al 0,1% a partir de la disolución madre de azul Tripán al 2% y se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 µ. La disolución de azul Tripán al 0,1% se guardó a temperatura ambiente durante hasta un mes.

2-Mercaptoetanol: Se añadieron 10 µl de 2-mercaptoetanol a 9,99 ml de PBS

esterilizado: esterilizado y se filtraron a través de membrana de acetato de celulosa de 0,2 µ y se guardaron en frigorífico durante hasta 3 meses.

Disolución madre de 1 mg/ml de GA RS: Se pesaron con exactitud 10 mg aproximadamente de acetato de glatiramer y se disolvieron en ddH2O a una concentración de 1,2 mg/ml. La densidad óptica (OD) de la disolución RS se midió a 275 nm. La OD se ajustó a aproximadamente 1,03 con ddH2O, y se obtuvo una disolución madre de 1 mg/ml de GA RS. La disolución se mezcló bien, se dividió en alícuotas de trabajo (200-500 µl)

y se guardaron a –20ºC hasta su uso.

MEM esterilizado x 100: La disolución esterilizada se dividió en alícuotas de 5 ml cada una, y se guardaron a –20ºC hasta su uso. Después de descongelar, la alícuota de trabajo se guardó en frigorífico durante hasta un mes.

Disolución 1 de: El envase original de 20 ml se guardó a 20ºC. El envase se

antibiótico/antimicótico: abrió y todos los contenidos se dividieron en alícuotas de 2 ml cada una y se guardaron a –20ºC hasta su uso. La alícuota de trabajo fue estable y capaz de someterse a varios ciclos de congelación-descongelación.

L-Glutamina esterilizada 2 mM x 100: Los contenidos del envase abierto se dividieron en alícuotas de 2 ml cada una y se guardaron a –20ºC hasta su uso.

Medio DCCM1 enriquecido: Para 100 ml de DCCM1 enriquecido estéril, se mezclaron conjuntamente los componentes siguientes: 1 ml de Lglutamina (2 mM). 1 ml de MEM, 1 ml de piruvato sódico (1 mM), 200 µl de Disolución 1 de antibiótico/antimicótico, 400 µl de 2-mercaptoetanol y 96,4 ml de de DCCM1. El DCCM1 enriquecido se filtró a través de filtro de acetato de celulosa de 0,2 µ y se guardó en frigorífico durante hasta 1 semana.

Péptido MBP: Banco primario: Se preparó la disolución madre de 10 mg/ml en ddH2O, se dividió en alícuotas de trabajo y se guardaron a 20ºC. Banco secundario: Se descongeló una alícuota del banco primario (10 mg/ml) y se diluyó a 1 mg/ml con ddH2O. La disolución del banco primario se dividió en alícuotas de trabajo de 50 µl cada una y se guardaron a –20ºC. Al usarla, la alícuota del banco secundario se descongeló y se diluyó con DCCM1 enriquecido para obtener una disolución de 20 µg/ml.

Disolución de Con A: Banco primario: Los contenidos de un vial de 5 mg de Con se disolvieron en 1 ml de PBS, se mezclaron bien y se dividieron en alícuotas de 50 µl cada una. Las alícuotas se guardaron a –20ºC hasta la fecha de caducidad fijada por el fabricante. Banco secundario: Una alícuota del banco primario (5 mg/ml) se descongeló y se diluyó con 4,95 ml de medio

DCCM1 enriquecido para obtener una disolución de 50 µg/ml. La disolución se dividió en alícuotas de trabajo de 100 µl cada una y se guardaron a –20ºC. Al usarla, una alícuota del banco secundario se descongeló y se diluyó hasta 1 ml (una dilución 10 veces mayor) con DCCM1 enriquecido para obtener una disolución de 5 µg/ml de Con A.

Inmunización

Se preparó emulsión de GA RS en CFA bajo condiciones estériles, es decir, en una campana de flujo laminar, usando equipo y materiales estériles.

5

Preparación de disolución de GA RS Se pesaron con exactitud 15 mg aproximadamente de GA RS y se disolvieron en PBS estéril a una concentración de 5 mg/ml.

10 Preparación de emulsión de GA RS

Se mezclaron volúmenes iguales de disolución de GA RS (5 mg/ml) y CFA. La mezcla se trasladó a una jeringa estéril de vidrio conectada a una segunda jeringa de vidrio a través de un conector Luer. La mezcla se mezcló bien trasladándola de una jeringa a otra hasta que la mezcla se emulsionó bien. Se confirmó una emulsión

15 estable cuando una gota de la emulsión flotó sobre agua sin dispersarse.

Inyección La emulsión de GA RS se trasladó a una jeringa de insulina. Después se inyectaron 100 µl de la emulsión (250 µg de Ga por ratón) en cuatro plantas de las

20 patas de cada ratón no tratado previamente (aproximadamente 25 µl en cada planta de pata). Los ratones inmunizados se usaron para la prueba in vitro 9-11 días después de inmunizar.

Preparación de un cultivo primario de células LN (células de nódulos linfáticos) 25 El cultivo primario de células LN se preparó 9-11 días después de la inmunización, de acuerdo con el procedimiento siguiente:

Procedimiento quirúrgico para la separación de células LN

La lámpara de UV se encendió 20 minutos antes de comenzar el trabajo en la campana de flujo laminar y se apagó cuando el trabajo comenzó. Antes de colocar cualquier reactivo bajo la campana, la superficie de trabajo se limpió con disolución de etanol al 70%. Se preparó medio DCCM1 enriquecido. El DCCM1 enriquecido y el medio RPMI se precalentaron a 37ºC antes de usar. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical. Cada ratón se colocó sobre su lomo y se sujetó sobre una plataforma soporte. El abdomen fue pulverizado con alcohol al 70% y se realizó una incisión media (fue normalmente suficiente una incisión de 2 cm de longitud). La piel fue entrecortada hacia las patas posteriores y se localizó LN desde las patas posteriores y delanteras. El LN se trasladó a una placa petri estéril que contenía aproximadamente 5 ml de medio RPMI estéril y las células de LN se sacaron por un émbolo de jeringa estéril. La jeringa estéril se usó para recoger la suspensión de células de la placa petri (se evitó la recogida de desechos tisulares usando agujas estériles). La suspensión de células se trasladó a un tubo estéril de 50 ml.

Recuento de células: Ejemplo de procedimiento para contar células LN derivadas de 5 ratones inmunizados

El tubo de células se llenó con medio RPMI hasta 40 ml. Las células LN se centrifugaron a 200xg durante 10 minutos a temperatura ambiente (15-25ºC). El glóbulo se resuspendió con 40 ml de RPMI. Se sacaron dos alícuotas de 50 µl cada una de la suspensión de células diluida 4 veces con 150 µl de azul Tripán al 0,1% en un pocillo de microprueba. Las alícuotas se mezclaron bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. El hemocitómetro se cubrió con un cubreobjetos. Se usó una pipeta Pipettman para cargar ambas alícuotas en la cámara superior e inferior del hemocitómetro, una suspensión en cada cámara. La mezcla se dejó sedimentar en las cámaras durante 2 minutos aproximadamente. Se procuró no introducir burbujas en la cámara. La mezcla (suspensión celular + azul Tripán ) se dejó cubrir la superficie íntegra de la cámara. Si había burbujas en la cámara, o si estaba sobrecargada, el hemocitómetro se limpió completamente y se secó con paños y las cámaras se recargaron.

Se contaron las células viables en el cuadrado central (compuesto por 25 cuadrados grandes, cada uno de 16 cuadrados pequeños, ver Fig. 3) de la cámara superior e inferior. Las células viables no absorbían el azul Tripán y por tanto se caracterizaron por un aspecto claro. Sin embargo, las células muertas eran permeables al azul Tripán y aparecían de color azul. Las células que aparecían en el borde del cuadrado central se contaron solamente si una parte de la célula estaba realmente dentro del cuadrado central. Si una célula estaba en el borde, y de ningún modo dentro del cuadrado central, no se contaba. La densidad de las células se calculó usando la ecuación siguiente:

células Número promedio de células viables (ambas cámaras) x 4 x 104 = ml

5

Las células se centrifugaron a 200xg durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se resuspendieron a una densidad de 1x107 células/ml con DCCM1 enriquecido.

10 Bioensayo in vitro El bioensayo in vitro se realizó en una placa de prueba de cultivo de tejidos con fondo plano, de 24 pocillos, con un volumen final de 1 ml.

Preparación de la curva de calibración de GA RS

15 Se descongeló una alícuota de la disolución madre de 1 mg/ml de GA RS. La disolución madre de GA RS se diluyó a 100 µg/ml (10 veces) con medio DCCM1 enriquecido y se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 µ. Se prepararon seis diluciones sucesivas de la disolución de GA RS con medio DCCM1 enriquecido entre 2-50 µg/ml, como se describe en el ejemplo de la Tabla 2.

20

Tabla 2: Ejemplo de preparación de dilciones de GA RS

CONCENTRACION DE GA RS (µg/ml): VOLUMEN (µl) DE DISOLUCION MADRE DE GA RS (100 µg/ml) VOLUMEN (µl) DE DCCM1 ENRIQUECIDO

50: 1000 1000

30: 600 1400

20: 400 1600

10: 200 1800

5: 100 1900

2: 40 1960

Preparación de diluciones de GA DS Se pesaron con exactitud 10-20 mg aproximadamente de GA DS del lote a

25 probar y se disolvieron con ddH2O a 1,2 mg/ml. Se midió a 275 nm la OD (densidad óptica) menos el blanco de la disolución. La OD de la muestra se ajustó a aproximadamente 1,03 con ddH2O para obtener una disolución madre de 1 mg/ml de GA. La disolución madre de 100 µl/ml se preparó con DCCM1 enriquecido y se filtró a

través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 µ. La disolución madre se diluyó a 10 y 20 µg/ml como se describe en la Tabla 2 para el lote RS.

Reacción del ensayo 5 Se añadió lo siguiente a la placa de cultivo tisular con fondo plano y 24 pocillos (ver un ejemplo de un modelo de placa más adelante):

GA RS 0,5 ml de células LN (densidad final, por ejemplo, 5x106 células/pocillo). 10 0,5 ml de cada dilución de GA RS, por tanto las concentraciones finales de GA RS en los pocillos fueron 25, 15, 10, 5, 2,5 y 1 µg/ml.

Muestras GA DS 0,5 ml de células LN (densidad final, por ejemplo, 5x106 células/pocillo). 15 0,5ml de cada dilución de muestra, por tanto las concentraciones finales de la muestra de prueba en el pocillo fueron 5 y 10 µg/ml. Cada prueba incluyó los controles siguientes: 1) Control negativo – células LN incubadas con un péptido control: 0,5 ml de células LN (densidad final de 5x106 células/pocillo) 20 0,5 ml de disolución de péptido de MBP (20 µg/ml) en DCCM1 enriquecido (concentración final 10 µg/ml)

2) Control positivo – células LN estimuladas con Con A (estimulante de células T inespecíficas): 0,5 ml de células LN (densidad final de 5x106 células/pocillo)

25 0,5 ml de Con A (5 µg/ml) en DCCM1 enriquecido (concentración final 2,5 µg/ml)

Ejemplo de un modelo de placa

GA RS* 1 µg/ml: GA RS* 2,5 µg/ml GA RS* 5 µg/ml GA RS* 10 µg/ml GA RS* 15 µg/ml GA RS* 25 µg/ml

Muestra 1 5 µg/ml: Muestra 1 10 µg/ml

Muestra 2 5 µg/ml: Muestra 2 10 µg/ml

Muestra 3 5 µg/ml: Muestra 3 10 µg/ml Control Negativo Control Positivo

GA RS* -Patrón de referencia de acetato de glatiramer

Se cambió la densidad de las células dependiendo de su respuesta al GA. Los cultivos se guardaron a 37ºC en un incubador humidificado de CO2 al 5% durante 1821 hrs. La placa se centrifugó a 200xg durante 10 minutos a temperatura ambiente.

5 Los sobrenadantes se recogieron en criotubos. Los sobrenadantes se dividieron en alícuotas de trabajo para evitar congelación/descongelación repetida de las muestras. Los sobrenadantes se guardaron a –20ºC durante hasta una semana. La campana se limpió con disolución de etanol al 70% y se secó con paños Kim. Los guantes se eliminaron y las manos se lavaron inmediatamente con desinfectante.

10

ELISA para detección de IL-2

Todas las muestras se analizaron por triplicado. Cada prueba en placa incluyó lo siguiente: 1) Curva patrón de IL-2 – que incluye al menos 6 concentraciones distintas de 15 cero de IL-2. 2) Blanco

+ primer anticuerpo, sin patrón de IL-2, + segundo anticuerpo (punto de origen). 3) Muestras Los medios de cultivo de GA RS, muestras de prueba y controles se diluyeron con

20 DCCM1 como sigue: a) Una dilución al doble de la muestras de 1 y 2,5 µg/l de GA RS y de la muestra control negativo; b) diluciones de 5-10 veces de las muestras de 5-25 µg/ml de GA RS y de las muestras de prueba ; y 25 c) dilución de 15-20 veces de la muestra de control positivo (Con A).

El protocolo de ELISA para medir niveles de IL-2 se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Si la densidad óptica de cualquier muestra alcanzaba los límites superior/inferior del lector de placa, la muestra se volvió a analizar a una dilución superior/inferior, respectivamente.

30

Cálculos y criterios de aceptación

Medidas de ELISA

La absorbancia media de la muestra del blanco (punto de origen de patrón de IL-2) se restó de la absorbancia de patrones, muestras y controles y se calculó para cada grupo de muestras triplicadas la media (absorbancia – blanco), desviación estándar (SD), y desviación estándar relativa (RSD).

5

Elementos Repetitivos de las Muestras

Siempre que había un valor anómalo sospechoso era necesario garantizar que el valor anómalo estaba basado estadísticamente, con el fin de dilucidar cualquier posible problema que podía haber afectado a los resultados globales. Si la RSD entre

10 medidas de muestras triplicadas era mayor que 10% y la OD (densidad óptica) media del blanco era > 0,300, se aplicó el rechazo del valor anómalo usando la prueba Q de Dixon. Se usó la prueba Q de Dixon para rechazar posibles valores anómalos cuando no se satisfacían los criterios relevantes de aceptación en una prueba basada en elementos repetitivos. La prueba de valores anómalos era aplicable solamente a

15 medidas de elementos repetitivos de la misma disolución patrón. Para menos de 10 observaciones, solamente 1 valor anómalo pudo ser determinado y eliminado. Este procedimiento extendió el uso de la prueba Q de Dixon al rechazar valores anómalos de cualquier número de medidas de muestras repetitivas entre 3 y 7, con un nivel de confianza de 95%.

20

Procedimiento

El valor anómalo sospechoso se denominó X1. Todas las otras medidas se marcaron en relación con el valor anómalo sospechoso, por ejemplo, X2 fue el valor junto al valor anómalo sospechoso, X3 fue el segundo valor desde el valor anómalo

25 sospechoso, Xk fue el más lejano desde el valor anómalo sospechoso, y Xk-1 fue el segundo valor desde el más lejano, etc. Para 3-7 elementos repetitivos se usó la ecuación siguiente:

X 2 − X 1 XK − X 1

El valor k apropiado se determinó a partir de la fracción calculada usando la 30 Tabla 3. Tabla 3 : Valores de k

No. de Observaciones (k): Valor a P95

3: 0,94

4: 0,76

5: 0,642

6: 0,560

7: 0,507

Si no se identificó valor anómalo alguno por la prueba Q de Dixon, pero el % de diferencia entre 2 de los 3 elementos repetitivos no fue mayor que 10%, se usaron los dos elementos repetitivos más próximos para calcular el % de actividad. En otro caso,

5 la prueba ELISA se repitió para esta muestra.

Se aplicó rechazo de valores anómalos de muestras con OD < 0,300 (blanco, control negativo y puntos patrón inferiores). Cuando se localizó un valor anómalo, se rechazó y se dio información. Se usaron medidas de duplicados para el cálculo del % de actividad.

10

Muestras de blanco

La absorbancia de cada una de las muestras de blanco fue � 10% de la absorbancia media de la concentración más alta del patrón IL-2. Si uno de los elementos repetitivos del blanco estaba fuera de los límites anteriores, se rechazó y se

15 usaron muestras duplicadas.

Curva Patrón de IL-2 La curva patrón de IL-2 se representó gráficamente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se pudieron rechazar patrones de IL-2 que presentan

20 mala sensibilidad o error de tratamiento de muestras si permanecían en la curva un mínimo de seis patrones de IL-2 de concentración distinta de cero. La concentración de patrón retro-calculada tenía un error relativo (RE) mayor que el 20% para el punto de calibración inferior y ±15% para las demás concentraciones. La curva de calibración de IL-2 se obtuvo a partir de al menos seis puntos de concentración distinta de cero (al

25 menos 17 puntos de calibración), cubriendo el intervalo de concentraciones esperadas. El intervalo de la curva patrón se pudo truncar si fallaban las concentraciones altas o bajas. El R2 de la curva de regresión lineal fue � 0,97.

Controles de Ensayo

30 La concentración de IL-2 se calculó en todas las muestras a partir del gráfico de regresión lineal del patrón IL-2, utilizando la ecuación de la curva de regresión lineal. La concentración final de IL-2 se calculó en todas las muestras multiplicando por el factor de dilución de las muestras.

Control Negativo (Péptido de la MBP)

La concentración final de IL-2 en al menos 2 de los 3 elementos repetitivos de la muestra de control negativo estuvo por debajo de los niveles de IL-2 medida para el punto de calibración más bajo de la curva de GA RS.

Control Positivo (Con A)

La concentración final de IL-2 en al menos 2 de los 3 elementos repetitivos de la muestra de control positivo fue similar al, o estuvo por encima del, nivel de IL-2 en el punto de calibración más alto de la curva de GA RS.

Cálculo de la actividad relativa de lotes de GA DS

Curva de GA RS

La curva de GA RS se representó gráficamente en una escala log-log, con log de concentración de IL-2 en el eje-y y log de concentración de GA RS en el eje-x. La curva de calibración se obtuvo a partir de al menos cinco concentraciones distintas de cero (al menos 14 puntos de calibración). Se rechazaron puntos de calibración como se describe para los puntos de patrón de IL-2. La curva de regresión mejor ajustada se calculó mediante los puntos patrón. El R2 fue � 0,97. La pendiente (≥) fue � 0,77.

Análisis de paralelismo

La curva dosis-respuesta de cada muestra de prueba se representó gráficamente sobre una escala log-log, con log de la concentración de IL-2 sobre el eje-y y log de la concentración de GA DS en el eje-x. La mejor curva de regresión ajustada se calculó mediante los puntos de muestras. La pendiente (≥*) estuvo dentro del siguiente intervalo:

≥ x 0,635 �≥* �≥ x 1,365

Si ≥* estaba fuera de los límites, la prueba in vitro se repitió por duplicado (dos preparaciones separadas de muestras). Si ≥* fallaba en una repetición de la prueba, el lote se rechazó. Si ≥* estaba dentro de los límites en ambas repeticiones de la prueba, se calculó el % de actividad y los límites de confianza al 95%.

Cálculo del % de actividad y de los límites de confianza

El cálculo del error aleatorio a usar para determinar los Límites de Confianza (que tienen una probabilidad del 95% de incluir el “verdadero porcentaje de actividad”) se obtuvo usando ANOVA. Esta técnica estadística separa la variación total entre respuestas observadas en componentes separados, a saber:

1.: debido a dosis-respuesta lineal

2.: debido al efecto medio de la preparación

imagen1 Modelo

3.: debido a desviación del paralelismo

4.: debido a desviación de la linealidad

Error

5. debido a la variación residual entre elementos repetitivos Aleatorio

Los componentes 3 y 4 se incluyeron en el término del error aleatorio debido a

5 desviaciones no significativas de la linealidad y paralelismo, respectivamente. La suma total de los cuadrados se dividió en 3 componentes (Regresión-SS, Preparación-SS y Error-SS), el número apropiado de grados de libertad y la prueba-F de significación.

Se calculó el % de actividad del lote examinado y los límites de confianza al 95% para la actividad calculada como se describe a continuación:

10

Algoritmo Computacional para el Cálculo de la Actividad Relativa y Límites de Confianza al 95%

Etapa 1: Calcular la transformación de los datos dados (Lote de GA. y GA. RS.) en 15 escala log10:

Ykl = log10(respuestakl); i = 1,... nk Xkl = log10(dosiskl); i =1,…, nk

20 donde k=1,2 es un índice de preparación de lote de GA. y GA. RS, respectivamente; n1 y n2 son los números totales de medidas realizadas para el lote de GA. y GA. RS, respectivamente. Así, N = n1+n2 es un número total global de observaciones.

25 Etapa 2: Calcular la pendiente común para la regresión lineal basada en todos los puntos de datos medidos a través de la fórmula:

N

ƒ (Yj − Y)( • Xj − X )

j=1

≥= N ; ƒ ( Xj − X )2

j=1

donde Y es un valor medio global de log10(respuesta); X es un valor medio global de log10(dosis).

Etapa 3: Calcular la suma de los cuadrados debidos a la regresión sobre log10(dosis) como:

imagen1

Etapa 4: Calcular la suma de los cuadrados de errores aleatorios como:

imagen1

10 dondeYk , Xk son valores medios de log10(respuesta) y log10(dosis), respectivamente, de la preparación k.

Etapa 5: Calcular el término del Error Cuadrático Medio como sigue:

15 DFERR(grados de libertad del error aleatorio) = N-3; MSERR = SSERR/DFERR.

Etapa 6: Usar las tablas estadísticas de distribución-t con el fin de encontrar el valor apropiado de la estadística-t:

t = t(0,975, DFERR).

Etapa 7: Calcular la estimación puntual de la actividad relativa como sigue:

Y1−Y2

−( X 1− X 2)

≥

% de Actividad = 10 ∇ 100%

5 Etapa 8: Calcular la expresión indicada por C a través de la fórmula:

SS REG

C = 2

SS REG − MS ERR .t

Etapa 9: Calcular los logaritmos de los límites inferior y superior del intervalo de 10 confianza al 95%:

imagen2

Etapa 10: Transformar en la escala original los valores calculados en la etapa anterior

tomando antilogaritmos de los log(límites) resultantes y multiplicar por 100%. La 20 actividad calculada de lote de GA DS no fue menor que 80% y no mayor que 125% de

la actividad expuesta. Los límites de confianza del error (P=0,95) de la actividad

calculada fueron menores que 70% y no mayores que 143% de la actividad expuesta.

Si el lote estaba fuera de los límites anteriores, la prueba in-vitro se repitió por

duplicado. Si los resultados de ambas repeticiones de pruebas estaban dentro de las 25 especificaciones, el lote era aceptable. Si una repetición de prueba fallaba, el lote se

rechazaba.

Documentación Se registró el recuento de células LN y el modelo de placas de ELISA. Se 30 anotaron los registros originales del lector de ELISA y los resultados en el formulario.

EJEMPLO 2: DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO ESTANDAR DEL EJEMPLO 1 Experimento 2A: Perfil de citoquinas segregadas por las células T específicas de GA RS

Las células LN se obtuvieron a partir de ratones hembra (SJLxBALB/C)F1 inmunizados con 250 µg de GA RS en CFA 9-11 días antes de ser cultivadas en

5 presencia de diversas concentraciones de GA RS. Las células se incubaron con GA RS durante 18-24 horas a 37ºC en un incubador humidificado de CO2 al 5%. Posteriormente, los cultivos se centrifugaron y los sobrenadantes se recogieron y analizaron para las citoquinas por ELISA.

El ELISA se realizó usando anticuerpos biotinilados específicos para la

10 citoquina y conjugado de estrepavidina-peroxidasa de rábano (HRP) para detección. Cada prueba en placa incluyó control de blanco (primer y segundo anticuerpo sin el patrón de citoquina). Cada prueba en placa incluyó también muestras para control de calidad (CQ) (tres concentraciones de patrón de citoquina dentro del intervalo lineal de los ensayos. Cada prueba in vitro incluyó un control positivo (Con A, un estimulante de

15 células T inespecíficas) y un control negativo (no GA o cualquier otro antígeno). Todas las citoquinas se midieron después de 18-24 horas de incubación. Tras 72 horas de incubación se analizaron nuevamente los niveles de TGF-≥, IL-10 e IL-4. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

20 Tabla 4: Perfil de citoquinas

Citoquina: Niveles de secreción

IL-2: ++

INF-�: ++

IL-6: +

L-10: +

L-13: -

TGF-≥: -

IL-4: -

TNF-γ: -

En la Tabla 4, los niveles máximos medidos para cada citoquina están representados en unidades arbitrarias: (-) < límite de detección; (+) hasta 400 pg/ml; y (++) > 400 pg/ml. La Tabla 4 muestra que como respuesta al GA RS en cultivo, las

25 células LN segregaban IL-2, INF-�, IL-10 e IL-6, mientras que no se detectaron en los medios de cultivo TNF-γ, IL-4, IL-13 y TGF-≥. Estos resultados indican que las citoquinas producidas por las células T específicas de GA RS son de tipo Th0. Se debe

advertir que se observó un perfil Th0 en diferentes protocolos de inmunización, es decir, inmunización con IFA o con dosis bajas de GA.

Puesto que IL-2 es un buen marcador para la activación de células T, y como la secreción de IL-2 en respuesta al GA RS era muy reproducible, con una relación dosis-respuesta lineal, parecía que la IL-2 era la citoquina óptima para medir la activación de células T.

Experimento 2B: Optimización del procedimiento de inmunización

Se realizaron varios experimentos para establecer el protocolo de inmunización óptima. El primer experimento verificó el efecto de la dosis de GA RS (antígeno inmunizante) sobre las respuestas de células T en los LN y en el bazo. Se inmunizaron dos grupos de 10 ratones cada uno con 250 µg de GA en CFA (grupo 1) (como en la prueba bloqueante de la EAE) o con 10 µg de GA en CFA (grupo 2). Se prepararon cultivos primarios a partir de los LN y de los bazos de los ratones inmunizados. Los cultivos se incubaron durante una noche con diversas dosis de GA RS y después los medios de cultivo se recogieron y analizaron para la IL-2 como en el experimento 2A. Los resultados de la Fig. 4 muestran claramente que en ambos protocolos de inmunización los niveles de IL-2 segregada por las células LN son altos comparados con los segregados por células del bazo. Sobre la base de estos resultados se decidió usar cultivos primarios de células LN para el ensayo. Además, las dosis de GA RS inyectado en ratones no afectaban a la respuesta de células T en cultivo. Tanto las células LN como las del bazo segregaron cantidades similares de IL-2 con independencia de la dosis inmunizante de GA RS. Esto indica que el procedimiento de inmunización es robusto, y que incluso grandes variaciones en la dosis inmunizante de GA RS no afectan al resultado inmunológico.

Para optimización adicional del protocolo de inmunización, a un grupo se le inyectó 250 µg de GA RS en CFA y a un segundo grupo 10 mg de GA en ICFA. La dosis de GA RS en el segundo grupo fue más alta porque se usó ICFA, un adyuvante más débil. Diez días después se analizó in vitro la respuesta de las células LN de ambos grupos al GA RS. La Fig. 5 muestra que la inmunización con 250 µg de GA RS en CFA indujo una respuesta mucho más fuerte en cultivo, aunque se usó una dosis de antígeno mucho más baja.

Sobre la base de estos hallazgos y del hecho de que 250 µg/ratón de GA en CFA son eficaces en bloquear la EAE (bloqueo de la EAE en al menos 80% en esta raza de ratones), 250 µg/ratón de GA en CFA parece ser la dosis óptima.

Se generaron células T específicas normalmente en un plazo aproximado de 10 días, después de una sola inmunización con CFA. La Fig. 6 muestra la respuesta de las células LN al GA RS en cultivo, preparado 9, 10 y 11 días después de la inmunización. Como la dosis-respuesta de la secreción de IL-2 fue similar todos los días, el periodo de inmunización puede durar 9-11 días.

Experimento 2C: Optimización de las condiciones de prueba in vitro

Se realizaron varios experimentos para establecer el protocolo óptimo para la reacción in-vitro. Estos estudios incluyeron la optimización de las condiciones de cultivo, tiempo de incubación, estabilidad de la IL-2 en muestras de prueba y estabilidad del GA RS a –20ºC.

i) Medios de cultivo

Los cultivos de células linfoides de ratón se mantienen normalmente en medio RPMI, suplementado con suero normal de ratón al 1%. El suero normal de ratón puede contener IL-2 endógena que se puede detectar por los anticuerpos monoclonales antiIL-2 de ratón usados en el estuche ELISA. Además, el uso de diferentes lotes de suero normal puede aumentar las variaciones interdiarias de la prueba in vitro. Para evitar contaminación cruzada con IL-2 endógena de ratón, y para reducir las variaciones interdiarias del método, se analizaron las respuestas de las células T específicas de GA en 4 medios de cultivo diferentes: 1) RPMI + suero normal de ratón al 1% (NMS); 2) RPMI + suero de bovino fetal al 1% (FBS) (la IL-2 de bovino no es reconocida por la anti-IL-2 de ratón usada en el estuche ELISA); 3) Biotarget (medios libres de suero producidos exclusivamente por BeitHaemek, Israel); y 4) DCCM1 (medios libres de suero producidos por diversos fabricantes).

La Fig. 7 muestra los resultados de un experimento representativo que compara la respuesta de células LN al GA RS en diferentes medios de cultivo. Las mejores respuestas se observaron cuando se usaron medios libres de suero. El intervalo dosis-respuesta se desplazó a la izquierda en ausencia de suero. Esto se puede explicar por estudios previos que demuestran que el GA se une a la albúmina y otras proteínas del suero. Esta unión puede reducir la disponibilidad del GA en cultivo para las interacciones con APCs, y por tanto se requieren concentraciones más altas de GA para estimular a las células T. Sobre la base de estos resultados, el medio óptimo parece ser el medio DCCM-1.

ii) Cinética de secreción de IL-2

La IL-2 es un factor de crecimiento autocrino y paracrino que es esencial para la proliferación clonal de células T y para las propiedades funcionales de células B y macrófagos. Tras la estimulación del cultivo con GA RS, se segrega IL-2 por las células T activadas específicas del GA y posteriormente es consumida por las células LN. Se realizaron estudios cinéticos de secreción de IL-2 en un intento para determinar el tiempo óptimo (pico) para la recogida de los sobrenadantes, tras la estimulación con GA. Se cultivaron e incubaron células LN con diversas concentraciones de GA RS a 37ºC en un incubador humidificado de CO2. En los intervalos de tiempo indicados en la Fig. 8, se recogieron alícuotas y las células se separaron por centrifugación. Los sobrenadantes se guardaron a 20ºC y al final del experimento se analizaron por ELISA para la IL-2.

La Fig. 8 muestra que el pico de niveles de IL-2 en los medios de cultivo está entre 18-21 horas. La reducción en niveles de IL-2 en muestras recogidas desde 24-48 horas se puede explicar por el consumo de IL-2 por las células LN. Por tanto, el momento óptimo para la recogida de sobrenadantes parece ser después de 18-21 horas de incubación.

iii) Medida de citoquinas

El método se basa en medidas precisas de IL-2 en muestras de GA RS y muestras de prueba. Durante los experimentos, los niveles de IL-2 se midieron por OptEIA (Pharmingen, Cat. # 2614KI) – un estuche de ELISA específico para IL-2 de ratón. Este estuche de ELISA es muy sensible y los resultados son exactos y reproducibles.

iv) Estabilidad de la IL-2 en muestras de prueba a –20ºC

En la mayor parte de los experimentos realizados, los medios de cultivo se recogieron y guardaron a –20ºC antes de ser analizados por el ELISA. Estudios preliminares de la estabilidad de la IL-2 en medios de cultivo demuestran que la citoquina es estable durante una semana a –20ºC (Fig. 9). Por tanto, los medios de cultivo de las muestras de prueba in-vitro se pueden guardar a –20ºC durante hasta una semana antes de medir la IL-2. Los resultados de este experimento demostraron también que los resultados de ELISA son muy reproducibles – los niveles de IL-2 medidos en las muestras fueron prácticamente idénticos en dos pruebas en placa de ELISA realizadas en dos días diferentes distanciados una semana.

v) Estabilidad de disolución de GA RS a –20ºC

Para probar la estabilidad de disolución de GA RS a –20ºC, la dosis-respuesta de una disolución de GA RS se analizó inmediatamente después de la preparación, y después de almacenamiento durante 5 meses a –20ºC. La Fig. 10 demuestra que prácticamente no hay diferencia alguna en las curvas dosis-respuesta de disolución de GA RS antes y después del almacenamiento durante 5 meses a –20ºC. Por tanto, se pueden preparar alícuotas de disolución de GA RS y guardarlas a –20ºC durante al menos 5 meses antes de usar.

Experimento 2D: Determinación de Intervalo Lineal de Curvas de Calibración de GA RS

La validación estadística se realizó basada en curvas de calibración de GA RS calculadas y evaluadas separadamente para cada una de las 21 placas recibidas para el análisis. Estas 21 muestras se recogieron en tiempos diferentes a lo largo de un periodo de aproximadamente cuatro meses. El intervalo de concentraciones de GA para las placas dadas varió de 0,25 a 50 µg/ml. Las siguientes características de validación derivadas de las curvas de calibración de GA RS constituyeron el principal interés del análisis :

1.: Transformación óptima para asegurar límites más amplios del intervalo lineal;

2.: Determinación de los límites del intervalo lineal;

3.: Criterios globales para aceptar una curva de calibración;

4.: Estimación de la exactitud y precisión del ensayo;

5.: Valoración de la fiabilidad de duplicados (ver el párrafo más adelante)

La naturaleza de los experimentos fue tal que había típicamente 3 elementos repetitivos (triplicados) en cada punto de calibración. Sin embargo, en algunos casos, cuando no se pudo proporcionar una medida de triplicados, la valoración de la fiabilidad de duplicados se hizo esencial.

Linealidad de la Relación Dosis de GA-Respuesta

La base de la mayoría de los aspectos de la discusión de la validación presentada más adelante fue un modelo de regresión lineal que relacionaba la concentración de IL-2 (pg/ml) con la concentración de GA (µg/ml). La asunción de la linealidad de esta relación fue necesaria para el ajuste apropiado del modelo de regresión lineal. Los datos se representaron gráficamente en una escala Lineal-Lineal. La misma relación se transformó en escala Log-Log, así como en escala Log-Lineal, y una escala Log-Raíz Cuadrada. La transformación Log-Log demostró las características lineales más adecuadas. Por tanto, la forma elegida del modelo de regresión lineal fue la Log-Log:

Log10 (conc. IL-2) = a + ≥*Log10(conc. GA) + error

La variable respuesta fue una media transformada logarítmicamente de los 3 elementos repetitivos medidos en cada punto de calibración. Este modelo se ajustó a cada muestra de calibración y se calculó la estadística apropiada (R2, ordenada en el origen, y pendiente) para cada curva ajustada. El valor de R2 reflejó la relación de la suma residual de cuadrados (RSS) a la suma total de cuadrados (TSS) a través de la fórmula:

R2 = 1 – RSS/TSS

Determinación del Intervalo Lineal El intervalo lineal se determinó sobre la base de los criterios siguientes:

1.: Inspección visual de la representación gráfica de log10(conc. IL-2) frente a log10(conc. GA);

2.: El diagnóstico de la influencia de la regresión, tal como el conocido de Cook en la técnica estadística de las distancias.

3.: La evaluación de la variación de los valores de precisión y exactitud calculados para las curvas de calibración para varias definiciones del posible intervalo lineal proporcionó una evaluación visual de la linealidad de la relación. No hubo evidencia alguna de no-linealidad de la relación dentro del intervalo lineal elegido de 1-25 µg/ml.

Experimento 2E: Determinación de Criterios para la Curva Patrón de GA RS

Se determinó que los parámetros de validación derivados de curvas de calibración de GA RS, ajustadas dentro de los límites seleccionados (1-25 µg/ml) del intervalo lineal, son los siguientes:

1.: R2 de los ajustes por regresión lineal de log10(conc. IL-2) frente a log10(conc. GA) para cada placa del estudio;

2.: Pendientes y ordenadas en el origen para estos ajustes a línea recta;

3.: Exactitud calculada en cada punto de calibración para cada placa; y

4.: Precisión calculada en cada punto de calibración para cada placa.

Con el fin de calcular la exactitud y precisión, se usó cada curva de calibración

para calibrar (retro-calcular) las concentraciones de GA dados los valores de

concentración de IL-2:

og ( 10 ConcI. L−2)i−γ)/ ≥

5 X1-retro = 10 (l

i = 1,2,3 – índice de triplicados. La medida básica de la in(exactitud) usada fue la diferencia porcentual entre la media de los cálculos de concentración y la verdadera concentración en las muestras 10 triplicadas:

Inexactitud = ([Media (X1-retro) – conc. GA]/conc. GA)α100%.

La medida básica de la precisión usada fue la desviación estándar relativa 15 (RSD o CV) de los cálculos de concentración de los triplicados:

precisión = CV(X1-retro) = [Desv. Est.(X1-retro) /Media(X1-retro)]α100%.

El objetivo del análisis fue proponer criterios de aceptación para la curva de

20 calibración ajustada que garantizaran que la exactitud y precisión del método fuesen adecuados. Los criterios de aceptación estuvieron basados en el R2 y la pendiente de la curva de calibración del GA RS. Aproximadamente el 80% de las placas se pudo caracterizar por pequeños valores de inexactitud (<13%) y por buena precisión (1,1%6,7%). Para estas 16 curvas patrón que “funcionan bien”, se obtuvieron los resultados

25 siguientes:

1.: Altos valores de R2 (>0,98);

2.: Valores de pendiente relativamente altos, que reflejan las relaciones dosis respuesta (>0,78 en 15 de 16 placas). Puesto que la mayoría de las curvas de calibración se caracterizaron por R2

30 relativamente alto (media = 0,99) y por pendientes relativamente grandes (media = 0,87), en contraste con las placas excluidas que tenían tanto R2 relativamente bajo (media = 0,94) como pendientes algo planas (media = 0,72), los criterios globales de aceptación para las curvas de calibración se consideraron en términos de R2 y pendiente. La simple regla que define los parámetros de aceptación estuvo basada en

35 el cálculo de los puntos límite para la pendiente y R2 separadamente y localizados en medio del valor máximo para las curvas rechazadas (máx_R2 =0,95 máx_pendiente =0,77) y el valor mínimo para las curvas aceptadas (mín_R2 =0,98 mín_pendiente = 0,77). Por tanto, los criterios de aceptación resultaron como sigue:

1.: R2 � 0,97;

2.: pendiente � 0,77.

Estos criterios se aplicaron a al menos cinco concentraciones (triplicadas) diferentes para ajustar la curva de calibración en el intervalo 1-25 µg/ml de concentración de GA. Además, el intervalo de valores de la ordenada en el origen fue entre 1,42-1,78, media = 1,58. Este intervalo fue similar para las 16 placas idóneas y las 5 eliminadas.

Se calculó la exactitud y precisión para cada curva, y para cada concentración entre las situadas sobre la placa. Estos valores individuales (para cada curva y concentración) se promediaron sobre:

1.: Diferentes concentraciones para cada curva;

2.: Diferentes curvas para cada concentración; y

3.: Sobre todas las curvas y concentraciones.

La conclusión relevante fue que para las curvas de calibración de GA RS basadas en al menos cinco puntos de calibración diferentes en el intervalo lineal 1-25 µg/ml, cuando la curva de calibración estuvo restringida a tener R2 � 0,97 y pendiente

� 0,77, la exactitud y precisión media resultante se calculó como:

1.: El valor medio (± SD) de la exactitud para el método fue: 8,0% ± 2,3%;

2.: El valor medio (± SD) de la precisión para el método fue: 2,9% ± 1,7%.

Valoración de la Fiabilidad de las Curvas de Calibración de GA RS Basadas en Medidas de Duplicados

Se realizó una comparación de la estadística descriptiva de la exactitud y precisión del ensayo con el fin de evaluar la fiabilidad de las curvas de calibración de GA RS ajustadas usando medidas de duplicados en cada punto de calibración. Además, se estudiaron los valores individuales de exactitud y precisión (para cada curva y concentración) para las tres posibles selecciones de medidas de duplicados, de entre los triplicados dados. Al centrarse en aquellas curvas que satisfacían los criterios de aceptación descritos en la sección anterior y ajustadas en los límites del intervalo lineal definido de 1-25 µg/ml, resultó evidente que cuando por algunas razones no se puede proporcionar una medida de triplicados, se puede sustituir exitosamente por medida de duplicados.

Tabla 5: Sumario de la Estadística Descriptiva de Exactitud y Precisión

Triplicado: Duplicado (1,2) Duplicado (1,3) Duplicado (2,3)

Exactitud: Precisión Exactitud Precisión Exactitud Precisión Exactitud Precisión

Media: 8,00 2,93 8,13 2,53 7,98 2,88 8,40 2,40

D.E.: 2,31 1,72 2,80 1,66 2,45 2,13 2,79 1,53

Mín.: 5,23 1,10 4,93 0,95 5,21 0,93 4,97 0,81

Máx.: 12,79 6,67 12,51 6,33 12,44 9,24 13,41 5,99

5

Las medias (±SD) de la exactitud y precisión del método basado en triplicados fueron 8,0% ± 2,3% y 2,9% ± 1,7%, respectivamente (Tabla 5). Las medias (±SD) de la exactitud y precisión del método basado en duplicados fueron:

10 1. Exactitud: 8,1% ± 2,8%; Precisión: 2,5% ± 1,7%;

2.: Exactitud: 8,0% ± 2,5%; Precisión: 2,9% ± 2,1%; y

3.: Exactitud: 8,4% ± 2,8%; Precisión: 2,4% ± 1,5%.

Experimento 2F: Determinación de la Relación Estadística

15 Se descubrió que la in(exactitud) media del método es 8,0% con SD = 2,3%. El objetivo fue desarrollar una prueba fiable para la comparación de pendientes de dos líneas log(dosis)-log(respuesta) de un nuevo lote de GA frente a GA RS. La prueba tuvo en cuenta la in(exactitud) del método mencionado anteriormente. El límite más alto de la región de tolerancia individual aproximada del 95% para la in(exactitud)

20 media del método sirvió como un valor umbral: Media + 2*SD = 12,6%. Por tanto, se consideraron no significativas las variaciones dentro del intervalo ±12,6%.

Sigue una explicación matemática detallada de la relación entre ≥* (la pendiente de la línea del lote), ≥ (la pendiente de la línea patrón) y el valor de la in(exactitud) más alto permitido. Sin pérdida de generalidad, solamente el caso en el

25 que ≥*> ≥ será demostrado con detalle (debido a la simetría existente, la extensión de la prueba para el caso en el que ≥*< ≥ es obvia). El valor de la dosis retro-calculada, para un log(respuesta) dado fue:

(Y-γ)/≥

Xretro = 10, donde Y = log10(concentración IL-2).

La fórmula para el cálculo de la in(exactitud) fue:

(Y-γ)/≥

in(exactitud) = [(10-Xexacto)/Xexacto]*100%.

Ybajo e Yalto fueron los valores más bajos y más altos de log(respuesta) permitidos para la in(exactitud) más alta permitida de ±12,6%. Así, la región donde la hipótesis de la igualdad de pendientes se iba a aceptar fue:

imagen1 (Ybajo−a)/ ≥

[( 10 -X1)/X1]α100% � -12,6% (Yalto−a)/ ≥

[( 10 -X2)/X2]α100% � -12,6%

(Ybajo−a)/ ≥

10 /X1 � 0,874 (Yalto−a)/ ≥

10 /X2 � 1,126

Por tanto, los límites de la igualdad de las pendientes fueron:

imagen1 Ybajo = γ + ≥∇ log(X1 ∇ 0,874)

Yalto = γ + ≥∇ log(X2 ∇ 1,126)

La pendiente de una línea recta se calculó como sigue:

≥* = (Yalto – Ybajo)/(logX2 – logX1) = [≥∇log([X2/X1]∇[1,126/08,74])]/log(X2/X1)

≥ =[≥∇log(1,288)]/log(X2/X1) = ≥∇(1 + log(1,288)/log(X2/X1))

Asumiendo para el caso particular en consideración que X2/X1 = 2 (para niveles de dosis 5 y10 µg/ml), ≥* se calculó como sigue:

≥*= ≥∇(1 + log(1,288)/log2) = ≥∇1,365

Combinando este resultado con el obtenido para el caso simétrico en el que ≥* < ≥, los límites se calcularon como:

imagen1 ≥* � ≥∇1,365

≥* � ≥∇0,635 En los datos dados, todos los valores de la pendiente estuvieron dentro de los correspondientes límites críticos, lo que significa que no se observó desviación alguna de la asunción de paralelismo. Una vez que un lote fue aceptado como estadísticamente válido (existencia de linealidad y paralelismo ha sido demostrada), se calculó la relación de actividad de la preparación de prueba con relación al patrón. Esto se hizo en un ensayo de líneas paralelas ajustando líneas rectas paralelas a los datos y determinando la distancia horizontal entre ellas:

YT − YS

M= log β = − ( XT − XS );

B

donde β indica la actividad, YS ,YT , XS , XT fueron las medias de log(respuestas) y log(dosis) de las preparaciones patrón y de prueba, respectivamente. B – fue una pendiente común para las líneas log(dosis)-log(respuesta) patrón y prueba. El cálculo por mínimos cuadrados de la pendiente común – B fue un promedio ponderado de los cálculos por mínimos cuadrados de dos pendientes separadamente de la línea patrón y la línea de prueba. Tomando el antilogaritmo de la expresión anterior, se pudo obtener una estimación puntual del “% exacto de actividad” de una preparación de prueba con relación a su patrón:

YT −YS

−( XT − XS

B

Actividad = 10 ) ∇100%

EJEMPLO 3: VALIDACION DEL PROCEDIMIENTO ESTANDAR DEL EJEMPLO 1

El objetivo del análisis, presentado más adelante, fue establecer las especificaciones de liberación validadas para la actividad relativa de un lote de GA. Un lote de GA se consideró válido si se cumplieron los siguientes criterios, basados en inferencia estadística:

1. Ninguna violación de las asunciones implicadas en la aproximación analítica del bioensayo:

(a): Independencia y normalidad del log(respuesta);

(b): Homogeneidad de la varianza del log(respuesta);

(c): Ningún valor anómalo;

(d): Paralelismo (prueba de la relación de pendientes no significante)

2.: La estimación puntual de la actividad relativa estuvo dentro de un intervalo preespecificado: 80% -125%; y

3.: Los límites de confianza al 95% para el valor de la “actividad relativa exacta” estuvieron dentro de un intervalo de confianza pre-definido más amplio: 70% a 143%. El modelo asumió que las preparaciones del patrón y de prueba deben

comportarse como si una fuera una simple dilución de la otra. Esto significa que las líneas log(dosis)-respuesta para las dos preparaciones no debe deben desviarse significativamente de la linealidad y paralelismo. Así, un antilogaritmo del desplazamiento horizontal constante entre estas líneas rectas pudo servir como un cálculo de la relación de actividad. Estos dos requisitos, linealidad y paralelismo, constituyeron un concepto de la validez del ensayo. La comprobación de la validez fue un prerrequisito para la valoración de la actividad relativa y sus límites de confianza.

El cálculo del error aleatorio fue necesario para el cómputo de los límites de confianza para el valor exacto de la actividad relativa. Esta medida se obtuvo por la implementación de la técnica estadística conocida como “Análisis de la Varianza” (ANOVA). Por tanto, los supuestos estadísticos clásicos del ANOVA deben haber sido satisfechos. Los requisitos para el análisis estadístico de un modelo de bioensayo de líneas paralelas fueron como sigue:

1.: Las respuestas estuvieron normalmente distribuidas independientemente sobre sus valores esperados;

2.: La varianza de la respuesta no estuvo afectada por el valor medio de la respuesta;

3.: No hubo valores anómalos;

4.: La relación entre el log(dosis) y respuesta se pudo representar por una línea recta a lo largo del intervalo de dosis; y

5.: La línea recta de la preparación de prueba fue paralela a la del patrón.

Los datos de análisis de lotes se obtuvieron a partir de diferentes experimentos realizados en días diferentes por diferentes operadores. Se realizaron pruebas de validación del procedimiento estándar del Ejemplo 1 mediante una serie de experimentos, implicando cada uno: 1) inmunización de ratones con 250 µg de GA RS en CFA; 2) preparación de un cultivo primario de las células LN 9-11 días después de inmunizar; 3) incubación de las células LN con diversas concentraciones de GA RS y con muestras de prueba; 4) recogida de los medios de cultivo y análisis de niveles de IL-2 por ELISA; 5) representar gráficamente una curva de GA RS basada en medidas de IL-2 de triplicados realizadas en 6 niveles de dosis de 1-25 µg/ml; y 6) comparación de la respuesta de células T a cada muestra de prueba con la respuesta al lote RS (por triplicado) a dos concentraciones dentro del intervalo lineal (5 y 10 µg/ml). Se calculó también el % de CV para cada triplicado con el fin de detectar cualquier problema asociado con la variabilidad entre triplicados (normalmente, el % de CV entre triplicados no debe sobrepasar 10-15%). Para los datos dados no se detectaron violaciones de las condiciones.

Las características de la validación usadas para proporcionar un conocimiento global de las capacidades del procedimiento analítico fueron: linealidad, intervalo, exactitud, precisión, especificidad y robustez. Los criterios de validación y análisis estuvieron basados en las normas generales consensuadas ICH, “Validation of Analytical Procedures: Methodology”, Noviembre 1996 (CPMP/ICH/281/95). Los métodos estadísticos recomendados en la directriz de “European Pharmacopeia” fueron adaptados a los datos dados para fines analíticos.

Experimento 3A: Linealidad e Intervalo

En cada prueba in vitro se usó un curva dosis-respuesta de lote de GA RS para calcular la respuesta relativa de las células a las muestras probadas. Cada curva de calibración incluyó al menos cinco puntos (sin cero). Veintiuna curvas de calibración obtenidas de diferentes pruebas in vitro, realizadas durante las etapas de desarrollo y validación, se representaron gráficamente y se evaluaron para cada placa.

El análisis estadístico de los datos reveló que las representaciones gráficas de log10(concentración IL-2) frente a log10(concentración GA RS) proporcionaron el mejor ajuste lineal. El intervalo lineal surgió principalmente por inspección visual y evaluación de la exactitud y precisión de los puntos de calibración. Se calculó el % de la RSD para cada triplicado con el fin de detectar cualquier problema asociado con la variabilidad entre triplicados (normalmente, el % de la RSD entre triplicados no debe exceder de 10-15%). El intervalo de la curva de GA RS se especificó entre 1-25 µg/ml.

Sobre la base de estos análisis, la curva de GA RS debe comprender al menos 6 puntos de calibración, uno con concentración cero (control negativo) y al menos 5 concentraciones de GA RS en el intervalo entre 1 y 25 µg/ml. La regresión lineal de log10(concentración IL-2) frente a log10(concentración GA RS) debe tener un R2 � 0,97 y una pendiente � 0,77.

Experimento 3B: Exactitud

La exactitud del método se estableció a través del intervalo lineal especificado de la curva de GA RS. El análisis estadístico de los datos reveló que la exactitud media del método fue: 8,0% ± 2,3%.

5 Experimento 3C: Precisión

La medida básica de la precisión usada fue la desviación estándar relativa (RSD) del cálculo de elementos repetitivos (normalmente triplicados) de concentración. La RSD se estableció a través del intervalo lineal de las curvas de GA RS. Los análisis estadísticos de los datos revelaron que la precisión media del método fue 2,9

10 ± 1,7%. La fiabilidad de las medidas de duplicados fue equivalente a la de triplicados. Por tanto, cuando uno de los tres elementos repetitivos fue identificado como un valor anómalo, el valor anómalo se omitió y se aceptaron los resultados de las medidas de duplicados.

15 Experimento 3D: Repetitividad del método La respuesta de células T específicas del GA al lote de GA DS se midió repetidamente, 3 veces, en la misma prueba in vitro. Tres pesos del mismo lote fueron diluidos cada uno a 5 y 10 µg/ml e incubados con las células T específicas del GA. Se midieron por ELISA en triplicados los niveles de Il-2 en los medios de cultivo de las

20 muestras de prueba y de las muestras de GA RS. El % de actividad y los límites de confianza al 95% de las células para cada elemento repetitivo se calcularon con relación al GA RS. La Tabla 6 muestra el % de respuesta calculado para cada elemento repetitivo. Tabla 6: Repetitividad del Método

Muestra #: Conc. GA DS (µg/ml) % de Actividad PROMEDIO N = 6 SD RSD Límites de Confianza al 95% (Límite Inferior-Límite Superior)

1: 5 75 80 74 77 3,3 4,3 67-89

10: 73 79 81

2: 5 83 83 92 84 5,0 5,9 73-97

10: 80 79 88

3: 5 72 74 71 76 5,2 5,2 65-88

10: 80 78 79

Experimento 3E: Precisión intermedia

Se analizó el % de respuesta de un lote de GA DS en 3 pruebas diferentes in vitro, realizadas en días diferentes, por 3 investigadores diferentes del mismo laboratorio. La Tabla 7 compendia el % de actividad y los límites de confianza al 95% determinados para este lote en los 3 experimentos repetidos.

Tabla 7: Precisión Intermedia

1: 5 85 86 83 83 3,1 3,7 71-97

10: 77 84 84

2: 5 90 86 87 86 3,0 3,7 79-94

10: 82 84 89

3: 5 75 80 74 77 3,3 4,2 65-88

10: 73 79 81

Experimento 3F: Reproducibilidad del método

10 La reproducibilidad del método se evaluó por medio de estudio inter-laboratorio. El % de respuesta del lote de GA DS se analizó en dos experimentos diferentes, realizados en 2 laboratorios diferentes, usando diferentes análisis, equipos y reactivos. La Tabla 8 compendia los resultados de ambos laboratorios.

15 Tabla 8: Reproducibilidad del Método

Lab. 1: Lab. 2

Media del % de Actividad ± RSD: 86 ± 3,5 83 ± 5,0

Límites de Confianza al 95%: 79-94 78-90

Sobre la base de los experimentos anteriores, se puede concluir que la prueba in vitro es reproducible.

20 Experimento 3G: Especificidad La discriminación del método se analizó a 3 niveles: 1) discriminación entre muestras incubadas con/sin GA RS (efecto matriz); 2) discriminación entre GA RS y otras proteínas y péptidos relacionados y no relacionados, incluyendo GA DS; y 3)

discriminación entre GA RS y copolímeros relacionados de GA en los que las secuencias peptídicas se han modificado deliberadamente.

i) Reconocimiento de GA RS por células T específicas de GA RS (efecto matriz)

Se indujeron células T específicas de GA por inmunización de ratones hembra (SJLxBALB/C)F1 con 250 g de GA RS en CFA. Esta dosis de GA se usa rutinariamente para analizar la actividad biológica de lotes de GA en esta raza de ratones usando la prueba bloqueante de la EAE. El grupo control de este experimento fue inyectado con CFA solo. A los diez días después de la inmunización, las células LN se separaron de ambos grupos de ratones. Las células se incubaron con GA RS durante 18-24 horas a 37ºC en un incubador humidificado de CO2 al 5%.

Posteriormente, los cultivos se centrifugaron y los sobrenadantes se recogieron y analizaron respecto a la interleuquina-2 (IL-2, una citoquina segregada por células T activadas) por ELISA usando anticuerpos biotinilados específicos de la IL-2 y conjugado de estrepavidina-peroxidasa de rábano (HRP) para detección (Fig. 1). Cada prueba en placa incluyó control de blanco (primer y segundo anticuerpo sin el patrón de citoquina). Cada prueba en placa incluyó también muestras para control de calidad (QC) (tres concentraciones de patrón de citoquina dentro del intervalo lineal del ensayo). Cada prueba in vitro incluyó un control positivo (Con A, un estimulante de células T inespecíficas) y un control negativo (no GA o cualquier otro antígeno). La Fig. 2 muestra que las células LN de ratones inmunizados con GA RS segregan dosis de IL-2 dependientemente en respuesta al GA RS en cultivo, mientras que las células LN de los ratones control no responden al GA RS en cultivo. Los niveles de IL-2 en las muestras de control negativo están normalmente por debajo o próximos a límite de detección por ELISA (aproximadamente 3 pg/ml). Estos niveles de IL-2 están siempre por debajo de los niveles segregados por el punto de calibración más bajo de GA RS (1 µg/ml). Estos resultados indican que la secreción de IL-2 por las células T específicas de GA es dependiente del GA.

ii) Discriminación entre antígenos relacionados y no relacionados

La discriminación entre antígenos relacionados y no relacionados (proteínas y péptidos sencillos) se demostró analizando la respuesta de las células T específicas de GA RS a varios antígenos in vitro. Se obtuvo un cultivo primario de células LN de ratones hembra (SJL x BALB/C)F1 inmunizados 9-11 días antes con 250 µg de GA RS en CFA. El cultivo primario se incubó durante una noche con GA RS y con otros diversos antígenos a 37ºC en un incubador humidificado de CO2 al 5%. Después los

cultivos se centrifugaron y los sobrenadantes se recogieron y analizaron para la IL-2 por ELISA como en el Experimento 3G(i). La Tabla 9 muestra que en este sistema experimental las células T específicas de GA no respondieron a la MBP (proteína básica de la mielina) humana, al péptido

5 inmuno-dominante pp. 87-99 de la MBP (un péptido encefalitogénico), o su pp. análogo 87-99Ala 96 (un péptido supresor de la EAE). La lisozima, una proteína básica no relevante, también no fue reconocida por las células T específicas de GA. TV-35 y TV-109 eran péptidos con un peso molecular de 3757 y 11727, respectivamente (Publicación Internacional PCT No. WO 00/18794). Estos péptidos tenían una

10 secuencia definida compuesta por los mismos cuatro aminoácidos de GA (Ala, Glu, Lys, Tyr), en la misma relación molar que en GA. Las células LN específicas de GA RS no respondieron a TV-35, y tenían una reactividad cruzada muy baja con TV-109. Estos resultados se pueden explicar por la observación de que la inmunización con GA RS indujo la formación de una mezcla de células T con diferente especificidad hacia

15 los múltiples epítopos de células T presentes en el GA. Sin embargo, TV-35 y TV109 pueden tener secuencias comunes con el GA, y la incubación de células T específicas de GA con un solo péptido probablemente causó solamente un estímulo parcial de una fracción pequeña de las células específicas de GA en cultivo. Así, la respuesta global de las células T (secreción de IL-2) estuvo por debajo o próxima a los límites de

20 detección.

Tabla 9: Especificidad de células LN específicas de GA RS

Antígeno: % de Actividad1

GA RS: 100

Lisozima: 0

MBP humana: 0

pp. 87-99 de MBP: 0

pp. 87-99Ala 96 de MBP: 0

TV-35: 0

TV-109: 17

1% de Actividad = concentración de IL-2 en medios de cultivo del antígeno X100 concentración de IL-2 en medios de cultivo de GA RS

La prueba in vitro fue sensible al peso molecular medio (MW) del lote de GA.

25 La Fig. 11 muestra la respuesta de las células específicas de GA RS a lotes de GA RS (MW = 7900) y de GA DS que difieren en su peso molecular MW. Como se puede ver, la respuesta se correlacionaba generalmente con el MW medio; cuanto mayor era el MW medio mayor era la respuesta. Sin embargo, se debe observar que las especificaciones de liberación para el MW medio de GA DS son entre 4700-10000, y que se segregaron niveles similares de IL-2 en respuesta a lotes DS con MW medio dentro de las especificaciones (Fig. 11). Estos resultados indican que el método fue muy específico para el GA y sensible a cambios en el MW medio de GA.

iii) Reconocimiento de sustancia farmacológica GA (DS) y producto farmacológico Copaxone¡ por células T específicas de GA RS

Nueve a once días después de la inmunización de ratones hembra (SJLx BALB/C)F1 con 250 µg de GA RS en CFA, se separaron las células LN y se cultivaron con diversas dosis de lote GA RS (el antígeno inmunizante) y con un lote DS.

Se midió IL-2 como en el Experimento 3G(i). La Fig. 12A muestra que las células LN reaccionaron cruzadamente con ambos lotes patrón. Las curvas dosis-respuesta de secreción de IL-2 (medida por ELISA como anteriormente) por ambos lotes fueron similares, lo que indica que los lotes probados tenían en común epítopos similares de células T. La comparación entre GA RS y un lote de Copaxone¡ muestra que las células T específicas de GA RS también reaccionaron cruzadamente con el lote DP, y que el manitol, el excipiente en la formulación Copaxone¡, no afectó o interfirió con las respuestas de células T (Fig. 12B). Por tanto, este método proporciona una indicación de reproducibilidad de lote a lote.

v) Discriminación entre GA y copolímeros relacionados

En el experimento 3G(ii) se demostró que la prueba in vitro fue sensible al MW medio de péptidos de GA, usando lotes de GA DS que difieren en su MW medio. Puesto que el experimento estuvo basado en el bio-reconocimiento de GA por células T específicas del GA, que responden específicamente a secuencias lineales, se esperaba que el método sería sensible a variaciones/modificaciones en las secuencias de péptidos de GA. Esto se demostró usando: 1) copolímeros sintetizados a partir de solamente 3 de los 4 aminoácidos que comprende el GA; 2) un lote de GA (XX) resultante de la modificación deliberada de las condiciones de fabricación, es decir, adición de exceso de aminoácidos libres a monómeros de GA durante la síntesis. El MW medio de este lote fue alto y fuera de las especificaciones (MW = 11150 Da); y 3) productos de degradación de GA RS obtenidos por proteolisis con tripsina y quimotripsina.

La Tabla 10 muestra que las células T específicas del GA no respondieron a los 3 copolímeros aminoacídicos que carecen de lisina, alanina o tirosina. Además, el % de respuesta de las células al lote XX fue relativamente alto y estuvo fuera de las especificaciones del método (100 ± 30%), indicando que el método podría ser sensible a modificaciones en el procedimiento de producción. El alto % de respuesta se puede explicar también por la sensibilidad de la prueba al MW de péptidos de GA, como se ha demostrado.

Tabla 10: Especificidad del Método

Copolímero: Modificación Media del % de Actividad ± RSD

Tyr-Lys-Glu: Carente de Alanina 0

Tyr-Ala-Glu: Carente de Lisina 0

Ala-Glu-lys: Carente de Tirosina 0

Lote XX: Exceso de aminoácidos libres en la etapa de polimerización 170 ± 4,7

Los estudios cinéticos de proteolisis de GA por tripsina y quimotripsina

10 muestran que la prueba in vitro fue sensible a la degradación de péptidos de GA. Las Fig. 13 y 15 muestran que la secreción de IL-2 por las células se redujo por el tiempo de proteolisis, y el % de actividad de las células a los péptidos proteolizados estuvo fuera de las especificaciones del método (100 ± 30%) (Tabla 11). Los cromatogramas superpuestos (por RP-HPLC) de las muestras degradadas (Figs. 14 y 16) demostraron

15 las cinéticas de la proteolisis por tripsina y quimitripsina, respectivamente. Los resultados acumulativos de todos los estudios de especificidad revelaron que el método fue muy específico para el GA y distinguió entre GA y antígenos estrechamente relacionados.

20 Tabla 11: Especificidad del Método – Efecto de la Proteolisis

Enzima: Tiempo de proteolisis (minutos) Media del % de Actividad

Tripsina: 1 40

5: 36

15: 19

30: 7

durante una noche: 0

Quimotripsina: 5 11

20: 0

Experimento 3G: Robustez

i) Robustez de los Criterios de Aceptación

La consistencia y robustez de los criterios de aceptación definidos se examinó comparando las resultantes valoraciones de la actividad relativa obtenida para los lotes de GA repetidos. Los datos de análisis de lotes incluyeron un número de lotes de GA repetidos. Se midieron dos lotes en tres días diferentes por operadores diferentes. También se analizó un lote en dos días diferentes por operadores diferentes.

En la prueba de paralelismo para los lotes de GA repetidos, todos los valores de las pendientes de los lotes de GA estaban dentro de los límites críticos apropiados para la prueba de paralelismo de relación de pendientes. Todos los lotes de GA satisficieron los criterios de aceptación para los cálculos puntuales de los valores de la actividad de relativa con límites de confianza al 95% (el % de actividad calculado estuvo dentro de los límites de 80%-125% y los límites de confianza al 95% estuvieron dentro del intervalo de 70%-143%). Para los datos analizados de los lotes de GA repetidos, su validez no dependió del día del experimento o del operador que realizaba la prueba. Estos datos apoyan la robustez de las especificaciones establecidas.

ii) Robustez de los Parámetros Críticos del Procedimiento de Inmunización y de la Reacción in vitro

Se evaluó la robustez de los parámetros críticos tanto del procedimiento de inmunización como de la reacción in vitro. Brevemente, se demostró que: 1) la respuesta inmunológica de las células LN no se afectó por la dosis inmunizante de GA RS; 2) el periodo de inmunización fue 9-11 días; 3) la respuesta de las células LN al GA RS fue mayor comparada con la respuesta de células de bazo; 4) la inmunización con GA RS + CFA dio por resultado que las células LN tenían una respuesta más intensa en comparación con la inmunización con ICFA; 5) la presencia de suero en medios de cultivo afectó intensamente a la respuesta de células T específicas de GA, por tanto la reacción in vitro se realizó en medios libres de suero; 6) el plan temporal óptimo para recoger los medios de cultivo fue 18-21 horas tras la incubación con GA RS y muestras de prueba; y 7) los medios de cultivo se pueden guardar a –20ºC durante hasta una semana antes de ser analizados por ELISA. Por tanto, se demostró que el método era robusto.

Sumario Estadístico para la Valoración Puntual y Límites de Confianza al 95% de la Actividad Relativa

Límites de Tolerancia al 95% para la Actividad Relativa Media

Para evaluar los límites de aceptación para la actividad relativa valorada de un nuevo lote, se calculó la media y la desviación estándar de las estimaciones de log(actividad) individuales:

Media (Mi) = 0,0074; SD(Mi) = 0,0402. Un intervalo aproximado de tolerancia al 95% para el valor medio de potencia

relativa, basado en los datos analizados, fue:

Med( Mi ±2•SD M i)

ia (

[10 ] α 100% = [84%, 122%].

Intervalo de los Límites de Confianza al 95% de la Actividad Relativa Los valores mínimos y máximos de los límites de confianza al 95% para las

estimaciones individuales de la actividad relativa fueron: Mínimo (Límite Bajo) = 79,3% Máximo (Límite Alto) = 147,3%

Satisfacción de los Criterios de Aceptación Sobre la base del análisis se determinó que los criterios de aceptación eran:

1. Las asunciones implicadas en el procedimiento de análisis del bioensayo fueron satisfechas, a saber:

a.: Independencia y normalidad del log(respuestas);

b.: Homogeneidad de la varianza del log(respuestas);

c.: Ningún valor anómalo; y

d.: Paralelismo (prueba de la relación de pendientes no significante).

2.: La actividad relativa estimada no fue menor que 80% y no mayor que 125% de la actividad estándar; y

3.: Los límites de confianza al 95% del error de la actividad relativa estimada no fueron menores que 70% y no mayores que 143% de la actividad estándar.

Discusión del Ejemplo 3

La validación de la prueba in vitro reveló que el método era reproducible y la exactitud y precisión media estaban en un intervalo aceptable. El método fue muy específico para los péptidos de GA y sensible a la calidad de la sustancia activa.

SUMARIO Y DISCUSION

Un método in vitro fue desarrollado para lotes de GA DS y Copaxone¡. Este método estuvo basado en bio-reconocimiento de epítopos de células T (secuencias lineales) por células T específicas de GA RS. Las células T específicas de GA RS segregan citoquinas Th0 en respuesta a GA en cultivo. En este método, el reconocimiento de lotes de GA por células T se controla midiendo los niveles de IL-2 en los medios de cultivo por ELISA. Se demostró que las células T específicas de GA RS son reactivas cruzadamente con lotes DS y DP, lo que indica que estos lotes tienen en común secuencias similares con el lote RS, y que el manitol, el excipiente en la formulación de DP, no interfiere con la reacción.

El método fue muy específico para péptidos de GA y es sensible al MW medio de la mezcla peptídica. La MBP no fue reconocida por las células T específicas del GA. Péptidos inmuno-dominantes de la MBP (tanto péptidos encefalitogénicos como supresores), así como péptidos sencillos con composición aminoacídica similar a la del GA, no estimularon a las células T. Durante este experimento se optimizaron parámetros críticos en el procedimiento de inmunización, así como en la reacción in vitro. Este experimento demostró que el método fue muy reproducible y robusto.

El método se puede adaptar para normalizar otros antígenos de células T para usar en composiciones farmacéuticas. A partir de animales inmunizados frente al antígeno RS se puede producir un cultivo primario de células T específicas para un antígeno RS, en vez de GA RS. La producción de citoquina de este cultivo en respuesta a antígeno RS se puede representar gráficamente frente a la concentración de antígeno RS para crear una curva patrón. La producción de citoquina en respuesta al antígeno de muestra se puede comparar con la curva patrón para determinar si el antígeno está dentro del intervalo aceptable de actividad.

La citoquina óptima a monitorizar se puede determinar como en el Experimento 2A. Las condiciones para inmunización y la prueba in vitro se pueden optimizar como en los Experimentos 2B y C.

Referencias

Patente de U.S. No. 3.849.550, publicada el 19 de Noviembre 1974 (Teitelbaum, et al.). Patente de U.S. No. 5.800.808, publicada el 1 de Septiembre 1998 (Konfino, et al.). Publicación Internacional PCT No. WO 00/05250, publicada el 3 de Febrero 2000 (Aharoni et al.). Publicación Internacional PCT No. WO 00/18794.

Aharoni, R. et al., Hibridomas T supresores y líneas dependientes de interleuquina-2 inducidas por copolímero 1 o por homogeneizado de médula espinal regulan a la baja la encefalomielitis alérgica experimental. Eur. J. Immunol., (1993), 23: 17-25. Bornstein, et al., New Eng. J. Med., 1987, 317(7), 408-414. Johnson, K.P., Neurology,

5 1:65-70 (1995). Lando et al., Efecto de la ciclofosfamida sobre la actividad de células supresoras en ratones insensibles a la EAE, J. Immunol. (1979) 123(5): 2156-2160. Lisak et al., Respuestas inmune In vitro e in vivo a la proteína básica de mielina homóloga en EAE, Cell. Immunol. (1974) 11:212-220. “Copaxone” en Physician’s Desk

10 Reference, 2000, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ. 3115. “Validación de Procedimientos Analíticos: Metodología”, Nov. 1996 (CPMP/ICH/281/95). Farmacopea Europea, 1997.

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20

25

30

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para medir la actividad de un lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con la actividad conocida de un lote de referencia que comprende: a) inmunizar ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 entre 8 y 12 semanas de edad con una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de referencia; b) preparar un cultivo primario de células de nódulos linfáticos de los ratones de la etapa (a) 9-11 días después de la inmunización; c) incubar separadamente al menos cinco muestras de referencia, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer entre 1 µg/ml y 25 µg/ml de un lote de referencia; d) incubar al menos dos muestras, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba; e) determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de interleuquina-2 segregada por las células en cada muestra después de 18-21 horas de incubación de tal muestra; f) correlacionar las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia de acetato de glatiramer.

donde en cada muestra de las etapas (c) y (d) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica de acetato de glatiramer del lote de referencia.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde seis muestras de referencia se incuban separadamente en la etapa (d).
3. Un procedimiento para medir la actividad de un lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con la actividad conocida de un lote de referencia que comprende: a) inmunizar un mamífero de prueba con una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de referencia; b) preparar un cultivo primario de células del mamífero de prueba de la etapa (a) en un tiempo predeterminado después de la inmunización; c) incubar separadamente al menos dos muestras de referencia, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células del cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer de un lote de referencia; d) incubar al menos dos muestras, cada una de las cuales contiene un número predeterminado de células de un cultivo primario de la etapa (b) y una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba; e) determinar para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de citoquina segregada por las células en cada muestra tras un periodo de tiempo predeterminado de incubación de tal muestra; f) correlacionar las cantidades de la citoquina segregada por las muestras incubadas con el lote de prueba de acetato de glatiramer con las cantidades de la citoquina segregada por las muestras incubadas con el lote de referencia de acetato de glatiramer para determinar la actividad del lote de prueba de acetato de glatiramer en relación con el lote de referencia de acetato de glatiramer.

donde en cada muestra de las etapas (c) y (d) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra de incubación que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer del lote de prueba hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente idéntica de acetato de glatiramer del lote de referencia.
4.

El procedimiento de la reivindicación 3, donde la citoquina es una interleuquina.
5.

El procedimiento de la reivindicación 4, donde la interleuquina es interleuquina-2.
6.

El procedimiento de la reivindicación 4, donde la interleuquina es interleuquina-6.
7.

El procedimiento de la reivindicación 4, donde la interleuquina es interleuquina-10.
8.

El procedimiento de la reivindicación 3, donde la citoquina es interferón-gamma.
9.

El procedimiento de la reivindicación 3, donde el mamífero produce células T específicas del patrón de referencia de acetato de glatiramer.
10.

El procedimiento de la reivindicación 3, donde el mamífero es un roedor.
11.

El procedimiento de la reivindicación 10, donde el roedor es un ratón.
12.

El procedimiento de la reivindicación 11, donde el ratón es un ratón hembra (SJLXBALB/C)F1.
13.

El procedimiento de la reivindicación 3, donde el mamífero es de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 semanas de edad.
14.

El procedimiento de la reivindicación 3, donde las células son células de nódulos linfáticos.
15.

El procedimiento de la reivindicación 3, donde las células son células del bazo.
16.

Un procedimiento para preparar un lote de acetato de glatiramer como aceptable

para uso farmacéutico que comprende:

a) preparar un lote de acetato de glatiramer;

b) medir la actividad relativa del lote de acuerdo con el procedimiento de

la reivindicación 1; y

c) calificar el lote como aceptable para uso farmacéutico si la actividad relativa así medida es entre 80% y 125% del lote de referencia de acetato de glatiramer.
17. Un procedimiento para preparar acetato de glatiramer aceptable para uso

farmacéutico que comprende:

a) preparar un lote de acetato de glatiramer;

b) medir la actividad relativa del lote de acuerdo con el procedimiento de

una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15; y

c) calificar el lote como aceptable para uso farmacéutico si la actividad relativa así medida es entre 80% y 125% del lote de referencia de acetato de glatiramer.
18. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica que contiene acetato de glatiramer que comprende: obtener un lote de acetato de glatiramer a probar; medir por separado la cantidad de interleuquina-2 segregada por un cultivo primario de células T obtenidas de ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 inmunizados con una cantidad definida de un lote patrón de referencia de acetato de glatiramer. a) cuando una muestra que contiene un número predeterminado de tales células se incuba en presencia de una cantidad predeterminada del lote patrón de referencia, y b) cuando una muestra que contiene el prácticamente idéntico número de células predeterminado se incuba en presencia de la misma cantidad predeterminada del lote de acetato de glatiramer que está siendo probado;

comparar las cantidades de interleuquina-2 segregada que se miden así para determinar la actividad de un lote de acetato de glatiramer que está siendo probado; e incluir en la composición farmacéutica un lote solamente si su potencia así medida es entre 80% y 125% del lote patrón de referencia.
19. Un procedimiento para determinar la actividad de un lote de acetato de glatiramer que comprende: medir por separado la cantidad de interleuquina-2 segregada por un cultivo primario de células T obtenidas de ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 inmunizados con una cantidad definida de un lote patrón de referencia de acetato de glatiramer, a) cuando una muestra que contiene un número predeterminado de tales células se incuba en presencia de una cantidad predeterminada de lote patrón de referencia; y

b) cuando una muestra que contiene el número predeterminado prácticamente idéntico de células se incuba en presencia de la misma cantidad predeterminada del lote de acetato de glatiramer que está siendo probado;

comparar las cantidades de interleuquina-2 segregada que se miden así,

determinado con ello la actividad del lote.
20. Un procedimiento para determinar si un lote de acetato de glatiramer tiene una actividad predeterminada aceptable para inclusión en una composición farmacéutica que comprende: medir por separado la cantidad de interleuquina-2 segregada por un cultivo primario de células T obtenidas de ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 inmunizados con una cantidad definida de un lote patrón de referencia de acetato de glatiramer, a) cuando una muestra que contiene un número predeterminado de tales células se incuba en presencia de una cantidad predeterminada del lote patrón de referencia, y b) cuando una muestra que contiene el número predeterminado prácticamente idéntico de células se incuba en presencia de la misma cantidad predeterminada del lote de acetato de glatiramer que está siendo probado;

comparar las cantidades de interleuquina-2 segregada que se miden así para determinar la actividad del lote; y comparar la actividad así medida con una actividad predeterminada para determinar si el lote es aceptable para incluirlo en la composición farmacéutica.
21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 20, donde el lote patrón de referencia es un lote de acetato de glatiramer que tiene un peso molecular medio de 7000 Da.
22. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica que contiene acetato de glatiramer que comprende obtener un lote de acetato de glatiramer; y medir la actividad del lote de acetato de glatiramer en relación con la actividad de un patrón de referencia de acetato de glatiramer: a) preparando un cultivo primario de células T de ratones hembra (SJLXBALB/C)F1 entre 8 y 12 semanas de edad inmunizados con una cantidad predeterminada del patrón de referencia;

b) incubando por separado muestras de referencia, conteniendo cada una de las cuales un número predeterminado de células del cultivo

primario de la etapa (a) y una cantidad predeterminada del patrón de referencia entre 1 µg/ml y 25 µg/ml;

c) incubando al menos dos muestras, conteniendo cada una de las cuales un número predeterminado de células del cultivo primario de 5 la etapa (a) y una cantidad predeterminada del lote de acetato de

glatiramer;

d) determinando para cada muestra de las etapas (c) y (d) la cantidad de interleuquina-2 segregada por las células T en cada muestra después de 18-21 horas de incubación de tal muestra; y

10 e) correlacionando las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el lote de acetato de glatiramer con las cantidades de interleuquina-2 segregada por las muestras incubadas con el patrón de referencia para determinar la actividad del lote de acetato de glatiramer en relación con la patrón de

15 referencia, donde en cada muestra de las etapas (b) y (c) el número predeterminado de células es prácticamente idéntico, y donde para cada muestra que contiene una cantidad predeterminada de acetato de glatiramer hay una correspondiente muestra de referencia que contiene una cantidad predeterminada prácticamente

20 idéntica del patrón de referencia; y preparando la composición farmacéutica usando el lote de acetato de glatiramer si su actividad relativa así medida es entre 80% y 125% de la actividad del patrón de referencia.
23. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, donde las 25 células son células de nódulos linfáticos.
24. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, donde las células son células del bazo.