ES2348087T3

ES2348087T3 - Uso de anticuerpos anti-cd40 antagonistas para tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes y rechazo de transplante de organos.

Info

Publication number: ES2348087T3
Application number: ES04810420T
Authority: ES
Inventors: Asha Yabannavar; Isabel Zaror; Mohammad Luqman; Li Long
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2003-11-04
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2010-11-30
Anticipated expiration: 2024-11-04
Also published as: ES2348237T3; SI2149585T1; ES2367892T3; ZA200802168B; ES2348238T3

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano anti-CD40 que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana que expresa CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmune, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a procedimientos para tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias usando anticuerpos monoclonales anti-CD40.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El CD40 es un antígeno de superficie celular de 55 kDa presente en la superficie de las células B normales y células B neoplásicas humanas, células dendríticas, otras células presentadoras de antígenos (APC), células endoteliales, células monolíticas, células T CD8+ y células epiteliales. El antígeno CD40 se expresa también en células T activadas, plaquetas activadas, células musculares lisas vasculares inflamadas, eosinófilos, membranas sinoviales en artritis reumatoide, fibroblastos dérmicos y otros tipos de células no linfoides. Dependiendo del tipo de célula que expresa CD40, la ligazón puede inducir adhesión intercelular, diferenciación, activación y proliferación. Por ejemplo, la unión de CD40 a su ligando cognado, CD40L (también designado CD154), estimula proliferación de células B y diferenciación en células plasmáticas, producción de anticuerpos, cambio de isotipos y generación de memoria en células B. Durante la diferenciación de células B, CD40 se expresa en células pre-B pero se pierde en la diferenciación en células plasmáticas.

El ligando de CD40 se ha identificado en la superficie de células B activadas (Fenslow y col. (1992) J. Immunol. 149: 655; Lane y col. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 2573; Noelle y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 6550), pero no se expresa genralmente en las células T humanas en reposo. DC40L es una glicoproteína transmembrana de tipo I con homología con TNF-α (Armitage y col. (1992) Nature 357: 80 y Spriggs y col. (1992) J. Exp. Med. 176: 1543). El dominio extracelular de CD40L contiene dos residuos de arginina proximales a la región transmembrana, proporcionando un sitio de escisión proteolítica potencial que ocasiona una forma soluble del ligando (sCD40L). La sobreexpresión de CD40L causa enfermedades autoinmunes similares a lupus eritematoso sistémico en modelos de roedor (Higuchi y col. (2002) J.Immunol. 168: 9-12). En contraste, la ausencia de CD40L funcional en células T activadas causa síndrome de hiper-IgM ligado a X (Allen y col. (1993) Science 259: 990; y Korthauer y col. (1993) Nature 361: 539). Adicionalmente, el bloqueo de la interacción CD40/CD40L puede evitar rechazo de transplantes en modelos de primates no humanos.

Véase, por ejemplo, Wee y col. (1992) Transplantation 53: 501-7.

La expresión de CD40 en APC juega un papel coestimulador importante en la activación de estas células. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CD40 agonistas han mostrado imitar los efectos de las células T ayudantes en la activación de las células B. Cuando están presentes en células adherentes que expresan FcγRII, estos anticuerpos inducen proliferación de células B (Banchereau y col. (1989) Science 251: 70). Además, los anticuerpos monoclonales anti-CD40 agonistas pueden reemplazar la señal T ayudante para la secreción de IgM, IgG e IgE en presencia de IL-4 (Gascan y col. (1991) J. Immunol. 147: 8). Además, los mAb anti-CD40 agonistas pueden evitar la muerte celular programada (apoptosis) en células B aisladas de nódulos linfáticos.

Éstas y otras observaciones respaldan la teoría actual de que la interacción de CD40 y CD40L juega un papel fundamental en regular tanto respuestas inmunes humorales como respuestas inmunes mediadas por células. Los estudios más recientes han revelado un papel mucho más amplio de interacción CD40/CD40L en diversos procedimientos fisiológicos y patológicos.

La ruta de transducción de señales de CD40 depende de la regulación coordinada de muchos factores intracelulares. Como otras membranas de la familia de receptores de TNF, CD40 reacciona con proteínas TRAF (protenías asociadas con factores receptores de TNF) tales como TRAF2 y TRAF3, que median una señal intracelular tras lal unión de CD40 con CD40L (bien CD40L en fase sólñida o bien CD40L soluble). Los TRAF translucen una señal dentro del núcleo por medio de quinasas map tales como NIK (quinasa inductora de NK-κB) y quinasas Ikappa B (IKK α/β), activando definitivamente el factor de transcripción NK-κB (Young y col. (1998) Immunol. Today 19: 502-06). La señalización por medio de Ras y la ruta MEK/ERK se ha demostrado en un subgrupo de células B. Rutas adicionales implicadas en señalización celular de CDF40 incluyen ruta PI3k/Akt u ruta P30 MAPK (Craxton y col. (1998) J. Immunol. 5: 439-447). La señalización por medio de CD40 se ha mostrado para prevenir muerte celular a partir de apoptosis (Makus y col. (2002) J. Immunol. 14: 973-982). Las señales apoptóticas son necesarias para inducir muerte celular programada en una manera coordinada. Las señales de muerte celular pueden incluir estímulas intrínsecos del interior de la célula tales como estrés de retículo endoplásmico o estímulos externos tales como unión de receptor de FasL o TNFα. La ruta de señalización es compleja, implicando activación de caspasas tales como caspasas 3 y 9 y de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP). Durante la cascada, las proteínas de señalización anti-apoptóticas, tales como Mcl-1 y BCLx, y miembros de las prtoteínas de la familia IAP, tales como Inhibidor Ligado a X de Apoptosis (XIAP), se regulan de forma descendente (Budihardjo y col. (1999) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15: 269-90). Por ejemplo, en células dendríticas, la señalización celular de CD40 puede bloquear señales de apoptosis trasducidas por FasL (Bjorck y col. (1997) Int’l Immunol. 9: 365-372).

Por consiguiente, la unión de CD40 por CD40L y la activación subsiguiente de señalización de CD40 son etapas necesarias para respuestas inmunes normales; sin embargo, la desregulación de señalización de CD40 puede conducir a enfermedad. La ruta de señalización de CD40 ha estado mostrando estar implicada en enfermedad autoinmune (Ichikawa y col. (2002) J. Immunol. 169: 2781-7 y Moore y col. (2002) J. Autoimmun. 19: 139-45). Adicionalmente, la interacción CD40/CD40L juega un papel importante en procedimientos inflamatorios. Por ejemplo, tanto CD40 como ligando de CD40 se sobreexpresan en aterosclerosis humana y en lesiones de aterosclerosis experimentales. La estimulación de CD40 induce expresión de enzimas que degradan matriz e induce expresión de factor de tejido en tipos celulares asociados con ateroma, tales como células endoteliales, células musculares lisas y macrófagos. Adicionalmente, la estimulación de CD40 induce producción de citoquinas proinflamatorias tales como IL-1, IL-6 e IL-8, y molçéculas de adhesión tales como ICAM-1, Eselectina y VCAM. La inhibición de la interacción de CD40/CD40L evita aterosclerosis en modelos animales. En modelos de transplante, bloquear la interacción CD40/CD40L evita inflamación. Se ha mostrado que la unión CD40/CD40L actúa sinérgicamente con el péptido beta-amiloide de Alzheimer para promover activación microglial, conduciendo así a neurotoxicidad.

En los pacientes con artritis reumatoide (RA), la expresión de CD40 está incrementada en condrocitos articulares, por consiguiente, la señalización de CD40 contribuye probablemente a producción de citoquinas dañinas y metaloproteinasas de matriz. Véase, Gotoh y col. (2004) J. Rheumatol.31: 1506-12. Adicionalmente, ello ha mostrado que la amplificación de la respuesta inflamtoria sinovial tiene lugar por activación de quinasas de proteínas activadas por mitógeno (MAP) y del factor del núcleo kappaB (NFκB) por medio de ligación de CD40 en células sinoviales CD14+ de pacientes de RA (Harigai y col. (2004) Arthritis. Rheum., 50: 2167-77). En un modelo experimental de RA, el tratamiento de anticuerpo anti-CD40L evitó inducción de enfermedad, inflamación de la articulaciones, y producción de amnticuerpos anticolágeno (Durie y col. (1993) Science 261: 1328). Finalmente, en ensayos clínicos, se ha mostrado que deplecionar células B positivas CD20+ de pacientes de RA administrando RITUXAN® (indicado generalmente por linfoma de células B) mejora los síntomas (Shaw y col. (2003) Ann. Deum. Dis. 62: ii55-ii59).

Se ha mostrado también que bloquear interacciones CD40/CD40L durante la presentación de antígeno a células T induce tolerancia a células T. Por lo tanto, bloquear interacción CD40/CD40L evita activación de células T inicial así como induce tolerancia a largo plazo para re-exposición al antígeno.

Los documentos WO 01/83755, WO 02/28480 y WO 02/28904 describen anticuerpos capaces de unirse a CD40, procedimientos para producir estos anticuerpos y procedimientos para su uso.

Ellmark y col. (Immunology 2002, 106, 456-463) dan un informe sobre la modulación de la interacción CD40-ligando de CD40 usando fragmentos de anticuerpos anti-CD40 de cadena simple humanos.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano que es capaz de unirse específicamente al antígeno CD40 humano expresado en la superficie de células que expresan CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de una enfermedad inflamatoria o de un enfermedad autoinmune, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, seleccionándose dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano del grupo constituido por:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº: 10 ó SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº: 10 ó SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano.

La invención proporciona también el uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa CD40 humana en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano para una enfermedad inflamatoria o enfermedad autoinmune, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad antagonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la supericie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por:

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano que es capaz de unirse específicamente al antígeno CD40 humano expresado en la superficie de células que expresan CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de rechazo de transplante, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal antiCD40 humano, seleccionándose dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano del grupo constituido por:

La invención proporciona también el uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa CD40 humana en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano de rechazo de transplante, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad antagonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la supericie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal antiCD40 humano seleccionado del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº: 10 ó SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº: 10 ó SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano.

La invención proporciona también un anticuerpo monoclonal humano que es capaz de unirse específicamente al antígeno CD40 humano expresado en la superficie de células que expresan CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de artritis reumatoide, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal antiCD40 humano, seleccionándose dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano del grupo constituido por:

La invención proporciona también el uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa CD40 humana en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano de artritis reumatoide, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad antagonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la supericie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por:

Otros aspectos de la invención se presentan en las reivindicaciones adjuntas.

BREVE RESUMEN DE LA REVELACIÓN

Se dan a conocer procedimientos para tratar a un ser humano con una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, comprendiendo administrar el sujeto un anticuerpo anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo que está libre de actividad agonista significativa donde se une a un antígeno CD40 en una célula humana que expresa CD40. Se dan a conocer también los procedimientos para inhibir la respuesta de células que expresan antígeno CD40. Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas adecuados para usar en la presente invención tienen una fuerte afinidad por CD40. Estos anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos son capaces de unión específica a antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana. Están libres de actividad agonista significativa pero presentan actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en células humanas. En una realización, el anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo presentan actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en células presentadoras de antígenos tales como células B.

Los anticuerpos antagonistas son especialmente útiles en evitar, mejorar o tratar enfermedades que comprenden un componente autoinmune y/o inflamatorio. Estas enfermedades incluyen pero no se limitan a enfermedades autoinmunes tales como lupus eritematoso sistémico (LES), lupus discoide, nefritis de lupus, sarcoidosis, artritis inflamatoria, incluyendo, pero no limitada a, artritis juvenil, artritis reumatoide, artritis soriática, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante y artritis gotosa, rechazo de un transplante de órgano o tejido, rechazo hiperagudo, agudo o crónico y/o enfermedad de injerto frente a hospedador, esclerosis múltiple, síndrome de hiper IgE, poliarteritis nodosa, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca (enteropatía de sensibilidad al gluten), hepatitis autoinmune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmune, soriasis, escleroderma, miastenia gravis, púrpura trombocitopénica autoinmune, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Graves, tiroiditis de hasimoto, enfermedad compleja inmune, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmune (SFCDI), polimiositis y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombolisis, cardiomiopatía, pénfigo vulgar, fibrosis intersticial pulmonar, sarcoidosis, diabetes mellitus de Tipo I y de Tipo II, hipersensibilidad de tipo retardado de tipo 1, 2, 3 y 4, alergia o trastornos alérgicos, respuestas inmunes indeseadas/no queridas a proteínas terapéuticas, asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatosis alérgica), dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica e irritante, urticaria, alergia mediada por IgE, aterosclerosis, vaculitis, miopatías inflamatorias idiomáticas, enfermedad hemolítica, enfermedad de Alzheimer, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, y similares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 presenta las secuencias de aminoácidos para las cadenas ligeras y pesadas del mAb CHIR-12.12. Las regiones líder (residuos 1-20 de SEC ID Nº: 2), variable (residuos 21-132 de SEC ID Nº: 2), y constante (residuos 133-239 de SEC ID Nº: 2) de la cadena ligera se muestran en la Figura 1A. Las regiones líder (residuos 1-19 de SEC ID Nº: 4), variable (residuos 20-139 de SEC ID Nº: 4), y constante (residuos 140-469 de SEC ID Nº: 4) de la cadena pesada se muestran en la Figura 1B. La región constante alternativa para la cadena pesada del mAb CHIR-12.12 mostrada en la Figura 1B refleja una sustitución de un residuo alanina por un residuo serina en la posición 153 de SEC ID Nº: 4. La secuencia completa para esta variante de la cadena pesada del mAb CHIR-12.12 se presenta en SEC ID Nº: 5. La Figura 2 muestra la secuencia codificadora para la cadena ligera (Figura 2A; SEC ID Nº: 1) y la cadena pesada (Figura 2B; SEC ID Nº: 3) para el mAb CHIR-12.12. La Figura 3 presenta las secuencias de aminoácidos para las cadenas ligera y pesada del mAb CHIR-5.9. Las regiones líder (residuos 1-20 de SEC ID Nº: 6), variable (residuos 21-132 de SEC ID Nº: 6), y constante (residuos 133-239 de SEC ID Nº: 6) de la cadena ligera se muestran en la Figura 3A. Las regiones líder (residuos 1-19 de SEC ID Nº: 7), variable (residuos 20-144 de SEC ID Nº: 7), y constante (residuos 145-474 de SEC ID Nº: 7) de la cadena pesada se muestran en la Figura 3B. La región constante alternativa para la cadena pesada del mAb CHIR-5.9 mostrada en la Figura 3B refleja una sustitución de un residuo alanina por un residuo serina en la posición 158 de SEC ID Nº: 7. La secuencia completa para esta variante de la cadena pesada del mAB CHIR-5.9 se presenta en la SEC ID Nº: 8. La Figura 4 muestra la secuencia codificadora (Figura 4A; SEC ID Nº: 9) para la isoforma corta del CD40 humano (secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4B; SEC ID Nº: 10), y la secuencia codificadora (Figura 4C; SEC ID Nº: 11) para la isoforma larga del CD40 humano (secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4D). La Figura 5 muestra la temperatura de fusión de CHIR-12.12 en formulaciones de diferente pH medidas por calorimetría diferencial de barrido (DSC).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente revelación se refiere a procedimientos para tratar enfemedades autoinmunes y antinflamatorias, usando anticuerpos que tienen una afinidad fuerte por el antígeno de superficie celular CD40. Estos anticuerpos anti-CD40 y fragmentos de unión a anticuerpo de los mismos están libres de actividad agonista significativa cuando se unen a CD40 en células que expresan CD40.

Los “anticuerpos” y las “inmunoglobulinas” (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión para un antígeno, las inmunoglobulinas incluyen tanto a los anticuerpos como a otras moléculas análogas a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos del último tipo son producidos, por ejemplo, en niveles bajos por el sistema linfático y en niveles aumentados por los mielomas.

El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y abarca los anticuerpos totalmente estructurados, fragmentos de anticuerpos que pueden unirse al antígeno (por ejemplo, Fab’, F’(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena simple, fragmentos divalentes o diabodies), y péptidos recombinantes que comprenden los anteriores.

El término “anticuerpo monoclonal” según se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que se dan en la naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores.

Los “anticuerpos nativos” y las “inmunoglobulinas nativas” son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras

(L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena ligera y pesada también tiene enlaces disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio de variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas ligera y pesada.

El término “variable” se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables tanto en los dominios de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones de marco (FR). Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración lámina β, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan la estructura de la lámina β, y en algunos casos forman parte de la misma. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y col. (1991) NIH Publ. Nº: 91-3242, Vol. I, páginas 647-669).

Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la unión del receptor de FC (FcR), la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos, la opsonización, la iniciación de la citotoxicidad dependiente del complemento y la desgranulación de los mastocitos.

El término “región hipervariable” cuando se usa en el presente documento se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una “región determinante de complementariedad” o “CDR” (es decir, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed., Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) y/o los residuos de un “bucle hipervariable” (es decir, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32(H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Clothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Los residuos del “marco” o “FR” son los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable.

Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, de preferencia la región de unión al anticuerpo o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2 y fragmentos Fv; fragmentos divalentes; anticuerpos lineales (Zapata y col. (1995) Protein Eng. 8(10): 10571062); moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, llamados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual “Fc”, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y aún es capaz de formar un entrecruzamiento con el antígeno.

“Fv” es el fragmento mínimo del anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión del antígeno completo. En una especie Fv de dos cadenas, esta región está constituida por un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación, no covalente. En una especie Fv de cadena única, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden estar unidos covalentemente por un conector peptídico flexible tal que las cadenas ligera y pesada pueden asociarse en una estructura “dimérica” análoga a la de una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDR confieren la especificidad de unión al antígeno para el anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab’ por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la denominación en el presente documento para el Fab’ en el que el(los) residuo(s) cisteína de los dominios constantes tiene(n) un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se producían originalmente como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las “cadenas ligeras” de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente diferentes, llamados kappa (κ)y lambda (λ), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras y las configuraciones tridimensionales de las subunidades de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Los isotipos diferentes tienen funciones efectoras diferentes. Por ejemplo, los isotipos IgG1 e IgG3 humanos median la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC).

La palabra “marcador” cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directamente o indirectamente a los anticuerpos para generar un anticuerpo “marcado”. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable.

El término “antagonista” se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea parcial o totalmente, inhibe o neutraliza una actividad biológica de una diana nativa dada a conocer en el presente documento o su transcripción o traducción.

“Vehículos” según se usa en el presente documento incluye los vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, que son no tóxicos para la célula o el mamífero que se expone al mismo en las dosis y concentraciones usadas. Frecuentemente el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluido el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (con menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, polietilenglicol (PEG) y Pluronics. La administración “en combinación con” otro u otros agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (al mismo tiempo) y la administración consecutiva en cualquier orden.

Una “célula huésped”, según se usa en el presente documento, se refiere a un microorganismo

o a una célula o línea celular de eucariota cultivada como una entidad unicelular que puede usarse, o se ha usado, como receptor de un vector recombinante u otros polinucleótidos de transferencia, e incluye a la progenie de la célula original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una célula única puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total a la original, por las mutaciones naturales, accidentales o deliberadas.

“Células efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o más FcR y que realizan funciones efectoras. De preferencia, las células expresan al menos FcγRIII y llevan a cabo la función efectora de citotoxicidad mediada por células dependiente de antígenos (ADCC). Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células citolíticas naturales (NK), monocitos, macrófagos, eosinófilos y neutrófilos, siendo las de preferencia las PBMC y las células NK. Los anticuerpos que tienen actividad ADCC son típicamente del isotipo IgG1 o IgG3. Nótese que además de aislar anticuerpos IgG1 e IgG3, tales anticuerpos que median la ADCC pueden generarse modificando una región variable de un anticuerpo que no media la ADCC o un fragmento de región variable formando una región constante del isotipo IgG1 o IgG3.

Los términos “receptor de Fc” o “FcR” se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR de preferencia es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR de preferencia es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye a los receptores de las subclases FcγRI, FcγRII y FcγRIII, incluidas las variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativas de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un “receptor activador”) y FcγRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor activador FcγRIIA contiene un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de inhibición inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234). Los FcR se recopilan en Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel y col. (1994) Immunomethods 4: 25-34; y de Haas y col. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126: 330-341. Otros FcRs, incluidos los que se identificarán en el futuro, están abarcados por el término “FcR” en el presente documento. El término incluye también el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer y col. (1976) J. Immunol. 117: 587 y Kim y col. (1994) J. Immunol. 24: 249 (1994)).

Hay varias maneras de producir anticuerpos humanos. Por ejemplo, pueden inmortalizarse células secretoras por medio de la infección con el virus de Epstein-Barr (EBV). Sin embargo, las células infectadas con EBV son difíciles de clonar y usualmente producen sólo rendimientos relativamente bajos de inmunoglobulina (James and Bell (1987) J. Immunol Methods 100: 540). En el futuro, posiblemente podría lograrse la inmortalización de células B humanas introduciendo una combinación definida de genes transformadores. Una posibilidad tal se destaca por medio de una reciente demostración de que la expresión de la subunidad catalítica de telomerasa junto con la oncoproteína grande de SV40 y un alelo oncogénico de H-ras dio como resultado la conversión tumorigénica de células fibroblásticas y epiteliales humanas normales (Hahn y col. (1999) Nature 400: 464-468). Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas (Jakobovits y col. (1993) Nature 362: 255-258; Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol.

13: 65-93; Fishwild y col. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 845-851; Mendez y col. (1997) Nat. Genet.

15: 146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23; Tomizuka y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727; recopilado en Little y col. (2000) Immunol. Today 21: 364-370). Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota de la región de unión de cadenas pesadas (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición completa de producción de anticuerpos endógenos (Jakobovits y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-2555). La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulinas humanas de línea germinal en tales ratones mutantes de línea germinal da como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el desafío con antígenos (Jakobovits y col. (1993) Nature 362: 255-258). Mendez y col. (1997) (Nature Genetics 15: 146156) han generado una línea de ratones transgénicos que, cuando se desafían con un antígeno, generan anticuerpos totalmente humanos de alta afinidad. Esto se logró por la integración en la línea germinal de loci megabase de cadenas pesadas y cadenas ligeras humanas en los ratones con deleción en el segmento endógeno JH como se describió anteriormente. Estos ratones (tecnología XenoMouse® II (Abgenix; Fremont, California)) albergan 1.020 kb del locus de cadena pesada humana que contiene aproximadamente 66 genes de VH, regiones DH y JH completas, y tres regiones constantes diferentes, y también albergan 800 kb del locus κ humano que contiene 32 genes de Vκ, segmentos Jκ y genes de Cκ. Los anticuerpos producidos en estos ratones se asemejan mucho a los que se observan en seres humanos en todos los aspectos, incluidos la reorganización genética, la estructura y el repertorio. Los anticuerpos humanos se expresan de preferencia sobre anticuerpos endógenos por deleción en el segmento endógeno que evita la reorganización genética en el locus murino. Tales ratones pueden inmunizarse con un antígeno de interés particular.

Los sueros de tales animales inmunizados pueden examinarse para reactividad de anticuerpo frente al antígeno inicial. Los linfocitos pueden aislarse de ganglios linfáticos o de células del bazo y además pueden seleccionarse para células B seleccionando las células CD138 negativas y CD19 positivas. En un aspecto, tales cultivos de células B (BCC) pueden fusionarse a células de mieloma para generar hibridomas como se detalló anteriormente.

En otro aspecto, tales cultivos de células B pueden seleccionarse además para reactividad frente al antígeno inicial, de preferencia. Tal selección incluye ELISA con la proteína diana/antígeno, un ensayo de competición con anticuerpos conocidos que se unen al antígeno de interés, y unión in vitro a células CHO u otras células transfectadas de manera transitoria que expresan el antígeno diana.

La presente revelación se refiere a composiciones y procedimientos para tratar sujetos humanos que tienen enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias. Los procedimientos implican el tratamiento con un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, en donde la administración del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno promueve una respuesta terapéutica positiva en el paciente que se somete a este procedimiento de terapia. Los procedimientos y composiciones son especialmente útiles en tratar enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades autoinmunes lupus eritematoso sistémico (LES), lupus discoide, nefritis de lupus, sarcoidosis, artritis inflamatoria, incluyendo, pero no limitada a, artritis juvenil, artritis reumatoide, artritis soriática, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante y artritis gotosa, rechazo de un transplante de órgano o tejido, rechazo hiperagudo, agudo o crónico y/o enfermedad de injerto frente a hospedador, esclerosis múltiple, síndrome de hiper IgE, poliarteritis nodosa, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca (enteropatía de sensibilidad al gluten), hepatitis autoinmune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmune, soriasis, escleroderma, miastenia gravis, púrpura trombocitopénica autoinmune, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Graves, tiroiditis de hasimoto, enfermedad compleja inmune, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmune (SFCDI), polimiositis y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombolisis, cardiomiopatía, pénfigo vulgar, fibrosis intersticial pulmonar, sarcoidosis, diabetes mellitus de Tipo I y de Tipo II, y similares. Adicionalmente, estos anticuerpos anti-CD40 antagonistas y fragmentos de unión a antígeno de los mismos anti-CD40 antagonistas son especialmente útiles entratar enfermedades asociadas con inflamación, incluyendo pero no limitadas a hipersensibilidad de tipo retardado de tipo 1, 2, 3 y 4, alergia o trastornos alérgicos, respuestas inmunes indeseadas/no queridas a proteínas terapéuticas (véanse por ejemplo, Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º US 2002/0119151 y Koren y col. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 349-60), asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatosis alérgica), dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica e irritante, urticaria, alergia mediada por IgE, aterosclerosis, vaculitis, miopatías inflamatorias idiomáticas, enfermedad hemolítica, enfermedad de Alzheimer, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, y similares.

Los anticuerpos anti-CD40 adecuados para uso en los procedimientos de la invención se unen específicamente al antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana y están exentos de actividad agonista significativa, pero exhiben actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en una célula humana que expresa CD40. Estos anticuerpos anti-CD40 y sus fragmentos de unión al antígeno se denominan en el presente documento “anticuerpos anti-CD40 antagonistas”. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 totalmente humanos que se describen a continuación y los anticuerpos monoclonales tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que se describen a continuación también.

Los anticuerpos que tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR

5.9 y CHIR-12.12 incluyen anticuerpos que interfieren de manera competitiva con la unión a CD40 y/o se unen a los mismos epítopos que CHIR-5.9 y CHIR-12.12. Un experto podría determinar si un anticuerpo interfiere de manera competitiva con CHIR-5.9 o CHIR-12.12 usando procedimientos convencionales.

Cuando estos anticuerpos se unen a CD40 expuesto en la superficie de las células humanas, tales como células B humanas, células T, células dendríticas, células endoteliales, plaquetas activadas, células del músculo liso vasculares inflamadas, eosinófilos, membranas sinoviales, fibroblastos dérmicos y similares, los anticuerpos están exentos de actividad agonista importante; en algunas realizaciones, su unión a CD40 expuesto en la superficie de las células humanas da como resultado la inhibición de la proliferación y la diferenciación de estas células humanas. Por consiguiente, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas adecuados para uso en los procedimientos de la invención incluyen los anticuerpos monoclonales que pueden exhibir actividad antagonista hacia las células humanas normales y malignas que expresan el antígeno de superficie celular CD40.

Anticuerpos anti-CD40 antagonistas

Los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 representan anticuerpos anti-CD40 antagonistas adecuados para uso en los procedimientos de la presente invención. Los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son anticuerpos monoclonales anti-CD40 totalmente humanos del isotipo IgG1 producidos a partir de las líneas celulares de hibridoma 131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en el presente documento como la línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace referencia en el presente documento como la línea celular 12.12). Estas líneas celulares se crearon usando esplenocitos de ratones xenotípicos inmunizados que contienen el locus de cadena pesada de IgG1 humana y el locus de cadena K humana (tecnología XenoMouse® (Abgenix; Fremont, California)). Las células del bazo se fusionaron con las células de mieloma SP2/0 de ratón (Sierra BioSource). Las hibridomas resultantes se subclonaron varias veces para crear las líneas celulares monoclonales estables

5.9 y 12.12. Otros anticuerpos de la invención pueden prepararse de manera similar usando ratones transgénicos para loci de inmunoglobulina humana o por otros procedimientos conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento.

Las secuencias de aminoácidos para las regiones líder, variable y constante para la cadena ligera y cadena pesada para el mAb CHIR-12.12 se presentan en las Figuras 1A y 1B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 2 (secuencia completa para la cadena ligera del mAb CHIR-12.12), SEC ID Nº: 4 (secuencia completa para la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº: 5 (secuencia completa para una variante de la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12 presentada en SEC ID Nº: 4, donde la variante comprende una sustitución del residuo alanina por serina en la posición de 153 de SEC ID Nº: 4). Las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena ligera y la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12 se presentan en las Figuras 2A y 2B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 1 (secuencia codificadora para la cadena ligera para el mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº: 3 (secuencia codificadora para la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12). Las secuencias de aminoácidos para las regiones líder, variable y constante para la cadena ligera y cadena pesada del mAb CHIR-5.9 se presentan en las Figuras 3A y 3B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 6 (secuencia completa para la cadena ligera del mAb CHR-5.9), SEC ID Nº: 7 (secuencia completa para la cadena pesada del mAb CHIR-5.9) y SEC ID Nº: 8 (secuencia completa para una variante de la cadena pesada del mAb CHIR-5.9 presentada en SEC ID Nº: 7, donde la variante comprende una sustitución del residuo alanina por serina en la posición de 158 de SEC ID Nº: 7). Además, los hibridomas que expresan los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se han depositado en la ATCC con una denominación de depósito de patente de PTA-5542 y PTA-5543, respectivamente.

Los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen a CD40 soluble en ensayos de tipo ELISA, evitan la unión del ligando de CD40 al CD40 de la superficie celular, y desplazan el ligando de CD40 previamente unido, según se determina por ensayos de citometría de flujo. Los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 compiten uno con el otro por la unión a CD40 pero no con 15B8, el anticuerpo monoclonal anti-CD40 descrito en el documento WO 02/28904.

Cuando se prueban in vitro los efectos en la proliferación de células B de sujetos humanos normales, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 actúan como anticuerpos anti-CD40 antagonistas. Además, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 no inducen fuerte proliferación de linfocitos humanos de sujetos normales. La afinidad de unión de CHIR-5.9 por el CD40 humano es de 1,2 x 10-8 M y la afinidad de unión de CHIR-12.12 es de 5 x 10-10 M, según se determina por medio del ensayo Biacore™.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas adecuados para uso en los procedimientos de la presente invención exhiben una fuerte afinidad de unión de sitio único por el antígeno CD40 de superficie celular. Los anticuerpos monoclonales de la invención exhiben una constante de equilibrio de disociación (KD) para CD40 de al menos 10-5 M, al menos 3 X 10-5 M, de preferencia al menos 10-6 M hasta 10-7 M, de más preferencia al menos 10-8 M hasta aproximadamente 10-12 M, medida usando un ensayo convencional tal como Biacore™. El análisis Biacore se conoce en la técnica y se proporcionan detalles en el “BIAapplications handbook”. Los procedimientos descritos en el documento WO 01/27160 pueden usarse para modular la afinidad de unión.

Se entiende por “antígeno CD40”, “antígeno CD40 de superficie celular”, “receptor de CD40” o “CD40” una glicoproteína transmembranaria que pertenece a la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (véanse, por ejemplo las Patentes de EEUU Nº: 5.674.492 y 4.708.871; Stamenkovic y col. (1989) EMBO 8: 1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36: 33; Barclay y col. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (2ª ed.; Academic Press, San Diego)). Se han identificado dos isoformas de CD40 humano, codificadas por variantes de transcripción con cortes y empalmes alternativos de este gen. La primera isoforma (también conocida como la “isoforma larga” o “isoforma 1”) se expresa como un polipéptido precursor de 277 aminoácidos (SEC ID Nº: 12 (informada primero en GenBank con Nº de acceso CAA43045, e identificada como isoforma 1 en GenBank con Nº de acceso NP 001241), codificado por SEC ID Nº: 11 (véase Nº de acceso de GenBank X60592 y NM 001250)), que tiene una secuencia señal representada por los primeros 19 residuos. La segunda isoforma (también conocida como la “isoforma corta” o “isoforma 2”) se expresa como un polipéptido precursor de 203 aminoácidos (SEC ID Nº: 10 (Nº de acceso de GenBank NP 690593), codificado por SEC ID Nº: 9 (Nº de acceso de GenBank NM 152854)), que también tiene una secuencia señal representada por los primeros 19 residuos. Los polipéptidos precursores de estas dos isoformas de CD40 humano comparten en común sus primeros 165 residuos (es decir, los residuos 1-165 de SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 12). El polipéptido precursor de la isoforma corta (mostrado en SEC ID Nº: 10) está codificado por una variante de transcripción (SEC ID Nº: 9) que carece de un segmento codificador, que da lugar a un cambio del marco de traducción; la isoforma de CD40 resultante contiene un extremo C terminal más corto y diferente (residuos 166-203 de SEC ID Nº: 10) del que está contenido en la isoforma larga de CD40 (extremo C terminal mostrado en los residuos 166-277 de SEC ID Nº: 12). Para los fines de la presente invención, el término “antígeno CD40”, “antígeno CD40 de superficie celular”, “receptor de CD40” o “CD40” abarca tanto la isoforma corta como la larga de CD40. Los anticuerpos anti-CD40 de la presente invención se unen a un epítopo de CD40 humano que se encuentra en la misma situación dentro de la isoforma corta o la isoforma larga de este antígeno de superficie celular como se señala a continuación en el presente documento.

El antígeno CD40 está expuesto en la superficie de una diversidad de tipos celulares, según se describe en otras partes en el presente documento. Por “expuesto en la superficie” y “expresado en la superficie” se entiende que todo o una parte del antígeno CD40 está expuesto al exterior de la célula. El antígeno CD40 expuesto o expresado puede estar total o parcialmente glicosilado.

Por “actividad agonista” se entiende que la sustancia funciona como un agonista. Un agonista se combina con un receptor en una célula e inicia una reacción o actividad que es similar a la misma que se inicia por el ligando natural del receptor. Un agonista de CD40 induce, pero no se limita a, cualquiera o todas las siguientes respuestas: proliferación y diferenciación de células, regulación ascendente de la adhesión intercelular por medio de moléculas tales como ICAM-1, E-selectina, VCAM y similares; secreción de citoquinas proinflamatorias tales como IL1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF y similares, transducción de señales por el receptor de CD40 por rutas tales como TRAF (por ejemplo, TRAF2 y/o TRAF3), MAP quinasas tales como N1K (quinasa inductora de NF-κB), quinasas I-kappa B (IKK α/β), factor de transcripción NF-κB, Ras y la ruta MEK/ERK, la ruta PI3K/Akt, la ruta P38 MAPK, y similares; transducción de una señal antiapoptótica por moléculas tales como XIAP, Mcl-1, BCLx, y similares; generación de células de memoria B y/o de células de memoria T; producción de anticuerpos de células B; cambio de isotipo de células B; regulación ascendente de expresión en la superficie celular de MHC de clase II y de CD80/86 y similares. Por “actividad antagonista” se entiende que la sustancia funciona como un antagonista. Por ejemplo, un antagonista de CD40 evita o reduce la inducción de cualquiera de las respuestas inducidas por la unión del receptor de CD40 a un ligando agonista, en particular CD40L. El antagonista puede reducir la inducción de una o más de las respuestas a la unión de agonistas en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, de preferencia 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, de más preferencia 70 %, 80 %, 85 % y de la mayor preferencia 90 %, 95 %, 99 % ó 100 %. Los procedimientos para medir la especificidad de unión y la actividad de antagonista de anticuerpos anti-CD40 y ligandos de CD40 son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, ensayos de unión competitiva estándar, ensayos para controlar la secreción de inmunoglobulinas por las células B, ensayos de proliferación de células B, ensayos de proliferación de células B análogos a Banchereau, ensayos de células T ayudantes para la producción de anticuerpos, ensayos de proliferación de células con coestimulación y ensayos para regulación ascendente de marcadores de activación de células B.

Por actividad antagonista “significativa” se entiende una actividad agonista de al menos 30 %, 35 %, 40%, 45 %, 50%, 60%,70 %, 75%, 80 %, 85%, 90 %, 95%ó 100 % superior a la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control negativo según se mide en un bioensayo tal como un ensayo de respuesta de células B. De preferencia, la actividad agonista “significativa” es una actividad agonista que es al menos 2 veces mayor o al menos 3 veces mayor que la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control negativo según se mide en el ensayo de una respuesta de células B. Por consiguiente, por ejemplo, cuando la respuesta de células B de interés es la proliferación de células B, la actividad agonista “significativa” sería la inducción de un nivel de proliferación de células B que es al menos 2 veces mayor o al menos 3 veces mayor que el nivel de proliferación de células B inducido por una sustancia neutra o un control negativo. En una realización, una inmunoglobulina no específica, por ejemplo IgG1, que no se une a CD40 sirve como el control negativo. Una sustancia “exenta de actividad agonista significativa” exhibirá una actividad agonista de no más que aproximadamente 25 % mayor que la actividad agonista inducida por una sustancia neutra

o un control negativo, de preferencia no más que aproximadamente 20 % mayor, 15 % mayor, 10 % mayor, 5 % mayor, 1 % mayor, 0,5 % mayor, o incluso no más que aproximadamente 0,1 % mayor que la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control negativo según se mide en un ensayo de una respuesta de células B. Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas útiles en los procedimientos de la presente invención están exentos de actividad agonista significativa como se señaló anteriormente cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula humana. En una realización de la invención, el anticuerpo anti-CD40 antagonista está exento de actividad agonista significativa en una respuesta de células B. En otra realización de la invención, el anticuerpo anti-CD40 antagonista está exento de actividad agonista significativa en ensayos de más de una respuesta de células B (por ejemplo, proliferación y diferenciación, o proliferación, diferenciación y producción de anticuerpos).

Según se usa en el presente documento “anticuerpo anti-CD40” abarca cualquier anticuerpo que reconoce específicamente el antígeno CD40 de superficie celular, incluidos anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena única, y sus fragmentos tales como Fab, F(ab’)2, Fv, y otros fragmentos que retienen la función de unión al antígeno del anticuerpo anti-CD40 original. Son de particular interés para la presente invención los anticuerpos anti-CD40 antagonistas que comparten las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos anteriormente.

Por consiguiente, además de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12, otros anticuerpos que serían útiles en llevar a la práctica la invención descrita en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: (1) los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de hibridoma denominadas 131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en el presente documento como línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace referencia en el presente documento como línea celular 12.12), depositadas en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 y Depósito de Patente Nº PTA-5543, respectivamente; (2) un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 2, la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 4, la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 5, ambas secuencias mostradas en SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 4, y por ambas secuencias mostradas en SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 5; (3) un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 6, la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 7, la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 8, ambas secuencias mostradas en SEC ID Nº:6 y SEC ID Nº: 7, y por ambas secuencias mostradas en SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 8; (4) un anticuerpo monoclonal que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 1, la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 3, y ambas secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID Nº: y SEC ID Nº: 3; (5) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma

5.9 o la línea celular de hibridoma 12.12; (6) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 10

: o SEC ID Nº: 12; (7) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 en un ensayo de unión competitiva; y (8) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 que se une al antígeno

: o los anticuerpos monoclonales anteriores en los puntos anteriores (1)-(7), en los que el fragmento retiene la capacidad de unirse específicamente al antígeno CD40 humano.Aquellos expertos en la técnica reconocen que los anticuerpos anti-CD40 antagonistas y los fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos adecuados para usar en los procedimientos revelados en el presente documento incluyen anticuerpos anti-CD-40 antagonistas y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se producen recombinantemente usando procedimientos bien conocidos en la técnica y descritos más adelante, e incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que se han producido recombinantemente.

Producción de anticuerpos anti-CD40

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas para usar en la presente invención pueden producirse usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. En general, primero se usa una solución que contiene el antígeno CD40 para inmunizar a un animal adecuado, de preferencia un ratón, rata, conejo o cabra. Los conejos o cabras son de preferencia para la preparación de sueros policlonales debido al volumen de suero que puede obtenerse y a la disponibilidad de anticuerpos anti conejo y anti cabra marcados.

Pueden prepararse sueros policlonales en un animal transgénico, de preferencia un ratón que lleve loci de inmunoglobulina humana. En una realización de preferencia, se usan células Sf9 que expresan CD40 como el inmunógeno. La inmunización también puede llevarse a cabo mezclando o emulsionando la solución que contiene el antígeno en solución salina, de preferencia en un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund, e inyectando por vía intravenosa la mezcla o emulsión por vía parenteral (generalmente por vía subcutánea o intramuscular). Típicamente es suficiente una dosis de 50-200 µg/inyección. La inmunización se estimula por lo general 2-6 semanas más tarde con una o más inyecciones de la proteína en solución salina, de preferencia usando adyuvante incompleto de Freund. Como alternativa, pueden también generarse anticuerpos mediante inmunización in vitro usando procedimientos conocidos en la técnica, que para los fines de esta invención se considera equivalente a la inmunización in vivo. Los antisueros policlonales se obtienen por extracción de sangre del animal inmunizado en un recipiente de vidrio o de plástico, incubando la sangre a 25 ºC durante una hora, seguido por la incubación a 4 ºC durante 2-18 horas. El suero se recupera por centrifugación (por ejemplo, 1.000 g x durante 10 minutos). Pueden obtenerse aproximadamente 20-50 ml por extracción de sangre de conejos.

La producción de células Sf9 (Spodoptera frugiperda) se da a conocer en la Patente de EEUU Nº 6.004.552. En resumen, se combinaron secuencias que codifican CD40 humano en un baculovirus usando vectores de transferencia. Los plásmidos se cotransfectaron con ADN de baculovirus de tipo silvestre en células Sf9. Las células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante se identificaron y se purificaron como clones.

De preferencia el anticuerpo es monoclonal en la naturaleza. Por “anticuerpo monoclonal” se entiende un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan naturalmente que puedan estar presentes en cantidades menores. El término no está limitado con respecto a la especie o la fuente del anticuerpo. El término abarca inmunoglobulinas completas, así como fragmentos tales como Fab, F(ab')2, Fv y otros que retienen la función de unión al antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico, es decir, el antígeno CD40 de superficie celular en la presente invención. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo ya que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que es necesaria la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usan según la presente invención pueden producirse por el procedimiento de hibridomas descrito por primera vez por Kohler y col. (1975) Nature 256: 495,

o pueden producirse por los procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de EEUU Nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” pueden aislarse también de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clackson y col. (1991) Nature 352: 624-628; Marks y col. (1991) J Mol. Biol. 222: 581-597; y en la Patente de EEUU Nº 5.514.548.

Por “epítopo” se entiende la parte de la molécula antigénica para la que se produce un anticuerpo y a la que se unirá el anticuerpo. Los epítopos pueden comprender residuos lineales de aminoácidos (es decir, los residuos en el epítopo están organizados consecutivamente uno después de otro en forma lineal), residuos no lineales (a los que se hace referencia en el presente documento como “epítopos no lineales”; estos epítopos no están organizados de forma consecutiva), o residuos de aminoácidos tanto lineales como no lineales.

La expresión “epítopo del antígeno CD40” según se usa en el presente documento se refiere a una molécula de estructura tridimensional (bien lineal o bien conformacional) que es capaz de tener inmunorreactividad con los anticuerpos monoclonales anti-CD40 de esta invención, excluyendo el propio antígeno CD40. Los epítopos del antígeno CD40 pueden comprender proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos, hidratos de carbono, lípidos y otras moléculas, pero para los fines de la presente invención son más comúnmente proteínas, oligopéptidos cortos, miméticos de oligopéptidos (es decir, compuestos orgánicos que imitan las propiedades de unión al anticuerpo del antígeno CD40), o sus combinaciones. Los miméticos de oligopéptidos adecuados se describen, entre otros, en la solicitud de PCT US 91/04282.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando el procedimiento de Kohler y col. (1975) Nature 256: 495-496, o una modificación del mismo. Típicamente, se inmuniza un ratón con una solución que contiene el antígeno. La inmunización puede llevarse a cabo mezclando

o emulsionando la solución que contiene el antígeno en solución salina, de preferencia en un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund, e inyectando la mezcla o emulsión por vía parenteral. Puede usarse cualquier procedimiento de inmunización conocido en la técnica para obtener anticuerpos monoclonales de la invención. Tras la inmunización del animal, se extirpa el bazo (y de manera opcional, varios ganglios linfáticos grandes) y se separan las células individuales. Las células del bazo pueden examinarse aplicando una suspensión de células a una placa o pocillo recubierto con el antígeno de interés. Las células B que expresan la inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno se unen a la placa y no se eliminan por aclarado. A continuación se induce la fusión de las células B resultantes, o de todas las células separadas del bazo, con células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo. Las células resultantes se plaquean por dilución en serie y se realiza el ensayo de producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno de interés (y que no se unen a antígenos no relacionados). A continuación se cultivan los hibridomas que secretan el anticuerpo monoclonal (mAb) seleccionado in vitro (por ejemplo, en frascos de cultivo tisular o reactores de fibras huecas), o in vivo (como ascitis en ratones).

Cuando los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención deben prepararse usando procedimientos de ADN recombinante, el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma descritas en el presente documento sirven como una fuente de preferencia de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en las células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra manera proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de recopilación sobre expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra y col. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5: 256 y Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130: 151. Como una alternativa al uso de hibridomas, puede producirse anticuerpo en una línea celular tal como una línea celular CHO, como se da a conocer en las Patentes de EEUU Nº 5.545.403; 5.545.405; y 5.998.144. En resumen, la línea celular se transfecta con vectores capaces de expresar una cadena ligera y una cadena pesada, respectivamente. Transfectando las dos proteínas en vectores separados, pueden producirse anticuerpos quiméricos. Otra ventaja es la glicosilación correcta del anticuerpo.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo el anticuerpo CHIR

12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se produce en células CHO usando el sistema de expresión de genes GS (Lonza Biologics, Portsmouth, New Hampshire), que usa glutamina sintetasa como un marcador. Véase también las Patentes de EEUU Nº 5.122.464; 5.591.639; 5.658.759; 5.770.359; 5.827.739; 5.879.936; 5.891.693; y 5.981.216.

Los anticuerpos monoclonales contra CD40 son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las secciones dedicadas a antígenos de células B en McMichael, ed. (1987; 1989). Leukocyte Typing III and IV (Oxford University Press, Nueva York); Patentes de EEUU Nº 5.674.492; 5.874.082; 5.677.165; 6.056.959; documento WO 00/63395; documentos de Publicación Internacional Nº WO 02/28905 y WO 02/28904; Gordon y col. (1988) J. Immunol. 140: 1425; Valle y col. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 1463; Clark y col. (1986) PNAS 83: 4494; Paulie y col. (1989) J. Immunol. 142: 590; Gordon y col. (1987) Eur. J. Immunol. 17: 1535; Jabara y col. (1990) J. Exp. Med. 172: 1861; Zhang y col. (1991) J. Immunol. 146: 1836; Gascan y col. (1991) J. Immunol. 147: 8; Banchereau y col. (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3: 8; y Banchereau y col. (1991) Science 251: 70. Son de particular interés para la presente invención los anticuerpos anti-CD40 antagonistas dados a conocer en el presente documento que comparten las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR

12.12 descritos anteriormente.

Adicionalmente, la expresión “anticuerpo anti-CD40” según se usa en el presente documento abarca anticuerpos quiméricos anti-CD40; tales anticuerpos anti-CD40 quiméricos para uso en los procedimientos de la invención tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos en el presente documento. Por anticuerpos “quiméricos” se entiende anticuerpos que de más preferencia se obtienen usando técnicas de ácido desoxirribonucleico recombinante y que comprenden tanto componentes humanos (incluidas especies inmunológicamente “relacionadas”, por ejemplo, chimpancé) como no humanos. Rituxan® es un ejemplo de un anticuerpo quimérico con una región variable murina y una región constante humana. Para propósitos de la presente invención, la región constante del anticuerpo quimérico es de la mayor preferencia sustancialmente idéntica a la región constante de un anticuerpo natural humano; la región variable del anticuerpo quimérico de la mayor preferencia se obtiene de una fuente no humana y tiene la especificidad antigénica deseada para el antígeno CD40 de superficie celular. La fuente no humana puede ser cualquier fuente de vertebrado que pueda usarse para generar anticuerpos contra un antígeno CD40 humano de superficie celular o material que comprenda un antígeno CD40 humano de superficie celular. Tales fuentes no humanas incluyen, pero no se limitan a, roedores (por ejemplo, conejo, rata, ratón, etc.; véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 4.816.567) y primates no humanos (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio, etc.; véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.750.105 y 5.756.096). Según se usa en el presente documento, la frase “inmunológicamente activo” cuando se usa en referencia a anticuerpos anti-CD40 quiméricos significa un anticuerpo quimérico que se une a CD40 humano.

Los anticuerpos anti-CD40 humanizados representan anticuerpos anti-CD40 adicionales adecuados para usar en la presente invención. Por “humanizado” se entienden formas de anticuerpos anti-CD40 que contienen una secuencia mínima derivada de secuencias de inmunoglobulinas no humanas. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que están reemplazados residuos de una región hipervariable (también conocida como región determinante de complementariedad o CDR) del receptor por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. La expresión “región determinante de complementariedad” se refiere a las secuencias de aminoácidos que juntas definen la afinidad y especificidad de unión de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina nativa. Véase, por ejemplo, Chothia y col. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Kabat y col. (1991) U.S. Dept of Health and Human Services, Publicación NIH Nº 91-3242). La expresión “región constante” se refiere a la parte de la molécula de anticuerpo que confiere funciones de efector. En trabajos anteriores dirigidos a la producción de anticuerpos no inmunogénicos para uso en terapia de enfermedades humanas, se sustituyeron regiones constantes de ratón por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los anticuerpos humanizados del sujeto se derivaron de inmunoglobulinas humanas. Sin embargo, estos anticuerpos humanizados aún facilitaron una respuesta inmune no deseada y potencialmente peligrosa en seres humanos y hubo pérdida de afinidad. Los anticuerpos anti-CD40 humanizados para uso en los procedimientos de la presente invención tienen características de unión similares a las exhibidas por los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos en el presente documento.

La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann y col. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen y col. (1988) Science 239: 1534-1536), sustituyendo secuencias de un anticuerpo humano por las correspondientes CDR o secuencias CDR de roedores o roedores mutantes. Véase también las Patentes de EEUU Nº 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761;

5.693.762 y 5.859.205. En algunos casos, los residuos dentro de las regiones marco de una o más regiones variables de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos (véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370). Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar más el rendimiento del anticuerpo (por ejemplo, para obtener la afinidad deseada). En general, en anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas

o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones y col. (1986) Nature 331: 522-525; Riechmann y col. (1988) Nature 332: 323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. Por consiguiente, tales anticuerpos “humanizados” pueden incluir anticuerpos en los que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos del marco están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Véase también la Patente de EEUU Nº 6.180.370, y el documento de Publicación Internacional WO 01/27160, en los que se dan a conocer anticuerpos humanizados y técnicas para producir anticuerpos humanizados que tienen mejor afinidad para un antígeno predeterminado.

También están abarcados por el término anticuerpos anti-CD40 los anticuerpos anti-CD40 xenogénicos o modificados producidos en un huésped mamífero no humano, más particularmente un ratón transgénico, caracterizados por loci de inmunoglobulina (Ig) endógena inactivados. En tales animales transgénicos, los genes endógenos competentes para la expresión de las subunidades ligera y pesada de las inmunoglobulinas del huésped se convierten en no funcionales y se sustituyen con los loci análogos de inmunoglobulina humana. Estos animales transgénicos producen anticuerpos humanos en ausencia sustancial de subunidades ligera o pesada de inmunoglobulina del huésped. Véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 5.877.397 y 5.939.598.

De preferencia, los anticuerpos totalmente humanos contra CD40 se obtienen inmunizando ratones transgénicos. Uno de tales ratones se obtiene usando tecnología XenoMouse® (Abgenix; Fremont, California), y se da a conocer en las Patentes de EEUU Nº 6.075.181,

6.091.001 y 6.114.598. Para producir los anticuerpos que se dan a conocer en el presente documento, se inmunizaron ratones transgénicos para el locus de cadena pesada de IgG1 humana y el locus de cadena ligera K humana con células Sf9 que expresan CD40 humano. Los ratones también pueden ser transgénicos para otros isotipos. Los anticuerpos totalmente humanos útiles en los procedimientos de la presente invención se caracterizan por tener propiedades de unión similares a las exhibidas por los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos en el presente documento.

Los fragmentos de los anticuerpos anti-CD40 son adecuados para uso en los procedimientos de la invención siempre que retengan la afinidad deseada del anticuerpo de longitud total. Por consiguiente, un fragmento de un anticuerpo anti-CD40 retendrá la capacidad para unirse al antígeno CD40 de superficie de las células B. Tales fragmentos se caracterizan por tener propiedades similares al anticuerpo anti-CD40 antagonista de longitud total correspondiente, es decir, los fragmentos se unirán específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana, y están exentos de actividad agonista significativa pero exhiben actividad antagonista cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula humana que expresa CD40. En el presente documento se hace referencia a estos fragmentos como fragmentos “que se unen al antígeno”.

Los fragmentos de un anticuerpo que se unen al antígeno adecuados comprenden una parte de un anticuerpo de longitud total, por lo general la región de unión al antígeno o una de sus regiones variables. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, F(ab’)2 y Fv y moléculas de anticuerpos de cadena simple. Por “Fab” se entiende un fragmento monovalente de una inmunoglobulina que se une al antígeno que está compuesto por la cadena ligera y parte de la cadena pesada. Por F(ab’)2 se entiende un fragmento bivalente de una inmunoglobulina que se une al antígeno que contiene ambas cadenas ligeras y parte de ambas cadenas pesadas. Por “Fv de cadena simple” o fragmentos “sFv” del anticuerpo se entiende fragmentos que comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica simple. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030 y 5.856.456. Por lo general, el polipéptido Fv comprende además un conector de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun (1994) en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, Nueva York), páginas 269

315. Los fragmentos de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas que se unen al antígeno dados a conocer en el presente documento también pueden conjugarse a una citotoxina para producir la lisis de las células cancerosas diana, como se describe a continuación en el presente documento.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos generadas usando las técnicas descritas en, por ejemplo, McCafferty y col. (1990) Nature

348: 552-554 (1990) y en la Patente de EEUU Nº 5.514.548. Clackson y col. (1991) Nature 352: 624-628 y Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (del orden de nM) por mezcla aleatoria de cadenas (Marks y col. (1992) Biol/Technology 10:779-783), así como por infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y col. (1993) Nucleic, Acids Res. 21: 22652266). Por consiguiente, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtuvieron por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y col. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) y Brennan y col. (1985) Science 229: 81). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente por medio de células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de la biblioteca de anticuerpos de fagos analizada anteriormente. Como alternativa, los fragmentos Fab’-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y pueden acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter y col. (1992) Bio/Technology 10: 163-167). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab’)2 pueden aislarse directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otra técnica para la producción de fragmentos de anticuerpos resultará evidente para el experto en la técnica.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas útiles en la presente invención incluyen los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR 12.12 dados a conocer en el presente documento así como los anticuerpos que difieren de estos anticuerpos pero que retienen las CDR; y los anticuerpos con una o más adiciones, deleciones o sustituciones, en los que la actividad antagonista se mide por inhibición de la proliferación y/o diferenciación de las células B. La invención también abarca los anticuerpos anti-CD40 antagonistas desinmunizados, que pueden producirse como se describe en, por ejemplo, los documentos de Publicación Internacional Nº WO 98/52976 y WO 0034317. De esta manera, los residuos dentro de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se modifican para convertir a los anticuerpos en no inmunogénicos o menos inmunogénicos para los seres humanos manteniendo al mismo tiempo su actividad antagonista hacia las células humanas que expresan CD40, en los que tal actividad se mide por medio de los ensayos señalados en otra parte en el presente documento. También se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones las proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo antiCD40 antagonista de la invención, o uno de sus fragmentos, cuyas proteínas de fusión pueden sintetizarse o expresarse a partir de vectores de polinucleótidos correspondientes, como se conoce en la técnica. Tales proteínas de fusión se describen con referencia a la conjugación de anticuerpos como se señala a continuación.

Los anticuerpos de la presente invención pueden tener variaciones de secuencia producidas usando los procedimientos descritos en, por ejemplo, los documentos de Publicación de Patente Nº EP 0 983 303 Al, WO 00/34317 y WO 98/52976. Por ejemplo, se ha mostrado que las secuencias dentro de la CDR pueden provocar que un anticuerpo se una a MAC Clase II y desencadenar una respuesta de células T ayudantes no deseada. Una sustitución conservadora puede permitir que el anticuerpo retenga la actividad de unión y aún pierda su capacidad para desencadenar una respuesta de células T no deseada. Cualquiera de tales sustituciones conservadoras o no conservadoras puede realizarse usando procedimientos reconocidos en la técnica, tales como los señalados en otra parte en el presente documento, y los anticuerpos resultantes se encontrarán dentro del alcance de la invención. Los anticuerpos variantes pueden probarse de manera rutinaria para verificar su actividad antagonista, afinidad y especificidad usando los procedimientos descritos en el presente documento.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas útiles en la práctica de la invención pueden tener uno

o muchos mecanismos de acción. Un anticuerpo producido por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, o por cualquier otro procedimiento no dado a conocer en el presente documento, se encontrará dentro del alcance de esta descripción si posee al menos una de las siguientes actividades biológicas in vitro y/o in vivo: inhibición de la secreción de inmunoglobulinas por las células B periféricas humanas normales estimuladas por células T; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de células B periféricas humanas normales estimuladas por células T Jurkat; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de células B periféricas humanas normales estimuladas por células que expresan CD40L o ligando de CD40 soluble (sCD40L); inhibición de señales intracelulares intra apoptóticas de “supervivencia” en cualquier célula estimulada por sCD40L o CD40L de fase sólida; e; inhibición de transducción de señal de CD40 en cualquier célula tras la unión con sCD40L o CD40L de fase sólida, deleción, anergia y/o inducción de tolerancia de células objetivo que llevan CD40 o de células que llevan ligandos de cognado para CD40 incluyendo, pero no limitados a, células T y células B, inducción de expansión o activación de células T reguladoras CD4+CD25+ (véase, por ejemplo, rechazo de tejidos específico de aloantígeno del donante por medio de interferencia CD40-CD40L, van Maurik y col. (2002) J. Immunol. 169: 5401-5404), citotoxicidad por medio de cualquier mecanismo (incluyendo, pero no limitados a, citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC), citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), regulación descendente de proliferación, y/o apoptosis en células objetivo), modulación de secreción de citoquinas y/o expresión de moléculas en la superficie celular en células objetivo y combinaciones de las mismas. Los ensayos para tales actividades biológicas pueden realizarse como se describe en los Ejemplos en el presente documento. Véanse también los ensayos descritos en Schultze y col. (1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 92: 8200-8204; Denton y col. (1998) Pediatr. transplant. 2: 6-15; Evans y col. (2000) J. Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman y col. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan y col. (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom y col. (1993) Immunology

79: 439-444; y Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y 5.847.082.

Un ensayo representativo para detectar anticuerpos anti-CD40 antagonistas específicos para los epítopos del antígeno CD40 identificado en el presente documento es un “ensayo de unión competitiva”. Los ensayos de unión competitiva son ensayos serológicos en los que lo desconocido se detecta y cuantifica por su capacidad para inhibir la unión de un ligando conocido marcado a su anticuerpo específico. Esto también se conoce como un ensayo de inhibición competitiva. En un ensayo de unión competitiva representativo, se precipita el polipéptido CD40 marcado por medio de anticuerpos candidatos en una muestra, por ejemplo, en combinación con anticuerpos monoclonales surgidos contra uno o más epítopos de los anticuerpos monoclonales de la invención. Los anticuerpos anti-CD40 que reaccionan específicamente con un epítopo de interés pueden identificarse seleccionando una serie de anticuerpos preparados contra una proteína CD40 o fragmento de la proteína que comprende el epítopo particular de la proteína CD40 de interés. Por ejemplo, para CD40 humano, los epítopos de interés incluyen epítopos que comprenden residuos de aminoácido lineales o no lineales de la isoforma corta del CD40 humano (véase GenBank Nº de acceso NP_690593) presentada en la Figura 4B (SEC ID Nº: 10), codificada por la secuencia presentada en la Figura 4A (SEC ID Nº: 9; véase también GenBank Nº de acceso MN_152854), o de la isoforma larga de CD40 humano (véase GenBank Nº de acceso CAA43045 y NP_001241) presentada en la Figura 4D (SEC ID Nº: 12), codificada por la secuencia presentada en la Figura 4C (SEC ID Nº: 11; véase GenBank Nº de acceso X60592 y MN_001250). Como alternativa, podrían usarse ensayos de unión competitiva con anticuerpos anti-CD40 antagonistas adecuados identificados anteriormente para seleccionar los anticuerpos monoclonales comparables a los anticuerpos identificados anteriormente.

Los anticuerpos usados en tales inmunoensayos pueden estar marcados o no marcados. Los anticuerpos no marcados pueden usarse en aglutinación; los anticuerpos marcados pueden usarse en una amplia diversidad de ensayos, usando una amplia diversidad de marcadores. La detección de la formación de un complejo antígeno-anticuerpo entre un anticuerpo anti-CD40 y un epítopo de interés puede facilitarse fijando una sustancia detectable al anticuerpo. Los medios de detección adecuados incluyen el uso de marcadores como radionúclidos, enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes, cromógenos, complejos enzima sustrato o cofactores, inhibidores de enzimas, complejos de grupos prostéticos, radicales libres, partículas, colorantes y similares. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes apropiados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material fluorescente es el luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de material radiactivos adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. Tales reactivos marcados pueden usarse en una diversidad de ensayos conocidos, tales como radioinmunoensayos, inmunoenzayos enzimáticos, por ejemplo, ELISA inmunoensayos fluorescentes y similares. Véase, por ejemplo, Patentes de EEUU Nº 3.766.162; 3.791.932; 3.817.837; y 4.233.402.

Cualquiera de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas o sus fragmentos de anticuerpos descritos previamente pueden conjugarse antes del uso en los procedimientos de la presente invención. Los procedimientos para producir anticuerpos conjugados son conocidos en la técnica. Por consiguiente, el anticuerpo anti-CD40 puede marcarse usando una marcación indirecta o un enfoque de marcación indirecta. Los marcadores adecuados incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radiactivos (especialmente 32P y 125I), reactivos densos a electrones, enzimas y ligandos que tienen parejas de unión específicas.

Las enzimas se detectan normalmente por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa del rábano picante se detecta usualmente mediante su capacidad para convertir 3,3’,5,5’tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. “Pareja de unión específica” se refiere a una proteína capaz de unirse a una molécula de ligando con alta especificidad, como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para éste. Otras parejas de unión específica incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y las numerosas parejas de receptor-ligando conocidas en la técnica. Debería entenderse que la descripción anterior no pretende categorizar los diversos marcadores en diferentes clases, ya que el mismo marcador puede servir en varios modos diferentes. Por ejemplo, HRP puede servir como enzima o como antígeno para un mAb. Además, pueden combinarse diversos marcadores para el efecto deseado. Por ejemplo, los mAb y la avidina también requieren marcadores en la práctica de esta invención: por consiguiente, podría marcarse un mAb con biotina, y detectarse su presencia con avidina

125I,

marcada con o con un mAb anti-biotina marcado con HRP. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente invención.

Además, un anticuerpo (o su fragmento) puede conjugarse a un resto terapéutico tal como un agente terapéutico, por ejemplo. El resto del fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que tenga una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una proteína tal como CTLA4-Ig, un anticuerpo o cualquier otra proteína, o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, factor de necrosis tumoral, interferón alfa, interferón beta, factor de crecimiento de los nervios, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, activador tisular del plasminógeno, BLys (Estimulador de Linfocitos B), interleucina 1 (“IL-1”), interleucina 2 (“IL-2”), interleucina-6 (“IL-6”), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (“GM-CSF”), factor estimulador de colonias de granulocitos (“GCSF”) u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar tales restos terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo, Amon y col. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs and Cancer Therapy", ed. Reisfeld y col. (Alan R. Liss, Inc.), páginas 243-256; ed. Hellstrom y col.

(1987), Controlled Drug Delivery, ed. Robinson y col. (2ª ed; Marcel Dekker, Inc.), páginas 623653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies ’84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera y col. páginas 475506 (Editrice Kurtis, Milán, Italia, 1985); Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin y col. (Academic Press, Nueva York, 1985), páginas 303-316; y Thorpe y col. (1982) Immunol. Rev. 62: 119-158.

Como alternativa, un anticuerpo puede conjugarse a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpos como se describe en la Patente de EEUU Nº 4.676.980. Además, pueden usarse conectores entre los marcadores y los anticuerpos de la invención (véase Patente de EEUU Nº 4.831.175). Los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno pueden marcarse directamente o indirectamente (Patente de EEUU Nº 5.595.721). El tratamiento puede estar constituido por una combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no conjugados administrados en forma simultánea o consecutiva (documentos WO 00/52031 y WO 00/52473).

Variantes de anticuerpos anti-CD40 antagonistas

En los procedimientos de la presente invención pueden usarse variantes de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas biológicamente activas adecuadas. Tales variantes retendrán las propiedades de unión deseadas del anticuerpo anti-CD40 antagonista original. Por lo general, en la técnica están disponibles procedimientos para producir variantes de anticuerpos.

Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 descritos en el presente documento, por medio de mutaciones en la secuencia de ADN clonada que codifica el anticuerpo de interés. Los procedimientos para mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 488-492; Kunkel y col. (1987) Methods Enzymol. 154: 367-382; Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York); Patente de EEUU Nº 4.873.192; y las referencias citadas en la misma. En el modelo de Dayhoff y col. (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) puede encontrarse orientación para sustituciones adecuadas de aminoácidos que no afectan la actividad biológica del polipéptido de interés. Las sustituciones conservadoras, tales como los intercambios de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser de preferencia. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen, pero no se limitan a, Gly⇔Ala, Val⇔Ile⇔Leu, Asp⇔Glu, Lys⇔Arg, Asn⇔Gln y Phe⇔Trpo⇔Tyr.

En la construcción de variantes del polipéptido de interés del anticuerpo anti-CD40 antagonista, las modificaciones se realizan de manera tal que las variantes sigan teniendo la actividad deseada, es decir, afinidad de unión similar y sean capaces de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana y estén exentas de actividad agonista significativa pero que exhiban actividad antagonista cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula humana que expresa CD40. Obviamente, cualesquiera mutaciones realizadas en el ADN que codifica la variante polipéptido no deben colocar a la secuencia fuera del marco de lectura y de preferencia no crearán regiones complementarias que podrían producir estructura de ARNm secundaria. Véase Publicación de Solicitud de Patente Nº 75.444.

Además, la región constante de un anticuerpo anti-CD40 antagonista puede mutarse para alterar la función efectora en una serie de formas. Por ejemplo, véase la Patente de EEUU Nº 6.737.056B1 y la Publicación de Solicitud de Patente Nº 2004/0132101A1, que dan a conocer mutaciones de Fc que optimizan la unión del anticuerpo a los receptores de Fc.

De preferencia, las variantes de un anticuerpo anti-CD40 antagonista de referencia tienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos 70 % o 75 % de identidad de secuencia, de preferencia al menos 80 % u 85 % de identidad de secuencia, de más preferencia al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % ó 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos para la molécula del anticuerpo anti-CD40 antagonista de referencia, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 descrito en el presente documento, o con una parte más corta de una molécula de anticuerpo de referencia. De más preferencia, las moléculas comparten al menos 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia. Para los fines de la presente invención, el porcentaje de identidad de secuencia se determina usando el algoritmo de búsqueda de identidad de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con parámetros de penalización de hueco abierto de 12 y penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de identidad de Smith-Waterman se enseña en Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489. Una variante puede, por ejemplo, diferir del anticuerpo anti-CD40 antagonista de referencia en tan pocos como 1 a 15 residuos de aminoácidos, tan pocos como 1 a 10 residuos de aminoácidos, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de aminoácido.

Con respecto a la alineación óptima de dos secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia de aminoácidos variante puede tener residuos de aminoácidos adicionales o residuos de aminoácidos delecionados con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo usado para la comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia incluirá al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos y puede tener 30, 40, 50

o más residuos de aminoácidos. Pueden hacerse correcciones para homología de secuencia asociadas con huecos o sustituciones conservadoras de residuos (véase el algoritmo de búsqueda de Smith-Waterman).

La estructura química exacta de un polipéptido capaz de unirse específicamente a CD40 y que retiene la actividad antagonista, en particular cuando se une al antígeno CD40 en células B malignas, depende de una serie de factores. Como en la molécula están presentes grupos amino y carboxilo ionizables, puede obtenerse un polipéptido particular como una sal ácida o básica, o en forma neutra. Todas las preparaciones que retienen su actividad biológica cuando se colocan en condiciones ambientales adecuadas están incluidas en la definición de anticuerpos anti-CD40 antagonistas como se usa en el presente documento. Además, puede aumentarse la secuencia de aminoácidos principal del polipéptido por derivatización usando restos de azúcar (glicosilación) o por otras moléculas complementarias tales como lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. También puede aumentarse por conjugación con sacáridos. Ciertos aspectos de tal aumento se realizan a través de sistemas de procesamiento postraduccionales del huésped productor; otras de tales modificaciones pueden introducirse in vitro. En cualquier caso, tales modificaciones están incluidas en la definición de un anticuerpo anti-CD40 usada en el presente documento siempre que no se destruyan las propiedades de antagonista del anticuerpo anti-CD40. Se espera que tales modificaciones puedan afectar cuantitativamente o cualitativamente la actividad, ya sea aumentando o disminuyendo la actividad del polipéptido, en los diversos ensayos. Además, pueden modificarse residuos de aminoácidos individuales en la cadena por oxidación, reducción u otra derivatización, y el polipéptido puede escindirse para obtener fragmentos que retengan la actividad. Tales alteraciones que no destruyen la actividad antagonista no retiran a la secuencia del polipéptido de la definición de anticuerpos anti-CD40 de interés según se usa en el presente documento.

La técnica proporciona orientación sustancial con respecto a la preparación y al uso de las variantes de polipéptidos. En la preparación de las variantes de anticuerpos anti-CD40, un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué modificaciones a la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la proteína nativa darán como resultado una variante que sea adecuada para uso como un componente terapéuticamente activo de una composición farmacéutica usada en los procedimientos dados a conocer en el presente documento.

Procedimientos de terapia usando los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención

Los procedimientos dados a conocer en el presente documento están dirigidos al uso de anticuerpos anti-CD40 antagonistas para tratar sujetos (es decir pacientes) que tienen una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, o una predisposición a desarrollar una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, en los que la enfermedad y/o inflamación está mediada por la señalización de CD40 mediada por ligando de CD40 en células que expresan CD40. Por el término “células que expresan CD40”, se entienden las células que expresan el antígeno CD40. Los procedimientos para detectar la expresión de CD40 en células son muy conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, técnicas de PCR, inmunohistoquímica, citometría de flujo, transferencia Western, ELISA y similares.

Los procedimientos dados a conocer en el presente documento son especialmente útiles para tratar enfermedades inflamatorias y/o enfermedades autoinmunes en las que está implicada la estimulación de CD40 mediada por ligando de CD40. Las composiciones de la invención se pueden administrar profilácticamente o terapéuticamente o en una combinación de las mismas.

Las enfermedades inflamatorias están caracterizadas por la inflamación y la destrucción de tejidos, o por una combinación de las mismas. “Enfermedad inflamatoria” incluye cualquier proceso mediado por el sistema inmune inflamatorio donde el evento iniciador o el objetivo de la respuesta imune implican antígeno o antígenos que no son autoantígenos, incluyendo, por ejemplo, aloantígenos, xenoantígenos, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos desconocidos o alérgenos.

Adicionalmente, para propósitos de la presente invención, el término “enfermedad(es) inflamatoria(s)” incluyen “enfermdad(es) autoinmune(s)”. Como se usa en el presente documento, el término “autoinmunidad” se entiende generalmente para abarcar procesos mediados por el sistema inmune inflamatorios que implican “autoantígenos”. En enfermedades autoinmunes, el/los autoantígeno(s) activan respuestas inmunes del huésped.

Además, la presente revelación incluye tratamiento de inflamación asociado con rechazo de transplante de tejidos. “Rechazo de transplantes” o “rechazo de injertos” se refiere a cualquier respuesta inmune elaborada por el hospedador contra un injerto incluyendo pero no limitada a antígenos HLA, antígenos de grupo sanguíneo y similares.

La invención también se puede usar para tratar la enfermedad injerto contra huésped, tal como aquella asociada con transplate de médula ósea, por ejemplo. En tal enfermedad injerto contra huésped, la médula ósea del donante incluye linfocitos y células que maduran en linfocitos. Por consiguiente, como se usa en el presente documento, “enfermedad injerto contra huésped” o “reacción injerto contra huésped” se refiere a respuesta inmune mediada por células T en la que los linfocitos del donante reaccionan con los antígenos del hospedador.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos descrito en el presente documento se pueden usar de acuerdo con la invención para tratar trastornos autoinmunes y/o inflamatorios que incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso sistémico (LES), lupus discoide, nefritis de lupus, sarcoidosis, artritis inflamatoria, incluyendo, pero no limitada a, artritis juvenil, artritis reumatoide, artritis soriática, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante y artritis gotosa, rechazo de un transplante de órgano o tejido, rechazo hiperagudo, agudo o crónico y/o enfermedad de injerto frente a hospedador, esclerosis múltiple, síndrome de hiper IgE, poliarteritis nodosa, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca (enteropatía de sensibilidad al gluten), hepatitis autoinmune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmune, soriasis, escleroderma, miastenia gravis, púrpura trombocitopénica autoinmune, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Graves, tiroiditis de hasimoto, enfermedad compleja inmune, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmune (SFCDI), polimiositis y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombolisis, cardiomiopatía, pénfigo vulgar, fibrosis intersticial pulmonar, sarcoidosis, diabetes mellitus de Tipo I y de Tipo II, hipersensibilidad de tipo retardado de tipo 1, 2, 3 y 4, alergia o trastornos alérgicos, respuestas inmunes indeseadas/no queridas a proteínas terapéuticas, asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatosis alérgica), dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica e irritante, urticaria, alergia mediada por IgE, aterosclerosis, vaculitis, miopatías inflamatorias idiomáticas, enfermedad hemolítica, enfermedad de Alzheimer, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, y similares.En algunas otras realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención son útiles en tratar inflamación pulmonar incluyendopero no limitada a rechazo de injerto pulmonar, asma, sarcoidosis, enfisema, fibrosis quística, fibrosis pulmonar idiomática, bronquitis crónica, rinitis alérgica y enfermedades alérgicas del pulmón tales como neumonitis de hipersensibilidad, neumonía eosinófila, bronquiolitis obliterante debida a transplante de médula ósea y/o de pulmón, u otras causas, aterosclerosis de injerto/fleboesclerosis de injerto, así como fibrosis pulmonar resultante de enfeemdades del colágeno, vasculars y autoinmunes tales como artritis reumatoide y lupus eritematoso.

“Tratamiento” se define en el presente documento como la aplicación o administración de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno a un sujeto, o la aplicación o administración de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión a antígeno a un tejido aislado o línea celular de un sujeto, donde un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, un síntoma de una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria o una predisposición hacia una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, donde el objetivo es curar, sanar, calmar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, hacer mejoras en o afectar la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria, cualesquiera síntomas de la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria o la predisposición al desarrollo de la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria. Por “tratamiento” también se entiende la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD40 antagonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto, o la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD40 antagonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un tejido aislado o una línea celular del sujeto, donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, un síntoma asociado con una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, o una predisposición hacia una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria , siendo el objetivo curar, sanar, calmar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, hacer mejoras en o afectar a la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria, los síntomas de la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria o la predisposición hacia la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria.

Se entiende por “actividad antiinflamatoria” una reducción o prevención de la inflamación. La terapia con al menos un anticuerpo anti-CD40 (o su fragmento de unión al antígeno) como se define en otro lugar en el presente documento causa una respuesta fisiológica que es beneficiosa con respecto al tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, donde la enfermedad involucra células que expresan el antígeno CD40. Se reconoce que los procedimientos descritos en el presente documento pueden ser útiles en evitar cambio fenotípico en células tal como proliferación, activación y similares.

De conformidad con los procedimientos dados a conocer en el presente documento, al menos un anticuerpo anti-CD40 antagonista (o su fragmento de unión al antígeno) tal como se define en otras partes en el presente documento se usa para promover una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria. Por “respuesta terapéutica positiva” con respecto a una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria se entiende una mejora en la enfermedad asociada con la actividad antiinflamatoria de estos anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno, y/o una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad. Es decir, puede observarse un efecto antiproliferativo, la prevención de proliferación adicional de las células que expresan CD40, una reducción en la respuesta inflamatoria que incluye pero no se limita a secreción reducida de citoquinas inflamatorias, moléculas de adhesión, proteasas, inmunoglobulinas (en casos donde la célula que lleva CD40 es una célula B), combinaciones de los mismos, y similares, producción incrementada de proteínas antiinflamatorias, una reducción en el número de células autorreactivas, un incremento en tolerancia inmune, inhibición de supervivencia de células autorreactivas, y/o un decrecimiento en uno o más síntomas mediados por la estimulación de las células que expresan CD40. Tales respuestas terapéuticas positivas no están limitadas por la vía de administración y pueden comprender administración al donante, al tejido del donante (tal como por ejemplo perfusión de órganos), al huésped, cualquier combinación de ellas y similares.

La respuesta clínica puede evaluarse usando técnicas de examen tales como la formación de imágenes de resonancia magnética (RM), la formación de imágenes de rayos x, exploración por tomografía computerizada (TC), citometría de flujo o análisis por clasificador de células activado por fluorescencia (FACS), histología, patología macroscópica y química de la sangre, incluyendo pero no limitadas a cambios detectables por ELISA, RIA, cromatografía y similares. Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto que se somete a terapia con el anticuerpo anti-CD40 antagonista o con su fragmento de unión a antígeno puede experimentar el efecto beneficioso de una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad.

Por “dosis o cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad eficaz” se entiende una cantidad de anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al anticuerpo que, cuando se administra da lugar a una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un sujeto con una enfermedad que comprende la estimulación de las células que expresan CD40. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 o su fragmento está en el intervalo desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. Se reconoce que el procedimiento de tratamiento puede comprender una única administración de una dosis terapéuticamente eficaz o múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno.

Otra realización de la descripción es el uso de anticuerpos anti-CD40 antagonistas para el control de diagnóstico de los niveles proteicos en el tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa del rábano picante, la fosfatasa alcalina, la β-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material fluorescente incluye el luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen la luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I 35S o 3H.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas y sus fragmentos de unión al antígeno, se pueden usarse en combinación con cualesquiera terapias conocidas para enfermedades autoinmunes

o inflamatorias, incluyendo cualquier agente o combinación de agentes que se conocen por ser útiles, o que se han usado o se están usando actualmente, para tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Tales terapias y agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, cirugía o procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, esplenectomía, hepatectomía, linfadenectomía, leucoforesis, transplante de células, tejidos u órganos, procedimientos intestinales, perfusión de órganos y similares); terapia de radiación; terapia tal como terapia de esteroides y terapia no esteroídica, terapia de hormonas, terapia de citoquinas, terapia con agentes dermatológicos (por ejemplo,agentes tópicos usados para tratar afecciones de la piel tales como alergias, dermatitis de contacto y soriasis), terapia inmunosupresora y terapia antiinflamatoria de anticuerpos monoclonales distinta y similares. De esta manera, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas descritos en el presente documento, o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos se administran en combinación con al menos otra terapia, incluyendo pero no limitada a, cirugía, perfusión de órganos, terapia de radiación, terapia de esteroides, terapia no esteroídica, terapia de antibióticos, terapia antifúngica, terapia de hormonas, terapia de citoqionas, terapia con agentes dermatológicos (por ejemplo agentes tópicos usados para tratar afecciones de la piel tales como alergias, dermatitis de contacto y soriasis), terapia inmunosupresora, terapia anti-inflamatoria de anticuerpos monoclonales distinta, combinaciones de las mismas y similares. Por consiguiente, donde las terapias combinadas comprenden administración de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión a anticuerpo en combinación con administración de otro agente terapéutico y con esteroides como un ejemplo, los procedimientos dados a conocer en el presente documento comprenden coadministración, usando formulaciones distintas o una formulación farmacéutica individual y administración consecutiva en cualquier orden.

Donde los procedimientos dados a conocer en el presente documento comprenden regímenes terapéuticos combinados, estas terapias pueden darse de manera simultánea, es decir, el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno se administra simultáneamente o dentro del mismo período de tiempo que la otra terapia (es decir, las terapias tienen lugar simultáneamente, pero el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno no se administra precisamente en el mismo momento que la otra terapia). Como alternativa, el anticuerpo anti-CD40 antagonista de la presente invención o su fragmento de unión al antígeno puede también administrarse antes de, o posteriormente a la otra terapia. La administración secuencial de las diferentes terapias contra el cáncer puede realizarse independientemente de que el sujeto tratado responda al primer curso de terapia para disminuir la posibilidad de remisión o recaída.

En algunas realizaciones de la revelación, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas descritos en el presente documento, o sus fragmentos de unión al antígeno, se administran en combinación con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios, en los que el anticuerpo y el/los agente(s) terapéutico(s) se pueden administrar secuencialmente, en cualquier orden, o simultáneamente (es decir, concurrentemente o dentro del mismo marco temportal). Los ejemplos de fármacos inmunosupresores adecuados que se pueden administrar en combinación con los anticuerpos anti-CDE40 antagonistas de la invención incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tal como, por ejemplo, ciclosporina aerosolizada (véase, Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º US20020006901), tacrolimus (FK506, ProGraf™), micofenolato de mofetilo y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamina; y proteínas inmunosupresoras, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti CTLA4 y condensaciones de Ig, anticuerpos estimuladores antilinfocitos B (por ejemplo LYMPHOSTAT-B™) y condensaciones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD80 y etanercept (Enbrel®), así como anticuerpos anti-células T tales como anti-CD3 (OKT3), antiCD4 y similares. Ejemplos de agentes antiinflamatorios adecuados incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides tales como, por ejemplo, clobetasol, halobetasol, hidrocortisona, triamciclolona, betametasona, flucinocol, fluocinonida, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID) tales como, por ejemplo, sulfasalazina, medicaciones que contienen mesalamina (conocidsa como agentes 5-ASA), celecoxib, diclofenaco, etodolaco, fenprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ketoprofeno, meclofamato, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, piroxicam, rofecoxib, salicilatos, sulindaco y tomentina; anticuerpos antiinflamatorios tales como adalidumab (HUMIRA®, un antagonista de TNF-α) e infliximab (Remicade®, un antagonista de TNF-α), y similares.

El rechazo a transplante y la enfermedad de injerto contra huésped pueden ser hiperagudas (humorales), agudas (mediadas por células T), o crónicas (etilogía desconocida), o una combinación de las mismas. Por consiguiente, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se usan en algunas realizaciones para evitar y/o mejorar el rechazo y/o los síntomas asociados con rechazo a transplante hiperagudo, agudo, y/o crónico de cualquier tejido, incluyendo, pero no limitado a, hígado, riñón, páncreas, células de isletas del páncreas, intestino delgado, pulmón, corazón, córneas, piel, vasos sanguíneos, hueso, médula ósea heteróloga o antóloga y similares. Los tejidos de injerto se pueden obtener a partir de cualquier donante y se pueden transplantar en cualquier huésped receptor y así el procedimiento de transplante puede comprender transplantar tejido animal a humanos (por ejemplo, xenoinjertos), transplantar tejido de un ser humano a otro ser humano (por ejemplo, aloinjertos), y/o transplantar tejido de una parte de un ser humano a otra (por ejemplo, autoinjertos). El tratamiento con los anticuerpos de la invención puedereducir también las secuelas de transplante tales como fiebre, anorexia, anormalidades hemodinámicas, leucopenia, infiltración de células blancas del tejido/órgano transplantado, sí como infecciones oportunistas.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se pueden usar sólos o en combinación con fármacos inmunosupresores para tratar y/o evitar rechazo de transplante tal como rechazo de transplante hiperagudo, agudo o crónico y/o enfermedad de injerto frente a hospedador. Por consiguiente, en algunas realizaciones donde los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se usan para tratar y/o evitar rechazo de transplantes, los anticuerpos se pueden usar en combinación con fármacos inmunosupresores adecuados, incluyendo, pero no limitados a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tal como, por ejemplo, ciclosporina aerosolizada (véase, Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º US20020006901), tacrolimus (FK506, ProGraf™), micofenolato de mofetilo y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamina; y proteínas inmunosupresoras, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti CTLA4 y condensaciones de Ig, anticuerpos estimuladores antilinfocitos B (por ejemplo LYMPHOSTAT-B™) y condensaciones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD80 y etanercept (Enbrel®), así como anticuerpos anticélulas T tales como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4 y similares.

Se contempla como tal que las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento se usen en combinación con otros fármacos para mejorar adicionalmente los síntomas y consecuencias en los receptores de transplantes, tales como aquellos que reciben injertos pulmonares, por ejemplo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se usaron para tratar rechazo de transplantes (tales como, por ejemplo rechazo hiperagudo, agudo y/o crónico o enfermedad de injerto contra huésped en receptores de transplante de pulmón) solos o en combinación con ciclosporina administrada parenteralmente y/o no parenteralmente, incluyendo por ejemplo ciclosporina oral, ciclosporina inyectable, ciclosporina aerosolizada (por ejemplo, inhalada) y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones donde al menos un componente de la terapia es ciclosporina aerosolizada, la ciclosporina se administra al pulmón del receptor por inalación de ciclosporina en forma de pulverizador de aerosol que usa, por ejemplo, un dispositivo de administración presurizada o un nebulizador. La ciclosporina se puede administrar bien en forma de polvo seco o bien en forma húmeda.

En algunas otras realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se pueden usar solos o en combinación con fármacos inmunosupresores para tratar y/o evitar artritis reumatoide. Por consiguiente en algunas realizaciones donde los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención seusan para tratar artritis reumatoide. Por consiguiente en algunas realizaciones donde los anticuerpos antagonistas anti-CD40 de la invención se pueden usar para tratar artritis reumatoide, los anticuerpos se pueden usar en combinación con fármacos inmunosupresores adecuados, incluyendo, pero no limitados a metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tacrolimus (FK506, ProGraf™), micofenolato de mofetilo y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamina; y proteínas inmunosupresoras, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti CTLA4 y condensaciones de Ig, anticuerpos estimuladores antilinfocitos B (por ejemplo LYMPHOSTAT-B™) y condensaciones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo RITUXAN®), el anticuerpo totalmente humanos HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tituxetan (Zevalin®); anticuerpos anti-CD80, y y etanercept (ENBREL®), así como anticuerpos anti-células T tales como antiCD3 (OKT3), anti-CD4 y similares. Como se discute anteriormente, la efectividad del tratamiento se evaluó usando cualesquiera medios e incluyen, pero no se limitan a, efectividad según se mide por respuestas clínicas definidas por los criterios American Collage of Rheumatology, los criterios de la European League of Rheumatism o cualesquiera otros criterios. Véase por ejemplo, Nelson y col. (1995) Artritis Rheum. 38: 727-35 y van Gestel y col. (1996) Artritis Rheum. 39: 34-40.

En aún otras realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención se pueden usar solos o en combinación con fármacos inmunosupresores para tratar esclerosis múltiple, los anticuerpos se pueden usar en combinación con fármacos inmunosupresores, incluyendo, pero no limitados a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tacrolimus (FK506, ProGraf™), micofenolato de mofetilo y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamina; y proteínas inmunosupresoras, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti CTLA4 y condensaciones de Ig, anticuerpos estimuladores antilinfocitos B (por ejemplo LYMPHOSTATB™) y condensaciones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo RITUXAN®), el anticuerpo totalmente humanos HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tituxetan (Zevalin®); anticuerpos anti-CD80, y y etanercept (ENBREL®), así como anticuerpos anti-células T tales como anti-CD3 (OKT3), antiCD4 y similares.

Formulaciones farmacéuticas y modos de administración

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de esta invención se administran en una concentración que es terapéuticamente eficaz para prevenir o tratar enfermedades autoinmunes y/o enfermedades antiinflamatorias. Para lograr este objetivo, los anticuerpos pueden formularse usando una diversidad de excipientes aceptables conocidos en la técnica. Típicamente, los anticuerpos se administran por medio de inyección, por ejemplo, bien intravenosamente, bien intraperitonealmente o bien subcutáneamente. Los procedimientos para llevar a cabo esta administración se conocen por los expertos en la técnica. También es posible obtener composiciones que pueden administrarse por tópicamente u oralmente, o que pueden ser capaces de transmisión a través de membranas mucosas.

La administración intravenosa se realiza de preferencia por medio de infusión durante un período de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 horas, de más preferencia durante aproximadamente 1 hasta aproximadamente 8 horas, de más preferencia aún durante aproximadamente 2 hasta aproximadamente 7 horas, todavía de más preferencia durante aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 horas, dependiendo del anticuerpo anti-CD40 que se administra. La infusión inicial con la composición farmacéutica puede administrarse durante un período de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 horas con infusiones posteriores administradas de manera más rápida. Las infusiones posteriores pueden administrarse durante un período de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 horas, incluyendo, por ejemplo, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4 horas, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 horas, o aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2 horas.

Una composición farmacéutica de la invención está formulada para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de posibles vías de administración incluyen la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradérmica, subcutánea (SC), o la infusión), oral y pulmonar (por ejemplo, inhalación), nasal, transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las disoluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio

o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples fabricados de vidrio o de plástico.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas se proporcionan típicamente por medio de técnicas convencionales en un tampón farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina estéril, agua tamponada estéril, propilenglicol, combinaciones de los anteriores, etc. En Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) se describen procedimientos para preparar agentes que pueden administrarse parenteralmente. Véase también, por ejemplo, el documento WO 98/56418, que describe formulaciones farmacéuticas de anticuerpos estabilizadas adecuadas para usar en los procedimientos descritos en la presente invención.

La cantidad de al menos un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento a administrar se determinará fácilmente por alguien de habilidad ordinaria en la técnica sin experimentación indebida. Los factores que influencian el modo de administración y la cantidad respectiva de al menos un anticuerpo anti-CD40 antagonista (o fragmento del mismo) incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad particular sometida a terapia, la gravedad de la enfermedad, el historial de la enfermedad, y la edad, altura, peso, salud y condición física del individuo que se somete a terapia. De forma similar, la cantidad de anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento a administrar dependerá del modo de administración y de si el sujeto se someterá a una o a múltiples dosis de este agente. Por lo general, al aumentar el peso del sujeto sometido al tratamiento, resulta de preferencia una dosis más alta del anticuerpo anti-CD40 o su fragmento. La dosis del anticuerpo anti-CD40 o su fragmento a administrar está en el intervalo desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, de preferencia en el intervalo de 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis puede ser de 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg o 50 mg/kg.

En otra realización de la divulgación, el procedimiento comprende la administración de dosis múltiples de anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento. El procedimiento puede comprender la administración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o más dosis terapéuticamente eficaces de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento. La frecuencia y duración de administración de las dosis múltiples de las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpo anti-CD40 o su fragmento pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica sin excesiva experimentación. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo puede incluir un tratamiento único o, de preferencia, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo de preferencia, se trata al sujeto con anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, una vez por semana durante aproximadamente entre 1 y 10 semanas, de preferencia aproximadamente entre 2 y 8 semanas, de más preferencia aproximadamente entre 3 y 7 semanas, y aún de más preferencia durante aproximadamente 4, 5, ó 6 semanas. El tratamiento puede llevarse a cabo anualmente para prevenir la recaída o tras la indicación de la recaída. También se apreciará que la dosis eficaz de anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno usado para el tratamiento puede aumentar o disminuir en el transcurso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosificación pueden ser el resultado y pueden resultar evidentes a partir de los resultados de los ensayos de diagnóstico como se describe en el presente documento. Por consiguiente, en una realización, el régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-CD40 o su fragmento en los días 1, 7, 14 y 21 de un período de tratamiento. En otra realización, el régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-CD40 o su fragmento en los días 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de una semana en un período de tratamiento. Realizaciones adicionales incluyen un régimen de dosificación que tiene una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-CD40 o su fragmento en los días 1, 3, 5 y 7 de una semana en un período de tratamiento; un régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo antiCD40 o su fragmento en los días 1 y 3 de una semana en un período de tratamiento; y un régimen de dosificación de preferencia que incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-CD40 o su fragmento en el día 1 de una semana en un período de tratamiento. El período de tratamiento puede comprender 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año. Los períodos de tratamiento pueden ser consecutivos o pueden estar separados uno de otro por un día, una semana, 2 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año.

Varía desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis de cualquier anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno, por ejemplo el anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 o CHIR-5.9 o su fragmento de unión al antígeno, puede ser de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, u otra dosis semejante que esté dentro el intervalo desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg. La misma dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede administrarse a lo largo de cada semana de dosificación del anticuerpo. Como alternativa, pueden usarse diferentes dosis terapéuticamente eficaces de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno durante el transcurso de un período de tratamiento.

En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno según se define en otra parte en el presente documento puede estar en el intervalo de dosificación inferior (es decir, desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg) con dosis posteriores dentro del intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg).

En realizaciones alternativas, la dosis terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo antiCD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno según se define en otra parte en el presente documento puede estar en el intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg) con dosis posteriores dentro del intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg). Por consiguiente, en una realización, la dosis terapéuticamente eficaz inicial del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno es de aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 35 mg/kg, incluyendo aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg, y las posteriores dosis terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno son de aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo aproximadamente 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg.

En algunas realizaciones de la revelación, el tratamiento con anticuerpo anti-CD40 antagonista se inicia administrando una “dosis de carga” del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno al sujeto que necesita terapia con anticuerpos anti-CD40 antagonistas. Por “dosis de carga” se entiende una dosis inicial del anticuerpo anti-CD40 antagonista o de su fragmento de unión al antígeno que se administra al sujeto, en la que la dosis del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno administrado está dentro del intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg). La “dosis de carga” puede administrarse como una única administración, por ejemplo, una infusión única en la que el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra por vía IV, o como administraciones múltiples, por ejemplo, infusiones múltiples en las que el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra por vía IV, siempre que la “dosis de carga” completa se administre en un período de aproximadamente 24 horas. Tras la administración de la “dosis de carga”, se administran a continuación una o más dosis terapéuticamente eficaces adicionales del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno al sujeto. Pueden administrarse dosis terapéuticamente eficaces posteriores, por ejemplo, según un programa de dosificación semanal, o una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas,

o una vez cada cuatro semanas. En tales realizaciones, las dosis terapéuticamente eficaces posteriores generalmente están en el intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg).

Como alternativa, en algunas realizaciones, tras la “dosis de carga”, las posteriores dosis terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno se administran según un “programa de mantenimiento”, en el que la dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra una vez al mes, una vez cada 6 semanas, una vez cada dos meses, una vez cada 10 semanas, una vez cada tres meses, una vez cada 14 semanas, una vez cada cuatro meses, una vez cada 18 semanas, una vez cada cinco meses, una vez cada 22 semanas, una vez cada seis meses, una vez cada 7 meses, una vez cada 8 meses, una vez cada 9 meses, una vez cada 10 meses, una vez cada 11 meses, o una vez cada 12 meses. En tales realizaciones, las dosis terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno están en el intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg), en particular cuando las dosis posteriores se administran en intervalos más frecuentes, por ejemplo, una vez cada dos semanas hasta una vez al mes, o dentro del intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg), en particular cuando las dosis posteriores se administran en intervalos menos frecuentes, por ejemplo, cuando las dosis posteriores se administran separadas por aproximadamente un mes hasta aproximadamente 12 meses.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas presentes en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento para usar en los procedimientos dados a conocer en el presente documento pueden ser nativos o pueden obtenerse por medio de técnicas recombinantes y pueden ser de cualquier fuente, incluidas las fuentes de mamíferos tales como, por ejemplo, ratón, rata, conejo, primate, cerdo y ser humano. De preferencia tales polipéptidos se obtienen de una fuente humana, y de más preferencia son proteínas humanas, recombinantes de líneas celulares de hibridoma.

Las composiciones farmacéuticas útiles en la invención pueden comprender variantes biológicamente activas de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención. Tales variantes deben retener la actividad biológica deseada del polipéptido nativo tal que la composición farmacéutica que comprende el polipéptido variante tenga el mismo efecto terapéutico que la composición farmacéutica que comprende el polipéptido nativo cuando se administra a un sujeto. Es decir, el anticuerpo anti-CD40 variante servirá como componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica de manera similar a la observada para el anticuerpo antagonista nativo, por ejemplo CHIR-5.9 o CHIR-12.12 como se expresa por la línea celular de hibridoma 5.9 ó 12.12, respectivamente. En la técnica están disponibles procedimientos para determinar si un anticuerpo anti-CD40 variante retiene la actividad biológica deseada, y sirve por consiguiente como un componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica. La actividad biológica de las variantes del anticuerpo puede medirse usando ensayos específicamente diseñados para medir la actividad del anticuerpo antagonista nativo, incluidos los ensayos descritos en el presente documento.

Cualquier composición farmacéutica que comprenda un anticuerpo anti-CD40 antagonista que tenga las propiedades de unión descritas en el presente documento como el componente terapéuticamente activo puede usarse en los procedimientos dados a conocer en el presente documento. Por consiguiente, las composiciones líquidas, liofilizadas o secadas por pulverización que comprenden uno o más de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la invención pueden prepararse como una solución o suspensión acuosa o no acuosa para la posterior administración a un sujeto de acuerdo con la invención. Cada una de estas composiciones comprenderá al menos uno de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas de la presente invención como un componente terapéuticamente o profilácticamente activo. Por “componente terapéuticamente o profilácticamente activo” se entiende que el anticuerpo antiCD40 está específicamente incorporado en la composición para provocar una respuesta terapéutica o profiláctica con respecto al tratamiento, la prevención o el diagnóstico de una enfermedad o afección en un sujeto cuando se administra la composición farmacéutica a ese sujeto. De preferencia la composición farmacéutica comprende agentes estabilizantes, agentes de carga adecuados, o ambos para reducir al mínimo los problemas asociados con la pérdida de estabilidad y actividad biológica de las proteínas durante la preparación y el almacenamiento.

Pueden añadirse compuestos de formulación a las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-CD40 antagonista de la invención. Estos compuestos de formulación pueden incluir, pero se limitan a, aceites, polímeros, vitaminas, hidratos de carbono, aminoácidos, sales, tampones, albúmina, tensioactivos o agentes de carga. Los hidratos de carbono de preferencia incluyen azúcares o alcoholes de azúcares tales como mono-, di-o polisacáridos, o glucanos solubles en agua. Los sacáridos o glucanos pueden incluir fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, sucrosa, dextrano, pullulano, dextrina, ciclodextrina α y β, almidón soluble, hidroxietil-almidón y carboximetilcelulosa, o sus mezclas. Se define “alcohol de azúcar” como un hidrocarburo C4 a C8 que tiene un grupo hidroxilo e incluye galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol y arabitol. Estos azúcares o alcoholes de azúcar pueden usarse de manera individual o en combinación. La concentración del azúcar o de alcohol de azúcar está entre 1,0 % y 7 % p/v., de más preferencia entre 2,0 % y 6,0 % p/v. Los aminoácidos de preferencia incluyen formas levógiras (L) de carnitina, arginina, y betaína; sin embargo, pueden añadirse otros aminoácidos. De preferencia los polímeros incluyen polivinilpirrolidona (PVP) con un peso molecular promedio entre 2.000 y 3.000, o polietilenglicol (PEG) con un peso molecular promedio entre 3.000 y 5.000. Los tensioactivos que pueden añadirse a la formulación se muestran en los documentos EP Nº 270.799 y

268.110.

Además, los anticuerpos pueden modificarse químicamente por conjugación covalente a un polímero para, por ejemplo, aumentar su semivida de circulación. Los polímeros preferidos y los procedimientos para ligarlos a péptidos, se muestran en las Patentes de EEUU Nº 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; y 4.609.546. Los polímeros preferidos son polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R(O-CH2 --CH2)n O--R donde R puede ser hidrógeno, o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. De preferencia, el grupo protector tiene entre 1 y 8 carbonos, de más preferencia es metilo. El símbolo n es un número entero positivo, de preferencia entre 1 y 1.000, de más preferencia entre 2 y 500. El PEG tiene de preferencia un peso molecular promedio entre 1.000 y 40.000, de más preferencia entre 2.000 y 20.000, de la mayor preferencia entre 3.000 y 12.000. De preferencia, el PEG tiene al menos un grupo hidroxilo, de más preferencia es un grupo hidroxi terminal. Este es el grupo hidroxi que se activa de preferencia para reaccionar con un grupo amino libre en el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la cantidad de los grupos reactivos pueden variarse para obtener un PEG/anticuerpo de la presente invención conjugado de manera covalente.

Los polioles polioxietilados solubles en agua también son útiles en la presente invención. Estos incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG) y similares. Se prefiere el POG. Una razón es porque la estructura central glicerol del glicerol polioxietilado es la misma estructura central que se presenta en la naturaleza en, por ejemplo, animales y seres humanos en los mono-, di-, triglicéridos. Por consiguiente, esta ramificación no será considerada necesariamente como un agente extraño en el cuerpo. El POG tiene un peso molecular de preferencia en el mismo intervalo que PEG. La estructura para el POG se muestra en Knauf y col. (1988) J. Bio. Chem. 263:15064-15070, y puede encontrarse un análisis de conjugados POG/IL-2 en la Patente de EEUU Nº. 4.766.106.

Otro sistema de administración de fármacos para aumentar la semivida circulatoria es el liposoma. Los procedimientos para preparar los sistemas de administración de liposomas se analizan en Gabizon y col. (1982) Cancer Research 42: 4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649: 129; y Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplsys. Eng. 9: 467. En la técnica se conocen otros sistemas de administración de fármacos y están descritos, por ejemplo, en Poznansky y col. (1980) Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y.) páginas 253-315; Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277.

Los compuestos de formulación a incorporar en una composición farmacéutica deberían proporcionar estabilidad del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno. Es decir, el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno debería retener su estabilidad física y/o química y debería tener la actividad biológica deseada, es decir, una o más de las actividades definidas anteriormente en el presente documento, incluidas, pero no limitadas a, inhibición de la secreción de inmunoglobulinas por células B periféricas humanas normales estimuladas por células T; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales estimuladas por células T de Jurkat; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales estimuladas por células que expresan CD40L o ligando de CD40 soluble (sCD40L); inhibición de señales intracelulares antiapoptóticas de “supervivencia” en cualquier célula estimulada por sCD40L o CD40L de fase sólida; inhibición de la transducción de señal de CD40 en cualquier célula tras la unión con sCD40L o CD40L de fase sólida; e inhibición de la proliferación de células B humanas malignas como se señaló en otra parte en el presente documento.

Los procedimientos para controlar la estabilidad de las proteínas son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Jones (1993) Adv Drug Delivery Rev. 10:29-90; Lee, ed. (1991) Peptide y Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York); y los ensayos de estabilidad que se dan a conocer en el presente documento a continuación. En general, la estabilidad de las proteínas se mide a una temperatura elegida durante un período de tiempo especificado. En realizaciones de preferencia, una formulación farmacéutica de anticuerpo estable proporciona estabilidad del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno cuando se almacena a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) durante al menos 1 mes, al menos 3 meses, o al menos 6 meses, y/o es estable aproximadamente a 2-8 ºC durante al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses.

Una proteína tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, se considera que mantiene su estabilidad física en un momento dado si no muestra signos visuales (es decir, decoloración o pérdida de transparencia) o signos que pueden medirse (por ejemplo, usando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o dispersión de luz UV) de precipitación, agregación, y/o desnaturalización en esa composición farmacéutica. Con respecto a la estabilidad química, una proteína tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, se considera que mantiene su estabilidad química en un punto temporal dado si las medidas de estabilidad química son indicativas de que la proteína (es decir, el anticuerpo) mantiene su actividad biológica de interés en esa composición farmacéutica. Los procedimientos para controlar los cambios en la estabilidad química son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, procedimientos para detectar formas químicamente alteradas de la proteína tal como resultan del corte, usando, por ejemplo, SDSPAGE, SEC, y/o ionización de desorción ayudada por matriz/espectrometría de masas de dispersión; y degradación asociada con cambios en la carga molecular (por ejemplo, asociada con desamidación), usando, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico. Véanse, por ejemplo, los procedimientos que se dan a conocer en el presente documento a continuación.

Se considera que un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno, cuando se formula en una composición farmacéutica, mantiene una actividad biológica deseada en un punto temporal dado si la actividad biológica deseada en ese momento está dentro del 30 %, de preferencia aproximadamente dentro del 20 % de la actividad biológica deseada exhibida en el momento en que se preparó la composición farmacéutica según se determina en un ensayo adecuado para la actividad biológica deseada. Los ensayos para medir la actividad biológica deseada de los anticuerpos anti-CD40 antagonistas dados a conocer en el presente documento, y sus fragmentos que se unen al antígeno, pueden llevarse a cabo como se describe en los Ejemplos en el presente documento. Véanse también los ensayos descritos en Schultze y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8200-8204; Denton y col. (1998) Pediatr. Transplant. 2: 6-15; Evans y col. (2000) J. Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman y col. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan y col. (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom y col. (1993) Immunology 79: 439-444; y las Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y 5.847.082.

En algunas realizaciones de la invención, el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se formula en una formulación farmacéutica líquida. El anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede prepararse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluidos los procedimientos dados a conocer anteriormente en el presente documento. En una realización, el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR

12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se produce de manera recombinante en una línea celular CHO.

Tras su preparación y purificación, el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede formularse como una formulación farmacéutica líquida de la manera expuesta en el presente documento. Donde el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno debe almacenarse antes de su formulación, pueden congelarse, por ejemplo, a ≤ -20 ºC, y a continuación descongelarse a temperatura ambiente para formulación adicional. La formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno. La cantidad de anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno presente en la formulación tiene en consideración la vía de administración y el volumen de dosis deseado.

De esta manera, la composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 40,0 mg/ml, aproximadamente 1,0 mg/ml hasta aproximadamente 30,0 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 20,0 mg/ml, o aproximadamente 15,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5,0 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 10,0 mg/ml, aproximadamente 10,0 mg/ml hasta aproximadamente 15,0 mg/ml, aproximadamente 15,0 mg/ml hasta aproximadamente 20,0 mg/ml, aproximadamente 20,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente 25,0 mg/ml hasta aproximadamente 30,0 mg/ml, aproximadamente 30,0 mg/ml hasta aproximadamente 35,0 mg/ml, aproximadamente 35,0 mg/ml hasta aproximadamente 40,0 mg/ml, aproximadamente 40,0 mg/ml hasta aproximadamente 45,0 mg/ml, o aproximadamente 45,0 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml. En otras realizaciones, la composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 15:0 mg/ml, aproximadamente 16,0 mg/ml, aproximadamente 17,0 mg/ml, aproximadamente 18,0 mg/ml, aproximadamente 19,0 mg/ml, aproximadamente 20,0 mg/ml, aproximadamente 21,0 mg/ml, aproximadamente 22,0 mg/ml, aproximadamente 23,0 mg/ml, aproximadamente 24,0 mg/ml, o aproximadamente 25,0 mg/ml. La composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno y un tampón que mantiene el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, incluyendo aproximadamente pH 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, y otros valores tales dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0. En algunas realizaciones, el tampón mantiene el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente 7,0, aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,0.

En la formulación puede usarse cualquier tampón adecuado que mantenga el pH de la formulación del anticuerpo anti-CD40 líquida en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, siempre que la estabilidad fisicoquímica y la actividad biológica deseada del anticuerpo se mantengan como se señaló anteriormente en el presente documento. Los tampones incluyen pero no se limitan a, ácidos convencionales y sus sales, donde el contraión puede ser, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o magnesio. Los ejemplos de ácidos convencionales y sus sales que pueden usarse para tamponar la formulación farmacéutica líquida incluyen, pero no se limitan a, tampones de ácido succínico o succinato, ácido cítrico o citrato, ácido acético o acetato, ácido tartárico o tartrato, ácido fosfórico o fosfato, ácido glucónico o gluconato, ácido glutámico o glutamato, ácido aspártico o aspartato, ácido maleico o maleato y ácido málico o malato. La concentración del tampón en la formulación puede ser desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, incluyendo aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores semejantes dentro del intervalo de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón en la formulación es desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, incluyendo aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, u otros valores semejantes dentro del intervalo de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM.

En algunas realizaciones de la invención, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR 12,12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno y tampón succinato o tampón citrato a una concentración que mantiene el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, de preferencia aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,5. Por “tampón succinato” o “tampón citrato” se entiende un tampón que comprende una sal de ácido succínico o una sal de ácido cítrico, respectivamente. En una realización de preferencia, el contraión de succinato o citrato es el catión sodio, por consiguiente el tampón es succinato de sodio o citrato de sodio, respectivamente. Sin embargo, se espera que sea eficaz cualquier catión. Otros posibles cationes de succinato o de citrato incluyen, pero no se limitan a, potasio, amonio, calcio y magnesio. Como se señaló anteriormente, la concentración del tampón succinato o citrato en la formulación puede ser desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, incluyendo aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores tales dentro del intervalo desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración de tampón en la formulación es desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, incluyendo aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, o aproximadamente 15 mM. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml, o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, y tampón succinato o citrato, por ejemplo, tampón succinato de sodio o citrato de sodio, a una concentración de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 20 mM, aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, de preferencia aproximadamente 10 mM.

Donde es deseable que la formulación farmacéutica líquida sea prácticamente isotónica, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 puede comprender además una cantidad de un agente de isotonicidad suficiente para hacer que la formulación sea prácticamente isotónica. Por "prácticamente isotónica" se entiende que la formulación acuosa tiene una osmolaridad de aproximadamente 240 mmol/kg hasta aproximadamente 360 mmol/kg, de preferencia aproximadamente 240 hasta aproximadamente 340 mmol/kg, de más preferencia aproximadamente 250 hasta aproximadamente 330 mmol/kg, aún de más preferencia aproximadamente 260 hasta aproximadamente 320 mmol/kg, de mayor preferencia aún aproximadamente 270 hasta aproximadamente 310 mmol/kg. Los procedimientos para determinar la isotonicidad de una solución son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Setnikar y col. (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48: 628.

Los expertos en la técnica están familiarizados con una diversidad de solutos farmacéuticamente aceptables útiles para proporcionar isotonicidad en las composiciones farmacéuticas. El agente de isotonicidad puede ser cualquier reactivo capaz de ajustar la presión osmótica de la formulación farmacéutica líquida de la presente invención hasta un valor prácticamente igual al de un líquido corporal. Es deseable usar un agente de isotonicidad fisiológicamente aceptable. Por consiguiente, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, puede comprender además componentes que pueden usarse para proporcionar isotonicidad, por ejemplo, cloruro de sodio; aminoácidos tales como alanina, valina y glicina; azúcares y alcoholes de azúcares (polioles), incluidos, pero no limitados a, glucosa, dextrosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, trehalosa, glicerol, sorbitol, y xilitol; ácido acético, otros ácidos orgánicos y sus sales, y cantidades relativamente menores de citratos o fosfatos. El experto en la técnica conocerá otros agentes que son adecuados para proporcionar la tonicidad óptima de la formulación líquida.

En algunas realizaciones de preferencia, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 comprende además cloruro de sodio como el agente de isotonicidad. La concentración de cloruro de sodio en la formulación dependerá de la contribución de otros componentes a la tonicidad. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 250 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 200 mM, aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 125 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 125 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 130 mM hasta aproximadamente 170 mM, aproximadamente 130 mM hasta aproximadamente 160 mM, aproximadamente 135 mM hasta aproximadamente 155 mM, aproximadamente 140 mM hasta aproximadamente 155 mM, o aproximadamente 145 mM hasta aproximadamente 155 mM. En una realización tal, la concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 150 mM. En otra de tales realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 150 mM, el tampón es tampón succinato de sodio o citrato de sodio en una concentración de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno y la formulación tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente cloruro de sodio 150 mM y aproximadamente succinato de sodio o citrato de sodio 10 mM, a un pH de aproximadamente pH 5,5.

La degradación proteica por congelación descongelación o cizallamiento mecánico durante el procesamiento de una formulación farmacéutica líquida de la presente invención puede inhibirse por incorporación de tensioactivos en la formulación para disminuir la tensión superficial en la interfase solución-aire. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR 5,9, o su fragmento de unión al antígeno, un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 y comprende además un tensioactivo. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, un agente de isotonicidad tal como cloruro de sodio en una concentración de aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, y comprende además un tensioactivo.

Los tensioactivos típicos usados son tensioactivos no iónicos, incluidos los ésteres de polioxietilensorbitol tales como polisorbato 80 (Tween 80) y polisorbato 20 (Tween 20); ésteres de polioxipropileno-polioxietileno tales como Pluronic F68; alcoholes de polioxietileno tales como Brij 35; simeticona; polietilenglicol tal como PEG400; lisofosfatidilcolina; y polioxietilen-p-toctilfenol tal como Triton X-100. La estabilización clásica de compuestos farmacéuticos por medio de tensioactivos o emulsivos se describe, por ejemplo, en Levine y col. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45(3): 160-165. Un tensioactivo de preferencia usada en la práctica de la presente invención es polisorbato 80. Cuando se incluye un tensioactivo, éste se añade típicamente en una cantidad desde aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 1,0 % (p/v), aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,4 %, aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,3 %, aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,2 %, aproximadamente 0,005 % hasta aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,005 % hasta aproximadamente 0,2 %, aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 0,2 %, aproximadamente 0,03 % hasta aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,03 % hasta aproximadamente 0,3 %, aproximadamente 0,05 % hasta aproximadamente 0,5 %, o aproximadamente 0,05 % hasta aproximadamente 0,2 %.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, el tampón es tampón de succinato de sodio o de citrato de sodio en una concentración de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM; la formulación tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5 y la formulación comprende además un tensioactivo, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad desde aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 1,0 % o aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,5 %. Tales formulaciones pueden comprender opcionalmente un agente de isotonicidad, tal como cloruro de sodio en una concentración de aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 150 mM. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR

12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, incluyendo aproximadamente 20,0 mg/ml; cloruro de sodio aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, incluyendo cloruro de sodio a aproximadamente 150 mM; succinato de sodio o citrato de sodio a una concentración de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 20 mM; incluyendo succinato de sodio o citrato de sodio a aproximadamente 10 mM; cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, incluyendo aproximadamente 150 mM; y opcionalmente un tensioactivo, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad desde aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 1,0 %, incluyendo aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,5 %; donde la formulación farmacéutica líquida tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,0.

La formulación farmacéutica líquida puede estar esencialmente libre de conservantes y otros vehículos, excipientes, o estabilizadores señalados anteriormente en el presente documento. Como alternativa, la formulación puede incluir uno o más conservantes, por ejemplo, agentes antibacterianos, vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento anteriormente con la condición de que no afecten de manera adversa la estabilidad fisicoquímica del anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno. Los ejemplos de vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables incluyen, pero no se limitan a, agentes tamponadores adicionales, codisolventes, tensioactivos, antioxidantes incluidos ácido ascórbico y metionina, agentes quelantes tales como EDTA, complejos de metales (por ejemplo, complejos Zn-proteína), y polímeros biodegradables tales como poliésteres. Puede encontrarse una discusión detallada de formulación y selección de vehículos, estabilizadores e isomolitos farmacéuticamente aceptables en Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990).

Una vez que la formulación farmacéutica líquida u otra composición farmacéutica descrita en el presente documento está preparada, puede liofilizarse para evitar la degradación. Los procedimientos para liofilizar composiciones líquidas se conocen por los expertos en la técnica. Justo antes de usar, la composición puede reconstituirse con un diluyente estéril (solución de Ringer, agua destilada o solución salina, por ejemplo) que puede incluir componentes adicionales. Tras la reconstitución, la composición se administra de preferencia a los sujetos usando los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Uso de anticuerpos anti-CD40 antagonistas en la fabricación de medicamentos

La presente invención también proporciona el uso de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con el tratamiento con al menos una terapia distinta. Por “coordinado” se entiende que el medicamento se usará antes, durante, o después del tratamiento del sujeto con al menos una terapia distinta. Los ejemplos de otras terapias incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos anteriormente en el presente documento, es decir, cirugía o procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, esplenectomía, hepatectomía, linfadenectomía, leucoforesis, transplante de células, tejidos u órganos, procedimientos intestinales, perfusión de órganos y similares); terapia de radiación; terapia tal como terapia de esteroides y terapia no esteroídica, terapia de hormonas, terapia de citoquinas, terapia con agentes dermatológicos (por ejemplo,agentes tópicos usados para tratar afecciones de la piel tales como alergias, dermatitis de contacto y soriasis), terapia inmunosupresora y terapia antiinflamatoria de anticuerpos monoclonales distinta y similares, donde el tratamiento con la terapia adicional o con las terapias adicionales tiene lugar antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto con el medicamento para tratar una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con el tratamiento con al menos una terapia distinta como se señaló anteriormente en el presente documento.

En algunas realizaciones, el medicamento que comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista, , por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 revelado en el presente documento, o su fragmento de unión al antígeno, está coordinado con el tratamiento con otras dos terapias. Cuando el medicamento que comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista está coordinado con el tratamiento con otras dos terapias, el uso del medicamento puede ser antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto con una o ambas de las otras terapias.

La presente invención proporciona también el uso de un anticuerpo anti-CD40 antagonista, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 revelado en el presente documento,

: o su fragmento de unión al antígeno en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en el que el medicamento se usa en un sujeto que ha sido pretratado con al menos otra terapia. Por “pretratado” o “pretratamiento” se quiere decir que el sujeto se ha tratado con una o más

terapias, antes de recibir el medicamento que comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista

: o su fragmento de unión al antígeno. “Pretratado” o “pretratamiento” incluye sujetos que se han tratado con la otra terapia o las otras terapias dentro de 2 años, dentro de 18 meses, dentro de 1 año, dentro de 6 meses, dentro de 2 meses, dentro de 6 semanas, dentro de 1 mes, dentro de 4 semanas, dentro de 3 semanas, dentro de 2 semanas, dentro de 1 semana, dentro de 6 días, dentro de 5 días, dentro de 4 días, dentro de 3 días, dentro de 2 días, o incluso dentro de 1 día antes del inicio del tratamiento con el medicamento que comprende el anticuerpo antiCD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 que se dan a conocer en el presente documento, o su fragmento de unión al antígeno. No es necesario que el sujeto haya sido un paciente que responde al tratamiento previo con la anterior terapia o anteriores terapias. Por consiguiente, el sujeto que recibe el medicamento que comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno podría haber respondido, o podría haber fallado al responder, al pretratamiento con la anterior terapia contra el cáncer, o a una o más terapias anteriores donde el tratamiento previo comprendía múltiples terapias.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no como limitación.

EXPERIMENTAL

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas usados en los ejemplos a continuación son CHIR-5.9 y CHIR-12.12. Los anticuerpos anti-CD40 CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CD40 humano del subtipo IgG1 humana generados por inmunización de ratones transgénicos que llevan el locus de cadena pesada de IgG1 humana y el locus de cadena ligera K humana (tecnología XenoMouse®; Abgenix; Fremont, California)). Las células de insectos SF9 que expresan dominio extracelular CD40 se usan como inmunógeno.

En resumen, se condensaron esplenocitos de ratones inmunizados con células de mieloma murino SP 2/0 o P 3 x 63Ag8.653 en una relación de 10:1 usando polietilenglicol al 50 % como está descrito previamente por de Boer y col. (1988) J. Immunol. Meth. 113: 143. Las células condensadas se resuspendieron en medio IMDM completo suplementado con hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,01 mM), timidina (0,016 mM), y hIL-6 0,5 ng/ml (Genzyme, Cambridge, Massachusetts). A continuación se distribuyeron las células fusionadas entre los pocillos de placas de cultivo tisular de 96 pocillos, de manera que cada una contenía 1 hibridoma en crecimiento en promedio.

Tras 10-14 días se analizaron los sobrenadantes de las poblaciones de hibridomas para detectar la producción de anticuerpos específicos. Para la detección de anticuerpos específicos por los clones de hibridoma, se combinaron los sobrenadantes de cada pocillo y se probaron para especificidad de actividad anti-CD 40 por ELISA en primer lugar. A continuación se usaron

5 los positivos para tinción fluorescente de células de las células B transformadas con VEB como se describió para el ensayo FACS anteriormente. Las células de hibridomas positivos se clonaron dos veces por dilución limitante en IMDM/FBS que contenía hIL-6 0,5 ng/ml.

Un total de 31 esplenocitos se condensaron con las células de mieloma murino SP 2/0 para

10 generar 895 anticuerpos que reconocen el CD40 recombinante en ELISA. En promedio aproximadamente el 10 % de los hibridomas producidos usando tecnología Abgenix XenoMouse® pueden contener la cadena ligera lambda de ratón en lugar de la cadena kappa humana. Se seleccionan los anticuerpos que contenían cadena ligera lambda de ratón y se descartaron. Se seleccionó un subgrupo de 260 anticuerpos que también mostraban unión al

15 CD40 de superficie celular para otro análisis. Los hibridomas estables seleccionados durante una serie de procedimientos de subclonación se usaron para caracterización adicionnal en ensayos de unión y funcionales.

Se identificaron clones de otros 7 hibridomas que tenían actividad antagonista. En base a su

20 potencia antagonista relativa y actividades de ADCC, se seleccionaron dos clones de hibridoma para evaluación adiconal. Se llaman: 131.2F8.5.9 (5.9) y 153.8E2.D10,D6.12.12 (12.12).

Tabla 1. Resumen del grupo de datos inicial con anticuerpos IgG1 anti-CD40 CHIR-5.9 y CHIR

12.12.

25

Hibridom a madre: Clones de hibridoma unión a la superfici e celular Antagonist a ADC C CD C CMCC # Secuenci a de ADN de la región V

131.2F5: 131.2F5.8.5.9 +++ +++ ++ - 12047 Sí

153.8E2: 153.8E2D10D6.12 .9 +++ ND ND ND 12063 Sí

La línea de hibridoma de ratón 131.2F8.5.9 (Nº de CMCC 12047) y la línea de hibridoma 153.8E2.D10.D6.12.12 (Nº de CMCC 12056) se han depositado en la American Type Culture

Collection (ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-22209 (EE.UU.)) bajo Número de Depósito de Patente PTA-5542 y PTA-5543, respectivamente.

Los cDNA que codifican las regiones variables de los de los anticuerpos candidatos se amplificaron por PCR, se clonaron y se secuenciaron. Las secuencias de aminoácidos para la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo CHIR-12.12 se expusieron en las figuras 1A y 1B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 2 (cadena ligera para mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº: 4 (cadena pesada para mAb CHIR-12.12). Una variante de la cadena pesada para mAb CHIR-12.12 se muestra en la figura 1B (véase también SEC ID Nº: 5), que difiere de la SEC ID Nº: 4 en que tiene un residuo de serina sustituido por el residuo de alanita en la posición 153 de la SEC ID Nº: 4. Las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo CHIR-12.12 se exponen en las figuras 2ª y 2B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 11 (secuencia codificante para cadena ligera para mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº: 3 (secuencia codificante para cadena pesada para mAb CHIR12.12). Las secuencias de aminoácidos para la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo CHIR-5.9 se exponen en las figuras 3A y 3B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº: 6 (cadena ligera para mAb CHIR-5-9) y SEC ID Nº: 7 (cadena pesada para mAb CHIR-59). Una variante de la cadena pesada para mAb CHIR-5-9 se muestra en la figura 3B (véase también SEC ID Nº: 8), que difiere de SEC ID Nº: 7 en que tiene un residuo se serina sustituido por el residuo de alanina en la posición 158 de la SEC ID Nº: 7.

Como se espera para los anticuerpos derivados de hibridomas independientes, hay variación sustancial en las secuencias de nucleótidos en las regiones determinantes complementarias (CDR). La diversidad en la región CDR3 de VH se cree que el lo que determina más significativamente la especificidad del anticuerpo.

Como se muestra por medio del análisis FACS, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen específicamente al CD40 humano y pueden evitar la unión del ligando de CD40. Ambos mAb pueden competir con la unión previa del ligando de CD40 al CD40 de la superficie celular. La afinidad de unión de CHIR-5.9 al CD40 humano es de 1,2 x 10-8 M y la afinidad de unión de CHIR-12.12 al CD40 humano es de 5 x 10-10 M.

Los anticuerpos monoclonales CHIR-12.12 y CHIR-5.9 son fuertes antagonistas e inhiben proliferación mediada por ligando de CD40 in vitro de células B normales.

Ejemplo 1. CHIR-12.12 bloquea la señalización celular mediada por CD40L

El ligando de CD40 soluble (CD40L) activa las células B e induce diversos aspectos de respuestas funcionales, incluidos el aumento de la supervivencia y la proliferación, y la activación de las vías de señales de NFκB, ERK/MAPK, PI3K/Akt y p38. Además, la estimulación de CD40 mediada por CD40L proporciona señales de supervivencia por reducción de PARP escindido e inducción de proteínas antiapoptóticas, XIAP y Mcl-1, en células B normales. La estimulación de CD40 mediada por CD40L también recluta TRAF2 y TRAF3 para la unión al dominio citoplasmático de CD40.

Los siguientes estudios demuestran que CHIR-12.12 inhibió directamente todos estos efectos de la estimulación en las células B humanas normales. Por ejemplo, el tratamiento con CHIR

12.12 dio como resultado el aumento de escisión de caspasa-9, caspasa-3 y PARP así como la reducción de XIAP y Mcl-1 de una manera dependiente del tiempo y de la dosis, restaurando la apoptosis de las células B. El tratamiento con CHIR-12.12 también inhibió la fosforilación de IκB quinasa (IKK) α y β (vía de NFκB), ERK, Akt y p38 en respuesta a la estimulación de CD40 mediada por CD40L. Además, se encontró que CHIR-12.12 no provocó estos efectos apoptóticos sin la estimulación inicial de CD40 mediada por CD40L.

CHIR-12.12 inhibió la supervivencia mediada por ligando de CD40 induciendo la escisión de PARP

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos, a las 2 horas, 6 horas, 18 horas y 26 horas. Se detectaron controles de caspasa 9 escindida, caspasa 3 escindida, PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western.

Brevemente, se observó que la estimulación de CD40 mediada por CD40L proporcionó señales de supervivencia ya que no dio lugar a aumentos de caspasa 9 escindida, caspasa 3 escindida

o PARP escindida con el tiempo, indicando que las células no estaban sufriendo apoptosis. Sin embargo, el tratamiento con CHIR-12.12 dio como resultado un aumento de estos productos de escisión, indicando que el tratamiento con CHIR-12.12 anuló los efectos de la unión de CD40L en las señales de supervivencia en las células B normales estimuladas con cCD40L, restaurando la apoptosis de las células B (datos no mostrados).

CHIR-12.12 inhibió la expresión de proteínas antiapoptóticas de “supervivencia”

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85-95 %) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos, a las 2 horas, 6 horas, 18 horas y 26 horas. Se detectaron controles de Mcl-1, XIAP, CD40 y β actina en los lisados celulares por transferencia Western.

Brevemente, la estimulación con sCD40L dio como resultado la expresión sostenida de Mcl-1 y XIAP con el tiempo. Sin embargo, el tratamiento de las células estimuladas con sCD40L con CHIR-12.12 dio como resultado una disminución en la expresión de estas proteínas con el tiempo (datos no mostrados). Como Mcl-1 y XIAP son señales de “supervivencia” capaces de bloquear la vía apoptótica, estos resultados demuestran que el tratamiento con CHIR-12.12 elimina el bloqueo contra la apoptosis en las células B normales estimuladas con sCD40L.

El tratamiento con CHIR-12.12 inhibió la fosforilación de IKK α (Ser180) e IKK β (Ser 181) en células B normales.

En estos experimentos, se estimularon 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85-95 %) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron los controles de IKK α (Ser180) e IKK β (Ser 181) y de IKK β total en los lisados celulares por transferencia Western.

Brevemente, la estimulación por medio de sCD40L dio como resultado la fosforilación de IKK α (Ser180) e IKK β (Ser 181) a lo largo del tiempo; sin embargo, el tratamiento con CHIR-12.12 anuló esta respuesta a la estimulación de sCD40L en las células B normales (datos no mostrados).

El tratamiento con CHIR-12.12 inhibió la supervivencia mediada por ligando de CD40 de una manera dependiente de la dosis.

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a las 24 horas. Se detectaron los controles de PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western.

Brevemente, el tratamiento con CHIR-12.12 dio como resultado el aumento de escisión de PARP en células estimuladas con sCD40L de una manera dependiente de la dosis y por lo tanto anuló la vía de señales de supervivencia en las células B normales estimuladas con sCD40L (datos no mostrados).

CHIR-12.12 inhibió la expresión de proteínas antiapoptóticas de “supervivencia” de una manera dependiente de la dosis.

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (0,5, 2 y 10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a las 22 horas. Se detectaron los controles de Mcl-1, XIAP, PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western.

Brevemente, el tratamiento con CHIR-12.12 redujo la expresión de Mcl-1 y XIAP y aumentó la expresión de PARP en células estimuladas con sCD40L de una manera dependiente de la dosis y por lo tanto anuló estos bloqueos a la vía apoptótica en las células B normales estimuladas con sCD40L (datos no mostrados).

CHIR-12.12 no afecta la expresión de proteínas antiapoptóticas, PARP escindida y XIAP, en ausencia de señales de CD40L soluble.

En estos experimentos, se estimularon 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85-95 %) con CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control sola (es decir, las células no se estimularon previamente con sCD40L antes de añadir el anticuerpo). Las células se recogieron a las 0, 4, 14 y 16 horas. Se detectaron los controles de XIAP, PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western.

Brevemente, los resultados muestran que sin estimulación de sCD40L, las células expresaron

concentraciones aumentadas de PARP escindida, mientras que la expresión de XIAP permaneció constante, tanto en las células tratadas con IgG de control como en las tratadas con CHIR-12.12 (datos no mostrados). Estos datos indican que CHIR-12.12 no provoca apoptosis en las células B humanas normales sin estimulación de CD40L.

CHIR-12.12 inhibe la fosforilación de IKKα (Ser180) e IKKβ (Ser181), Akt, ERK y p38 en las células B normales.

En estos experimentos, se privaron de suero en medio que contenía FBS al 1 % 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) y se estimularon con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). Los cultivos se trataron con CHIR-12.12 (1 y 10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron fosfo-IKKα, fosfo-IKKβ, IKKβ total, fosfoERK, ERK total, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-p38 y p38 total en los lisados celulares por transferencia Western.

Brevemente, la estimulación con sCD40L dio como resultado aumentos en la fosforilación de IKKα/β, fosforilación de ERK, fosforilación de Akt y fosforilación de p38, dando lugar así a la supervivencia y/o proliferación de las células. El tratamiento de las células con CHIR-12.12 anuló los efectos de la estimulación de sCD40L en estas vías de señales en las células B normales (datos no mostrados).

CHIR 12.12 inhibe las vías de señales múltiples tales como PI3K y MEK/ERK en la cascada de señales de CD40.

En estos experimentos, se privaron de suero en medio que contenía FBS al 1 % 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) y se estimularon con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). Los cultivos se trataron también con CHIR-12.12 (1 y 10 µg/ml), Wortmanin (un inhibidor de PI3K/Akt, 1 y 10 µM), LY 294002 (un inhibidor de PI3K/Akt; 10 y 30 µM) y PD 98095 (un inhibidor de MEK, 10 y 30 µg/ml). Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron fosfoERK, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-IKKα/β y total en los lisados celulares por transferencia Western.

Brevemente, los resultados muestran que CHIR-12.12 anuló la fosforilación de todas estas moléculas de transducción de señales, mientras que los inhibidores de transducción de señales mostraron sólo anulación específica de las señales, indicando que CHIR-12.12 probablemente inhibe en una etapa anterior a estas moléculas de transducción de señales mediadas por la estimulación por CD40L (datos no mostrados).

CHIR-12.12 inhibe la unión de las moléculas de señalización TRAF2 y TRAF3 al dominio citoplásmico de CD40 en las células B normales.

En estos experimentos, se privaron de suero durante cuatro horas en medio que contenía FBS al 1 % 4,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95 %) y se estimularon con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU) durante 20 minutos. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se inmunoprecipitó CD40 usando anti-CD40 policlonal (Santa Cruz Biotechnology, CA), y se sondeó en una transferencia Western con mAb anti TRAF2 (Santa Cruz Biotechnology, CA), mAb anti TRAF3 (Santa Cruz Biotechnology, CA), y mAb anti-CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA). Brevemente, los resultados muestran que TRAF2 y TRAF3 co-precipitaron con CD40 tras la estimulación de sCD40L. Por el contrario, el tratamiento con CHIR-12.12 anuló la formación del complejo de señal CD40-TRAF2/3 en células B normales estimuladas con sCD40L. No hubo cambios en la expresión de CD40 (datos no mostrados).

Sin estar ligados por la teoría, los resultados de estos experimentos, y los resultados en los ejemplos resumidos anteriormente, indican que el anticuerpo CHIR-12.12 es un anticuerpo monoclonal anti-CD40 antagonista de acción dual que tiene una única combinación de atributos. Este anticuerpo monoclonal totalmente humano bloquea las vías de señales de CD40 mediadas por CD40L para la supervivencia y la proliferación de las células B; este antagonismo da lugar finalmente a la muerte celular. CHIR-12.12 también media el reconocimiento y la unión por las células efectoras, iniciando la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Una vez que CHIR-12.12 está unido a las células efectoras, se liberan las enzimas citolíticas, dando lugar a la apoptosis y lisis de las células B. CHIR-12.12 es un anticuerpo antitumoral más potente que rituximab cuando se compara en modelos de tumores preclínicos.

Ejemplo 2: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen a un epítopo diferente que 15B8 en CD40

Los anticuerpos monoclonales candidatos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 compiten uno con el otro por la unión al CD40 pero no con 15B8, un mAb IgG2 anti-CD40 (véase documento de Publicación Internacional Nº WO 02/28904). Se diseñaron estudios de unión competitiva de anticuerpos usando Biacore con chips biosensores CM5 con proteína A inmovilizada por medio de

acoplamiento de aminas, que se usó para capturar anti-CD40, CHIR-12.12, o 15B8. Se observaron las curvas de unión de asociación/disociación normales con concentraciones variables de CD40-his (datos no mostrados). Para los estudios de competición, se capturaron bien CHIR-12.12 o bien 15B8 en la superficie de la proteína A. Posteriormente se hizo fluir un 5 complejo CD40-his / Fab de CHIR-5.9 (CD40 100 nM: Fab de CHIR-5.9 1 µM), en concentraciones variables, a través de la superficie modificada. En el caso de CHIR-12.12, no se observó asociación del complejo observado, que indica que CHIR-5.9 bloquea la unión de CHIR-12.12 a CD40-his. Para 15B8, se observó asociación del complejo Fab CHIR-5.9 que indica que CHIR-5.9 no bloquea la unión de 15B8 al sitio de unión de CD40. Sin embargo, la

10 tasa de disociación del complejo aumentó drásticamente (datos no mostrados).

También se determinó que 15B8 y CHIR-12.12 no compiten por la unión de CD40-his. Este experimento se llevó a cabo capturando CHIR-12.12 en el chip biosensor de proteína A, bloqueando los sitios residuales de proteína A con hIgG1 control, uniendo CD40-his y a

15 continuación haciendo fluir 15B8 sobre la superficie modificada. 15B8 se unió bajo estas condiciones indicando que CHIR-12.12 no bloquea la unión de 15B8 al CD40.

Ejemplo 3: Propiedades de unión de los mAb CHIR-12.12 y CHIR-5.9

20 Se inmovilizó proteína A en chips biosensores CM5 a través de acoplamiento de aminas. Se capturaron anticuerpos monoclonales anti-CD40 humanos, en una concentración de 1,5 µg/ml, sobre la superficie modificada del biosensor durante 1,5 minutos a 10 µl/min. Se hizo fluir CD40-his recombinante soluble sobre la superficie del biosensor en concentraciones variables. El anticuerpo y el antígeno se diluyeron en HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM,

25 Tensioactivo P al 20 0,005 % (HBS-EP). Se determinaron las constantes cinéticas y de afinidad usando el programa informático Biaevaluation con un ajuste de interacción modelo/global de

1:1.

Como se muestra en la Tabla 2 a continuación, hay una diferencia de 121 veces en la tasa de 30 disociación de CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que da como resultado una afinidad 24 veces mayor para CHIR-12.12.

35

Anticuerpo: ka (M-1 seg-1) kd (seg-1) KD (nM)

Anti-CD40,CHIR-5.9: (12,35 ± 0,64) x 105 (15,0 ± 1,3) x 10-3 12,15 ± 0,35

Anti-CD40,CHIR-12.12: (2,41 ± 0,13) x 105 (1,24 ± 0,06) x 10-4 0,51 ± 0,02

Ejemplo 4: Caracterización del epítopo para los anticuerpos monoclonales CHIR-12.12 y CHIR

5.9

5

Para determinar la localización del epítopo en CD40 reconocido por los anticuerpos monoclonales CHIR-12.12 y CHIR-5.9, se realizaron análisis SDS-PAGE y transferencia Western. Se separó CD40 purificado (0,5 µg) en un gel NUPAGE al 4-12 % bajo condiciones reductoras y no reductoras, se transfirió a membranas PVDF, y se sondeó con anticuerpos

10 monoclonales en una concentración de 10 µg/ml. Las transferencias se sondearon con IgG anti humano conjugada con fosfatasa alcalina y se desarrollaron usando el sustrato estabilizado Azul Western® para fosfatasa alcalina (Promega).

Los resultados indican que el anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR12.12 reconoce epítopos

15 tanto en la forma no reducida como en la forma reducida de CD40, exhibiendo la forma no reducida de CD40 mayor intensidad que la forma reducida de CD40 (Tabla 3; transferencias no mostradas). El hecho de que el reconocimiento fuera positivo para ambas formas de CD40 indica que este anticuerpo interactúa con un epítopo conformacional, parte del cual es una secuencia lineal. El anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 reconoce principalmente la forma no

20 reducida de CD40 sugiriendo que este anticuerpo interactúa principalmente con un epítopo conformacional (Tabla 3; transferencias no mostradas).

Tabla 3. Identificación de dominios.

Dominio 1: Dominio 2 Dominio 3 Dominio 4

mAb CHIR-12.12: - + - -

mAb CHIR-5.9: - + - -

mAb 15B8: + - - -

25 Para realizar un mapa de la región antigénica en CD40, se clonaron los cuatro dominios extracelulares de CD40 y se expresaron en células de insecto como proteínas de fusión GST. La secreción de los cuatro dominios se aseguró con una señal de secreción GP67. El sobrenadante de las células de insecto se analizó por análisis SDS-PAGE y transferencia Western para identificar el dominio que contenía el epítopo.

EL anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 reconoce un epítopo en el Dominio 2 bajo tanto condiciones reductoras como no reductoras (Tabla 4; transferencias no mostradas). Por el contrario, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 exhibe reconocimiento muy débil para el Dominio 2 (Tabla 16; transferencias no mostradas). Ninguno de estos anticuerpos reconoce los Dominios 1, 3 ó 4 en este análisis.

Tabla 4. Análisis del Dominio2.

Reducido: No reducido

mAb CHIR-12.12: ++ +++

mAb CHIR-5.9: + +

10 Para definir con más precisión el epítopo reconocido por el mAb CHIR-12.12, se sintetizaron péptidos del Dominio 2 extracelular de CD40, que corresponde a la secuencia PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT (residuos 61-104 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12). Se generaron membranas de síntesis

15 SPOT (Sigma) conteniendo treinta y cinco péptidos 10-meros con un desplazamiento de 1 aminoácido. Se realizó el análisis de transferencia Western con mAb CHIR-12.12 y anti IgG humana marcado con beta galactosidasa como anticuerpo secundario. Se desmontó la transferencia y se volvió a sondear con mAb CHIR-5.9 para determinar la región reconocida por este anticuerpo.

20 Los análisis SPOTs sondando con anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 en una concentración de 10 µg/ml dieron reacciones positivas con las transferencias 18 a 22. La región de la secuencia cubierta por estos péptidos se muestra en la Tabla 5.

25 Tabla 5. Resultados de análisis SPOTs sondeando con anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12.

Número de transferencia: Región de la secuencia

18: HQHKYCDPNL (residuos 78-87 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12)

19: QHKYCDPNLG (residuos 79-88 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12)

20: HKYCDPNLGL (residuos 80-89 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº:

12)

21: KYCDPNLGLR (residuos 81-90 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12)

22: YCDPNLGLRV (residuos 82-91 de SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12)

Estos resultados corresponden a un epítopo lineal de: YCDPNL (residuos 82-87 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº:10 o SEC ID Nº: 12). Este epítopo contiene Y82, D84 y N86, que se ha predicho que están implicados en la interacción CD40-ligando de CD40.

5

Los análisis SPOTs con mAb CHIR-5.9 mostraron un débil reconocimiento de los péptidos representados por las manchas 20-22 mostradas en la Tabla 6, sugiriendo implicación de la región YCDPNLGL (residuos 82-89 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12) en su unión a CD40. Debe señalarse que los mAb CHIR-12.12 y CHR-5.9 compiten uno

10 con el otro por la unión a CD40 en el análisis BIACORE.

Tabla 6. Resultados de análisis SPOTs sondeando con anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-5.9.

Número de transferencia: Región de la secuencia

20: HKYCDPNLGL (residuos 80-89 de SEC ID Nº: 10 o 12)

21: KYCDPNLGLR (residuos 81-90 de SEC ID Nº: 10 o 12)

22: YCDPNLGLRV (residuos 82-91 de SEC ID Nº: 10 o 12)

15 Los epítopos lineales identificados por los análisis SPOTs están dentro del módulo B1 de CD40. La secuencia del módulo B1 de CD40 es:

HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (residuos 80-103 de SEC ID Nº: 10 o 12).

20 Dentro del epítopo lineal identificado para CHIR-12.12 está C83. Se sabe que este residuo de cisteína forma un enlace disulfuro con C103. Es probable que el epítopo conformacional del mAb CHIR-12.12 contenga este enlace disulfuro (C83-C103) y/o aminoácidos vecinos conformacionalmente próximos a C103.

25

Ejemplo 5: Realización de pruebas en modelos de enfermedades autoinmunes e inflamatorias

Modelo de lupus eritematoso sistémico (LES).

La CHIR-12.12 se probó en un modelo de lupus eritematoso sistémico (LES) en el que las células mononucleares de sangre periférica (PMBC) de pacientes de LES se injetan en ratones SCID. Véase, por ejemplo, el modelo descrito en Duchosal y col. (1990) J. Exp. Med. 172: 985

8.

Después de transferencia de PBMC de pacientes de LES en ratones SCID, se determina si el tratamiento con CHIR-12.12 influye o no en la respuesta de linfocitos T a producción de autoantígenos y autoanticuerpos y en las manifestaciones morbosas tales como glomerulonefritis. El primer grupo de estudios prueba CHIR-12.12 como un agente individual seguido por probar el efecto en una combinación con otos agentes tales como CTLA4-Ig.

Modelo de esclerosis múltiple.

La encefalitis autoinmune experimental (EAE) del mono tití es un modelo para esclerosis múltiple humana. Véase, por ejemplo, el modelo descrito en Raine y col. (1999) Ann. Neurol.

46: 144-60 y Hart y col. (2004) Lancet Neurol. 3: 588-97. CHIR-12.12 se une a CD40 de tití y se prueba para eficacia en este modelo.

Inflamación y aterosclerosis

Se prueba in vitro CHIR-12.12 por su capacidad para inhibir producción inducida por CD40L de enzimas que degradan matriz, expresión de factor tisular, citoquinas proinflamatorias y regulación ascendente de moléculas de adhesión. Estudios subsiguientes prueban la capacidad de CHIR-12.12 mostranso actividades antiinflamatorias in vivo usando ratones transgénicos que expresan la molécula CD40 humana. Véase, por ejemplo, el modelo descrito en Yasui (2002) Inty. Immunol. 14: 319-29.

Transplante.

Se prueba CHIR-12.12 por su capacidad para evitar rechazo de transplantes en modelos de primates no humanos. Los acacos cangrejeros receptores de aloinjertos renales se tratan con anticuerpo CHIR12.12. demostrando el efecto de aceptación de injerto con o sin fármacos inmunosupresores adicionales tales como ciclosporina, FK506, rapamicina, corticosteroides, molécula CTLA4-Ig y anti-anticuerpo estimulador de linfocitos B y similares. Véase, por ejemplo, el modelo descrito en Wee y col. (1992) Transplantation 53: 501-7.

Enfermedad de Alzheimer.

. CHIR-12.12 se prueba primero in vitro por su capacidad para bloquear activación microglial. Los estudios de eficacia in vivo con CHIR-12.12 se llevan a cabo en ratones doblemente transgénicos que expresan CD40 humano y sobreproducen péptido beta-amiloide. Véase, por ejemplo, el modelo descrito en Tan y col. (2002) Nat. Neurosci. 5: 1288-93.

Ejemplo 6: Estudios clínicos con CHIR-5.9 y CHIR-12.12

Objetivos clínicos

El objetivo general es proporcionar una terapia eficaz para artritis reumatoide (RA) marcando como objetivo células con una IgG1 anti-CD40. La señal para está enfermedad se determina en la fase I aunque puede obtenerse alguna medición de actividad en fase I. Inicialmente, el agente se estudia como un agente único, pero se combinará con otros agentes terapéuticos a medida que proceda el desarrollo.

Fase I

•: Evaluar la seguridad y la farmacocinética – aumento de dosis en sujetos con RA.

•: Elegir la dosis en base a la seguridad, tolerabilidad y cambio en los marcadores séricos de CD40. En general se busca una dosis máxima tolerable (DMT) pero pueden resultar adecuadas otras indicaciones de eficacia (depleción de células que llevan CD40+, etc.) para el hallazgo de la dosis.

•: Consideración de más de una dosis, ya que puede ser necesario algún hallazgo de dosis en fase II.

•: Los pacientes se dosifican semanalmente con toma de muestras para farmacocinética (Pk) en tiempo real. Inicialmente la dosis máxima permitida es un ciclo de 4 semanas. La Pk puede ser altamente variable dependiendo del estado morboso, densidad de CD40, etc.

•: Este/estos ensayo(s) está(n) abierto(s) a sujetos con RA.

•: La decisión para interrumpir o continuar los estudios se basa en la seguridad, las dosis y

•: la evidencia preliminar de actividad terapéutica.

•: La actividad del fármaco según se determina por la tasa de respuesta, se determina en la Fase II.

•: Identificar dosi(s) para la Fase II.

Fase II

Se iniciarán varios ensayos en sujetos con RA. Puede probarse más de una dosis y más de un programa en una configuración al azar de fase II.

• Marcar como objetivo una población de RA que tiene estándar actual fallido de cuidado (fallos de terapia de fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAID) y de fármacos antirreumáticos modificadores de enfermedad (DMARD; por ejemplo oro y penicilamina))

: imagen1 La decisión para interrumpir o continuar con el estudio se basa en la prueba del concepto terapéutico en Fase II

: imagen1 Determinar si puede usarse un marcador sustituto como indicación temprana para la eficacia clínica

: imagen1 Identificar las dosis para la Fase III

Fase III

La fase III dependerá de cuándo se detecta la señal en la fase II y de qué terapias competidoras se considera que son el estándar. Si la señal está en una fase de la enfermedad donde no hay estándar de terapia, entonces podrá servir un estudio de un único brazo, bien controlado, como ensayo fundamental. Si hay agentes competidores que se consideran estándares, entonces se realizan estudios directos.

Ejemplo 7: Formulación farmacéutica líquida para anticuerpos anti-CD40 antagonistas

El objetivo de este estudio fue investigar los efectos del pH de la solución en la estabilidad del anticuerpo anti-CD40 antagonista CHIR-12.12 por medio de procedimientos biofísicos y bioquímicos para seleccionar el entorno de solución óptimo para este anticuerpo. Los resultados de calorimetría diferencial de barrido (DSC) mostraron que la estabilidad de la conformación de CHIR-12.12 es óptima en formulaciones que tienen pH 5,5-6,5. En base a una combinación de análisis SDS-PAGE, HPLC de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) y HPLC de intercambio catiónico (CEX-HPLC), la estabilidad fisicoquímica de CHIR-12.12 es óptima a un pH de aproximadamente 5,0-5,5. En vista de estos resultados, una formulación farmacéutica

5 líquida recomendada que comprende este anticuerpo es una formulación que comprende CHIR-12.12 a aproximadamente 20 mg/ml formulada en succinato de sodio 10 mM aproximadamente, cloruro de sodio 150 mM aproximadamente y que tiene un pH de aproximadamente pH 5,5.

10 Materiales y procedimientos

El anticuerpo CHIR-12.12 usado en los estudios de formulación es un anticuerpo monoclonal humano producido por un proceso de cultivo de células CHO. Este mAb tiene un peso molecular de 150 kDa y está constituido por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas

15 unidas juntas por enlaces disulfuro. Está dirigido contra el receptor de CD40 de superficie celular en las células que expresan CD40, incluidas las células B normales y malignas, para el tratamiento de diversos tipos de cáncer y enfermedades autoinmunes/inflamatorias.

La sustancia del fármaco anti-CD40 usada para este estudio fue un lote a granel de anti-CD40

20 (CHIR-12.12) purificado derivado de células CHO. La composición de la sustancia del fármaco era de anticuerpo CHIR-12.12 9,7 mg/ml en citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, a pH 6,5. La muestra de control en el estudio era la sustancia del fármaco recibida, seguida por congelación a ≤ -60 ºC, descongelación a TA y probada junto con muestras de estabilidad en los puntos temporales predeterminados. Las muestras de estabilidad se prepararon por diálisis

25 de la sustancia del fármaco contra disoluciones de diferentes pH y la concentración de CHIR

12.12 en cada una de las muestras se determinó por UV 280 tal como se presenta en la Tabla

7.

Tabla 7. Formulaciones de CHIR-12.12.

Composición tampón: pH Concentración de CHIR-12.12 (mg/ml)

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 4,5 9,0

Succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 5,0 9,3

Composición tampón: pH Concentración de CHIR-12.12 (mg/ml)

Succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 5,5 9,2

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 6,0 9,7

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 6,5 9,4

Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 7,0 9,4

Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 7,5 9,5

Glicina 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 9,0 9,5

La estabilidad fisicoquímica del anticuerpo CHIR-12.12 en las diversas formulaciones se ensayó usando los siguientes protocolos.

5 Calorimetría diferencial de barrido (DSC)

La estabilidad conformacional de diferentes muestras de formulaciones se controló usando un MicroCal VP-DSC tras calentar de 15ºC hasta 90ºC a razón de 1ºC/min.

10 SDS-PAGE

Se estimó la fragmentación y la agregación usando gel Tris-glicina al 4-20 % bajo condiciones no reductoras y reductoras. Se detectaron las proteínas por medio de tinción con azul Coomassie.

15

Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC)

La fragmentación y agregación de proteínas se midieron también por medio de un sistema de HPLC Water Alliance con una columna Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL, con fosfato de sodio

20 100 mM, pH 7,0 como fase móvil a un caudal de 0,7 ml/min.

Cromatografía de intercambio catiónico (CEX-H PLC)

La degradación relacionada con el cambio de cargas se midió usando un sistema de HPLC Waters 600s con una columna Dionex Propac WCX-10, con HEPES 50 mM, pH 7,3 como fase móvil A y HEPES 50 mM que contenía NaCl 500 mM, pH 7,3 como fase móvil B a un caudal de 0,5 ºC/min.

Resultados y discusión

Estudio de estabilidad conformacional.

El desplegamiento térmico de CHIR-12.12 reveló al menos dos transiciones térmicas, que representan probablemente la fusión de desplegamiento de los dominios Fab y Fc, respectivamente. A temperaturas más altas, la proteína presumiblemente se agregó, dando lugar a pérdida de la señal de DSC. Con la finalidad de examinar la formulación, se definió la temperatura de transición térmica más baja como la temperatura de fusión, Tf, en este estudio. La Figura 5 muestra la temperatura de fusión térmica como una función de los pH de las formulaciones. Las formulaciones a pH 5,5-6,5 proporcionaron anti-CD40 con estabilidad conformacional superior como se demuestra por las temperaturas de fusión térmica más elevadas.

Análisis SDS-PAGE.

Las muestras de formulaciones de CHIR-12.12 a pH 4,5-9,0 se incubaron a 40 ºC durante 2 meses y se sometieron al análisis SDS-PAGE (datos no mostrados). Bajo condiciones no reductoras, se observaron especies con peso molecular (PM) de 23 kDa y 2,7 kDa en formulaciones con pH superior a 5,5, y se observaron especies con PM de 51 kDa en todas las formulaciones, pero aparecieron menos a pH 5,0-5,5. Pudo verse una especie con PM de 100 kDaa pH 7,5 ypH9,0,

Bajo condiciones reductoras, CHIR-12.12 se redujo en cadenas pesadas y cadenas ligeras libres con PM de 50 kDa y 24 kDa, respectivamente. Las especies de 100 kDa parecieron no ser totalmente reducibles y aumentaron con el aumento del pH de la solución, sugiriendo que podría existir asociación covalente diferente de disulfuro en las moléculas. Como había otras especies con identidades desconocidas en SDS-PAGE, la comparación de estabilidad para cada formulación se basa en la pureza restante de CHIR-12.12. Las formulaciones a pH 5,0-6,0 proporcionaron un entorno más estable para CHIR-12.12. Se detectaron pocos agregados por medio de SDS-PAGE (datos no mostrados).

Análisis SEC-HPLC.

5 El análisis SEC-HPLC detectó el CHIR-12.12 intacto como la especie del pico principal, una especie de agregación como una especie de pico anterior separada de la especie del pico principal, una especie de fragmento grande como un pico meseta en la parte posterior de la especie del pico principal, y se detectaron especies de fragmentos pequeños posteriores a las especies del pico principal. Tras la incubación a 5ºC y 25ºC durante 3 meses, se detectaron

10 cantidades insignificantes de fragmentos y agregados de proteínas (<1,0 %) en las formulaciones anteriores y las especies del pico principal de CHIR-12.12 siguieron teniendo más del 99 % de pureza (datos no mostrados). Sin embargo, se desarrollaron gradualmente fragmentos de proteínas tras el almacenamiento a 40ºC y se formaron más fragmentos a pH 4,5 y pH 6,5-9,0, como se muestra en la Tabla 8. Tras incubar las formulaciones de CHIR-12.12

15 a 40 ºC durante 3 meses, se detectó aproximadamente 2-3 % de agregados en pH 7,5 y pH 9,0, mientras que se detectó menos del 1 % de agregados en las formulaciones a otros pH (datos no mostrados). Los resultados de SEC-HPLC indican que CHIR-12.12 es más estable a un pH de aproximadamente 5,0-6,0,

20 Tabla 8. Resultados de SEC-HPLC de muestras de estabilidad de CHIR-12.12 bajo condiciones de tiempo real y de almacenaje acelerado.

Muestra: Pico principal % Fragmentos %

t=0: 40 °C 1 m 40 °C 2 m 40 °C 3 m t=0 40 °C 1 m 40 °C 2 m 40 °C 3 m

Control: 99,4 99,2 99,9 99,5 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0

pH 4,5: 99,4 93,2 86,0 81,3 <1,0 6,4 13,2 18,1

pH 5,0: 99,8 98,7 91,3 89,2 <1,0 <1,0 7,8 10,2

pH 5,5: 99,8 98,9 91,4 90,6 <1,0 <1,0 7,6 8,8

pH 6,0: 99,6 97,7 90,4 87,3 <1,0 1,9 8,2 11,7

pH 6,5: 99,3 93,4 89,0 86,9 <1,0 5,6 9,9 12,4

pH 7,0: 99,2 93,9 87,4 85,1 <1,0 5,5 11,1 13,5

pH 7,5: 99,1 92,8 84,4 81,9 <1,0 6,4 12,9 16,2

pH 9,0: 99,3 82,4 61,6 50,6 <1,0 15,4 36,2 47,6

Análisis CEX-FIPLC.

El análisis CEX-HPLC detectó el CHIR-12.12 intacto como la especie del pico principal, las variantes ácidas eluyeron más temprano que las especies del pico principal y las variantes de adición de lisina en el extremo C terminal eluyeron después de las especies de pico principal. La tabla 9 muestra la dependencia de los porcentajes de las especies restantes de CHIR-12.12 5 del pico principal y las variantes ácidas en el pH de la solución. La muestra de control ya contenía un alto grado de especies ácidas (aproximadamente 33 %), probablemente debido a los procesos de fermentación de etapa temprana y purificación. La susceptibilidad de CHIR

12.12 a las disoluciones de pH más alto se evidencia por dos hechos. Primero, la muestra de la formulación inicial a pH 9 (t = 0) ya generaba 12 % más especies ácidas que el control.

10 Segundo, el porcentaje de especies ácidas aumentó bruscamente con el aumento del pH. La degradación relacionada con el cambio de cargas se debe probablemente a la desamidación. Los datos anteriores indican que este tipo de degradación de CHIR-12.12 se redujo al mínimo a pH de aproximadamente 5,0-5,5.

15 Tabla 9. Porcentaje de área de picos por CEX-HPLC para CHIR-12.12 en formulaciones de diferente pH bajo condiciones de tiempo real y de almacenamiento acelerado.

Muestra: Pico principal % Variantes ácidas %

T=0: 5 ºC 25 ºC 40 ºC 40 ºC t=0 5 ºC 25 ºC 40 ºC 40 ºC

3 m
3 m: 1 m 2 m 3 m 3 m 1 m 2 m

Control: 49,2 49,8 49,8 49,2 50,3 32,0 33,7 33,7 32,0 33,6

pH 4,5: 48,5 49,7 43,7 39,7 30,0 32,5 32,6 38,0 44,2 56,4

pH 5,0: 49,6 49,8 48,3 40,6 31,4 32,7 31,8 35,0 44,3 57,1

pH 5,5: 50,7 50,3 48,1 40,0 30,2 32,6 31,8 37,8 48,9 63,3

pH 6,0: 50,2 49,9 47,9 37,4 23,9 33,1 33,6 38,5 54,9 72,7

pH 6,5: 49,4 49,9 42,3 29,7 14,6 33,3 33,6 47,7 65,2 84,6

pH 7,0: 49,7 49,9 21,9 - - 34,4 36,4 64,4 - -

pH 7,5: 49,3 48,3 12,7 - - 35,5 40,1 79,2 - -

pH 9,0: 41,3 31,8 - - - 44,7 59,9 - - -

Conclusión

20 El pH tiene un efecto significativo en la estabilidad conformacional y fisicoquímica de CHIR

12.12. Se determinó que la degradación relacionada con el cambio de cargas es la principal vía de degradación para CHIR-12.12, que se redujo al mínimo a pH 5,0-5,5. En base a los datos de estabilidad general, una formulación farmacéutica líquida recomendada que comprende este anticuerpo es una formulación que comprende CHIR-12.12 a una concentración de aproximadamente 20 mg/ml formulada en succinato de sodio 10 mM aproximadamente, cloruro de sodio 150 mM aproximadamente, y que tiene un pH de aproximadamente 5,5.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Long, Li Luqman, Mohammad Yabannavar, Asha Zaror, Isabel

<120> USO DE ANTICUERPOS ANTI-CD40 ANTAGONISTAS PARA TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS Y AUTOINMUNES Y RECHAZO DE TRANSPLANTE DE ÓRGANOS

<130> PP23725.001 (284072)

<150> 60/565.710

<151> 27-04-2004

<150> 60/525.579

<151> 26-11-2003

<150> 60/517.337

<151> 04-11-2003

<160> 12

<170> FastSEQ para Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 720

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia codificadora para cadena ligera del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR

<221> CDS

<222> (1)...(720)

<400> 1 <210> 2

imagen2

<211> 239

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR-12.12

<400> 2

imagen3

<210> 3

<211> 2016

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia codificadora para cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR

12.12 (con intrones)

<400> 3

imagen3

<210> 4

<211> 469

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR-12.12

<400> 4

imagen3

<210> 5

<211> 469

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Cadena pesada de la variante del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR-12.12

<400> 5

10

15

20

25

30

imagen3

<210> 6

<211> 239

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR-12.12

<400> 6 <210> 7

imagen3

<211> 474

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR-5.9

<400> 7

10

imagen3

<210> 8

<211> 474

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Cadena pesada de la variante del anticuerpo anti-CD40 humano CHIR-5.9

<400> 8

10

imagen3

<210> 9

<211> 612

<212> ADN

<213> Homo sapiens

5

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(612)

10 <221> característica miscelánea

<222> (0)...(0)

<223> Secuencia codificadora para la isoforma corta del CD40 humano

<400> 9

15

imagen3

<210> 10

<211> 203

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

imagen3

<210> 11

<211> 834

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(834)

<221> característica miscelánea

<222> (0)...(0)

<223> Secuencia codificadora para la isoforma larga del CD40 humano

<400> 11

imagen3

<210> 12<211> 277

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

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Claims

Reivindicaciones

1. Un anticuerpo monoclonal humano anti-CD40 que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana que expresa CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de una enfermedad inflamatoria

o una enfermedad autoinmune, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano.
2. Uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una célula que expresa CD40 humano en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano de una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmune, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano.
3.

El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en el que dicha enfermedad inflamatoria o enfermedad autoinmune está seleccionada del grupo constituido por lupus eritematoso sistémico (LES), lupus discoide, nefritis de lupus, sarcoidosis, artritis juvenil, artritis reumatoide, artritis soriática, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante, artritis gotosa, rechazo de un transplante de órgano o tejido, enfermedad de injerto frente a hospedador, esclerosis múltiple, síndrome de hiper IgE, poliarteritis nodosa, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca (enteropatía de sensibilidad al gluten), hepatitis autoinmune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmune, soriasis, escleroderma, miastenia gravis, púrpura trombocitopénica autoinmune, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hasimoto, enfermedad compleja inmune, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmune (SFCDI), polimiositis y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombolisis, cardiomiopatía, pénfigo vulgar, fibrosis intersticial pulmonar, sarcoidosis, diabetes mellitus de Tipo I y de Tipo II, hipersensibilidad de tipo retardado de tipo 1, 2, 3 y 4, alergia o trastornos alérgicos, asma, síndrome de Churg-Strauss

(granulomatosis alérgica), dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica e irritante, urticaria, alergia mediada por IgE, aterosclerosis, vasculitis, miopatías inflamatorias idiopáticas, enfermedad hemolítica, enfermedad de Alzheimer y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica.
4.

Un anticuerpo monoclonal humano anti-CD40 que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana que expresa CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de rechazo de transplante, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano.
5.

Uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una

célula que expresa CD40 humano en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano de rechazo de transplante, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano.
6.

El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 4 o el uso de la reivindicación 5, en los que dicho tratamiento comprende adicionalmente administrar un agente inmunosupresor en el excipiente farmacéuticamente aceptable.
7.

El anticuerpo monoclonal o el uso de la reivindicación 6, en los que el agente inmunosupresor se selecciona del grupo constituido por ciclosporina, FK506, rapamicina, corticosteroides, CTLA4-Ig y anticuerpo anti-estimulador de linfocitos B.
8.

Un anticuerpo monoclonal humano anti-CD40 que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una célula que expresa CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando

se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto humano de artritis reumatoide, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano.

9 Uso de una cantidad efectiva de anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una célula que expresa CD40 humano en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano de artritis reumatoide, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, estando dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano seleccionado del grupo constituido por:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano mostrada en SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12; d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva; y e) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de los ítems precedentes a)-d), en el que dicho fragmento mantiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano
10.

El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 8 o el uso de la reivindicación 9, en los que dicho tratamiento comprende adicionalmente administrar un agente inmunosupresor en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
11.

El anticuerpo monoclonal o el uso de la reivindicación 10, en los que el agente inmunosupresor se selecciona del grupo constituido por ciclosporina, FK506, rapamicina, corticosteroides, CTLA4-Ig, un anticuerpo anti-CD20 y anticuerpo anti-estimulador de linfocitos

B.
12. El anticuerpo monoclonal o el uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo constituido por:

(i)

un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene los residuos 44-54, 70-76 y 109-117 de SEC ID Nº: 2 o de SEC ID Nº: 6;

(ii)

un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 50-54, 69-84 y 114-121 de SEC ID Nº: 4 o de SEC ID Nº: 7;

(iii) un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene los residuos 46-52, 70-72 y 111-116 de SEC ID Nº: 2 o de SEC ID Nº: 6; y

(iv) un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 45-51, 72-74, 115-120 de SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 7.
13. El anticuerpo monoclonal o el uso de la reivindicación 12, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

(i)

los residuos 21-132 de SEC ID Nº: 2;

(ii)

los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 2;

(iii) SEC ID Nº: 2;

(iv)

los residuos 20-139 de SEC ID Nº: 4;

(v)

los residuos 20-469 de SEC ID Nº: 4;

(vi)

SEC ID Nº: 4;

(vii) los residuos 20-469 de SEC ID Nº: 5;

(viii) SEC ID Nº: 5;

(ix)

los residuos 21-132 de SEC ID Nº: 2 y los residuos 20-139 de SEC ID Nº: 4;

(x)

los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 2 y los residuos 20-469 de SEC ID Nº: 4;

(xi)

los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 2 y los residuos 20-469 de SEC ID Nº: 5;

(xii) SEC ID Nº: 2ySEC ID Nº: 4; y

(xiii) SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 5.
14. El anticuerpo monoclonal o el uso de la reivindicación 12, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

(i)

los residuos 21-132 de SEC ID Nº: 6;

(ii)

los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 6;

(iii) SEC ID Nº: 6;

(iv)

los residuos 20-144 de SEC ID Nº: 7;

(v)

los residuos 20-474 de SEC ID Nº: 7;

(vi)

SEC ID Nº: 7;

(vii) los residuos 20-474 de SEC ID Nº: 8;

(viii) SEC ID Nº: 8;

(ix)

los residuos 21-132 de SEC ID Nº: 6 y los residuos 20-144 de SEC ID Nº: 7;

(x)

los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 6 y los residuos 20-474 de SEC ID Nº: 7;

(xi)

los residuos 21-239 de SEC ID Nº: 6 y los residuos 20-474 de SEC ID Nº: 8

(xii) SEC ID Nº: 6ySEC ID Nº: 7; y

(xiii) SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 8.
15.

El anticuerpo monoclonal o el uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo se une a antígeno CD40 humano con una afinidad (KD) de al menos 10-6 M.
16.

El anticuerpo monoclonal o el uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo se une a antígeno CD40 humano con una afinidad (KD) de al menos 10-8 M.
17.

El anticuerpo monoclonal o el uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho

5

10 anticuerpo se selecciona del grupo constituido por el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543.

15 18. El anticuerpo monoclonal o uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho fragmento está seleccionado del grupo constituido por un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena simple.
19. El anticuerpo monoclonal o uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho 20 anticuerpo monoclonal se produce en una línea celular de CHO.