ES2347617B1 - Dispositivo sensor interdigitado perfeccionado basado en anticuerpos marcados con nanoparticulas conductoras. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo sensor interdigitado basado en
anticuerpos
marcados con nanopartículas conductoras y procedimiento para la detección y cuantificación de sustancias presentes en líquidos.
marcados con nanopartículas conductoras y procedimiento para la detección y cuantificación de sustancias presentes en líquidos.
Comprende una matriz de electrodos (4.1.1)
interdigitados tapizados con antígeno para reaccionar con unos
anticuerpos marcados con nanopartículas conductoras que se aportan
después de unas sustancias a detectar y cuantificar, al sensor,
siendo una parte de anticuerpos capturada por los electrodos y otra
parte es capturada por las moléculas a detectar y cuantificar
reaccionando competitivamente respecto al antígeno, con dichos
anticuerpos marcados, incluyendo unos medios de detección de la
variación en las propiedades eléctricas de la matriz de electrodos,
provocada por los anticuerpos marcados capturados por dicha capa de
antígeno.
El método comprende realizar una primera medida
de las propiedades eléctricas de los electrodos interdigitados con
antígeno, aplicar una solución de anticuerpos marcados y de una
sustancia a detectar, realizar una segunda medida y comparar las
medidas.
Description
Dispositivo sensor interdigitado basado en
anticuerpos marcados con nanopartículas conductoras y procedimiento
para la detección y cuantificación de sustancias presentes en
líquidos.
La presente solicitud de Patente de Invención
consiste conforme indica su enunciado, en un dispositivo sensor
interdigitado perfeccionado basado en anticuerpos marcados con
nanopartículas conductoras para la detección y cuantificación de
sustancias presentes en líquidos, cuyas nuevas características de
construcción, conformación y diseño cumplen lo proyectado con una
seguridad y eficacia máximas.
Más concretamente, la presente invención se
refiere a un dispositivo sensor para la detección de compuestos o
moléculas en líquidos, con aplicación en la detección de
contaminantes en suelos, aguas, al control de calidad de diversos
alimentos, y similares.
El dispositivo sensor permite realizar la medida
en seco (medida de impedancia) una vez evacuado del dispositivo
sensor el liquido conteniendo la sustancia a detectar y cuantificar,
o bien en liquido (medida de conductividad) sumergiendo el
dispositivo en una solución PBS (tampón).
Otro de los fines de la invención es la
fabricación de dispositivos sensores de bajo coste que permitan la
detección y/o cuantificación altamente selectiva de especies
químicas en bajas concentraciones. Además puede ser actuado y leído
automáticamente por medios electrónicos y automáticos.
El dispositivo sensor de la invención brinda la
posibilidad de realizar las medidas en corriente continua lo que
permite una fuerte reducción de costes en la circuitería de control.
Así mismo, también podemos realizar las medidas a una única
frecuencia o en un espectro de frecuencias.
El dispositivo sensor presentado combina una
alta sensibilidad con una alta especificidad. El dispositivo sensor
es altamente sensible pues se basa en la reacción competitiva entre
un antígeno inmovilizado en la superficie del dispositivo sensor y
unas moléculas a detectar, por la captura por dicho antígeno y por
dichas moléculas de unos anticuerpos marcados con nanopartículas
conductoras que se aportan después de dichas moléculas a detectar.
Como resultado de esta reacción competitiva, una cantidad de
anticuerpo marcado con nanopartículas conductoras es capturado por
el antígeno inmovilizado en la superficie del dispositivo y es
medida, y otra parte, restante es evacuada del dispositivo por
acción de las moléculas a detectar. En efecto, la cantidad de
anticuerpo marcado capturado por el antígeno está en relación con la
concentración de moléculas a detectar presentes en la solución de
testeo. El dispositivo sensor es altamente selectivo gracias a la
especificidad de los anticuerpos. Es un dispositivo de sencilla
fabricación y por tanto de bajo coste. Es un dispositivo en el que
la medida, al ser en corriente continua, es muy fácil de realizar,
siendo muy sencillo automatizarla. Es un dispositivo sensor muy
adecuado para detección y cuantificación en campo y cuando se
requiere bajo coste del sistema.
La invención también comprende un procedimiento
para la detección y cuantificación de sustancias presentes en
líquidos en el que se utiliza dicho dispositivo sensor.
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Existen en el estado de la técnica variedad de
diseños propuestos en la literatura de sensores de moléculas en
líquidos. Muchos de estos sensores se basan en procesos
electroquímicos sobre células de detección. Estos sensores
usualmente se basan en configuraciones de 3 electrodos, con uno de
referencia y otro que lleva una capa sensible que aporta
selectividad al sensor, en recipientes con soluciones líquidas. En
estos sensores las medidas se basan frecuentemente en la
interpretación de las curvas de histéresis de corriente en función
de la tensión aplicada en ciclos periódicos. La obtención de las
concentraciones de las moléculas objetivo es un proceso
relativamente complicado donde se requiere personal entrenado y/o
software de cierta complejidad. Las células de detección se pueden
reducir en tamaño, pero existen límites a esta miniaturización.
El dispositivo sensor objeto de esta invención
tiene su base en tres características principales:
- 1.
- En la reacción competitiva entre el antígeno inmovilizado en la superficie del dispositivo y las sustancias a detectar respecto a unos anticuerpos marcados con nanopartículas conductoras que se aportan después de la solución de la muestra (sustancia(s) a detectar), una cantidad de estos anticuerpos marcados, capturada por las moléculas a detectar, es evacuada del dispositivo juntamente con estas moléculas. Por lo tanto la cantidad de anticuerpos marcados capturada por el antígeno inmovilizado en la superficie del dispositivo está en relación con la concentración de moléculas a detectar presentes en la solución de testeo.
- 2.
- El uso de nanopartículas conductoras (Ej.: nanopartículas de oro). Estas nanopartículas están unidas a los anticuerpos por lo que ofrecen 3 ventajas relevantes: i) la señal de respuesta de impedancia de los dispositivos sensores es mucho mayor que en el caso de usar anticuerpos sin marcadores; ii) permiten diseñar sensores que puedan excitarse simplemente mediante tensiones continuas y medirse con corrientes continuas. Esto simplifica fuertemente la circuitería asociada al control, y a la toma de señal de los dispositivos sensores. Además de la posibilidad de realizar las medidas en continua, también podemos realizar las medidas en un espectro de frecuencias o inclusive a una única frecuencia. En estos casos la variación se realizará mediante el análisis de la variación de la impedancia del sistema; iii) permiten realizar medidas en seco, sin la necesidad de incluir una solución buffer (tampón) en el momento de la medida, aunque si se desea, también se puede incluir una solución buffer, Ej.: phosphate buffered saline (PBS).
- 3.
- El uso de electrodos interdigitados (IDE's) como transductores. Estos electrodos brindan importantes mejoras en sensibilidad gracias a la posibilidad de obtener separaciones micrométricas, o incluso nanométricas, entre sus dedos, con lo que se obtiene una gran relación de aspecto (w/l) en el diseño.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sensores presentados en la literatura
muestran generalmente mayor complejidad, tanto para la realización
de la medida como para la interpretación. A continuación mostramos
algunos ejemplos de sensores potenciométricos y amperométricos:
Entre los sensores potenciométricos encontramos
el Light-addressable potentiometric sensor
(LAPS), el cual es un sensor químico basado en un semiconductor con
una estructura
electrolyte-insulator-semiconductor
(EIS). Si bien el uso de este sensor ha sido muy recurrente en la
literatura para la detección de diferentes especies, el sistema de
detección implica inicialmente aplicar un voltaje de corriente
continua lo largo de la estructura EIS para conseguir un cambio en
la capacidad en la interfaz aislante-semiconductor.
Esta capacidad cambia con el potencial de la superficie, el cual es
una función de la concentración de iones en la solución electrolito.
Entonces, para que esta capacidad pueda ser leída hará falta
iluminar el substrato semiconductor con una luz modulada y lo que se
medirá será la fotocorriente alterna, ac, generada. Finalmente, la
medida se deberá realizar mediante un circuito externo.
Como vemos, este sistema, a diferencia del que
presentamos en esta patente implica una estructura compleja y con
miniaturización limitada.
Entre los sensores amperométricos encontramos el
Microsens Amperometric Sensor, de la firma MICROSENS S.A., el
cual es un dispositivo electroquímico miniaturizado mediante
tecnología microelectrónica. Este sensor puede ser usado para
determinar la concentración de una amplia gama de especies químicas
activas redox. Si bien este es un sensor de pequeño tamaño, bajo
consumo de analito y bajo coste, utiliza un diseño de tres
electrodos.
El principio de amperometría está basado en la
medida de la corriente entre el electrodo de trabajo y el electrodo
auxiliar, la cual es inducida por una reacción redox en el
electrodo de trabajo. Las condiciones son escogidas de tal
forma que la corriente es directamente proporcional a la
concentración de una especie activa redox en la solución de analito.
El potencial eléctrico del electrodo de trabajo hacia la
solución medida es alcanzado por un electrodo de referencia separado
y es controlado por un sistema potenciostato electrónico. El
electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar se fabrican
mediante capas de película delgadas de platino sobre una oblea de Si
mediante un proceso de depósito especifico. Además el electrodo
de referencia integra una capa delgada de Ag/AgCl el cual se
fabrica por un proceso similar. Adicionalmente, se fotopolimerizan
membranas orgánicas sobre el área de electrodo de trabajo
para separar la superficie de electrodo de la solución medida. La
selectividad para una especie química activa redox se obtiene
mediante un potencial de polarización conveniente y una membrana
bien definida fotopolimerizada.
Vemos que este sistema consigue buenas
prestaciones, sin embargo, a diferencia del sistema que presentamos
en esta patente el proceso de fabricación del dispositivo sensor
requiere elevada complejidad.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención está basada en una matriz
de electrodos interdigitados (IDE's) y en anticuerpos marcados con
nanopartículas conductoras.
Para la fabricación de estos electrodos podemos
utilizar diferentes metales conductores (Ej.: oro, platino), así
como diferentes substratos (Ej.: pirex, plástico). Así mismo, la
geometría (Ej.: barra, zig-zag), las dimensiones de
los electrodos (Ej.: mm, sub-mm) y el grosor entre
dedos así como el gap (Ej.: \mum, nm) también pueden ser
escogidos.
Los IDE's serán funcionalizados previamente con
una capa de antígeno tapizado (Ej.: AT-BSA). Sobre
esta capa se realizará el ensayo competitivo (en relación con las
moléculas a detectar) para la captura del anticuerpo especifico
(Ej.: IgG), el cual está previamente etiquetado con nanopartículas
conductoras (ej.: partículas de oro de 40 nm). La unión de la capa
de antígeno tapizado a la superficie del dispositivo puede
realizarse mediante diferentes tipos de absorción (Ej.: pasiva,
covalente).
Al aportar las moléculas a detectar sobre el
dispositivo sensor y después el anticuerpo específico marcado con
nanopartículas conductoras,una fracción del anticuerpo marcado es
capturada por dichas moléculas a detectar y no será capturada por el
antígeno. Está fracción tanto menor de anticuerpo marcado sobre el
dispositivo sensor cuanto mayor sea la concentración de moléculas a
detectar implica directamente una menor cantidad de nanopartículas
conductoras capturadas por el dispositivo sensor y por lo tanto una
menor variación de las propiedades de la capa funcionalizada con
antígeno entre los electrodos con respecto a la situación anterior a
la puesta en contacto con la solución a medir. Tal como se indicará
en los ejemplos que se incluyen al final, en primer lugar se aporta
la sustancia a detectar, seguida de la solución de anticuerpo
marcado con nanopartículas, para que tanto las moléculas de dicha
sustancia como el antígeno inmovilizado sobre los electrodos
compitan para capturar dichos anticuerpos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las moléculas a detectar estarán presentes en la
solución de testeo. La reacción entre los anticuerpos marcados con
nanopartículas conductoras y las moléculas a detectar se produce al
depositar ambas soluciones sobre los electrodos, los cuales disponen
previamente de una capa de antígeno inmovilizado sobre su
superficie. Tras esperar un tiempo para la fijación de anticuerpos
marcados a la capa de antígeno, la solución depositada sobre el
dispositivo se limpia con agua Milli-Q y esta se
seca. Tras este pre-tratamiento se procede a
realizar la medida.
A mayor concentración de moléculas a detectar en
la solución, la cantidad de de moléculas a detectar con
nanopartículas conductoras evacuado del dispositivo sensor será
mayor, como consecuencia, la cantidad de nanopartículas conductoras
sobre el dispositivo sensor será menor que en el caso en que no se
hubieran incluido moléculas a detectar. Debido a estas variaciones
en la concentración de anticuerpo sobre el dispositivo sensor la
impedancia total de la capa será diferente según la concentración
presente de anticuerpo marcado.
Dado el tamaño relativo de los anticuerpos y de
las moléculas a detectar, este sistema ofrece sensibilidades muy
superiores a otros que se basan en la captura de las moléculas
mediante anticuerpos prefijados en el dispositivo sensor, gracias a
que en el dispositivo sensor presentado en esta patente, una
cantidad de los anticuerpos marcados con nanopartículas conductoras,
que está en relación con la concentración de moléculas a detectar,
es evacuada del dispositivo.
Los terminales de los IDE's de los dispositivos
sensores estarán conectados al equipo de medida. Un sistema de
conexión fácilmente acoplable a los dispositivos sensores
presentados son los contactos conocidos como
clip-on. Este es un sistema muy sencillo que
permite contactar y dirigir las salidas de cada IDE, aunque existen
otros sistemas que también pueden ser utilizados consiguiendo
iguales prestaciones.
Los contactos de clip-on
son sencillos de fabricar y sobretodo de usar. Consisten en 2
piezas: i) la matriz de IDE's que incluyen unas salidas simétricas y
externas; y ii) el "espejo" de estas salidas externas las
cuales contactan los IDE's con el instrumento de medida. Este
sistema permite realizar fácilmente el cambio de las matrices de
electrodos interdigitados.
Estos dispositivos sensores tienen la ventaja
adicional de que pueden ser reutilizados. Tras cada proceso de
detección es posible limpiar completamente los electrodos de
todo agente biológico así como de las nanopartículas conductoras.
Entonces se vuelve a inmovilizar el antígeno sobre la superficie de
los electrodos, para luego repetir el ensayo competitivo con nuevas
moléculas a detectar.
Para el depósito de las soluciones de
funcionalización sobre la matriz de electrodos, así como para el
depósito de la solución a analizar se podrá disponer de un sencillo
sistema de micro-jeringas, denotado
\mu-jeringas o bien de un sistema fluídico que
puede estar integrado o no, a la matriz de electrodos
interdigitados.
En el caso del sistema de
\mu-jeringas, en una matriz de electrodos
interdigitados, cada electrodo contará con su propio grupo de
\mu-jeringas, de esta forma es posible inyectar
diferentes soluciones a cada electrodo, o diferentes réplicas de la
misma solución y mostrar el promedio de detección.
En el caso del sistema fluídico se dispondrá de
un único canal de entrada (inlet) y de un único canal de
salida (outlet) para todos los electrodos interdigitados de
la matriz. En este caso es posible introducir una solución compleja
que contenga diferentes moléculas a detectar, lo que permitirá la
detección simultánea de diferentes sustancias. En esta solución
podrán haber tantas moléculas a detectar como electrodos en la
matriz.
Ya sea entre las \mu-jeringas
o en el sistema fluídico se incluirá el paso de flujo de un gas de
secado (por Ej.: N_{2}) para el secado de los IDE's entre cada
paso de la funcionalización. Alternativamente, el depósito de las
muestras y soluciones, el secado y el lavado de los electrodos
pueden realizarse de forma manual usando jeringas u otros elementos
convencionales de manipulación de líquidos en laboratorio.
Gracias a que la detección se realiza por
medidas de conducción en corriente continua dc, el equipamiento de
medida es tan sencillo como un amperímetro midiendo corriente en el
orden de centenas de pA. De esta forma podemos ser capaces de
detectar la presencia o no presencia de un nivel mínimo de
la(s) sustancia(s) de interés, o si se desea, podremos
también cuantificar con precisión la concentración de
dicha(s) sustancia (s).
\vskip1.000000\baselineskip
La figura nº 1 muestra el esquema de un
electrodo interdigitado (IDE).
La figura nº 2 ilustra esquemáticamente el
funcionamiento del dispositivo de la invención.
La figura nº 3 muestra el esquema de un
electrodo interdigitado con contactos de tipo
"clip-on".
La figura nº 4 es un esquema de la disposición
de medida del dispositivo, para medidas en corriente continua.
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La figura nº 1 muestra el esquema de un
electrodo interdigitados (IDE), en si conocido, utilizado en el
dispositivo de esta invención.
En la figura nº 1 se muestra un esquema de la
vista frontal (1.1), así como un esquema de la vista en alzado
lateral (1.2) de los electrodos interdigitados en una de las
realizaciones preferidas de la invención. Tal y como puede verse en
esta figura, los IDE's se fabricarán con forma de barra sobre un
substrato de pirex (2.3), se fabricarán en oro (2.4) como metal
principal, aunque se utilizará además cromo (2.5) como metal de
adhesión entre el oro y el substrato.
La figura nº 2, además de ilustrar acerca de la
funcionalización de los electrodos interdigitados y del ensayo o
proceso competitivo que ocurre sobre el dispositivo sensor, permite
apreciar de forma esquemática el substrato del dispositivo sensor
(2.3), el metal principal de los electrodos (2.4), el metal de
adhesión de los electrodos (2.5), el antígeno tapizado (2.6), el
anticuerpo (2.7), la molécula a detectar (2.8), así como la
nanopartícula conductora (2.9).
La figura nº 2, ilustra sobre la
funcionalización de los electrodos interdigitados, y muestra:
- \circ
- la inmovilización de la capa de antígeno sobre la superficie de los electrodos;
- \circ
- la captura (2.1) por el antígeno de la capa de anticuerpo específico marcado con nanopartículas conductoras; y
- \circ
- la evacuación (2.2) de una fracción de estos anticuerpos marcados por acción de las moléculas a detectar que reaccionan competitivamente con la capa de antígeno para capturar dichos anticuerpos marcados.
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La figura nº 3 nos muestra el esquema de un
electrodo interdigitado (3.1) con contactos
clip-on (3.2).
La figura nº 4 es un esquema de la disposición o
set-up de medida para medidas de conducción
en de. El set-up se compone principalmente de
dos bloques: i) "bloque de alimentación y detección química"
(4.1); ii) "bloque de captura y procesado de datos" (4.2).
En el "bloque de alimentación y detección
química" (4.1) que se muestra en la figura nº 4 se encuentra,
además de la matriz de electrodos interdigitados (4.1.1) con
contactos clip-on (que pueden ser sustituidos
por otro tipo de contactos), el "espejo" de los contactos
(4.1.2) para la salida de la señal eléctrica, así como la serie de
\mu-jeringas (4.1.3), que pueden ser sustituidas
por un sistema fluídico, para la inyección de los sistemas
biológicos, las sustancias a detectar y la entrada de N_{2} para
el secado de los IDE's. También existe una fuente de alimentación de
corriente continua, de (4.1.4) que excita el sistema mediante un
voltaje de de moderada amplitud (4.1.5). Esta fuente, para otras
aplicaciones que se detallarán en los ejemplos, puede ser de
corriente alterna (ac).
En el "bloque de captura y procesado de
datos" que se muestra en la figura nº 4 puede verse un sencillo
sistema compuesto primeramente de un amperímetro (4.2.1) para la
lectura de la corriente que pasa por los electrodos interdigitados.
Posteriormente, estos datos de conductividad son comparados en una
tabla guardada por Ej.: en un \mu-controlador,
incluido en una circuitería de control (4.2.2), para determinar la
concentración de la(s) sustancia(s) a detectar y
finalmente estos datos son presentados o transmitidos mediante un
ordenador portátil, PDA, y similares (4.2.3).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se completa adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser
limitativos de su alcance.
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Procedimiento para la funcionalización de los
dispositivos sensores y la detección de residuos de pesticida en
vino mediante medidas de conducción en de, sin utilizar solución
buffer y en el caso en que la capa de antígeno ha sido inmovilizada
sobre la superficie del dispositivo mediante absorción pasiva.
- 1.
- Lavado de los electrodos interdigitados. Lavamos los IDE's mediante una solución de etanol absoluto 70% y agua Milli-Q 30%. A continuación, los dispositivos son sumergidos en una solución de NaOH 2.5% en agua Milli-Q. Después de 12 horas las muestras son aclaradas en agua Milli-Q para neutralizar la acción del NaOH. Secamos los electrodos con etanol y N_{2}.
- 2.
- Inmovilización del antígeno. Incubamos la solución de antígeno durante toda una noche a 25ºC. Después eliminamos el líquido sobrante en los electrodos interdigitados y los secamos con N_{2}.
- 3.
- Medidas de conductividad del estado inicial. Excitamos el sistema con un voltaje de de moderada amplitud (Ej.: 1 V). Realizamos las medidas de conductividad a temperatura ambiente y los datos de corriente se guardan en la tabla 1 generada por la circuitería de control.
- 4.
- Ensayo competitivo. Añadimos la muestra de vino sobre los IDE's seguida de la solución de anticuerpo marcado con nanopartículas de oro. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente lavamos los electrodos con PBST y con agua Milli-Q.
- 5.
- Medidas de conductividad del estado final. Excitamos el sistema con un voltaje de de moderada amplitud (Ej.: IV). Realizamos las medidas de conductividad a temperatura ambiente y los datos de corriente se guardan en la tabla 2 generada por la circuitería de control.
- 6.
- Detección de pesticida. El sistema de control calcula la variación de conductividad existente entre las tablas 1 y 2 para cada dispositivo y las compara con los datos almacenados en las tablas de referencia para cada uno de los pesticidas que se incluyen.
- 7.
- Muestra de resultados. El sistema de control muestra los resultados mediante gráficas y tabla de resultados en el equipo de display (Ej.: ordenador portátil, PDA).
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento para la funcionalización de los
dispositivos sensores y la detección de residuos de pesticida en
vino mediante medidas impedancia a una única frecuencia, utilizando
PBS como solución buffer y en el caso en que la capa de antígeno ha
sido inmovilizada sobre la superficie del dispositivo mediante
absorción pasiva.
- 1.
- Lavado de los electrodos interdigitados. Lavamos los IDE's mediante una solución de etanol absoluto 70% y agua Milli-Q 30%. A continuación, los dispositivos son sumergidos en una solución de NaOH 2.5% en agua Milli-Q. Después de 12 horas las muestras son aclaradas en agua Milli-Q para neutralizar la acción del NaOH. Secamos los electrodos con etanol y N_{2}.
- 2.
- Inmovilización del antígeno. Incubamos la solución de antígeno durante toda una noche a 25ºC. Después eliminamos el liquido sobrante en los electrodos interdigitados y los secamos con N_{2}.
- 3.
- Medidas de impedancia del estado inicial. Sumergimos los electrodos en una solución de PBS. Excitamos el sistema con una señal de voltaje ac de baja amplitud (Ej.: 25 mV). Realizamos las medidas de impedancia a la frecuencia escogida (Ej.: 1 MHz) a temperatura ambiente y los datos (Ej.: parte real, parte imaginaria) se guardan en la tabla 1 generada por la circuitería de control.
- 4.
- Ensayo competitivo. Añadimos la muestra de vino sobre los IDE's seguida de la solución de anticuerpo marcado con nanopartículas de oro. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente lavamos los electrodos con PBST y con agua Milli-Q.
- 5.
- Medidas de impedancia del estado final. Sumergimos los electrodos en una solución de PBS. Excitamos el sistema con una señal de voltaje ac de baja amplitud (Ej.: 25 mV). Realizamos las medidas de impedancia a la frecuencia escogida (Ej.: 1 MHz) a temperatura ambiente y los datos (Ej.: parte real, parte imaginaria) se guardan en la tabla 2 generada por la circuitería de control.
- 6.
- Detección de pesticida. El sistema de control calcula la variación de conductividad existente entre las tablas 1 y 2 para cada dispositivo y las compara con los datos almacenados en las tablas de referencia para cada uno de los pesticidas que se incluyen.
- 7.
- Muestra de resultados. El sistema de control muestra los resultados mediante gráficas y tabla de resultados en el equipo de display (Ej.: ordenador portátil, PDA).
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento para la funcionalización de los
dispositivos sensores y la detección de residuos de pesticida en
vino mediante medidas impedancia en un espectro de frecuencias,
utilizando PBS como solución buffer y en el caso en que la capa de
antígeno ha sido inmovilizada sobre la superficie del dispositivo
mediante absorción pasiva.
- 1.
- Lavado de los electrodos interdigitados. Lavamos los IDE's mediante una solución de etanol absoluto 70% y agua Milli-Q 30%. A continuación, los dispositivos son sumergidos en una solución de NaOH 2.5% en agua Milli-Q. Después de 12 horas las muestras son aclaradas en agua Milli-Q para neutralizar la acción del NaOH. Secamos los electrodos con etanol y N_{2}.
\newpage
- 2.
- Inmovilización del antígeno. Incubamos la solución de antígeno durante toda una noche a 25ºC. Después eliminamos el liquido sobrante en los electrodos interdigitados y los secamos con N_{2}.
- 3.
- Medidas de impedancia del estado inicial. Sumergimos los electrodos en una solución de PBS. Excitamos el sistema con una señal de voltaje ac de baja amplitud (Ej.: 25 mV). Realizamos las medidas de impedancia en el espectro de frecuencia escogido (Ej.: 40 Hz-1 MHz) a temperatura ambiente y enviamos los datos (módulo y fase) a la circuitería de control. A partir de estos datos la circuitería de control obtiene los elementos del circuito (resistencias, capacidades) que modelan el sistema y se guardan en la tabla 1 generada para este fin.
- 4.
- Ensayo competitivo. Añadimos la muestra de vino sobre los IDE's seguida de la solución de anticuerpo marcado con nanopartículas de oro. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente lavamos los electrodos con PBST y con agua Milli-Q.
- 5.
- Medidas de impedancia del estado final. Sumergimos los electrodos en una solución de PBS. Excitamos el sistema con una señal de voltaje ac de baja amplitud (ej.: 25 mV). Realizamos las medidas de impedancia en el espectro de frecuencia escogido (ej.: 40 Hz-1 MHz) a temperatura ambiente y enviamos los datos (módulo y fase) a la circuitería de control. A partir de estos datos la circuitería de control obtiene los elementos del circuito (resistencias, capacidades) que modelan el sistema y se guardan en la tabla 2 generada para este fin.
- 6.
- Detección de pesticida. El sistema de control calcula la variación de conductividad existente entre las tablas 1 y 2 para cada dispositivo y las compara con los datos almacenados en las tablas de referencia para cada uno de los pesticidas que se incluyen.
- 7.
- Muestra de resultados. El sistema de control muestra los resultados mediante gráficas y tabla de resultados en el equipo de display (Ej.: ordenador portátil, PDA).
Descrita suficientemente la presente invención
en correspondencia con las figuras anexas, es fácil comprender que
podrán realizarse en la misma, cualesquiera modificaciones de
detalle que se estimen convenientes siempre y cuando no se altere la
esencia de la invención que queda resumida en las siguientes
reivindicaciones.
Claims (20)
1. Un dispositivo sensor interdigitado basado en
anticuerpos marcados con nanopartículas conductoras, aplicable a la
detección y cuantificación de sustancias presentes en líquidos, que
comprende:
- una matriz de electrodos interdigitados
funcionalizados previamente con una capa de antígeno tapizado en la
superficie de los electrodos, mediante una técnica de inmovilizado
por absorción, estando dicha capa de antígeno prevista para
reaccionar con unos anticuerpos marcados con nanopartículas
conductoras que se aportan después de dichas sustancias a detectar y
cuantificar, contenidas en un líquido, al dispositivo sensor, de
manera que una parte de dichos anticuerpos es capturada por dicha
superficie de los electrodos funcionalizada y otra parte es
capturada por las moléculas de la sustancia a detectar y
cuantificar, las cuales reaccionan competitivamente respecto a la
reacción de dicha capa de antígeno, con dichos anticuerpos marcados
con nanopartículas conductoras; y
- unos medios de detección previstos para
detectar la variación en las propiedades eléctricas de dicha matriz
de electrodos interdigitados, provocada por dicha parte de
anticuerpos marcados capturados por dicha capa de antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende una fuente de alimentación
(4.1.4) prevista para excitar a dicha matriz de electrodos
interdigitados con una tensión continua de amplitud moderada.
3. Dispositivo según la reivindicación 2,
caracterizado porque dichos medios de detección comprenden un
amperímetro (4.2.1) previsto para la lectura de la corriente que
pasa por los electrodos interdigitados antes y después de la
captura, por parte de dicha capa de antígeno, de dicha parte de
anticuerpos marcados.
4. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende una fuente de alimentación
prevista para excitar a dicha matriz de electrodos interdigitados
con una tensión alterna de baja amplitud.
5. Dispositivo según la reivindicación 4,
caracterizado porque dichos medios de detección se aplican a
medir la impedancia de dicha matriz de electrodos interdigitados,
estando éstos sumergidos en una solución tampón, para al menos una
frecuencia eléctrica, antes y después de la captura, por parte de
dicha capa de antígeno, de dicha parte de anticuerpos marcados.
6. Dispositivo según la reivindicación 5,
caracterizado porque dichos medios de detección se aplican a
medir la impedancia de dicha matriz de electrodos interdigitados,
estando éstos sumergidos en una solución buffer, para un espectro de
frecuencias eléctricas, antes y después de la captura, por parte de
dicha capa de antígeno, de dicha parte de anticuerpos marcados.
7. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende un sistema de
micro-jeringas previsto para realizar el depósito
sobre los electrodos interdigitados de unas soluciones de dicha capa
de antígeno de funcionalización, y de una solución de una sustancia
a analizar.
8. Dispositivo según la reivindicación 7,
caracterizado porque cada electrodo de dicha matriz de
electrodos interdigitados integra un grupo propio de micro jeringas
permitiendo inyectar diferentes soluciones a cada electrodo, o
diferentes réplicas de la misma solución para mostrar un promedio de
detección.
9. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende un sistema fluídico previsto
para realizar el depósito de unas soluciones de funcionalización de
dicha capa de antígeno sobre los electrodos interdigitados, y de una
solución de una sustancia a analizar.
10. Dispositivo según la reivindicación 9,
caracterizado porque dicho sistema fluídico dispone de un
único canal de entrada y un único canal de salida para todos los
electrodos interdigitados de la matriz, permitiendo introducir a
través de dicho canal de entrada una solución contenedora de una o
más moléculas a detectar.
11. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque dichos electrodos interdigitados tienen
forma de barra y están dispuestos sobre un substrato de pirex.
12. Dispositivo según la reivindicación 11,
caracterizado porque dichos electrodos interdigitados son de
oro.
13. Dispositivo según la reivindicación 12,
caracterizado porque comprende una capa de cromo como metal
de adhesión entre los electrodos de oro y dichos substrato de
pirex.
14. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 10, caracterizado por incorporar medios
para aportación de un gas de secado para el secado de los electrodos
interdigitados entre cada paso de su funcionalización.
\newpage
15. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque los terminales de los electrodos
interdigitados se encuentran conectados a un equipo de medida
mediante un sistema de conexión con contactos
clip-on formado por dos piezas:
- i)
- una matriz de electrodos interdigitados que incluyen unas salidas simétricas y externas, y
- ii)
- un "espejo" de estas salidas externas, las cuales conectan dichos IDE's con dicho equipo de medida).
\vskip1.000000\baselineskip
16. Dispositivo según la reivindicación 3, 5 ó
6, caracterizado por comprender un bloque de procesado de
datos que incluye una tabla almacenada en un microcontrolador y una
circuitería de control para determinar la concentración de
la(s) sustancia(s) a detectar.
17. Procedimiento para la detección y
cuantificación de sustancias presentes en líquidos, que
comprende:
a) funcionalizar con una capa de antígeno la
superficie de unos electrodos interdigitados, tapizando dicha
superficie;
b) realizar una primera medida de las
propiedades eléctricas de dichos electrodos interdigitados,
c) aplicar una solución con unas moléculas a
detectar seguida de una solución con anticuerpos marcados con
nanopartículas conductoras sobre dichos electrodos interdigitados,
para que dichos antígenos y dichas moléculas de la sustancia a
detectar, que luego es evacuada, reaccionen competitivamente con
dichos anticuerpos marcados con nanopartículas conductoras;
d) realizar una segunda medida de las
propiedades eléctricas de dichos electrodos interdigitados, una vez
que una parte de los anticuerpos marcados con nanopartículas
conductoras han sido capturados por dicha capa de antígeno;
e) comparar dichas segundas medidas con dichas
primeras medidas; y
f) detectar, en función de la variación
detectada en dicha comparación, a qué sustancia pertenecen dichas
moléculas, por comparación con unas tablas de referencia para cada
sustancia.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Procedimiento según la reivindicación 17,
caracterizado porque dicha etapa f) comprende además
cuantificar el número de moléculas incluidas en dicha solución de
moléculas a detectar.
19. Procedimiento según la reivindicación 17 ó
18, caracterizado porque dicha etapa f) comprende detectar
simultáneamente varias sustancias mediante la aplicación, en dicha
etapa c), de varias soluciones con anticuerpos específicos al
antígeno inmovilizado en dicha etapa a), y el uso de matrices de
electrodos integrables.
20. Procedimiento según la reivindicación 17,
caracterizado porque comprende, tras dicha etapa f), limpiar
a los electrodos de todo agente biológico, así como de las
nanopartículas conductoras, y reutilizar a dichos electrodos
interdigitados realizando de nuevo dichas etapas a) a f).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200700282A ES2347617B1 (es) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Dispositivo sensor interdigitado perfeccionado basado en anticuerpos marcados con nanoparticulas conductoras. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200700282A ES2347617B1 (es) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Dispositivo sensor interdigitado perfeccionado basado en anticuerpos marcados con nanoparticulas conductoras. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2347617A1 ES2347617A1 (es) | 2010-11-02 |
| ES2347617B1 true ES2347617B1 (es) | 2011-09-22 |
Family
ID=42978775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200700282A Active ES2347617B1 (es) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Dispositivo sensor interdigitado perfeccionado basado en anticuerpos marcados con nanoparticulas conductoras. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2347617B1 (es) |
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| US4822566A (en) * | 1985-11-19 | 1989-04-18 | The Johns Hopkins University | Optimized capacitive sensor for chemical analysis and measurement |
| WO2006121266A1 (en) * | 2005-05-06 | 2006-11-16 | Jae Chern Yoo | Digital bio disc(dbd), dbd driver apparatus, and assay method using the same |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7435384B2 (en) * | 2001-01-08 | 2008-10-14 | Leonard Fish | Diagnostic instrument with movable electrode mounting member and methods for detecting analytes |
-
2007
- 2007-01-29 ES ES200700282A patent/ES2347617B1/es active Active
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| WO2006121266A1 (en) * | 2005-05-06 | 2006-11-16 | Jae Chern Yoo | Digital bio disc(dbd), dbd driver apparatus, and assay method using the same |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2347617A1 (es) | 2010-11-02 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
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| FG2A | Definitive protection |
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