ES2346525T3

ES2346525T3 - Un metodo para optimizar expresion genica utilizando optimizacion de condon sinonimo.

Info

Publication number: ES2346525T3
Application number: ES03810343T
Authority: ES
Inventors: Ian Hector Frazer
Original assignee: University of Queensland UQ
Current assignee: University of Queensland UQ
Priority date: 2002-11-08
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2010-10-18
Anticipated expiration: 2023-11-10
Also published as: EP1578969A1; EP1578969A4; ATE463570T1; AU2003275776B2; EP1578969B1; AU2003275776A1; US20060292566A1; WO2004042059A1; DE60332041D1; JP2006506986A; NZ539893A; US20130074218A1; DK1578969T3

Abstract

Un método para construir un polinucleótido sintético del cual se puede producir un polinucleótido para conferir un fenotipo seleccionado sobre un organismo multicelular de interés o parte del mismo en una calidad diferente que aquella conferida por un polinucleótido progenitor que codifica el mismo polipéptido, el método comprende: (a) seleccionar un primer codón del polinucleótido progenitor para sustitución con un codón sinónimo, en donde el codón sinónimo se selecciona sobre la base de que este exhibe a una preferencia fenotípica diferente a aquella del primer codón en una comparación de preferencias fenotípicas en organismos de prueba no humanos o partes de los mismos, en donde las partes de los organismos de prueba se seleccionan de tejidos u órganos de los organismos de prueba, en donde los organismos de prueba se seleccionan del grupo que consiste de organismos de la misma especie como el organismo de interés y el organismo que se relaciona con el organismo de interés: y (b) reemplazar el primer codón con el codón sinónimo para construir el polinucleótido sintético, en donde el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido sobre una célula por el polinucleótido progenitor que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido.

Description

Un método para optimizar expresión génica utilizando optimización de codón sinónimo.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona de manera general con la expresión génica. Más particularmente, la presente invención se relaciona con un método para modular la calidad de un fenotipo seleccionado que se exhibe por un organismo o parte del mismo y que resulta de la expresión de un polinucleótido que codifica el polipéptido al reemplazar por lo menos un codón de tal polinucleótido con un codón sinónimo que tiene una mayor o menor preferencia de uso por el organismo o parte del mismo para producir el fenotipo seleccionado que el codón reemplaza. Aún más particularmente, la invención se relaciona con el uso de un polinucleótido que codifica proteína cuya composición de codón se ha modificado para modular la calidad de un fenotipo seleccionado exhibido por un organismo o parte del mismo.

Antecedente de la invención

La expresión génica heteróloga externa en células transformadas es algo corriente. Un gran número de genes de mamíferos, que incluyen, por ejemplo, genes de murino y humano, se han expresado de forma exitosa en varias células anfitrionas, que incluyen células anfitrionas de bacterias, levadura, insecto, planta y mamífero. No obstante, a pesar del creciente conocimiento de los sistemas de expresión y la tecnología del ADN recombinante, permanecen obstáculos significativos cuando se intenta expresar un gen externo o sintético en una célula anfitriona seleccionada. Por ejemplo, la traducción de un gen sintético, aún cuando se acopla con un promotor fuerte, que a menudo procede mucho más lentamente de lo esperado. Lo mismo es frecuentemente cierto de los genes exógenos que son externos a la célula anfitriona. Esta es menor que la eficiencia de traducción esperada que se debe frecuentemente a las regiones de codificación de proteína del gen que tienen un patrón de uso de codón que no se asemeja a aquellos de los genes altamente expresados en la célula anfitriona. Se sabe a este respecto que la utilización de codón es altamente sesgada y varía considerablemente en diferentes organismos y que los sesgos en el uso del codón pueden alterar los índices de alargamiento del péptido. También se sabe que los patrones de uso de codones están relacionados con la abundancia relativa de isoaceptores de tARN, y que los genes que codifican proteínas de alta abundancia versus baja abundancia muestran las diferencias en sus preferencias de codón.

Las implicaciones del fenómeno de preferencia de codón sobre la expresión génica se manifiestan en que estos fenómenos pueden afectar la eficiencia traducional del ARN mensajero (mARN). Es ampliamente conocido a este respecto que la traducción de "codones raros", para los que el iso-tARN correspondiente es bajo en abundancia con relación a otros iso-tARNs, pueden originar un ribosoma para pausa durante la traducción que puede conducir a una falla para completar una cadena de polipéptido naciente y un desacoplamiento de la trascripción y traducción. Así, la expresión de un gen exógeno se puede impedir severamente si una célula anfitriona particular de un organismo o del organismo en si mismo tiene una baja abundancia de iso-tARNs que corresponde a uno o más codones del gen exógeno. De acuerdo a lo anterior, un objetivo principal de los investigadores en este campo es discernir primero la preferencia del codón para células particulares en las que un gen exógeno se va a expresar, y posteriormente alterar la composición del codón de ese gen para expresión optimizada en aquellas células.

La WO98/12207 describe métodos y genes para expresión de alto nivel de proteínas. La WO01/66739 describe un cADN que codifica un gen TRAG (TGF-\beta gen asociado a la resistencia) y su producto de proteína. La US-A-
5 689 052 describe secuencias de ADN sintético que tienen expresión mejorada en plantas monocotiledóneas y un método para la preparación de las mismas.

Se conocen técnicas para optimización de codón para mejorar las técnicas traduccionales de regiones de codificación de proteína traduccionalmente ineficientes. Tradicionalmente, estas técnicas se han basado en el remplazo de codones que se utilizan rara o poco frecuentemente en la célula anfitrión con aquellos que son anfitriones preferidos. Las frecuencias de codón se pueden derivar de fuentes de bibliografía para genes altamente expresados de muchos organismos (ver, por ejemplo, Nakamura et al., 1996, Nucleic Acids Res 24: 214-215). Estas frecuencias se expresan generalmente sobre una "base promedio cumplida de organismos" como el porcentaje de ocasiones que se utiliza un codón sinónimo para codificar un aminoácido correspondiente a través de una colección de genes que codifican proteínas de su organismo, que preferiblemente se expresan enormemente.

Típicamente, los codones se clasifican como: (a) codones "comunes" (o codones "preferidos") si su frecuencia de uso está por encima de aproximadamente 4/3 x la frecuencia de uso que se esperaría en la ausencia de cualquier sesgo en el uso de codón; (b) codones "raros" (o codones "no preferidos") si su frecuencia de uso está por debajo de aproximadamente 2/3 x la frecuencia de uso que se esperaría en la ausencia de cualquier sesgo en el uso de codón; y (c) codones "intermedio" (o codones "menos preferidos" ) si su frecuencia de uso está entre la frecuencia de uso de los codones "comunes" y de los codones "raros". Debido a que un aminoácido se puede codificar mediante 2, 3, 4 o 6 codones, la frecuencia de uso de cualquier codón seleccionado, que se esperaría en la ausencia de cualquier sesgo en el uso de codón, dependería del número de codones sinónimos que codifican los mismos aminoácidos como el codón seleccionado. De acuerdo con lo anterior, para un aminoácido particular, el lumbral de frecuencia para clasificar codones en las categorías "común", "intermedio" y "raro" dependería del número de codones sinónimos para ese aminoácido. Por consiguiente, para los aminoácidos que tienen 6 elecciones de codones sinónimos, la frecuencia de uso de codón que se esperaría en la ausencia de cualquier sesgo en el uso de codón es 16% y Así los codones "común", "intermedio" y "raros" se definen como aquellos codones que tienen una frecuencia de uso por encima de 20%, entre 10 y 20% y por debajo de 10%, respectivamente. Para los aminoácidos que tienen 4 elecciones de codones sinónimos, la frecuencia de uso de codón que se esperaría en la ausencia del sesgo del uso de codón es 25% y Así los codones "común", "intermedio" y "raros" se definen como aquellos codones que tienen una frecuencia de uso por encima de del 33%, entre 16 y 33% y por debajo del 16%, respectivamente. Para la isoleucina, que es el único aminoácido que tiene 3 elecciones de codones sinónimos, la frecuencia de uso del codón que se esperaría en la ausencia de cualquier sesgo en el uso de codón es 33% y Así los codones "común", "intermedio" y "raros" para la isoleucina se definen como aquellos codones que tienen una frecuencia de uso por encima de 45%, entre el 20 y 45% y por debajo del 20%, respectivamente. Para los aminoácidos que tienen 2 elecciones de codones sinónimos, la frecuencia de uso de codón que se esperaría en la ausencia del sesgo del uso de codón es del 50% y Así los codones "común", "intermedio" y "raros" se definen como aquellos codones que tienen una frecuencia de uso por encima de 60%, entre 30 y 60% y por debajo del 30%, respectivamente. Así, la categorización de los codones en las clases "común", "intermedio" y "raro" (o "preferidos", "menos preferidos" o "no preferidos", respectivamente) se han basado convencionalmente sobre una compilación de uso de codón para un organismo en general (por ejemplo, "a escala humana") o para una clase de organismos en general (por ejemplo, "a nivel de mamíferos"). Por ejemplo, se puede hacer referencia a Verd (véase Patente Estadounidense Nos de Serie 5,786,464 y 5,795,737) que describen codones preferidos, menos preferidos y no preferidos para células de mamífero en general. Sin embargo, el presente inventor revela en la WO 99/02694 y en WO 00/42190 que hay sustanciales diferencias en la abundancia relativa del iso-tARNs particular en diferentes células o tejidos de un único organismo multicelular (por ejemplo, un mamífero o una planta) y que este tiene un papel vital en la traducción de proteína de una secuencia de codificación con una composición o uso de codón dado.

Así, en contraste con la presunción reconocida por la técnica que las distintas células de un organismo multicelular tienen el mismo sesgo en el uso de codón se revela por primera vez que un tipo de células de un organismo multicelular utiliza codones de una manera distinta de otro tipo de células del mismo organismo. En otras palabras, se revela que las diferentes células de un organismo exhibir diferentes eficiencias de traslación para el mismo codón y que no es posible predecir qué codones serían preferidos, menos preferidos o no preferidos en un tipo de célula seleccionada. De acuerdo con lo anterior, se propone que las diferencias en la eficiencia de traslación de codón entre los tipos de células podrían ser explotadas, junto con la composición codón de un gen, para regular la producción de una proteína en, o dirigir aquella producción a, un tipo de célula escogida.

Por lo tanto, con el fin de optimizar la expresión de un polinucleótido que codifica la proteína en un tipo de célula en particular, es necesario determinar primero la eficiencia traduccional para cada codón en tal tipo de células, en lugar de basarse en las frecuencias de codón calculada sobre una base promedio amplia del organismo, y luego para que el codón modifique el polinucleótido con base en tal determinación.

Todos los métodos anteriores se relacionan con la optimización del codón del polinucleótido que codifica proteínas para modular la expresión de aquellos polinucleótidos de un tipo celular elegido o para expresar diferencialmente aquellos polinucleótidos entre los tipos de células seleccionadas.

Breve resumen de la invención

La presente invención se relaciona con una estrategia novedosa para cambiar la calidad de un fenotipo seleccionado que se exhibe por un organismo de interés y que resulta de la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido. En contraste con los métodos descritos hasta ahora, esta estrategia no se basa en los datos de uso de codón o en los datos de eficiencia traduccional de codón que se puede aplicar al organismo de interés. En cambio, se basa en la clasificación de codones sinónimos individuales que codifican a un aminoácido en el polipéptido de acuerdo con su preferencia de uso por el organismo de interés para producir el fenotipo seleccionado. En otras palabras, el método objeto se basa en la determinación de las "preferencias fenotípicas" de los codones sinónimos individuales. Ventajosamente, se pueden determinar las preferencias fenotípicas al introducir en el organismo de interés o en un organismo relacionado una construcción sintética que comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem de un codón fusionado en un marco con un polinucleótido indicador que codifica una proteína, que produce, o que se predice que produce, el fenotipo seleccionado o un fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado. La calidad del fenotipo producida por la expresión de la construcción sintética en el organismo de interés o en el organismo relacionado luego se determina utilizando un ensayo adecuado. El fenotipo seleccionado puede ser un fenotipo terapéutico o profiláctico que incluye inmunidad, tolerancia, resistencia a patógeno etc., u otra característica benéfica que incluye la mejora o prevención de un proceso de reparación, resistencia a las plagas, resistencia a las heladas, tolerancia al herbicida etc. De acuerdo con la presente invención, un conjunto de codones sinónimos exhibirán a menudo un rango de preferencias fenotípicas, que se pueden utilizar como una base para seleccionar racionalmente un codón en el polinucleótido original para sustitución con un codón sinónimo que tiene una preferencia fenotípica diferente.

Así en un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para construir un polinucleótido sintético del cual se puede producir un polinucleótido para conferir un fenotipo seleccionado sobre un organismo multicelular de interés o parte del mismo en una calidad diferente que aquella conferida por un polinucleótido progenitor que codifica el mismo polipéptido, el método comprende: (a) seleccionar un primer codón del polinucleótido progenitor para sustitución con un codón sinónimo, en donde el codón sinónimo se selecciona sobre la base de que este exhibe una preferencia fenotípica diferente de aquella del primer codón en una comparación de preferencias fenotípicas en organismos de prueba no humanos o partes de los mismos, en donde las partes de organismos de prueba se seleccionan de tejidos u órganos de los organismos de prueba, en donde los organismos de prueba se seleccionan del grupo que consiste de organismos de la misma especie como el organismo de interés y organismos que se relacionan con el organismo de interés: y (b) reemplazar el primer codón con el codón sinónimo para construir el polinucleótido sintético, en donde el fenotipo seleccionado es seleccionado de un fenotipo conferido sobre una célula mediante un polinucleótido pariente que contiene el primer codón que se expresa en las células y que codifica el polipéptido. En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona aquí un método para construir un polinucleótido sintético a partir del cual se puede producir un polipéptido para conferir un fenotipo seleccionado sobre un organismo multicelular de interés o parte del mismo o en calidad diferente que aquella conferida por un nucleótido pariente que codifica el mismo polipéptido, el método comprende. (a) seleccionar un primer codón del polinucleótido pariente para reemplazo con un codón sinónimo, en donde el codón sinónimo selecciona sobre la base de que este exhibe una preferencia fenotípica diferente que la del primer codón en una comparación de preferencias fenotípicas en parte ex vivo de organismos de prueba, en donde dichas partes de los organismos de prueba se seleccionan de tejidos u órganos de los organismos de prueba, en donde dichas partes de los organismos de prueba no incluyen un citoblasto embriónico humano o una célula de estirpe germinal humana, en donde las partes de los organismos de prueba se seleccionan del grupo que consiste de organismos de la misma especie que los organismos de interés y los organismos que se relacionan con los organismos de interés: y (b) reemplazar el primer codón con el codón sinónimo para construir el polinucleótido sintético, en donde el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido sobre una célula por e polinucleótido pariente que contiene el primer codón que se expresa en las células y que codifica el polipéptido.

Las preferencias fenotípicas de los codones en los organismos de prueba o partes se comparan adecuadamente al: (i) introducir separadamente en los organismos de prueba o partes de construcciones sintéticas individuales, casa una de las cuales comprende un polinucleótido regulador y ligado operablemente a una repetición tándem de un codón fusionado en cuadro con un indicador de polinucleótido que codifica una proteína indicadora, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo correspondiente seleccionado del grupo que consiste del fenotipo seleccionado y un fenotipo de la misma clase que el fenotipo seleccionado; y (ii) comparar la calidad de los fenotipos exhibida por los organismos de prueba o partes para determinar las preferencias fenotípicas relativas de los codones.

Las construcciones sintéticas son típicamente entre los organismos de prueba o partes utilizando la misma forma de introducción o una forma de introducción similar. Es deseable cuando el fenotipo correspondiente o su calidad es dependiente de una forma particular o sitio de introducción de las construcciones sintéticas.

En algunas realizaciones, la repetición tándem de cada una de las construcciones sintéticas comprende por lo menos tres copias del codón correspondiente.

En algunas realizaciones, los codones sinónimo se seleccionan de tal manera que estos tienen una mayor preferencia fenotípica que el primer codón. De acuerdo con la presente invención, una mayor preferencia fenotípica se correlacionara con una mayor calidad del fenotipo seleccionado. De acuerdo con lo anterior, un codón sinónimo para estas realizaciones se puede seleccionar preferiblemente cuando la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética comprende una repetición tándem del codón sinónimo que es adecuado por lo menos aproximadamente 5% más que la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón.

En otras realizaciones, el codón sinónimo es seleccionado de tal manera que este tiene una menor preferencia fenotípica que el primer codón. De acuerdo con la invención objeto, una menor preferencia fenotípica se correlacionara con una menor calidad del fenotipo seleccionado. Así, un codón sinónimo para estas realizaciones se puede seleccionar preferiblemente cuando la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética que comprende una repetición tándem del codón sinónimo es adecuada en por lo menos aproximadamente el 5% menor que la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón.

La presente invención se puede aplicar a organismos multicelulares que incluyen plantas y animales.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para determinar la preferencia fenotípica de un primer codón en un organismo multicelular de interés o parte del mismo, el método: (a) introducir una construcción sintética dentro de un organismo de prueba no humano o parte del mismo, en donde dicha parte del organismo de prueba se selecciona de tejidos u órganos del organismo de prueba, en donde el organismo de prueba se selecciona del grupo que consiste de un organismo de las misma especie que el organismo de interés y un organismo que se relaciona con el organismo de interés, la construcción sintética comprende un polinucleótido regulador ligador operablemente a una repetición tándem del primer codón fusionado en cuadro con un polinucleótido indicador que codifica una proteína indicadora, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo seleccionado o un fenotipo de la misma clase que el fenotipo seleccionado; y (b) determinar la calidad del fenotipo correspondiente desplegado por el organismo de prueba no humano o parte, en donde el fenotipo seleccionado o el fenotipo de la misma clase que el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido por una célula mediante un polinucleótido pariente que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona aquí un método para determinar la preferencia fenotípica del primer codón en un organismo multicelular de interés o parte del mismo, el método comprende: (a) introducir una construcción sintética ex vivo de un organismo de prueba, en donde dicha parte de un organismo de prueba se selecciona de tejidos u órganos del organismo de prueba, en donde dicha parte de organismo de prueba no incluye un citoblasto embriónico humano o una célula de estirpe germinal humana, en donde la parte del organismo de prueba se selecciona del grupo que consiste de organismos de la misma especie que el organismo de interés y un organismo que se relaciona con el organismo de interés, la construcción sintética comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem del primer codón fusionado en un cuadro con un polinucleótido indicador, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo seleccionado o un fenotipo de la misma clase que el fenotipo seleccionado; y (b) determinar la calidad del fenotipo desplegado por la parte ex vivo de un organismo de prueba, en donde el fenotipo seleccionado o el fenotipo de la misma clase que el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferida sobre una célula por el polinucleótido pariente que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido.

En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente comparar: (i) la calidad del fenotipo correspondiente del fenotipo desplegado por una parte ex vivo de un organismo de prueba al que se proporciona una construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón, en donde dicha parte del organismo de prueba se selecciona de tejidos o órganos del organismo de prueba, en donde dicha parte de un organismo de prueba no incluye un citoblasto embriónico humano o una célula de estirpe germinal humana; y (ii) la calidad correspondiente al fenotipo desplegada por una parte ex vivo de un organismo de prueba al que una construcción sintética comprende una repetición tándem de un segundo codón se proporciona, en donde dicha parte de un organismo de prueba se selecciona de tejidos u órganos del organismo de prueba, en donde dicha parte de un organismo de prueba no incluye un citoblasto embriónico humano o una célula de estirpe germinal humana, en donde el segundo codón codifica el mimo amino ácido que le primer codón, para determinar por lo tanto la preferencia fenotípica de un primer codón relación a la preferencia fenotípica del segundo codón en el organismo de prueba o parte.

En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente comparar: (i) la calidad del fenotipo correspondiente fenotipo desplegado por una parte u organismo de prueba al que la construcción sintética comprende una repetición tándem del primer codón se proporciona; y (ii) la calidad del fenotipo correspondiente fenotipo desplegada por una parte u organismo de prueba al que se proporciona una construcción sintética que comprende una repetición tándem del segundo codón, en donde el segundo codón codifica el mismo amino ácido que el primer codón, para determinar por lo tanto la preferencia fenotípica del primer codón con relación a la preferencia fenotípica del segundo codón en el organismo de prueba o parte.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden adicionalmente: (1) introducir la construcción sintética entre un progenitor de una parte o de un organismo de prueba; y (2) producir la parte u organismo de prueba del progenitor, en donde la parte u organismo de prueba contienen la construcción sintética.

En otras realizaciones, los métodos comprenden adicionalmente: (1) introducir la construcción sintética entre un progenitor de una parte u organismo de prueba; y (2) hacer crecer la parte u organismo de prueba del progenitor; en donde la parte u organismo de prueba comprende una célula que contiene la construcción sintética.

En todavía otras realizaciones, los métodos comprenden adicionalmente: introducir la construcción sintética entre una célula seleccionada de la parte u organismo de prueba.

Se puede construir un polinucleótido sintético de acuerdo con uno cualquiera de los métodos anteriores.

Describimos un organismo de interés o parte del mismo que contiene un polinucleótido sintético construido de acuerdo con uno cualquiera de los métodos anteriores.

Un organismo de interés o parte del mismo puede contener una construcción sintética que comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem de un primer codón fusionado en cuadro con un polinucleótido indicador que codifica una proteína indicadora, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo seleccionado o un fenotipo de la misma clase que el fenotipo seleccionado.

Describimos métodos para modelar la calidad de un fenotipo seleccionado que se visualiza por un organismo de interés o parte del mismo y que resulta de la expresión de un polinucleótido pariente que codifica el polipéptido. Estos métodos comprenden generalmente: introducir en la parte u organismo un polinucleótido sintético que se distingue del polinucleótido pariente mediante el reemplazo de un primer codón en el polinucleótido pariente con un codón sinónimo que presenta una preferencia fenotípica que la del primer codón en la parte u organismo.

Describimos métodos para mejorara la calidad de un fenotipo seleccionado que se visualiza mediante un organismo de interés o parte del mismo y que resulta de la expresión de un polinucleótido pariente que codifica el polipéptido. Estos métodos comprenden generalmente: introducir en la parte u organismo un polinucleótido sintético que se distingue del polinucleótido pariente mediante el reemplazo de un primer codón en el polinucleótido pariente con un codón sinónimo que presenta una mayor preferencia fenotípica que la del primer codón en la parte u organismo.

Describimos métodos para modelar la calidad de un fenotipo seleccionado que se visualiza por un organismo de interés o parte del mismo y que resulta de la expresión de un polinucleótido pariente que codifica el polipéptido. Estos métodos comprenden generalmente: introducir en la parte u organismo un polinucleótido sintético que se distingue del polinucleótido pariente mediante el reemplazo de un primer codón en el polinucleótido pariente con un codón sinónimo que presenta una menor preferencia fenotípica que la del primer codón en la parte u organismo.

Descripción detallada de la invención Definiciones

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que lo entiende comúnmente la persona medianamente versada en la técnica a la que pertenece. Aunque se pueden utilizar aquí no todos los materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la práctica o pruebas de la presente invención, se describen métodos de materiales preferidos. Para propósito de la presente invención se definen los siguientes términos.

Los artículos "un" y "uno" se utilizan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno) de los objetos gramaticales del articulo. Por vía de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

El término "aproximadamente" s utiliza aquí para referirse a parámetros (por ejemplo, cantidades, concentraciones, eficiencias que confieren genotipos, tiempo, etc.) que varia a los sumo al 30%, 20%, 15%, 10%, 5% o un 4%, 3%, 2%, 1% para un parámetro especifico.

Como se utiliza aquí el término "secuencia de asación cis" o "región reguladora cis" o términos similares deben significar cualquier secuencia de nucleótidos que se deriva de una secuencia genética expresable en donde la expresión de la secuencia genética se regula, por lo menos en parte mediante dicha secuencia de nucleótidos. Aquellos expertos en la técnica sabrán que una región reguladora cis puede ser capaz de activar, silenciar, mejorar, represar o alterar de otra forma el nivel de expresión y/o la especificidad de tipo celular y/o la especificidad de desarrollo de cualquier secuencia génica estructural.

A lo largo de esta especificación, a menos que el contexto indique lo contrario, las palabras "comprende", "comprenden" y "que comprenden" se entienden que implican la inclusión de una etapa establecida que elemento o grupo de etapas de elementos pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.

Como se utiliza aquí un "fenotipo compelido" se refiere a un cambio permanente temporal en el estado de un organismo de interés o clase de organismo de interés, o de una parte de tejido o célula o tipo de célula o clases de células de un organismo de interés, que ocurre después de la introducción de un polinucleótido a este organismo, o a esta clase de organismos, o a la parte o tejido o célula o tipo de célula o clase de célula, o aun precursor de dicho organismo o parte de tejido o célula o tipo de célula o clases de células, y que no habrían ocurrido en la ausencia de esta introducción. Típicamente, tales cambios permanentes o temporales ocurren como un resultado de la transcripción y/o traducción de una información genética contenida dentro de ese polinucleótido en la célula, o en por lo menos una célula o tipo de célula o clase de célula dentro de un organismo de interés o dentro de la clase o clases de organismos de interés, y se puede utilizar para distinguir el organismo de interés, o clases de organismos de interés, o parte o tejido o célula o tipo de célula o clase de célula de la misma, o progenies genéticas de estas, a las que se han proporcionado polinucleótidos de un organismo similar de interés o clases de organismos de interés, o parte o tejido o célula o tipo de células o clases de células de las mismas, o progenie genética de estas, a las que no se han proporcionado polinucleótidos.

"Vector de expresión" significa cualquier elemento genético autónomo capaz de dirigir la síntesis de una proteína codificada por el vector. Tales vectores de expresión se conocen por los expertos en la técnica.

El término "gen" como se utiliza aquí se refiere a cualquiera y todas las regiones de codificación discreta de un genoma anfitrión, o regiones que codifican un solo ARN funcional (por ejemplo, tARN, rARN, ARN regulador tal como ribosomas, ARN asociado con el silenciamiento génico postraduccional etc.) Así como también regiones no codificantes asociadas y regiones opcionalmente reguladoras. En ciertas realizaciones el término "gen" incluye dentro de su alcance los polipéptidos específicos que codifican los marcos de lectura abierto, intrones, y secuencias de nucleótidos no codificantes 5' y 3' adyacentes involucradas en la regulación de la expresión. A este respecto el gen puede comprender señales adicionales de control tal como promotores, mejoradores, señales de terminación y/o poliadenilación que se asocia naturalmente con un gen dado, o señales de control heterólogas. Las secuencias génicas pueden ser ADN genómico o cADN un fragmento de los mismos. El gen se puede introducir en un vector apropiado para mantenimiento extra cromosómico o para integración en el anfitrión.

"Modulación", "modula" significa incrementar o reducir, ya sea directa o indirectamente, la calidad de un fenotipo seleccionado.

"Gen natural" significa un gen que codifica naturalmente la proteína. Sin embargo, que el polinucleótido pariente codifica una proteína que no es de ocurrencia natural pero que se ha construido con ingeniería genética utilizando técnicas recombinantes.

"Región de no codificación 5'" se utiliza aquí en su contexto más amplio para incluir todas las secuencias de nucleótidos que se derivan de la región en la dirección 5' de un gen explotable, diferentes de aquellas secuencias que codifican residuos de aminoácidos que comprenden el producto de polipéptido de dicho gen, en donde la región de no codificación 5' confiere o activa o facilita de otra forma, por lo menos en parte la expresión del gen.

El término "oligonucleótido" como se utiliza aquí se refiere a un polímero compuesto de una multiplicidad de unidades de nucleótidos (desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos, o variantes estructurales relacionadas o análogos sintéticos del mismo) ligados a través de enlaces fosforiéster (o variantes estructurales relacionadas o análogos sintéticos del mismo). Así, aunque el término "oligonucleótido" se refiere típicamente a un polímero de nucleótido en el que los nucleótidos y enlaces entre ellos son de ocurrencia natural, se entenderá que el termino también incluye que el termino también incluye dentro de su alcance varios análogos que incluyen, pero no se restringen a, ácidos nucleicos de péptido (PNAs), fosforamidatos, fosforitioatos, metilfosfosfonatos, ácidos 2-o-metilribonucleicos, y similares. El tamaño exacto de la molécula puede variar dependiendo de la aplicación particular. Un oligonucleótido es típicamente bastante corto de longitud, generalmente de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos, pero el término puede referirse a moléculas de cualquier longitud, aunque el término "polinucleótido" o "ácido nucleico" se utiliza típicamente para oligonucleótidos mayores.

El término "conectado operablemente" como se utiliza aquí significa colocar un gen estructural bajo el control regulador de un promotor, que luego controla la transcripción y opcionalmente la traducción del gen. En la construcción de combinaciones de promotores heterólogos/genes estructurales, se prefiere normalmente posicionar la secuencia genética o promotor a una distancia del sitio de inicio de transcripción génico que es aproximadamente igual a la distancia entre esa secuencia genética o promotora y el gen que controla en su configuración natural; es decir el gen del que la secuencia genética o promotor se deriva. Como se sabe en la técnica, alguna variación en esta distancia se puede acomodar sin pérdida de función. De manera similar, el posicionamiento preferido de un elemento de secuencia reguladora con respecto a un gen heterólogo a ser colocado bajo su control se define mediante el posicionamiento del elemento en su configuración inicial; es decir los genes de los que se derivan.

Los términos "precursor" y "progenitor" como se utilizan aquí se refieren a una célula o parte de una célula que puede hacer de un organismo de interés en el que se desea la expresión fenotípica o en el que la preferencia fenotípica de un codón se determina.

El término "fenotipo" una cualquiera o más de las características típicas o funcionales detectables, propiedades, atributos o rasgos en un organismo tejido, o célula o clase de organismos, tejidos o células, que resulta generalmente de la interacción entre los rasgos genéticos (es decir genotipos) del organismo, tejido, o célula, o las clases de organismos, tejidos o células y el ambiente. En ciertas realizaciones, el término "genotipo" excluye la resistencia a un agente selectivo o detección de una actividad enzimática o en fuera de luz, contenida directamente por una proteína indicadora.

"Preferencias genotípicas" significa la preferencia con que un organismo utiliza un codón para producir un fenotipo seleccionado. Esta preferencia se puede evidenciar como por ejemplo, mediante la calidad de un genotipo seleccionado que se puede producir mediante un polinucleótido que comprende el codón en un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido que produce el genotipo seleccionado. En ciertas realizaciones las preferencias de uso es independiente de la ruta mediante la que se introduce en el organismo. Sin embargo, en otras realizaciones, la preferencia de uso es dependiente de la ruta de introducción del polinucleótido en el organismo.

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" como se utiliza aquí designa mARN, ARN, cARN, cADN, o ADN. El término se refiere típicamente a oligonucleótidos mayores de 30 nucleótidos de longitud.

"Polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente aquí para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos del mismo. Así, estos términos aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un aminoácido de ocurrencia no natural sintética, tal como un análogo químico de un aminoácido de ocurrencia natural correspondiente, así como también con polímeros de aminoácidos de ocurrencia natural.

"Producir" y términos similares tales como "producción" y "producible", en el contexto o producción de proteína, significa la producción de una proteína a un nivel suficiente para alcanzar una función particular o fenotipo asociada con la proteína. En contraste, los términos "no producible" y "sustancialmente no producible" como se utiliza intercambiablemente aquí se refiere a (a) ninguna producción de una proteína, (b) producción de una proteína a un nivel que no es suficiente para efectuar una función particular o fenotipo asociada con la proteína, (c) producción de una proteína que no se puede detectar mediante un anticuerpo monoclonal especifico para la proteína, o (d) producción de una proteína, que es menor de 1% del nivel producido en una célula tipo silvestre que produce normalmente la proteína.

La referencia aquí a "promotor" se hace en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras transduccionales de un gen genómico clásico, que incluye la caja TATA que se requiere para la iniciación de la transcripción exacta, con o sin la secuencia de la caja CCAAT y elementos reguladores adicionales (es decir que fuentes de activación en la dirección 5', mejoradores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a un estimulo del desarrollo y/o ambiental, o en una forma específica del tipo de célula o especifica de tejido. Un promotor es usualmente, pero no necesariamente, posicionado en la dirección 5' o 5' de un gen estructural, cuya expresión se regula. Adicionalmente, los elementos reguladores comprenden un promotor que se posiciona usualmente dentro del 2kd del ciclo de inicio de transcripción del gen. Los promotores preferidos de acuerdo con la invención pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos para mejorar adicionalmente la expresión en una célula, y/o alterar el tiempo de expresión de un gen estructural al que se conecta operablemente.

El término "calidad" se utiliza aquí en su sentido más amplio e incluye una medida, resistencia, intensidad, grado o grado de un fenotipo, por ejemplo, una respuesta inmune superior o inferior, resistencia a la enfermedad incrementada o reducida, mayor o menor acumulación de sacarosa, menor o peor tolerancia a la sal, etc.

El "polipéptido recombinante" significa un polipéptido que se hace utilizando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un polinucleótido recombinante o sintético.

El término "polinucleótido sintético" como se utiliza aquí se refiere a un polinucleótido formado in vitro por la manipulación de un polinucleótido en una forma no encontrada normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, el polinucleótido sintético puede estar en la forma de un vector de expresión. Generalmente, tales vectores de expresión incluyen polinucleótido reguladores transcripcionales y traduccionales ligados operablemente al polinucleótido.

El término "codón sinónimo" como se utiliza aquí se refiere a un codón que tiene una secuencia de nucleótido diferente de aquel otro codón pero que codifica el mismo amino ácido que aquel otro codón.

"Vector" significa una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de ADN derivada, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago, o virus de planta, en el que una secuencia de ácido nucleico se puede insertar o clonar. Un vector contiene preferiblemente uno o más sitos de restricción únicos y puede ser capaz de replicación autónoma en una célula anfitriona definida que incluye una célula objetivo o tejido o una célula progenitora o tejido de la misma, o se puede integrar sobre el genoma o el anfitrión definido de tal manera que la secuencia clonada se puede reproducir. De acuerdo con lo anterior, el vector puede ser un vector de replicación autónomo, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plasmo circular lineal o cerrado, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar auto-replicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduzca en la célula anfitriona, se integre en el genoma y se replique junto con los cromosomas en los que este se ha integrado. Un sistema de vector puede comprender un único vector o plásmido, dos o más vectores o plásmidos, que juntos contienen el ADN total a ser introducido en el genoma de la célula anfitriona, o un transposón. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula anfitriona en la que se va a introducir el vector. El vector también puede incluir un marcador de selección tal como un gen de resistencia antibiótica que se puede utilizar para la selección de transformantes adecuados. Ejemplos de tal gen de resistencia se conocen bien en la técnica por aquellos expertos en el arte.

2. Preferencia fenotípica de codones

La presente invención proporciona una estrategia novedosa para mejorar o reducir la calidad de un fenotipo seleccionado que se visualiza, o se propone que se visualice, mediante un organismo de interés. La estrategia involucra la modificación de codón de un polinucleótido que codifica un polipéptido asociado a fenotipos que ya sea por sí mismo o en asociación con otras moléculas, en el organismo de interés imparte e o considere el fenotipo seleccionado sobre el organismo. A diferencia de los métodos anteriores, sin embargo, la estrategia no se basa en datos que proporcionen una clasificación de codones sinónimos de acuerdo con su preferencia de uso en un organismo o clases de organismos. Tampoco se basa en datos que proporcionen una clasificación de codones sinónimos de acuerdo con sus eficiencias traduccionales en una o más células de los organismos o clases de organismos. En cambio, se basa en la clasificación de codones sinónimos individuales que codifican un aminoácido en el polipéptido asociación con fenotipo de acuerdo con su preferencia de uso por el organismo o clases de organismos, o por una parte e de los mismos, para producir el fenotipo seleccionado. Como se utiliza aquí, la preferencia de uso de un codón individual por un organismo o clases de organismos o por una parte e de los mismos se denomina como una "preferencia fenotípica". Tal preferencia se puede hacer referencia se puede determinar al determinar cuantitativamente o cualitativamente la influencia del codón individual sobre un alcance del fenotipo seleccionado y no requiere, por lo tanto, el cálculo de frecuencia de codón o eficiencias traduccionales como se describió anteriormente.

Ventajosamente, las preferencias fenotípicas para codones sinónimos se puede determinar al introducir en el organismo de interés o en un organismo relacionado, o en una parte e de tales organismos una construcción sintética que comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem de un codón fusionado en cuadro con un polinucleótido indicador que codifica una proteína indicadora, que produce, por que se predice que produce, el fenotipo seleccionado o un fenotipo de la misma clase que el fenotipo seleccionado. En una realización, la proteína indicadora es un polipéptido asociado con fenotipos (por ejemplo, un antígeno específico de melanoma tal como BAGE o GAGE-1) que será el objeto de producción del fenotipo seleccionado (por ejemplo, inmunidad al melanoma). En otra realización, el polipéptido asociado a fenotipo (por ejemplo, proteína fluorescente verde o un antígeno gastrointestinal asociado tal como 17-1A) es incapaz de producción el fenotipo seleccionado (por ejemplo, inmunidad a melanoma) pero produce la misma clase de fenotipo (por ejemplo, una respuesta inmune) que el fenotipo seleccionado. En ejemplos ilustrativos, el polipéptido asociado a fenotipo se selecciona de antígenos que incluyen antígenos de organismos patogénicos o canceres (por ejemplo, en donde el fenotipo es inmunidad a la enfermedad) y autos antígenos o antígenos de trasplantes(por ejemplo, en donde el fenotipo es energía especifica de antígeno o tolerancia), factores de crecimiento (por ejemplo, en donde el fenotipo se selecciona del tamaño del organismo o parte, cicatrización, proliferación celular, diferenciación celular, migración celular, función de células inmunes), hormonas (por ejemplo, en donde el fenotipo es lactación incrementada, por ejemplo, utilizando oxitocina, o alivio de un estado diabético, por ejemplo, utilización de insulina) y toxinas (por ejemplo, en donde el fenotipo es la regresión del tumor o muerte celular).

El diseño de la construcción sintética se basa preferiblemente en el diseño de construcción sintética Frazer et al. En la publicación internacional WO 00/42215, que se predice sobre la determinación de que diferentes codones pero codones idénticos sinónimos fusionados respectivamente en marco con un polinucleótido indicador pueden hacer surgir diferentes niveles de proteínas indicadoras producidas dentro de un tipo de celular dado. El nivel de proteína indicadora producida en un tipo celular seleccionado es sensible a la abundancia intracelular las especies iso-tARN que corresponden a los codones idénticos de la construcción y, por lo tanto, proporciona una correlación directa de una preferencia celular para traducir un codón dado. Sin embargo, en contraste a la WO 00/42215, que se relaciona principalmente con la determinación de eficiencias traduccionales de codones sinónimos en tipos celulares seleccionados, la presente invención con el uso de construcciones sintética para determinar la influencia de sus extensiones sinónimas de codones idénticos en el fenotipo o clase de fenotipo presentado por el organismo o parte en respuesta a la proteína asociada a fenotipo producida por aquellas construcciones sintética. Esto significa, por ejemplo, que si la calidad del fenotipo presentada por un organismo seleccionado o parte del mismo al que una construcción sintética que tiene una serie en tándem de primeros codones idénticos se proporcionan es menor que la calidad del fenotipo presentado por el organismo seleccionado o parte al que se proporciona una construcción sintética que tiene una serie en tándem de segundos codones idénticos (es decir., en donde el primer codones son diferentes qué, pero sinónimos a, el segundo codones), entonces se puede deducir que el organismo seleccionado o parte tiene una mayor preferencia para el segundo codón que el primer codón con respecto a la calidad del fenotipo producido. Colocar de otra forma, el segundo codón tiene una mayor preferencia fenotípica que el primer codón en la parte o organismo seleccionado.

Adecuadamente, la repetición del tándem comprende por lo menos tres codones idénticos, preferiblemente entre cuatro y siete codones idénticos y más preferiblemente cinco o seis codones idénticos.

La repetición del tándem se puede fusionar en una ubicación adyacente a, o dentro de, el polinucleótido indicador. Esta ubicación se selecciona preferiblemente de tal manera que la repetición del tándem interfiere con la traducción de por lo menos una porción de la proteína asociada a fenotipo. Preferiblemente, la repetición del tándem se ubica inmediatamente en la dirección cinco prima (traduccionalmente) del polinucleótido indicador.

Por supuesto es posible que una repetición en tándem de los residuos de aminoácidos idénticos (por ejemplo, una repetición de oligo-prolina) puede hacer la proteína asociada a fenotipo inestables. Típicamente, la inestabilidad de la proteína se detecta cuando la expresión conferida por el fenotipo del polinucleótido indicador no se puede detectar con ninguna elección de codón isoaceptador específico para el aminoácido que corresponde a la repetición del tándem. Sin embargo, tal la inestabilidad de la proteína se puede aliviar mediante el uso de por lo menos un codón separador dentro de la repetición del tándem de codones idénticos, en donde el codón separador codifica un aminoácido neutral.

Los codones separadores se pueden colocar adyacentes a, o interpuestos en, algunos o todos de los codones idénticos que corresponden a la repetición del tándem. Por ejemplo, una interposición adecuada para una repetición penta de codones idénticos se puede seleccionar del grupo que consiste de: (a) I-S-I-S-I-S-I-S-IS; (b) S-I-S-I-S-I-S-I-S-I; (c) I-S-I-S-I-I-S-I; (d) I-S-I-I-S-I-S-I; (e) I-S-I-S-I-I-I; (f) I-I-S-I-S-I-I; (g) I-I-I-S-I-S-I; (h) I-S-I-I-S-I-I; (i) I-I-S-I-I-S-I; (j) I-S-I-I-I-S-I; (k) I-S-I-I-I-I; (l) I-I-S-I-I-I; (m) I-I-I-S-I-I; y (n) I-I-I-I-S-I, en donde I corresponde a un codón idéntico de una repetición de tándem y S corresponde a un codón separador.

Preferiblemente, un codón separador se traduce eficientemente en un tipo de célula del organismo o del organismo en sí mismo con relación a otros codones sinónimos. Esto es importante ya que la traducción del codón separador no es limitante de la proporción. Los aminoácidos neutrales incluyen, pero no se restringen a, alanina y glicina.

El polinucleótido indicador puede codificar cualquier proteína adecuada que confiera sobre el organismo o parte, ya sea por sí mismo o en asociación con otras moléculas, un fenotipo o clase de fenotipo. En realizaciones especificas, el fenotipo seleccionado o clase de fenotipo corresponde a una condición o estado benéfico o mejorado o superior del organismo o parte del mismo con relación a un estado o condición de referencia. En ejemplos ilustrativos, el estado de referencia o afección corresponde a un estado patofisiológico. Los fenotipos contemplados por la presente invención incluyen cualquier rasgo benéfico deseado que incluye, pero no se restringe a: inmunidad (por ejemplo, inmunidad a una infección patogénica o cáncer); tolerancia antígeno (por ejemplo, anergia de linfocitos T especifica de antígeno, tolerancia a alérgenos, antígenos de trasplantes autos antígenos); angiogenia (por ejemplo, formación de vasos sanguíneos en el corazón y vasculatura y en crecimiento de tumor); anti-angiogenia (por ejemplo, tratamiento de enfermedad cardiaca isquémica y tumores); alivio de síntomas clínicos (por ejemplo, fiebre; inflamaciones; encefalitis; pérdida de peso; anemia; síntomas sensores tal como parestesia o hiperestesia; ataxia; neuralgia; parálisis; vértigo; anormalidades urinarias o de movimiento de la vejiga; y disfunción cognitiva tal como pérdida de memoria, atención deteriorada, dificultad de resolución de problemas, procesamiento de la información retardada, y dificultad en cambio entre tareas cognitivas); muerte celular incrementada o reducida r (por ejemplo, apoptosis); diferenciación celular incrementada o reducida; proliferación célula incrementada o reducida; regresión de tumor o cáncer; crecimiento y reparación de tejidos u órganos; fibrosis reducida; inhibición o reversión de senectud celular; migración celular incrementado o reducida; expresión de proteína diferencial entre diferentes células o tejidos de un organismo o parte del mismo; recuperación de trauma; recuperación de quemaduras; resistencia o sensibilidad antibiótica (por ejemplo, resistencia o sensibilidad a antibióticos aminoglicosidicos tal como geneticina y paromomicina); tolerancia o sensibilidad a herbicidas (por ejemplo tolerancia o sensibilidad al glifosato o glufosinato); biosíntesis o modificación de almidón (por ejemplo utilizando un enzima de ramificación de almidón, sintasa de almidón, pirofosforilasa ADP-glucosa); biosíntesis de ácidos grasos (por ejemplo utilizando una desaturasa o hidroxilasa); enfermedad de resistencia o tolerancia (por ejemplo, resistencia a enfermedades animales tal como enfermedad cardiovascular, autoinmunidad, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson diabetes, SIDA etc o resistencia a enfermedades de plantas tal como roya, nanismo, putrefacción, carbón, moho, sarna y laminilla); resistencia o tolerancia a plagas que incluye resistencia o tolerancia a insectos (por ejemplo, resistencia a perforadores y gusanos); resistencia o tolerancia vírica (por ejemplo resistencia a virus animales tal como herpesvirus, hepandavirus, adenovirus, flavivirus, lentivirus, poxvirus etc o resistencia a virus de planta tal como bandavirus, caulimovirus, potivirus, luteovirus, rhabdovirus etc); resistencia o tolerancia fúngica (por ejemplo, resistencia a hongos micorrital arbusculares, hongos endofílicos etc.); un rasgo metabólico incluye metabolismo de sacarosa (por ejemplo, isomerización de sacarosa); resistencia o tolerancia al congelamiento; resistencia a la tensión (por ejemplo, tolerancia a la sal, tolerancia a la sequía); y contenido de alimento mejorado o producción incrementada. Los expertos en la técnica reconocerán que las anteriores clases de ejemplo de fenotipo se pueden subdividir en subclases fenotípicas y que tales subclases también caerían dentro del alcance de las clases fenotípicas contempladas por la presente invención. Por ejemplo, las subclases de inmunidad incluye inmunidad innata (que se puede subdividir adicionalmente inter alía en sistemas de complemento, monocitos, macrófagos, neutrófilos y linfocitos agresores naturales), inmunidad celular (que se puede subdividir adicionalmente inter alía en linfocitos T citolíticos, células dendríticas y linfocitos auxiliares T) e inmunidad humoral (que se puede subdividir adicionalmente inter alía en clase de anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG y IgM).

El presente método se puede aplicar a organismos multicelulares, que incluyen anfitriones eucarísticos tal como, pero no limitado a levadura, plantas y animales que incluyen animales invertebrados tal como mamíferos, reptiles, peces, aves etc. así como también animales invertebrados tal como metazoarios, esponja, gusanos, moluscos, nematodos, crustáceos, equinodermos etc. En ciertas realizaciones de la presente invención, el organismo de interés se selecciona de plantas y mamíferos.

Ejemplos ilustrativos de organismos eucarióticos incluyen, pero no se limitan a, hongos tales como levadura y hongos filamentosos, que incluyen las especies de Aspergillus, Trichoderma, y Neurospora; los animales anfitriones incluyen animales vertebrados ejemplos ilustrativos de los cuales incluyen peces (por ejemplo, salmón, trucha, tilapia, atún, carpa, barbo, fletán, pez espada, bacalao y pez cebra), aves (por ejemplo, pollos, patos, codornices, faisanes y pavos, otras aves de la selva o para juego) y mamíferos (por ejemplo, perros, gatos, caballos, vacas, búfalos, ciervos, ovejas, conejos, roedores, como ratones, ratas, hámsteres y conejillos de indias, cabras, cerdos, primates, mamíferos marinos, que incluyen delfines y ballenas, y citoblastos no humanos, que incluyen las citoblastos embriónicos pluripotentes y no pluripotentes humanos, y cigotos no humanos), así como también ejemplos ilustrativos de animales invertebrados incluyen nemátodos (los géneros representativos incluyen aquellos que infectan a animales tales como, pero no limitados a Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Bunostomum, Caenorhabditis, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Haernonchus, Heterakis, Nematodirus, Oesophagostomum, Ostertagia, Oxyuris. Parascaris, Strongylus, Toxascaris, Trichuris, Trichostrongylus, Tflichonema, Toxocara, Uncinaria, y aquellos que infectan a las plantas, tales como pero no limitados a Bursaphalenchus, Criconerriella, Diiylenchus, Ditylenchus, Globodera, Helicotylenchus, Heterodera, Longidorus, Melodoigyne, Nacobbus, Paratylenchus, Pratylenchus, Radopholus, Rotelynchus, Tylenchus y Xiphinerna) y otros gusanos, Drosophila y otros insectos (tales como el de las familias Apidae, Curculionidae, Scarabaeidae, Tephritidae, Tortricidae, entre otros, órdenes representativos de los cuales incluyen Coleóptero, Díptero, Lepidóptero y Homóptera.

En ciertas realizaciones, el organismo de interés es una planta que se selecciona de forma adecuada de monocotiledones, dicotiledones y gimnospermas. La planta puede ser una planta ornamental o planta de cultivo. Ejemplos ilustrativos de plantas ornamentales incluyen, pero no se limitan a, Malus spp, Crataegus spp, Rosa spp., Betuna spp, Sorbus spp, Olea spp, Nerium spp, Salix spp, Populus spp. Ejemplos ilustrativos de plantas de cultivo incluyen especies de plantas que se cultivan con el fin de producir un producto cosechable tal como, pero no limitado a, Abelmoschus esculentus (ocra). Acacia spp., Agave fourcroydes (henequén), Agave sisalana (sisal), Albizia spp., Allium fistulosum (cebolla para ensalada), Allium sativum (ajo), Allium spp. (Cebolla), Alpinia galanga (galanga mayor), Amaranthus caudatus, Amarnthus spp., Anacardium spp. (anacardo), Ananas comosus (piña), Anethum graveolens (eneldo), Annona cherimola (chirimoya), Apios americana (chufa Americana), Arachis hypogaea (maní), Arctium spp. (Bardana), Artemisia spp. (Ajenjo), Aspalathus linearis (té rojo), Athertonia diversifolia, Atriplex nummularia (zampa australiana), Averrhoa carambola (carambolo), Azadirachta indica (árbol del Neem), Backhousia spp., Bambusa spp. (Bambú), Beta vulgaris (remolacha azucarera), Boehmeria nivea (ramio), col china, Boronia megastigma (Boronia dulce), Brassica carinata (mostaza Abisinia), Brassica juncea (mostaza de la India), Brassica napus (colza), Brassica oleracea (repollo, brócoli), Brassica oleracea var Albogabra (brócoli), Brassica parachinensis (col china), Brassica pekensis (col o repollo chino Wong), Brassica spp., Burrella obovata, Cajanus cajan (gandul), Camellia sinensis (té), Cannabis sativa (marihuana), Capsicum spp., Carica spp. (Papaya); Carthamus tinctorius (cártamo), Carum carvi (comino), Cassinia spp., Castanospermum Australe (castaño de Australia), Casuarina cunninghamiana pino australiano), Ceratonia siliqua (algarrobo), Chamaemelum nobile (manzanilla), Chamelaucium spp. (Cera Geraldton), Chenopodium quinoa (quino), Chrysanthemum (matricaria), cinerariifolium (piretroide), Cicer arietinum (garbanzo), Cichorium intybus (achicoria), Clematis spp., Clianthus formosus (guisante del desierto deSturt), Cocos nucifera (coco), Coffea spp. (café), Colocasia esculenta (taro), Coriandrum sativum (cilantro), Crambe abyssinica (col de abisinia), Crocus sativus (azafrán), Cucurbita foetidissima (taro gigante), Cucurbita spp. (Calabaza), Cyamopsis tetragonoloba (guar), Cymbopogon spp. (hierba luisa de la India), Cytisus proliferus (tomillo), Daucus carota (zanahoria), Desmanthus spp., Dioscorea esculenta (ñame asiático), Dioscorea spp. (Ñame), Diospyros spp. (Caqui), Doronicum Spp., Echinacea Spp., Eleocharis dulcis (castaña de agua), Eleusine coracana (mijo coracán), Emanthus arundinaceus, Eragrostis tef (hierba TEF), Erianthus jarundinaceus, Eriobonya japonica (níspero), Eucalyptus spp., Eucalyptus spp., (eucalipto), Euclea spp., Eugenia malaccensis (manzana malaya), Euphorbia spp., Euphoria longana (longán), Eutrema wasabi (wasabi), Fagopyrum esculentum (trigo sarraceno), Festuca arundinacea (cañuela alta), Ficus spp. (Fig), Flacourtia inermis, Flindersia grayliana (arce de Queensland), Foeniculum Olearia, Foeniculum vulgare (hinojo), Garcinia mangostana (mangostán), Glycinia latifolia, Glycinae max (soya), Glycinae max (soya vegetal), Glycyrrhiza glabra (regaliz), Gossypium spp. (algodón), Grevillea Spp., Grindelia Spp., Guizotia abyssinica (Níger), Harpagophyllum spp., Helianthus annuus (girasol de alto aceite), Helianthus annuus (girasol), Helianthus tuberosus (pataca), Hibiscus cannabinus (kenaf), Hordeum bulbosum, Hordeum spp. (Cebada cérea), Hordeum vulgare (cebada), Hordeum vulgare subsp. spontaneum, Humulus lupulus (lúpulo), Hydrastis canadensis (sello de oro), Hymenachne spp., Hyssopus officinalis (hisopo), Indigofera spp., Inga edulis (guaba), Inocarpus tugiter, Ipomoea batatas (camote), Ipomoea spp. (gloria de la mañana), Lablab purpureus (zarandaja), Lactuca spp. (Lechuga), Lathyrus spp. (Veza), Lavandula spp. (lavanda), Lente spp. (lentejas), Lesquerella spp. (lescuerela), Leucaena spp., Lilium spp., Limnanthes spp. (pradera), Linum usitatissimum (lino), Linum usitatissimum (lino), Linum usitatissimum (Linola. TM.), Litchi chinensis (lichi), Lotus corniculatus (cuernecillo), Lotus pedunculatus, Lotus spp., Luffa spp., Lunaria annua (honestidad), Lupinus mutabilis (altramuz perla), Lupinus spp. (Lupino), Macadamia spp., Mangifera indica (mango), Manihot esculenta (yuca), Medicago spp. (Alfalfa), Medicago spp., Melaleuca spp. (árbol de té), Melaleuca uncinata (malaleuca), Mentha tasmannia, Mentha spicata (hierbabuena), Mentha X piperita (menta), Momordica charantia (melón amargo), Musa spp. (Plátano), Myrciaria cauliflora (guayabo jaboticaba), Myrothamnus flabellifolia, Nephelium lappaceum (rambután), Nerine spp., Ocimum basilicum (albahaca), Oenanthe javanica (guapurú), Oenothera biennis (onagra), Olea europaea (olivo), Olearia spp. Origanum spp. (Mejorana, orégano), Oryza spp. (Arroz), Oxalis tuberosa (oca), Ozothamnus spp. (flor de arroz), Pachyrrhizus ahipa (ahipa), Panax spp. (ginseng), Panicum miliaceum (mijo común), Papaver spp. (Amapola), Parthenium argentatum (guayule), Passiflora sp., Paulownia tomemtosa (árbol princesa), Pelargonium graveolens (rosa geranio), Pelargonium sp., Pennisetum americanum (junco o mijo perla), Persoonia spp., Petroselinum crispum (perejil), Phacelia tanacetifolia (tanaceto), Phalaris canariensis (alpiste), Phalaris sp. Phaseolus coccineus (judía verde), Phaseolus lunatus (judía lima), Phaseolus spp., Phaseolus vulgaris (fríjol arbustivo), Phaseolus vulgaris (judía blanco), Phaseolus vulgaris (judía rojo), Pisum sativum (guisante), Plantago ovata (ispagula), Polygonum minnus, Polygonum odoratum, Prunus mume (albaricoquero japonés), Psidium guajava (guayabo), Psophocarpus tetragonolobus (fríjol alado), Pyrus spp. (níspero), Raphanus satulus (rábano grande blanco o daikón), Rhagodia spp. (Caramillo), Ribes nigrum (grosellero negro), Ricinus communis (ricino), Rosmarinus officinalis (romero), Rungia klossii (rungia), Saccharum officinarum (caña de azúcar), Salvia offcinalis (salvia), Salvia sclarea (salvia), Salvia sp. Sandersonia sp., Santalum acuminatum (Quandong del Desierto), Santalum Spp. (Sándalo), Sclerocarya caffra (marula), Scutellaria galericulata (escutelaria), Escala cereale (centeno), Sesamum indicum (ajonjolí), Setaria italica (moha), Simmondsia Spp. (Jojoba), Solanum spp., Sorghum almum (sorgo), Stachys Betonica (betónica), Stenanthemum scortechenii, Strychnos cocculoides (naranja del mono), Stylosanthes spp. (Stylo), Syzygium spp., Tasmannia Lanceolata (pimienta de la montaña), Terminalia kambachii, Theobroma cacao (cacao), Thymus vulgaris (tomillo), Toona australis (cedro rojo), Trifoliium Spp. (Tréboles), Trifolium alexandrinum (trébol), Triforio resupinatum (trébol persa), Triticum spp., Triticum tauschii, esculentum Tylosema (judía morama), Valeriana sp. (Valeriana), Vernonia spp., Vetiver zizanioides (pasto vetiver), Vicia benghalensis (vicia púrpura), Vicia faba (haba), Vicia narbonensis (judía Narbon), Vicia sativa, Vicia spp., Vigna aconitifolia (Vigna mungo), Vigna angularis (judía adzuki), Vigna mungo (gramo negro), Vigna radiata (judía mungo), Vigna spp., Vigna unguiculata (caupí), Vitis spp. (Uva), Voandzeia subterranea (chufa Bambarra maní), Triticosecale (triticale), Zea mays (maíz dulce bicolor), Zea mays (maíz), Zea mays (maíz dulce), Zea mays subsp. mexicana (teocintle), Zieria spp., Zingiber officinale (jengibre), Zizania spp. (Arroz silvestre), Ziziphus jujuba (azufaifo común). Los cultivos deseables en la práctica de la presente invención incluyen Nicotiana tabacum (tabaco) y los cultivos hortícolas, como, por ejemplo, Ananas comosus (piña), Saccharum spp (caña de azúcar), Musa spp (plátano), Lycopersicon esculentum (tomate) y
Solanum tuberosum (papa).

Las construcciones sintéticas de la invención se pueden introducir directamente en un organismo de interés o en una o más de sus partes, por ejemplo, tipos de célula o tejido (por ejemplo, de músculo, piel, cerebro, pulmón, riñón, páncreas, de un órgano reproductor tal como testículos, ovarios y mama, ojos, hígado, corazón, células vasculares, raíz, hoja, flor, tallo o meristemas) o en un órgano del organismo. Alternativamente, la construcción sintética se introduce en un progenitor del organismo y el progenitor luego se hace crecer o se cultiva durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para producir el organismo de interés, mediante el cual la construcción sintética está contenida en uno o más tipos de células de ese organismo. Las células progenitoras adecuadas incluyen, pero no se limitan a, citoblastos, como citoblastos embrionarias no humanos, células inmunes pluripotenciales, células meristemáticas y callo embrionarias. En ciertas realizaciones, la construcción sintética se introduce en el organismo de interés con utilizando una ruta de administración particular (por ejemplo, para los mamíferos, por la ruta oral, parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intaventricular, intrarticular), por mucosa (por ejemplo, intranasal, intrapulmonar, oral, bucal, sublingual, rectal, intravaginal), dérmica (tópica, subcutánea, transdérmica); para las plantas, administración a las flores, meristemas, raíz, hojas o tallos). Los expertos reconocerán que la ruta de administración será diferente dependiendo de la elección del organismo de interés y fenotipo buscado. De forma deseada, las construcciones sintéticas se introducen en el mismo sitio o el correspondiente. En otras realizaciones, la construcción sintética se introduce en una célula del organismo de interés (por ejemplo, células autólogas), o en una célula que es compatible con el organismo de interés (por ejemplo, células singénicas alogénicas) y las célula modificadas genéticamente así producidas se introduce en el organismo de interés en un sitio seleccionado o en una parte de tal organismo.

Las construcciones sintéticas de la invención se pueden introducir en un organismo de interés o parte del mismo utilizando cualquier método adecuado, y el tipo de método empleado será diferente dependiendo del tipo de célula destinada, parte y/u organismo de interés. Por ejemplo, se han descrito cuatro clases generales de los métodos para el suministro de moléculas de ácido nucleico en células: (1) métodos químicos, tales como la precipitación de fosfato de calcio, precipitación mediada por polietilenglicol (PEG) y lipofección, (2) métodos físicos tales como la microinyección, electroporación, métodos de aceleración y la infiltración al vacío, (3) métodos basados en vectores tales como transformación mediada por vectores de bacterias y virus, y (4) mediados por receptor. Las técnicas de transformación que caen dentro de los mismos y otras clases son bien conocidas por los trabajadores en el arte, y las nuevas técnicas continuamente se conocen. La elección particular de una tecnología de transformación se determinará por su eficacia para transformar ciertas especies anfitrionas, así como también la experiencia y la preferencia de la persona que practica la invención con una metodología particular de la elección. Será evidente para la persona experta que la elección particular de un sistema de transformación para introducir una construcción sintética de la invención en las células no es esencial o una limitación de la invención, siempre que alcance un nivel aceptable de transferencia de ácido nucleico. Así pues, las construcciones síntesis se introducen en los tejidos y las células anfitrionas por cualquier número de rutas, que incluyen infección vírica, infección por fagos, microinyección, electroporación, o fusión de vesículas, lipofección, infección por Agrobacterium tumefaciens o A. rhizogenes, o fusión de protoplastos. También se puede utilizar la inyección a chorro para la administración intramuscular (como se describe por ejemplo, Furth et al., 1992, Anal Biochem 205:365-368). Las construcciones sintéticas se pueden recubrir en microproyectiles, y suministrar en una célula anfitriona o en el tejido mediante un dispositivo de bombardeo de partículas, o "pistola de genes" (ver, por ejemplo, Tang et al., 1992, Nature 356: 152-154). Alternativamente, las construcciones sintéticas se pueden alimentar directamente, o se inyectan en el organismo anfitrión o se pueden introducir en la célula (es decir, dentro de la célula) o introducir extracelularmente en una cavidad, espacio intersticial, en la circulación de un organismo, introducir oralmente, etc. Los métodos para la introducción oral incluyen mezcla directa de las construcciones sintéticas con la comida del organismo. En ciertas realizaciones, se emplea un protocolo de administración de ácido nucleico hidrodinámica (por ejemplo, ver Chang et al., 2001, J. Virol. 75:3469-3473; Liu et al., 1999, Gene Ther. 6:1258-1266; Wolff et al., 1990, Science 247:1465-1468; Zhang et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10:1735-1737, y Zhang et al., 1999, Gene Ther. 7:1344-1349). Otros métodos de suministro de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, la transferencia mediada por liposomas, suministro de ADN desnudo (inyección directa) y la transferencia mediada por receptor (complejo ADN-ligando).

De acuerdo con la presente invención, las construcciones sintéticas individuales se introducen separadamente en organismos de prueba que se seleccionan preferiblemente a partir de organismos de la misma especie como el organismo de interés u organismos que se relacionan con el organismo de interés, o con partes de prueba de tales organismos. Los organismos relacionados son generalmente especies dentro de la misma familia, preferiblemente especies dentro del mismo subfamilia, más preferiblemente especies dentro de superclase, aún más preferiblemente especies dentro de la misma clase, aún más preferiblemente especies dentro del mismo orden y todavía aún más preferiblemente especies dentro del mismo género. Por ejemplo, si el organismo de interés es humano, una especie relacionada se selecciona de forma adecuada de ratón, vaca, perro o gato, que pertenecen a la misma clase como el humano, o un chimpancé, que pertenece al mismo orden como el humano. Alternativamente, si el organismo de interés es el banano, el organismo relacionado se puede seleccionar de taro, jengibre, cebolla, ajo, piña, bromelias, palmas, orquídeas, lirios, lirios y similares, que son todas las plantas monocotiledóneas no gramíneas que son todas plantas monocotiledóneas no gramináceas y que constituyen relaciones hortícolas y botánicas.

Después de la introducción de las construcciones sintéticas en los organismos o partes de prueba, se determinan las calidades de sus fenotipos mediante un ensayo adecuado y luego se comparan para determinar las preferencias fenotípicas relativas de los codones sinónimos. La calidad es adecuadamente una medida de la resistencia, intensidad o grado del fenotipo, o la resistencia relativa, intensidad o grado de dos o más rasgos fenotípicos deseados.

Los ensayos para varios fenotipos conferidos por la producción de una proteína indicadora escogida se conocen por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la inmunidad se puede ensayar mediante cualesquier métodos adecuados que detectan un incremento en una capacidad animal para responder a antígenos externos o específicos a enfermedad (por ejemplo, antígenos de cáncer) es decir, aquellas células que se preparan para atacar tales antígenos se incrementan en número, actividad y capacidad para detectar y destruir aquellos antígenos. La resistencia de las respuestas inmunes medidas por las pruebas estándar incluyen: medición directa de los linfocitos de sangre periférica por medios conocidos en la técnica; ensayos de citotoxicidad de agresores naturales natural (ver, por ejemplo, Provinciali et al (1992, J. Inmunol. Meth. 155: 19-24), ensayos de proliferación celular (ver, por ejemplo, Vollenweider and Groseurth (1992, J. Inmunol. Meth. 149: 133-135), inmunoensayos de células y subconjuntos inmunes (ver, por ejemplo, Loeffler et al. (1992, Cytom. 13: 169-174); Rivoltini et al. (1992, Can. Inmunol. Inmunother. 34: 241-251); o pruebas en piel para inmunidad mediada por célula (ver, por ejemplo, Chang et al (1993, Cancer Res. 53: 1043-1050). La respuesta inmune mejorada también se indica por manifestaciones físicas tales como fiebre y inflamación, así como también cicatrización de infecciones locales y sistémicas, y reducción de síntomas en enfermedad, es decir, disminución en el tamaño del tumor, alivio de los síntomas de una enfermedad o afección que incluyen, pero no se restringen a, lepra, malaria, úlceras naftosa, verrugas herpética y papilomatosas, gingivitis, aterosclerosis, los concomitantes del SIDA como sarcoma de Kaposi, infecciones bronquiales, y similares. También se pueden utilizar tales manifestaciones físicas para detectar, o definir la calidad de, el fenotipo o clase de fenotipo exhibido por un organismo. Alternativamente, se puede ensayar la tolerancia a herbicida al tratar organismos de prueba (por ejemplo, plantas tales como plantas de algodón), que expresan un gen de tolerancia a herbicida (por ejemplo, gen de proteína tolerante a glifosato tal como una sintasa EPSP resistente a glifosato), con un herbicida (por ejemplo, glifosato) y determinar la eficacia de la tolerancia a herbicida exhibida por las plantas. Por ejemplo, cuando se determina la eficacia de las construcciones sintéticas para conferir tolerancia al herbicida en algodón, la cantidad de retención de capullo es una medida de la eficacia y es un rasgo deseable.

\newpage

Las calidades del fenotipo seleccionado exhibidas por los organismos de prueba o por las partes de prueba luego se comparan para proporcionar un orden clasificado de los codones individuales, que codifican un aminoácido específico, que se repite en tándem en las construcciones sintéticas de acuerdo con su preferencia de uso por el organismo o parte para conferir el fenotipo seleccionado. Un persona medianamente versada en la técnica por lo tanto será capaz de determinar una "tabla de preferencia de codón" para cada aminoácido en el polipéptido cuya expresión trasmite el fenotipo seleccionado al organismo de interés. La comparación de los codones sinónimos dentro de una tabla de preferencia de codón luego se puede utilizar para identificar codones para adaptar un polinucleótido sintético para modular la calidad de un fenotipo seleccionado.

3. Selección de sinónimos y primeros codones

De acuerdo con la presente invención, una comparación de preferencias fenotípicas se puede determinar para codones sinónimos en un organismo de interés o en un organismo relacionado, o en partes de prueba del mismo, que se puede utilizar como una base para construir un polinucleótido sintético del cual se puede producir un polipéptido asociado a fenotipo en el organismo de interés o parte del mismo. El polinucleótido sintético se construye de tal manera que su expresión en el organismo o parte confiere un fenotipo seleccionado de tal organismo o parte en diferente calidad a aquella que se confiere por un polinucleótido progenitor que codifica el mismo polipéptido. El método comprende seleccionar un primer codón del polinucleótido pariente para sustitución con un codón sinónimo, en donde el codón sinónimo se selecciona sobre la base que este exhibe una preferencia fenotípica diferente que el primer codón en una comparación de preferencias fenotípicas en el organismo de interés o en un organismo relacionado, o en una parte del mismo, según se determina en la Sección 2. El primer codón luego se reemplaza con el codón sinónimo para construir el polinucleótido sintético.

Así, de acuerdo con la presente invención, un polinucleótido progenitor se puede modificar con codones sinónimos de tal manera que la calidad del fenotipo seleccionado conferida por el polinucleótido así modificado (polinucleótido sintético) es mayor que la del polinucleótido progenitor. Generalmente, la diferencia entre las calidades fenotípicas respectivas conferidas por un polinucleótido sintético y por un polinucleótido progenitor dependen del número de primeros codones que se reemplazan por codones sinónimos, y sobre la diferencias en la preferencia fenotípica entre los primeros codones y los codones sinónimos en el organismo de interés o parte del mismo. Dicho de otro modo, tales pocas sustituciones, y/o entre mayor es la diferencia en la preferencia fenotípica entre los codones sinónimos y los primeros codones, mayor será la diferencia entre la calidad fenotípica entre los polinucleótido sintéticos y progenitores. Por el contrario, entre mayor sean tales sustituciones, y/o mayor sea la diferencia en la preferencia fenotípica entre los codones sinónimos y primeros codones, mayor será la diferencia en la calidad fenotípica entre los polinucleótidos sintéticos y progenitores.

En una realización, la presente invención contempla un método para construir un polinucleótido sintético que codifica un polipéptido asociado un fenotipo y que confiere una mayor calidad de un fenotipo seleccionado exhibido por un organismo de interés o parte del mismo la calidad conferida por un polinucleótido progenitor que codifica para el mismo polipéptido. En esta realización, un primer codón del polinucleótido progenitor se selecciona para sustitución con un codón sinónimo, en donde el codón sinónimo se selecciona sobre la base de que este exhibe una preferencia fenotípica mayor que el primer codón en una comparación de preferencias fenotípicas en el organismo de interés o en un organismo relacionado, o en una parte del mismo.

De acuerdo con la presente invención, una mayor calidad de un fenotipo seleccionado se puede lograr al seleccionar un codón sinónimo que tiene una preferencia fenotípica mayor que el primer codón. Generalmente, una preferencia fenotípica mayor se correlacionará con una mayor calidad del fenotipo seleccionado. Así, en un ejemplo no limitante de tal una correlación, se considera que un codón sinónimo tiene por lo menos aproximadamente un 5% de más de preferencia fenotípica que un primer codón cuando la calidad del fenotipo exhibida por un organismo o parte del mismo al que se ha proporcionado una construcción sintética que comprende una repetición tándem del codón sinónimo es por lo menos aproximadamente 5% mayor que la calidad del fenotipo exhibida por un organismo o parte del mismo al que se ha proporcionado una construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón. Cuando se selecciona el codón sinónimo, se prefiere que este tenga una preferencia fenotípica en el organismo de interés que es por lo menos aproximadamente 105%, adecuadamente por lo menos aproximadamente 110%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 120%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 130%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 140%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 150%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 160%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 170%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 180%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 190%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 200%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 250%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 300%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 350%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 400%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 450%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 500%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 550%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 600%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 650%, y todavía aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 700% de la preferencia fenotípica del primer codón. En el caso de dos o más codones sinónimos que tienen similares preferencias fenotípicas, se apreciará que se puede utilizar uno cualquiera de estos codones para remplazar el primer codón. Generalmente, si un polinucleótido progenitor tiene una selección de codones de preferencia fenotípica baja a intermedia, es preferible en primera instancia reemplazar algunos, o más preferiblemente todos, los codones de preferencia fenotípica baja con codones sinónimos que tienen preferencia fenotípicas intermedias, o preferiblemente altas. Típicamente, la sustitución de codones de preferencia fenotípica baja con codones de preferencia fenotípica intermedia o alta resulta en un incremento sustancial en la calidad del fenotipo conferido por el polinucleótido sintético así construido. Sin embargo, es también preferible reemplazar algunos, o preferiblemente todos, los codones de preferencia fenotípica intermedia con codones eficientemente traduccionales altos para conferir una calidad óptima en el fenotipo seleccionado.

En otra realización, la presente invención contempla un método para construir un polinucleótido sintético que codifica un polipéptido asociado, un fenotipo y que confiere una calidad inferior de un fenotipo seleccionado exhibido por un organismo de interés o parte del mismo que la calidad conferida por un polinucleótido progenitor que codifica para el mismo polipéptido. En esta realización, un primer codón del polinucleótido progenitor se selecciona para sustitución con un codón sinónimo, en donde el codón sinónimo se selecciona sobre la base de que este exhibe una preferencia fenotípica más baja que el primer codón en una comparación de preferencias fenotípicas en el organismo de interés o en un organismo relacionado o en una parte del mismo.

De acuerdo con la presente invención, una calidad inferior de un fenotipo seleccionado se puede lograr al seleccionar un codón sinónimo que tiene una preferencia fenotípica más baja que el primer codón. Una preferencia fenotípica más baja típicamente se correlacionará con una calidad inferior del fenotipo seleccionado. De acuerdo con lo anterior, en un ejemplo no limitante de tal una correlación, se considera que un codón sinónimo tiene por lo menos aproximadamente un 5% de preferencia fenotípica más baja que un primer codón cuando la calidad del fenotipo exhibido por un organismo o parte del mismo al que se ha proporcionado una construcción sintética que comprende una repetición de tándem del codón sinónimo es por lo menos aproximadamente 5% más bajo que la calidad del fenotipo exhibido por un organismo o parte del mismo al que se ha proporcionado una construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón. Cuando se selecciona del codón sinónimo para esta realización, se prefiere que éste tenga una preferencia fenotípica en el organismo de interés que es por lo menos aproximadamente 95%, adecuadamente por lo menos aproximadamente 90%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 85%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 80%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 75%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 70%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 65%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 60%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 55%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 50%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 45%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 40%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 35%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 30%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 25%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 20%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 15%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 10%, y todavía aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 5% de la preferencia fenotípica del primer codón.

Es preferible pero no es necesario reemplazar todos los codones del polinucleótido progenitor con codones sinónimos que tienen mayor o menor preferencia fenotípica en el organismo de interés o parte del mismo que los primeros codones. Por ejemplo, una mayor o menor calidad fenotípica se puede lograr aún con sustitución parcial. Típicamente, la etapa de sustitución afecta 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, más preferiblemente 35%, 40%, 50%, 60%, 70% o más de los primeros codones del polinucleótido progenitor. En una realización preferida que requiere una calidad fenotípica mayor, el número de, y diferencia en la preferencia fenotípica entre, los primeros codones y los codones sinónimos se seleccionan de tal manera que el polipéptido asociado con fenotipo se produce a partir del polinucleótido sintético para conferir un fenotipo sobre un organismo escogido o parte de un organismo en una calidad que es por lo menos aproximadamente 110%, adecuadamente por lo menos aproximadamente 150%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 200%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 250%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 300%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 350%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 400%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 450%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 500%, y todavía aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 1000%, de la calidad del fenotipo conferida por el polinucleótido progenitor en el organismo o parte. Por el contrario, en una realización preferida que requiere una calidad fenotípica menor, el número de, y la diferencia en la preferencia fenotípica entre, los primeros codones y los codones sinónimos se seleccionan de tal manera que el polipéptido asociado con fenotipo se produce a partir del polinucleótido sintético para conferir un fenotipo sobre un organismo escogido o parte del mismo en una calidad que es no más de aproximadamente 90%, adecuadamente no más de aproximadamente 80%, preferiblemente no más de aproximadamente 70%, más preferiblemente no más de aproximadamente 60%, aún más preferiblemente no más de aproximadamente 50%, aún más preferiblemente no más de aproximadamente 40%, aún más preferiblemente no más de aproximadamente 30%, aún más preferiblemente no más de aproximadamente 20%, aún más preferiblemente no más de aproximadamente 10%, y todavía aún más preferiblemente no más de aproximadamente 5%, de la calidad del fenotipo conferida por el polinucleótido progenitor en el organismo o parte.

4. Construcción de polinucleótido sintéticos

Se puede alcanzar la sustitución de un codón por otro utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo la modificación codón de un polinucleótido progenitor se puede efectuar utilizando varias técnicas de mutagenia conocidas que incluyen, por ejemplo, mutagenia directa de oligonucleótido, mutagenia con oligonucleótidos degenerados, y mutagenia específica a región. Ejemplos de técnicas de mutagenia in vitro se describen por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,184,917, 4,321,365 y 4,351,901 o en las secciones pertinentes de Ausubel, et al. (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. 1997) y of Sambrook, et al., (MOLECULAR CLONING. a LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, 1989). En lugar de la mutagenia in vitro, el polinucleótido sintético se puede sintetizar de novo utilizando maquinaría fácilmente disponible como se describe, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No 4,293,652. Sin embargo, se debe notar que la presente invención es no dependiente de, y no se dirige a, una cualquier técnica particular para construir el polinucleótido sintético.

El polinucleótido progenitor es adecuadamente un gen natural. Sin embargo, es posible que el polinucleótido progenitor no sea de ocurrencia natural sino que se elabore mediante ingeniería genética utilizando técnicas recombinantes. Los polinucleótidos progenitores se pueden obtener a partir de cualquier fuente adecuada, tal como organismos eucarióticos o procarióticos, que incluyen pero no se limitan a mamíferos u otros animales, y organismos patogénicos tales como levaduras, bacterias, protozoos y virus.

La invención también contempla polinucleótidos sintéticos que codifican una o más porciones deseadas del polipéptido asociado a fenotipo. A este respecto, se prefiere que el polinucleótido sintético codifique por lo menos un dominio funcional del polipéptido asociado con fenotipo, que es preferiblemente por lo menos aproximadamente 10, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 20, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 50, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 100, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 150, y todavía más preferiblemente por lo menos aproximadamente 500 residuos de aminoácido contiguo de tal polipéptido.

La invención contempla adicionalmente una construcción sintética (o vector de expresión), que comprende un polinucleótido sintéticos de la invención, que se liga operablemente a un polinucleótido regulador. El polinucleótido regulador comprende de manera adecuada secuencias de control transcripcional y/o traduccional, que serán compatibles para la ex en el organismo de interés o en células de tal organismo. Típicamente, las secuencias de control regulador transcripcional y/o traduccional incluyen, pero no se limitan a, una secuencia promotora, un región no codificante 5', una región a cis-reguladora tal como un sitio de unión funcional para proteína reguladora transcripcional o proteína reguladora traduccional, un marco de lectura abierto con dirección 5', secuencias de unión ribosómica, sitios de inicio transcripcional, sitio de inicio traduccional, y/o secuencia de nucleótido que codifica una secuencia líder, codón de terminación, sitio de parada traduccional y una región no traducida 3'. Los promotores constitutivos o inducibles como se conoce en la técnica se contemplan por la invención. Los promotores pueden ser ya sea promotores de ocurrencia natural, o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Las secuencias promotoras contempladas por la presente invención pueden ser naturales al organismo de interés o se pueden derivar de una fuente alternativa, donde la región es funcional en el organismo escogido. La elección del promotor diferirá dependiendo del anfitrión destinado. Por ejemplo, los promotores que se pueden utilizar para la expresión en plantas incluyen promotores de planta tales como: promotores de planta constitutivos ejemplos de los cuales incluyen promotor de planta CaMV35S, promotor de planta CaMV19S, promotor de planta FMV34S, promotor de planta de badnavirus baciliforme de caña de azúcar, promotor de planta CsVMV, promotor de planta Arabidopsis ACT2/actina ACT8, promotor de planta Arabidopsis ubiquitin UBQ1, promotor de planta tionina BTH6 de hoja de cebada, y promotor de planta de actina de arroz; promotores de planta específicos a tejido ejemplos de de los cuales incluyen promotor de planta de proteína de almacenamiento faseolina de judía, promotor de planta DLEC, promotor de planta PHS. beta., promotor de planta de proteína de almacenamiento de zeína, promotor de planta conglutina gamma de soya, promotor de planta de gen AT2S1, promotor de planta actina ACT11 de Arabidopsis, promotor de planta napA de Brassica napus y promotor de planta de gen patatina de papa; y promotores de planta inducibles ejemplos de los cuales incluyen un promotor de planta inducible a la luz derivado del gen rbcS de guisante, un promotor de planta del gen rbcS de alfalfa, promotores de planta DRE, MYC y MYB que son activos en la sequía; promotores de planta INT, INPS, prxEa, Ha hsp17.7G4 y RD21 planta activos en salinidad alta y tensión osmótica, y promotores de planta hsr203J y str246C activos en la tensión patogénica. Alternativamente, los promotores que se pueden utilizar para expresión en mamíferos incluyen el promotor de metalotioneína, que se puede inducir en respuesta a metales pesados tales como cadmio, el promotor \beta-actina así como también promotores víricos tales como el promotor de antígeno T grande SV40, promotor temprano inmediato (IE) de citomegalovirus humano (CMV), promotor LTR de virus de sarcoma de Rous, promotor de adenovirus, o un promotor HPV, particularmente también se puede utilizar la región reguladora con dirección 5' HPV (URR). Todos estos promotores de describirán bien y estarán fácilmente disponibles en la técnica.

La construcción sintética de la presente invención también puede comprender una secuencia no traducida 3'. Una secuencia no traducida 3' se refiere a aquella porción de un gen que comprende un segmento de ADN que contiene una señal de poliadenilación y cualesquier otras señales reguladoras capaces de efectuar el proceso de mARN o expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza por efectuar la adición de conductos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de mARN. Las señales de poliadenilación se reconocen comúnmente por la presencia de homología a la forma canónica 5' AATAAA-3' aunque no son comunes las variaciones. La secuencia de ADN reguladora no traducida 3' preferiblemente incluye de aproximadamente 50 a 1,000 pares base de nucleótido y pueden contener secuencias de terminación transcripcionales y traduccionales en adición a la señal de poliadenilación y cualesquier otras señales reguladoras capaces de efectuar proceso de mARN o expresión génica.

En una realización preferida, la construcción sintética contiene adicionalmente un gen marcador seleccionable para permitir la selección de un organismo o un precursor del mismo que contiene la construcción sintética. Los genes de selección son bien conocidos en la técnica y serán compatibles para expresión en organismo o su precursor.

\newpage

Se entenderá, sin embargo, que la expresión de los polinucleótidos que codifican proteínas en sistemas heterólogos es ahora bien conocida, y la presente invención no se dirige a o depende de cualquier vector particular, la secuencia de control transcripcional o técnica para su producción. A diferencia, los polinucleótidos sintéticos preparados de acuerdo con los métodos establecidos aquí se pueden introducir en un organismo de interés o en un precursor o progenitor del mismo en cualquier forma adecuada en conjunto con una construcción sintética o vector adecuado, y los polinucleótidos sintéticos se pueden expresar con promotores conocidos en cualquier forma convencional.

En algunas realizaciones, las construcciones sintéticas de la invención están en la forma de vectores víricos, tales como virus 40 de simio (SV40) o virus de papiloma bovino (BPV), que tiene la capacidad de replicarse como elementos extracromosómicos (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982; Sarver et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1:486). Los vectores víricos incluyen virus retrovíricos (lentivirus), virus asociados a adeno (ver, por ejemplo, Okada, 1996, Gene Ther. 3:957-964; Muzyczka, 1994, J. Clin. Invst. 94:1351; Patentes Estadounidenses Nos. 6,156,303; 6,143,548 5,952,221, que describen los vectores AAV; ver también Patentes Estadounidenses Nos. 6,004,799; 5,833,993), adenovirus (ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 6,140.087; 6,136,594; 6,133,028; 6,120,764), reovirus, herpesvirus, genomas de rotavirus etc., modificados para introducir y dirigir la expresión de un polinucleótido o trasgen en células. Los vectores retrovíricos pueden incluir aquellos basados sobre virus de leucemia de murino (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,132,731), virus de leucemia de mono gibón (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,033,905), virus de inmunodeficiencia de simio, virus de inmunodeficiencia humano (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,985,641), y combinaciones de los mismos.

Los vectores también incluyen aquellos genes de suministro eficiente a células de animales in vivo (por ejemplo, citoblastos) (ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,821,235 y 5,786,340; Croyle et al., 1998, Gene Ther. 5:645; Croyle et al., 1998, Pharm. Res. 15:1348; Croyle et al., 1998, Hum. Gene Ther. 9:561; Foreman et al., 1998, Hum. Gene Ther. 9:1313; Wirtz et al., 1999, Gut 44: 800). Los vectores víricos asociados a adeno y adenovíricos adecuados para suministro in vivo se describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,700,470, 5,731,172 y 5,604,090. Los vectores adicionales adecuados para suministro in vivo incluyen vectores del virus simplex de herpes (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,501,979), vectores retrovíricos (ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,624,820, 5,693,508 y 5,674,703; y WO92/0526 y WO92/14829), vectores del virus del papiloma bovino (BPV) (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,719,054), vectores basados en CMV (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,561,063) y vectores de parvovirus, rotavirus y virus Norwalk. Los vectores lentivíricos son útiles para infectar células divididas así como también células no divididas (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,013,516).

Los vectores para expresión de células en insectos utilizan comúnmente variaciones recombinantes de baculovirus y otros nucleopolihedrovirus, por ejemplo, vectores de nucleopolihedrovirus Bombyx mori (ver, por ejemplo, Choi, 2000, Arch. Virol. 145:171-177). Por ejemplo, se utilizan células de Lepidóptero y Coleóptero para replicar baculovirus para promover las expresiones génicas externos llevados por baculovirus, por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda se infectan con virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica recombinantes (AcNPV) que llevan una secuencia heteróloga, por ejemplo, una secuencia humana, codificante (ver, por ejemplo, Lee, 2000, J. Virol. 74:11873-11880; Wu, 2000, J. Biotechnol. 80:75-83). Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,143,565, que describe el uso del polidnavirus de la avispa parásita Glyptapanteles indiensis para integrar establemente el ácido nucleico en el genoma de las estirpes celulares del insecto Lepidóptero y Coleóptero insecto. Ver también, Patentes Estadounidenses Nos. 6,130.074; 5,858,353; 5,004,687.

Los vectores de expresión capaces de expresar proteínas en plantas con bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, vectores de Agrobacterium spp., virus de la papa X (ver, por ejemplo, Angell, 1997, EMBO J. 16:3675-3684), virus mosaico del tabaco (ver, por ejemplo, Casper, 1996, Gene 173:69-73), virus del enanismo del arbusto de tomate (ver, por ejemplo, Hillman, 1989, Virology 169:42-50), virus "etch" de tabaco (ver, por ejemplo, Dolja, 1997, Virology 234:243-252), virus mosaico dorado de judía (ver, por ejemplo, Morinaga, 1993, Microbial Inmunol. 37:471-476), virus mosaico del coliflor (ver, por ejemplo, Cecchini, 1997, Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101), elemento trasponible del maíz Ac/Ds (ver, por ejemplo, Rubin, 1997, Mol. Cell. Biol, 17:6294-6302; Kunze, 1996, Curr. Top. Microbiol. Inmunol. 204:161-194), y el elemento trasponible mutador supresor de maíz (Spm) (ver, por ejemplo, Schlappi, 1996, planta Mol. Biol. 32:717-725); y derivados de los mismos.

La invención contempla adicionalmente organismos que contienen la construcción sintética de la invención, o alternativamente, partes, precursores, células o tejidos producidos por los métodos de la invención.

Con el fin de que la invención se pueda comprender fácilmente y llevar a efecto práctico, realizaciones preferidas particulares ahora serán descritas a través de los siguientes ejemplos no limitantes.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1 Modificación de codón de un polinucleótido que codifica antígeno para mejorar la respuesta del anticuerpo de un mamífero a aquel antígeno Reactivos

Para cada conjunto de codones sinónimos que codifican para un aminoácido individual, se construye un conjunto de 2-6 construcciones de gen, cada uno codifica proteína fluorescente verde con una secuencia líder que comprende seis copias de un aminoácido. Cada miembro del conjunto es idéntico excepto que, en todo el conjunto, la secuencia líder comprende 6 copias de cada uno de los tripletes de codón sinónimo posibles (XXX) que codifican para el
aminoácido.

El formato general de estas construcciones de gen sería:

: Promotor Eucariótico -ATG - (XXX)6 - gen GFP -señal de poliadenilación

\vskip1.000000\baselineskip

El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen GFP se establecen en la SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos deducidas de las diferentes secuencias líder se establecen en la SEQ ID NO: 3 a 120.

Se construye así un superconjunto de 20 de tales conjuntos de construcciones de gen, que codifica todos los aminoácidos de ocurrencia natural posibles para los que existe tripletes de codificación excedente, que comprende en total 59 construcciones de gen.

\vskip1.000000\baselineskip

Método

Grupos de 8-10 ratones hembra Balb/c de 6 semanas de edad se inmunizan transcutáneamente utilizando un sistema de suministro biolístico (por ejemplo, la pistola de gen Biorad o el sistema de administración Powderject) con una de las 59 construcciones de gen, en una a tres ocasiones en tres intervalos semanales. El plásmido (1-2 \mug) se recubre en microesferas de oro (Biorad) o azúcar (Powderject) material de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las microesferas se suministran a la piel abdominal afeitada del ratón. El sistema Powderject se optimiza para suministro a la epidermis basal. El sistema Biorad tiene la capacidad de alterar la profundidad de suministro al ajustar la presión del gas utilizada para el suministro. Se recolectan los datos para presiones de gas optimizadas para suministro a la superficie, o epitelio basal, o a la dermis. Esto se calibra para la pistola de gen y microesferas particular al suministrar microesferas a la piel y se examina las secciones microscópicas para clasificar el porcentaje de microesferas a varias profundidades en la dermis y epidermis.

Se toman muestras de suero mediante hemorragia reto-orbital en las semanas 3 y 6 post-inmunisación y mediante punción cardiaca terminal en la semana 9 post-inmunisación y el título de anticuerpo a GFP determinado por ELISA para cada suero. Para ELISA, el GFP (Sigma) se cubre en placas y la reactividad en suero se determina de acuerdo con protocolos estándar (ver, por ejemplo, Walsh et al., 2000, J Gen Virol. 709-718).

\vskip1.000000\baselineskip

Resultados e interpretación

El título de anticuerpo medio para GPF inducido por cada conjunto de construcciones que codifican un aminoácido dado se clasifica para determinar el codón óptimo para la producción de anticuerpos utilizando un polinucleótido suministrado por un sistema de suministro biolístico (por el contrario el codón óptimo evita la producción de
anticuerpo).

Una lista de codones óptimos es así producida. Una construcción de gen mejorada para una vacuna de polinucleótido suministrada por el sistema de administración probado a la piel y diseñada para inducir título de anticuerpo máximo es una en la que los codones en el gen de interés (por ejemplo, hemaglutinina en influenza) que no son óptimos se reemplazan (en gran medida) por unos que son útiles para producir título de anticuerpo máximo.

\newpage

Ejemplo 2 Modificación de codón de un polinucleótido que codifica antígeno para conferir tolerancia a aquel antígeno en un mamífero Reactivos

Para cada conjunto de codones sinónimos que codifican para un aminoácido individual, un conjunto de 2-6 construcciones de gen se construye, cada uno codifica descarboxilasa de ácido glutámico (GAD) con una secuencia líder que comprende seis copias de un aminoácido. Cada miembro del conjunto es idéntico excepto que, en todo el conjunto, la secuencia líder comprende 6 copias de cada uno de los tripletes de codón sinónimo posibles (XXX) que codifican para el aminoácido.

El formato general de tales construcciones de gen sería:

: Promotor eucariótico -ATG - (XXX)6 - gen GAD - señal de poliadenilación

\vskip1.000000\baselineskip

El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen GAD se establecen en la SEQ ID NO: 121 y 122, respectivamente.

\vskip1.000000\baselineskip

Métodos

Grupos de ratones hembra NOD de 4 semanas de edad (diabéticos no obesos) se inmunizan transcutáneamente utilizando un sistema de suministro biolístico (por ejemplo, la pistola de gen Biorad o el sistema de administración Powderject) con una de las 59 construcciones de gen, en una a tres ocasiones en tres intervalos semanales. El plásmido (1-2 \mug) se recubre en material de microesferas de oro (Biorad) o azúcar (Powderject) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las microesferas se suministran a la piel abdominal afeitada del ratón. El sistema Powderject se optimiza para suministro a la epidermis basal. El sistema Biorad tiene la capacidad de alterar la profundidad de suministro al ajustar la presión del gas utilizada para el suministro. Se recolectan los datos para presiones de gas optimizadas para suministro a la superficie, o epitelio basal, o a la dermis. Esto se calibra para la pistola de gen y microesferas particular al suministrar microesferas a la piel y se examina las secciones microscópicas para clasificar el porcentaje de microesferas a varias profundidades de la dermis y epidermis.

Luego se induce diabetes a los ratones según se evalúa por un nivel de azúcar en la sangre sobre 10 mM/L en muestras de sangre obtenidas semanalmente mediante hemorragia reto-orbital. El inicio de diabetes se confirma por las pruebas de glicosuria, y la histología pancreática se determina en los ratones diabéticos, y en ratones considerados libres de diabetes en 26 semanas.

\vskip1.000000\baselineskip

Resultados e interpretación

El tiempo medio de inicio de diabetes para los ratones inmunizados con cada conjunto de construcciones que codifican un aminoácido dado se clasificaría, para determinar el codón óptimo para expresar el gen de interés en los sitios responsables de la prevención de una respuesta inmune patogénica, utilizando un polinucleótido suministrado por un sistema de suministro biolístico.

Se produce así una lista de codones óptimos para asegurar la expresión de proteína de una vacuna de polinucleótido en los sitios óptimos para inducir inmunidad protectora al anfitrión (tolerancia). Una construcción de gen mejorada para una vacuna de polinucleótido suministrada por el sistema de administración probado a la piel y diseñada para inducir tolerancia inmune protectora al anfitrión máxima es una en la que los codones en el gen de interés (por ejemplo, insulina con una vista para controlar diabetes humana) que no son óptimos se reemplazan (en gran medida) por unos que son óptimos.

\newpage

\global\parskip0.900000\baselineskip

Ejemplo 3 Modificación de codón para optimizar la resistencia de plantas transgénicas a herbicidas mientras que se mantiene la producción de semilla Reactivos

Para cada conjunto de codones sinónimos que codifican para un aminoácido individual, un conjunto de 2-6 construcciones de gen se construye, cada uno codifica fosfinotricina acetiltransferasa (codificada por el gen Bar) con una secuencia líder que comprende seis copias de un aminoácido. Cada miembro del conjunto es idéntico excepto que, en todo el conjunto, la secuencia líder comprende 6 copias de cada uno de los tripletes de codón sinónimo posibles (XXX) que codifican para el aminoácido.

El formato general de tales construcciones de gen sería:

: Promotor de planta -ATG - (XXX)6 - gen BAR - señal de poliadenilación de planta

\vskip1.000000\baselineskip

El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen BAR se establecen en la SEQ ID NO: 123 y 124, respectivamente.

Se construye así un superconjunto de 20 de tales conjuntos de construcciones de gen, que codifica todos los aminoácidos de ocurrencia natural posibles, que comprende en total 59 construcciones de gen.

\vskip1.000000\baselineskip

Método

El método de Weeks et al. (1993, Plant Physiol 102(4):1077-1084) para la producción de estirpes independientes múltiples de trigo transgénico independiente (Triticum aestivum).En resumen, el callo derivado de embriones inmaduros, 0.5 a 1 mm de largo, se bombarean con microproyectiles recubiertos con ADN que contiene como genes marcadores el gen Bar, que codifica resistencia a fosfinotricina, y el gen que codifica \beta-glucuronidasa (GUS), cada uno bajo control de un promotor de ubiquitina de maíz. El bombardeo se realiza 5 d después de escisión del embrión, solo después de la iniciación de la proliferación del callo. La capacidad de las plántulas a la raíz en la presencia de 1 o 3 mg/L de bialafos es un criterio de selección confiable utilizado para identificar las plantas transformadas. La transformación estable se confirma por los ensayos de expresión génica marcador y la presencia del ADN cromosómico de alto peso molecular de las secuencias Bar de las plantas resultantes. En promedio, transcurren 168 d entre la escisión de embrión para el bombardeo y la antesis de las plantas T0. La transmisión de ambas el fenotipo de resistencia y ADN bar a la generación T1 verifica que ha ocurrido la transformación de línea germinal.

La resistencia a herbicida se mide utilizando el método de Singh and Wright (2002, Lett. Appl. Microbiol. 35(1): 12-16) y la concentración de proteína en semilla se mide por método de Turner et al. (1990, Plant Mol. Biol. 14(5):793-803).

\vskip1.000000\baselineskip

Resultados e interpretación

Para cada secuencia líder de aminoácido, las plantas se clasifican de acuerdo con su resistencia al Basta Herbicide, y a su contenido de proteína de semilla. El codón óptimo de cada conjunto es el uno que da resistencia a herbicida adecuada a las plantas y la producción de proteína de semilla máxima.

Se produce así una lista de codones óptimos, y una construcción de gen mejorada para un gen que transporta resistencia a herbicida a plantas de grano transgénicas es una en la que los codones en el gen de interés (dichos aquellos en los que un plásmido de anfitrión de amplio rango pJP4, llevan genes para la degradación de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido 2-metil-4-clorofenoxiacético, y ácido 3-clorobenzoico (ver por ejemplo, Kleinsteuber, et al, 2001, Extremophiles. 5(6):375-384) que no son óptimos (en gran medida) se reemplazan por unos que son óptimos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Modificación de codón para optimizar la selectividad de un gen inhibidor de crecimiento para controlar un tumor de piel son dañar a la piel normal circundante Reactivos

Para cada conjunto de codones sinónimos que codifican para un aminoácido individual, un conjunto de 2-6 construcciones de gen se construye, cada uno codifica un inhibidor negativo dominante E2F1 con una secuencia líder que comprende seis copias de un aminoácido. Cada miembro del conjunto es idéntico excepto que, en todo el conjunto, la secuencia líder comprende 6 copias de cada uno de los tripletes de codón sinónimo posibles (XXX) que codifican para el aminoácido.

\global\parskip1.000000\baselineskip

El formato general de tales construcciones de gen sería:

: Promotor eucariótico -ATG - (XXX)6 - gen E2Fldn - IRES - gen GFP-señal de poliadenilación

\vskip1.000000\baselineskip

El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen inhibidor negativo dominante E2F1 se establecen en la SEQ ID NO: 125 y 126, respectivamente.

\vskip1.000000\baselineskip

Métodos

Se inducen tumores en la piel de ratones FVB al pintar con carcinógenos químicos utilizando un régimen de DM-BA/TPA promoción/inducción estándar. Los grupos de ratones hembra que llevan tumor se tratan tópicamente utilizando un sistema de suministro biolístico (por ejemplo, la pistola de gen Biorad o el sistema de administración Powderject) con una de las 59 construcciones de gen, en una a tres ocasiones en tres intervalos semanales. El plásmido (1-2 \mug) se recubre en las microesferas de oro (Biorad) o azúcar (Powderject) material de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las microesferas se suministran a la piel abdominal afeitada del ratón. El sistema Powderject se optimiza para suministro a la epidermis basal. El sistema Biorad tiene la capacidad de alterar la profundidad de suministro al ajustar la presión del gas utilizada para el suministro. Se recolectan los datos para presiones de gas optimizadas para suministro a la superficie, o epitelio basal, o a la dermis. Esto se calibra para la pistola de gen y microesferas particulares al suministrar microesferas a la piel y se examinan las secciones microscópicas para clasificar el porcentaje de microesferas a varias profundidades en la dermis y epidermis.

Veinticuatro horas después de tratamiento, la piel del tumor y la piel normal circundante se separan y se desagregan en células individuales. Las células se clasifican para expresión del GFP por citometría de flujo de alta velocidad, y se evalúa el potencial clonogénico de las células positivas al GFP para cada construcción, y para tejido normal y de tumor. El potencial clonogénico se establece al preparar las células en placas recubiertas con colágeno en medio KGM mínimo, y al contar las colonias establecidas por 10000 células de salida entrada. La relación de las colonias obtenidas a partir de tejido normal a colonias obtenidas de tejido de tumor se mide de la eficiencia de objetivación de tal construcción particular al tejido de tumor - la mayor eficiencia de formación de colonia para las células de piel normales en comparación con las células de tumor indica un codón más preferido para suministrar correctamente la terapia de gen al tumor.

\vskip1.000000\baselineskip

Resultados e interpretación

La relación de eficiencia de formación de colonia media (células normales/de tumor) se clasifica para determinar el codón óptimo para inhibir crecimiento de tumor mientras que se preserva la piel normal, utilizando un polinucleótido suministrado por un sistema de suministro biolístico. Se produce así una lista de codones óptimos. Una construcción de gen mejorada para tratar cánceres de piel suministrada por el sistema de administración probado a la piel y diseñada para inducir selectividad máxima al tumor en el tejido normal es una en la que los codones en el gen de interés para tratamiento de cáncer de piel (por ejemplo p53) se asemejan más a la lista óptima.

A través de la especificación el objetivo se ha descrito en las realizaciones preferidas de la invención sin limitar la invención a una cualquiera realización o colección específica de características. Aquellos expertos en la técnica por lo tanto apreciarán que, a la luz de la descripción inmediata, varias modificaciones y cambios se pueden hacer en las realizaciones particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance de la presente invención. Todas tales modificaciones y cambios se destinan a ser incluidos dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> The University of Queensland (todos los estados, excepto Estados Unidos) Frazer, Ian Hector (solo Estados Unidos)

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Un método para optimizar expresión génica

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 12178192/VPA

\vskip0.400000\baselineskip

<140> no asignado

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2003-11-10

\vskip0.400000\baselineskip

<150> USSN 60/425,163

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-11-08

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 714

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GFP Humanizado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(711)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GFP Humanizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala(GCA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala(GCA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala(GCG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala(GCG)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala(GCT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala(GCT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala(GCC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala(GCC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

10

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(AGA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(AGA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(CGA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(CGA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(CGG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(CGG)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(CGT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(CGT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(AGG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(AGG)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(CGC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg(CGC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm

22

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asn(AAC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asn(AAC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asn(AAT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asn(AAT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp(GAT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp(GAT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp(GAC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp(GAC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cys(TGC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cys(TGC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cys(TGT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cys(TGT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gln(CAA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gln(CAA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gln(CAG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gln (CAG) x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu(GAA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu(GAA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu(GAG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu(GAG)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly(GGA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly(GGA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly(GGG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly(GGG)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly(GGC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly(GGC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly(GGT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly(GGT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His(CAC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip1cm

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His(CAC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip1cm

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His(CAT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His(CAT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\hskip1cm

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile(ATC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip1cm

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile(ATC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\hskip1cm

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile(ATT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\hskip1cm

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile(ATT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\hskip1cm

58

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile(ATA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\hskip1cm

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile(ATA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\hskip1cm

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu(CTC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip1cm

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu(CTC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\hskip1cm

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu(TTG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\hskip1cm

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu(TTG)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\hskip1cm

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu(CTA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\hskip1cm

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu(CTA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\hskip1cm

66

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu(CTG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\hskip1cm

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu(CTG)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\hskip1cm

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu (TTA) x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\hskip1cm

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu(TTA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\hskip1cm

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu(CTT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\hskip1cm

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu(CTT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\hskip1cm

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(AAG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\hskip1cm

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(AAG)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\hskip1cm

74

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(AAA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\hskip1cm

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(AAA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\hskip1cm

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe(TTT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\hskip1cm

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe(TTT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\hskip1cm

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe(TTC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\hskip1cm

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe(TTC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\hskip1cm

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro(CCC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\hskip1cm

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro(CCC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\hskip1cm

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro(CCT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\hskip1cm

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro(CCT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\hskip1cm

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro(CCG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\hskip1cm

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro (CCG) x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\hskip1cm

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro(CCA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\hskip1cm

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro(CCA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\hskip1cm

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser(AGC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\hskip1cm

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser(AGC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\hskip1cm

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser(TCT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\hskip1cm

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser(TCT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\hskip1cm

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

<223 Ser(AGT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\hskip1cm

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser(AGT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\hskip1cm

94

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser(TCG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\hskip1cm

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser(TCG)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\hskip1cm

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser(TCA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\hskip1cm

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser(TCA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\hskip1cm

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser(TCC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\hskip1cm

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser(TCC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\hskip1cm

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr(ACA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\hskip1cm

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr(ACA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\hskip1cm

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr(ACG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\hskip1cm

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr(ACG)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\hskip1cm

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr(ACT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\hskip1cm

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr(ACT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\hskip1cm

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr(ACC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\hskip1cm

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr(ACC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\hskip1cm

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tyr(TAC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\hskip1cm

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tyr(TAC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\hskip1cm

110

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tyr(TAT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\hskip1cm

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tyr(TAT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\hskip1cm

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val(GTG)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\hskip1cm

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val(GTG)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\hskip1cm

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val(GTT)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\hskip1cm

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val(GTT)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\hskip1cm

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val(GTC)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\hskip1cm

117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val(GTC)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\hskip1cm

118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val(GTA)x6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\hskip1cm

119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val(GTA)x6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\hskip1cm

120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2583

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2166)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

121

122

123

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 722

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

125

126

127

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 549

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> gen BAR

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(549)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> gen BAR

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 366

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(363)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

132

Claims

1. Un método para construir un polinucleótido sintético del cual se puede producir un polinucleótido para conferir un fenotipo seleccionado sobre un organismo multicelular de interés o parte del mismo en una calidad diferente que aquella conferida por un polinucleótido progenitor que codifica el mismo polipéptido, el método comprende: (a) seleccionar un primer codón del polinucleótido progenitor para sustitución con un codón sinónimo, en donde el codón sinónimo se selecciona sobre la base de que este exhibe a una preferencia fenotípica diferente a aquella del primer codón en una comparación de preferencias fenotípicas en organismos de prueba no humanos o partes de los mismos, en donde las partes de los organismos de prueba se seleccionan de tejidos u órganos de los organismos de prueba, en donde los organismos de prueba se seleccionan del grupo que consiste de organismos de la misma especie como el organismo de interés y el organismo que se relaciona con el organismo de interés: y (b) reemplazar el primer codón con el codón sinónimo para construir el polinucleótido sintético, en donde el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido sobre una célula por el polinucleótido progenitor que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las preferencias fenotípicas de codones en los organismos de prueba o partes se comparan al: (i) introducir separadamente en los organismos o partes de prueba construcciones sintéticas individuales, cada una de las cuales comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem de un codón fusionado en un marco con un polinucleótido indicador que codifica una proteína reportera, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo correspondiente seleccionado del grupo que consiste del fenotipo seleccionado y un fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado; y (ii) comparar la calidad del fenotipos exhibidos por los organismos de prueba o partes para determinar las preferencias relativas fenotípicas de los codones.

3. Un método para construir un polinucleótido sintético del cual se puede producir un polinucleótido para conferir un fenotipo seleccionado sobre un organismo multicelular de interés o parte del mismo en una calidad diferente que aquella conferida por un polinucleótido progenitor que codifica el mismo polipéptido, el método comprende: (a) seleccionar un primer codón del polinucleótido progenitor para sustitución con un codón sinónimo, en donde el codón sinónimo se selecciona sobre la base de que este exhibe una preferencia fenotípica diferente de aquella del primer codón en una comparación de preferencias fenotípicas partes ex vivo de organismos de prueba, en donde dichas partes de organismos de prueba se seleccionan de tejidos u órganos de los organismos de prueba, en donde dichas partes de organismos de prueba no incluyen un citoblasto embriónico humano o una estirpe celular germinal, en donde las partes de organismos de prueba se seleccionan del grupo que consiste de organismos de la misma especie como el organismo de interés y organismos que se relacionan con el organismo de interés: y (b) reemplazar el primer codón con el codón sinónimo para construir el polinucleótido sintético, en donde el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido sobre una célula por el polinucleótido progenitor que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las preferencias fenotípicas de codones en las partes de organismos de prueba se comparan al: (i) introducir separadamente en las partes ex vivo de organismos de prueba individual construcciones sintéticas, cada una de las cuales comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem de un codón fusionado en un marco con un polinucleótido indicador que codifica una proteína reportera, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo correspondiente seleccionado del grupo que consiste del fenotipo seleccionado y un fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado; y (ii) comparar la calidad del fenotipos exhibidos por las partes ex vivo de los organismos de prueba para determinar las preferencias relativas fenotípicas de los codones.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en donde la proteína reportero produce el fenotipo seleccionado.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en donde el reportero no produce el fenotipo seleccionado pero produce la misma clase de fenotipo como el fenotipo seleccionado.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 o reivindicación 6, en donde la proteína reportero se selecciona de antígenos derivados de organismos patogénicos, antígenos de cáncer, autoantígenos, antígenos de trasplante, factores de crecimiento, hormonas y toxinas.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el fenotipo se selecciona de inmunidad, tolerancia a antígeno, angiogenia, anti-angiogenia, alivio de síntomas clínicos, muerte celular incrementada o reducida, diferenciación celular incrementada o reducida, proliferación celular incrementada o reducida, regresión de tumor o cáncer, crecimiento y reparación de tejido o órgano, fibrosis disminuida, inhibición o reversión de la senescencia celular, migración celular incrementada o reducida, expresión diferencial de proteínas entre las diferentes células o tejidos de un organismo o parte del mismo, recuperación de trauma, recuperación de quemaduras, resistencia o sensibilidad a los antibióticos, tolerancia o sensibilidad a herbicidas, biosíntesis o modificación del almidón, biosíntesis de ácidos grasos, resistencia o tolerancia a enfermedades, resistencia o tolerancia a las plagas que incluyen resistencia o tolerancia a insectos, resistencia o tolerancia vírica, resistencia o tolerancia a los hongos, una característica metabólica incluye el metabolismo de la sacarosa, resistencia o tolerancia a las heladas, tolerancia al estrés, y contenido de alimentos mejorado o rendimientos incrementados.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el fenotipo es una respuesta inmune.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la respuesta inmune es una repuesta inmune humoral.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la respuesta inmune es una repuesta inmune mediada por célula.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la respuesta inmune es una repuesta mediada por inmunidad innata.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 4, en donde las construcciones sintéticas se introducen en los organismos de prueba no humanos utilizando el mismo o similar modo de introducción.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 4, en donde las construcciones sintéticas se introducen en los organismos de prueba no humanos en el mismo o sitio correspondiente.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el organismo de interés es un mamífero no humano y las construcciones sintéticas se introducen por ruta oral, intravenosa, intramuscular, intranasal, bucal, subcutánea, transdérmica, bucal o sublingual.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las construcciones sintéticas se introducen en uno o más de los tipos de célula o tejido del organismo de interés.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde las construcciones sintéticas se introducen en células seleccionadas de células de músculo, células de piel, células de cerebro, células de pulmón, células de riñón, células de páncreas, células de un órgano reproductor, células de corazón, células vasculares, células de hígado, células de ojo, células de flores, células del meristemo, células de la raíz y células de la hoja.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las construcciones sintéticas se introducen en uno o más tipos de tejido o célula ex vivo del organismo de interés en donde dichos tipos de célula o tejido no incluyen un citoblasto embriónico humano o una estirpe celular germinal.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la célula en la que las construcciones sintéticas se introducen se seleccionan de células de músculo, células de piel, células de cerebro, células de pulmón, células de riñón, células de páncreas, células de un órgano reproductor, células de corazón, células vasculares, células de hígado, células de ojo, células de flores, células del meristemo, células de la raíz y células de la hoja.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en donde la repetición tándem de cada una de las construcciones sintéticas comprende por lo menos tres copias del codón correspondiente.

21. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el codón sinónimo se selecciona de tal manera que este tiene una preferencia fenotípica mayor que el primer codón.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el codón sinónimo se selecciona cuando la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética comprende una repetición tándem del codón sinónimo es por lo menos aproximadamente 5% mayor que la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón.

23. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el codón sinónimo se selecciona de tal manera que tiene una menor preferencia fenotípica que el primer el primer codón.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el codón sinónimo se selecciona cuando la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética comprende una repetición tándem del codón sinónimo es por lo menos aproximadamente 5% más baja que la calidad del fenotipo conferida por la construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón.

25. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el organismo multicelular es un animal.

26. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el organismo multicelular es un mamífero.

27. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el organismo multicelular es una planta.

28. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde las construcciones sintéticas se introducen en los progenitores de los organismos de prueba no humanos o partes y los progenitores se hacen crecer o se cultivan durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para producir los organismos de prueba o partes, por lo cual las construcciones sintéticas están contenidas en uno o más tipos celulares de aquellos organismos o partes.

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde las células progenitoras se seleccionan de citoblastos, células pluripotenciales, células del meristemo y callo embriónico.

30. Un método para determinar la preferencia fenotípica de un primer codón en un organismo multicelular de interés o parte del mismo, el método comprende: (a) introducir una construcción sintética en un organismo de prueba no humano o parte del mismo, en donde dicha parte de un organismo de prueba se selecciona de tejidos u órganos del organismo de prueba, en donde el organismo de prueba se selecciona del grupo que consiste de un organismo de la misma especie como el organismo de interés y un organismo que se relaciona con el organismo de interés, la construcción sintética comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem del primer codón fusionado en el marco con un polinucleótido indicador que codifica una proteína reportera, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo seleccionado o un fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado; y (b) determinar la calidad del fenotipo correspondiente exhibido por el organismo de prueba no humano o parte, en donde el fenotipo seleccionado o el fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido sobre una célula por el polinucleótido progenitor que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido.

31. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, comprende adicionalmente: comparar (i) la calidad del fenotipo correspondiente exhibida por un organismo de prueba no humano o parte del mismo al cual se proporciona una construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón; y (ii) la calidad del fenotipo correspondiente exhibida por un organismo de prueba no humano o parte del mismo al que se proporciona una construcción sintética que comprende una repetición tándem de un segundo codón, en donde el segundo codón codifica el mismo aminoácido como el primer codón, por lo cual determina la preferencia fenotípica del primer codón relativo a la preferencia fenotípica del segundo codón en el organismo de prueba o parte.

32. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, comprende adicionalmente: (1) introducir la construcción sintética en un progenitor de un organismo de prueba no humano o parte del mismo; y (2) producir el organismo de prueba o parte del progenitor en donde el organismo de prueba o parte contiene la construcción sintética.

33. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, comprende adicionalmente: (1) introducir la construcción sintética en un progenitor de un organismo de prueba no humano o parte del mismo; y (2) hacer crecer el organismo de prueba o parte del progenitor; en donde el organismo de prueba o parte comprende una célula que contiene la construcción sintética.

34. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, comprende adicionalmente: introducir la construcción sintética en una célula seleccionada del organismo de prueba no humano o parte.

35. Un método para determinar la preferencia fenotípica de un primer codón en un organismo multicelular de interés o parte del mismo, el método comprende: (a) introducir una construcción sintética en una parte ex vivo de un organismo de prueba, en donde dicha parte de un organismo de prueba se selecciona de tejidos u órganos del organismo de prueba, en donde dicha parte de un organismo de prueba no incluye un citoblasto embriónico humano o una estirpe celular germinal, en donde la parte de un organismo de prueba se selecciona del grupo que consiste de un organismo de la misma especie como el organismo de interés y un organismo que se relaciona con el organismo de interés, la construcción sintética comprende un polinucleótido regulador ligado operablemente a una repetición tándem del primer codón fusionado en el marco con un polinucleótido indicador que codifica una proteína reportera, que produce, o que se predice que produce, un fenotipo seleccionado o un fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado; y (b) determinar la calidad del fenotipo correspondiente exhibida por la parte ex vivo de un organismo de prueba, en donde el fenotipo seleccionado o el fenotipo de la misma clase como el fenotipo seleccionado es diferente de un fenotipo conferido sobre una célula por el polinucleótido progenitor que contiene el primer codón que se expresa en la célula y que codifica el polipéptido.

36. Un método de acuerdo con la reivindicación 35, comprende adicionalmente: comparar (i) la calidad del fenotipo correspondiente exhibida por una parte ex vivo de un organismo de prueba al que se proporciona una construcción sintética que comprende una repetición tándem del primer codón, en donde dicha parte de un organismo de prueba se selecciona de tejidos u órganos del organismo de prueba, en donde dicha parte de un organismo de prueba no incluye un citoblasto embriónico humano o una estirpe celular germinal; y (ii) la calidad del fenotipo correspondiente exhibida por una parte ex vivo de un organismo de prueba al cual se proporciona una construcción sintética que comprende una repetición tándem de un segundo codón, en donde dicha parte de un organismo de prueba se selecciona de tejidos u órganos del organismo de prueba, en donde dicha parte de un organismo de prueba no incluye un citoblasto embriónico humano o una estirpe celular germinal, en donde el segundo codón codifica el mismo aminoácido como el primer codón, por lo cual determina preferencia fenotípica del primer codón relativa a la preferencia fenotípica del segundo codón en el organismo de prueba o parte.