ES2346067T3

ES2346067T3 - Identificacion de antigenos asociados a la superficie para el diagnostico y la terapia de tumores.

Info

Publication number: ES2346067T3
Application number: ES05747772T
Authority: ES
Inventors: Ozlem Tureci; Ugur Sahin; Sandra Schneider; Gerd Helftenbein; Volker Schluter; Dirk Usener; Philippe Thiel; Michael Koslowski
Original assignee: Ganymed Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: Ganymed Pharmaceuticals GmbH
Priority date: 2004-05-11
Filing date: 2005-05-11
Publication date: 2010-10-08
Anticipated expiration: 2025-05-11
Also published as: JP6434444B2; JP5796003B2; EP2258869A2; JP2016179986A; JP2007537197A; EP2258867A3; AU2005244425B2; US10724103B2; US20180169236A1; WO2005110338A3; EP2280082B1; EP2239340A3; US9255131B2; WO2005110338A2; EP2258868A3; EP1759013A2; EP2270209A3; JP5732369B2; EP2280082A2; EP2258869A3

Abstract

Composición farmacéutica que comprende uno o más componentes seleccionados de entre el grupo constituido por: (i) un anticuerpo que se une a un antígeno asociado a tumores, (ii) un antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo que comprende por lo menos 6 aminoácidos contiguos, (iii) un ácido nucleico, que codifica para un antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo que comprende por lo menos 6 aminoácidos contiguos, (iv) una célula huésped, que expresa un antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo que comprende por lo menos 6 aminoácidos contiguos y (v) unos complejos aislados entre un antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo y una molécula de HLA, en la que el antígeno asociado a tumores (a) comprende la secuencia de aminoácidos según SEC ID nº: 10 o (b) presenta una secuencia, que se codifica por un ácido nucleico que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el ácido nucleico según SEC ID nº: 9 para el tratamiento y/o la vacunación frente al cáncer caracterizado porque comprende la expresión o expresión anómala del antígeno asociado a tumores, estando seleccionado el cáncer de entre el grupo constituido por tumor de mama, tumor de pulmón, tumor de esófago, tumor de colon, tumor de estómago, tumor de páncreas, tumor de hígado, tumor de ovario, tumor de próstata, tumor ORL, tumor renal, tumor de cuello uterino, tumor de piel y tumor de útero.

Description

Identificación de antígenos asociados a la superficie para el diagnóstico y la terapia de tumores.

A pesar de los enfoques interdisciplinarios y de la utilización exhaustiva de los procedimientos terapéuticos clásicos, el cáncer se encuentra todavía entre las principales causas de muerte. Los conceptos terapéuticos más recientes tienen como objetivo la incorporación del sistema inmunitario del paciente en el concepto terapéutico global mediante la utilización de vacunas tumorales recombinantes y otras medidas específicas tales como la terapia con anticuerpos. Un requisito previo para el éxito de una estrategia de este tipo es el reconocimiento de antígenos o epítopos específicos de tumores o asociados a tumores por el sistema inmunitario del paciente cuyas funciones efectoras van a potenciarse de manera intervencionista. Las células tumorales biológicamente difieren sustancialmente de sus células de origen no malignas. Estas diferencias se deben a alteraciones genéticas adquiridas durante el desarrollo tumoral y también dan como resultado, entre otros, la formación de estructuras moleculares alteradas de manera cualitativa o cuantitativa en las células cancerosas. Las estructuras asociadas a tumores de este tipo, que se reconocen por el sistema inmunitario específico del huésped que porta tumor, se denominan como antígenos asociados a tumores.

El reconocimiento específico de los antígenos asociados a tumores implica mecanismos celulares y humorales que son dos unidades funcionalmente interconectadas: los linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} reconocen los antígenos procesados presentados en las moléculas de las clases II y I del CMH (complejo mayor de histocompatibilidad), respectivamente, mientras que los linfocitos B producen moléculas de anticuerpos circulantes que se unen directamente a antígenos no procesados.

La potencial importancia clínico-terapéutica de los antígenos asociados a tumores resulta del hecho de que el reconocimiento de antígenos en células neoplásicas por el sistema inmunitario conduce a la iniciación de mecanismos efectores citotóxicos, y en presencia, de células T cooperadoras, pueden provocar la eliminación de las células cancerosas (Pardoll, Nat. Med. 4:525-31, 1998). Por consiguiente, un objetivo central de la inmunología tumoral consiste en definir molecularmente estas estructuras. La naturaleza molecular de estos antígenos ha sido enigmática durante mucho tiempo. Sólo tras el desarrollo de técnicas de clonación apropiadas ha sido posible examinar sistemáticamente bibliotecas de expresión de ADNc de tumores para determinar antígenos asociados a tumores analizando las estructuras diana de los linfocitos T citotóxicos (CTL) (van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7, 1991) o utilizando autoanticuerpos circulantes (Sahin et al., Curr. Opin. Immunol. 9:709-16, 1997) como sondas. Para este fin, se prepararon bibliotecas de expresión de ADNc a partir de tejido tumoral reciente y se expresaron de manera recombinante como proteínas en sistemas adecuados. Se utilizaron inmunoefectores aislados de pacientes, concretamente clones de CTL con patrones de lisis específicos de tumores o autoanticuerpos circulantes para clonar los antígenos respectivos.

En los últimos años, se ha definido una multiplicidad de antígenos en diversas neoplasias mediante estos enfoques. En este caso, la clase de antígenos cáncer/testículo (CTA) es de gran interés. Los CTA y los genes que codifican para los mismos (genes cáncer/testículo o CTG) se definen por su patrón de expresión característico [Tureci et al, Mol Med Today. 3:342-9, 1997]. No se encuentran en tejidos normales, excepto en el testículo y las células germinales, pero se expresan en varios malignomas humanos, no específicamente del tipo tumoral sino con diferente frecuencia en entidades tumorales de orígenes muy diferentes (Chen & Old, Cancer J. Sci. Am. 5:16-7, 1999). Los anticuerpos contra CTA no se encuentran en individuos sanos sino en pacientes con tumores. Esta clase de antígenos, en particular debido a su distribución tisular, es particularmente valiosa para proyectos inmunoterapéuticos y se somete a prueba en estudios clínicos con pacientes actuales (Marchand et al., Int. J. Cancer 80:219-30, 1999; Knuth et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46: págs. 46-51, 2000)

Sin embargo, las sondas utilizadas para la identificación de antígenos en los procedimientos clásicos ilustrados anteriormente son inmunoefectores (autoanticuerpos circulantes o clones de CTL) de pacientes que habitualmente presentan ya cáncer avanzado. Varios datos indican que los tumores pueden conducir, por ejemplo a la tolerización y anergización de células T y que, durante el transcurso de la enfermedad, especialmente las especificidades que podrían provocar un reconocimiento inmunitario eficaz se pierden del repertorio inmunoefector. Los estudios con pacientes actuales aún no han producido ninguna prueba sólida de una acción real de lo hallado anteriormente ni han utilizado antígenos asociados a tumores. Por consiguiente, no puede descartarse que las proteínas que provocan respuestas inmunitarias espontáneas sean las estructuras diana erróneas.

El nº de registro de base de datos BQ427878, base de datos EMBL [en línea] 28 de mayo de 2002, el n.º de registro de base de datos AX714011, base de datos EMBL [en línea] 15 de abril de 2003, el n.º de registro de base de datos AK056023, base de datos EMBL [en línea] 31 de octubre de 2001, y el n.º de registro de base de datos Q96N35, base de datos UniProt [en línea] 1 de diciembre de 2001, son entradas en base de datos que dan a conocer secuencias de ácido nucleico y una secuencia de aminoácidos, respectivamente. Nada se declara con respecto a la función o una utilización potencial de estas secuencias. El documento WO 03/076631 describe productos génicos que se expresan de manera diferente en tumores y su utilización. El documento WO 03/000928 describe procedimientos para identificar moléculas que presentan un grado de expresión diferente en la superficie de las células cancerosas con relación a células no malignas.

El objetivo de la presente invención es proporcionar estructuras diana para un diagnóstico y terapia de cánceres.

Según la invención, este objetivo se alcanza mediante el objeto de las reivindicaciones.

Según la invención, se buscó un estrategia para identificar y proporcionar antígenos expresados en asociación con un tumor y los ácidos nucleicos que codifican para los mismos. Esta estrategia se basa en la evaluación de bases de datos de proteínas y ácidos nucleicos humanos con respecto a los potenciales antígenos específicos de cáncer que son accesibles en la superficie celular. La definición de los criterios de filtrado que son necesarios para esto, junto con una metodología de alto rendimiento para analizar todos los genes, si es posible, forman la parte central de la invención. En primer lugar, la minería de datos produce una lista que es tan completa como sea posible de todos los genes conocidos que según el principio básico "gen a ARNm a proteína" se examinan para determinar la presencia de uno o más dominios transmembrana. Esto va seguido por una búsqueda de homología, una clasificación de las coincidencias en grupos específicos de tejido (entre otros, tejido tumoral) y una inspección de la existencia real del ARNm. Finalmente, las proteínas que se identifican de esta manera se evalúan para determinar su activación aberrante en tumores, por ejemplo mediante análisis de expresión y procedimientos químicos para proteínas.

La minería de datos es un procedimiento conocido de identificación de genes asociados a tumores. Sin embargo, en las estrategias convencionales, habitualmente se sustraen electrónicamente los transcriptomas de bibliotecas de tejidos normales de bibliotecas de tejidos tumorales, suponiendo que los genes restantes son específicos de tumor (Schmitt et al., Nucleic Acids Res. 27:4251-60, 1999; Vasmatzis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:300-4, 1998; Scheurle et al., Cancer Res. 60:4037-43, 2000).

Sin embargo, el concepto de la invención se basa en utilizar la minería de datos pare extraer electrónicamente todos los genes que codifican para antígenos específicos de cáncer que son accesibles en las superficies celulares y entonces evaluar dichos genes para determinar su expresión ectópica en tumores.

La estrategia para identificar genes expresados de manera diferencial en tumores combina la minería de datos de bibliotecas de secuencias públicas ("in silico") con posteriores estudios experimentales de laboratorio ("wet bench", banco de trabajo para ensayo por vía húmeda).

Una estrategia combinada basada en diferentes comandos bioinformáticos permitió que se identificaran genes que codifican antígenos específicos de cáncer que son accesibles en las superficies celulares. De este modo se identificaron estos genes asociados a tumores y los productos genéticos codificados, independientemente de una acción inmunogénica.

La propiedad de los antígenos asociados a tumores identificados que están ubicados en o por la superficie celular los califica como dianas adecuadas o medios para la terapia y el diagnóstico. Especialmente adecuado para esto es una parte de los antígenos asociados a tumores identificados que corresponden a la parte que no es transmembrana, en particular la parte extracelular de los antígenos, o que se compone de los mismos. Por tanto, para la terapia o el diagnóstico se prefiere una parte de los antígenos asociados a tumores identificados que corresponde a la parte que no es transmembrana de los antígenos o que se compone de los mismos, o una parte correspondiente de los ácidos nucleicos que codifican para los antígenos identificados. De manera similar, se prefiere la utilización de anticuerpos que se dirigen contra una parte de los antígenos asociados a tumores identificados que corresponde a la parte que no es transmembrana de los antígenos o que se compone de los mismos.

En un aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más componentes seleccionados de entre el grupo constituido por:

(i): un anticuerpo que se une a un antígeno asociado a tumores,

(ii): un antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo que comprende por lo menos 6 aminoácidos contiguos,

(iii): un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo que comprende por lo menos seis aminoácidos contiguos,

(iv): una célula huésped que expresa un antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo que comprende por lo menos seis aminoácidos contiguos y

(v): complejos aislados de un antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo y una molécula de HLA,

\quad: en la que el antígeno asociado a tumores

(a): comprende la secuencia de aminoácidos según SEC ID nº: 10 o

(b): presenta una secuencia que está codificada por un ácido nucleico que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el ácido nucleico según SEC ID nº: 9

para el tratamiento y/o la vacunación frente al cáncer caracterizado por la expresión o la expresión anómala del antígeno asociado a tumores, en la que el cáncer se selecciona de entre el grupo constituido por tumor de mama, tumor de pulmón, tumor de esófago, tumor de colon, tumor de estómago, tumor de páncreas, tumor de hígado, tumor de ovario, tumor de próstata, tumor ORL, tumor renal, tumor de cuello uterino, tumor de piel y tumor uterino.

En una forma de realización preferida, el anticuerpo se une selectivamente al antígeno asociado a tumores, presenta actividad inhibidora de tumores y es selectivo para células que expresan o que expresan de manera anómala el antígeno asociado a tumores.

En una forma de realización preferida, los componentes en (ii), (iii), (iv) y (v) aumentan selectivamente la cantidad de complejos de una molécula de HLA y el antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo.

En una forma de realización preferida, el ácido nucleico en (iii) está presente en un vector de expresión.

En una forma de realización preferida, la célula huésped secreta el antígeno asociado a tumores o el fragmento del mismo. En una forma de realización preferida adicional, la célula huésped expresa adicionalmente una molécula de HLA que se une al antígeno asociado a tumores o el fragmento del mismo, en la que la célula huésped expresa preferentemente la molécula de HLA y/o el antígeno asociado a tumores o el fragmento del mismo de una manera recombinante o expresa la molécula de HLA de manera endógena. Preferentemente, la célula huésped es no proliferativa. Preferentemente, la célula huésped es una célula presentadora de antígeno.

En una forma de realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado o un fragmento de un anticuerpo. Preferentemente, el anticuerpo se acopla a un agente terapéutico o de diagnóstico.

En formas de realización particulares, un antígeno asociado a tumores, proporcionado mediante una composición farmacéutica de la invención o bien directamente o bien mediante la expresión de un ácido nucleico, o bien una parte del mismo se une a moléculas de CMH en la superficie de las células, provocando preferentemente dicha unión una respuesta citolítica y/o induciendo la liberación de citocinas.

Una composición farmacéutica de la invención puede comprender un portador farmacéuticamente compatible y/o un adyuvante. El adyuvante puede seleccionarse de saponina, GM-CSF, oligonucleótidos CpG, ARN, una citocina o una quimiocina.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar una enfermedad cancerosa caracterizada por la expresión o expresión anómala de un antígeno asociado a tumores que comprende la detección de:

(i): un ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado a tumores, y/o

(ii): el antígeno asociado a tumores

\quad: en una muestra biológica aislada de un paciente,

\quad: en el que el antígeno asociado a tumores

(a): comprende la secuencia de aminoácidos según SEC ID nº: 10 o

(b): presenta una secuencia que está codificada por un ácido nucleico que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el ácido nucleico según SEC ID nº: 9,

en la que la enfermedad cancerosa se selecciona de entre el grupo constituido por tumor de mama, tumor de pulmón, tumor de esófago, tumor de colon, tumor de estómago, tumor de páncreas, tumor de hígado, tumor de ovario, tumor de próstata, tumor ORL, tumor renal, tumor de cuello uterino, tumor de piel y tumor uterino.

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En formas de realización particulares, la detección comprende (i) poner en contacto la muestra biológica con un agente que se une específicamente al ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado a tumores o a dicho antígeno asociado a tumores y (ii) detectar la formación de un complejo entre el agente y el ácido nucleico o el antígeno asociado a tumores. En una realización adicional, la muestra biológica aislada del paciente se compara con una muestra biológica normal comparable.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para determinar la regresión, el transcurso o el comienzo de una enfermedad cancerosa caracterizada por la expresión o la expresión anómala de un antígeno asociado a tumores, comprendiendo dicho procedimiento la monitorización de una muestra de un paciente que presenta la enfermedad cancerosa o del que se sospecha que va a desarrollar la enfermedad cancerosa con respecto a uno o más parámetros seleccionados de entre el grupo constituido por:

(i): la cantidad del ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado a tumores y

(ii): la cantidad del antígeno asociado a tumores,

\newpage

\quad: en el que el antígeno asociado a tumores

(a): comprende la secuencia de aminoácidos según SEC ID nº: 10 o

en el que la enfermedad cancerosa se selecciona de entre el grupo constituido por tumor de mama, tumor de pulmón, tumor de esófago, tumor de colon, tumor de estómago, tumor de páncreas, tumor de hígado, tumor de ovario, tumor de próstata, tumor ORL, tumor renal, tumor de cuello uterino, tumor de piel y tumor uterino.

En una forma de realización preferida del procedimiento según el tercer aspecto, el procedimiento comprende la determinación del parámetro o de los parámetros en un primer punto en el tiempo de una primera muestra y un segundo punto en el tiempo en una muestra adicional, en el que el transcurso de la enfermedad cancerosa se determina comparando ambas muestras.

En una forma de realización preferida del procedimiento según los aspectos segundo y tercero, la detección o la monitorización según (i) se efectúa selectivamente amplificando el ácido nucleico o un fragmento del mismo o utilizando una sonda de polinucleótido que se hibride específicamente con el ácido nucleico. En una forma de realización, la sonda de polinucleótido comprende una secuencia de 6-50, particularmente de 10-30, de 15-30 ó 20-30 nucleótidos contiguos del ácido nucleico.

En una forma de realización preferida del procedimiento según los aspectos segundo y tercero, la detección o la monitorización según (ii) se efectúa utilizando un anticuerpo que se une específicamente al antígeno asociado a tumores.

La sonda de polinucleótido o el anticuerpo, que se utilizan para detectar o monitorizar, preferentemente se marcan de una manera detectable. En formas de realización particulares, el marcador detectable es un marcador radiactivo o un marcador enzimático.

En un cuarto aspecto, la invención se refiere a una utilización de un anticuerpo que se une a un antígeno asociado a tumores y que se acopla un agente terapéutico o de diagnóstico para preparar una composición farmacéutica para tratar, diagnosticar, monitorizar una enfermedad cancerosa caracterizada por la expresión o la expresión anómala del antígeno asociado a tumores, en la que el antígeno asociado a tumores

(a): comprende la secuencia de aminoácidos según SEC ID nº: 10 o

En una forma de realización preferida del procedimiento según la invención o la utilización según la invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado, o un fragmento de un anticuerpo.

Los oligonucleótidos que se hibridan con un ácido nucleico identificado según la invención pueden utilizarse como sondas genéticas. La hibridación puede llevarse a cabo con baja rigurosidad, más preferentemente con rigurosidad media y lo más preferentemente con condiciones de alta rigurosidad. La expresión "condiciones rigurosas" según la invención se refiere a las condiciones que permiten una hibridación específica entre polinucleótidos.

Descripción detallada de la invención

Los conceptos terapéuticos contemplan los antígenos asociados a tumores como marcadores que reclutan mecanismos efectores que presentan potencial de daño celular selectivamente a las células tumorales. En este caso, la función de la propia molécula diana y su papel en el desarrollo del tumor son totalmente irrelevantes.

El término "Derivado" de un ácido nucleico significa según la invención que sustituciones, deleciones y/o adiciones de un solo nucleótido o de múltiples nucleótidos están presentes en dicho ácido nucleico. Además, el término "derivado" también comprende la derivatización química de un ácido nucleico en una base, en un azúcar o en un fosfato de un nucleótido. El término "derivado" también comprende ácidos nucleicos que contienen nucleótidos y análogos de nucleótidos que no se producen de forma natural.

Según la invención, un ácido nucleico preferentemente es ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Los ácidos nucleicos comprenden según la invención, ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas producidas de manera recombinante o sintetizadas químicamente. Según la invención, un ácido nucleico puede estar presente como una molécula monocatenaria o bicatenaria, y lineal o cerrada covalentemente de manera circular.

Según la invención preferentemente se han aislado los ácidos nucleicos descritos. La expresión "ácido nucleico aislado" significa según la invención que el ácido nucleico (i) se amplificó in vitro, por ejemplo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo de manera recombinante mediante clonación, (iii) se purificó, por ejemplo mediante escisión y fraccionamiento electroforético en gel, o (iv) se sintetizó, por ejemplo mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que está disponible para su manipulación mediante técnicas de ADN recombinante.

Un ácido nucleico es "complementario" a otro ácido nucleico si las dos secuencias pueden hibridarse y formar un dúplex estable entre sí, llevándose a cabo la hibridación preferentemente en condiciones que permitan una hibridación específica entre polinucleótidos (condiciones rigurosas). Las condiciones rigurosas se describen por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editores, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editores, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York y se refieren, por ejemplo, a la hibridación a 65ºC en tampón de hibridación (3,5 x SSC, Ficoll al 0,02%, polivinilpirrolidona al 0,02%, albúmina sérica bovina al 0,02%, NaH_{2}PO_{4} 2,5 mM (pH 7), SDS al 0,5%, EDTA 2 mM). SSC es cloruro de sodio 0,15 M/citrato de sodio 0,15 M, pH 7. Tras la hibridación, se lava la membrana a la que se ha transferido el ADN, por ejemplo, en 2 x SSC a temperatura ambiente y entonces en 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas de hasta 68ºC.

Según la invención, los ácidos nucleicos complementarios presentan por lo menos el 40%, en particular por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 80%, por lo menos el 90% y preferentemente por lo menos el 95%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99%, de nucleótidos idénticos.

Los ácidos nucleicos que codifican para antígenos asociados a tumores pueden, según la invención, estar presentes solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos heterólogos. En formas de realización preferidas, un ácido nucleico se une funcionalmente a secuencias de control de la expresión o secuencias reguladoras que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico. Una secuencia codificante y una secuencia reguladora se unen "funcionalmente" entre sí, si se unen covalentemente entre sí de tal manera que la expresión o trascripción de dicha secuencia codificante está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia reguladora. Si la secuencia codificante va a transcribirse en una proteína funcional, entonces, con una secuencia reguladora unida funcionalmente a dicha secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia reguladora da como resultado la trascripción de dicha secuencia codificante, sin provocar un desplazamiento del marco de lectura en la secuencia codificante o sin que dicha secuencia codificante pueda traducirse en la proteína o péptido deseado.

La expresión "secuencia de control de la expresión" o "secuencia reguladora" comprende, según la invención, promotores, potenciadores y otros elementos de control que regulan la expresión de un gen. En formas de realización particulares de la invención, las secuencias de control de la expresión pueden estar reguladas. La estructura exacta de las secuencias reguladoras puede variar como una función de la especie o el tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias en 5' no trascritas y en 5' no traducidas que están implicadas en la iniciación de la trascripción y la traducción, respectivamente, tales como la caja TATA, secuencias de ocupación de extremos, secuencia CAAT, y similares. Más específicamente, las secuencias reguladoras en 5' no trascritas comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido funcionalmente. Las secuencias reguladoras también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en el sentido de 5'.

Por tanto, por un lado, los antígenos asociados a tumores ilustrados en la presente memoria pueden combinarse con cualquier secuencia de control de la expresión y promotor. Por otro lado, sin embargo, los promotores de productos genéticos asociados a tumores ilustrados en la presente memoria pueden, según la invención, combinarse con cualquier otro gen. Esto permite la actividad selectiva de estos promotores que van a utilizarse.

Según la invención, un ácido nucleico puede estar presente además en combinación con otro ácido nucleico que codifica para un polipéptido que controla la secreción de la proteína o polipéptido codificado por dicho ácido nucleico de una célula huésped. Según la invención, un ácido nucleico también puede estar presente en combinación con otro ácido nucleico que codifica para un polipéptido que provoca que la proteína o polipéptido codificado se ancle en la membrana celular de la célula huésped o que se compartimentalice en orgánulos particulares de dicha célula.

En una forma de realización preferida, una molécula de ADN recombinante es según la invención un vector, cuando sea apropiado con un promotor, que controla la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado a tumores de la invención. El término "vector" se utiliza en este caso en su significado más general y comprende cualquier vehículo intermediario para un ácido nucleico que permita que dicho ácido nucleico, por ejemplo, se introduzca en células procariotas y/o eucariotas y, cuando sea apropiado, que se integre en un genoma. Los vectores de este tipo preferentemente se replican y/o se expresan en las células. Puede adaptarse un vehículo intermediario, por ejemplo, para la utilización en electroporación, en el bombardeo con microproyectiles, en la administración liposomal, en la transferencia con la ayuda de agrobacterias o en la inserción mediante virus de ADN o ARN. Los vectores comprenden plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas virales.

Los ácidos nucleicos que codifican para un antígeno asociado a tumores identificado según la invención pueden utilizarse para la transfección de células huésped. Los ácidos nucleicos en este caso significan tanto ARN como ADN recombinante. El ARN recombinante puede prepararse mediante trascripción in vitro de un molde de ADN. Además, puede modificarse mediante secuencias estabilizantes, ocupación de extremos y poliadenilación antes de su aplicación.

Según la invención, la expresión "célula huésped" se refiere a cualquier célula que puede transformarse o transfectarse con un ácido nucleico exógeno. La expresión "células huésped" comprende según la invención células procariotas (por ejemplo, E. coli) o eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células de levaduras y células de insectos). Se da preferencia particular a las células de mamíferos tales como células de seres humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras, primates. Las células pueden derivarse de una multiplicidad de tipos de tejido y comprenden células primarias y líneas celulares. Ejemplo específicos comprenden queratinocitos, leucocitos de sangre periférica, células madre de la médula ósea y células madre embrionarias. En las formas de realización adicionales, la célula huésped es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago. Un ácido nucleico puede estar presente en la célula huésped en forma de una sola copia o de dos o más copias, y en una realización, se expresa en la célula huésped.

Según la invención, el término "expresión" se utiliza en su significado más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede llevarse a cabo de manera transitoria o de manera estable. Los sistemas de expresión preferidos en células de mamíferos comprenden pcDNA3.1 y pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contienen un marcador selectivo tal como un gen que confiere resistencia a G418 (y permitiendo así que se seleccionen líneas celulares transfectadas de manera estable) y las secuencias potenciadoras-promotoras de citomegalovirus (CMV).

En los casos de la invención en los que una molécula de HLA presenta un antígeno asociado a tumores o una parte del mismo, un vector de expresión también puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha molécula de HLA. La secuencia de ácido nucleico que codifica para la molécula de HLA puede estar presente en el mismo vector de expresión como el ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado a tumores o la parte del mismo, o pueden estar presentes ambos ácidos nucleicos en diferentes vectores de expresión. En este último caso, los dos vectores de expresión pueden cotransfectarse en una célula. Si una célula huésped no expresa ni el antígeno asociado a tumores o la parte del mismo ni la molécula de HLA, ambos ácidos nucleicos que codifican para los mismos se transfectan en la célula o bien en el mismo vector de expresión o bien en vectores de expresión diferentes . Si la célula ya expresa la molécula de HLA, sólo puede transfectarse en la célula la secuencia del ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado a tumores o la parte del mismo.

Los kits para la amplificación de un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado a tumores comprenden, por ejemplo, un par de cebadores de amplificación que se hibridan con el ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado a tumores. Los cebadores comprenden preferentemente una secuencia de 6-50, en particular 10-30, 15-30 y 20-30 nucleótidos contiguos del ácido nucleico y no son solapantes, con el fin de evitar la formación de dímeros de cebadores. Uno de los cebadores se hibridará con una cadena del ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado a tumores, y el otro cebador se hibridará con la cadena complementaria en una disposición que permita la amplificación del ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado a tumores.

Preferentemente, un oligonucleótido consiste en ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o una combinación de los mismos, uniéndose entre sí el extremo 5' de un nucleótido y el extremo 3' del otro nucleótido mediante un enlace fosfodiéster. Estos oligonucleótidos pueden sintetizarse de la manera convencional o producirse de manera recombinante.

Preferentemente, un oligonucleótido es un oligonucleótido "modificado". En este caso, el oligonucleótido puede modificarse de maneras muy diferentes, sin perjudicar su capacidad de unión a su diana, con el fin de aumentar, por ejemplo su estabilidad. Según la invención, la expresión "oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido en el que (i) por lo menos dos de sus nucleótidos se unen entre sí mediante un enlace internucleósido sintético (es decir, un enlace internucleósido que no es un enlace fosfodiéster) y/o (ii) un grupo químico que habitualmente no se encuentra en ácidos nucleicos está unido covalentemente al oligonucleótido. Los enlaces internucleósidos sintéticos preferidos son fosfotionatos, alquilfosfonatos, fosforoditioatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, ésteres carboximetílicos y péptidos.

La expresión "oligonucleótido modificado" también comprende oligonucleótidos que presenta una base y/o azúcar modificado covalentemente. Los "oligonucleótidos modificados" comprenden, por ejemplo, oligonucleótidos con residuos de azúcar que se unen covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos a un grupo hidroxilo en la posición 3' y un grupo fosfato en la posición 5'. Los oligonucleótidos modificados pueden comprender, por ejemplo un residuo de ribosa 2'-O-alquilada u otro azúcar en vez de ribosa, tal como arabinosa.

Preferentemente, se han aislado las proteínas y los polipéptidos descritos según la invención. Las expresiones "proteína aislada" o "polipéptido aislado" significan que se ha separado la proteína o el polipéptido de su entorno natural. Una proteína o polipéptido aislado puede estar en un estado esencialmente purificado. La expresión "esencialmente purificado" significa que la proteína o el polipéptido está esencialmente libre de otras sustancias con la que se asocia en la naturaleza o in vivo.

Dichas proteínas y polipéptidos pueden utilizarse, por ejemplo, en la producción de anticuerpos y en un ensayo inmunológico o de diagnóstico o como agentes terapéuticos. Las proteínas y polipéptidos descritos según la invención pueden aislarse de muestras biológicas tales como homogeneizados tisulares o celulares y también pueden expresarse de manera recombinante en una multiplicidad de sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos.

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Para los objetivos de la presente invención, los "derivados" de una proteína o un polipéptido o de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden fusiones amino- y/o carboxi-terminales y también inserciones de uno solo o de dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de las variantes de secuencia de aminoácidos que presentan una inserción, uno o más residuos de aminoácidos se insertan en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible la inserción al azar con la selección apropiada del producto resultante. Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por por lo menos un residuo en la secuencia que se elimina y otro residuo que se inserta en su lugar. Se da preferencia a las modificaciones que están en las posiciones en la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre las proteínas o polipéptidos homólogos. Se da preferencia al reemplazo de aminoácidos por otros que presentan propiedades similares tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, electronegatividad, volumen de la cadena lateral y similares (sustitución conservativa). Las sustituciones conservativas, por ejemplo, se refieren al intercambio de un aminoácido por otro aminoácido enumerado a continuación en el mismo grupo que el aminoácido que va a sustituirse:

1.: residuos pequeños alifáticos, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly)

2.: residuos cargados negativamente y sus amidas: Asn, Asp, Glu, Gln

3.: residuos cargados positivamente: His, Arg, Lys

4.: residuos grandes alifáticos, no polares: Met, Leu, Ile, Val (Cys)

5.: residuos grandes aromáticos: Phe, Tyr, Trp.

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Debido a su papel particular en la arquitectura de la proteína, se muestran tres residuos entre paréntesis. Gly es el único residuo sin una cadena lateral y por tanto confiere flexibilidad a la cadena. Pro presenta una geometría inusual que restringe enormemente la cadena, Cys puede formar un puente disulfuro.

Las variantes de aminoácidos descritas anteriormente pueden prepararse fácilmente con la ayuda de las técnicas de síntesis de péptidos conocidas tales como, por ejemplo, mediante la síntesis en fase sólida (Merrifield, 1964) y procedimientos similares o mediante la manipulación de ADN recombinante. Las técnicas para introducir mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN que presenta una secuencia conocida o parcialmente conocida se conocen bien y comprenden mutagénesis M13, por ejemplo. La manipulación de secuencias de ADN para preparar proteínas que presentan sustituciones, inserciones o deleciones, se describen en detalle en Sambrook et al. (1989), por ejemplo.

Según la invención, los "derivados" de proteínas o polipéptidos también comprenden sustituciones, deleciones y/o adiciones individuales o múltiples de cualquier molécula asociada con la enzima, tales como hidratos de carbono, lípidos y/o proteínas o polipéptidos. El término "derivado" también se extiende a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas o polipéptidos.

Según la invención, una parte o un fragmento de un antígeno asociado a tumores presenta una propiedad funcional del polipéptido del cual se ha derivado. Dichas propiedades funcionales comprenden la interacción con anticuerpos, la interacción con otros polipéptidos o proteínas, la unión selectiva de ácidos nucleicos y una actividad enzimática. Una propiedad particular es la capacidad de formar un complejo con HLA y, cuando sea apropiado, generar una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede basarse en estimular células citotóxicas o células T cooperadoras. Una parte o un fragmento de un antígeno asociado a tumores de la invención comprende preferentemente una secuencia de por lo menos 6, en particular por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 30 o por lo menos 50, aminoácidos consecutivos del antígeno asociado a tumores. Una parte o un fragmento de un antígeno asociado a tumores es preferentemente una parte del antígeno asociado a tumores que corresponde a la parte que no es transmembrana, en particular la parte extracelular o se compone de la misma.

Una parte o un fragmento de un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado a tumores se refiere, según la invención, a la parte del ácido nucleico, que codifica por lo menos para el antígeno asociado a tumores y/o para una parte o un fragmento de dicho antígeno asociado a tumores, tal como se definió anteriormente. Preferentemente, una parte o un fragmento de un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado a tumores es la parte que corresponde al marco de lectura abierto, en particular tal como se indica en la lista de secuencias.

Los ácidos nucleicos que codifican para antígenos asociados a tumores pueden determinarse de la manera convencional, incluyendo mediante la reacción en cadena de la polimerasa o hibridación con una sonda marcada. Los antígenos asociados a tumores pueden determinarse mediante la selección de antisueros del paciente con respecto al reconocimiento del antígeno. También pueden determinarse mediante selección de células T del paciente para determinar especificidades para el correspondiente antígeno asociado a tumores.

Pueden utilizarse sustancias tales como polipéptidos que se unen a antígenos asociados a tumores, por ejemplo, en ensayos de selección para detectar antígenos asociados a tumores y complejos de antígenos asociados a tumores con sus parejas de unión y en una purificación de dichos antígenos asociados a tumores y de complejos de los mismos con sus parejas de unión. También pueden utilizarse tales sustancias para inhibir la actividad de antígenos asociados a tumores, por ejemplo mediante la unión a tales antígenos.

Las sustancias de unión que pueden unirse selectivamente a antígenos asociados a tumores comprenden anticuerpos policlonales y monoclonales que se producen de la manera convencional.

Se conoce que sólo una parte pequeña de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está implicada en la unión del anticuerpo a su epítopo (véase Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., Nueva York; Roitt, l. (1991), Essential Immunology, 7ª edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc' y Fc son, por ejemplo, efectores de la cascada del complemente pero no están implicadas en la unión a antígenos. Un anticuerpo del cual se ha eliminado enzimáticamente la región pFc' o que se ha producido sin la región pFc', denominado fragmento F(ab')_{2}, lleva ambos sitios de unión a antígenos de un anticuerpo completo. De manera similar, un anticuerpo del cual se ha eliminado enzimáticamente la región Fc o que se ha producido sin dicha región Fc, denominado fragmento Fab, lleva un sitio de unión a antígenos de una molécula de anticuerpo intacto. Además, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera unida covalentemente de un anticuerpo y parte de cadena pesada de dicho anticuerpo, denominado Fd. Los fragmentos de Fd son los principales determinantes de la especificidad del anticuerpo (un solo fragmento Fd puede asociarse con hasta diez cadenas ligeras diferentes, sin alterar la especificidad del anticuerpo), y los fragmentos Fd, cuando se aíslan, retienen la capacidad de unirse a un epítopo.

Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están ubicadas dentro de la parte de unión a antígenos de un anticuerpo que interacciona directamente con el epítopo antigénico y las regiones de entramado (FR) que mantienen la estructura terciaria del paratopo. Tanto el fragmento Fd de la cadena pesada como la cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG contienen cuatro regiones de entramado (FR1 a FR4) que se separan en cada caso mediante tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3). Las CDR y, en particular, las regiones CDR3 y, todavía más particularmente, la región CDR3 de la cadena pesada son responsables en gran medida de la especificidad del anticuerpo.

Se sabe que las regiones que no son CDR de un anticuerpo de mamífero pueden reemplazarse por regiones similares de anticuerpos con la misma especificidad o una especificidad diferente, reteniéndose la especificidad por el epítopo del anticuerpo original. Esto hace posible el desarrollo de anticuerpos "humanizados" en los que las CRD no humanas se unen covalentemente a regiones FR y/o Fc/pFc' humanas para producir un anticuerpo funcional.

Por ejemplo, el documento WO 92/04381 describe la producción y utilización de anticuerpos contra VRS murinos humanizados en los que por lo menos parte de las regiones FR murinas se han reemplazado por regiones FR de un origen humano. Los anticuerpos de este tipo, incluyendo fragmentos de anticuerpos intactos con capacidad de unión a antígenos, a menudo se denominan anticuerpos "quiméricos".

La invención también contempla fragmentos F(ab')_{2}, Fab, Fv y Fd de anticuerpos, anticuerpos quiméricos, en los que se han reemplazado las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera por secuencias humanas o no humanas homólogas, anticuerpos de fragmentos F(ab')_{2} quiméricos en los que se han reemplazado las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera por secuencias humanas o no humanas homólogas, anticuerpos de fragmentos Fab quiméricos en los que se han reemplazado las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera por secuencias humanas o no humanas homólogas, y anticuerpos de fragmentos Fd quiméricos en los que se han reemplazado las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 por secuencias humanas o no humanas homólogas. La invención también contempla anticuerpos de "cadena sencilla".

Preferentemente, un anticuerpo utilizado según la invención se dirige contra una de las secuencias según SEC ID nº: 10, 17 y 18, o una parte o un derivado de las mismas y/o puede obtenerse mediante inmunización utilizando estos péptidos.

Los polipéptidos que se unen específicamente a antígenos asociados a tumores pueden proporcionarse, por ejemplo degenerando bibliotecas de péptidos que pueden prepararse simplemente en disolución en forma inmovilizada o como bibliotecas de exposición en fago. Asimismo es posible preparar bibliotecas combinatorias de péptidos con uno o más aminoácidos. También pueden prepararse bibliotecas de peptoides y de residuos sintéticos no peptídicos.

La exposición en fago puede ser particularmente eficaz en la identificación de péptidos de unión. A este respecto, por ejemplo, se prepara una biblioteca de fagos (utilizando, por ejemplo, los fagos M13, fd o lambda) que presenta insertos de desde 4 hasta aproximadamente 80 residuos de aminoácido de longitud. Entonces, se seleccionan los fagos que llevan insertos que se unen al antígeno asociado a tumores. Este proceso puede repetirse mediante dos o más ciclos de una nueva selección de fagos que se unen al antígeno asociado a tumores. Rondas sucesivas dan como resultado una concentración de fagos que llevan secuencias particulares. Puede llevarse a cabo un análisis de las secuencias de ADN con el fin de identificar las secuencias de los polipéptidos expresados. Puede determinarse la parte lineal más pequeña de la secuencia que se une al antígeno asociado a tumores. El "sistema de dos híbridos" de levaduras también puede utilizarse para identificar los polipéptidos que se unen a un antígeno asociado a tumores. Pueden utilizarse antígenos asociados a tumores o fragmentos de los mismos para examinar bibliotecas de péptidos, incluyendo bibliotecas de exposición en fago, con el fin de identificar y seleccionar parejas de unión peptídicas de los antígenos asociados a tumores. Dichas moléculas pueden utilizarse, por ejemplo para ensayos de selección, protocolos de purificación, para interferencia con la función del antígeno asociado a tumores y para otros fines conocidos por el trabajador experto.

Pueden utilizarse los anticuerpos descritos anteriormente y otras moléculas de unión, por ejemplo, para identificar tejido que expresa un antígeno asociado a tumores. Los anticuerpos también pueden acoplarse a sustancias de diagnóstico específicas para exponer células y tejidos que expresan antígenos asociados a tumores. También pueden acoplarse a sustancias terapéuticamente útiles. Las sustancias de diagnóstico comprenden, de manera no limitativa, sulfato de bario, ácido iocetámico, ácido iopanoico, ipodato de calcio, diatrizoato de sodio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato de sodio y radiodiagnóstico, incluyendo emisores de positrones tales como flúor-18 y carbono-11, emisores gamma tales como yodo-123, tecnecio-99m, yodo-131 e indio-111, nucleidos para resonancia magnética nuclear, tal como flúor y gadolinio. Según la invención, la expresión "sustancia terapéuticamente útil" significa cualquier molécula terapéutica que, tal como se desea, se guía selectivamente hasta una célula que expresa uno o más antígenos asociados a tumores, incluyendo agentes anticancerígenos, compuestos marcados con yodo radiactivo, toxinas, fármacos citostáticos o citolíticos, etc. Los agentes anticancerígenos comprenden, por ejemplo, aminoglutetimida, azatioprina, sulfato de bleomicina, busulfano, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, ciclosporina, citarabidina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubina, doxorubicina, taxol, etopósido, fluorouracilo, interferón-\alpha, lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, procarbazina HCl, tioguanina, sulfato de vinblastina y sulfato de vincristina. Otros agentes anticancerígenos se describen por ejemplo, en Goodman y Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8ª edición, 1990, MCGraw-Hill, Inc., en particular el capítulo 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi y Bruce A. Chabner). Las toxinas pueden ser proteínas tales como proteína antiviral de hierba carmín, toxina del cólera, toxina de la tos ferina, ricina, gelonina, abrina, exotoxina de difteria o exotoxina de Pseudomonas. Los residuos de toxina también pueden ser radionucleidos emisores de alta energía tales como cobalto-60.

El término "paciente" significa según la invención un ser humano, un primate no humano u otro animal, en particular un mamífero tal como una vaca, un caballo, un cerdo, una oveja, una cabra, un perro, un gato o un roedor tal como un ratón y una rata. En una forma de realización particularmente preferida, el paciente es un ser humano.

La expresión "Expresión anómala" significa según la invención que la expresión está alterada, preferentemente aumentada, en comparación con el estado en un individuo sano. Un aumento en la expresión hace referencia a un aumento en por lo menos un 10%, en particular por lo menos un 20%, por lo menos un 50% o por lo menos un 100%. En una forma de realización, el antígeno asociado a tumores se expresa sólo en el tejido de un individuo enfermo, mientras que se reprime la expresión en un individuo sano.

Según la invención, una muestra biológica puede ser una muestra de tejido y/o una muestra celular y puede obtenerse de la manera convencional tal como biopsia de tejido, incluyendo biopsia en sacabocados, y tomando sangre, aspirado bronquial, orina, heces y otros fluidos corporales, para su utilización en los diversos procedimientos descritos en la presente memoria.

Según la invención, la expresión "célula inmunorreactiva" significa una célula que puede madurar en una célula inmunitaria (tal como célula B, célula T cooperadora o célula T citolítica) con una estimulación adecuada. Las células inmunorreactivas comprenden células madre hematopoyéticas CD34^{+}, células T maduras e inmaduras y células B maduras e inmaduras. Si se desea la producción de células T citolíticas o cooperadoras que reconocen un antígeno asociado a tumores, se pone en contacto la célula inmunorreactiva con una célula que expresa un antígeno asociado a tumores en condiciones que favorecen la producción, diferenciación y/o selección de células T citolíticas y de células T cooperadoras. La diferenciación de los precursores de células T en una célula T citolítica, cuando se expone a un antígeno, es similar a la selección clonal del sistema inmunitario.

Algunos procedimientos terapéuticos se basan en una reacción del sistema inmunitario del paciente, que da como resultado una lisis de células presentadoras de antígeno tales como células cancerosas que presentan uno o más antígenos asociados a tumores. A este respecto, por ejemplo se administran linfocitos T citotóxicos autólogos específicos para un complejo de un antígeno asociado a tumores y una molécula de CMH a un paciente que presenta una anomalía celular. Se conoce la producción de tales linfocitos T citotóxicos in vitro. Un ejemplo de un procedimiento de diferenciación de células T puede encontrarse en el documento WO-A-96/33265. Generalmente, se toma de un paciente una muestra conteniendo células tales como células sanguíneas y se ponen en contacto las células con una célula que presenta el complejo y que puede provocar la propagación de linfocitos T citotóxicos (por ejemplo, células dendríticas). La célula diana puede ser una célula transfectada tal como una célula COS. Estas células transfectadas presentan el complejo deseado en su superficie y, cuando se ponen en contacto con linfocitos T citotóxicos, estimulan la propagación de estos últimos. Entonces, se administran al paciente los linfocitos T citotóxicos autólogos expandidos de manera clonal.

En otro procedimiento de selección de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno, se utilizan tetrámeros fluorogénicos de complejos de molécula de CMH de clase I/péptido para detectar clones específicos de linfocitos T citotóxicos (Altman et al., Science 274:94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. BioI., 8:413-416, 1998). Las moléculas de CMH de clase I solubles se pliegan in vitro en presencia de microglobulina \beta_{2} y un antígeno peptídico que se une a dicha molécula de clase I. Se purifican los complejos de CMH/péptido y entonces se marcan con biotina. Se forman tetrámeros mezclando los complejos de péptido-CMH biotinilados con avidina marcada (por ejemplo, ficoeritrina) en una razón molar de 4:1. Entonces se ponen en contacto los tetrámeros con linfocitos T citotóxicos tales como de sangre periférica o ganglios linfáticos. Los tetrámeros se unen a los linfocitos T citotóxicos que reconocen el complejo de antígeno peptídico/CMH de clase I. Las células que se unen a los tetrámeros pueden clasificarse mediante clasificación de células controlada por fluorescencia para aislar linfocitos T citotóxicos reactivos. Entonces, los linfocitos T citotóxicos aislados pueden propagarse in vitro.

En un procedimiento terapéutico denominado transferencia adoptiva (Greenberg, J. Immunol. 136(5):1917, 1986; Riddel et al., Science 257: 238, 1992; Lynch et al., Eur. J. Immunol. 21:1403-1410, 1991; Kast et al., Cell 59:603-614, 1989), se combinan células que presentan el complejo deseado (por ejemplo, células dendríticas) con linfocitos T citotóxicos del paciente que va a tratarse, dando como resultado una propagación de linfocitos T citototóxicos específicos. A continuación, se administran los linfocitos T citotóxicos propagados al paciente que presenta una anomalía celular caracterizada por células anómalas particulares que presentan el complejo específico. Entonces, los linfocitos T citotóxico lisan las células anómalas, logrando de ese modo un efecto terapéutico deseado.

A menudo, del repertorio de células T de un paciente, pueden propagarse sólo células T con baja afinidad por un complejo específico de este tipo, dado que se han extinguido aquellas con alta afinidad debido al desarrollo de tolerancia. Una alternativa en este caso puede ser una transferencia del propio receptor de células T. Para esto también, se combinan células que presentan el complejo deseado (por ejemplo, células dendríticas) con linfocitos T citotóxicos de individuos sanos. Esto da como resultado la propagación de linfocitos T citotóxicos específicos con alta afinidad si el donante no ha tenido un contacto previo con el complejo específico. Se clona el receptor de células T de alta afinidad de estos linfocitos T específicos propagados y puede transducirse mediante transferencia génica, por ejemplo utilizando vectores retrovirales, en las células T de otros pacientes, tal como se desee. Entonces, se lleva a cabo la transferencia adoptiva utilizando estos linfocitos T genéticamente alterados (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2: 962-70, 2001; Kessels et al., Nat Immunol. 2:957-61, 2001).

Los aspectos terapéuticos anteriores parten del hecho de que por lo menos algunas de las células anómalas del paciente presentan un complejo de un antígeno asociado a tumores y una molécula de HLA. Tales células pueden identificarse de una manera conocida per se. En cuanto se han identificado las células que presentan el complejo, pueden combinarse con una muestra del paciente, que contiene linfocitos T citotóxicos. Si los linfocitos T citotóxicos lisan las células que presentan el complejo, puede suponerse que se presenta un antígeno asociado a tumores.

La transferencia adoptiva no es la única forma de terapia que puede aplicarse. También pueden generarse in vivo linfocitos T citotóxicos de una manera conocida per se. Un procedimiento utiliza células no proliferativas que expresan el complejo. Las células utilizadas en este caso serán aquellas que habitualmente expresan el complejo, tales como células tumorales irradiadas o células transfectadas con uno o ambos genes necesarios para la presentación del complejo (es decir, el péptido antigénico y la molécula HLA presentadora). Pueden utilizarse diversos tipos de células. Además, es posible utilizar vectores que llevan uno o ambos genes de interés. Se da preferencia particular a vectores virales o bacterianos. Por ejemplo, ácido nucleicos que codifican para un antígeno asociado a tumores o para una parte del mismo pueden unirse funcionalmente a secuencias promotoras y potenciadoras que controlan la expresión de dicho antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo en tipos de tejidos o células particulares. Puede incorporarse el ácido nucleico en un vector de expresión. Los vectores de expresión pueden ser ácidos nucleicos extracromosómicos no modificados, plásmidos o genomas virales en los que pueden insertarse ácidos nucleicos exógenos. También pueden insertarse ácido nucleicos que codifican para un antígeno asociado a tumores en un genoma retroviral, permitiendo de ese modo que el ácido nucleico se integre en el genoma del tejido diana o célula diana. En estos sistemas, un microorganismo tal como virus Vaccinia, virus de la viruela, virus del herpes simple, retrovirus o adenovirus, lleva el gen de interés y de hecho "infecta" las células huésped. Otra forma preferida es la introducción del antígeno asociado a tumores en forma de ARN recombinante que puede introducirse en las células mediante transferencia liposomal o mediante electroporación, por ejemplo. Las células resultantes presentan el complejo de interés y las reconocen linfocitos T citotóxicos autólogos que luego se propagan.

Puede lograrse un efecto similar combinando el antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo con un adyuvante con el fin de hacer posible la incorporación en las células presentadoras de antígeno in vivo. El antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo puede representarse como proteína, como ADN (por ejemplo dentro de un vector) o como ARN. El antígeno asociado a tumores se procesa para producir una pareja peptídica para la molécula de HLA, mientras que un fragmento del mismo puede presentarse sin la necesidad de procesamiento adicional. Este último es el caso en particular, si estos pueden unirse a moléculas de HLA. Se da preferencia a las formas de administración en las que el antígeno completo se procesa in vivo en una célula dendrítica, dado que esta también puede producir respuestas de células T cooperadoras que se necesitan para una respuesta inmunitaria eficaz (Ossendorp et al, Immunol Lett. 74:75-9, 2000; Ossendorp et al., J. Exp. Med. 187:693-702, 1998). En general, es posible administrar una cantidad eficaz del antígeno asociado a tumores a un paciente mediante inyección intradérmica, por ejemplo. Sin embargo, la inyección también puede llevarse a cabo por vía intraganglionar en un ganglio linfático (Maloy et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303, 2001). Esto también puede llevarse a cabo en combinación con reactivos que facilitan la captación en las células dendríticas. Los antígenos asociados a tumores preferidos comprenden aquellos que reaccionan con antisueros contra el cáncer alogénicos o con células T de muchos pacientes con cáncer. De particular interés, sin embargo, son aquellos frente a los que preexisten respuestas inmunitarias no espontáneas. Evidentemente, es posible inducir estas respuestas inmunitarias que pueden lisar tumores (Keogh et al., J. Immunol. 167:787-96, 2001; Appella et al., Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1:177-84, 1995; Wentworth et al., Mol Immunol. 32:603-12, 1995).

Las composiciones farmacéuticas descritas según la invención también pueden utilizarse como vacunas para la inmunización. Según la invención, los términos "inmunización" o "vacunación" significan un aumento en o la activación de una respuesta inmunitaria frente a un antígeno. Es posible utilizar modelos de animales para someter a prueba un efecto de inmunización en cáncer utilizando un antígeno asociado a tumores o un ácido nucleico que codifica para el mismo. Por ejemplo, las células cancerosas humanas pueden introducirse en un ratón para generar un tumor, y pueden administrarse uno o más ácidos nucleicos que codifican para antígenos asociados a tumores. El efecto sobre las células cancerosas (por ejemplo, la reducción en el tamaño del tumor) puede medirse como una medida para la eficacia de una inmunización mediante el ácido nucleico.

Como parte de la composición para una inmunización, se administran uno o más antígenos asociados a tumores o fragmentos estimulantes de los mismos junto con uno o más coadyuvantes para inducir una respuesta inmunitaria o para aumentar una respuesta inmunitaria. Un adyuvante es una sustancia que se incorpora en el antígeno o se administra junto con este último y que mejora la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes pueden mejorar la respuesta inmunitaria proporcionando un reservorio de antígenos (de forma extracelular o en macrófagos), activando macrófagos y estimulando linfocitos particulares. Los adyuvantes se conocen y comprenden de manera no limitativa monofosforil-lípido A (MPL, SmithKline Beecham), saponinas tales como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; documento WO 96/33739) QS7, QS17, QS18 y QS-L1 (So et al., Mol. Cells 7:178-186, 1997), adyuvante incompleto de Freund, adyuvante completo de Freund, vitamina E, montanida, alumbre, oligonucleótidos CpG (véase Krieg et al., Nature 374:546-9, 1995) y diversas emulsiones de agua en aceite preparadas a partir de aceites biológicamente degradables tales como escualeno y/o tocoferol. Preferentemente, los péptidos se administran en una mezcla con DQS21/MPL. La razón de DQS21 con respecto a MPL normalmente es de aproximadamente 1:10 a 10:1, preferentemente de aproximadamente 1:5 a 5:1 y en particular de aproximadamente 1:1. Para la administración a seres humanos, una formulación de vacuna normalmente contiene DQS21 y MPL en un intervalo de desde aproximadamente 1 \mug hasta aproximadamente 100 \mug.

También pueden administrarse otras sustancias que estimulan una respuesta inmunitaria del paciente. Es posible, por ejemplo, utilizar citocinas en una vacunación, debido a sus propiedades reguladoras sobre los linfocitos. Tales citocinas comprenden, por ejemplo, interleucina 12 (IL-12) que se mostró que aumentaba las acciones protectoras de las vacunas (véase Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF e IL-18.

Existen varios compuestos que potencian una respuesta inmunitaria y que, por tanto, pueden utilizarse en una vacunación. Dichos compuestos comprenden moléculas coestimuladoras en forma de proteínas o ácidos nucleicos. Ejemplos de tales moléculas coestimuladoras son B7-1 y B7-2 (CD80 y CD86, respectivamente) que se expresan en células dendríticas (DC) e interaccionan con la molécula de CD28 expresada en las células T. Esta interacción proporciona una coestimulación (señal 2) para una célula T estimulada con antígeno/CMH/TCR (señal 1), potenciando de esa manera la propagación de dicha célula T y la función efectora. B7 también interacciona con CTLA4 (CD125) en células T, y estudios que implican ligandos B7 y CTLA4 demuestran que la interacción B7-CTLA4 puede potenciar la inmunidad antitumoral y la propagación de CTL (Zheng, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 (11): 6284-6289 (1998)).

Normalmente B7 no se expresa en células tumorales de modo que no son células presentadoras de antígeno (APC) eficaces para las células T. La inducción de la expresión de B7 permitiría que las células tumorales estimulasen la propagación más eficaz de linfocitos T citotóxicos y una función efectora. La coestimulación mediante una combinación de B7/IL-6/IL-12 reveló la inducción de perfil de citocinas Th1 e IFN-gamma en una población de células T, dando como resultado una actividad de células T potenciada adicionalmente (Gajewski et al., J. Immunol. 154 :5637-5648 (1995)).

Una activación completa de linfocitos T citotóxicos y una función efectora completa requieren una participación de células T auxiliares mediante la interacción entre el ligando de CD40 en dichas células T cooperadoras y la molécula de CD40 expresada por células dendríticas (Ridge et al., Nature 393:474 (1998), Bennett et al., Nature 393:478 (1998), Schönberger et al., Nature 393:480 (1998)). El mecanismo de esta señal de coestimulación probablemente se relaciona con el aumento en la producción de B7 y la producción asociada de IL6/IL12 por dichas células dendríticas (células presentadoras de antígeno). La interacción CD40-CD40L complementa así la interacción de señal 1 (antígeno/CMH-TCR) y señal 2 (B7-CD28).

Se esperaría que la utilización de anticuerpos anti-CD40 para estimular células dendríticas potenciara directamente una respuesta frente a los antígenos tumorales que habitualmente están fuera del intervalo de una respuesta inflamatoria o que se presentan en células presentadoras de antígeno no profesionales (células tumorales). En estas situaciones, no se proporcionan señales de coestimulación de B7 y T cooperadoras. Este mecanismo puede utilizarse en conexión con terapias basadas en células dendríticas con pulsación de antígenos o en situaciones en las que no se han definido epítopos de células T cooperadoras en precursores de TRA conocidos.

Pueden administrarse polipéptidos y péptidos de una manera conocida per se. En una realización, se administran ácido nucleicos mediante procedimientos ex vivo, es decir, mediante la extracción de células de un paciente, modificación genética de dichas células con el fin de incorporar un antígeno asociado a tumores y nueva introducción de las células alteradas en el paciente. Generalmente, esto comprende introducir una copia funcional de un gen en las células de un paciente in vitro y volver a introducir las células genéticamente alteradas en el paciente. La copia funcional del gen está bajo el control funcional de elementos reguladores que permiten que el gen se exprese en las células genéticamente alteradas. Los procedimientos de transfección y transducción los conoce el trabajador experto. La invención también prevé la administración de ácido nucleicos in vivo utilizando vectores tales como virus y liposomas de diana controlada.

En una forma de realización preferida, se selecciona un vector viral para administrar un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado a tumores del grupo que consiste en adenovirus, virus adenoasociados, virus de la viruela, incluyendo virus Vaccinia y virus de la viruela atenuados, virus del bosque de Semliki, retrovirus, virus Sindbis y partículas similares a virus Ty. Se da particular preferencia a adenovirus y retrovirus. Normalmente los retrovirus son deficientes en la replicación (es decir, no pueden generar partículas infecciosas).

Pueden utilizarse diversos procedimientos con el fin de introducir según la invención ácidos nucleicos en células in vitro o in vivo. Los procedimientos de este tipo comprenden la transfección de precipitados con CaPO_{4} de ácidos nucleicos, transfección de ácidos nucleicos asociados con DEAE, transfección o infección con los virus anteriores que llevan ácidos nucleicos de interés, transfección mediada por liposomas, y similares. En formas de realización particulares, se da preferencia a dirigir el ácido nucleico a células particulares. En tales formas de realización, un portador utilizado para administrar un ácido nucleico a una célula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma) puede presentar una molécula de control diana unida. Por ejemplo, puede incorporarse en o unirse al portador de ácido nucleico una molécula tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie en la célula diana o un ligando para un receptor en la célula diana. Los anticuerpos preferidos comprenden anticuerpos que se unen selectivamente a un antígeno asociado a tumores. Si se desea la administración de un ácido nucleico mediante liposomas, pueden incorporarse proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie asociada con endocitosis en la formulación de liposomas con el fin de hacer posible el control y/o captación de la diana. Tales proteínas comprenden proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas que son específicos para un tipo de célula particular, anticuerpos contra proteínas que se internalizan, proteínas que se direccionan a un sitio intracelular, y similares.

Las composiciones terapéuticas de la invención pueden administrarse en preparaciones farmacéuticamente compatibles. Tales preparaciones habitualmente pueden contener concentraciones farmacéuticamente compatibles de sales, sustancias tampón, conservantes, portadores, sustancias que potencian la inmunidad complementarias tales como adyuvantes (por ejemplo, oligonucleótidos CpG) y citocinas y, cuando sea apropiado, otros compuestos terapéuticamente activos.

Pueden administrarse compuestos terapéuticamente activos mediante cualquier vía convencional, incluyendo mediante inyección o infusión. La administración puede llevarse a cabo, por ejemplo, por vía oral, por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, por vía subcutánea o por vía transdérmica. Preferentemente, los anticuerpos se administran terapéuticamente a modo de un aerosol pulmonar.

Las composiciones de la invención se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado sola o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de un estado particular caracterizado por la expresión de uno o más antígenos asociados a tumores, la reacción deseada se refiere a la inhibición del transcurso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar la evolución de la enfermedad y, en particular, interrumpir la evolución de la enfermedad. La reacción deseada en el tratamiento de la enfermedad o de un estado también puede ser el retraso del comienzo o una prevención del comienzo de dicha enfermedad o dicho estado.

Una cantidad eficaz de una composición de la invención dependerá del estado que va a tratarse, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluyendo edad, estado fisiológico, talla y peso, la duración del tratamiento, el tipo de terapia concomitante (si está presente), la vía de administración específica y factores similares.

Las composiciones farmacéuticas de la invención preferentemente son estériles y contienen una cantidad eficaz de la sustancia terapéuticamente activa para generar la reacción deseada o el efecto deseado.

Las dosis administradas de las composiciones de la invención pueden depender de diversos parámetros tales como el tipo de administración, el estado del paciente, el periodo de administración deseado, etc. En el caso de que una reacción en un paciente es insuficiente con una dosis inicial, pueden utilizarse dosis superiores (o dosis eficazmente superiores logradas mediante una vía de administración, más localizada, diferente).

Generalmente, se formulan y administran dosis del antígeno asociado a tumores de desde 1 ng hasta 1 mg, preferentemente de desde 10 ng hasta 100 \mug, para un tratamiento o para generar o aumentar una respuesta inmunitaria. Si se desea la administración de ácidos nucleicos (ADN y ARN) que codifican para antígenos asociados a tumores, se formulan y administran dosis de desde 1 ng hasta 0,1 mg.

Las composiciones farmacéuticas de la invención generalmente se administran en cantidades farmacéuticamente compatibles y en composiciones farmacéuticamente compatibles. La expresión "farmacéuticamente compatible" se refiere a un material no tóxico que no interacciona con la acción del componente activo de la composición farmacéutica. Las preparaciones de este tipo habitualmente pueden contener sales, sustancias tampón, conservantes, portadores, y cuando sea apropiado, otros compuestos terapéuticamente activos. Cuando se utilizan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente compatibles. Sin embargo, pueden utilizarse sales que no son farmacéuticamente compatibles para preparar sales farmacéuticamente compatibles y están incluidas en la invención. Las sales farmacológica y farmacéuticamente compatibles de este tipo comprenden de manera no limitativa las preparadas a partir de los siguientes ácidos: ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico, y similares. También pueden prepararse sales farmacéuticamente compatibles como sales de metal alcalino o sales de metal alcalinotérreo, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.

Una composición farmacéutica de la invención puede comprender un portador farmacéuticamente compatible. Según la invención, la expresión "portador farmacéuticamente compatible" se refiere a una o más cargas sólidas o líquidas compatibles, diluyentes o sustancias de encapsulación, que son adecuados para su administración a seres humanos. El término "portador" se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de naturaleza natural o sintética, en el que se combina el componente activo con el fin de facilitar la aplicación. Los componentes de la composición farmacéutica de la invención habitualmente son tales que no se produce ninguna interacción que afecte sustancialmente a la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener sustancias tampón adecuadas tales como ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en un sal y ácido fosfórico en una sal.

Las composiciones farmacéuticas pueden, cuando sea apropiado, contener también conservantes adecuados tales como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabenos y timerosal.

Las composiciones farmacéuticas habitualmente se proporcionan en una forma farmacéutica uniforme y pueden prepararse de una manera conocida per se. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en forma de cápsulas, comprimidos, pastillas para chupar, disoluciones, suspensiones, jarabes, elíxires o en forma de una emulsión, por ejemplo.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral habitualmente comprenden una preparación acuosa o no acuosa estéril del compuesto activo, que preferentemente es isotónica con respecto a la sangre del receptor. Ejemplos de portadores y disolventes compatibles son la solución de Ringer y disolución isotónica de cloruro de sodio. Además, habitualmente se utilizan aceites fijos, estériles como medio de disolución o suspensión.

La presente invención se describe en detalle mediante las figuras y los ejemplos a continuación, que se utilizan sólo a título ilustrativo y no se pretende que sean limitativos. Debido a la descripción y los ejemplos, las formas de realización adicionales que están incluidas asimismo en la invención son accesibles para el experto.

Figuras

Figura 1: Análisis por PCR del gen FLJ31461

A: Análisis de expresión cuantitativa de FLJ31461 en tejido normales (izquierda) y en diversos tumores (combinaciones que consisten en 3-4 muestras individuales cada una, derecha) en una representación logarítmica de la expresión relativa (activación de x veces). En la mayoría de tumores, se observa una sobreexpresión de por lo menos 100 veces de FLJ31461 en comparación con el nivel de expresión en tejidos sanos.

B: Imagen de gel de un análisis con RT-PCR convencional de FLJ31461 en tumores de mama, pulmones, oído, nariz y garganta con los tejidos normales apropiados N_{x}; M: marcador de longitud de ADN.

C: Análisis de expresión cuantitativa en diversos tejidos normales (izquierda) y en tumores de mama en una representación logarítmica de la expresión relativa (activación de x veces). En casi todos los tumores de mama, se observa una expresión de por lo menos 100 veces de FLJ31461 en comparación con el nivel de expresión en tejidos sanos.

D: Resumen de la expresión específica para FLJ31461 en diversos tumores analizados. Se muestra el número de muestras de tumor sometidas a prueba positivamente en relación con el número total de muestras de tumor analizadas. Mientras que todos los tejidos somáticos normales investigados (3-10 tejidos cada uno, dependiendo del tipo de tejido) no presentaron expresión de FLJ31461, el gen se expresa en muchos tumores con frecuencia variable.

Figura 2: Localización de la proteína

Representación de la localización celular de la proteína de FLJ31461. La figura muestra la expresión de la proteína endógena de la línea celular de tumor de mama MCF7.

Figura 3: Análisis inmunohistoquímico

A: Tejido normal de testículo (localización en membrana positiva), de colon y riñón (localización en membrana negativa).

B: Detección de la proteína de FLJ31461 en un carcinoma bronquial, un carcinoma de cuello uterino así como una metástasis en ganglio linfático de un tumor de mama en una visión general (columna izquierda) y en detalle (columna derecha).

C: Resumen de los análisis inmunohistoquímicos de la proteína de FLJ31461. Se muestra el número de muestras de tumor sometidas a prueba positivamente en relación con el número total de muestras de tumor analizadas. Mientras que todos los tejidos normales investigados no presentaron ninguna expresión de FLJ31461, se detecta la proteína en muchos de los tumores con frecuencia variable en la superficie celular.

Ejemplos Materiales y procedimientos

Las expresiones "in silico" y "electrónico" se refieren únicamente a la utilización de procedimientos basados en bases de datos, que también pueden utilizarse para simular procedimientos experimentales de laboratorio.

A menos que se defina expresamente lo contrario, todos los demás términos y expresiones se utilizan de modo que los entienda el trabajador experto. Las técnicas y los procedimientos mencionados se llevan a cabo de una manera conocida per se y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Todos los procedimientos incluyendo la utilización de kits y reactivos se llevan a cabo según la información del fabricante.

A. Estrategia basada en la minería de datos para identificar antígenos asociados a tumores

Se examinaron bases de datos públicas de proteínas y ácidos nucleicos humanos con respecto a antígenos específicos de cáncer accesibles en la superficie celular. La definición de los criterios de selección requeridos para el mismo, junto con procedimientos de alto rendimiento para analizar, si es posible, todas las proteínas, formaron el componente central de esta estrategia.

El punto de partida consistió en las entradas de proteínas validadas (NP) y, respectivamente, los ARNm correspondientes (NM) que se han depositados en la base de datos RefSeq (Pruitt et al., Trends Genet. enero; 16 (1): 44-47, 2000) del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, National Center for Biotechnology Information). Siguiendo el principio fundamental gen \rightarrow ARNm \rightarrow proteína, se estudiaron en primer lugar las proteínas para determinar la presencia de uno o más dominios transmembrana. Para este fin, se utilizó el programa de análisis de proteínas TMHMM server v 2.0 (Krogh et al., Journal of Molecular Biology 305(3): 567-580, 2001) y entonces se verificaron los resultados del mismo nuevamente utilizando el programa ALOM 2 (Nakai et al., Genomics 14:897-911, 1992). Se realizó la predicción de secuencias señal adicionales que influían sobre la ubicación intracelular de proteínas utilizando los programas PSORT II (Horton et al., Intelligent Systems for Molecular Biology 4:109-115, 1996) e iPSORT (Bannai et al., Bioinformatics, 18(2): 298-305, 2002). La fracción de NP en seres humanos que presenta un total de 19.110 entradas proporcionó 4634 proteínas filtradas.

A continuación, se sometió el ARNm correspondiente a cada una de estas 4634 proteínas, respectivamente, a una búsqueda de homología en la base de datos EST (Boguski et al., Nat. Genet. 4 (4): 332-333, 1993) del NCBI con la ayuda del algoritmo BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997). Los criterios de selección en esta búsqueda se establecieron a un valor e < 10e-20 y una identidad de secuencia mínima del 93% de tal manera que las coincidencias resultantes de la misma con alta probabilidad sólo podían derivarse de los ARNm respectivos pero no de los transcritos homólogos. Casi todos los ARNm proporcionaron por lo menos una coincidencia en la base de datos EST en la que en algunos casos el número de coincidencias superó las 4000.

Posteriormente, se determinaron el origen específico de tejido de la biblioteca de ADNc subyacente así como el nombre de la biblioteca para cada una de estas coincidencias válidas. Los tejidos resultantes de ello se dividieron en 4 grupos diferentes que oscilaban desde órganos prescindibles (grupo 3) hasta órganos absolutamente esenciales (grupo 0). Otro grupo, grupo 4, consistió de cualquier muestra obtenida de tejido canceroso. Se registró la distribución de las coincidencias en los cinco grupos en una tabla que se clasificó según la mejor razón de la suma de los grupos 3 y 4 con respecto a la suma de los grupos 0-2. Los ARNm cuyas coincidencias en EST se originaron exclusivamente de tejido canceroso alcanzaron una posición superior, seguido por las que adicionalmente podían encontrarse en tejidos de órganos prescindibles del grupo 3. Un criterio adicional para la significación de esta distribución fue el número de bibliotecas de ADNc independientes de las que se obtuvieron las EST y se registró en una columna separada de la tabla.

Dado que los transcritos determinados en el primer enfoque y las proteínas correspondientes son en primer lugar constructos hipotéticos, se utilizaron criterios de selección adicionales con la intención de demostrar la existencia real de los ARNm y por consiguiente también de las proteínas. Para este fin, se comparó cada ARNm con el locus del gen predicho utilizando el programa "Spidey" (Wheelan et al., Genome Res. 11 (11): 1952-1957, 2001). Sólo se utilizaron los transcritos que presentaron por lo menos un proceso de corte y empalme, es decir que se extendieron sobre por lo menos 2 exones, para análisis más detallados.

La aplicación secuencial de todos los filtros mencionados condujo a que los antígenos asociados a tumores pudieran considerarse accesibles de forma extracelular, debido a un dominio transmembrana predicho y a la topología relacionada con el mismo. El perfil de expresión derivado de los datos de EST indica, en todos los casos, una expresión específica de cáncer que puede como mucho extenderse sólo a órganos prescindibles.

B. Estrategia de validación de los antígenos asociados a tumores identificados mediante análisis in silico

Con el propósito de utilizar los antígenos para fines inmunoterapéuticos (terapia con anticuerpos mediante anticuerpos monoclonales, vacunación, enfoques terapéuticos mediados por receptor de células T; véase el documento EP-B-0 879 282), en la terapia de cánceres así como para problemas de diagnóstico, la validación de los antígenos identificados es de importancia fundamental. A este respecto, se lleva a cabo la validación mediante análisis de expresión a niveles tanto de ARN como de proteína.

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1. Examen de la expresión de ARN

En primer lugar se validan los antígenos de tumores identificados con la ayuda del ARN, que se obtiene de diversos tejidos o de líneas celulares específicas de tejidos. Dado que el patrón de expresión diferencial del tejido sano en comparación con tejidos tumorales es de importancia decisiva para la posterior aplicación terapéutica, los genes diana se caracterizan preferentemente con la ayuda de estas muestras de tejido.

Se aísla el ARN total de muestras de tejido nativo o de líneas de células tumorales mediante procedimientos convencionales de biología molecular. Dicho aislamiento puede llevarse a cabo, por ejemplo, con la ayuda del kit RNeasy Maxi (Qiagen, n.º cat. 75162) según las instrucciones del fabricante. Este procedimiento de aislamiento se basa en la utilización del reactivo caotrópico isotiocianato de guanidinio. Alternativamente, puede utilizarse fenol ácido para el aislamiento (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987). Tras haber tratado el tejido mediante isotiocianato de guanidinio, se extrae el ARN con fenol ácido, posteriormente se precipita con isopropanol y se lleva a agua tratada con DEPC.

Posteriormente, se transcriben a ADNc 2-4 \mug del ARN aislado de esta manera, por ejemplo por medio de Superscript II (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. La síntesis de ADNc se ceba con la ayuda de hexámeros al azar (por ejemplo Roche Diagnostics) según los protocolos convencionales del fabricante pertinente. Para el control de la calidad, se amplifican los ADNc durante 30 ciclos, utilizando cebadores específicos para el gen p53 que se sólo expresa de manera moderada. Sólo se utilizarán las muestras de ADNc positivas para p53 para las posteriores etapas de reacción.

Los antígenos se analizan en detalle llevando a cabo un análisis de expresión por medio de PCR o PCR cuantitativa (PCRq) basándose en un archivo de ADNc que se ha aislado de diversos tejidos normales y tumorales y de líneas de células tumorales. Para este fin, se amplifica 0,5 \mul de ADNc de la mezcla de reacción anterior mediante una ADN polimerasa (por ejemplo 1 U de ADN polimerasa de HotStarTaq, Qiagen) según los protocolos del fabricante en particular (volumen total de la mezcla de reacción: 25-50 \mul). Aparte de dicha polimerasa, la mezcla de amplificación comprende dNTP 0,3 mM, tampón de reacción (concentración final 1 x, dependiendo del fabricante de la ADN polimerasa) y en cada caso 0,3 mM de cebadores directos e inversos específicos de gen.

Los cebadores específicos del gen diana se seleccionan, tanto como sea posible, de tal manera que están ubicados en dos exones diferentes de modo que contaminaciones genómicas no conducen a resultados falsos positivos. En una PCR de punto final no cuantitativa, el ADNc se incuba normalmente a 95ºC durante 15 minutos con el fin de desnaturalizar el ADN y activar la enzima de inicio en caliente ("hot-start"). Posteriormente, se amplifica el ADN durante 35 ciclos (1 min. a 95ºC, 1 min. a la temperatura de hibridación específica del cebador (aproximadamente 55-65ºC), 1 min. a 72ºC para elongar los amplicones). Posteriormente, se aplican 10 \mul de la mezcla de PCR a geles de agarosa y se fraccionan en el campo eléctrico. El ADN se hace visible en los geles mediante tinción con bromuro de etidio y el resultado de la PCR se documenta mediante una fotografía.

Como una alternativa al PCR convencional, la expresión de un gen diana también puede analizarse mediante PCR en tiempo real cuantitativa. Mientras tanto, hay diversos sistemas analíticos disponibles para este análisis, de los cuales los mejor conocidos son el sistema de detección de secuencia ABI 7900 HT (Applied Biosystems), el iCycler (Biorad) y el Light cycler (Roche Diagnostics). Tal como se describió anteriormente, se somete una mezcla de PCR específica a una corrida en los instrumentos en tiempo real. Mediante la adición de un tinte que se intercala en el ADN (por ejemplo bromuro de etidio, CybrGreen), el ADN recién sintetizado se hace visible mediante excitación con luz específica (según la información de los fabricantes de tintes). Una multiplicidad de puntos medidos durante la aplicación permite que se monitorice todo el proceso y se determine cuantitativamente la concentración de ácido nucleico del gen diana. La mezcla de PCR se normaliza midiendo un gen de mantenimiento (por ejemplo ARN 18S, \beta-actina, GAPDH). Estrategias alternativas mediante sondas de ADN marcadas de manera fluorescente permiten igualmente la determinación cuantitativa del gen diana de una muestra de tejido específico (véanse las aplicaciones de TaqMan de Applied Biosystems).

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2. Clonación

El gen diana completo que se requiere para la caracterización adicional del antígeno tumoral se clona según los procedimientos biológicos-moleculares comunes (por ejemplo en "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterSciencie). Con el fin de clonar el gen diana o analizar su secuencia, en primer lugar se amplifica dicho gen mediante una ADN polimerasa que presenta una función de corrección de lectura (por ejemplo pfu, Roche Diagnostics). A continuación, se liga el amplicón mediante procedimientos convencionales a un vector de clonación. Se identifican los clones positivos mediante análisis de secuencia y posteriormente se caracterizan con la ayuda de programas de predicción y algoritmos conocidos.

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3. Producción de anticuerpos

Los antígenos asociados a tumores identificados se caracterizan, por ejemplo, mediante la utilización de anticuerpos. La invención comprende además la utilización terapéutica o de diagnóstico de anticuerpos. Los anticuerpos pueden reconocer proteínas en el estado nativo y/o desnaturalizado (Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000; Kayyem et al., Eur. J. Biochem. 208: 1-8, 1992; Spiller et al., J. Immunol. Methods 224: 51-60, 1999).

Pueden prepararse antisueros que comprenden anticuerpos específicos que se unen específicamente a la proteína diana mediante diversos procedimientos convencionales; véanse, por ejemplo, "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" de Phillip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9, "Antibodies: A Laboratory Manual" de Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142 y "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" de Ed Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447. También es posible en este caso generar anticuerpos afines y específicos que reconocen proteínas de la membrana complejas en su forma nativa (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods, 234: 107-116, 2000). Esto es especialmente importante en la preparación de anticuerpos destinados a utilizarse terapéuticamente pero también para muchas aplicaciones de diagnóstico. Para este fin, tanto la proteína completa como las secuencias parciales extracelulares pueden utilizarse para la inmunización.

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Inmunización y producción de anticuerpos policlonales

Se han publicado varios protocolos de inmunización. Se inmuniza una especie (por ejemplo conejos, ratones) mediante una primera inyección de la proteína diana deseada. La respuesta inmunitaria del animal al inmunógeno puede potenciarse mediante una segunda o tercera inmunización dentro de un periodo de tiempo definido (aproximadamente 2-4 semanas tras la inmunización anterior). Se toma sangre de dichos animales y se obtienen sueros inmunitarios, nuevamente tras diversos intervalos de tiempo definidos (1^{er} sangrado tras 4 semanas, luego cada 2-3 semanas, hasta 5 tomas). Los sueros inmunitarios tomados de esta manera comprenden anticuerpos policlonales que pueden utilizarse para detectar y caracterizar la proteína diana en inmunotransferencia de tipo Western, mediante citometría de flujo, inmunofluorescencia o inmunohistoquímica.

Los animales se inmunizan habitualmente mediante cualquiera de cuatro procedimientos bien establecidos, existiendo también otros procedimientos. La inmunización puede llevarse a cabo utilizando péptidos específicos para la proteína diana, utilizando la proteína completa, utilizando secuencias parciales extracelulares de una proteína que puede identificarse experimentalmente o mediante programas de predicción. Dado que los programas de predicción no siempre funcionan perfectamente, también es posible emplear dos dominios separados entre sí mediante un dominio transmembrana. En este caso, uno de los dos dominios debe ser extracelular, que luego puede demostrarse experimentalmente (véase a continuación). La inmunización se proporciona mediante diversos proveedores de servicios comerciales.

(1): En el primer caso, se sintetizan péptidos (longitud: 8-12 aminoácidos) mediante procedimientos in vitro (posiblemente llevados a cabo mediante un servicio comercial), y se utilizan dichos péptidos para la inmunización. Normalmente, se llevan a cabo 3 inmunizaciones (por ejemplo con una concentración de 5-100 \mug/inmunización).

(2): Alternativamente, la inmunización puede llevarse a cabo utilizando proteínas recombinantes. Para este fin, se clona el ADN clonado del gen diana en un vector de expresión y se sintetiza la proteína diana, por ejemplo, libre de células in vitro, en bacterias (por ejemplo E. coli), en levadura (por ejemplo S. pombe), en células de insectos o en células de mamíferos, según las condiciones del fabricante en particular (por ejemplo Roche Diagnostic, Invitrogen, Clontech, Qiagen). También es posible sintetizar la proteína diana con la ayuda de sistemas de expresión virales (por ejemplo baculovirus, virus Vaccinia, adenovirus). Tras haberse sintetizado en uno de dichos sistemas, se purifica la proteína diana, normalmente empleando procedimientos cromatográficos. En este contexto, también es posible utilizar para la inmunización proteínas que presentan un anclaje molecular como ayuda para la purificación (por ejemplo, cola de histidina, Qiagen; etiqueta de FLAG, Roche Diagnostics; proteínas de fusión GST). Puede encontrase una multiplicidad de protocolos, por ejemplo, en "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience. Tras haberse purificado la proteína diana, se lleva a cabo una inmunización tal como se describió anteriormente.

(3): Si está disponible una línea celular que sintetiza la proteína deseada de manera endógena, también es posible utilizar directamente esta línea celular para preparar el antisuero específico. En este caso, la inmunización se lleva a cabo mediante 1-3 inyecciones, en cada caso con aproximadamente 1-5 x 10^{7} células.

(4): La inmunización puede también llevarse a cabo mediante inyección de ADN (inmunización de ADN). Para este fin, en primer lugar se clona el gen diana en un vector de expresión de tal manera que la secuencia diana está bajo el control de un promotor eucariótico fuerte (por ejemplo promotor CMV). Posteriormente, se transfiere el ADN (por ejemplo 1-10 \mug por inyección) como inmunógeno utilizando una pistola génica en regiones capilares con un flujo de sangre fuerte en un organismo (por ejemplo ratón, conejo). Se lleva el ADN transferido a las células del animal, se expresa el gen diana, y finalmente el animal desarrolla una respuesta inmunitaria a la proteína diana (Jung et al., Mol. Cells 12: 41-49, 2001; Kasinrerk et al., Hybrid Hybridomics 21: 287-293, 2002).

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Producción de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se producen tradicionalmente con la ayuda de la tecnología de hibridomas (detalles técnicos: véase "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" de Phillip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antidobies: A Laboratory Manual" de Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142, "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" de Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447). Un nuevo procedimiento que también se utiliza es la tecnología "SLAM". En este caso, se aíslan células B de sangre entera y las células se vuelven monoclonales. Posteriormente, se analiza el sobrenadante de la célula B aislada para determinar su especificidad de anticuerpo. A diferencia de la tecnología de hibridomas, entonces se amplifica la región variable del gen del anticuerpo mediante PCR de una sola célula y se clona en un vector adecuado. De esta manera, se acelera la producción de anticuerpos monoclonales (de Wildt et al., J. Immunol. Methods 207: 61-67, 1997).

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4. Validación de las dianas mediante procedimientos químicos para proteínas utilizando anticuerpos

Los anticuerpos que pueden producirse tal como se describió anteriormente, pueden utilizarse para preparar varias afirmaciones importantes acerca de la proteína diana. Específicamente, los siguientes análisis de validación de la proteína diana son útiles:

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Especificidad del anticuerpo

Los ensayos basados en cultivos celulares con posteriores inmunotransferencias de tipo Western son más adecuados para demostrar el hecho que un anticuerpo se une específicamente sólo a la proteína diana deseada (se describen diversas variaciones, por ejemplo, en "Current Protocols in Proteinchemistry", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience). Para la demostración, se transfectan células con un ADNc para la proteína diana, que está bajo el control de un promotor eucariótico fuerte (por ejemplo, promotor de citomegalovirus; CMV). Una amplia variedad de procedimientos (por ejemplo, electroporación, transfección basada en liposoma, precipitación con fosfato de calcio) están bien establecidos para la transfección de líneas celulares con ADN (por ejemplo, Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75: 441-7, 1997). Como una alternativa, también es posible utilizar líneas celulares que expresan el gen diana de manera endógena (detección mediante RT-PCR específica de gen diana). Como control, en el caso ideal, en el experimento se contransfectan genes homólogos, con el fin de permitir demostrar en la siguiente inmunotransferencia de tipo Western la especificidad del anticuerpo analizado.

En las posteriores inmunotransferencias de tipo Western, se lisan células del cultivo celular o muestras de tejido que pueden contener la proteína diana en una disolución de SDS con una concentración del 1%, y se desnaturalizan las proteínas en el procedimiento. Se fraccionan los lisados según el tamaño mediante electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturailizantes con una concentración del 8-15% (contiene SDS al 1%) (electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, SDS-PAGE). A continuación, se transfieren las proteínas mediante uno de una pluralidad de procedimientos de transferencia (por ejemplo electrotransferencia semiseca; Biorad) a una membrana especifica (por ejemplo, nitrocelulosa, Schleicher & Schüll). La proteína deseada puede visualizarse en esta membrana. Para este fin, en primer lugar se incuba la membrana con el anticuerpo que reconoce la proteína diana (dilución aproximadamente 1:20-1:200, dependiendo de la especificidad de dicho anticuerpo), durante 60 minutos. Tras una etapa de lavado, se incuba la membrana con un segundo anticuerpo que está acoplado a un marcador (por ejemplo, enzimas tales como peroxidadas o fosfatasa alcalina) y que reconoce el primer anticuerpo. Entonces es posible hacer que la proteína diana sea visible en la membrana en una reacción de color o quimioluminiscente (por ejemplo, ECL, Amersham Biosciencie). En el caso ideal, un anticuerpo con una alta especificidad para la proteína diana sólo debe reconocer la propia proteína deseada.

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Localización de la proteína diana

Se utilizan diversos procedimientos para confirmar la ubicación en la membrana, identificada en el enfoque in silico, de la proteína diana. Un procedimiento importante y bien establecido utilizando los anticuerpos descritos anteriormente es la inmunofluorescencia (IF). Para este fin, se utilizan las células de las líneas celulares establecidas que o bien sintetizan la proteína diana (detección del ARN mediante RT-PCR o de la proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western) o bien se han transfectado con ADN de plásmido. Una gran variedad de procedimientos (por ejemplo, electroporación, transfección basada en liposoma, precipitación con fosfato de calcio) están bien establecidos para la transfección de líneas celulares con ADN (por ejemplo, Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75: 441-7, 1997). El plásmido transfectado, en inmunofluorescencia, puede codificar para la proteína no modificada o bien acoplar diferentes marcadores de aminoácido a la proteína diana. Los principales marcadores son, por ejemplo, la proteína verde fluorescente (GFP) en varias formas fluorescentes de manera diferencial, secuencias de péptidos cortas de 6-12 aminoácidos para las que hay disponibles anticuerpos específicos y de alta afinidad, o la secuencia de aminoácidos corta Cys-Cys-X-X-Cys-Cys que puede unirse mediante sus cisteínas a sustancias fluorescentes específicas (Invitrogen). Células que sintetizan la proteína diana se fijan, por ejemplo, con para-formaldehído o metanol. Posteriormente, si se requiere, las células pueden permeabilizarse mediante incubación con detergentes (por ejemplo, el 0,2% de Triton X-100). Entonces, se incuban las células con un anticuerpo primario dirigido contra la proteína diana o contra uno de los marcadores acoplados. Tras una etapa de lavado, se incuba la mezcla con un segundo anticuerpo acoplado a un marcador fluorescente (por ejemplo, fluoresceína, rojo de Texas, Dako), que se une al primer anticuerpo. Entonces, las células marcadas de esta forma de recubren con glicerol y se analizan con la ayuda de un microscopio de fluorescencia según la información del fabricante. En este caso, se logran emisiones de fluorescencia específicas mediante la excitación específica dependiendo de las sustancias empleadas. El análisis permite habitualmente la localización fiable de la proteína diana, confirmándose la calidad del anticuerpo y la proteína diana en tinciones dobles tiñendo, además de la proteína diana, también los marcadores de aminoácido acoplado u otras proteínas de marcador cuya localización ya se ha descrito en la bibliografía. GFP y sus derivados representan un caso especial, que pueden excitarse directamente y siendo fluorescentes por sí mismos. La permeabilidad a la membrana que puede controlarse mediante la utilización de detergentes, en inmunofluorescencia, permite la demostración de si un epítopo inmunogénico está ubicado dentro o fuera de la célula. La predicción de las proteínas seleccionadas puede por tanto respaldarse de manera experimental. Una posibilidad alternativa es detectar dominios extracelulares por medio de citometría de flujo. Para este fin, las células se fijan en condiciones no permeabilizantes (por ejemplo, con PBS/azida de Na/FCS al 2%/EDTA 5 mM) y se analizan en un citómetro de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Solo pueden reconocerse epítopos extracelulares mediante el anticuerpo que va a analizarse en este procedimiento. Una diferencia de la inmunofluorescencia es que es posible distinguir entre células muertas y vivas utilizando, por ejemplo, yoduro de propidio o azul Trypan, y así se evitan resultados falsos positivos.

Otra detección importante es mediante inmunohistoquímica (IHC) en muestras de tejidos específicos. El objetivo de este procedimiento es identificar la ubicación de una proteína en un agregado de tejido funcionalmente intacto. IHC sirve específicamente para (1) permitir estimar la cantidad de proteína diana en tejidos normales y tumorales, (2) analizar cuántas células en tejidos tumorales y sanos expresan el gen diana, y (3) definir el tipo de célula en un tejido (células sanas, tumorales) en el que puede detectarse la proteína diana. Alternativamente, las cantidades de proteína de un gen diana pueden cuantificarse mediante inmunofluorescencia de tejido utilizando una cámara digital y software adecuado (por ejemplo, Tillvision, Till-photonics, Alemania). La tecnología se ha publicado frecuentemente, y por tanto pueden encontrarse detalles de la tinción y la microscopia, por ejemplo, en "Diagnostic Immunohistochemistry" de David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667 o en "Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy" ISBN: 0306467704. Debe observarse que, debido a las propiedades de los anticuerpos, deben de utilizarse diferentes protocolos (a continuación se describe un ejemplo) con el fin de obtener un resultado significativo.

Normalmente, en ICH se emplean tejidos tumorales definidos histológicamente y, como referencia, tejidos sanos comparables. También es posible utilizar como controles positivos y negativos líneas celulares en las que se conoce la presencia del gen diana mediante análisis de RT-PCR. Siempre debe incluirse un control de fondo.

Se aplican fragmentos de tejido fijados en formalina (también es posible otro procedimiento de fijación, por ejemplo con metanol) e incrustadas en parafina con un grosor de 4 \mum a un soporte de vidrio y se desparafinan con xileno, por ejemplo. Se lavan las muestras con TBS-T y se bloquean en suero. Esto va seguido por incubación con el primer anticuerpo (dilución de 1:2 a 1:2000) durante 1-18 horas, utilizando normalmente con anticuerpos purificados por afinidad. Una etapa de lavado va seguida por la incubación con una segundo anticuerpo que está acoplado a una fosfatasa alcalina (una alternativa: por ejemplo peroxidada) y dirigido contra el primer anticuerpo, durante aproximadamente 30-60 minutos. Esto va seguido por una reacción de color utilizando dicha fosfatasa alcalina (véase, por ejemplo, Shi et al., J. Histochem. Cytochem. 39: 741-748, 1991; Shin et al., Lab. Invest. 64: 693-702, 1991). Para demostrar la especificidad del anticuerpo, la reacción puede bloquearse con una adición previa del inmunógeno.

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Análisis de modificaciones de la proteína

Las modificaciones secundarias de la proteína tales como, por ejemplo, N- y O-glicosilaciones o miristilaciones, pueden perjudicar o incluso impedir completamente la accesibilidad de epítopos inmunogénicos y por tanto ponen en tela de juicio la eficacia de terapias con anticuerpos. Además, se ha demostrado frecuentemente que el tipo y cantidad de modificaciones secundarias son diferentes en tejidos normales y tumorales (por ejemplo, Durand & Seta, 2000; Clin. Chem. 46: 795-805; Hakomori, 1996; Cancer Res. 56: 5309-18). Por tanto el análisis de estas modificaciones es esencial para el éxito terapéutico de un anticuerpo. Pueden predecirse posibles sitios de unión mediante algoritmos específicos.

Los análisis de modificaciones de proteínas habitualmente tienen lugar mediante inmunotransferencia de tipo Western (véase anteriormente). Las glicosilaciones que habitualmente presentan un tamaño de varios kDa, conducen especialmente a una masa total mayor de la proteína diana, que puede fraccionarse en SDS-PAGE. Para detectar los enlaces O- y N-glicosídicos específicos, se incuban lisados de proteínas antes de la desnaturalización mediante SDS con O- o N-glicosidasas (según sus respectivas instrucciones del fabricante, por ejemplo PNgasa, endoglicosidasa F, endoglicosidasa H, Roche Diagnostics). Esto va seguido por inmunotransferencia de tipo Western tal como se describió anteriormente. Por tanto, si hay una reducción en el tamaño de la proteína diana tras la incubación con una glicosidasa, es posible detectar una glicosilación específica y, de esta manera, también analizar la especificidad del tumor de una modificación.

Análisis funcional del gen diana

La función de la molécula diana puede ser crucial para su utilidad terapéutica, de modo que los análisis funcionales son un importante componente en la caracterización de moléculas utilizables terapéuticamente. El análisis funcional puede tener lugar o bien en células, en experimentos de cultivos celulares o bien in vivo con la ayuda de modelos animales. Esto implica o bien inactivar el gen de la molécula diana por mutación (desactivación) o bien insertar la secuencia diana dentro de la célula o el organismo (activación). Por tanto, esto posibilita analizar las modificaciones funcionales en un contexto celular en primer lugar por medio de la pérdida de la función del gen que va a analizarse (pérdida de función). En el segundo caso, pueden analizarse las modificaciones causadas por la adición del gen analizado (ganancia de función).

a. Análisis funcional en células

Transfección. Con el fin de analizar la ganancia de función, el gen de la molécula diana debe transferirse a la célula. Para este fin, se transfectan células con un ADN que permite la síntesis de la molécula diana. Normalmente, el gen de la molécula diana, en este caso, está bajo el control de un promotor eucariótico fuerte (por ejemplo, promotor de citomegalovirus; CMV). Una amplia variedad de procedimientos (por ejemplo, electroporación, transfección basada en liposoma, precipitación con fosfato de calcio) están bien establecidos para transfectar líneas celulares con ADN (por ejemplo, Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75: 441-7, 1997). El gen puede sintetizarse o bien de forma transitoria, sin integración genómica, o bien de forma estable, con integración genómica tras la selección con neomicina, por ejemplo.

Interferencia de ARN (ARNsi). Una inhibición de la expresión del gen diana, que puede inducir una pérdida completa de la función de la molécula diana en células, puede generarse mediante la tecnología de interferencia de ARN (ARNsi) en células (Hannon, GJ. 2002. RNA interference. Nature 418: 244-51; Czauderna et al., 2003. Nucl. Acid. Res. 31: 670-82). Para este fin, se transfectan células con moléculas de ARN cortas bicatenarias de aproximadamente de 20-25 nucleótidos de longitud, que son específicas para la molécula diana. Un proceso enzimático da entonces como resultado la degradación del ARN especifico del gen diana y por tanto una inhibición de la función de la proteína diana y por consiguiente permite analizar funcionalmente el gen diana.

Las líneas celulares que se han modificado por medio de transfección o ARNsi pueden posteriormente analizarse en diferentes maneras. Los ejemplos más comunes se indican a continuación.

1. Proliferación

Se establece una multiplicidad de procedimientos para analizar la proliferación celular y se suministran comercialmente por diversas compañías (por ejemplo, Roche Diagnostics, Invitrogen; se describen detalles de los procedimientos de ensayo en los numerosos protocolos de aplicación). El número de células en los experimentos de cultivos celulares puede determinarse mediante recuento sencillo o mediante ensayos colorimétricos que miden la actividad metabólica de las células (por ejemplo, wst-1, Roche Diagnostics). Los procedimientos de ensayos metabólicos miden el número de células en un experimento indirectamente por medio de marcadores enzimáticos. La proliferación celular puede medirse directamente analizando la velocidad de síntesis de ADN, por ejemplo mediante la adición de bromodesoxiuridina (BrdU), detectándose la BrdU integrada de manera colorimétrica mediante anticuerpos específicos.

2. Apoptosis y citotoxicidad

Está disponible un gran número de sistemas de ensayo para detectar la apoptosis celular y la citotoxicidad. Una característica decisiva es la fragmentación dependiente de enzima, específica, del ADN genómico, que es irreversible y da como resultado en cualquier de caso la muerte celular. Los procedimientos para detectar estos fragmentos de ADN específicos pueden obtenerse de manera comercial. Un procedimiento adicional disponible es el ensayo TUNEL que puede detectar roturas monocatenarias de ADN también en secciones del tejido. La citotoxicidad se detecta principalmente mediante una permeabilidad celular alterada que sirve como marcador del estado de vitalidad de las células. Esto implica, por un lado, el análisis de marcadores que normalmente pueden encontrarse intracelularmente en el sobrenadante de cultivo celular. Por otro lado también es posible analizar la capacidad de absorción de los marcadores de tinción que no se absorben en células intactas. Los ejemplos mejor conocidos de marcadores de tinción son azul Trypan y yoduro de propidio, un marcador intracelular común es lactato deshidrogenasa que puede detectarse enzimáticamente en el sobrenadante. Están disponibles diferentes sistemas de ensayos de diversos proveedores comerciales (por ejemplo Roche Diagnostics, Invitrogen).

3. Ensayo de migración

Se analiza la capacidad de las células para migrar en un ensayo de migración específico, preferentemente con la ayuda de una cámara Boyden (Corning Costar) (Cinamon G., Alon R. J. Immunol Methods. 2003 Feb; 273(1-2): 53-62; Stockton et al., 2001. Mol. Bio. Cell. 12: 1937-56). Para este fin, se cultivan las células en un filtro con un tamaño de poro específico. Las células que pueden migrar pueden migrar a través de este filtro a otro recipiente de cultivo por debajo. El análisis microscópico posterior permite entonces la determinación de un comportamiento de migración posiblemente alterado inducido por la ganancia de función o perdida de función de la molécula diana.

b. Análisis funcional en modelos de animales

Una posible alternativa a los experimentos de cultivo celular para el análisis de la función del gen diana son complicados experimentos in vivo en modelos de animales. En comparación con los procedimientos a base de células, estos modelos presentan la ventaja de poder detectar desarrollos defectuosos o enfermedades que sólo pueden detectarse en el contexto del organismo entero. Actualmente está disponible una multiplicidad de modelos para trastornos en seres humanos (Abate-Shen & Shen. 2002. Trends in Genetics S1-5; Matsusue et al., 2003. J. Clin. Invest. 111:737-47). Diversos modelos de animales tales como, por ejemplo, levadura, nematodo o pez cebra ya se han caracterizado intensamente. Sin embargo, modelos que se prefieren sobre otras especies son modelos de animales tales como, por ejemplo, ratones (Mus musculus) debido a que ofrecen la mejor posibilidad de reproducir los procesos biológicos en un contexto de seres humanos. Para ratones, por un lado se han establecido en años recientes procedimientos transgénicos que integran nuevos genes en el genoma del ratón (ganancia de función; Jegstrup I. et al., 2003. Lab Anim. 2003 Enero; 37(1): 1-9). Por otro lado, otros enfoques metódicos inactivan genes en el genoma del ratón y por tanto inducen una pérdida de función de un gen deseado (modelos desactivados, perdida de función; Zambrowicz BP & Sands AT. 2003. Nat. Rev. Drug Discov. 2003 Enero; 2(1): 38-51; Niwa H. 2001. Cell Struct. Funct. 2001 Junio; 26(3); 137-48); se han publicado detalles técnicos en grandes números.

Tras haberse generado modelos de ratón, pueden analizarse las alteraciones inducidas por el transgén o por la pérdida de función de un gen en el contexto de todo el organismo (Balling R, 2001. Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:463-92). Por tanto, es posible llevar a cabo, por ejemplo, pruebas de comportamiento así como parámetros de sangre establecidos bioquímicamente mediante estudios. Los análisis histológicos, la inmunohistoquímica o el microscopio electrónico permiten caracterizar alteraciones en el nivel celular. El patrón de expresión específica de un gen puede detectarse mediante hibridación in situ (Peters et al., 2003. Hum. Mol. Genet 12: 2109-20).

Ejemplo 1 Identificación de la proteína hipotética FLJ31461 como diana de cáncer de diagnóstico y terapéutica

Utilizando programas de predicción de genes, se determinó FLJ31461 (SEC ID nº: 1) presentado con el número de registro de Gene Bank NM_152454, como supuestamente funcional no caracterizado anteriormente en el cromosoma 15 (15q25.3). Dos posibles marcos de lectura abiertos resultan de la secuencia depositada en Gene Bank. El primer marco de lectura codifica para una proteína con una longitud de 136 aminoácidos. El producto génico (SEC ID nº: 2) que se depositó en el banco de datos RefSeq del NCBI con el número NP_689667, presenta por consiguiente un peso molecular calculado de aproximadamente 15 kDa. El segundo marco de lectura codifica para una proteína con una longitud de 100 aminoácidos (secuencia de nucleótidos: SEC ID nº: 7; secuencia de aminoácidos: SEC ID nº: 8).

En análisis de secuencia del gen FLJ31461 clonado, resultó sorprendente encontrar la inserción de un nucleótido en la región codificante en comparación con las secuencias depositadas en las bases de datos. Esto da como resultado un desplazamiento del marco de lectura. El resultado son dos marcos de lectura abiertos completamente nuevos, que no pueden derivarse de las secuencias ya depositadas en bases de datos de secuencias. Por la presente memoria el nuevo marco de lectura (SEC ID nº: 9) codifica para una nueva proteína hipotética con una longitud de 96 aminoácidos (SEC ID nº: 10). SEC ID nº: 11 codifica para una proteína hipotética con una longitud de 133 aminoácidos (SEC ID nº: 12). Debido a que debe suponerse que las deposiciones originales en las bases de datos son incorrectas, se han centrado las investigaciones adicionales en SEC ID nº: 9; SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 11 y SEC ID nº: 12.

De acuerdo con la invención, tras establecer la RT-PCR cuantitativa específica de FLJ31461 (cebador con la SEC ID nº: 3, 4, 13, 14, 15, 16) se investigó la cantidad de transcritos específicos del gen en tejido sano y en muestras de carcinoma (figura 1). Con la excepción de los testículos, FLJ31461 no puede detectarse en ninguno de los tejidos normales que se investigaron (figura 1A). Por tanto, con gran probabilidad FLJ31461 es un producto génico muy específico de gameto. Sorprendentemente, se encontró durante el análisis de tumores que FLJ31461 está activado en muchos tipos de tumores, mientras que está por debajo del limite de detección en los tejidos normales correspondientes (figura 1A-D). Esto no sólo se aplica prácticamente a todos los tumores de mama que se investigaron (figura 1C) y también a una serie de tumores de pulmón y carcinomas de nariz y garganta, sino también a otras neoplasias con frecuencia variable (figura 1D).

FLJ31461 es por lo tanto un marcador molecular sumamente específico para tejidos tumorales, que puede utilizarse de manera diagnostica así como terapéutica. Como representante típico de la clase de los denominados antígenos de cáncer de testículos, que debido a su distribución en tejido selectiva sirven como marcadores, este producto génico puede garantizar por ejemplo la selección como diana precisa de células tumorales sin dañar a los tejidos normales. Los genes de cáncer de testículos se consideran estructuras diana atractivas para terapias dirigidas y ya se han sometido a prueba para enfoques inmunoterapéuticos específicos en enfermedades cancerosas en estudios de fase I/II (es decir, Scanlan MJ, Gure AO, Jungbluth AA, Old LJ, Chen YT. 2002. Immunol. Rev. 2002 Oct; 188: 22-32).

Con el fin de confirmar estos datos sobre los niveles de proteínas, se han generado sueros inmunitarios o anticuerpos específicos mediante inmunización de animales. La topología de la proteína se predijo mediante análisis de los dominios transmembrana de SEC ID nº: 10 y SEC ID nº: 12 con herramientas bioinformáticas (TMHMM, TMPRED). De esta manera para SEC ID nº: 10 por ejemplo, se predijeron dos dominios transmembrana; el extremo N terminal y el extremo C terminal de la proteína son extracelulares.

De acuerdo con la invención, se seleccionaron epítopos de péptidos para la inmunización, particularmente epítopos de péptidos extracelulares, que son específicos para ambas variantes de proteína.

Entre otros, se seleccionaron los siguientes péptidos para la inmunización con el fin de producir anticuerpos: SEC ID nº: 5, 6, 17 y 18.

Se muestran a título de ejemplo los datos para el anticuerpo producido mediante inmunización utilizando SEC ID nº: 17. El anticuerpo específico puede utilizarse en diversas condiciones de fijación para investigaciones de inmunofluorescencia. En tinciones comparativas de líneas celulares positivas tanto como negativas para RT-PCR, la proteína respectiva está en una cantidad bien detectable específica entre otros en las líneas celulares del carcinoma de mama que eran de tipo positivo utilizando RT-PCR cuantitativa (figura 2). La proteína endógena en este caso presenta localización en la membrana.

Dichos anticuerpos son adecuados para la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejidos humanos. En gran medida pudo confirmarse la distribución del tejido encontrada en el nivel de transcripto. Mientras no se observó casi ninguna reactividad del anticuerpo en el tejido normal con la excepción del tejido del testículo (figura 3A), los anticuerpos contra FLJ31461 tiñen varias preparaciones de tumores humanos, entre ellas los tumores de mama y pulmón (figura 3B). La tinción de las células se produce de manera acentuada en las membranas, lo que indica una ubicación de la proteína en la superficie celular. Sorprendentemente, se encontró que particularmente la metástasis de tumores (figura 3B) expresan esta proteína de manera particularmente frecuente y en una alta proporción de células.

Estos datos indican por un lado, que este gen que se encontró sí que forma una proteína, que esta proteína es sumamente específica para tumores humanos y que está presente en la superficie de la membrana de tales células tumorales. Por lo tanto esta proteína es particularmente accesible para anticuerpos terapéuticos. Igualmente, los datos demuestran que pueden producirse anticuerpos específicos contra esta proteína. Estos anticuerpos se unen selectivamente mediante el marcador FLJ31461 a células tumorales.

De acuerdo con la invención, tales anticuerpos pueden utilizarse para fines de diagnóstico, por ejemplo, inmunohistología. En particular, tales anticuerpos pueden utilizarse de manera terapéutica. Los anticuerpos producidos también pueden utilizarse directamente para la producción de anticuerpos recombinantes humanizados o quiméricos. Esto también puede realizarse directamente con anticuerpos obtenidos de conejos (véase J. Biol. Chem. 5 de mayo de 2000; 275(18): 13668-76 de Rader C, Ritter G, Nathan S, Elia M, Gout I, Jungbluth AA, Cohen LS, Welt S, Old LJ, Barbas CF 3º "The Rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation of therapeutic human antibodies"). Con el fin de alcanzar esto, se tomaron linfocitos de animales inmunizados. FLJ31461 también es una diana sumamente atractiva para procedimientos inmunoterapéuticos, tales como vacunaciones o la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos de antígeno.

<110> Ganymed Pharmaceuticals AG

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<120> Identificación de antígenos asociados a la superficie para el diagnóstico y la terapia de tumores

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<130> 342-20 PCT EP

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<150> DE 10 2004 023 187.7

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<151> 2004-05-11

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<160> 18

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 1785

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (204)..(614)

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<400> 1

1

2

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<210> 2

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<211> 136

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

3

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<210> 3

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 3

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cagcctccag aatgaagaat g

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21

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<210> 4

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

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ggagggagac tgagattt

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<210> 5

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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<210> 7

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<211> 303

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(303)

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<400> 7

7

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<210> 8

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

8

9

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<210> 9

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<211> 1786

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (204)..(494)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

10

11

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<210> 10

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<211> 96

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

12

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<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 402

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(402)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

13

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 133

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccatgaat tgtgatgctt tgctac

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaggtagct ggtcttgggg aa

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcagcct ccagaatgaa g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggtaagg acagacgtgt c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm16

Claims

1. Composición farmacéutica que comprende uno o más componentes seleccionados de entre el grupo constituido por:

(i): un anticuerpo que se une a un antígeno asociado a tumores,

(iii): un ácido nucleico, que codifica para un antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo que comprende por lo menos 6 aminoácidos contiguos,

(iv): una célula huésped, que expresa un antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo que comprende por lo menos 6 aminoácidos contiguos y

(v): unos complejos aislados entre un antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo y una molécula de HLA,

\quad: en la que el antígeno asociado a tumores

(a): comprende la secuencia de aminoácidos según SEC ID nº: 10 o

(b): presenta una secuencia, que se codifica por un ácido nucleico que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el ácido nucleico según SEC ID nº: 9

para el tratamiento y/o la vacunación frente al cáncer caracterizado porque comprende la expresión o expresión anómala del antígeno asociado a tumores, estando seleccionado el cáncer de entre el grupo constituido por tumor de mama, tumor de pulmón, tumor de esófago, tumor de colon, tumor de estómago, tumor de páncreas, tumor de hígado, tumor de ovario, tumor de próstata, tumor ORL, tumor renal, tumor de cuello uterino, tumor de piel y tumor de útero.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo se une selectivamente al antígeno asociado a tumores, presenta actividad inhibidora de tumores y es selectivo para células que expresan o expresan de manera anómala el antígeno asociado a tumores.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que los componentes en (ii), (iii), (iv) y (v) aumentan selectivamente la cantidad de complejos entre una molécula de HLA y el antígeno asociado a tumores o un fragmento del mismo.

4. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 ó 3, en la que el ácido nucleico en (iii) está presente en un vector de expresión.

5. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 ó 3, en la que la célula huésped secreta el antígeno asociado a tumores o el fragmento del mismo.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 ó 3, en la que la célula huésped expresa adicionalmente una molécula de HLA que se une al antígeno asociado a tumores o el fragmento del mismo.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que la célula huésped expresa la molécula de HLA y/o el antígeno asociado a tumores o el fragmento del mismo de una forma recombinante.

8. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que la célula huésped expresa la molécula de HLA de manera endógena.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, 3, 6, u 8, en la que la célula huésped es una célula presentadora de antígeno.

10. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 ó 2, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado o un fragmento de un anticuerpo.

11. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 ó 2, en la que el anticuerpo está acoplado a un agente terapéutico o de diagnóstico.

12. Procedimiento para diagnosticar una enfermedad cancerosa caracterizado porque comprende la expresión o expresión anómala de un antígeno asociado a tumores que comprende la detección de:

(i): un ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado a tumores y/o

(ii): el antígeno asociado a tumores

\quad: en una muestra biológica aislada de un paciente,

\quad: en el que el antígeno asociado a tumores

(a): comprende la secuencia de aminoácidos según SEC ID nº: 10 o

(b): presenta una secuencia, que se codifica por un ácido nucleico, que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el ácido nucleico según SEC ID nº: 9,

en el que la enfermedad cancerosa se selecciona de entre el grupo constituido por tumor de mama, tumor de pulmón, tumor de esófago, tumor de colon, tumor de estómago, tumor de páncreas, tumor de hígado, tumor de ovario, tumor de próstata, tumor ORL, tumor renal, tumor de cuello uterino, tumor de piel y tumor de útero.

13. Procedimiento para determinar la regresión, transcurso o comienzo de una enfermedad cancerosa caracterizado porque comprende la expresión o expresión anómala de un antígeno asociado a tumores, comprendiendo dicho procedimiento la monitorización de una muestra de un paciente que presenta la enfermedad cancerosa o que se sospecha que está desarrollando la enfermedad cancerosa con respecto a uno o más parámetros seleccionados de entre el grupo constituido por:

(i): la cantidad de ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado a tumores y

(ii): la cantidad de antígeno asociado a tumores,

\quad: en el que el antígeno asociado a tumores

(a): comprende la secuencia de aminoácidos según SEC ID nº:10 o

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el procedimiento comprende la determinación del parámetro o de los parámetros en un primer punto en el tiempo en una primera muestra y en un segundo punto en el tiempo en una muestra adicional, en el que el transcurso de la enfermedad cancerosa se determina mediante la comparación de ambas muestras.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicación 12 a 14, en el que la detección o monitorización según (i) se lleva a cabo amplificando selectivamente el ácido nucleico o un fragmento del mismo o utilizando una sonda de polinucleótidos que se hibrida específicamente con el ácido nucleico.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que la detección o monitorización según (ii) se lleva a cabo utilizando un anticuerpo que se une específicamente al antígeno asociado a tumores.

17. Utilización de un anticuerpo, que se une a un antígeno asociado a tumores y que está acoplado a un agente terapéutico o de diagnóstico para preparar una composición farmacéutica destinada al tratamiento, diagnóstico o monitorización de una enfermedad cancerosa caracterizada porque comprende la expresión o expresión anómala de un antígeno asociado a tumores, en la que el antígeno asociado a tumores

(a): comprende una secuencia de aminoácidos según SEC ID nº: 10 o

(b): presenta una secuencia que se codifica por un ácido nucleico que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el ácido nucleico según SEC ID nº: 9,

en la que la enfermedad cancerosa se selecciona de entre el grupo constituido por tumor de mama, tumor de pulmón, tumor de esófago, tumor de colon, tumor de estómago, tumor de páncreas, tumor de hígado, tumor de ovario, tumor de próstata, tumor ORL, tumor renal, tumor de cuello uterino, tumor de piel y tumor de útero.

18. Procedimiento según la reivindicación 16 o utilización según la reivindicación 17, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado o un fragmento de un anticuerpo.