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ES2344706T3 - Celula madre prostatica cancerosa. - Google Patents

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ES2344706T3
ES2344706T3 ES05732870T ES05732870T ES2344706T3 ES 2344706 T3 ES2344706 T3 ES 2344706T3 ES 05732870 T ES05732870 T ES 05732870T ES 05732870 T ES05732870 T ES 05732870T ES 2344706 T3 ES2344706 T3 ES 2344706T3
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prostate
cancerous
antigen
stem cells
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ES05732870T
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English (en)
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Norman Maitland
Anne Collins
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Original Assignee
Procure Therapeutics Ltd
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Abstract

Un método para el aislamiento de células madre prostáticas cancerosas, que comprende el enriquecimiento selectivo de células madre prostáticas cancerosas que expresan el antígeno CD133, que comprende: i) proporcionar una preparación celular que comprende células madre prostáticas cancerosas derivadas de tejido prostático; ii) proporcionar condiciones de cultivo celular que permitan el mantenimiento de dichas células madre prostáticas cancerosas en cultivo y la unión de dichas células madre prostáticas cancerosas a una matriz basada en colágeno; iii) seleccionar dichas células unidas donde dichas células expresan el antígeno CD133.

Description

Célula madre prostática cancerosa.
La invención se refiere a un método para el aislamiento de células madre prostáticas, típicamente células madre de cáncer de próstata; células madre y células madre cancerosas aisladas por el método y su uso.
La glándula prostática es el órgano accesorio principal del tracto reproductor masculino, y es el sitio más habitual de trastornos neoplásicos en los hombres. Las dos patologías principales de la glándula son: (i) hiperplasia prostática benigna, que es una afección no maligna que es habitual con la edad y (ii) carcinoma, que es la segunda causa más habitual de muerte en los hombres europeos, después de cáncer pulmonar y es predominante de forma creciente en la sociedad occidental envejecida. Los síntomas incluyen sangre en el semen o la orina, dolor frecuente o rigidez en la parte inferior de la espalda, las caderas o la parte superior del muslo. Los tumores de próstata pueden ser primarios (es decir, localizados en el órgano de origen) o secundarios (es decir, tumores que se forman que en otros órganos debido a la capacidad de las células cancerosas de moverse e invadir otros tejidos mediante el sistema circulatorio).
El cáncer de próstata puede ser relativamente inofensivo o extremadamente agresivo. Algunos tumores de próstata son de crecimiento lento y causan pocos síntomas clínicos. Los tumores de próstata agresivos se propagan rápidamente hasta los ganglios linfáticos y otros órganos, especialmente los huesos. Se sabe que el crecimiento del cáncer de próstata puede inhibirse bloqueando el suministro de hormonas masculinas tales como testosterona. Sin embargo, los cánceres de próstata finalmente se desarrollan y llegan a ser independientes de las hormonas sexuales masculinas (es decir, llegan a ser células cancerosas prostáticas independientes de andrógenos). Estas células están ligadas a cáncer de próstata maligno, agresivo. Todos los mamíferos de sexo masculino tienen una glándula prostática pero los únicos que se sabe que desarrollan cáncer de próstata de forma natural son los seres humanos y los perros.
Los cánceres prostáticos metastáticos se mueven predominantemente hasta el hueso y se tratan reduciendo la producción de andrógenos bloqueando la producción de andrógenos por las glándulas suprarrenales y los testículos. Este tratamiento es eficaz solamente durante un corto periodo de tiempo ya que las lesiones metastásicas llegan a ser independientes de andrógenos y crecen de forma descontrolada.
La presencia de células cancerosas prostéticas independientes de andrógenos significa que este régimen de tratamiento ya no es eficaz y se requiere intervención adicional para controlar el progreso de la enfermedad. Se observa una respuesta similar contra tratamientos quimioterapéuticos y radioterapéuticos. Como resultado, el cáncer de próstata metastático sigue siendo una enfermedad incurable por estrategias de tratamiento actuales. Por lo tanto, hay una necesidad continua de identificar nuevas dianas terapéuticas para proporcionar nuevos tratamientos para el cáncer de próstata.
Un problema subyacente al tratamiento eficaz de afecciones cancerosas es la identificación de una población de células en un tumor que tiene la capacidad de sostener el crecimiento de un tumor. Las evidencias sugieren que los tumores son clonales y por lo tanto derivan de una única célula. Sin embargo, hay pocos estudios que identifican y caracterizan esos tipos celulares que son responsables de mantener el crecimiento de células tumorales. Algunos han investigado estas llamadas "células madre cancerosas".
El documento WO03/050502 describe un método para enriquecer de forma selectiva células madre de tumor de mama a través del uso de un modelo de xenoinjerto en que el se cultivan células de cáncer de mama humanas en ratones inmunocomprometidos. El documento WO03/102215 describe el aislamiento de células madre y células madre cancerosas en virtud de la expresión específica de un gen informador que está regulado por \beta catenina que llega a expresarse de forma activa en una célula madre. El documento US2003119080 describe un método para el aislamiento de células madre tumorales a partir de tumores sólidos. En el documento WO0140309 se describe un anticuerpo contra un antígeno de células madre de próstata supuesto, mencionado como antígeno de células madre de próstata (PSCA) que también se describe en los documentos US5.856.136, WO99/14328 y WO98/51805.
Se ha identificado CD133, que se expresa por células madre hematopoyéticas primitivas y epitelios en desarrollo como un marcador adicional de células madre para epitelios de la próstata. Las células CD133 están restringidas a la población \alpha_{2}\beta_{1}^{hi} (el receptor para el colágeno tipo I) y se localizan en la capa basal, a menudo en la base de una región en germinación o punto de ramificación (Fig. 1A). Las células \alpha_{2}\beta_{1}^{hi} /CD133^{+} muestran dos atributos importantes de células madre epiteliales: tienen un elevado potencial proliferativo in vitro (Fig. 1B) y pueden reconstituir acinos tipo prostáticos en ratones desnudos macho inmunocomprometidos (Fig. 1C).
Se han aislado directamente células madre de tumor de próstata a partir de nódulos linfáticos y glándulas prostáticas de una serie de muestras de pacientes usando los siguientes marcadores: antígeno epitelial humano (HEA), CD44 (que se expresa por células basales en la próstata; Liu et al., 1997), \alpha_{2}\beta_{1}^{hi} y CD133. Morfológicamente, las células varían de fibroblastoides (que expresan elevados niveles de vimentina que es típica de células transformadas) o epiteliales, y son capaces de producir progenitores asociados con diferenciación epitelial prostática (Fig. 2A). Ensayos de invasión, usando filtros recubiertos con Matrigel han determinado que estas células tienen una capacidad similar de invadir a través de Matrigel que PC3M (una sublínea altamente metastásica de células PC3 (Fig. 2B).
\newpage
Se describe un método para enriquecer selectivamente las células madre de próstata o células madre de cáncer de próstata que utiliza la adhesión diferencial a colágeno tipo I y el crecimiento de células madre en cultivo para seleccionar una población de células con potencial de células madre prostáticas.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para el aislamiento de células madre prostáticas, que comprende el enriquecimiento selectivo de células madre prostáticas que expresan el antígeno CD133. Preferiblemente, dichas células madre también expresan elevados niveles de integrina \alpha_{2}\beta_{1}.
En un método preferido de la invención, dicho enriquecimiento selectivo comprende las siguientes etapas:
i)
proporcionar una preparación celular que comprende células prostáticas derivadas de tejido prostático;
ii)
proporcionar condiciones de cultivo celular que permitan el mantenimiento de dichas células prostáticas en cultivo y la unión de dichas células prostáticas a una matriz de colágeno;
iii)
seleccionar dichas células unidas donde dichas células expresan el antígeno CD133.
En un método preferido de la invención, dicho método incluye las etapas adicionales de:
i)
cultivar células que expresan el antígeno CD133 en medio de cultivo que comprende: factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF), factor de células madre (SCF) y factor inhibidor de leucemia (LIF); y
ii)
pasar las células seleccionadas en (i) en un medio libre de suero.
En un método alternativo de la invención, dicha matriz es una matriz peptídico no basada en colágeno. Un ejemplo de dicha matriz peptídico no basada en colágeno es PuraMatrix^{tm}.
En un método preferido adicional de la invención, dichas células seleccionadas expresan antígeno epitelial, preferiblemente antígeno epitelial humano.
En un método preferido adicional más de la invención, dichas células seleccionadas expresan el antígeno CD44.
En método preferido adicional más de la invención, dichas células seleccionadas no expresan telomerasa.
En un método preferido de la invención, dicho tejido derivado de próstata comprende células prostáticas cancerosas.
En un método preferido adicional de la invención, dichas células prostáticas cancerosas se obtienen de tejido derivado de próstata, maligno.
En un método preferido de la invención, dichas células prostáticas cancerosas se obtiene de sitios de nódulos linfáticos primarios o metastásicos.
En un método preferido adicional de la invención, dicha matriz basada en colágeno comprende colágeno I.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona una célula madre prostática que se puede obtener por el método de acuerdo con la invención.
En una realización preferida de la invención, dicha célula es una célula madre de cáncer de próstata.
En una realización preferida adicional de la invención, dicha célula madre es una célula clonada.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un cultivo sustancialmente puro de células madre prostáticas donde dichas células expresan el antígeno CD133. Preferiblemente, dichas células son células madre de cáncer de próstata.
En una realización preferida de la invención, dichas células expresan elevados niveles de integrina \alpha_{2}\beta_{1}.
En una realización preferida adicional de la invención, dichas células expresan el antígeno epitelial humano. Preferiblemente dichas células expresan el antígeno CD44.
En una realización preferida adicional más de la invención, dichas células expresan el antígeno CD133, elevados niveles de integrina \alpha_{2}\beta_{1}, el antígeno epitelial humano y el antígeno CD44.
Las células madre prostáticas/células madre de cáncer de próstata se caracterizan típicamente por características fenotípicas específicas. Por ejemplo, las células con potencial de célula madre son capaces de dividirse en cultivo en un estado indiferenciado por múltiples pases; son capaces de formar todos los tipos celulares encontrados en tejido prostático; y de expresar marcadores génicos de células madre prostáticas y/o células prostáticas diferenciadas. Se entiende que estas características son simplemente ilustrativas de células madre prostáticas y no se entienden como restrictivas.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una preparación de células madre prostáticas que se puede obtener por el método de acuerdo con la invención para su uso como en una composición de vacuna.
Será evidente que las células madre prostáticas seleccionadas por el método de acuerdo con la invención tienen utilidad con respecto a la selección de genes expresados en células madre prostáticas normales y también células madre prostáticas cancerosas. Los anticuerpos generados contra estas secuencias expresadas son útiles ya que representan dianas potenciales para el desarrollo de vacunas que pueden usarse de forma profiláctica o terapéutica para tratar a aquellos con predisposición a cáncer de próstata o que están padeciendo cáncer de próstata primario o cáncer de próstata secundario como resultado de metástasis a partir de un cáncer primario. Los anticuerpos generados también tendrán utilidad con respecto al diagnóstico de cáncer de próstata.
En una realización preferida de la invención, dicha célula madre prostática es una célula madre prostática cancerosa.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición de vacuna que comprende una célula madre prostática de acuerdo con la invención.
En una realización preferida de la invención, dicha composición incluye un adyuvante y/o un vehículo.
Un adyuvante es una sustancia o procedimiento que aumenta las respuestas inmunes específicas contra los antígenos modulando la actividad de las células inmunes. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, solamente a modo de ejemplo, adyuvante de Freund, muramil dipéptidos, liposomas. Un vehículo es una molécula inmunogénica que, cuando se une una segunda molécula, aumenta las respuestas inmunes contra la última. Algunos antígenos no son inmunogénicos de forma intrínseca aunque pueden ser capaces de generar respuestas de anticuerpos cuando se asocian con una molécula proteica foránea tal como hemocianina de lapa californiana o toxoide tetánico. Dichos antígenos contienen epítopos de células B pero no epítopos de células T. El resto proteico de dicho conjugado (la proteína "vehículo") proporciona epítopos de células T que estimulan las células T auxiliares que a su vez estimulan a las células B específicas de antígeno para diferenciarse en células plasmáticas y producir anticuerpos contra el antígeno. Las células T auxiliares también pueden estimular otras células inmunes tales como células T citotóxicas, y un vehículo puede cumplir un papel análogo en la generación de inmunidad mediada por células así como anticuerpos.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para inmunizar un animal, que comprende administrar una cantidad eficaz de una preparación de células madre prostáticas de acuerdo con la invención.
En un método preferido de la invención, dicha preparación celular comprende células madre prostáticas cancerosas de acuerdo con la invención.
En un método preferido de la invención, dicho animal es un ser humano.
En un método preferido alternativo de la invención, dicho animal es un roedor, preferiblemente una rata, ratón o hámster.
En un método preferido adicional de la invención, dicho animal es un conejo, cabra u oveja.
En un método preferido adicional más de la invención, dicho animal es un perro.
Una vía preferida de administración es intradérmica, subcutánea, intramuscular, oral o intranasal; sin embargo, el método de inmunización no está restringido a un modo de administración particular.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un anticuerpo que se puede obtener por el método de acuerdo con la invención.
En una realización preferida de la invención, dicho anticuerpo es un anticuerpo terapéutico.
En una realización preferida adicional de la invención, dicho anticuerpo es un anticuerpo de diagnóstico. Preferiblemente, dicho anticuerpo de diagnóstico se proporciona con un marcador o marca.
En una realización preferida de la invención, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del mismo. Preferiblemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado o quimérico.
Un anticuerpo quimérico se produce por métodos recombinantes para que contengan la región variable de un anticuerpo con una región invariante o constante de un anticuerpo humano.
Un anticuerpo humanizado se produce por métodos recombinantes para combinar las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo tanto con las regiones constantes (C) como con las regiones flanqueantes de las regiones variables (V) de un anticuerpo humano. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos recombinantes en los que todas las regiones V de un anticuerpo de ratón o rata están combinadas con las regiones C de un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos híbridos recombinantes que fusionan las regiones determinantes de complementariedad de una región V de anticuerpo de roedor con las regiones flanqueantes de las regiones V de anticuerpo humano. También pueden usarse las regiones C del anticuerpo humano. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son las regiones dentro del dominio N-terminal tanto de la cadena pesada como de la ligera del anticuerpo donde está restringida la mayoría de la variación de la región V. Estas regiones forman bucles en la superficie de la molécula de anticuerpo. Estos bucles proporcionan la superficie de unión entre el anticuerpo y el antígeno.
Los anticuerpos de animales no humanos provocan una respuesta inmune contra el anticuerpo foráneo y su eliminación de la circulación. Los anticuerpos tanto quiméricos como humanizados tienen antigenicidad reducida cuando se inyectan a un sujeto humano porque hay una cantidad reducida de anticuerpo de roedor (es decir, foráneo) dentro del anticuerpo híbrido recombinante, mientras que las regiones de anticuerpo humano no provocan una respuesta inmune. Esto produce una respuesta inmune más débil y una disminución en la eliminación del anticuerpo. Esto es claramente deseable cuando se usan anticuerpos terapéuticos en el tratamiento de enfermedades humanas. Los anticuerpos humanizados se diseñan para que tengan menos regiones de anticuerpo "foráneo" y por lo tanto se cree que son menos inmunogénicos que los anticuerpos quiméricos.
También es posible crear regiones variables sencillas, llamadas fragmentos de la región variable del anticuerpo de cadena sencilla (scFv). Si existe un hibridoma para un anticuerpo monoclonal específico pertenece a los conocimientos de los especialistas cómo aislar scFv a partir de ARNm extraído de dicho hibridoma mediante RT PCR. Como alternativa, puede emprenderse exploración de presentación de fagos para identificar clones que expresen scFv. Como alternativa, dichos fragmentos son "fragmentos de anticuerpo de dominio". Los anticuerpos de dominio son la parte de unión más pequeña de un anticuerpo (aproximadamente 13 kDa). Se describen ejemplos de esta tecnología en los documentos US6.248.516, US6.291.158, US6.127.197 y EP0368684 que se incorporan todos por referencia en su totalidad.
En una realización preferida adicional de la invención, dichos anticuerpos son anticuerpos opsónicos.
La fagocitosis está mediada por macrófagos y leucocitos polimórficos e implica la ingestión y digestión de microorganismos, células dañadas o muertas, desechos celulares, partículas insolubles y factores de coagulación activados. Las opsoninas son agentes que facilitan la fagocitosis de los cuerpos foráneos anteriores. Los anticuerpos opsónicos por lo tanto son anticuerpos que proporcionan la misma función. Ejemplos de opsoninas son la parte Fc de un anticuerpo o el complemento C3. Los anticuerpos creados por inmunización y en forma de un complejo inmune con antígeno pueden causar la opsonización mediante la fijación del complemento sobre el antígeno, o moléculas en si microentorno inmediato.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso como un agente farmacéutico.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un linfocito T que se puede obtener por el método de acuerdo con la invención.
Preferiblemente, dichos linfocitos T son linfocitos T auxiliares.
El sistema inmune está compuesto en parte por linfocitos que son capaces de reconocer antígenos específicos. Los linfocitos B reconocen antígenos en su conformación nativa a través de receptores superficiales de inmunoglobulina, y los linfocitos T reconocen antígenos proteicos que se presentan como péptidos junto con moléculas propias conocidas como antígeno de histocompatibilidad principal (MHC), o antígeno de leucocitos humanos (HLA) en seres humanos, sobre la superficie de células presentadoras de antígeno. Las células presentadoras de antígeno existen en formas diferentes y pueden distinguirse en células presentadoras de antígenos "clásicas", ejemplificadas por macrófagos y células dendríticas y células presentadoras de antígeno "no clásicas", que incluyen linfocitos B. Los linfocitos T pueden subdividirse adicionalmente en "linfocitos T citotóxicos", que son capaces de eliminar, por ejemplo, células diana infectadas con virus, y linfocitos "T auxiliares". Los linfocitos T auxiliares tienen una función reguladora y son capaces de "ayudar" a los linfocitos B a producir anticuerpos específicos, o de ayudar a los macrófagos a eliminar las células cancerosas.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para la identificación de genes asociados con células madre prostáticas, que comprende las etapas de:
i)
proporcionar una preparación que comprende al menos una célula madre prostática de acuerdo con la invención;
ii)
extraer el ácido nucleico de dicha preparación celular;
iii)
poner en contacto dicho ácido nucleico extraído con una serie de ácido nucleico; y
iv)
detectar una señal que indique la unión de dicho ácido nucleico con un compañero de unión sobre dicha serie de ácido nucleico.
Preferiblemente dicho método incluye las etapas adicionales de:
i)
comparar la(s) señal(es) generada(s) por la unión de dicho ácido nucleico a dicho compañero de unión;
ii)
convertir la(s) señal(es) comparada(s) en forma de datos analizables; y opcionalmente;
iii)
proporcionar un resultado para los datos analizados.
En un método preferido de la invención, dicha preparación comprende células madre de cáncer de próstata.
En un método preferido adicional de la invención, dicho método incluye una comparación de la señal de la serie producida entre células madre prostáticas normales y cancerosas.
En un método preferido alternativo de la invención, dicho método incluye una comparación de la señal de la serie producida entre una primera muestra de células madre prostáticas cancerosas y una segunda muestra de células madre prostáticas cancerosas diferentes.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para la preparación de una biblioteca que comprende productos de expresión génica específicos de próstata, que comprende las etapas de:
i)
proporcionar una preparación que comprende al menos una célula madre prostática de acuerdo con la invención;
ii)
extraer el ácido nucleico de dicha preparación celular;
iii)
preparar un ADNc a partir del ácido ribonucleico contenido en dicho ácido nucleico extraído; y
iv)
ligar el ADNc formado en (iii) en un vector.
En un método preferido de la invención, dicho vector es un vector en fagos.
En la solicitud PCT WO03/014334 se ha desarrollado un método de cultivo celular in vitro que proporciona un régimen de cultivo que permite que las células epiteliales prostáticas formen acinos tipo prostáticos que se parecen mucho a los acinos prostáticos encontrados in vivo. El método depende de una combinación de suero, hormonas y un soporte de matriz celular adecuado que permite que las células epiteliales se unan, proliferen, se diferencien y formen acinos tipo prostáticos. El sistema es capaz de soportar el crecimiento de células epiteliales normales clonadas así como células prostáticas cancerosas clonadas, células epiteliales prostáticas primarias y células prostáticas cancerosas primarias para proporcionar una estructura 3D que refleje el estado in vivo. El sistema es inestimable para el estudio de la diferenciación de células prostáticas y la transformación de células prostáticas. Proporcionará una herramienta para su uso en la identificación de agentes eficaces en la inhibición de la proliferación y metástasis de células de cáncer de próstata y también para identificar nuevos marcadores de diferenciación y transformación de células prostáticas. En este documento se describe que las células madre prostáticas seleccionadas por el método de acuerdo con la invención son capaces de formar acinos tipo prostáticos como se describe en el documento WO03/014334, y más específicamente las condiciones de cultivo para la formación de acinos tipo prostáticos.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro para la formación de acinos tipo prostáticos, que comprende:
i)
proporcionar un recipiente de cultivo celular que comprende:
a)
células madre prostáticas de acuerdo con la invención;
b)
una matriz de soporte de cultivo celular al que puedan unirse las células de (a) y proliferar;
c)
medio de cultivo celular suplementado con suero, una fracción estromal y una proporción de las hormonas estrógeno y dihidrotestosterona, o derivados funcionales de las mismas; y
ii)
proporcionar condiciones que promuevan el crecimiento y diferenciación de dichas células derivadas de próstata en dicho recipiente.
En un método preferido de la invención, el suero se proporciona entre aproximadamente el 0,5%-4% (v/v). Preferiblemente dicho suero se proporciona aproximadamente entre el 1%-3% (v/v). Más preferiblemente dicho suero se proporciona aproximadamente al 2% (v/v).
En un método preferido adicional de la invención se proporciona estrógeno a aproximadamente 10ng/ml y dihidrotestosterona a aproximadamente 10^{-7} M.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método in vitro para la formación de acinos prostáticos vascularizados, que comprende las etapas de:
i)
proporcionar un recipiente de cultivo celular que incluye: acinos tipo prostáticos formados a partir de células madre prostáticas de acuerdo con la invención que se han formado en un medio de cultivo celular suplementado con suero, una fracción estromal, y una proporción de estrógeno y dihidrotestosterona, o derivados funcionales de las mismas, una matriz de soporte de cultivo celular; y un medio de cultivo celular que soporta el crecimiento de dichos acinos prostáticos; y
ii)
la adición de células endoteliales, preferiblemente células endoteliales activadas, a dicho recipiente de cultivo celular donde dichas células endoteliales proliferan y/o migran para formar túbulos de vasos sanguíneos en o alrededor de dichos acinos prostáticos.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro para la formación de acinos tipo prostáticos vascularizados, que comprende:
i)
proporcionar un recipiente de cultivo celular que incluye:
a)
células madre prostáticas y células endoteliales activadas;
b)
una matriz de soporte de cultivo celular al que pueden unirse las células de (a) y proliferar;
c)
medio de cultivo celular suplementado con suero, una fracción estromal y una proporción de las hormonas estrógeno y dihidrotestosterona, o derivados funcionales de las mismas; y
ii)
proporcionar condiciones que promuevan el crecimiento y diferenciación de dichas células madre prostáticas en dicho recipiente para formar acinos prostáticos y la vascularización de dichos acinos por la formación de túbulos de vasos sanguíneos a partir de dichas células endoteliales activadas.
En un método preferido de la invención, dichas células epiteliales prostáticas y células endoteliales son de origen humano.
"Recipiente" se define como cualquier medio adecuado para que contenga el cultivo celular descrito anteriormente. Típicamente, ejemplos de dicho recipiente son una placa petri; un frasco o matraz de cultivo celular; placas de cultivo multi-pocillo.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un acino tipo prostático que se puede obtener por el método de acuerdo con la invención.
En una realización preferida de la invención dicho acino tipo prostático comprende células prostáticas modificadas genéticamente.
La ingeniería genética puede emprenderse para introducir un gen o genes en una célula madre a partir de la cual puede formarse un acino. Por ejemplo, y no a modo de limitación, pueden introducirse por transfección genes activadores de profármacos en células prostáticas para controlar la eficacia e los profármacos como agentes citotóxicos. Un gen activador de profármacos se refiere a un gen cuya expresión provoca la producción de una proteína capaz de convertir un compuesto no terapéutico en un compuesto terapéutico, que vuelve a la célula susceptible de eliminar por factores o causas externas un estado tóxico en la célula.
Un ejemplo de un gen activado de profármacos es el gen de la citosina desaminasa. La citosina desaminasa convierte la 5-fluorocitosina en 5-fluorouracilo, un potente agente antitumoral. La lisis de la célula tumoral proporciona un brote localizado de citosina desaminasa capaz de convertir 5FC en 5FU en el punto localizado del tumor provocando la eliminación de muchas células tumorales adyacentes. Esto provoca la eliminación de una gran cantidad de células tumorales sin la necesidad de infectar estas células con un vector (el llamado "efecto espectador"). Otro ejemplo de un gen activador de profármacos es la timidina quinasa (TK) (véanse los documentos US5.631.236 y US 5.601.818) en el que las células que expresan el producto génico TK son susceptibles a la eliminación selectiva por la administración de ganciclovir. Esto se entiende de forma simplemente ilustrativa de los métodos recombinantes que podrían usarse en combinación con las células de acuerdo con la invención. Otros ejemplos pueden incluir la introducción por transfección de genes supresores tumorales (por ejemplo, p53). El término gen supresor tumoral se refiere a una secuencia de nucleótidos, cuya expresión en una célula diana es capaz de suprimir el fenotipo canceroso y/o inducir la apoptosis.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para identificar agentes capaces de inhibir la proliferación de células prostáticas cancerosas, que comprende:
i)
proporcionar condiciones de cultivo y al menos un acino canceroso de acuerdo con la invención;
ii)
añadir al menos un agente a ensayar; y
iii)
controlar la actividad anti-proliferativa del agente con respecto a las células que comprende el acino canceroso.
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De acuerdo con un aspecto adicional más de la invención, se proporciona un método para identificar agentes capaces de inhibir la motilidad de células prostáticas cancerosas, que comprende:
i)
proporcionar condiciones de cultivo y al menos un acino canceroso de acuerdo con la invención;
ii)
añadir al menos un agente a ensayar; y
iii)
controlar la motilidad de las células que comprenden el acino canceroso.
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De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para identificar marcadores de diferenciación de células prostáticas, que comprende las etapas de:
i)
proporcionar una preparación que comprende células madre prostáticas de acuerdo con la invención; y
ii)
determinar la expresión de al menos un gen cuya expresión está asociada con la diferenciación de células prostáticas.
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De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para identificar marcadores de transformación de células prostáticas, que comprende las etapas de:
i)
proporcionar una preparación que comprende células madre prostáticas de acuerdo con la invención; y
ii)
determinar la expresión de al menos un gen cuya expresión está asociada con la transformación de células prostáticas.
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Los métodos usados en la identificación de marcadores de diferenciación celular y/o marcadores de transformación de células prostáticas incluyen técnicas basadas en inmunogenética (por ejemplo, usando las células como inmunógenos complejos para desarrollar antisueros contra marcadores de superficie celular como se ha descrito anteriormente y similares), técnicas basadas en ácido nucleico (por ejemplo, exploración diferencial usando ADNc de acinos normales y transformados). Además, se ha sabido desde hace muchos años que las células tumorales producen varios antígenos específicos de células tumorales, algunos de los cuales se presentan en la superficie de la célula tumoral. Éstos se mencionan generalmente como antígenos de rechazo tumoral y derivan de polipéptidos más grandes mencionados como precursores de antígenos de rechazo tumoral. Los antígenos de rechazo tumoral se presentan mediante el HLA al sistema inmune. El sistema inmune reconoce estas moléculas como foráneas y selecciona y destruye de forma natural las células que expresan estos antígenos. Si una célula transformada se escapa de la detección y llega a establecerse, se desarrolla un tumor. Se han desarrollado vacunas basadas en los antígenos de rechazo tumoral dominantes para proporcionar individuos con una defensa preformada contra el establecimiento de un tumor. El método de acuerdo con la invención proporciona un medio para identificar antígenos y precursores de rechazo tumoral que tendrán utilidad con respecto al desarrollo de vacunas para provocar que el propio sistema inmune de los pacientes impida el establecimiento de tumores de próstata.
En un método preferido de la invención, dicho gen es un oncogén.
La hibridación de una molécula de ácido nucleico sucede cuando dos moléculas de ácido nucleico complementarias experimentan una cantidad de enlaces de hidrógeno entre sí. La rigurosidad de la hibridación puede variar de acuerdo con las condiciones ambientales que rodean los ácidos nucleicos, la naturaleza del método de hibridación, y la composición y longitud de las moléculas de ácido nucleico usadas. Se analizan cálculos respecto a las condiciones de hibridación requeridas para obtener grados particulares de rigurosidad en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); y Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York, 1993). La T_{m} es la temperatura a la que el 50% de una cadena dada de una molécula de ácido nucleico hibrida con su cadena complementaria. A continuación hay una serie ejemplar de condiciones de hibridación y no es limitante:
Rigurosidad Muy Elevada (permite que hibriden secuencias que comparten al menor el 90% de identidad)
Hibridación:
5x SSC a 65ºC durante 16 horas
Lavar dos veces:
2x SSC a temperatura ambiente (TA) durante 15 minutos cada vez
Lavar dos veces:
0,5x SSC a 65ºC durante 20 minutos cada vez
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Rigurosidad Elevada (permite que hibriden secuencias que comparten al menos el 80% de identidad)
Hibridación:
5x-6x SSC a 65ºC-70ºC durante 16-20 horas
Lavar dos veces:
2x SSC a TA durante 5-20 minutos cada vez
Lavar dos veces:
1x SSC a 55ºC-70ºC durante 30 minutos cada vez
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Rigurosidad Baja (permite que hibriden secuencias que comparten al menos el 50% de identidad)
Hibridación:
6x SSC a TA a 55ºC durante 16-20 horas
Lavada al menos dos veces:
2x-3x SSC de TA a 55ºC durante 20-30 minutos cada vez.
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Un polipéptido variante puede diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones, truncamientos que pueden estar presentes en cualquier combinación. Entre las variantes preferidas están las que varían de un polipéptido de referencia en sustituciones de aminoácidos conservativas. Dichas sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado por otro aminoácido de características similares. La siguiente lista de aminoácidos se consideran reemplazos conservativos (similares): a) alanina, serina, y treonina; b) ácido glutámico y ácido aspártico; c) asparagina y glutamina d) arginina y lisina; e) isoleucina, leucina, metionina y valina y f) fenilalanina, tirosina y triptófano.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método que usa un modelo animal no humano para el análisis de la formación de acinos prostáticos, que comprende las etapas de:
i)
proporcionar una preparación de células madre prostáticas;
ii)
transplantar dichas células en un sujeto animal no humano; y
iii)
controlar la diferenciación y crecimiento de las células transplantadas.
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En un método preferido de la invención, dicho animal no humano se selecciona entre el grupo compuesto por: ratón, rata, cobaya, perro, primate no humano.
En un método preferido de la invención, dicho animal es un ratón, preferiblemente un ratón inmunocomprometido. Preferiblemente, dicho ratón es un ratón SCID o un ratón desnudo atímico.
En un método preferido de la invención, dichas células se transplantan de forma subcutánea.
En un método preferido alternativo de la invención, dichas células se transplantan de forma ortotópica en o alrededor de tejido prostático.
Ahora se describirá una realización de la invención a modo de ejemplo solamente y con referencia a las siguientes Figuras:
Figura 1: Verificación de CD133 como marcador de células madre de epitelios prostáticos: 1A: Una sección en parafina de acinos prostáticos marcados con le tinte nuclear DAPI (Azul) y anti-CD133 directamente conjugado con PE (Rojo). 1B: Células basales con el fenotipo \alpha_{2}\beta_{1}^{hi} /CD133^{+} tienen una mayor eficacia de formación de colonias (CFE) que \alpha_{2}P_{1}^{low} /CD133^{-}. La (CFE) se calculó como la cantidad de colonias formadas por cantidad de células seleccionadas x100%. Las CFE se expresan como la proporción del CFE control. Los resultados muestran la media \pm s.e.m. de cuatro experimentos. 1C: Xenoinjertos de acinos prostáticos formados por transplante de células basales \alpha_{2}P_{1}^{hi}/CD133^{+} teñidas con (A) Hematoxilina y Eosina, (B) 34\betaE12, (C) anti-K18, (D) anti-PAP, (E) receptor anti-andrógenos. Barra 40 \mum.
\newpage
Figura 2: Caracterización de células "madre" tumorales de una metástasis del nódulo linfático de la próstata (LNMP). 2A. Células tumorales seleccionadas en base a que \alpha_{2}\beta_{1}/CD133 se diferencian en cultivo. 2B. Actividad en ensayo de invasión de LNMP en comparación con PC3M y una línea celular epitelial de próstata inmortalizada, PNTIa.
Materiales y métodos Genotipo de células madre tumorales aisladas
Usando una combinación de marcadores de microsatélites asociados con cáncer de próstata esporádico (8p 10q 16p, Fig. 3) se puede determinar si las células HEA^{+}/CD44^{+}/\alpha_{2}\beta_{1}^{hi}/CD133^{+} aisladas presentan pérdida de los patrones de heterocigosidad característicos de tumores de próstata en comparación con ADN de linfocitos sanguíneos del mismo paciente. El análisis se realiza sobre un micromuestreo de cultivos con papel 3MM y cebadores de PCR marcados de forma fluorescente (MacIntosh et al., 1998). Esto posibilitará discriminar entre células normales y cancerosas y determinar si las células madre de hecho son dianas para acontecimientos de transformación.
Potencial proliferativo, de diferenciación y maligno de células madre cancerosas putativas
Se aíslan distintas poblaciones de células tumorales y se determina su potencial proliferativo, de diferenciación y maligno in vitro e in vivo. Se aíslan las siguientes poblaciones (HEA^{+}/CD44^{-} (células luminales), HEA^{+}/CD44^{+} (células basales), HEA^{+}/CD44^{+}/\alpha_{2}\beta_{1}^{low}/CD133^{-} (células de tránsito), HEA^{+}/CD44^{+}/\alpha_{2}\beta_{1}^{hi}/CD133^{+} (células madre) y se comparan con la población tumoral no clasificada.
Eficacia de formación de colonias (CFE): crecimiento independiente de anclaje y dependiente de anclaje
El potencial transformante de distintas poblaciones (como anteriormente) de células cancerosas (independencia de anclaje) se mide por su capacidad e forma colonias en agar blando. Las colonias individuales se cuentan después de 21 días usando un microscopio invertido. Se hacen comparaciones del CFE y el tamaño de las colonias.
Morfogénesis en geles de matriz de membrana basal reconstituida
Se ha determinado el potencial de células madre tumorales y sus progenitores de experimentar morfogénesis glandular en membrana basal reconstituida (por ejemplo, Matrigel). Se ha demostrado que las células basales normales pueden experimentar morfogénesis glandular cuando crecen en una matriz basada en colágeno, (por ejemplo, Matrigel) con estroma, en presencia de andrógenos. Se generan esferoides que son arquitectónica y fenotípicamente similares a los acinos in vivo y a menudo son de tipo conducto y alvéolos ramificado (Lang et al., 2001). En contraste, las células cancerosas a menudo forman grandes agregados de células con forma de huso sin organización obvia. No obstante, las estructuras a menudo contendrán células que muestran algún grado de diferenciación y pueden compararse con el tumor original.
Ensayos de invasión
La capacidad de estas células madre de migrar a través de Matrigel se determina por el método de cámara Borden modificado (Albini et al., 1987). Las velocidades de migración se evaluarán usando microscopía confocal de secuencia acelerada, usando células marcadas con EGFP. Se ha generado epitelio prostático que expresa bajos niveles de EGFP. Se usarán retrovirus recombinantes basados en pLNCX-EGFP(2) generados para infectar las poblaciones celulares y se usarán colonias resistentes a G418 en ensayos de motilidad. Los bajos niveles de expresión de GFP se usarán para rastrear la invasión y la motilidad a tiempo real.
Tumourigénesis in vivo
Las células madre tumorales deben tener criterios clave que definan las células madre normales: después del transplante deben proliferar, diferenciarse y auto-renovarse. Para determinar la capacidad de distintos fenotipos tumorales de colonizar in vivo injertos de células madre, se introducen células de tránsito, células basales, células luminales y células no clasificadas en las próstatas de ratones macho de 6 a 8 semanas de edad, inmunocomprometidos. Los ratones se tratan hormonalmente en el momento del injerto por implante subcutáneo de gránulos de testosterona de liberación sostenida. La cantidad de células de cada población que se injerta de forma satisfactoria e inicia la proliferación tumoral se determina variando la cantidad de células implantadas. La capacidad de auto-renovación de las distintas poblaciones se determina por transplante en serie en receptores secundarios.
Comparación de perfiles de expresión génica entre células madre cancerosas y normales
Se obtienen perfiles de expresión de células madre aisladas de muestras tisulares que contienen cáncer y no cancerosas. Se usa una plataforma de microserie Affymetrix GeneChip para ensayar los niveles absolutos de expresión génica para cada muestra. Para conseguir esto, se extrae el ARN total de células \alpha_{2}\beta_{1}^{++} purificadas. Como el rendimiento celular es bajo, es necesario usar una etapa de amplificación lineal para proporcionar suficiente diana para la hibridación a las series. El protocolo de marcaje de muestra pequeña Affymetrix ha demostrado funcionar bien con 100 ng (\sim10^{4} células) pero puede usarse para tan poco como 1-10 ng de ARN total. Hasta la fecha, se ha usado esta tecnología (Hu-U133A GeneChips) para perfilar el ARN total amplificado extraído de poblaciones celulares seleccionadas (incluyendo \alpha_{2}\beta_{1}^{++}) derivadas de la línea celular de metástasis de nódulo linfático de cáncer de próstata recientemente aislada.
Cada muestra se obtiene de un individuo diferente, por lo tanto, un grado sustancial de variación en la expresión génica (tanto entre muestras cancerosas y no cancerosas y entre muestras dentro de la misma clase) se deberá a la heterogeneidad genérica subyacente entre los individuos. Como resultado, es necesario incluir varias réplicas "biológicas" dentro de cada clase de muestra y típicamente se usan 6-10 muestras para cada una (es decir, hasta 20 muestras en total).
Se usa análisis de comparación en lotes para comparar cada experimento de muestra cancerosa con cada una de las muestras no cancerosas y someter las comparaciones a tres algoritmos estadísticos diferentes, en base al ensayo de Mann-Whitney, el ensayo de rango de Wilcoxon no paramétrico y el análisis de grupos en mapas de auto-organización, para detectar la expresión diferencial. Además, se aplica el análisis de grupos para buscar grupos de genes que se comporten de forma diferente a lo normal.

Claims (49)

1. Un método para el aislamiento de células madre prostáticas cancerosas, que comprende el enriquecimiento selectivo de células madre prostáticas cancerosas que expresan el antígeno CD133, que comprende:
i)
proporcionar una preparación celular que comprende células madre prostáticas cancerosas derivadas de tejido prostático;
ii)
proporcionar condiciones de cultivo celular que permitan el mantenimiento de dichas células madre prostáticas cancerosas en cultivo y la unión de dichas células madre prostáticas cancerosas a una matriz basada en colágeno;
iii)
seleccionar dichas células unidas donde dichas células expresan el antígeno CD133.
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2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichas células madre también expresan elevados niveles de integrina \alpha_{2}\beta_{1}.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde dicho método incluye las etapas adicionales de:
i)
cultivar células madre prostáticas cancerosas que expresan el antígeno CD133 en medio de cultivo que comprende factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF), factor de células madre (SCF) y factor inhibidor de leucemia (LIF); y
ii)
pasar las células seleccionadas en (i) en un medio libre de suero.
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4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dichas células seleccionadas expresan el antígeno epitelial.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho antígeno es el antígeno epitelial humano.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dichas células seleccionadas expresan el antígeno CD44.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dichas células madre prostáticas cancerosas se obtienen de tejidos derivado de próstata metastásica.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dichas células se obtienen de tumores de próstata metastáticos primarios.
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha matriz basada en colágeno comprende colágeno 1.
10. Una célula madre prostática cancerosa que expresa el antígeno CD133 que se puede obtener por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. Una célula madre prostática cancerosa de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicha célula madre está clonada.
12. Un cultivo celular de células madre prostáticas cancerosas sustancialmente puras donde dichas células expresan el antígeno CD133.
13. Un cultivo de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dichas células expresan elevados niveles de integrina \alpha_{2}\beta_{1}.
14. Un cultivo de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en el que dichas células expresan el antígeno epitelial.
15. Un cultivo de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho antígeno epitelial es el antígeno epitelial humano.
16. Un cultivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el que las células expresan el antígeno CD44.
17. Un cultivo de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dichas células expresan el antígeno CD133, elevados niveles de integrina \alpha_{2}\beta_{1}, el antígeno epitelial humano y el antígeno CD44.
18. Una preparación de células madre prostáticas cancerosas que expresa el antígeno CD133 que se puede obtener por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso como en una composición de vacuna.
19. Una composición de vacuna que comprende un cultivo de células madre prostáticas cancerosas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-17.
20. Una composición de acuerdo con la reivindicación 19, donde dicha composición incluye un adyuvante y/o un vehículo.
21. Un anticuerpo que se puede obtener por la inmunización de un animal con un cultivo de células madre prostáticas cancerosas de acuerdo con las reivindicaciones 12-17.
22. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 21, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del mismo.
23. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22 para su uso como un agente farmacéutico.
24. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22.
25. Un linfocito T que se puede obtener por inmunización de un animal con un cultivo de células madre prostáticas cancerosas de acuerdo con las reivindicaciones 12-17.
26. Un linfocito T de acuerdo con la reivindicación 25, donde dicho linfocito es un linfocito T auxiliar.
27. Un método para la identificación de genes que muestren expresión potenciada en células madre prostáticas cancerosas, que comprende las etapas de:
i)
proporcionar una preparación que comprende al menos una célula madre prostática cancerosa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11;
ii)
extraer el ácido nucleico de dicha preparación celular;
iii)
poner en contacto dicho ácido nucleico extraído con una serie de ácido nucleico; y
iv)
detectar una señal que indique la unión de dicho ácido nucleico con un compañero de unión sobre dicha serie de ácido nucleico.
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28. Un método de acuerdo con la reivindicación 27, donde dicho método incluye las etapas adicionales de:
i)
comparar la(s) señal(es) generada(s) por la unión de dicho ácido nucleico a dicho compañero de unión;
ii)
convertir la(s) señal(es) comparada(s) en una forma de datos analizable; y opcionalmente;
iii)
proporcionar un resultado para los datos analizados.
\vskip1.000000\baselineskip
29. Un método de acuerdo con la reivindicación 27 y 28, donde dicho método incluye una comparación de la señal de la serie producida entre células madre prostáticas normales y cancerosas.
30. Un método de acuerdo con la reivindicación 27 y 28, donde dicho método incluye una comparación de la señal de la serie producida entre una primera muestra de células madre prostática cancerosas y una segunda muestra de células madre prostáticas cancerosas diferente.
31. Un método para la preparación de una biblioteca que comprende productos de expresión génica específicos de próstata cancerosa, que comprende las etapas de:
i)
proporcionar una preparación que comprende al menos una célula madre prostática cancerosa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11;
ii)
extraer el ácido nucleico de dicha preparación celular;
iii)
preparar un ADNc a partir del ácido ribonucleico contenido en dicho ácido nucleico extraído; y
iv)
ligar el ADNc formado en (iii) en un vector.
\vskip1.000000\baselineskip
32. Un método de acuerdo con la reivindicación 31, en el que dicho vector es un vector basado en fagos.
33. Un método in vitro para la formación de acinos tipo prostáticos, que comprende:
i)
proporcionar un recipiente de cultivo celular que comprende:
a)
células madre prostáticas cancerosas de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11;
b)
una matriz de soporte de cultivo celular a la que pueden unirse las células de (a) y proliferar;
c)
medio de cultivo celular suplementado con suero, una fracción estromal y una proporción de las hormonas estrógeno y dihidrotestosterona, o derivados funcionales de los mismos; y
ii)
proporcionar condiciones que promuevan el crecimiento y diferenciación de dichas células derivadas de próstata en dicho recipiente.
34. Un acino tipo prostático canceroso que puede obtenerse por el método de acuerdo con la reivindicación 33.
35. Un acino tipo prostático de acuerdo con la reivindicación 34, donde dicho acino comprende células prostáticas modificadas genéticamente.
36. Un método para identificar agentes capaces de inhibir la proliferación de células madre prostáticas cancerosas, que comprende:
i)
proporcionar condiciones de cultivo y al menos un acino canceroso de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35;
ii)
añadir al menos un agente a ensayar; y
iii)
controlar la actividad anti-proliferativa del agente con respecto a las células que comprende el acino canceroso.
37. Un método para identificar agentes capaces de inhibir la motilidad de células madre prostáticas cancerosas, que comprende:
i)
proporcionar condiciones de cultivo y al menos un acino canceroso de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35;
ii)
añadir al menos un agente a ensayar; y
iii)
controlar la motilidad de las células que comprenden el acino canceroso.
38. Un método para identificar marcadores de diferenciación de células prostáticas, que comprende las etapas de:
i)
proporcionar una preparación que comprende células madre prostáticas cancerosas de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11; y
ii)
determinar la expresión de al menor un gen cuya expresión está asociada con la diferenciación de células prostáticas.
39. Un método para identificar marcadores de transformación de células prostáticas, que comprende:
i)
proporcionar una preparación que comprende células madre prostáticas de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11; y
ii)
determinar la expresión de al menos un gen cuya expresión está asociada con la transformación de células prostáticas.
40. Un método de acuerdo con la reivindicación 39, en el que dicho gen es un oncogén.
41. Un método que usa un modelo animal no humano para el análisis de la formación de acinos prostáticos, que comprende las etapas de:
i)
proporcionar una preparación de células madre prostáticas cancerosas que expresan el antígeno CD133;
ii)
transplantar dichas células en un sujeto animal no humano; y
iii)
controlar la diferenciación y crecimiento de las células transplantadas.
42. Un método de acuerdo con la reivindicación 41, en el que dicho animal se selecciona entre el grupo compuesto por: ratón, rata, cobaya, perro, primate no humano.
43. Un método de acuerdo con la reivindicación 42, en el que dicho animal es un ratón inmunocomprometido.
44. Un método de acuerdo con la reivindicación 43, en el que dicho mamífero es un ratón SCID o un ratón desnudo atímico.
45. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 41-44, en el que dichas células se transplantan de forma subcutánea.
46. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 41-44, en el que dichas células se transplantan de forma ortotópica en o alrededor del tejido prostático.
47. Un método in vitro para la formación de acinos prostáticos cancerosos vascularizados, que comprende las etapas de:
i)
proporcionar un recipiente de cultivo celular que incluye: acinos tipo prostáticos cancerosos formados a partir de células madre prostáticas cancerosas que expresan el antígeno CD133 que se han formado en un medio de cultivo celular suplementado con suero, una fracción estromal, y una proporción de estrógeno y dihidrotestosterona, o derivados funcionales de las mismas, una matriz de soporte de cultivo celular; y un medio de cultivo celular que soporta el crecimiento de dichos acinos prostáticos; y
ii)
añadir las células endoteliales activadas a dicho recipiente de cultivo celular donde dichas células endoteliales proliferan y/o migran para formar túbulos de vasos sanguíneos en o alrededor de dichos acinos.
48. Un método in vitro para la formación de acinos tipo prostáticos cancerosos vascularizados, que comprende:
i)
proporcionar un recipiente de cultivo celular que incluye:
a)
células madre prostáticas cancerosas que expresan el antígeno CD133 y células endoteliales activadas;
b)
una matriz de soporte de cultivo celular a la que pueden unirse las células de (a) y proliferar;
c)
medio de cultivo celular suplementado con suero, una fracción estromal y una proporción de las hormonas estrógeno y dihidrotestosterona, o derivados funcionales de las mismas; y
ii)
proporcionar condiciones que promuevan el crecimiento y diferenciación de dichas células epiteliales prostáticas en dicho recipiente para formar acinos prostáticos y la vascularización de dichos acinos por la formación de túbulos de vasos sanguíneos a partir de dichas células endoteliales activadas.
49. Un método de acuerdo con la reivindicación 47 ó 48, en el que dichas células madre prostáticas y células endoteliales son de origen humano.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0406215D0 (en) * 2004-03-19 2004-04-21 Procure Therapeutics Ltd Prostate stem cell
WO2006051405A2 (en) * 2004-11-12 2006-05-18 Cambridge University Technical Services Ltd. Methods and means related to cancer stem cells
AU2006273892A1 (en) * 2005-07-26 2007-02-01 Procure Therapeutics Limited Prostate stem cell markers
JP5263756B2 (ja) 2005-09-30 2013-08-14 国立大学法人 岡山大学 細胞の培養方法および細胞培養物
GB0625041D0 (en) * 2006-12-15 2007-01-24 Procure Therapeutics Ltd Prostate stem cell model
CA2673607A1 (en) * 2006-12-20 2008-09-04 Novarx Universal tumor cell vaccine for anti cancer therapeutic and prophylactic utilization
KR101523698B1 (ko) 2007-01-22 2015-05-29 마크로제닉스 웨스트 인코퍼레이티드 사람 암 줄기세포
GB0701321D0 (en) * 2007-01-24 2007-03-07 Procure Therapeutics Ltd Agent
GB0908934D0 (en) 2009-05-26 2009-07-01 Univ The West Of Scotland Differentiation medium
GB0910751D0 (en) 2009-06-23 2009-08-05 Procure Therapeutics Ltd Prostate cancer vaccine
WO2011158019A1 (en) 2010-06-16 2011-12-22 Adjuvantix Limited Polypeptide vaccine
WO2012010904A1 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Procure Therapeutics Limited Mammalian model for amplification of cancer stem cells
US9408873B2 (en) * 2010-08-23 2016-08-09 Kang Stem Biotech Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising stem cells treated with NOD2 agonist or culture thereof for prevention and treatment of immune disorders and inflammatory diseases
SG10201506767QA (en) 2010-09-03 2015-10-29 Stemcentrx Inc Identification and enrichment of cell subpopulations
US9778264B2 (en) 2010-09-03 2017-10-03 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
GB201116702D0 (en) 2011-09-28 2011-11-09 Procure Therapeutics Ltd Cell surface markers
US9506925B2 (en) 2014-07-02 2016-11-29 Dragon Victory Development Ltd. Specific biomarker set for non-invasive diagnosis of liver cancer
US9885718B2 (en) 2014-07-02 2018-02-06 Dragon Victory Development Ltd. Specific biomarker set for non-invasive diagnosis of liver cancer
TWI700493B (zh) * 2014-07-02 2020-08-01 香港商龍勝發展有限公司 用於非侵入性肝癌診斷之特異性生物標記組

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
WO1993002556A1 (en) 1991-07-26 1993-02-18 University Of Rochester Cancer therapy utilizing malignant cells
US5631236A (en) 1993-08-26 1997-05-20 Baylor College Of Medicine Gene therapy for solid tumors, using a DNA sequence encoding HSV-Tk or VZV-Tk
US5856136A (en) 1996-07-03 1999-01-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human stem cell antigens
WO1998051805A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
KR100272659B1 (ko) 1997-06-28 2000-12-01 김영환 반도체 소자의 금속배선 선폭 측정방법
KR100502596B1 (ko) 1997-09-17 2005-07-22 제넨테크, 인크. 분비 폴리펩티드와 막횡단 폴리펩티드 및 이들을 코딩하는핵산
CA2387108A1 (en) 1999-10-29 2001-06-07 Genentech, Inc. Anti-prostate stem cell antigen (psca) antibody compositions and methods of use
US6541249B2 (en) * 1999-12-22 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Immortalized human stromal cell lines
US6632620B1 (en) * 2000-06-22 2003-10-14 Andrew N. Makarovskiy Compositions for identification and isolation of stem cells
EP1414945B8 (en) 2001-08-09 2009-04-01 Procure Therapeutics Limited Cell culture method for obtaining prostate-like acini
US20030119080A1 (en) * 2001-10-15 2003-06-26 Mangano Joseph A. Strategies for the identification and isolation of cancer stem cells and non-cancerous stem cells
AU2002364537A1 (en) 2001-12-07 2003-06-23 Regents Of The University Of Michigan Prospective identification and characterization of breast cancer stem cells
ITTO20020311A1 (it) * 2002-04-10 2003-10-10 Medestea Int Spa Procedimento per la preparazione di cellule staminali da tessuto muscolare e tessuto adiposo umano e cellule staminali ottenibili mediante t
WO2003102215A2 (en) 2002-05-31 2003-12-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of identifying and isolating stem cells and cancer stem cells
GB0406215D0 (en) * 2004-03-19 2004-04-21 Procure Therapeutics Ltd Prostate stem cell

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