ES2344071T3

ES2344071T3 - Secuencias de adn con actividad anti-represora.

Info

Publication number: ES2344071T3
Application number: ES06124475T
Authority: ES
Inventors: Arthur Leo Kruckeberg; Arie Peter Otte
Original assignee: Chromagenics BV
Current assignee: Chromagenics BV
Priority date: 2001-07-04
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2010-08-17
Anticipated expiration: 2022-06-14
Also published as: KR20090037960A; DK1829972T3; US20070031936A1; ATE467682T1; ATE358183T1; HK1068652A1; DE60236332D1; AU2011202193A1; US7951586B2; US7655441B2; DK1845162T3; CA2450020A1; EP1808488B1; EP1404872B1; EP1829971A1; BR0210771A; US7662591B2; US20070037256A1; AU2011202193B2; ATE474053T1

Abstract

Una secuencia de ADN aislada y/o recombinante que tiene actividad anti-represora, seleccionada dicha secuencia del grupo que consiste en: (a) el SEQ ID: 27 de la Figura 20; (b) un fragmento del SEQ ID: 27 de la Figura 20; (c) una secuencia derivada del SEQ ID: 27 de la Figura 20 por deleción, inserción y/o mutación de una o más bases; donde la actividad anti-represora de dicha secuencia confiere a una célula de osteosarcoma U-2 OS humana la capacidad para crecer después de 4-5 semanas de cultivo en presencia de 250 μg/ml de Zeocina y 0,1 ng/ml de doxiciclina, cuando dicha célula comprende una proteína de fusión represora de LexA que contiene el dominio de unión a ADN de LexA y una región codificadora de HP1 o HPC2 bajo el control del sistema regulador de la transcripción Tet-Off, cuando dicha secuencia de ADN aislada y/o recombinante es clonada en una secuencia poliligadora en un plásmido, estando situado dicho poliligador entre cuatro sitios operadores de LexA y el promotor de SV40 que controla el gen de resistencia a zeocina, cuando el plásmido está presente en dicha célula.

Description

Secuencias de ADN con actividad anti-represora.

La invención hace referencia a los campos de la medicina y la biología celular. La invención en particular hace referencia a los medios y métodos para la regulación de la transcripción génica. Adicionalmente la invención hace referencia a los medios y métodos para determinar si una secuencia de ADN comprende una cualidad moduladora de la transcripción génica y/o una cualidad represora de la transcripción génica.

Con el progreso de los diversos proyectos genoma, se han vuelto asequibles las secuencias de los genomas completos de los organismos. La avalancha de datos ha incrementado el interés de muchos investigadores. Uno de los descubrimientos más notables fue la observación de que el genoma humano no codifica significativamente más genes que el genoma de organismos simples como la mosca de la fruta. El enfoque de muchos investigadores se está desplazando ahora de la identificación de los genes a la determinación de la expresión génica y la función génica. Los ejemplos de tales tecnologías son las micromatrices de ADN, las aplicaciones genómicas funcionales y la proteinómica. Estas tecnologías tienen en común que están centradas en la función y expresión de secuencias codificadoras. No obstante, si bien nuestro conocimiento de los genes aumenta espectacularmente, la comprensión de cómo está regulada la expresión de los genes está limitando la capacidad de aplicar este conocimiento rápidamente creciente. Este es por ejemplo el caso en la generación de plantas y animales transgénicos y en la terapia génica humana. En estas aplicaciones el ácido nucleico foráneo es introducido típicamente en células para obtener la expresión de las secuencias codificadoras. A menudo la integración del ácido nucleico foráneo en el genoma de la célula es requerida para el funcionamiento prolongado de las secuencias introducidas. No obstante, la integración de secuencias en el genoma conduce a la imprevisibilidad de la expresión debido a que el ADN circundante influye en la transcripción de las secuencias integradas. Esta imprevisibilidad es debida en parte al hecho de que las secuencias introducidas no pueden ser proporcionadas todavía con la suficiente información genética para aislar funcionalmente las secuencias integradas de los efectos que influyen en la transcripción del ADN circundante. Por otra parte esto es debido al hecho de que no se sabe suficiente sobre los efectos que influyen en la transcripción del ADN circundante.

La presente invención tiene que ver con las secuencias de ADN que comprenden la capacidad de influir en la transcripción de los genes en cis. Típicamente, aunque no necesariamente, las secuencias investigadas no codifican por sí mismas una proteína funcional. Diversas secuencias de elementos de secuencia no codifican por sí mismas una proteína funcional. Se han identificado diversos elementos de secuencia con la capacidad de afectar a la transcripción génica en cis. Estos elementos se extienden desde promotores, intensificadores, y silenciadores de elementos limítrofes y regiones de anclaje a la matriz.

El hecho de que se hayan descubierto tantos tipos diferentes de secuencias reguladoras da la impresión de que es muy fácil diseñar casetes de expresión eficaces. No obstante, más bien es al contrario. El diseño de casetes de expresión todavía está dirigido a menudo por el ensayo y error. Bastante a menudo es posible obtener alguna clase de expresión de un gen foráneo en una célula diana o en su progenie. No obstante, muy a menudo es difícil prever con cualquier clase de exactitud el nivel de expresión o la persistencia de la expresión que una casete de expresión puede presentar en una célula diana.

Un método para detectar, y opcionalmente seleccionar, una secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica comprende proporcionar un sistema de transcripción con una variedad de vectores que comprenden fragmentos, comprendiendo dichos vectores i) un elemento con una cualidad represora de la transcripción génica, y ii) un promotor que dirija la transcripción de un gen informador, comprendiendo el método adicionalmente realizar una etapa de selección en dicho sistema de transcripción con el fin de identificar dicha secuencia de ADN con dicha cualidad moduladora de la transcripción génica. Los fragmentos pueden estar localizados entre i) dicho elemento con una cualidad represora de la transcripción génica, y ii) dicho promotor que dirige la transcripción de dicho gen informador. La ARN polimerasa inicia el proceso de transcripción tras la unión a una secuencia especifica, denominada promotor, que señala dónde debe comenzar la síntesis de ARN. Una cualidad moduladora puede intensificar la transcripción a partir de dicho promotor en cis, en un tipo de célula dado y/o un promotor dado. La misma secuencia de ADN puede comprender una cualidad intensificadora en un tipo de célula o con un tipo de promotor, mientras puede comprender o no otra cualidad moduladora de la transcripción génica en otro tipo de célula o con otro tipo de promotor. La transcripción puede estar influenciada por un efecto directo del elemento regulador (o la proteína o las proteínas que se unen a él) sobre la transcripción de un promotor concreto. No obstante, la trascripción puede estar influenciada por un efecto indirecto, por ejemplo porque el elemento regulador afecta a la función de uno o más elementos reguladores distintos. La cualidad moduladora de la transcripción génica también puede comprender una cualidad de la transcripción génica estable. Con estable se quiere significar que el nivel de transcripción observado no cambia significativamente a lo largo de al menos 30 divisiones celulares. Una cualidad estable es útil en situaciones en las que las características de expresión deben ser predecibles a lo largo de muchas divisiones celulares. Los ejemplos típicos son las líneas celulares transfectadas con genes foráneos. Otros ejemplos son los animales y plantas transgénicos y las terapias génicas. Muy a menudo, las casetes de expresión introducidas funcionan de manera diferente al cabo de un número creciente de divisiones celulares o generaciones de plantas o animales. En una realización preferida una cualidad estable comprende la capacidad de mantener la transcripción génica en generaciones posteriores de una planta o animal transgénico. Por supuesto en el caso de que la expresión sea inducible, dicha cualidad comprende la cualidad de mantener la inducibilidad de la expresión en generaciones posteriores de una planta o animal transgénico. Frecuentemente, los niveles de expresión caen espectacularmente con el número creciente de divisiones celulares. Con un método descrito en el presente documento es posible detectar y opcionalmente seleccionar una secuencia de ADN que sea capaz de prevenir al menos en parte la espectacular caída en los niveles de transcripción con números crecientes de divisiones celulares. Dicha cualidad moduladora de la transcripción génica puede comprender una cualidad de transcripción génica estable. Sorprendentemente, los fragmentos que comprenden una secuencia de ADN con dicha cualidad de transcripción génica estable pueden ser detectados y opcionalmente seleccionados con un método descrito en el presente documento, a pesar del hecho de que dicho método no mide necesariamente la estabilidad a largo plazo de la transcripción. En una realización preferida de la invención dicha cualidad moduladora de la transcripción comprende una cualidad intensificadora de la transcripción génica estable. Se ha observado que la incorporación de una secuencia de ADN a un vector de expresión con un gen de interés, produce un nivel superior de transcripción de dicho gen de interés, tras la integración del vector de expresión al genoma de una célula y por otra parte que dicha expresión génica superior también es más estable que en ausencia de dicha secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica.

En experimentos diseñados para introducir un gen de interés en el genoma de una célula y para obtener la expresión de dicho gen de interés, se ha observado lo siguiente. Si junto con dicho gen de interés también se había introducido una secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica, se podían detectar más clones que expresaban más de una cierta cantidad de producto génico de dicho gen de interés, que cuando dicha secuencia no era introducida junto con dicho gen de interés. De este modo la presente invención también proporciona un método para incrementar el número de células que expresan más de cierto nivel de un producto génico de un gen de interés tras proporcionar dicho gen de interés al genoma de dichas células, que comprende proporcionar a dicha célula una secuencia de ADN que comprende una cualidad moduladora de la transcripción génica junto con dicho gen de interés.

Las oportunidades de detectar un fragmento con una cualidad moduladora de la transcripción génica varían con la fuente de la cual derivan los fragmentos. Típicamente, no existe un conocimiento previo de la presencia o ausencia de fragmentos con dicha cualidad. En esas situaciones muchos fragmentos no comprenderán una secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica. En estas situaciones se introduce una etapa de selección formal para las secuencias de ADN con dicha cualidad. Esto se realiza por medio de la selección de vectores que comprenden dicha secuencia basándose en una característica de un producto de dicho gen informador, que puede ser seleccionado a favor o en contra. Por ejemplo, dicho producto génico puede inducir fluorescencia o un depósito de color (v.g. proteína fluorescente verde y derivados, luciferasa o fosfatasa alcalina) o conferir resistencia a antibióticos o inducir apoptosis y muerte celular.

Un método como se describe en el presente documento es particularmente adecuado para detectar y opcionalmente seleccionar una secuencia de ADN que comprende una cualidad intensificadora de la transcripción génica. Se ha observado que al menos alguna de las secuencias de ADN seleccionadas, cuando son incorporadas a un vector de expresión que comprende un gen de interés, pueden incrementar espectacularmente la transcripción génica de dicho gen de interés en una célula huésped incluso cuando el vector no comprende un elemento con una cualidad represora de la transcripción génica. Esta cualidad intensificadora de la transcripción génica es muy útil en las líneas celulares transfectadas con genes foráneos o en animales y plantas transgénicos.

Para la presente invención dicho sistema de transcripción comprende células huésped. El uso de células huésped garantiza que los fragmentos son detectados y opcionalmente seleccionados con actividad en las células.

Un elemento con una cualidad represora de la transcripción génica reprimirá, en el método de la invención la transcripción de un promotor en el sistema de transcripción utilizado. Dicha represión no tiene que conducir a niveles de expresión no detectables. Es importante que la diferencia en los niveles de expresión en ausencia o presencia de represión sea detectable y opcionalmente seleccionable. En una realización, la represión de la transcripción génica en dichos vectores produce cromatina represora de la transcripción génica. En esta realización se pueden detectar secuencias de ADN, y opcionalmente seleccionar que sean capaces, al menos en parte, de contrarrestar la formación de cromatina represora de la transcripción génica. En un aspecto una secuencia de ADN capaz de contrarrestar, al menos en parte, la formación de cromatina represora de la transcripción génica comprende una cualidad de transcripción génica estable. En una realización la secuencia de ADN implicada en la represión de la transcripción génica es una secuencia de ADN que es reconocida por un complejo proteico y donde dicho sistema de transcripción comprende dicho complejo. Preferiblemente dicho complejo comprende una proteína de unión a heterocromatina que comprende HP1, una proteína del grupo Polycomb (Pc-G), una actividad histona desacetilasa o MeCP2 (proteína de unión a metil-CpG). Muchos organismos comprenden una o más de estas proteínas. Estas proteínas frecuentemente muestran también actividad en otras especies. Dicho complejo puede por tanto comprenden también proteínas de dos o más especies. El grupo mencionado de complejos de proteínas asociadas con cromatina conocidos es capaz de transmitir la represión de un amplio intervalo a lo largo de muchos pares de bases. Los complejos también están implicados en la transferencia estable del estado reprimido de los genes a las células hijas tras la división celular. Las secuencias seleccionadas de esta manera son capaces de transmitir la anti-represión de amplio intervalo a lo largo de muchos pares de genes (van der Vlag et al., 2000).

El vector utilizado puede ser cualquier vector que sea adecuado para la clonación de ADN y que pueda ser utilizado en un sistema de transcripción. Cuando se utilizan células huésped, se prefiere que el vector sea un vector de replicación episómica. De esta manera, se evitan los efectos debidos a los sitios de integración diferentes del vector. Los elementos de ADN que flanquean el vector en el sitio de integración pueden tener efectos sobre el nivel de transcripción del promotor y de ese modo imitar los efectos de los fragmentos que comprenden secuencias de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica. En una realización dicho vector comprende un origen de replicación del virus de Epstein- Barr (EBV), OriP, y un antígeno nuclear (EBNA-1). Tales vectores son capaces de replicar en muchos tipos de células eucarióticas y ensamblarse a la cromatina en condiciones apropiadas.

Se proporciona una secuencia de ADN que comprende i) una secuencia de ADN aislada de una planta o vertebrado, o derivados de los mismos, o ii) una secuencia de ADN sintético o una construida por medio de ingeniería genética, cuya secuencia de ADN es una secuencia inhibidora de la represión que, puede ser detectada mediante el método descrito en el presente documento, seleccionada y opcionalmente clonada. También se proporciona una secuencia de ADN que comprende i) una secuencia de ADN aislada de una planta o vertebrado, o derivados de los mismos, o ii) una secuencia de ADN sintético o una construida mediante ingeniería genética, cuya secuencia de ADN es detectada, seleccionada y opcionalmente clonada por medio del método de la invención. Preferiblemente dicha secuencia de ADN comprende una secuencia como se representa en la Tabla 4 o un homólogo funcional de la misma. Un homólogo funcional de una secuencia representada en la Tabla 4 es una secuencia derivada con la información dada en la Tabla 4. Por ejemplo, una secuencia que puede ser derivada de una secuencia de la Tabla 4 mediante deleción, modificación y/o inserción de bases en o de la secuencia enumerada en la Tabla 4, donde dicha secuencia derivada comprende la misma actividad en clase, no necesariamente en cantidad, de una secuencia como se representa en la Tabla 4. Un homólogo funcional es adicionalmente una secuencia que comprende una parte de dos o más secuencias representadas en la Tabla 4. Una secuencia de ADN sintético es una secuencia que no deriva directamente o indirectamente de una secuencia presente en un organismo. Por ejemplo una secuencia que comprende una secuencia scs o scs' de drosophila no es una secuencia sintética, ni siquiera cuando la secuencia scs o scs' es generada artificialmente.

La presente invención proporciona en particular una secuencia de ADN aislada y/o recombinante que tiene actividad antirepresora, dicha secuencia seleccionada de un grupo que consiste en:

(a): ID SEC.: 27 en la figura 20;

(b): un fragmento de ID SEC.: 27 en la Figura 20;

(c): una secuencia derivada de ID SEC. N°: 27 en la figura 20 por inserción, deleción y/o mutación de una o más bases;

: en la que la actividad antirepresora de dicha secuencia confiere a una célula de osteosarcoma U-2 OS humana la habilidad de crecer después de 4-5 semanas de cultivo en presencia de zeocina 250 \mug/ml y doxiciclina 0,1 ng/ml, cuando dicha célula comprende una proteína de fusión represora de LexA que contiene el dominio de unión a ADN LexA y una región codificante de HP1 o HPC2 bajo control del sistema regulatorio transcripcional Tet-Off, cuando dicha secuencia de ADN aislado y/o recombinante se clona en una secuencia de policlonaje en un plásmido, situándose dicha región de policlonaje entre cuatro sitios operadores LexA y el promotor SV40 que controla el gen de resistencia a zeocina, cuando el plásmido está presente en dicha célula.

En un aspecto la invención se refiere al conocimiento creciente de la regulación génica de orden superior y a los medios y métodos para utilizar este conocimiento. Si bien se han caracterizado elementos, tales como los promotores y los intensificadores clásicos, que dirigen y regulan la transcripción de genes individuales, los elementos reguladores de orden superior que gobiernan las capacidades de la transcripción génica de regiones cromosómicas completas todavía han recibido poca atención. Gran parte del conocimiento de los autores de la presente invención referente a semejantes elementos de orden superior proviene del estudio de la embriogénesis. Durante la embriogénesis las células quedan comprometidas en diferentes rutas evolutivas. Una vez comprometidas, las células raramente cambian su destino, ni siquiera después de muchas divisiones celulares.

Esta quedando cada vez más claro que la transmisión estable de los patrones de transcripción génica específicos del tipo de célula no depende del contexto de un promotor, sino que en lugar de eso está mediada por cambios en la estructura del ADN y las proteínas asociadas, denominadas

El molde de cromatina es un complejo altamente condensado de ADN, histonas, y proteínas no histónicas, que es capaz de empaquetar el genoma completo en el núcleo y simultáneamente permitir la transcripción apropiada de los genes específicos. El cromosoma eucariótico no es un molde uniforme para la activación de la transcripción génica. Se pueden distinguir diferentes tipos de cromatina y regiones de cromatina, que afectan de modo diferente a la transcripción génica. Las llamadas regiones de heterocromatina identifican estructuras de cromatina "cerradas" mientras la eucromatina está asociada con una estructura de cromatina "abierta" más difusa. La región de eucromatina puede ser sometida a cambios estructurales, dando como resultado estructuras más o menos condensadas, referidas como heterocromatina y eucromatina facultativas. Se cree que la formación de eucromatina o heterocromatina facultativa representa el mecanismo subyacente de la regulación génica mediada por cromatina, manteniendo los genes en un estado activo o reprimido, de una manera específica del tipo célular.

En todos los eucariotas se han identificado numerosos complejos asociados con cromatina que están implicados en el mantenimiento de la especificidad del tipo celular, uno de los cuales es el complejo del grupo Polycomb (PcG). El complejo PcG está implicado en la represión estable de los genes, en los que se cree que los cambios en la estructura de la cromatina juegan un importante papel. De un modo similar, se ha identificado una segunda clase de proteínas, denominada grupo trithorax (Trg), que contrarresta la acción de las proteínas PcG. Las proteínas TrG están implicadas en el mantenimiento de la transcripción génica. Basándose en sus respectivos modos de acción, las proteínas PcG y TrG representan por lo tanto un sistema de memoria celular que es importante para la transmisión heredable de los patrones de transcripción génica.

Cómo están asociados los complejos de PcG y TrG con sus genes diana todavía no está claro. Estudios genéticos han caracterizado secuencias reguladoras que actúan en cis que mantienen estados transcripcionalmente inactivos de los genes. El silencio mediado por estas secuencias reguladoras que actúan en cis depende de la presencia de proteínas PcG funcionales, y por tanto estas secuencias han sido denominadas elementos de respuesta a PcG (PRE). Se han identificado secuencias que están implicadas en la represión de la cromatina mediada por PcG. Sin embargo, todavía no se ha encontrado (en vertebrados ni en plantas) PRE completos que comprendan toda la información de la secuencia requerida para mediar la represión de la cromatina en vertebrados ni en plantas) no se han encontrado PRE completos que comprendan toda la información de la secuencia requerida para mediar la represión de la cromatina.

Un elemento de respuesta al grupo Polycomb es un elemento que es capaz de reprimir la transcripción de un promotor en respuesta a la interacción directa y/o indirecta de una o más proteínas del grupo Polycomb con dicho elemento. Un elemento de respuesta de tipo grupo Polycomb es un elemento de respuesta al grupo Polycomb o alternativamente es un elemento capaz de reprimir la transcripción de un promotor tras la interacción directa y/o indirecta de una o más proteínas con dicho elemento, donde dichas una o más proteínas no pertenecen al grupo Polycomb, pero donde como resultado de dicha represión de la transcripción génica por la interacción se forma cromatina. Los ejemplos de tales proteínas son proteínas asociadas con cromatina tales como la proteína heterocromatina 1 (HPLJL) (Eisenberg et al., 1990). Otra proteína asociada con la cromatina que reprime la actividad génica es la proteína de unión a metil-CpG, MeCP2 (Nan et al., 1997). En una realización preferida un elemento sensible de tipo grupo polycomb de la invención comprende la capacidad para reprimir la transcripción de un promotor a lo largo de grandes distancias, preferiblemente a lo largo de más de 2.000 pares de bases (van der Vlag et al., 2000).

Un gen informador es un gen que codifica un producto de expresión cuya presencia puede ser detectada directamente o indirectamente en una célula.

Entre los ejemplos de las secuencias de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica se encuentran los denominados elementos STAR enumerados en las Tablas 1 y 2.

Los métodos como se describen en el presente documento producen la clonación e identificación de numerosos elementos que comprenden una actividad moduladora de la transcripción génica. Semejante elemento puede contener ácido nucleico irrelevante que no es instrumental en el desempeño de dicha cualidad, por ejemplo no implicado en la formación de cromatina represora de la transcripción génica. Las secuencias funcionales de tales elementos pueden ser delineadas por medio de diversos métodos conocidos en la técnica. En una realización se realizan deleciones y/o sustituciones en una secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica. El ADN que es modificado de tal modo, es sometido a ensayo en cuanto a la actividad. Esto se puede realizar utilizando un ácido nucleico modificado individual o generando una colección de ácidos nucleicos de ensayo que comprende dicho ácido nucleico modificado. La elucidación de las secuencias funcionales dentro de las secuencias de ADN de la invención permite la elucidación de las secuencias consenso para los elementos con una cualidad moduladora de la transcripción génica. Se prevé que se encontrará más de un tipo de secuencias consenso para un elemento que comprenda una cualidad moduladora de la transcripción génica. Se puede proporcionar una genoteca de ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que comprenden cualidades moduladoras de la transcripción génica y/o represora de la transcripción génica tales como elementos de respuesta de tipo grupo polycomb. En una realización dicha genoteca comprende ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que comprenden la misma secuencia consenso. En una realización dicha genoteca comprende más de un tipo de secuencias consenso. Dicha genoteca puede ser utilizada por ejemplo para determinar si una molécula de ADN dada comprende una cualidad moduladora del ADN. En una realización preferida dicha genoteca comprende esencialmente todos los elementos con una función intensificadora de la transcripción génica, elementos que comprenden una cualidad de la transcripción génica estable y/o elementos con una cualidad represora de la transcripción génica tales como elementos de respuesta de tipo grupo polycomb, de un cromosoma. Junto con el conocimiento de la localización de estos elementos en el cromosoma esto permite a un experto en la técnica generar una predicción de la regulación de orden superior de la expresión génica de genes naturalmente presentes en dicho cromosoma y de genes (ácido nucleico foráneo) introducidos en dicho cromosoma mediante medios recombinantes. Semejante predicción puede ser utilizada por ejemplo para seleccionar una localización candidato adecuada en dicho cromosoma para la inserción de ADN foráneo. Una localización adecuada puede ser la localización que se espera que sea expresada específicamente en una cierta célula, tipo celular y/o tejido. Preferiblemente, dicho cromosoma comprende el cromosoma 21 o el cromosoma 22. En una realización todas las secuencias de ADN que comprenden una cualidad moduladora de la transcripción génica o represora de la transcripción génica en una célula, están en la genoteca. En esta realización se puede utilizar el genoma completo para la predicción de una localización candidato adecuada. En una realización dicha genoteca ha sido generada en diferentes líneas celulares de especies que oscilan entre plantas y humanos. En diferentes líneas y/o especies celulares se expresarán proteínas diferentes (o complejos de proteínas) capaces de interaccionar con secuencias de ADN con una cualidad represora de la transcripción génica, dando como resultado diferentes elementos de ADN con una cualidad represora de la transcripción génica. De un modo similar se expresarán diferentes proteínas que interaccionan directa o indirectamente con secuencias de ADN que comprenden una cualidad moduladora de la transcripción génica. Por lo tanto la elaboración de la genoteca depende del tipo celular y depende de la presencia de proteínas relevantes. Este también es el caso con los elementos de respuesta de tipo grupo polycomb. Si HP1 es expresada en el tipo celular uno, los elementos dependientes de HP1 serán detectados mediante el método de la invención. Si HP1 no es expresada en el tipo celular dos, el método de la invención no detectará el elemento que ha sido recuperado del tipo celular uno.

En un aspecto dicha genoteca comprende al menos un elemento capaz de contrarrestar, al menos en parte, la formación de cromatina represora de la transcripción génica. Junto con el conocimiento de la localización de las secuencias de ADN con una cualidad represora de la transcripción génica en un cromosoma o genoma, el conocimiento de la localización de semejantes elementos contrarrestadores permite la predicción exacta de la regulación de orden superior de la transcripción génica de genes (insertados) en dicho cromosoma o genoma. Preferiblemente dicha genoteca comprende otros elementos reguladores de la transcripción tales como intensificadores y silenciadores. Aunque tales secuencias han limitado la influencia sobre la regulación génica de orden superior, la información sobre la localización de tales otras secuencias incrementa adicionalmente la exactitud de la predicción de las localizaciones adecuadas en el genoma para la expresión de secuencias foráneas introducidas allí. Preferiblemente, dicha genoteca comprende esencialmente todas las secuencias de ADN que comprenden una cualidad moduladora de la transcripción génica y/o todas las demás secuencias reguladoras de un cromosoma.

Considerando que un cromosoma ya consta típicamente de varias decenas de millones de bases, se prefiere que la información que la genoteca pueda proporcionar sobre la regulación génica de orden superior sea incorporada en un sistema al menos parcialmente automatizado.

Otro uso de una genoteca es la generación de una predicción de la transcripción de genes tras la modificación elegida como diana de las secuencias de un cromosoma de manera que las secuencias reguladoras de "orden superior" sean mutadas. Por ejemplo, uno o más elementos sensibles de tipo grupo polycomb de la invención, y/o otros elementos reguladores de dicho cromosoma pueden ser mutados. Se espera que esto cambie los niveles de transcripción de los genes que están en las proximidades de los elementos sensibles de tipo grupo polycomb y/o otros elementos moduladores de la expresión.

Otro uso más de una genoteca o sistema es la predicción de la expresión génica resultante de las mutaciones del genoma. En los casos en los que una mutación da como resultado una transcripción génica alterada, la detección de semejante transcripción génica alterada puede indicar la presencia de dicha mutación de origen natural. Este enfoque es útil por ejemplo al limitar el número de secuencias de proteínas que van a ser sometidas a ensayo en un análisis de diagnóstico. Esto es particularmente importante en los enfoques de micromatrices debido a que en estos enfoques el número de secuencias expresadas que va a ser sometido a ensayo, está limitado por el número de secuencias que puede contener una matriz como máximo. Con los medios y métodos como se describen en el presente documento es posible limitar el número de secuencias que van a ser sometidas a ensayo en los enfoques de micromatrices.

Otro uso más de un sistema o genoteca es el descubrimiento de las dianas de fármaco. Los elementos reguladores, sean elementos de "orden superior" o no, funcionan debido a la proteína (complejos) que se puede unir a ellos. Se puede utilizar un sistema para determinar si el redireccionamiento de los fármacos para interferir en la unión o la función de una proteína concreta (complejo) proporciona la esperanza de la alteración de un gen concreto.

De acuerdo con la invención se proporciona también un constructo de ADN con una secuencia de ADN de la invención. En una realización preferida se proporciona un constructo de ADN que comprende un promotor conectado operablemente con un ácido nucleico de interés. Preferiblemente, la cantidad de actividad de una cualidad de dicha secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica, depende de la orientación de dicha secuencia de ADN en dicho constructo, en comparación con dicho promotor. Preferiblemente dicha cualidad moduladora de la transcripción génica depende de la presencia de una señal. Preferiblemente, dicha señal comprende una proteína de unión a ADN. Preferiblemente, dicha señal comprende una proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana.

Uno de los usos de una secuencia de ADN que comprende una cualidad moduladora de la transcripción génica es por supuesto la regulación de la transcripción de un gen de interés. La transcripción de un gen de interés puede ser alterada alterando las secuencias en las proximidades de dicho gen de manera que las secuencias de ADN con cualidades moduladoras de la transcripción génica se pueden generar de cualquier clase o cantidad o ambas.

Asimismo es posible diseñar secuencias de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica deseada. Las proteínas de unión a ADN junto con otras proteínas y secuencias de ADN determinan las cualidades de la secuencia de ADN. Es posible insertar una o más secuencias de ADN de unión a proteínas en una secuencia de ADN con una cualidad. Permitiendo la unión de la proteína o las proteínas de unión es posible interferir en, o dirigir, la cualidad, permitiendo de este modo la generación de secuencias de ADN con cualidades constructoras. Por supuesto también es posible separar sitios de unión a la proteína de una secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica alternado de ese modo la cualidad de las secuencias de ADN resultantes. La combinación de la adición y eliminación también es posible. Se pueden seleccionar cualidades moduladoras de la transcripción génica concretas poniendo a punto los métodos de detección descritos en la presente invención. Por ejemplo es posible sintetizar secuencias de ADN con cualidades moduladoras de la transcripción génica inducibles. Se encuentran disponibles proteínas de unión a ADN que solamente se unen a su secuencia diana en ausencia o presencia de una señal. Los ejemplos no limitantes de tales proteínas son el represor TET y las diversas mutaciones del mismo, el represor lac, los receptores de hormonas esteroides, el receptor del ácido retinoico, y sus derivados. Es posible por ejemplo diseñar una secuencia de ADN con una cualidad modulador de la transcripción génica específica del tipo celular. La secuencia de ADN se
puede hacer específica para un complejo de proteína que sea expresado de una manera específica del tipo célular.

Los constructos de expresión que comprenden una secuencia de ADN que comprende una cualidad moduladora de la transcripción génica son adecuados para obtener la expresión de dicho constructo en células que comprenden más de una copia de dicho constructo de expresión. Asimismo cuando el constructo de expresión está presente en el genoma de dicha célula y, asimismo cuando la casete de expresión está presente en más de una copia de dicha célula. Por otra parte, incluso funcionan cuando son integrados en la misma posición en más de una copia.

En una realización preferida de la invención dicha secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica comprende un constructo denominado STAR (Stabilizing Anti-Repression) está presente en el genoma de dicha célula y, asimismo cuando la casete de expresión está presente en más de una copia de dicha célula. Por otra parte, incluso funcionan cuando son integrados en la misma posición en más de una copia.

De acuerdo con la invención dicha secuencia de ADN que tiene actividad anti-represora comprende una secuencia denominada STAR (Stabilizing Anti-Repression). Una secuencia STAR según se utiliza aquí hace referencia a una secuencia de ADN que comprende una o más de las cualidades moduladoras de la transcripción génica mencionadas.

Se presentan aquí numerosos métodos para determinar si una secuencia comprende actividad STAR. La actividad STAR es confirmada si la secuencia es capaz de realizar al menos una de las siguiente funciones: (i) inhibir al menos en parte el efecto de la secuencia que comprende un elemento de represión de la transcripción génica de la invención, (ii) bloquear al menos en parte la represión asociada con la cromatina, (iii) bloquear al menos en parte la actividad de un intensificador, (iv) conferir a un ácido nucleico conectado operablemente que codifica una unidad de transcripción en comparación con el mismo ácido nucleico solo (iv-a) un predictibilidad de la transcripción superior, (iv-b) un transcripción superior, y/o una estabilidad de la transcripción a lo largo del tiempo superior.

El gran número de secuencias que comprenden actividad STAR identificadas en la presente invención abre una amplia variedad de posibilidades para generar e identificar las secuencias que comprenden la misma actividad en clase, no necesariamente en cantidad. Por ejemplo, está dentro del alcance del experto en la técnica alterar las secuencias identificadas en la presente invención y someter a ensayo las secuencias alteradas en cuanto a la actividad STAR. Tales secuencias alteradas son también por lo tanto parte de la presente invención. La alteración puede incluir la deleción, inserción y mutación de una o más bases en las secuencias.

Las secuencias que comprenden actividad STAR fueron identificadas en tramos de 400 bases. No obstante, no se espera que sean necesarias las 400 bases para conservar la actividad STAR. Los métodos para delimitar las secuencias que confieren una cierta propiedad a un fragmento de entre 400 y 5.000 bases son bien conocidos. Se estima que la longitud de la secuencia mínima de un fragmento que comprende actividad STAR es de aproximadamente 50 bases.

La actividad STAR es un rasgo compartido por las secuencias enumeradas en la Figura 20.

Como se ha mencionado antes, una secuencia STAR puede ejercer su actividad de un modo direccional, es decir, conteniéndola un lado del fragmento más que otro. Por otra parte, la actividad STAR puede ser amplificada en cantidad multiplicando el número de elementos STAR. Esto último sugiere que un elemento STAR puede comprender uno o más elementos que comprendan actividad STAR.

El término cualidad en relación con la secuencia hace referencia a una actividad de dicha secuencia. El término STAR, secuencia STAR o elemento STAR, según se utiliza aquí, hace referencia a una secuencia de ADN que comprende una o más de las cualidades moduladoras de la transcripción génica mencionadas. El término "secuencia de ADN" según se utiliza aquí, a menos que se especifique de otro modo, no hace referencia a un listado de ordenamiento específico de bases sino más bien a una porción física de ADN. Una cualidad de transcripción con referencia a una secuencia de ADN hace referencia a un efecto que dicha secuencia de ADN tiene sobre la transcripción de un gen de interés. Según se utiliza aquí, "cualidad" hace referencia a las propiedades detectables o atributos de un ácido nucleico o proteína en un sistema de transcripción.

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Ejemplos Ejemplo 1 Métodos para aislar elementos STAR Materiales y métodos

Plásmidos y cepas. El vector de seleción para los elementos STAR, pSelect-SV40-zeo ("pSelect", Figura 1) es construido como sigue: el vector pREP4 (Invitrogen V004- 50) es utilizado como esqueleto plasmídico. Este proporciona el origen de replicación oriP de Epstein Barr y el antígeno nuclear EBNA-1 para la replicación episómica de elevado número de copias en líneas celulares de primate; el gen de resistencia a la higromicina con el promotor de la timidina quinasa y el sitio de poliadenilación, para la selección en células de mamífero; y el gen de resistencia a ampicilina y el origen colE1 de derivado de pSV40/Zeo (Invitrogen V502- 20); este es el marcador seleccionable para el rastreo de STAR.

El vector pSDH (Figura 2) es construido como sigue: El gen informador de la luciferasa de pGL3-Control (Promega E1741) es amplificado mediante PCR e insertado en pUHD10-3 digerido con SacII/BamHI (Gossen and Bujard, 1992). Este coloca la luciferasa bajo el control del promotor Tet-Off, y aguas arriba de la señal de poliadenilación de SV40. Se introducen múltiples sitios de clonación mediante PCR, aguas arriba del promotor Tet- Off (MCSI, XhoI-NotI-EcoRI-SalI) y aguas abajo de la señal de poliadenilación (MCSII, NbeI-BglII-EcoRV- HindIII).

Se construyen genotecas génicas mediante digestión con Sau3AI de ADN genómico humano, ya sea purificado a partir de placenta (Clontech 6550-1) o portado en cromosomas artificiales bacteriano/P1 (BAC/PAC). Los clones BAC/PAC contienen ADN genómico de la región citogenética 1q12 (clones RP1154H19 y RP3328E19) o a partir de la agrupación HOX de genes homeóticos (clones RP1167F23, RP1170019, y RP11387A1). Los ADN son fraccionados por tamaño, y la fracción de tamaño 0,5 - 2 kb es ligada en el vector pSelect digerido con BamHI, mediante mecanismos normalizados (Sambrook et al., 1989).

La construcción de las células huésped ha sido descrita (van der Vlag et al., 2000). Brevemente, se basan en la línea celular de osteosarcoma humano U-2 OS (American Type Culture Collection HTB-96). U-2 OS es transfectada establemente con el plásmido pTet-Off (Clontech K1620-A), que codifica una quimera de proteína que consta del dominio de unión a ADN del represor Tet y el dominio de transactivación VP16. La línea celular es transfectada establemente con posterioridad con genes de la proteína de fusión que contienen el dominio de unión al ADN LexA, y las regiones codificadoras de HP1 o HPC2 (dos proteínas del grupo Polycomb de Drosophila que reprimen la expresión génica cuando se traban al ADN). Los genes represores de LexA están bajo el control del sistema regulador transcripcional Tet-Off (Gossen and Bujard, 1992).

Rastreo de la genoteca y caracterización del elemento STAR. Los genotecas génicas de pSelect son transfectadas en la línea celular U-2 OS/Tet-Off/represor LexA mediante precipitación con fosfato de calcio (Graham and van der Eb, 1973; Wigler et al., 1978) como recomendaba el proveedor del reactivo de transfección (Life Technologies). Las células transfectadas son cultivadas bajo selección con higromicina (25 \mug/ml) y represión con tetraciclina (doxiciclina, 10 ng/ml) durante 1 semana (confluencia 50%). Después la concentración de doxiciclina se reduce a 0,1 ng/ml para inducir los genes represores de LexA, y después de 2 días se añade zeocina a 250 \mug/ml. Las células son cultivadas durante 4-5 semanas más, hasta que los cultivos de control (transfectados con pSelect vacío) son eliminados por la zeocina.

Las colonias resistentes a zeocina de esta transfección de la genoteca son propagadas, y el ADN plasmídico es aislado y recuperado en E. coli mediante mecanismos normalizados (Sambrook et al., 1989). Los elementos STAR candidatos del ADN rescatado son analizados mediante mapeo con endonucleasas de restricción (Sambrook et al., 1989), análisis de la secuencia de ADN (Sanger et al., 1977), y actividad de STAR (resistencia a zeocina) después de la re-transfección a U-2 OS/Tet-Off/represor LexA y disminución de la concentración de doxiciclina.

Los elementos STAR candidatos que tienen una secuencia de ADN correspondiente a una secuencia conocida en el genoma humano son identificados mediante búsquedas

BLAST (Altschul et al., 1990) de la base de datos del genoma humano (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/
HsBlast.html 20 Junio 2001). Las localizaciones cromosómicas de los elementos son registradas, junto con la proporción de ADN repetitivo y la identidad de los genes adyacentes.

Aquellos candidatos que muestran actividad STAR tras la re-transfección son caracterizados adicionalmente por la subclonación del fragmento STAR en el plásmido pSDH y la integración estable en el ADN cromosómico de U-2 OS. Los plásmidos de pSDH son co-transfectados en células U-2 OS con pBABE puro (Morgenstern and Land, 1990), y seleccionados en cuanto a la resistencia a la puromicina. Se aíslan y cultivan poblaciones de aproximadamente 30 clones individuales por elemento STAR. Los clones son analizados periódicamente en cuanto a la actividad luciferasa según las instrucciones del fabricante (Roche 1669893).

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Resultados

Caracterización del elemento funcional STAR. Los rastreos de ADN genómico y de los loci HOX y 1q12 rindieron 17 elementos STAR genuinos. Los criterios son que (a) los elementos desplegaban actividad STAR tras la re-transfección de los clones basados en pSelect en la línea celular de osteosarcoma humano U-2 OS huésped (indicando que la actividad anti-represora expresada en el rastreo inicial es específica del plásmido y no debida a cambios por artefactos en las células huésped); (2) los elementos contienen una secuencia de ADN que coincide con la secuencia de la base de datos del genoma humano (indicando que el clon no contiene una secuencia de ADN contaminante, v.g. de fuentes bacterianas o de vectores).

Los elementos STAR son sub-clonados en el plásmido pSDH e integrados en el genoma de la célula huésped. La expresión de los genes informadores es analizada en poblaciones de transfectantes estables para demostrar la capacidad de los elementos STAR para proteger los genes informadores del silenciamiento después de la integración al azar en el genoma. Esto proporciona información (1) sobre la proporción de clones que despliegan una expresión elevada, y (2) sobre el grado de sobre-expresión logrado por los elementos STAR.

La expresión del gen informador de la luciferasa por un clon es considerada significativa si está dos veces por encima del nivel medio para los plásmidos que no contienen elementos STAR (nivel de referencia). Para todos los plásmidos se observa una distribución en el nivel de expresión entre los clones: desde la no expresión hasta una expresión significativamente por encima del nivel de referencia, y desde unos pocos sobre-expresadores a muchos sobre-expresadores. La actividad STAR superior es manifestada por los plásmidos que dan como resultado muchos clones de sobre-expresión, incluyendo algunos clones altamente sobre-expresados. Los resultados de un experimento representativo se muestran en la Tabla 1, y en las Figuras 3-5:

Los resultados indican que los elementos STAR humanos que son sometidos a ensayo rinden una proporción mucho mayor de clones de sobre-expresión que el gen informador no protegido, o el gen informador protegido por el elemento SCS de Drosophila (Kellum and Schedl, 1992). Además, el grado de sobre-expresión por estos plásmidos es mucho mayor a partir del gen informador protegido con STAR que del informador no protegido o protegido con
SCS.

Secuencia del elemento STAR y datos de la posición genómica. En la Tabla 2 se enumeran las localizaciones cromosómicas de cada uno de los 17 elementos STAR, así como la identidad de los genes inmediatos y el contenido de ADN repetitivo de los elementos. Los elementos STAR se distribuyen a lo largo de numerosos cromosomas. Son diversos en su secuencia de ADN real y contenido en ADN repetitivo, y despliegan diversos grados de asociación con los genes vecinos.

Ejemplo 2 Características de la expresión del transgen que son debidas al STAR

Antecedentes: se utiliza la recombinación de sitio específico para separar precisamente los ADN heterólogos de sus localizaciones cromosómicas. Esto se lleva a cabo rutinariamente por medio de uno de dos sistemas: la recombinasa cre y la diana loxP del bacteriófago P1 (Feng et al., 1999), o la recombinasa FLP y FRT (diana recombinasa FLP) de la levadura (Wigley et al., 1994). En estos sistemas, una región de ADN (conteniendo normalmente un gen informador y/o un marcador seleccionable) está flanqueada en el cromosoma por la diana loxP o FRT. La actividad de la recombinasa cataliza después la separación por corte precisa de la región de ADN del cromosoma. La recombinasa resuelve sus dos secuencias de reconocimiento en un único sitio, suprimiendo la secuencia entre ellas. De este modo, un tramo de ADN debe estar flanqueado por sitios diana que van a ser suprimidos con posterioridad in vivo tras la introducción o activación de la recombinasa (Schwenk et al., 1995; Dymecki, 1996). Las recombinasas Cre y Flp catalizan la recombinación entre dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases, separadas por un espaciador con un mínimo de 6 (loxP) u 8 (FRT) pares de bases (Senecoff et al., 1985). La secuencia loxP es ATAACTTCGTATA y la secuencia FRT es GAAGTTCCTATAC.

Protocolo: Utilizando la clonación de ADN convencional (Sambrook et al., 1989), se construye un gen informador (que codifica una proteína informadora, por ejemplo la proteína fluorescente verde (GFP) (Bierhuizen et al., 1997) o la luciferasa (Himes and Shannon, 2000) que está flanqueado en un plásmido por un par de elementos STAR. En cada caso, los elementos están a su vez flanqueados por sitios diana de la recombinasa. Un elemento está flanqueado por un par de sitios loxP, y el otro está flanqueado por un par de sitios FRT (Figura 1). Tras la transfección el plásmido se integra en el cromosoma del huésped en un pequeño porcentaje de células, y los integrantes se seleccionan mediante resistencia a antibióticos.

Utilizando los mecanismos convencionales, ("SuperFect Transfection Reagent Handbook", Qiagen, Noviembre, 1997) estos plásmidos son transfectados en la línea celular de osteosarcoma humano U-2 OS, y seleccionados en cuanto a la resistencia a la higromicina. Los productos aislados resistentes a la higromicina tienen el plásmido integrado establemente en el genoma de la línea celular. Los productos aislados individuales son propagados en medio de cultivo celular, y la expresión del gen informador transgénico es analizada, por ejemplo mediante citometría de flujo (Stull et al., 2000).

Después utilizando mecanismos convencionales (transfección, o estimulación con hormonas), los productos aislados estables anteriores son tratados con el fin de introducir o activar la actividad recombinasa. Esto se realiza sucesivamente, de manera que por ejemplo la actividad de la recombinasa que catalice la separación por corte de STAR1, y con posterioridad la actividad recombinasa FLP catalice la separación por corte de STAR2. El nivel de expresión de este gen informador en estas células es analizado y el valor comparado con el valor de referencia del producto aislado que contiene STAR parental.

Ejemplo 3 Análisis de la secuencia de los STAR; determinación de la secuencia esencial mínima para la función del elemento; conservación de la secuencia entre elementos; y propiedades de elementos en tándem y múltiples

Antecedentes: Se aíslan fragmentos de ADN que contienen elementos STAR mediante selección genética utilizando el plásmido pSelect (Figura 1). En esta sección se describe el enfoque para caracterizar las secuencias de ADN dentro de aquellos fragmentos que tienen actividad STAR.

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Protocolos:

Secuencia de ADN: Se diseñan oligonucleótidos basándose en la secuencia del plásmido pSelect para secuenciar los fragmentos de ADN. Los fragmentos son secuenciados utilizando la técnica de terminación de la cadena didesoxi (Sanger et al., 1977). Las secuencias de ADN son localizadas después con respecto a su posición en el cromosoma utilizando la base de datos de la secuencia del genoma humano pública (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/cgibin/Entrez/hum_
srch?chr=humchr.inf&query). Los genes y la densidad génica en la vecindad del fragmento son registrados a partir de la anotación de la secuencia del genoma. La actividad transcripcional de aquellos genes es determinada a partir de las bases de datos públicas de micromatrices de ADN (http://arrays.rockefeller.edu/xenopus/links.html) y datos SAGE (Serial Analysis of Gene Expression; http://bioinfo.amc.uva.nl/HTM-bin/index.cgi). Una vez recopilada la información posicional sobre las secuencias STAR, los datos son analizados en términos de las secuencias consenso subyacentes. Las secuencias consenso o las tendencias (por estas se entiende las áreas locales ricas en combinaciones de nucleótidos concretas, v.g. ricas en bases C y G) son detectadas utilizando algoritmos de búsqueda de la similitud tales como la puntuación de similitud clustalw (Higgins et al., 1996) y blosum (Altschul and Gish, 1996). Después se utilizan cualquiera de los consensos subyacentes o tendencias encontrados para identificar otros STAR potenciales realizando búsquedas BLAST (Altschul et al., 1990). La búsqueda previa ha identificado proteínas reguladoras de la transcripción que se unen a aislantes y elementos límite conocidos (Gaszner et al., 1999; Gerasimova and Corces, 1998). En los ejemplos descritos antes, los sitios de unión a la proteína coinciden con los sitios hipersensibles a la DNasa I que son esenciales para la función del aislante o el límite. La hipótesis de que los elementos STAR también están unidos por proteínas reguladoras conocidas es examinada investigando la base de datos TRANSFAC de factores de transcripción (http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/) en cuanto a los motivos secuenciales que existen en los elementos STAR. Los motivos secuenciales que son comunes entre los miembros de las colecciones de STAR son indicadores de que el factor de transcripción correspondiente se une a ese elemento.

Secuencia esencial mínima: Utilizando este conocimiento, los elementos STAR son truncados y sometidos a ensayo en cuanto a su funcionalidad. Esto se realiza utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para clonar sub-fragmentos de los fragmentos que contienen STAR en pSelect mediante mecanismos normalizados (Sambrook et al., 1989). Los plásmidos que contienen los sub-fragmentos son transfectados en células U-2 OS y sometidos a ensayo en cuanto a la funcionalidad analizando la resistencia a antibióticos.

Direccionalidad: Los elementos STAR son sometidos a ensayo en cuanto a su direccionalidad utilizando el plásmido pSelect. Por ejemplo, la dirección de los elementos STAR aislados mediante el rastreo de pSelect es referida como orientación 5'3'. La orientación del elemento es invertida mediante mecanismos de recombinación de ADN convencionales (Sambrook et al., 1989). Los plásmidos resultantes son transfectados en la línea celular U-2 OS y la expresión del gen informador es analizada (Bierhuizen et al., 1997; Himes and Shannon, 2000). El nivel de expresión del plásmido con el elemento de orientación inversa es comparado con el de orientación 5'3'. Si el plásmido de orientación inversa tiene niveles de expresión similares, el elemento STAR no muestra direccionalidad.

Combinaciones y múltiplos de elementos: Para determinar si los elementos STAR son capaces de funcionar en pares mezclados, se combinan elementos diferentes y se someten a ensayo. El análisis se realiza en el plásmido pSDH insertando un elemento STAR en MCSI y un STAR diferente en MCSII mediante mecanismos de ADN recombinante (Sambrook et al., 1989). Los plásmidos resultantes son transfectados, y la expresión del gen informador es analizada (Bierhuizen et al., 1997; Himes and Shannon, 2000); los resultados son comparados con la expresión de plásmidos que contienen el mismo elemento en MCSI y MCSII; si la expresión es similar para los dos tipos de plásmidos, se concluye que los elementos STAR diferentes no interfieren entre sí.

La resistencia de los elementos STAR individuales se compara con las repeticiones en tándem de los elementos. Esto se realiza mediante concatamerización de los elementos STAR de interés con ADN ligasa e inserción del producto de ligadura en el plásmido pSDH mediante mecanismos de ADN recombinante (Sambrook et al., 1989). Los plásmidos resultantes son transfectados en células U-2 OS, y la expresión del gen informador es analizada (Bierhuizen et al., 1997; Himes and Shannon, 2000); Los resultados se comparan con la expresión de plásmidos que contienen elementos STAR individuales.

Ejemplo 4 Determinación de la distancia a lo largo de la cual funciona STAR

Antecedentes: se utilizan elementos STAR para optimizar la expresión de transgenes individuales y múltiples. Para determinar si un único par de elementos STAR puede proteger transgenes grandes o múltiples del silenciamiento es necesario determinar el intervalo a lo largo del cual actúan los elementos STAR.

Protocolo: Los elementos STAR son sometidos a ensayo en cuanto a su funcionalidad a lo largo de una distancia utilizando plásmidos derivados basados en pSelect, como sigue. Se ensambla una genoteca de fragmentos de ADN al azar de 500 pb a 10 kb mediante mecanismos de clonación de ADN normalizados (Sambrook et al., 1989). De esta genoteca se seleccionan los fragmentos que no poseen actividad STAR, sometiéndolos a ensayo en el plásmido pSelect como se ha descrito antes. Para los elementos STAR, estos fragmentos son insertados entre el sitio de clonación y el promotor del gen informador en el plásmido pSelect apropiado (Figura 1). Este grupo de plásmidos es transfectado a la línea célular U-2 OS, y la expresión es medida como se ha descrito antes. La resistencia de la expresión del gen informador se corresponde con la longitud del fragmento de ADN al azar que separa el elemento STAR y el promotor.

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Ejemplo 5 Determinación de la longitud máxima de los elementos STAR

Antecedentes: los STAR son clonados como fragmentos de ADN recuperados utilizando el plásmido pSelect, lo que se realiza con fragmentos de ADN genómico de menos de 2 kb. No obstante, estos podrían ser porciones de un elemento STAR más ampliado. La actividad de STAR ampliada se examina mediante los siguientes experimentos.

Protocolo: los elementos STAR clonados en pSelect son mapeados para la secuencia del genoma humano. Con el fin de determinar si son porciones de un elemento STAR más ampliado, las regiones de 4 kb que abarcan los clones son amplificadas mediante PCR y clonadas en el plásmido pSelect y/o pSDH mediante mecanismos de ADN recombinante normalizados (Sambrook et al., 1989). Los plásmidos resultantes son transfectados en células U-2 OS y analizados en cuanto a la expresión del gen informador como se ha descrito antes; los plásmidos que contienen el elemento STAR de 2 kb original son incluidos como control. Se pueden esperar tres posibles resultados: (1) una expresión similar por los productos aislados de control y ampliados, demostrando que el elemento STAR está confinado al fragmento de 2 kb original; (2) una expresión inferior por los productos aislados de STAR ampliado, sugiriendo que el elemento STAR está contenido en el fragmento de 2 kb y no actúa eficazmente a lo largo de una distancia o que el fragmento ampliado contiene un elemento con una cualidad represora de la transcripción génica; (3) una expresión superior por los productos aislados de STAR ampliado, sugiriendo que la región ampliada contiene un elemento STAR más completo. En el caso del resultado (3), el ejercicio se reitera con un fragmento de PCR más grande de
6 kb.

Un elemento STAR también puede estar compuesto por sitios a los cuales se unen diversas proteínas. Por lo tanto los fragmentos de ADN grandes con una actividad STAR podrían ser divisibles en fragmentos más pequeños con actividad STAR (ver ejemplo 3). Los elementos que son mayores de 2 kb son reconocidos como elementos STAR si todavía presentan actividad STAR tras el truncamiento a menos de 2 kb (incluyendo por medio de deleción interna).

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Ejemplo 6 Estados de metilación y acetilación de histona de elementos STAR y de transgenes adyacentes

Antecedentes: Las propiedades reguladoras de los elementos STAR están asociadas con la estructura de la cromatina local, que es determinada por el propio ADN y por las proteínas asociadas al ADN. Los cambios en la estructura de la cromatina que están asociados con los cambios en la expresión génica son producidos a menudo por modificaciones secundarias de las macromoléculas, especialmente la metilación del ADN o la acetilación de las proteínas histónicas. La identificación de las modificaciones secundarias que se producen en los elementos STAR y en los transgenes adyacentes proporciona sellos para estos elementos.

Protocolo: Metilación de ADN: los elementos STAR son clonados en el plásmido pSelect mediante mecanismos normalizados (Sambrook et al., 1989). Las células U-2 OS son transfectadas establemente con estos plásmidos, y con pSelect que carece de un elemento STAR como control para determinar la metilación de ADN basal en el gen informador.

Las células son cosechadas y la cromatina purificada mediante procedimientos normalizados (Thomas, 1998). El ADN es digerido con las endonucleasas de restricción HpaII y MspI en reacciones separadas (Sambrook et al., 1989). Ambas enzimas de restricción son capaces de cortar la secuencia no metilada CCGG. Cuando la C externa está metilada, ni MspI ni HpaII pueden escindir. No obstante, a diferencia de HpaII, MspI puede escindir la secuencia cuando la C interna está metilada. El ADN es sometido a transferencia Southern y la transferencia es analizada mediante marcaje terminal indirecto (Pazin and Kadonaga, 1998). Como control, el correspondiente plásmido pSelect en forma de ADN no metilado, desnudo, también es cortado con las enzimas descritas y sometido a transferencia Southern. La comparación de los diferentes tamaños de los fragmentos de ADN revela si el ADN está metilado in vivo
o no.

Acetilación de las histonas: Las mismas líneas celulares transfectadas utilizadas para el análisis de metilación del ADN se utilizan para estos experimentos. El método descrito más abajo rinde un mapa de alta resolución del patrón de acetilación de la histona sobre los elementos STAR y el gen informador (Litt et al., 2001). Los productos digeridos con nucleasa Microcócica de los núcleos son fraccionados sobre gradientes de sacarosa, y los monómeros y dímeros de nucleosoma purificados son enriquecidos en histonas acetiladas mediante inmunoprecipitación con anticuerpos anti-acetilhistona. La fracción de nucleosoma y los productos inmunoprecipitados son sometidos a análisis, por ejemplo, mediante PCR en tiempo real (Jung et al., 2000) utilizando cebadores y una sonda Taqman que hibrida con el gen informador o el elemento STAR para rendir productos de 0,2 kb, con una ventana móvil de 0,1 kb. La tasa de incremento de la señal fluorescente de la sonda Taqman durante la PCR (que es proporcional a la abundancia del ADN molde en la muestra) es medida después. La proporción de la abundancia del ADN molde en la fracción de nucleosoma y los productos inmunoprecipitados proporciona una mapa fino del patrón de acetilación de las histonas para cada 0,1 kb sobre el gen informador y el elemento STAR (o sobre el gen informador en ausencia de un elemento).

Ejemplo 7 Posicionamiento del nucleosoma In vivo y sitios hipersensibles a la ADNasa I

Antecedentes: La cromatina está formada por ADN, histonas, y proteínas no histónicas. Las histonas forman una partícula núcleo que está envuelta por \sim150 pb de ADN para formar el nucleosoma. Los nucleosomas están separados por 50-75 pb de ADN conector.

Los nucleosomas posicionados establemente sobre el ADN cromosómico reprimen la expresión génica, y los factores que excluyen los nucleosomas o la cromatina remodelada de otro modo pueden superar esta represión. El posicionamiento de los nucleosomas en una región cromosómica es analizado mediante análisis con nucleasa microcócica (MNasa); la MNasa corta la cromatina preferentemente en el ADN conector. De un modo similar, algunas áreas de ADN están constitutivamente expuestas a las proteínas no histónicas, y estas son frecuentemente regiones reguladoras, es decir, sitios donde se unen los factores reguladores que actúan en cis. Experimentalmente, estos sitios son hipersensibles a la digestión por la enzima ADNasa I.

Protocolo: Para determinar la posición de los nucleosomas sobre el gen informador y sobre los elementos STAR, se utiliza la MNasa (Saluz and Jost, 1993). Los núcleos son purificados a partir de las células U-2 OS cultivadas y digeridas con MNasa como se ha descrito antes (acetilación de histonas). Para investigar los sitios hipersensibles a la ADNasa I en los elementos STAR o el gen informador, los núcleos purificados son tratados con ADNasa I a una concentración apropiada (v.g. 100 \mug/ml de ADN genómico en 20-100 U/ml de ADNasa I), como se ha descrito (Wallrath et al., 1998). El ADN desnudo es digerido con ADNasa I como control. Para ambas técnicas, el gen informador y los elementos STAR son sometidos a mapeo fino utilizando la prolongación del cebador o el marcaje terminal indirecto y la transferencia Southern, como se ha descrito (Tanaka et al., 1996; van der Vlag et al., 2000). El análisis de la MNasa revela una escala de bandas discretas en un autorradiograma correspondiente a las posiciones de los nucleosomas sobre los elementos STAR o el gen informador. Los sitios hipersensibles a la ADNasa I se manifiestan como bandas discretas en el autorradiograma resultante que están ausentes o son menos prominentes en el control de ADN desnudo.

Ejemplo 8 Tipo celular, dependencia del tejido, y dependencia del promotor de los elementos STAR

Antecedentes: Se ha informado de que algunos elementos aislantes o límite pueden mostrar especificidad hacia el tejido (Takada et al., 2000). Los elementos STAR tienen muchos rasgos en común con los elementos aislantes y límite. Tanto los elementos STAR promiscuos como los específicos de tejidos tienen un valor biotecnológico en las aplicaciones transgénicas. El análisis descrito más abajo se realiza para evaluar la dependencia del tipo de célula. La especificidad de la célula y del tejido de los elementos es examinada adicionalmente examinando la expresión de los genes en la vecindad de los elementos en el genoma humano, utilizando las bases de datos públicas de micromatrices de ADN (http://arrays.rockefeller.edu/xenopus/links.html) y datos SAGE (Serial Analysis of Gene Expression; http://bioinfo.amc.uva.nl/HTM-bin/index.cgi).

Protocolo: los elementos STAR son sometidos a ensayo en el plásmido pSDH. Se transfectan tres líneas celulares utilizando protocolos normalizados: la línea celular de osteosarcoma U-2 OS (Heldin et al., 1986), la línea celular Vero de riñón de mono verde Africano (Simizu et al., 1967), y la línea celular CHO de ovario de hámster Chino (Kao and Puck, 1968). Los elementos capaces de funcionar en los tres tipos celulares son categorizados como promiscuos. Aquellos que solamente despliegan actividad en una o dos de las líneas celulares se categorizan como restringidos en su funcionalidad en el tipo celular.

Especificidad del promotor: los elementos STAR son actualmente seleccionados y sometidos a ensayo en el contexto de la función con dos promotores, el promotor de citomegalovirus completo (CMV) o el Elemento de Respuesta a la Tetraciclina y el promotor mínimo de CMV (combinado con el activador transcripcional tTA). Para evaluar la especificidad del promotor, la función STAR es sometida a ensayo con otros promotores virales comúnmente utilizados, a saber los promotores temprano y tardío del virus de simios de tipo 40 (SV40), y los promotores principal y tardío de EIA adenoviral, y la repetición larga terminal del virus del sarcoma de Rous (RSV) (Doll et al., 1996; Smith et al., 2000; Weaver and Kadan, 2000; Xu et al, 1995). Cada uno de estos promotores es clonado por separado en el plásmido pSelect mediante mecanismos normalizados (Sambrook et al, 1989) junto con los elementos STAR. Los plásmidos resultantes son transfectados en la línea celular U-2 OS y analizados en cuanto a la expresión del gen informador, como se ha descrito antes. La capacidad de los elementos STAR para protegerse frente al silenciamiento, es determinada mediante comparación con los plásmidos que carecen de elementos STAR.

Ejemplo 9 Métodos para mejorar los elementos STAR

Antecedentes: Se desarrollan elementos STAR mejorados. Las mejoras rindieron una actividad anti-represiva de resistencia incrementada, y elementos con actividad inducible y específica del tejido. Estas mejoras se realizan por medio de una combinación de técnicas.

Protocolos:

Evolución forzada: Se utiliza una PCR propensa a errores (Cherry et al., 1999; Henke and Bornscheuer, 1999) para introducir una media de una o dos mutaciones puntuales por elemento. Los elementos mutagenizados son rastreados utilizando plásmidos pSelect conteniendo proteínas de fusión informador-marcador seleccionable por ejemplo mediante clasificación celular activada por fluorescencia y resistencia a antibióticos (Bennett et al., 1998). Posteriores rondas de PCR propensas a errores y selección se llevan a cabo para derivar elementos con mejoras adicionales en la actividad.

Combinaciones en tándem y heterólogas: Como se ha descrito antes, las combinaciones en tándem y heterólogas de los elementos son sometidas a ensayo en cuanto a la actividad en comparación con los elementos individuales (ejemplo 3).

La dominancia relativa de los elementos STAR es sometida a ensayo caso por caso. Esto se utiliza para someter a ensayo la resistencia de un elemento; por ejemplo, si un nuevo elemento STAR es dominante para un elemento fuerte, conocido con una cualidad represora de la transcripción génica, en ese caso el STAR es clasificado como muy fuerte. También se considera la posibilidad de que la relación de dominancia entre un STAR y un elemento con una cualidad de represión de la transcripción génica sea específica del tipo celular, del tejido, o del promotor (ejemplo 8). En el ensayo de dominancia se utiliza el plásmido pSelect, con elementos individuales con una cualidad represora de la transcripción génica situada aguas arriba de los elementos STAR individuales mediante mecanismos de ADN recombinante (Sambrook et al., 1989). Los plásmidos son transfectados a células U-2 OS y la expresión del gen informador es analizada. La dominancia de STAR es manifestada por una expresión superior que el plásmido con sólo un elemento con una cualidad represora de la transcripción génica.

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Introducción de sitios de unión para otras proteínas de unión a ADN a elementos STAR para añadir características novedosas (v.g. inducibilidad, especificidad de tejido)

Antecedentes: se crean elementos STAR regulables combinándolos con sitios de unión para proteínas de unión al ADN dependientes de la señal. En un ejemplo esto implicaría la yuxtaposición de un STAR y un elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE). En ausencia de estimulación por glucocorticoides el elemento STAR funcionaría como se describe. Tras la estimulación, el receptor de glucocorticoides de origen natural se une a GRE e interfiere en la función de STAR.

Protocolo: Utilizando la clonación de ADN convencional (Sambrook et al., 1989), se introduce un GRE en el vector pSelect adyacente a los elementos STAR. El plásmido es transfectado en células U-2 OS como se ha descrito antes. Las células se dividen en dos cultivos; uno se trata con glucocorticoides (10 \muM). La expresión del gen informador se mide y se compara entre los dos cultivos. Las diferencias en la expresión demuestran la capacidad para regular la función de STAR mediante la acción de una proteína de unión a ADN dependiente de la señal.

Elementos STAR promiscuos: El ensayo o la intensificación de estas características implica el cultivo en diferentes líneas celulares, y el cultivo a largo plazo sin selección con antibiótico (ejemplos 8 y 10).

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Ejemplo 10 Los elementos STAR obvian la necesidad de una selección continua para el mantenimiento del transgen

Antecedentes: En la transgénesis, la dependencia de los marcadores de selección tiene dos desventajas: el agente de selección es normalmente caro y conlleva un coste metabólico para las células, y existen objeciones reguladoras y éticas para incluir marcadores seleccionables en aplicaciones transgénicas, especialmente si el propio transgen está en el producto (v.g. plantas de cultivo, vectores de terapia génica). Los elementos STAR reducen o eliminan la necesidad de mantener la selección después de establecer el producto aislado transgénico. Por consiguiente, el gen de resistencia puede ser separado del genoma transgénico mediante recombinación de sitio específico con una pérdida disminuida de la expresión del transgen.

Protocolo: Se producen líneas celulares U-2 OS transfectadas establemente conteniendo elementos STAR integrados cromosómicamente flanqueando genes informadores por medio de co-transfección del plásmido pSDH con un plásmido de resistencia a antibióticos que actúan en trans como se ha descrito antes. El experimento implica someter a ensayo la estabilidad del nivel de expresión del gen informador en estas líneas celulares durante un cultivo prolongado (3-6 meses) en ausencia de selección. Este se somete a ensayo con elementos STAR flanqueando los genes informadores de la luciferasa o GFP en plásmidos pSDH. El gen de resistencia a antibióticos es separado construyendo un plásmido de expresión (basado en pSDH) en el cual el marcador de selección del antibiótico está flanqueado por sitios diana para la recombinasa. El marcador seleccionable es separado por corte con posterioridad por medio de la actividad de la recombinasa, como se ha descrito antes (ejemplo 2).

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Ejemplo 11 La Pronosticabilidad y el rendimiento resultan mejorados por la aplicación de elementos STAR a los sistemas de expresión

Los elementos STAR funcionan bloqueando las influencias de la represión transcripcional sobre las unidades de expresión de los transgenes. Estas influencias de represión pueden estar debidas a la heterocromatina ("efectos sobre la posición", (Boivin & Dura, 1998)) o a copias adyacentes del transgen ("silenciamiento génico inducido por repeticiones", (Garrick et al., 1998)). Dos de los beneficios de los elementos STAR para la producción de proteínas heterólogas son el incremento de la pronosticabilidad del descubrimiento de células huésped recombinantes primarias con un elevado nivel de expresión y el incremento del rendimiento durante los ciclos de producción. Estas ventajas se ilustran en este ejemplo.

Materiales y Métodos

Construcción de vectores pSDH y derivados que contienen STAR: El vector pSDH-Tet fue construido mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del marco de lectura abierto de la luciferasa a partir del plásmido pREP4-HSF- Luc (van der Vlag et al., 2000) utilizando los cebadores C67 y C68 (todos los cebadores de la PCR y oligonucleótidos mutagénicos se enumeran en la Tabla 5), e inserción del fragmento SacII/BamHI en pUHD1o-3 digerido con SacIIIBamHI (Gossen & Bujard, 1992). La unidad de expresión de la luciferasa fue re-amplificada con los cebadores C65 y C66, y re-insertada en pUHD10-3 con el fin de flanquearla con dos sitios de clonación múltiple (MCSI and MCSII). Después se introdujo un sitio AscI en MCSI mediante digestión con EcoRI e inserción de un conector (que constaba de oligonucleótidos hibridados D93 y D94). El promotor de CMV fue amplificado a partir del plásmido pCMV-Bsd (Invitrogen K510-01) con los cebadores D90 y D91, y utilizado para remplazar el promotor Tet-Off en pSDH-Tet mediante digestión con SaII/SacII y ligadura para crear el vector pSDH-CMV. El marco de lectura abierto de la luciferasa en este vector fue remplazado por SEAP (Fosfatasa Alcalina Secretada) como sigue: el vector pSDH-CMV fue digerido con SacII y BamHI y sus extremos fueron convertidos en romos; el marco de lectura abierto SEAP fue aislado de pSEAP-basic (Clontech 6037-1) por medio de digestión con EcoRI/SaII, sus extremos fueron convertidos en romos y fue ligado en pSDH-CMV para crear el vector pSDH-CS. El gen de resistencia a la puromicina bajo el control del promotor de SV40 fue aislado del plásmido pBabe-Puro (Morgenstern & Land, 1990) mediante PCR, utilizando los cebadores C81 y C82. Este fue ligado en el vector pGL3-control (sitio BamHI eliminado) (Promega E1741) digerido con NcoI/XbaI, para crear pGL3-puro. pGL3-puro fue digerido con BglII/SalI para aislar el gen de resistencia a SV40 puro, sus extremos fueron convertidos en romos y fue ligado en pSDH-CS digerido con NheI, con los extremos romos. El vector resultante, pSDH-CSP, se muestra en la Fig 6. Todas las etapas de clonación se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones proporcionadas por los fabricantes de los reactivos, según los métodos conocidos en la técnica (Sambrook et al., 1989).

Los elementos STAR fueron insertados en MCSI y MCSII en dos etapas, mediante digestión del elemento STAR y el vector pSDH-CSP con una enzima de restricción apropiada, seguido de ligadura. La orientación de los elementos STAR en los vectores pSDH recombinantes fue determinada mediante mapeo de restricción. La identidad y la orientación de los insertos fueron verificadas mediante análisis de la secuencia de ADN. La secuenciación fue realizada mediante el método didesoxi (Sanger et al., 1977) utilizando un secuenciador de ADN automatizado Beckman CEQ2000, según las instrucciones del fabricante. En resumen, el ADN fue purificado de E. coli utilizando QIAprep Spin Miniprep and Plasmid Midi Kits (QIAGEN 27106 y 12145, respectivamente). La secuenciación del ciclo se llevó a cabo utilizando los oligonucleótidos C85, E25, y E42 (Tabla 5) de costumbre, en presencia de terminadores coloreados (CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Beckman 608000).

Transfección y cultivo de células CHO con plásmidos pSDH: La línea celular de Ovario de Hámster Chino CHO-K1 (ATCC CCL-61) en medio HAMS-F12 + Suero de Ternera Fetal al 10% conteniendo glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, y 100 microgramos/ml de estreptomicina a 37°C/CO2 al 5%. Las células fueron transfectadas con el vector pSDH-CSP, y sus derivados conteniendo STAR6 o STAR49 en MCSI y MCSII, utilizando SuperFect (QIAGEN) como describe el fabricante. En resumen, las células fueron sembradas en recipientes de cultivo y se hicieron crecer durante la noche hasta una confluencia del 70-90%. El reactivo SuperFect se combinó con el ADN plasmídico (linealizado en este ejemplo mediante digestión con PvuI) a una proporción de 6 microlitros por microgramo (v.g. para una placa Petri de 10 cm, 20 microgramos de ADN y 120 microlitros de SuperFect) y se añadieron a las células. Tras incubar durante la noche la mezcla de transfección fue remplazada por medio de nueva aportación, y las células transfectadas fueron incubadas adicionalmente. Tras cultivar durante la noche, se añadieron 5 microgramos/ml de puromicina. La selección con puromicina se completó en 2 semanas, después de lo cual se aislaron clones CHO/pSDH resistentes a la puromicina individuales al azar y se cultivaron adicionalmente.

Análisis con Fosfatasa Alcalina Secretada (SEAP): La actividad SEAP (Berger et al., 1988, Henthorn et al., 1988, Kain, 1997, Yang et al., 1997) en el medio de cultivo de los clones CHO/pSDH-CSP fue determinada como describe el fabricante (estuche Clontech Great EscAPe #K2041). Brevemente, una alícuota del medio fue inactivada con calor a 65°C, después fue combinada con tampón de análisis y sustrato quimioluminiscente CSPD e incubada a la temperatura ambiente durante 10 minutos. La tasa de conversión de sustrato fue determinada después en un luminómetro (Turner 20/20TD). La densidad celular fue determinada sometiendo a recuento las células tratadas con tripsina en un contador celular Coulter ACT10.

Transfección y cultivo de células U-2 OS con plásmidos pSDH: La línea celular de osteosarcoma humano U-2 OS (ATCC #HTB-96) fue cultivada en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco + Suero de Ternera Fetal al 10% conteniendo glutamina, penicilina, y estreptomicina (supra) a 37°C/CO2 al 5%. Las células fueron co-transfectadas con el vector pSDH-CMV vector, y sus derivados conteniendo STAR6 o STAR8 en MCSII y MCSII, (junto con el plásmido pBabe-Puro) utilizando SuperFect (supra). La selección con Puromicina se completó en 2 semanas, tiempo tras el cual se aislaron clones U-2 OS/pSDH-CMV resistentes a la puromicina al azar y se cultivaron adicionalmente.

Análisis con luciferasa: la actividad luciferasa fue analizada (Himes & Shannon, 2000) en células resuspendidas según las instrucciones del fabricante del estuche de análisis (Roche 1669893), utilizando un luminómetro (Turner 20/20TD). La concentración de proteína celular total fue determinada mediante el método del ácido bicincónico según las instrucciones del fabricante (Sigma B-9643), y utilizada para normalizar los datos de la luciferasa.

Resultados

Los clones de las células CHO recombinantes que contienen el vector pSDH-CSP, o los plásmidos pSDH-CSP que contienen STAR6 o STAR49 (Tabla 6), fueron cultivados durante 3 semanas. La actividad SEAP de los sobrenadantes de cultivo fue determinada después, y es expresada basándose en el número de células (Fig. 7). Como se puede observar, se aislaron clones con elementos STAR en las unidades de expresión que expresan una actividad SEAP 2-3 veces superior que los clones cuyas unidades de expresión no incluían elementos STAR. Además, el número de clones que contienen elementos STAR que expresan actividad SEAP a la actividad máxima o por encima de ella de los clones STAR negativos es bastante elevado: del 25% al 40% de las poblaciones de clones STAR excedían la expresión SEAP más elevada de los clones pSDH-CSP.

Los clones de las células U-2 OS recombinantes que contenían el vector pSDH-CMV, o los plásmidos pSDH-CMV que contenían STAR6 o STAR8 (Tabla 6), fueron cultivados durante 3 semanas. La actividad luciferasa de las células huésped fue determinada después, y expresada como unidades de luciferasa relativas (Fig. 8), normalizadas para la proteína celular total. Los clones de U-2 OS recombinantes con elementos STAR flanqueando las unidades de expresión que tenían rendimiento mayores que los clones STAR negativos: la expresión más elevada observada a partir de los clones STAR8 era 2-3 veces superior que la expresión observada a partir de los clones STAR negativos. Los clones STAR6 tenían niveles de expresión máxima 5 veces superiores que los clones STAR negativos. Los elementos STAR conferían también una mayor pronosticabilidad: para ambos elementos STAR, de 15 al 20% de los clones presentaban expresión luciferasa a niveles comparables o mayores que los clones STAR negativos con el nivel de expresión más elevado.

Estos resultados demuestran que, cuando se utilizan con un promotor CMV potente, los elementos STAR incrementan el rendimiento de proteínas heterólogas (luciferasa y SEAP). Los tres elementos STAR introducidos en este ejemplo proporcionan rendimientos elevados. El aumento de pronosticabilidad conferido por los elementos STAR es manifestado por la gran proporción de los clones con rendimiento iguales o mayores que los rendimientos más elevados presentados por los clones STAR negativos.

Ejemplo 12 Los elementos STAR mejoran la estabilidad de la expresión del transgen

Durante el cultivo de las células huésped recombinantes, es una práctica común mantener la selección mediante antibióticos. Esto está destinado a evitar el silenciamiento transcripcional del transgen, o la pérdida del transgen a partir del genoma mediante procedimientos tales como la recombinación. No obstante no es deseable para la producción de proteínas heterólogas, por numerosas razones. Primero, los antibióticos que se utilizan son bastante caros, y contribuyen significativamente al coste unitario del producto. Segundo, para el uso biofarmacéutico, la proteína debe ser demostrablemente pura, sin trazas del antibiótico en el producto. Una ventaja de los elementos STAR para la producción de proteínas heterólogas es que confieren una expresión estable a los transgenes durante el cultivo prolongado, incluso en ausencia de selección con antibiótico; esta propiedad se demuestra en este ejemplo.

Materiales y Métodos

La línea celular U-2 OS fue transfectada con el plásmido pSDH-Tet-STAR6 y cultivada como se describe en el Ejemplo 11. Los clones resistentes a la puromicina individuales fueron aislados y cultivados adicionalmente en ausencia de doxiciclina. A intervalos semanales las células fueron transferidas a recipientes de cultivo nuevos a una dilución 1:20. La actividad luciferasa fue media a intervalos periódicos como se describe en el Ejemplo 11. Al cabo de 15 semanas los cultivos fueron divididos en dos productos replicados; un producto replicado continuó recibiendo puromicina
mientras el otro producto replicado no recibió antibiótico durante el resto del experimento (25 semanas en total).

Resultados

La Tabla 7 presenta los datos de expresión de la luciferasa mediante la unidad de expresión flanqueada por STAR6 durante el crecimiento prolongado con o sin antibióticos. Como se puede observar, la expresión del transgen informador, luciferasa, permanece estable en las células huésped U-2 OS durante el experimento. Una vez que los cultivos se dividieron en dos tratamientos (más antibiótico y sin antibiótico) la expresión de la luciferasa era esencialmente estable en ausencia de selección con antibiótico. Esto demuestra la capacidad de los elementos STAR para proteger los transgenes del silenciamiento o pérdida durante el cultivo prolongado. También demuestra que esta propiedad es independiente de la selección con antibiótico.

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Por lo tanto la producción de proteínas heterólogas es posible sin que incurra en los costes del antibiótico o la dificultad del procesamiento aguas abajo.

Ejemplo 13 Secuencias esenciales mínimas de elementos STAR

Los elementos STAR fueron aislados del rastreo genético descrito en el Ejemplo 1. En el rastreo se utilizan genotecas construidas con ADN genómico humano que estaba fraccionado por tamaño entre aproximadamente 0,5 - 2 kilobases (supra). Los elementos STAR oscilan entre 500 y 2.361 pb. (Tabla 6). Es probable que, para muchos de los elementos STAR que han sido aislados, la actividad STAR sea conferida por un fragmento de ADN más pequeño que el clon aislado inicialmente. Es útil determinar estos tamaños de fragmentos mínimos que son esenciales para la actividad STAR, por dos razones.

Primera, los elementos STAR funcionales más pequeños serían ventajosos en el diseño de vectores de expresión compactos, puesto que los vectores más pequeños transfectan las células huésped con mayor eficacia.

Segunda, determinar las secuencias STAR esenciales mínimas permite la modificación de aquellas secuencias para una funcionalidad intensificada. Dos elementos STAR han sido sometidos a mapeo fino para determinar sus secuencias esenciales mínimas.

Materiales y métodos

STAR10 (1.167 pares de bases)) y STAR27 (1.520 pares de bases) han sido sometidos a mapeo fino. Han sido amplificados mediante PCR para rendir sub-fragmentos de una longitud aproximadamente igual (leyenda de la Fig. 9). Para el ensayo inicial, estos han sido clonados en el vector pSelect en el sitio BamHI, y transfectados en células U-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1 como se describe en el Ejemplo 1. Tras la selección en cuanto a la resistencia a la higromicina, LexA-HP1 fue inducido disminuyendo la concentración de doxiciclina. Las células transfectadas fueron incubadas después con zeocina para someter a ensayo la capacidad de los elementos STAR para proteger la unidad de expresión SV40-Zeo de la represión debida a la unión a LexA-HP1.

Resultados

En este experimento STAR10 y STAR27 confieren una buena protección frente al silenciamiento génico, como se esperaba (Fig. 9). Esto se manifiesta por un fuerte crecimiento en presencia de zeocina.

De los 3 sub-fragmentos de STAR10, 10A (\sim400 pares de bases) confiere a las células transfectadas un crecimiento vigoroso en presencia de zeocina, que excede el del elemento STAR completo. Las células transfectadas con los constructos pSelect que contenían los otros 2 sub-fragmentos no crecen en presencia de zeocina. Estos resultados identifican el fragmento 10A de \sim400 pares de bases que abarca la secuencia de ADN responsable de la actividad anti-represión de STAR10. STAR 27 confiere un crecimiento moderado en zeocina a las células transfectadas en este experimento (Fig. 9). Uno de los sub-fragmentos de este STAR, 27B (\sim500 pares de bases), permite un crecimiento débil de las células huésped en el medio que contiene zeocina. Esto sugiere que la actividad anti-represión de este STAR está parcialmente localizada en el sub-fragmento 27B, pero la actividad completa requiere también las secuencias 27A y/o 27C (cada una de \sim500 pares de bases).

Ejemplo 14

Los elementos STAR funcionan en diversas cepas de células de mamífero cultivadas. La elección de la línea de células huésped para la expresión de la proteína heteróloga es un parámetro crítico para la cualidad, el rendimiento, y el coste por unidad de la proteína. Consideraciones tales como las modificaciones post-traduccionales, la capacidad de la ruta secretora, y la inmortalidad de la línea celular dictan la línea celular apropiada para un sistema de producción biofarmacéutico concreto. Por esta razón, las ventajas proporcionadas por los elementos STAR en términos de rendimiento, pronosticabilidad, y estabilidad deben ser obtenibles en diversas líneas celulares. Esto fue sometido a ensayo comparando la función de STAR6 en la línea celular U-2 OS humana en la cual éste había sido clonado originalmente, y en la línea celular CHO que es ampliamente aplicada en biotecnología.

Materiales y Métodos

Se refieren los experimentos del ejemplo 11.

Resultados

La expresión del gen informador SEAP en células CHO es presentada en la Fig. 7; la expresión del gen informador de luciferasa en las células U-2 OS se presenta en la Fig. 8. Por medio de la comparación de los resultados de estos dos experimentos, es evidente que el elemento STAR6 es funcional en ambas línea celulares: la expresión del gen informador era más predecible en ambas, y los clones de cada línea celular presentaban rendimientos más altos, cuando el gen informador era protegido de los efectos de la posición por STAR6. Estas dos líneas celulares derivan de diferentes especies (humano y hámster) y diferentes tipos de tejidos (hueso y ovario), reflejando la amplia gama de huéspedes en la cual puede ser utilizado este elemento STAR para la mejora de la expresión de proteínas heterólogas.

Ejemplo 15

Los elementos STAR funcionan en el contexto de diversos promotores transcripcionales. La transcripción del transgen se realiza colocando el marco de lectura abierto del transgen bajo el control de un promotor exógeno. La elección del promotor está influenciada por la naturaleza de la proteína heteróloga y el sistema de producción. En la mayoría de los casos, se prefieren los promotores constitutivos fuertes debido a que pueden proporcionar elevados rendimientos. Algunos promotores virales tienen estas propiedades; promotor/intensificador del gen temprano inmediato de citomegalovirus ("promotor de CMV") se considera generalmente como el promotor más fuerte en uso biotecnológico común (Boshart et al., 1985, Doll et al., 1996, Foecking & Hofstetter, 1986). El promotor del virus de simios SV40 también es moderadamente fuerte (Boshart et al., 1985, Foecking & Hofstetter, 1986) y es utilizado frecuentemente para la expresión ectópica en vectores de células de mamífero. El promotor Tet-Off es inducible: el promotor es reprimido en presencia de tetraciclina o antibióticos relacionados (comúnmente se utiliza doxiciclina) en líneas celulares que expresan el plásmido tTA (Clontech K1620-A), y la eliminación del antibiótico produce una inducción transcripcional (Deuschle et al., 1995, Gossen & Bujard, 1992, Izumi & Gilbert, 1999, Umana et al., 1999).

Materiales y Métodos

La construcción de los vectores pSDH-Tet y pSDH-CMV se describe en el Ejemplo 11. pSDH-SV40 fue construido mediante amplificación por PCR del promotor SV40 (cebadores D41 y D42) del plásmido pSelect-SV4 0-Zeo (Ejemplo 1), seguido de digestión del producto de la PCR con SacII y SalI. El vector pSDH-CMV fue digerido con SacII y SalI para separar el promotor de CMV, y el vector y el fragmento de SV40 fueron ligados entre sí para crear pSDH-SV40. STAR 6 fue clonado en MCSI y MCSII como se describe en el Ejemplo 11. Los plásmidos pSDH-Tet, pSDH-Tet-S TAR 6, pSDH-Tet-STAR7, pSDH-SV40 y pSDH-SV40-STAR6 fueron co-transfectados con pBabe-Puro en U-2 OS utilizando SuperFect como describe el fabricante. El cultivo celular, la selección con puromicina, y los análisis con luciferasa se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 11.

Resultados

Las Figs. 8, 10, y 11 comparan la expresión del gen informador luciferasa de 3 promotores diferentes: dos promotores virales fuertes y constitutivos (CMV y SV40), y el promotor Tet-Off inducible. Los tres promotores fueron sometidos a ensayo en el contexto del elemento STAR6 en células U-2 OS. Los resultados demuestran que el rendimiento y la pronosticabilidad de los 3 promotores aumentaban con STAR6.

Como se describe en los Ejemplo 11 y 14, STAR6 es beneficioso en el contexto del promotor CMV (Fig. 8). Se observan mejoras similares en el contexto del promotor de SV40 (Fig. 10): el rendimiento del clon STAR6 más altamente expresado es 2-3 veces mayor que el mejor de los clones pSDH-SV4 0, y los clones STAR 6 (20% de la población) tienen rendimientos más altos que el mejor de los clones STAR negativos. En el contexto del promotor Tet-Off a concentraciones inductoras (poca doxiciclina), STAR6 también mejora el rendimiento y la pronosticabilidad de la expresión del transgen (Fig. 11): el clon STAR6 más altamente expresado tiene un rendimiento 20 veces superior que el mejor clon pSDH-tet, y los 9 clones STAR6 (35% de la población) tienen rendimientos más altos que el mejor clon STAR negativo. Se concluye que este elemento STAR es versátil en sus propiedades protectoras del transgen, puesto que funciona en el contexto de diversos promotores de la transcripción biotecnológicamente útiles.

Ejemplo 16 La función del elemento STAR puede ser direccional

Si bien las secuencias de ácido nucleico cortas pueden ser simétricas (v.g. palindrómicas), las secuencias de origen natural más largas son típicamente asimétricas. Como resultado, el contenido de información de las secuencias de ácido nucleico es direccional, y las propias secuencias pueden ser descritas con respecto a sus extremos 5' y 3'. La direccionalidad de la información de la secuencia de ácido nucleico afecta a la disposición en la cual son ensambladas las moléculas de ADN recombinante utilizando mecanismos de clonación normalizados conocidos en la técnica (Sambrook et al., 1989). Los elementos STAR son secuencias de ADN largas, asimétricas, y tienen una direccionalidad basada en la orientación en la cual son clonadas originalmente en el vector pSelect. En los ejemplos dados antes, utilizando dos elementos STAR en vectores pSDH, esta direccionalidad es preservada. Esta orientación es descrita como la orientación natural o 5'-3', relativa al gen de resistencia a la zeocina (ver la Fig. 12). En este ejemplo se somete a ensayo la importancia de la direccionalidad para la función STAR en el vector pSDH-Tet. Puesto que los genes informadores de los vectores pSDH están flanqueados en ambos lados por copias del elemento STAR de interés, la orientación de cada copia STAR debe ser considerada. En este ejemplo se compara la orientación natural con la orientación contraria (Fig. 12).

Materiales y Métodos

El elemento STAR6 fue clonado en pSDH-Tet como se describe en el Ejemplo 11. Las células U-2 OS fueron co-transfectadas con los plásmidos pSDH-Tet-STAR,66-natural y pSDH-Tet-STAR66-contrario, y cultivadas como se describe en el Ejemplo 11. Los clones individuales fueron aislados y cultivados; el nivel de expresión de luciferasa fue determinado como se ha descrito (supra).

Resultados

Los resultados de la comparación de la actividad STAR66 en la orientación natural y la orientación contraria se muestran en la Fig. 13. Cuando STAR66 está en la orientación contraria, el rendimiento de un solo clon es razonablemente elevado (60 unidades luciferasa). En contraste, el rendimiento del clon de expresión más elevada cuando STAR66 está en la orientación natural es considerablemente mayor (100 unidades luciferasa), y la pronosticabilidad también es mucho mayor: 7 clones de la población de orientación natural (30%) expresan la luciferasa por encima del nivel del clon de expresión más elevada de la población de orientación contraria, y 15 de los clones de la población de orientación natural (60%) expresan la luciferasa por encima de aproximadamente 10 unidades luciferasa relativas. Por lo tanto se demuestra que la función STAR66 es direccional.

Ejemplo 17

La expresión del transgen en el contexto de los elementos STAR es dependiente del número de copias.

Las unidades de expresión del transgen para la expresión de la proteína heteróloga son integradas generalmente en el genoma de la célula huésped para asegurar la retención estable durante la división celular. La integración puede producir una o múltiples copias de la unidad de expresión que esté siendo insertada en el genoma; las copias múltiples pueden estar presentes o no en forma de disposiciones en tándem. El rendimiento incrementado demostrado para los transgenes protegidos por elementos STAR (supra) sugiere que los elementos STAR son capaces de permitir que las unidades de expresión del transgen funcionen independientemente de las influencias sobre la transcripción asociadas con el sitio de integración en el genoma (independencia de los efectos de la posición (Boivin & Dura, 1998)). Esto sugiere adicionalmente que los elementos STAR permiten que cada unidad de expresión funcione independientemente de las copias vecinas de la unidad de expresión cuando están integradas en forma de una ordenación en tándem (independencia del silenciamiento del gen inducido por la repetición (Garrick et al., 1998)). La dependencia del número de copias se determina a partir de la relación entre los niveles de expresión del transgen y el número de copias, como se describe más abajo en el ejemplo.

Materiales y Métodos

Las células U-2 OS fueron co-transfectadas con pSDH- Tet-STAR10 y cultivadas bajo selección con puromicina como se ha descrito (supra). Ocho clones individuales fueron aislados y cultivados adicionalmente. Después las células fueron cosechadas, y una porción fue analizada en cuanto a la actividad luciferasa como se ha descrito (supra). Las células restantes fueron sometidas a lisis y el ADN genómico fue purificado utilizando el DNeasy Tissue Kit (QIAGEN 69504) como describe el fabricante. Las muestras de ADN fueron cuantificadas mediante espectrometría de UV. Tres microgramos de cada muestra de ADN genómico fueron digeridos con PvuII y XhoI durante la noche como describe el fabricante (New England Biolabs), y resueltos mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN fueron transferidos a una membrana de nailon como se ha descrito (Sambrook et al., 1989), e hibridados con una sonda marcada radiactivamente al gen de la luciferasa (aislado de pSDH-Tet digerido con BamHI/SacII). La transferencia fue lavada como se ha descrito (Sambrook et al., 1989) y expuesta a una pantalla de formadora de imágenes con fósforo (Personal F/X, BioRad). El autorradiograma resultante (Fig. 14) fue analizado mediante densitometría para determinar la fuerza relativa de las bandas de ADN de luciferasa, que representa el número de copias del transgen.

Resultados

Las actividades de la enzima y los números de copias (intensidades de las bandas de ADN) de la luciferasa en los clones de la población de clones pSDH-STAR10 se muestran en la Fig. 15. El número de copias del transgen está altamente correlacionado con el nivel de expresión de luciferasa en estos clones pSDH-STAR10 (r = 0,86). Esto sugiere que STAR10 confiere una dependencia del número de copias de las unidades de expresión del transgen, haciendo la expresión del transgen independiente de otras copias del transgen en disposiciones en tándem, e independiente de las influencias del silenciamiento del gen en el sitio de integración.

Ejemplo 18

Los elementos STAR funcionan como bloqueadores intensificadores pero no como intensificadores.

Los promotores génicos están sujetos tanto a influencias positivas como negativas sobre su capacidad para iniciar la transcripción. Una clase importante de elementos que ejercen influencias positivas son los intensificadores. Los intensificadores son característicamente capaces de afectar a los promotores incluso cuando están localizados lejos (muchos kilopares de bases) del promotor. Las influencias negativas que actúan mediante la formación de heterocromatina (v.g. proteínas del grupo Polycomb) han sido descritas antes, y estas son la diana de la actividad STAR. La base bioquímica para la función intensificadora y para la formación de heterocromatina es fundamentalmente similar, ya que ambas implican la unión de proteínas al ADN. Por lo tanto es importante determinar si los elementos STAR son capaces de bloquear las influencias positivas así como las influencias negativas, en otras palabras, proteger los transgenes de los intensificadores genómicos en la vecindad del sitio de integración. La capacidad para proteger los transgenes de la actividad intensificadora asegura un funcionamiento estable y predecible de los transgenes en las aplicaciones biotecnológicas. Este ejemplo examina el funcionamiento de los elementos STAR en un análisis de bloqueo del intensificador.

Otro rasgo de la actividad STAR que es importante para su función es el aumento de rendimiento que confieren a los transgenes (Ejemplo 11). Los STAR son aislados basándose en su capacidad para mantener elevados niveles de expresión de zeocina cuando las proteínas formadoras de heterocromatina se unen adyacentes a los elementos STAR candidato. Se pronostica que se producirá una elevada expresión debido a que se prevé que los STAR bloquearán la diseminación de la heterocromatina en la unidad de expresión de zeocina. No obstante, un segundo escenario es que los fragmentos de ADN de los clones resistentes a zeocina contienen intensificadores. Se ha demostrado que los intensificadores tienen la capacidad de superar los efectos represivos de las proteínas del grupo Polycomb tales como las utilizadas en el método del rastreo con STAR (Zink & Paro, 1995). Los intensificadores aislados mediante este fenómeno serían considerados falsos positivos, puesto que los intensificadores no tienen las propiedades reivindicadas aquí para los STAR. Con el fin de demostrar que los elementos STAR no son intensificadores, estos han sido sometidos a ensayo en un análisis de intensificador.

El análisis de bloqueo del intensificador y el análisis de intensificador son metodológicamente y conceptualmente similares. Los análisis se muestran esquemáticamente en la Fig. 16. La capacidad de los elementos STAR para bloquear los intensificadores se realiza utilizando el sistema intensificador E47/caja E. La proteína E47 es capaz de activar la transcripción por medio de promotores cuando se une a una secuencia de ADN de la caja E localizada en la vecindad de esos promotores (Quong et al., 2002). E47 está implicada normalmente en la regulación de la diferenciación de linfocitos B y T (Quong et al., 2002), pero es capaz de funcionar en diversos tipos celulares cuando es expresada ectópicamente (Petersson et al., 2002). La caja E es una secuencia de ADN palindrómica, CANNTG (Knofler et al., 2002). En el análisis de bloqueo del intensificador, se coloca una caja E aguas arriba del gen informador de la luciferasa (incluyendo un promotor mínimo) en un vector de expresión. Se coloca un sitio de clonación para los elementos STAR entre la caja E y el promotor. La proteína E47 es codificada en un segundo plásmido. El análisis se realiza transfectando tanto el plásmido E47 como el vector de expresión de la luciferasa en las células; la proteína E47 es expresada y se une a la caja E, y el complejo E47/caja E es capaz de actuar como intensificador. Cuando el vector de expresión de la luciferasa no contiene un elemento STAR, el complejo E47/caja E intensifica la expresión de la luciferasa (Fig. 16A, situación 1). Cuando los elementos STAR son insertados entre la caja E y el promotor, su capacidad para bloquear el intensificador es demostrada mediante la expresión reducida de la actividad luciferasa (Fig. 16A, situación 2); si los STAR no pueden bloquear los intensificadores, la expresión de la luciferasa es activada (Fig 16A, situación 3).

La capacidad de los elementos STAR para actuar como intensificadores utiliza el mismo vector de expresión de la luciferasa. En ausencia de E47, la propia caja E no afecta a la transcripción. Al contrario, el comportamiento intensificador de los elementos STAR dará como resultado la activación de la trascripción de la luciferasa. El análisis es realizado transfectando el vector de expresión de la luciferasa sin el plásmido E47. Cuando el vector de expresión no contiene elementos STAR, la expresión de la luciferasa es baja (Fig. 16B, situación 1). Si los elementos STAR no tienen propiedades intensificadoras, la expresión de la luciferasa es baja cuando un elemento STAR está presente en el vector (Fig. 16B, situación 2). Si los elementos STAR tienen propiedades intensificadoras, la expresión de la luciferasa será activada en los vectores que contienen STAR (Fig. 16B, situación 3).

Materiales y Métodos

El vector de expresión de la luciferasa fue construido insertando la caja E y un promotor mínimo de la fosfatasa alcalina humana a partir del plásmido mu- E5+E2x6-cat(x) (Ruezinsky et al., 1991) aguas arriba del gen de la luciferasa en el plásmido pGL3-básico (Promega E1751), para crear pGL3-caja-E-luciferasa (donación de W. Romanow). El plásmido de expresión de E47 contiene el marco de lectura abierto de E47 bajo el control de un promotor de la beta-actina en el plásmido pHBAPr-1-neo; E47 es expresado constitutivamente a partir de este plásmido (donación de W. Romanow). Los elementos STAR 1, 2, 3, 6, 10, 11, 18, y 27 han sido clonados en el vector de expresión de la luciferasa. Los clones que contenían el elemento scs de Drosophila y el núcleo HS4-6x de la beta-globina de pollo ("HS4") han sido incluidos como controles positivos (se sabe que bloquean los intensificadores, y no tienen propiedades intensificadoras intrínsecas (Chung et al., 1993, Kellum & Schedl, 1992)), y el vector de expresión de luciferasa vacío ha sido incluido como control negativo. Todos los análisis fueron realizados utilizando la línea celular U-2 OS. En el análisis de bloqueo del intensificador, el plásmido E47 fue co-transfectado con los vectores de expresión de la luciferasa (vector vacío, o conteniendo elementos STAR o de control positivo). En el análisis del intensificador, el plásmido E47 fue co-transfectado con el vector de expresión de la luciferasa sin STAR como control positivo para la actividad intensificadora; todas las demás muestras recibieron un supuesto plásmido durante la co-transfección. Las células transfectadas transitoriamente fueron analizadas en cuanto a la actividad de la luciferasa 48 horas después de la transfección del plásmido (supra). La actividad de la luciferasa expresada a partir del plásmido que no contenía los elementos de la caja E o STAR/control fueron sustraídos,
y las actividades de la luciferasa fueron normalizadas para el contenido de proteína como se ha descrito (supra).

Resultados

La Fig. 17 muestra los resultados del análisis de bloqueo de intensificador. En ausencia de elementos STAR (o de los elementos scs y HS4 de bloqueo del intensificador conocido), el complejo intensificador E47/caja E activa la expresión de la luciferasa ("vector"); este nivel de expresión intensificado ha sido normalizado a 100. La actividad intensificadora es bloqueada por todos los elementos STAR sometidos a ensayo. La actividad intensificadora es bloqueada también por los elementos HS4 y scs, como se esperaba (Bell et al., 2001, Gerasimova & Corces, 2001). Estos resultados demuestran que además de su capacidad para bloquear la diseminación del silenciamiento transcripcional (influencias negativas), los elementos STAR son capaces de bloquear la acción de los intensificadores (influencias positivas).

La Fig. 18 muestra los resultados del análisis de intensificador. El nivel de expresión de luciferasa debido a la intensificación por el complejo E47/caja-E se ajusta a 100 ("E47"). En comparación, ninguno de los elementos STAR ocasiona una activación significativa de la expresión de la luciferasa. Como se esperaba, los elementos scs y HS4 tampoco ocasionan la activación del gen informador. Por lo tanto se concluye que al menos los elementos STAR sometidos a ensayo no poseen propiedades intensificadoras.

Ejemplo 20

Los elementos STAR son conservados entre ratón y humano

El análisis BLAT de la secuencia de ADN STAR frente a la base de datos del genoma humano (http://genome.ucsc.
edu/cgi-bin/hgGateway) revela que algunas de estas secuencias tienen una elevada conservación de la secuencias con otras regiones del genoma humano. Estas regiones duplicadas son elementos STAR candidatos; si muestran actividad STAR, serían considerados parálogos de los STAR clonados (se dice que dos genes o elementos genéticos son parálogos si derivan de un evento de duplicación (Li, 1997)).

El análisis BLAST de los STAR humanos frente al genoma de ratón (http://www.ensembl.org/Mus_musculus/
blastview) también revela regiones de elevada conservación de la secuencia entre ratón y humano. Esta conservación de la secuencia ha sido demostrada para fragmentos de 15 de los 65 elementos STAR humanos. La conservación oscila entre el 64% y el 89%, sobre longitudes de 141 pares de bases a 909 pares de bases (Tabla 8). Estos grados de conservación de la secuencia son notables y sugieren que estas secuencias de ADN pueden conferir actividad STAR también dentro del genoma de ratón. Algunas de las secuencias de los genomas de ratón y humano de la Tabla 8 podrían ser definidas estrictamente como ortólogos (se dice que dos genes o elementos genéticos son ortólogos si derivan de un evento de especiación (Li, 1997)). Por ejemplo, STAR6 está entre los genes SLC8A1 y HAAO en los genomas tanto humano como de ratón. En otros casos, un STAR humano clonado tiene un parálogo dentro del genoma humano, y su ortólogo ha sido identificado en el genoma de ratón. Por ejemplo, STAR3a es un fragmento de la región 15q11.2 del cromosoma humano 15. Esta región es idéntica en un 96,9% (paráloga) con un fragmento de ADN en 5q33.3 del cromosoma humano 5, que está cerca del gen de la interleuquina IL12B. Estos ADN humanos comparten aproximadamente una identidad del 80% con un fragmento de la región 11B2 del cromosoma de ratón 11. El fragmento 11B2 también está cerca del gen de la interleuquina IL112B (de ratón). Por lo tanto STAR3a y el fragmento 11B2 de ratón pueden ser definidos estrictamente como parálogos.

Con el fin de someter a ensayo la hipótesis de que la actividad STAR es compartida entre regiones de elevada conservación de la secuencia en el genoma de ratón y humano, uno de los STAR humanos con una secuencia conservada en el ratón, STAR18, ha sido analizada con mayor detalle. La conservación de la secuencia en el genoma de ratón detectada con el clon STAR18 original se extiende hacia la izquierda del cromosoma 2 humano durante aproximadamente 500 pares de bases (la Fig. 19; izquierda y derecha hacen referencia a la descripción normalizada de los brazos del cromosoma 2). En este ejemplo los autores de la presente invención examinan si la región de conservación de la secuencia define un elemento STAR de "origen natural" en humanos que es más extensa en longitud que el clon original. Los autores de la presente invención también examinan si la función STAR de este elemento STAR está conservada entre ratón y humano.

Materiales y Métodos

La región de conservación de la secuencia de ratón/humano en torno a STAR 18 fue recuperada del clon BAC humano RP11-387A1 mediante amplificación por PCR, en tres fragmentos: la región completa (cebadores E93 y E94), la mitad izquierda (cebadores E93 y E92), y la mitad derecha (cebadores E57 y E94). Los correspondientes fragmentos de la región de ratón homóloga fueron recuperados del clon BAC RP23-400H17 de la misma manera (cebadores E95 y E98, E95 y E96, y E97 y E98, respectivamente). Todos los fragmentos fueron clonados en el vector pSelect y transfectados en una línea celular U- 2 OS/Tet-Off/LexA-HP1 (supra). Tras la transfección, se llevó a cabo la selección con higromicina para seleccionar las células transfectadas. La proteína LexA-HP1 fue inducida disminuyendo la concentración de doxiciclina, y la capacidad de las células transfectadas para resistir al antibiótico zeocina (una medida de la actividad STAR) fue evaluada controlando el crecimiento celular.

Resultados

El clon STAR18 original fue aislado de ADN humano digerido con Sau3AI ligado en el vector pSelect basándose en su capacidad para prevenir el silenciamiento de un gen resistente a la zeocina. El alineamiento del clon STAR18 humano (497 pares de bases) con el genoma de ratón reveló una elevada similitud de secuencia (72%) entre las regiones STAR18 de humano y de ratón ortólogas. También dejaba patente una elevada similitud (73%) en la región que se prolongaba durante 488 pares de bases inmediatamente hacia la izquierda del sitio Sau3AI que define el extremo izquierdo de la región clonada (Fig. 19). Fuera de estas regiones la similitud de secuencia entre el ADN humano y de ratón cae por debajo del 60%.

Como se indica en la Fig. 19, los elementos STAR18 tanto humanos como de ratón confieren supervivencia en zeocina a las células huésped que expresan la proteína represora lexA-HP1. El clon STAR18 de 497 pares de bases y su ortólogo de ratón confieren ambos capacidad de crecimiento (Fig. 19, a y d). Las regiones de 488 pares de bases adyacentes de elevada similitud de ambos genomas también confieren capacidad para crecer, y de hecho su fenotipo de crecimiento es más vigoroso que el del clon STAR18 original (Fig 19, b ye). Cuando la región completa de similitud de secuencia era sometida a ensayo, estos ADN tanto de ratón como de humano confieren crecimiento, y el fenotipo de crecimiento es más vigoroso que los dos sub-fragmentos (Fig. 19, c y f). Estos resultados demuestran que la actividad STAR de STAR18 humano es conservada en su ortólogo de ratón. La elevada conservación de la secuencia entre estas regiones ortólogas es particularmente notable debido a que no son secuencias codificadoras de proteínas, conduciendo a la conclusión de que tienen alguna función reguladora que ha evitado su divergencia evolutiva por medio de mutaciones.

Este análisis demuestra que los elementos STAR clonados identificados mediante el programa de rastreo original pueden representar en algunos casos elementos STAR parciales, y que el análisis del ADN genómico en el cual están embebidos puede identificar secuencias con una actividad STAR más fuerte.

Ejemplo 21 Materiales y Métodos

Utilizando el rastreo genético descrito en la solicitud de patente original, se aislaron inicialmente sesenta y seis (66) elementos STAR a partir de ADN genómico humano y se caracterizaron con detalle (Tabla 6). El rastreo se realizó sobre genotecas génicas construidas mediante digestión con Sau3AI de ADN genómico humano, ya sea purificado de placenta (Clontech 6550-1) o llevado a cabo en cromosomas artificiales bacteriano/P1 (BAC/PAC). Los clones BAC/PAC contienen ADN genómico de regiones del cromosoma 1 (clones RP1154H19 y RP3328E19), de la agrupación HOX de genes homeóticos (clones RP1167F23, RP1170019, y RP11387A1), o del cromosoma humano 22 (Research Genetics 96010-22). Los ADN fueron fraccionados por tamaño, y la fracción de tamaño 0,5 - 2 kb fue ligada en el vector pSelect digerido con BamHI, mediante mecanismos normalizados (Sambrook et al., 1989). Los plásmidos pSelect que contenían ADN genómico que confería resistencia a zeocina a bajas concentraciones de doxiciclina fueron aislados y propagados en Escherichia coli. Los rastreos que rendían los elementos STAR de la Tabla 6 han analizado aproximadamente el 1-2% del genoma humano.

Los insertos de ADN genómico humano en estos 66 plásmidos fueron secuenciados mediante el método didesoxi (Sanger et al., 1977) utilizando un secuenciador de ADN automático Beckman CEQ2000, empleando las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ADN fue purificado a partir de E. coli utilizando QIAprep Spin Miniprep y Plasmid Midi Kits (QIAGEN 27106 y 12145, respectivamente). La secuenciación en ciclos se llevó a cabo utilizando los oligonucleótidos de costumbre correspondientes al vector pSelect (cebadores D89 y D95, Tabla 5), en presencia de terminadores coloreados (CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Beckman 608000). Las secuencias de ADN STAR ensambladas fueron localizadas en el genoma humano (construcciones de bases de datos Agosto y Diciembre 2001) utilizando BLAT (Basic Local Alignment Tool (Kent, 2002); http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgGateway; Tabla 6). Además, las secuencias STAR combinadas comprenden 85, 6 kilopares de bases, con una longitud media de 1,3 kilopares de bases.

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Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. La familia de plásmidos pSelect para la selección y caracterización de elementos STAR. Un marcador de resistencia (zeocina o puromicina) o un gen informador (GFP o luciferasa) bajo el control del promotor de SV40 promiscuo es adyacente a un sitio de clonación BamHI flanqueado por los sitios AscI y HindIII. Aguas arriba del sitio de clonación están los operadores lexA a los cuales se puede unir la proteína lexA. La unión de las proteínas del grupo lexA-Polycomb quiméricas a los operadores ocasiona la represión del gen marcador o informador. Los fragmentos de ADN insertados en el sitio de clonación que bloquean la represión son identificados mediante la expresión persistente del gen marcador o informador. El plásmido replica episómicamente en células de mamífero cultivadas debido a la secuencia de oriP.

Fig. 2. La familia pSDH de plásmidos para someter a ensayo los elementos STAR. Dos sitios de clonación múltiple (MCSI y MCSII) flanquean un gen informador (GFP o luciferasa) cuya expresión es conducida por un promotor aguas arriba (CMV, Tet-off, o SV40). Los elementos STAR a someter a ensayo son insertados en MCSI y MCSII. Estos contienen sitios de restricción únicos (MCSI: XhoI, NotI, EcoRI, y S a11; MCSIL HindIII, EcoRV, BglII, y NheI). El plásmido replica después de la integración al azar en el genoma de células de mamífero.

Fig. 3. Proporción de clones que sobre-expresan la luciferasa. Las células de osteosarcoma humano U-2 OS fueron transfectadas establemente con plásmidos pSDH (conteniendo el gen informador de la luciferasa bajo el control del promotor tet-off), y los clones transfectados individuales fueron aislados y cultivados. La expresión de la luciferasa fue medida enzimáticamente. Se determinó la expresión de luciferasa media por los clones que contenían el pSDH sin STAR ("nivel de referencia"). Los clones de los grupos de todos los plásmidos fueron puntuados como "sobre-expresión" si su actividad luciferasa era más de dos veces más alta que el nivel de referencia. Se traza el porcentaje de clones con sobre-expresión en cada grupo de plásmidos.

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Fig. 4. Veces de sobre-expresión por los clones con sobre-expresión. El intervalo de sobre-expresión en los plásmidos pSDH que contienen STAR integrado en el ADN genómico fue determinado dividiendo las actividades de la luciferasa de cada clon por el nivel de referencia. Para aquellos que presentaban una expresión significativa (más de dos veces por encima del nivel de referencia), se observaron incrementos en veces reales; los valores mínimo y medio de estos datos se trazan para cada plásmido.

Fig. 5. Veces de sobre-expresión por los clones con sobre-expresión. El intervalo de sobre-expresión en los plásmidos pSDH que contienen STAR integrado en el ADN genómico fue determinado dividiendo las actividades de la luciferasa de cada clon por el nivel de referencia. Para aquellos que presentaban una expresión significativa (más de dos veces por encima del nivel de referencia), se observaron incrementos en veces reales; los valores máximos de estos datos se trazan para cada plásmido.

Fig 6. El plásmido pSDH-CSP utilizado para someter a ensayo la actividad STAR. El gen informador de la Fosfatasa Alcalina Secretada (SEAP) está bajo el control del promotor CMV, y el marcador seleccionable de resistencia a la puromicina (puro) está bajo el control del promotor de SV40. Flanqueando estos dos genes se encuentran múltiples sitios de clonación en los cuales los elementos STAR pueden ser clonados. El plásmido también tiene un origen de replicación (ori) y un gen de resistencia a ampicilina (ampR) para la propagación en Escherichia coli.

Fig. 7. STAR6 y STAR49 mejoran la pronosticabilidad y el rendimiento de la expresión del transgen. Se determinó la expresión de SEAP a partir del promotor CMV por las células CHO transfectadas con pSDH-CSP, pSDH-CSP-STAR6, o pSDH-CSP-STAR,4 9. Los constructos que contienen STAR confieren mayor pronosticabilidad y un elevado rendimiento en relación con el constructo pSDH-CSP solo.

Fig 8. STAR6 y STAR8 mejoran la pronosticabilidad y el rendimiento de la expresión del transgen. Se determinó la expresión de luciferasa a partir del promotor de CMV por las células U-2 OS transfectadas con pSDH-CMV, pSDH-CMV-STAR6, o pSDH-CMV-STAR8. Los constructos que contienen STAR confieren mayor pronosticabilidad y un elevado rendimiento en relación con el constructo pSDH-CMV solo.

Fig 9. Secuencias esenciales mínimas de STAR10 y STAR27. Las porciones de los elementos STAR fueron amplificadas mediante PCR: STAR10 fue amplificado con los cebadores E23 y E12 para rendir el fragmento 10A, E13 y E14 para rendir el fragmento 10B, y E15 y E16 para rendir el fragmento 10C. STAR27 fue amplificado con los cebadores E17 y E18 para rendir el fragmento 27A, E19 y E20 para rendir el fragmento 27B, y E21 y E22 para rendir el fragmento 27C. Estos sub-fragmentos fueron clonados en el vector pSelect. Tras la transfección en células U-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1, se verificó el crecimiento de los cultivos en presencia de zeocina. Las tasas de crecimiento variaban de vigoroso (+++) a escaso (+/-), mientras algunos cultivos no lograban sobrevivir al tratamiento con zeocina (-) debido a la ausencia de actividad STAR en el fragmento de ADN sometido a ensayo.

Fig 10. Función del elemento STAR en el contexto del promotor SV40. pSDH-SV4 0 y pSDH-SV4 0-STAR6 fueron transfectados en la línea celular de osteosarcoma humano U-2 OS, y la expresión de la luciferasa fue analizada con o sin protección del silenciamiento del gen por STAR6 en clones resistentes a la puromicina.

Fig 11. Función del elemento STAR en el contexto del promotor Tet-Off. pSDH-Tet y pSDH-Tet-STAR6 fueron transfectados en la línea celular de osteosarcoma humano U-2 OS, y la expresión de la luciferasa fue analizada con o sin protección del silenciamiento del gen por STAR6 en clones resistentes a la puromicina.

Fig 12. Diagrama esquemático de la orientación de elementos STAR a medida que son clonados en el vector pSelect (panel A), a medida que son clonados en vectores pSDH para conservar su orientación natural (panel B), y a medida que son clonados en el vector pSDH en la orientación contraria (panel C).

Fig 13. Direccionalidad de la función STAR66. El elemento STAR66 fue clonado en pSDH-Tet en orientación natural (STAR66 natural) o en orientación contraria (STAR66 contraria), y transfectado en células U-2 OS. La actividad de la luciferasa fue analizada en clones resistentes a la puromicina.

Fig 14. Dependencia del número de copias de la función STAR. Transferencia Southern de unidades de expresión de la luciferasa en pSDH-Tet-STAR10, integrado en ADN genómico de U-2 OS. La sonda de ADN de luciferasa radiactiva para detectar la cantidad de ADN de transgen en el genoma de cada clon, que después fue cuantificado con un aparato para la formación de imágenes con fósforo.

Fig 15. Dependencia del número de copias de la función STAR. Se determinó el número de copias de unidades de expresión pSDH-Tet-STAR10 en cada clon mediante formación de imágenes con fósforo, y se comparó con la actividad de la enzima informadora luciferasa expresada por cada clon.

Fig 16. Análisis de bloqueo del intensificador e intensificador. Los vectores de expresión de luciferasa utilizados para someter a ensayo los STAR en cuanto a la actividad de bloqueo del intensificador y del intensificador se muestran esquemáticamente. El sitio de unión a la caja-E para la proteína intensificadora E47 está aguas arriba de un sitio de clonación para los elementos STAR. Aguas abajo del sitio de clonación STAR está el gen de la luciferasa bajo el control de un promotor mínimo de la fosfatasa alcalina humana (mp). Los histogramas indican los resultados esperados para las tres posibles situaciones experimentales (ver el texto).

Panel A: Análisis de bloqueo del intensificador.

Panel B: Análisis del intensificador.

Fig 17. Análisis de bloqueo del intensificador. La expresión de la luciferasa de un promotor mínimo es activada por el intensificador E47/caja-E en el vector vacío (vector). La inserción de los bloqueadores del intensificador (scs, HS4) o de los elementos STAR (elementos STAR 1, 2, 3, 6, 10, 11, 18, y 27) bloquean la activación de la luciferasa por el intensificador E47/caja-E.

Fig 18. Análisis de intensificador. La expresión de la luciferasa de un promotor mínimo es activada por el intensificador E47/caja-E en el vector vacío (E47). La inserción de los elementos scs y HS4 o diversos elementos STAR (STAR 1, 2, 3, 6, 10, 11, 18, y 27) no activan las transcripción del gen informador.

Fig 19. Conservación de la secuencia de STAR18 entre ratón y humano. La región del genoma humano que contiene STAR18 de 497 pares de bases (recuadros negros); el elemento existe entre los genes del homeodominio HOXD8 y HOXD4 del cromosoma humano 2. Está alineado con una región en el cromosoma de ratón 2 que comparte una identidad de secuencia del 72%. La región del cromosoma 2 humano inmediatamente a la izquierda de STAR18 está altamente conservada con el cromosoma 2 de ratón (identidad del 73%, recuadros grises); más allá de esta región, la identidad cae por debajo del 60%. Se indica la capacidad de estas regiones de humano y de ratón, ya sea por separado o combinadas, para conferir crecimiento en zeocina: -, sin crecimiento; +, crecimiento moderado; ++, crecimiento vigoroso; +++, crecimiento rápido.

Fig. 20. Secuencias que comprenden STAR1 - STAR65 (SEQ ID:1 - 65)

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\global\parskip1.000000\baselineskip

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1

La expresión del gen informador luciferasa es medida en líneas celulares que contienen plásmidos pSDH integrados, sin elementos STAR ("vacío", control negativo) o conteniéndolos (incluyendo el elemento control positivo, SCS de Drosophila). El nivel medio de expresión del control negativo se define como el nivel de referencia, y los clones son considerados con sobre-expresión si su nivel de expresión es >2 veces superior al nivel de referencia. Se informa sobre el porcentaje de clones con sobre-expresión para cada plásmido y el número de veces de sobre-expresión, junto con el número de clones analizados para cada plásmido.

TABLA 2 Elemento STAR clonado

2

TABLA 2 (continuación)

3

TABLA 2 (continuación)

4

TABLA 4 Secuencia de diversos elementos STAR en una hebra (directa) o la hebra opuesta (inversa)

5

TABLA 4 (continuación)

6

TABLA 4 (continuación)

7

TABLA 4 (continuacón)

8

TABLA 4 (continuación)

9

TABLA 4 (continuación)

10

TABLA 4 (continuación)

11

TABLA 4 (continuación)

12

TABLA 5 Oligonucleótidos utilizados para las reacciones en cadena de la polimerasa (cebadores de PCR) o mutagénesis de ADN

13

TABLA 5 (continuación)

14

TABLA 6 Elementos STAR de la invención, incluyendo localización y longitud genómica

15

TABLA 6 (continuación)

16

TABLA 6 (continuación)

17

TABLA 6 (continuación)

18

TABLA 7 Los elementos STAR otorgan estabilidad con el tiempo a la expresión de los transgenes^{1}

19

TABLA 8 Elementos STAR humanos y sus supuestos ortólogos y parálogos de ratón

20

TABLA 8 (continuación)

21

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Chromagenics B.V.

\hskip1cm Otte, Arie P.

\hskip1cm Arthur, Kruckeberg L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Secuencias de ADN que tienen actividad anti-represora

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 0103 EP 04 DIV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 01202581.3

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 04-07-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/303.199

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 05-07-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 749

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 883

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2126

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

24

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1625

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

26

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1571

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1173

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

30

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

32

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1821

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1929

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR9

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1167

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (452)..(1143)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1377

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR11

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1051

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR12

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR13

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 711

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

41

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1876

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1282

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 793

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 492

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

48

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 1840

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

49

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 780

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 607

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1246

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR23

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 939

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1067

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

56

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 540

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1520

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

59

590

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 961

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2233

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

61

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1851

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

63

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1701

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (159)..(1696)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

65

650

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 771

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1368

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 755

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

68

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1193

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (355)..(1191)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (312)..(1191)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

70

700

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1712

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

71

710

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (348)..(949)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2331

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

74

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1071

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1135

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 735

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

78

780

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1227

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1586

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1981

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR45

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1859

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1082

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR48

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1015

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

85

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2355

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

87

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

89

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1184

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR52

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1431

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

92

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 975

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 501

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 741

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1365

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1401

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR58

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 866

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

100

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2067

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (92)..(1777)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Todos los "N" en diferentes posiciones representan cualquier ácido nucleico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1470

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (130)..(976)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1011

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR62

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1410

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR63

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1414

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR64

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1310

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR65

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2500

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de T2F (STAR66F)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

108

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2500

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de T2R (STAR66R)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

110

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia loxP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataacttcgt ata

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia FRT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagttccta tac

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 631

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> elementos STAR en STAR3 directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(630)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 774

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> elementos STAR en STAR3 inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (637)..(762)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 717

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> elementos STAR en STAR4 directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (444)..(704)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 541

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> elementos STAR en STAR4 inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(533)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 794

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> elementos STAR en STAR6 directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (374)..(792)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 379

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> elementos STAR en STAR6 inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (287)..(379)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> elementos STAR en STAR8 directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (98)..(395)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico en diferentes posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 309

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> elementos STAR en STAR8 inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (72)..(72)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 606

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> elementos STAR en STAR18 directo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (524)..(524)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "N" representa cualquier ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 465

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> elementos STAR en STAR18 inverso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

121

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido C65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaagcttg atatcagatc tgctagcttg gttcgagctga tacttccc

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido C66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaactcgagc ggccgcgaat tcgtcgactt taccactccc tatcagtgat agag

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido C67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaccgcggc atggaagacg ccaaaaacat aaagaaagg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido C68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatggatcct agaattacac ggcgatcttt cc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido C81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaccatggc cgagtacaag cccacggtgc gcc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido C82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaatctagat caggcaccgg gcttgcgggt catgc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido C85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catttccccg aaaagtgcca cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcactgctag cgagtggtaa actc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagtcgacg aggcaggcag aagtatgc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagccgcggt ttagttcctc accttgtcg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctggaagct ttgctgaaga aac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcaagatg tcgragtcag g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcccatgg tcacctccat cgctactgtg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaatcactc actgtgtaat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattacaggc gcgcc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattggcgcg cctgt

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgctttgcat acttctgcct gcctc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taggggggat ccaaatgttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctaaaagaa gatctttagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagtgttgga tccactttgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttgaagatc taccaaatgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttcgggatc cacctggccg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taggcaagat cttggccctc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctctctagg gatccgaccc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagagagat cttccagtat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agagttccgg atccgcctgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaggcagac tcggaactct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtgaaacc ggatccctac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtcaggag atctagacca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccattttcgc ttccttagct cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatgtaacc cactcgtgca cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agagatctag gataatttcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcgctagc acgcgttcta ctcttttcct actctg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcaagctt acgcgtctaa aggcatttta tatag

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcgctagc acgcgttcag agttagtgat ccagg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcaagctt acgcgtcagt aaaggtttcg tatgg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<223> oligonucleótido E96

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcgctagc acgcgttcta ctctttcatt actctg

\hfill

36

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> oligonucleótido E97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaggaagct ggagaaggag aagctg

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido E98

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagggccgc agcttacaca tgttc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagttgac cagtgcc

\hfill

17

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttcgtggac acgacctccg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido D70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacaagccaa ccacggcct

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> oligonucleótido D71

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggaagtgct tgacattggg

\hfill

20

Claims

1. Una secuencia de ADN aislada y/o recombinante que tiene actividad anti-represora, seleccionada dicha secuencia del grupo que consiste en:

(a): el SEQ ID: 27 de la Figura 20;

(b): un fragmento del SEQ ID: 27 de la Figura 20;

(c): una secuencia derivada del SEQ ID: 27 de la Figura 20 por deleción, inserción y/o mutación de una o más bases;

donde la actividad anti-represora de dicha secuencia confiere a una célula de osteosarcoma U-2 OS humana la capacidad para crecer después de 4-5 semanas de cultivo en presencia de 250 \mug/ml de Zeocina y 0,1 ng/ml de doxiciclina, cuando dicha célula comprende una proteína de fusión represora de LexA que contiene el dominio de unión a ADN de LexA y una región codificadora de HP1 o HPC2 bajo el control del sistema regulador de la transcripción Tet-Off, cuando dicha secuencia de ADN aislada y/o recombinante es clonada en una secuencia poliligadora en un plásmido, estando situado dicho poliligador entre cuatro sitios operadores de LexA y el promotor de SV40 que controla el gen de resistencia a zeocina, cuando el plásmido está presente en dicha célula.

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2. Un constructo de ADN recombinante provisto de una secuencia de ADN según la reivindicación 1.

3. Un constructo de ADN según la reivindicación 2, que comprende adicionalmente un promotor conectado operablemente a una secuencia de ácido nucleico de interés.

4. Un constructo de ADN según la reivindicación 3, donde dicha secuencia de ácido nucleico de interés es un marco de lectura abierto de un transgen.

5. Un constructo de ADN según la reivindicación 4, donde dicho promotor es un promotor exógeno.

6. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, donde dicho promotor es un promotor constitutivo fuerte, preferiblemente un promotor viral, o un promotor inducible.

7. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, donde dicho promotor es un promotor de CMV, un promotor de SV40 o un promotor Tet-Off.

8. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que comprende en el siguiente orden:

(i): una secuencia de ADN según la reivindicación 1,

(ii): el promotor conectado operablemente a la secuencia de ácido nucleico de interés, y

(iii): una secuencia de ARN según la reivindicación 1, preferiblemente en orientación opuesta a (i).

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9. Un método para obtener una célula anfitriona que comprende la etapa de transfectar la célula anfitriona con un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 3-8.

10. Una célula que comprende un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 3-8.

11. Una célula según la reivindicación 10, que comprende múltiples copias de dicho constructo de ADN.

12. Una célula según la reivindicación 10 u 11, que es una célula CHO.

13. Un método para producir un producto génico en una célula que comprende proporcionar una casete de expresión que comprende:

(i): un transgen que codifica dicho producto génico, y

(ii): una secuencia de ADN según la reivindicación 1, y permitir la transcripción de dicha casete de expresión en una célula.

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14. Un método según la reivindicación 13, donde dicha célula es una célula CHO.

\newpage

15. Un método según la reivindicación 13 o 14, donde la casete de expresión comprende en el siguiente orden:

(i): una secuencia de ADN según la reivindicación 1,

(ii): el transgen que comprende un promotor conectado operablemente a un marco de lectura abierto que codifica dicho producto génico, y

(iii): una secuencia de ADN según la reivindicación 1, preferiblemente en orientación opuesta a (i).

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16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, donde se proporciona una multiplicidad de dichas casetes de expresión y se permite la transcripción de las mismas en dicha célula, y la expresión de dicho transgen depende del número de copias.

17. El uso in vitro de una secuencia de ADN según la reivindicación 1, para regular la transcipción de un ácido nucleico de interés.