ES2343732T3 - Interferon beta para la terapia antivirica de enfermedades respiratorias. - Google Patents

Abstract

Un agente seleccionado entre (a) interferón-β (IFN-β); o (b) un polinucleótido que es capaz de expresar IFN-β para su uso en el tratamiento de la exacerbación de una enfermedad respiratoria inducida por rinovirus seleccionada entre asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), en el que dicho tratamiento es mediante administración en las vías aéreas de dicho medicamento.

Description

Interferon-\beta para la terapia antivírica de enfermedades respiratorias.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una terapia antivírica para enfermedades respiratorias. Más específicamente, la invención se refiere al tratamiento de los agravamientos de asma o enfermedad respiratoria obstructiva crónica inducidas por rinovirus mediante la administración a las vías respiratorias de interferón \beta (IFN-\beta) o de un agente que aumenta la expresión de IFN-\beta. El asma y la COPD son ejemplos de enfermedades inflamatorias de las vías aéreas en las que se reconoce el virus del resfriado común (rinovirus) por producir agravamientos asociados con graves problemas clínicos.

Antecedentes de la Invención

Las infecciones víricas del tracto respiratorio conducen al agravamiento de numerosas enfermedades respiratorias. De hecho, las infecciones víricas del tracto respiratorio son responsables del 85% de los agravamientos del asma (Johnston y col., BMJ, 1995; 310: 1225-8; Nicholson y col., BMJ, 1993; 307: 982-6), incluyendo las más graves, que requieren de hospitalización (Johnston y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996; 154: 654-660). Preocupa que las infecciones víricas puedan estimular importantes agravamientos de asma incluso cuando existe un buen control del asma en pacientes disciplinados que toman dosis óptimas de corticoesteroides inhalados (Reddel y col., Lancet, 1999; 353: 364-369). El patógeno más común asociado con los agravamientos de asma es rinovirus. La infección por rinovirus conduce a la liberación de mediadores inflamatorios (Teran y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997; 155: 1362-1366) y a una sensibilidad bronquial aumentada (Grunberg y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997; 156: 609-616).

Los sujetos con asma no parecen ser más susceptibles de adquirir infecciones víricas en el tracto respiratorio, pero tienen síntomas más graves en el tracto respiratorio inferior (Corne y col., Lancet, 2002; 359: 831-834). Aunque se sabe que los rinovirus infectan las células epiteliales bronquiales (Gern y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997; 155: 1159-1161) y se han aislado de las vías aéreas inferiores (Papadopoulos y col., J. Infect. Dis., 2000; 1821: 1875-1884; Gem y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997; 155: 1159-1161), no están claras las razones por las que el tracto respiratorio inferior asmático es más propenso a los efectos de la invención. Es por tanto necesario determinar qué células epiteliales bronquiales asmáticas tienen una respuesta(s) anormal a la infección vírica que produce un aumento de la replicación vírica lo que da lugar a respuestas proinflamatorias prolongadas y aumentadas y a agravamiento asociado con síntomas de asma. Es también necesario proporcionar tratamientos para los agravamientos de asma inducidos víricamente.

Sorprendentemente, se ha encontrado que las células bronquiales asmáticas son anormales en su respuesta frente a la infección vírica, lo que conduce a un aumento en la producción de viriones en comparación con los controles normales sanos. Esto es a pesar del hecho de que las células asmáticas y las sanas provocan una respuesta inflamatoria temprana a la infección. Se ha demostrado también que las células asmáticas son más resistentes a la apoptosis inicial que sigue a la infección y tienen una respuesta deficiente al interferón de tipo I. Esta respuesta apoptótica inicial es un mecanismo protector clave debido a que la inhibición de la apoptosis en células control sanas conduce a un rendimiento vírico potenciado. Por tanto, el aumento en la producción de viriones en células epiteliales por las células epiteliales bronquiales asmáticas se asocia con la capacidad de las células de sortear la apoptosis. Además, se ha encontrado que la inducción de la apoptosis en células epiteliales bronquiales asmáticas usando IFN-\beta produce una significativa reducción en la producción de viriones infecciosos. La invención se refiere por tanto al tratamiento de agravamientos de asma inducidos víricamente usando un agente inductor de la apoptosis, preferiblemente IFN-\beta o un análogo del mismo.

La Patente de los Estados Unidos nº 6.030.609 ha propuesto anteriormente un procedimiento para tratar la infección en la vías aéreas por el virus sincitial respiratorio (VSR) mediante la administración de IFN-\beta en aerosol. Esta propuesta se hizo únicamente sobre la base de experimentos con células epiteliales de pulmón cultivadas. No existe mención en la Patente de los Estados unidos nº 6.030.609 sobre el asma y, más particularmente, sobre el agravamiento del asma inducida por rinovirus, lo que según se ha indicado anteriormente, es un grave problema clínico. A su vez, no es posible extrapolar a partir de los experimentos informados en la Patente de los Estados Unidos nº 6.030.609 que IFN-\beta pudiera ser eficaz en el tratamiento del agravamiento del asma inducida por rinovirus, ya que se sabe que VSR produce proteínas que interfieren con la producción de interferón de Tipo I (Bossert y Conzelmann, Respiratory syncytial virus (RSV) nonstructural (NS) proteins as host range determinants: a chimeric bovine RSV with NS genes from human RSV is attenuated in interferon-competent bovine cells. J Virol. (2002) 76, 4287-93; y Spann y col., Suppression of the induction of alpha, beta, and lambda interferons by the NS1 and NS2 proteins of human respiratory syncytial virus in human epithelial cells and macrophages [corrected].J Virol. (2004) Abr; 78(8):4363-9; Erratum en: J Virol. (2005) 78 (12):6705), mientras que no se sabe que rinovirus produzca actividad similar. Además, aunque el primer ensayo clínico en población general usando IFN-\beta-ser frente a la infección experimental por rinovirus mostró efectos beneficiosos prometedores (Higgins PG, Al-Nakib W, Willman J, Tyrrell DA. Interferon-beta ser as prophylaxis against experimental rhinovirus infection in volunteers. J. Interferon Res. (1986) 6: 153-9), en un ensayo posterior de profilaxis de resfriados naturales se encontró que IFN-\beta-ser no era eficaz (Sperber SJ, Levine PA, Sorrentino JV, Riker DK, Hayden FG. Ineffectiveness of recombinant interferon-beta serine nasal drops for prophylaxis of natural colds. J. Infect Dis. (1989) 160, 700-5), debido posiblemente a que las células normales tienen una capacidad innata para producir IFN-\beta en respuesta a la infección por rinovirus. Tal como se ha indicado anteriormente, los inventores han encontrado en este ejemplo que una característica clave que distingue a las células epiteliales asmáticas es una deficiente respuesta apoptótica debida a la producción perjudicial de IFN-\beta que permite que la infección vírica quede sin señalar, contribuyendo por tanto a síntomas prolongados y a agravamiento de la enfermedad. Aunque los inventores propusieron en primer lugar el tratamiento de dicha deficiencia mediante el uso de IFN-\beta en relación con el agravamiento del asma inducida por rinovirus, se propone ahora, por ser igualmente aplicable al agravamiento de la COPD inducida por rinovirus, que abarque una gama de dolencias que incluyan la bronquitis y el enfisema crónico.

Resumen de la invención

Según esto, la invención proporciona el uso de un agente seleccionado entre:

(a) interferón-\beta (IFN-\beta); o

(b) un polinucleótido capaz de expresar (IFN-\beta)

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del agravamiento de una enfermedad respiratoria inducida por rinovirus seleccionada entre asma y COPD, en la que dicho tratamiento es mediante la administración en las vías aéreas de dicho medicamento, por ejemplo, mediante el uso de un nebulizador en aerosol.

La invención proporciona además un agente seleccionado entre:

(a) IFN-\beta; o

(b) un polinucleótido capaz de expresar IFN-\beta

para uso en dicho tratamiento

Dicho tratamiento puede ser un tratamiento profiláctico o terapéutico. Por "inducido por rinovirus" se entenderá la inducción únicamente mediante rinovirus o un virus que comprende preferible pero no exclusivamente rinovirus.

Breve descripción de las figuras

la Figura 1 muestra las respuestas proinflamatorias de las células epiteliales bronquiales normales y asmáticas (BEC) tras la infección por rinovirus (RV). Paneles (a) y (c): Se midió la inducción de IL-8 y del ARNm de TNF\alpha (c) 8 h después de la infección por RV-16 mediante células asmáticas PCRc que tenían una inducción de una vez la mediana (IQR) de IL-8 de 33,2 (7,3, 208,6) en comparación con 101,4 (6,4, 802,9) en los controles sanos sin diferencias significativas entre grupos (p = 8) Ambos grupos demostraron un aumento significativo en el ARNm de IL-8 en comparación con las células tratadas solo con medio (p = 0,001) y RV inactivado con UV (p = 0,01). Para el ARNm de TNF\alpha, las células asmáticas tenían una inducción de una vez la mediana de los valores iniciales de 94,4 (5,8, 1001,4) en comparación con 272,9 (30, 676) en células control sanas, sin diferencia significativa entre los grupos (p = 8). Ambos grupos demostraron un significativo aumento en el ARMn de TNF-\alpha en comparación con las células tratadas solo con medio (p< 0,01) y RV inactivado con UV (p < 0,01). Paneles (b) y (d): IL-8 (b) y se midió la producción de proteína de TNF\alpha (d) en el sobrenadante 48 h tras la infección por RV-16 mediante ELISA. Los niveles de la mediana (IQR) de IL-8 fueron de 922 pg/ml (868, 1065) en células asmáticas en comparación con 705 pg/ml (414, 979) (p = 0,6) en los controles sanos. Ambos grupos demostraron un aumento significativo por encima del de las células tratadas solo con medio (61,4 pg/ml, p < 0,001) y RV-16 inactivado por UV; (43,8, P < 0,01). La secreción de TNF-\alpha fue de 10,4 pg/ml (6,9, 29,6) en células asmáticas infectadas por RV-16 y 24,6 pg/ml (9,2, 30,4) en células control sanas infectadas por RV-16 (p = 0,7). Ambos grupos demostraron un aumento significativo de las anteriores células tratadas solo con medio (1,85 pg/ml, p < 0,01) y de RV-16 inactivado con UV (4,69 (4,69, P < 0,01). Paneles (e) y (f): se midió la expresión de ICAM-1 mediante citometría de flujo inmediatamente antes de la infección por RV-16 (e) o 24 h después de la infección (f). Se expresaron los datos como intensidad de la fluorescencia promedio (MFI). Antes de la infección, las células asmáticas tenían una tendencia a una MFI media de 31 (12,80) en comparación con las células control sanas de 67 (34, 83) pero no fue significativa (p = 0,3). Después de 24 h, las células asmáticas tenían una MFI media significativamente inferior de 54,6 (27,6, 145,2) en comparación con las células control sanas de 110,4 (65, 195,3) (p = 0,02). Las gráficas son representaciones gráficas de medias y dispersión (box whisker plots), las líneas gruesas representan la media, el borde de la caja superior representa el cuartil 75º, el inferior el cuartil 25º, los bigotes son los centiles 5º y 95º. * = significativamente diferentes de las células tratadas sólo con medio y RV-16 inactivado con UV;

la Figura 2 muestra la replicación de RV-16 y la liberación de BEC normales y asmáticas. Panel (a): se estimó la liberación de RV-16 en el sobrenadante de células infectadas; calculando la DICT_{50} de la CPE en las monocapas confluentes de células Hela Ohio. Se han transformado los valores logarítmicamente; los puntos de datos representan la media geométrica y el error estándar de la media. En 48 h se detectó significativamente más RV procedente de células asmáticas con una DICT_{50} promedio de 3,99, en comparación con 0,54 en las células control sanas (p < 0,01). Panel (b): Se midió la producción de ARNm de RV-16 mediante PCRc tras 8 h de infección. La producción de la mediana (IQR) de las células asmáticas fue de 21 x 10^{5} (1,6 x 10^{5}, 97 x 10^{5}) en comparación con 0,4 x 10^{5} (0,09 x 10^{5},
0,6 x 10^{5}) de los controles sanos (p < 0,01). Las gráficas son representaciones gráficas de gráficas de medias y dispersión, las líneas gruesas representan la media, el borde de la caja superior representa el cuartil 75º, el inferior el cuartil 25º, los bigotes son los centiles 5º y 95º. Los puntos representan valores atípicos. Paneles (c) y (d): Se analizó la lisis celular como consecuencia de la infección por RV-16 basándose en la actividad de LDH en los sobrenadantes de los cultivos. Los valores se han transformado logarítmicamente; los puntos de datos representan la media geométrica y el error estándar de la media. Ambos grupos demostraron un progresivo aumento en la actividad de LDH en el tiempo que fue creciendo significativamente a partir de los valores iniciales en las 24 h (p < 0,01) en células asmáticas pero no en células control sanas incluso a las 48 h (p = 0,2) (c). En 48 h, la actividad de LDH de las células asmáticas mostró un aumento promedio de 3,4 veces de los valores iniciales en comparación con el aumento de 1,34 veces en las células control sanas (p < 0,001) (d). No se observaron cambios significativos en la actividad de LDH en las células tratadas solo con medio o con RV inactivado con UV. * = los resultados de las células asmáticas y de los controles sanos son significativamente diferentes (p < 0,01).

Asma = \bullet, Controles sanos = \circ.

la Figura 3 muestra los cambios en la viabilidad celular tras la infección por RV-16. Tras infección por RV-16 durante 8 h, se tiñeron las células con Annexin-V conjugado con el fluorocromo de la Ficoeritrina (FE) y colorante vital 7-amino-actinomicina (7-AAD) y se analizaron mediante citometría de flujo. Panel (a). Se determinaron numerosas células viables (AxV^{-}/7AAD^{-}) y se expresaron como % de viabilidad en comparación con las células tratadas solo con medio. La infección con RV-16 condujo a una significativa reducción en la viabilidad celular de la mediana (IQR) en las células asmáticas y control en comparación con el medio solo (p = 0,03). No hubo reducción significativa en la viabilidad en las células tratadas con 96% de RV-16 inactivado (91, 98). Las células asmáticas mostraron significativamente mejor viabilidad, una mediana del 80% (74, 86), en comparación con el 63% de los controles sanos (51, 69) (p = 0,02). Panel (b): Se analizaron también las células apoptóticas (AxV^{+}/7AAD^{-}) tras 8 h de infección por RV-16. Aunque ambos grupos demostraron un aumento en la apoptosis. Las células tratadas von RV-16 inactivado con UV muestran un pequeño aumento por encima de los valores iniciales, 1,2 (1,1, 1,4) (p = 0,02). * = significativamente diferente de las células tratadas solo con medio (p < 0,01). ** = significativamente diferente de las células asmáticas (p < 0,05).

la Figura 4 muestra la actividad de la caspasa y su papel tras la infección por RV-16. Panel (a): Se determinó el curso de tiempo para la activación de la Caspasa 3/7 por RV-16 usando el ensayo Apo-One Homogéneo de la Caspasa 3/7 (Promega, Maddison, EE.UU. con el lector ajustado para el número de células. Los valores se han transformado logarítmicamente para permitir representarlos gráficamente en el tiempo; los puntos de datos representan la media geométrica y el error estándar de la media. Hubo inducción significativa de caspasa 3/7 activa en respuesta a la infección que alcanzó una meseta a las 8 h (p < 0,01). Las células asmáticas mostraron una inducción inferior de la caspasa 3/7 activa (promedio (SEM) = 1,47 (0,1) en comparación con los controles sanos (promedio (SEM) = 2,16 (0,3); p = 0,004). Panel (b): Se midió el efecto de inhibición de la caspasa-3 usando el inhibidor, ZVD-fmk, mediante citometría de flujo, según se describe en la leyenda de la Figura 3. Se trataron las células solo con RV-16 o con ZVD-fmk, antes y después de la infección con RV-16. Se expresan los resultados como las veces de inducción de la apoptosis que se observan por encima de las células control tratadas solo con RV-16. En células asmáticas hubo una inducción de la mediana (IQR) de la apoptosis por encima de los valores iniciales de 1,4 (1,35, 1,68) solo con RV-16; el pretratamiento de las células con ZVD-fmk, tuvo poco efecto sobre la apoptosis (mediana (IQR) = 1,17 (0,96, 1,95); p > 0,05). Sin embargo, en las células control sanas, la infección por RV-16 dio como resultado una mediana (IQR) de inducción de la apoptosis por encima de los valores iniciales de 2,19 ((1,98, 2,22) y se suprimió ésta mediante pretratamiento con ZVD-fmk (mediana (IQR) = 0,82 (0,78, 0,86); p = 0,03). Panel (c): Se midió el efecto de inhibición de la caspasa-3 sobre la producción de RV-16 mediante el ensayo de valoración de HeLa sobre el sobrenadante de BEC eliminado tras 48 h de infección. No hubo diferencia observable en la DITC_{50} en el sobrenadante eliminado de las células asmáticas infectadas con RV-16 (mediana (IQR) = 3,56 (3,50-3,62) en comparación con células infectadas tratadas con ZVD-fmk (mediana (IQR) = 3,56 (3,5-3,62); p = 0,94). Sin embargo, para las BEC control sanas, la DITC_{50} aumentó desde un valor de la mediana (IQR) de 0,6 (0,4, 0,63) solo con la infección hasta 2,78 (0,63, 6,32) (p = 0,01) en presencia de RV-16 y ZVD-fmk. * = significativamente diferente de las células asmáticas ((p < 0,01). ** = significativamente diferente de las células tratadas solo con RV-16. Asma = \bullet, Controles sanos = \circ.

la Figura 5 muestra la producción de IFN\beta y su papel en la infección por RV-16. Panel (a): Se midió la inducción del ARNm de IFN\beta mediante PCRc tras 8 h de infección por RV-16. Las células asmáticas demostraron una inducción de una vez la mediana (IQR) a partir de los valores control 0,3 iniciales (0,3, 0,8) que no fue significativamente diferente de la de las células tratadas solo con medio o RV-16 inactivado con UV pero que fue significativamente menor cuando se la comparó con los controles 3,6 sanos (3,4, 3,6) (p = 0,004). Panel (b): se midió la liberación de IFN\beta en los sobrenadantes del cultivo 48 h después de la infección mediante ELISA. Para BEC asmáticas, la mediana (IQR) de los niveles de IFN\beta fue de 721 (464, 1290) pg/ml, en comparación con los 1854 pg/ml (758,3766) (p = 0,03) de los controles sanos. Ambos grupos demostraron un aumento significativo por encima de las células tratadas solo con medio (56,4 pg/ml, p < 0,001) y RV-16 inactivado con UV (113,8 pg/ml, P0,01). Panel (c): Se midió el efecto de IFN\beta sobre la inducción de la apoptosis en células asmáticas infectadas con RV-16 mediante el análisis FACS según se describe en la leyenda de la Figura 3. Para imitar la presencia de ARN vírico, se expusieron también las células a poli(I):poli(C) un oligonucleótido sintético de ARN de doble cadena, en vez de RV-16. Se expresaron los resultados como la inducción de una vez en la apoptosis que se observa por encima de las células control tratadas solo con medio. Hubo un significativo aumento de la apoptosis en las células expuestas tanto a IFN\beta como a RV-16 solo (inducción de la mediana (IQR) de la apoptosis = 1,11 (0,99, 1,94) ó 1,57 (0,98, 1,98), respectivamente. Las células tratadas con RV-16 e IFN\beta conjuntamente mostraron una tendencia a un aumento de la apoptosis (mediana (IQR) = 3,75 (1,12, 5,25); p = 0,11) mientras que las pretratadas con IFN-\beta e infectadas a continuación tuvieron un significativo aumento en la inducción de la apoptosis (mediana (IQR) = 5,69 (2,19, 5,69)). Las células expuestas a poli(I):poli(C) mostraron únicamente un pequeño aumento en la apoptosis (mediana (IQR) = 1,92 (1,34, 4) que se potenció mediante el tratamiento con IFN-\beta (mediana (IQR) = 9,25 (3,46, 9,25); p < 0,05). Panel (d): Se midió el efecto de IFN\beta sobre el rendimiento vírico de las células asmáticas mediante el ensayo de valoración de HeLa usando sobrenadantes de cultivo de BEC asmáticas retirados tras 48 h de infección. Las células fueron tanto pretratadas con IFN\beta (100 UI) durante 12 h y a continuación expuestas a RV-15 como tratadas con IFN\beta inmediatamente tras la infección. Hubo una significativa reducción en el rendimiento vírico observado en células tratadas con IFN\beta tras la infección, log de la mediana de DICT_{50} 2,78 (2, 3,56) y una reducción adicional en las células pretratadas con IFN\beta 1,12 (0,28, 1,34) en comparación con las células infectadas solo con RV-16 en comparación con células infectadas solo con RV16 3,56 (3,5-3,62) (p < 0,05). * = significativamente diferente entre el medio solo y las células asmáticas tratadas con RV-16. ** = significativamente diferente del medio solo. # = significativamente diferente de la infección de RV-10 solo. \alm{2} = significativamente diferente de poli(I):poli(c) solo.

la Figura 6 muestra la inducción del ARNm de IFN\beta 8 h después de la infección de los cultivos de BEC primarios procedentes de un voluntario sin COPD y un paciente de COPD con RV-16 (2moi). Se midió el ARNm de IFN-\beta mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa y normalizada en los niveles de IFN-\beta en controles no tratados (SFM).

la Figura 7 muestra una comparación de la replicación vírica 24 horas después de la infección por RV-16 (2moi) de los cultivos de BEC procedentes de un paciente con COPD y uno con COPD. Se midió la producción de viriones como DICT_{50}/ml según se determinó mediante el ensayo de valoración de células HeLa.

la Figura 8 muestra la inducción del ARNm de IFN-\beta 8 horas después de la infección de las BEC primarias procedentes de un paciente de COPD con RV-16 (2moi) en ausencia o presencia de IFN-\beta exógeno. Se midieron los niveles del ARNm de IFN-\beta mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa y con niveles normalizados de IFN-\beta en controles no tratados (SFM).

la Figura 9 muestra que IFN-\beta redujo la replicación de RV-16 en BEC procedentes de un paciente de COPD. Se infectaron las células con RV-16 (2moi) en ausencia o presencia de IFN-\beta exógeno (100 UI/ml). Se midió la producción de viriones como DICT_{50}/ml mediante el ensayo de valoración de células HeLa.

Breve descripción del listado de secuencias

La SEC DE ID Nº: 1 muestra la secuencia de nucleótidos de IFN\beta-1a humano.

La SEC DE ID Nº: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de IFN\beta-1a humano.

La SEC DE ID Nº: 3 muestra la secuencia de nucleótidos de IFN\beta-1b humano.

La SEC DE ID Nº: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de IFN\beta-1b. IFN\beta-1b es idéntica a la de IFN\beta-1a excepto por la sustitución de la cisteína en el resto 17 con serina.

Descripción detallada de la invención

Según se ha indicado anteriormente en el presente documento, la presente invención se refiere a nuevos usos terapéuticos de IFN-\beta. En particular, se refiere, por ejemplo, al uso terapéutico de IFN-\beta mediante la administración en las vías aéreas para promover la apoptosis en las células epiteliales bronquiales de los pacientes infectados con rinovirus. La invención que se presenta se extiende a la administración en las vías aéreas de IFN-\beta para tratar el agravamiento de COPD inducida por rinovirus.

Definición de IFN-\beta

El término de IFN-\beta según se usa en el presente documento se entenderá que se refiere a cualquier forma o análogo de IFN-\beta que retiene la actividad biológica del IFN-\beta natural y retiene preferiblemente la actividad de IFN-\beta que está presente en el pulmón y, en particular, el epitelio bronquial.

El IFN-\beta puede ser idéntico a o comprender la secuencia del IFN\beta-1a humano (SEC DE ID Nº: 2) o el IFN\beta-1b (SEC DE ID Nº: 4). IFN-\beta se refiere también a una variante de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que varía de la de la SEC DE ID Nº: 2 ó 4. Alternativamente, IFN-\beta puede estar químicamente modificado.

Una variante de IFN-\beta puede ser una variante que se produce naturalmente, por ejemplo una variante que se expresa en especies no humanas. También, las variantes de IFN-\beta incluyen las secuencias que varían de la SEC DE ID Nº: 2 ó 4 pero que no se producen necesariamente de manera natural. Sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2 ó 4, una variante será preferiblemente al menos un 80% homóloga a la secuencia basada en la identidad de aminoácidos. Más preferiblemente, el polipéptido tiene al menos un 85% o un 90% y más preferiblemente al menos un 95%, 97% o 99% de homología basada en la identidad de los aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2 o 4 sobre la secuencia completa. Puede existir al menos un 80%, por ejemplo al menos un 85%, 90% o 95%, de identidad de aminoácidos en un tramo de 40 o más, por ejemplo 60, 80, 100, 120, 140 ó 160 o más, aminoácidos contiguos ("homología fuerte").

Se puede determinar la homología usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, el Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que se puede usar para calcular la homología, por ejemplo, usándolo es sus ajustes por defecto (Devereux y col. (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). Se pueden usar los algoritmos PILEUP y BLAST para calcular la homología o las secuencias puestas en fila (tales como las que identifican los restos equivalentes o las secuencias correspondientes (normalmente en sus ajustes por defecto), según se describe, por ejemplo, en Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S.F y col (1990) J Mol Biol 215:403-10.

El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar Identificar una pareja de secuencias de elevada puntuación (HSP) identificando parejas cortas de longitud W en la petición de secuencia que tanto empareja como satisface una determinada puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul y col, más arriba). Estas localizaciones de las palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar la HSP que las contiene. Estas localizaciones de las palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para que se pueda aumentar tanto como sea posible la puntuación de la alineación acumulativa. Las extensiones para las localizaciones de las palabras se detienen en cada dirección cuando: la puntuación de la alineación acumulativa disminuye en la cantidad X de su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa va hasta cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos con puntuación negativa; o de que se alcance el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa una longitud de palabra (W) por defecto de 11, alineaciones (B) de la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) de 50, expectativa

\euro

de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencia; véase por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad, que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se podría producir un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por azar. Por ejemplo, se considera una secuencia similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia a la segunda secuencia es menor de aproximadamente 1, preferiblemente menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y lo más preferible menor de aproximadamente 0,01.

Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº:1 ó 2, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4 ó 5 a 10, 20 ó 30 sustituciones. Se pueden hacer sustituciones conservativas, por ejemplo, según la Tabla 1. Se pueden sustituir entre sí aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna:

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Sustituciones de aminoácidos conservativos

1

Se pueden eliminar alternativa o adicionalmente uno o más restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 1 ó 2, o más. Se pueden eliminar de 1, 2, 3, 4 ó 5 a 10, 20 ó 30 restos, o más.

IFN-\beta incluye también fragmentos de las secuencias anteriormente mencionadas. Dichos fragmentos retienen la actividad de IFN-\beta. Los fragmentos pueden ser al menos de 120 o 140 aminoácidos de longitud. Se pueden usar dichos fragmentos para producir agentes quiméricos según se describe con más detalle a continuación.

IFN-\beta incluye proteínas quiméricas que comprenden fragmentos o porciones de la SEC DE ID Nº: 2 ó 4. Se pueden añadir alternativa o adicionalmente uno o más aminoácidos a los polipéptidos descritos anteriormente. Se puede proporcionar una extensión en el término N o el término C de la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2 o 4 o una variante o fragmento de polipéptido de la misma. La extensión puede ser muy corta, por ejemplo, entre 1 y 10 aminoácidos de longitud. Alternativamente, la extensión puede ser más larga. Se puede fusionar una proteína vehículo con una secuencia de aminoácidos descrita anteriormente. Se puede usar de esta manera en la invención una proteína de fusión que incorpora uno de los polipéptidos descritos anteriormente.

IFN-\beta incluye también la SEC DE ID Nº: 2 o 4 o las variantes de la misma que se han modificado químicamente. Se conocen en la técnica numerosas modificaciones de la cadena secundaria y se pueden hacer en las cadenas secundarias de las proteínas o los péptidos descritos anteriormente. Dichas modificaciones incluye, por ejemplo, glicosilación, fosforilación, modificaciones de los aminoácidos mediante alquilación reductora por reacción con un aldehído seguida por reducción con NaBH_{4}, amidación con metilacetimidato o acetilación con anhídrido acético. La modificación es preferiblemente glicosilación.

El IFN-\beta se puede preparar sintéticamente o por medios recombinantes usando los procedimientos conocidos en la técnica. Se puede modificar la secuencia de aminoácidos de las proteínas y los polipéptidos para incluir aminoácidos que no se producen naturalmente o para aumentar la estabilidad del compuesto. Cuando las proteínas o los péptidos se producen por medios sintéticos, se pueden introducir dichos aminoácidos durante la producción. Se pueden modificar también las proteínas o los péptidos tras la producción tanto sintética como recombinante.

Se puede producir el IFN-\beta usando D-aminoácidos. En dichos casos, los aminoácidos se unirán en secuencia inversa en la orientación C y N. Esto es convencional en la técnica para producir dichas proteínas o péptidos.

Se puede producir el IFN-\beta en una célula mediante expresión in situ del polipéptido procedente de un vector de expresión recombinante. El vector de expresión transporta opcionalmente un promotor inducible para controlar la expresión del polipéptido. Se puede producir el IFN-\beta o su análogo a gran escala tras purificación mediante cualquier sistema de cromatografía líquida de proteínas tras la expresión recombinante. Los sistemas de cromatografía líquida de proteínas preferidos incluyen sistemas FPLC, AKTA, el sistema Bio-Cad, el sistema BioLogic de BioRad, y el sistema HPLC de Gilson.

Se pueden usar en la invención formas comercialmente disponibles de IFN-\beta o sus análogos. Los ejemplos incluyen Betaseron® y Avonex®.

Polinucleótidos

La invención puede implicar también usar un polinucleótido que sea capaz de expresar IFN-\beta en las vías aéreas pulmonares. Dicho polinucleótido puede estar preferiblemente en forma de un vector capaz de dirigir la expresión de IFN-\beta en el epitelio bronquial. A continuación, el IFN-\beta resultante puede tener un efecto terapéutico ("terapia génica"). El polinucleótido puede codificar cualquiera de las formas de IFN-\beta descritas anteriormente incluyendo las variantes, sus fragmentos y las proteínas quiméricas.

Los polinucleótidos que codifican IFN-\beta pueden comprender la secuencia humana (SEC DE ID Nº: 1 ó 3) o una variante de la secuencia que se produce naturalmente, por ejemplo, una variante que se expresa mediante una especie no humana. También, un polinucleótido que codifica IFN-\beta incluye las secuencias que varían de la SEC DE ID Nº: 1 ó 3 pero que no se producen naturalmente de manera necesaria. En la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 1 ó 3, una variante será preferiblemente al menos un 80 % homóloga a la de la secuencia basada en la identidad de los nucleótidos. Más preferiblemente, el polinucleótido tiene al menos un 85% o un 90% y más preferiblemente al menos un 95%, p7% o 99% de homología basada en la identidad del nucleótido con el nucleótido de la SEC DE ID Nº: 1 ó 3 sobre la secuencia completa. Puede haber al menos un 80%, por ejemplo al menos un 85%, 90% ó 95%, de identidad de nucleótidos en un tramo de 40 o más, por ejemplo 60, 80, 100, 120, 140 o 160 o más, nucleótidos contiguos ("homología fuerte"). Se puede determinar la homología según se ha descrito anteriormente.

Los polinucleótidos pueden comprender ADN o ARN pero comprenden preferiblemente ADN. Pueden ser también polinucleótidos que incluyen en su interior nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen en la técnica numerosos tipos diferentes de modificaciones en polinucleótidos. Estos incluyen esqueletos de metilfosfato y fosforotioato, cadenas de adición de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los objetivos de la presente invención, debe entenderse que los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden estar modificados mediante cualquier procedimiento disponible en la técnica.

Las personas expertas en la técnica pueden producir polinucleótidos tales como polinucleótidos de ADN de manera recombinante, sintética, o mediante cualquier medio disponible. Se pueden clonar también mediante técnicas normalizadas. Se proporcionan polinucleótidos normalmente en forma aislada y/o purificada.

Se producirán polinucleótidos generalmente usando medios recombinantes, usando, por ejemplo técnicas de clonación mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto implicará preparar una pareja de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15-30 nucleótidos) en una región del gen requerido que se desea clonar, poniendo los cebadores en contacto con el ADN obtenido procedente de una célula adecuada, llevando a cabo una reacción en cadena de la polimerasa que realiza la amplificación de la región deseada, aislando el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Se pueden diseñar los cebadores para contener los emplazamientos de reconocimiento adecuados del enzima de restricción de tal manera que se pueda clonar el ADN amplificado en un vector de clonación adecuado.

Aunque en general se conocen bien en la técnica las técnicas mencionadas en el presente documento, se puede hacer referencia en particular a Sambrook y col, 1989.

Según se usa en el presente documento indicado, se usa preferiblemente el polinucleótido en un vector de expresión en el que se une de manera operable a una secuencia control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de codificación en las vías aéreas del pulmón humano.

Los vectores de expresión para uso según la invención pueden ser cualquier tipo de vector convencionalmente empleado para la terapia génica. Puede ser un vector de expresión administrado como ADN desnudo o complejado con uno o más anfifilos catiónicos, por ejemplo, uno o más lípidos catiónicos, por ejemplo, en forma de ADN/liposomas. Se puede emplear alternativamente un vector vírico. Se han descrito anteriormente los vectores de expresión de las proteínas terapéuticas en las vías aéreas del pulmón humano. Por ejemplo, la Solicitud Internacional Publicada WO 01/91800 (Isis Innovation Limited) describe a dicho objeto vectores de expresión que incluyen el promotor C de la ubiquitina humana o sus análogos funcionales. El promotor C de la ubiquitina humana ha demostrado ser capaz de producir un elevado nivel de expresión de la proteína en las vías aéreas de ratones durante muchas semanas y se ha propuesto por tanto como un promotor favorecido para uso en la terapia génica de las vías aéreas para una variedad de enfermedades respiratorias. Se han descrito también ejemplos de vectores de expresión para uso en la dirección de la expresión del transgén en el epitelio de las vías aéreas en Chow y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94: 14695-14700. Se pueden administrar dichos vectores de expresión vía las vías aéreas, por ejemplo, en la cavidad nasal o la tráquea.

Agravamientos de la enfermedad respiratoria inducidas víricamente

En la presente invención, se usa IFN-\beta o un polinucleótido que es capaz de expresar IFN-\beta para tratar agravamientos de la enfermedad respiratoria inducidas por rinovirus, más particularmente, por ejemplo asma. Una exacerbación de una enfermedad respiratoria inducida víricamente es un aumento en la gravedad de una enfermedad respiratoria que da es el resultado de la presencia de un virus, tal como rinovirus. El virus conduce normalmente a un empeoramiento de los síntomas asociados con la enfermedad respiratoria, una respuesta reducida a la terapia, y, en algunos casos, la hospitalización. El virus infecta normalmente el tejido pulmonar, incluyendo o especialmente el epitelio bronquial. Generalmente, el virus da como resultado la liberación de mediadores inflamatorios y un aumento en la sensibilidad bronquial. Según se ha indicado anteriormente en el presente documento, se reconoce rinovirus como un patógeno común estimulador del agravamiento del asma. Similarmente, rinovirus puede promover el agravamiento indeseable de otras enfermedades respiratorias. De esta manera, las enfermedades respiratorias de interés en relación con la presente invención incluyen también dolencias que pueden ser COPD marcada.

Terapia

La administración de IFN-\beta; o un polinucleótido según se describe anteriormente, puede ser tanto con objetivo profiláctico como terapéutico. Cuando se proporcionan profilácticamente, el IFN-\beta, o el polinucleótido, se proporciona por adelantado de cualquier exacerbación. La administración profiláctica del IFN-\beta, o del polinucleótido, sirve para evitar o atenuar cualquier exacerbación posterior.

Cuando se proporciona terapéuticamente, el IFN-\beta, o el polinucleótido, se proporciona al comienzo (o poco después) de un síntoma del agravamiento. La administración terapéutica del IFN-\beta, o del polinucleótido, sirve para atenuar cualquier exacerbación real. El individuo tratado puede ser cualquier animal, pero preferiblemente el individuo tratado será un ser humano, lo más preferible un ser humano asmático.

El IFN-\beta, o el polinucleótido, se pueden administrar en un medicamento o en una composición farmacéutica adecuada para la administración en las vías aéreas que incluirá también normalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho "excipiente" se refiere generalmente a un material sustancialmente inerte que es no tóxico y no interactúa con otros componentes de la composición de una manera perjudicial.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, líquidos tales como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol y etanol.

Se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables en los anteriores, por ejemplo, sales minerales ácidas tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares.

Se prefiere también, aunque no se requiere, que una composición o medicamento que comprende el agente terapéutico contenga un vehículo farmacéuticamente aceptable que sirva como estabilizante, particularmente de péptidos, proteínas, polinucleótidos u otros agentes similares. Los ejemplos de vehículos adecuados que pueden actuar también como estabilizantes de péptidos incluyen, sin limitación, calidades farmacéuticas de dextrosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, manitol, sorbitol, inositol, dextrano, y similares. Otros vehículos adecuados incluyen, de nuevo sin limitación, almidón, celulosa, fosfatos de sodio o calcio, ácido cítrico, ácido tartárico, glicina, polietilenglicoles de elevado peso molecular (PEG), y sus combinaciones. Puede ser útil también emplear un lípido y/o detergente cargado. Los lípidos cargados adecuados incluyen, sin limitación, fosfatidilcolinas (lecitina), y similares. Los detergentes serán normalmente un tensioactivo no iónico, aniónico, catiónico o anfótero. Los ejemplos de tensioactivos adecuados incluyen, por ejemplo, los tensioactivos Tergitol® y Triton® (Union Carbide Chemicals and Plastic, Danbury, CT), polioxietilensorbitanes, por ejemplo, tensioactivos TWEENS (Atlas Chemical Industries, Wilmington, DE), éteres de polioxietileno, por ejemplo Brij, ésteres de ácidos grasos farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, lauril sulfato y sus sales (SDS), y materiales similares. Está disponible en Remingtons Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J. 1991) una descripción vigorosa de los excipientes, vehículos estabilizantes y otras sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables.

Se puede formular una composición adecuada para la administración de IFN-\beta en las vías aéreas, por ejemplo, según se describe en la Patente de los Estados Unidos nº 6.030.609, disolviendo IFN-\beta liofilizado en un vehículo farmacéuticamente tal como agua destilada estéril o solución salina fisiológica estéril, opcionalmente con adición de uno o más vehículos, estabilizantes, tensioactivos u otros agentes con el fin de potenciar la efectividad del agente IFN-\beta activo.

Se puede administrar convenientemente una composición que comprende una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva del IFN-\beta, o un polinucleótido descrito en el presente documento a las vías aéreas pulmonares por medio de un nebulizador en aerosol. Se puede determinar una cantidad efectiva apropiada mediante ensayo clínico apropiado y variará con, por ejemplo, la actividad del IFN-\beta administrado o inducido. Se puede administrar el IFN-\beta, o el polinucleótido, por ejemplo, en cantidades de microgramos. Se administran al sujeto que se va a tratar de una manera compatible con la formulación de la dosificación, y en una cantidad que será efectiva para obtener el efecto deseado. La cantidad que se va a administrar puede ser de 1 \mug a 5 \mug, por ejemplo, de 1 a 50 \mug, dependiendo del sujeto que se va a tratar. La cantidad exacta necesaria variará dependiendo de la edad y la condición general del individuo que se está tratando y del agente seleccionado, así como de otros factores. Por ejemplo, se pueden administrar 250 \mug de IFN-\beta cada día alternado o se pueden administrar 30 \mug de IFN-\beta semanalmente (Cook, J Neurol, 2003; 250 Suppl 4: 15-20; Durelli, J Neurol 2003; 250 Suppl 4: 9-14).

Se puede administrar el IFN-\beta, o el polinucleótido por sí mismo o en combinación con otro compuesto terapéutico, en particular, se puede administrar el IFN-\beta o el polinucleótido en conjunción con un compuesto terapéutico usado para tratar la enfermedad respiratoria en el individuo. Se puede formular el IFN-\beta, o el polinucleótido, y el compuesto terapéutico adicional en la misma o en diferentes composiciones. En una realización, el IFN-\beta, o el polinucleótido se administra a un individuo con asma en combinación con un corticoesteroide inhalado. Se puede administrar el IFN-\beta, o el polinucleótido simultánea, secuencial o separadamente con un corticoesteroide inhalado, por ejemplo, fluticasona, beclometasona y budesonida.

Se puede proporcionar el IFN-\beta, o el polinucleótido, y un corticoesteroide inhalado, en forma de una composición farmacéutica única adecuada para la administración en aerosol a las vías aéreas.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar la invención con respecto al tratamiento de los agravamientos de asma y COPD inducidas por rinovirus.

Ejemplos Ejemplo 1 Estudio de células epiteliales bronquiales de pacientes de asma Materiales y procedimientos Sujetos

Todos los sujetos eran no fumadores, sin exacerbación de su enfermedad de pulmón o historial de infección del tracto respiratorio en las 4 semanas anteriores. Las pruebas de alergia de la piel usando un panel de aeroalérgenos comunes incluyendo extracto de ácaros del polvo doméstico, polen de césped, polen de árbol, caspa de gato, caspa de perro, Candidia, Aspergillus, así como controles negativos (solución salina) y controles positivos (histamina). Se consideraron positivos los ensayos si hubo una respuesta tipo roncha de 3 mm o mayor de la del control negativo. Se evaluó la función pulmonar mediante espirometría, midiendo el volumen espiratorio forzado en 1 segundo (FEV_{1}) y la capacidad vital forzada (FVC). A continuación se evaluó la hipersensibilidad bronquial mediante el estímulo de la histamina, definido por una PC_{20} de la histamina menor de 8 mg/ml. Los sujetos con asma se subdividieron sobre una base de gravedad clínica según las directrices GINA (National, H., Lung and Blood Institute. Global strategy for asthma management and prevention 96-3659a, Bethseda, 1995).

Se diagnosticó el asma sobre un historial consistente con evidencia de hipersensibilidad bronquial, definida por una PC_{20} de la histamina menor de 8 mg/ml. Los sujetos asmáticos se clasificaron como leves, con síntomas estables que requerían tratamiento únicamente con salbutamol según necesidad, menos de 3 veces por semana y con enfermedad moderada, con síntomas estables sobre beclometasona inhalada de menos de 1500 \mug por día. Los sujetos sanos no tenían historial anterior de enfermedad de pulmón, función pulmonar normal, sin evidencia de hipersensibilidad bronquial sobre estímulo de histamina y eran no atópicos. Se aprobó el estudio por los comités éticos relevantes. Todos los sujetos facilitaron su consentimiento informado escrito.

La Tabla 2 reseña las características de los sujetos usados en los estudios. El % de FEV_{1} predicho se refiere al volumen espiratorio forzado en 1 segundo expresado como porcentaje del valor predicho. ICS se refiere a corticoesteroides inhalados. La dosis se expresa en dosis de beclometasona (BDP) en \mug por día en la que 1 \mug de BDP = 1 \mug de budesonida o 0,5 \mug de Fluticasona.

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TABLA 2 Sujetos usados en los estudios

2

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Cultivo de tejidos

Se obtuvieron células epiteliales mediante broncoscopia mediante fibra óptica según las directrices normalizadas publicadas, se medicaron previamente todos los sujetos con salbutamol (Hurd, J Allergy Clin Immunol, 1991; 88: 808-814) y se llevó a cabo el cultivo celular según se ha descrito anteriormente (Bucchieri, y col., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2001; 27: 179-185). En resumen, se obtuvieron células usando un hisopo de citología recubierto de nylon tomando 5-10 exudados bronquiales procedentes de los bronquios de la segunda a la tercera generación con visión directa. Se establecieron cultivos primarios sembrando células epiteliales bronquiales de exudados recientes en placas d cultivo. Se cultivaron las células a 37ºC y dióxido de carbono al 5% en medio de crecimiento epitelial bronquial suplementado hormonalmente (BEGM; Clonetics, San Diego, EE.UU.) que contenía 50 U/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina. Se cultivaron las células y se pasaron en matraces de cultivo de tejidos usando tripsina. En el paso 2 se sembraron las células en bandejas de 12 pocillos y se cultivaron hasta una confluencia del 80% (Bucchieri, y col., Am J Respir Cell Mol Biol, 2001; 27: 179-185). Se comprobó la pureza de las células epiteliales mediante recuentos celulares diferenciales en citoespinas de las células cosechadas.

Se trataron también las células solas o tras la infección con el grupo RV-16 principal. Tras la infección se trataron también las células con el inhibidor ZVD-fmk de la caspasa 3 a 120 \muM (Calbiochem, La Jolla, CA, EE.UU.) e IFN\beta humano a 100 UI (Sigma Chemical St Louis MO, EE.UU.).

Preparación e infección con RV

Los inventores generaron cultivos madre de RV-16 infectando cultivos de células HeLa Ohio según se ha descrito anteriormente (Papi y Johnston, J Biol Chem, 1999; 274: 9707-9720); se cosecharon las células y los sobrenadantes, se rompieron las células mediante congelación y descongelación, se aglomeraron los residuos celulares mediante centrifugación a baja velocidad y se congeló el sobrenadante clarificado a - 70ºC.

Se llevó a cabo la valoración de RV exponiendo monocapas confluentes de células HeLa en placas de 96 pocillo en diluciones en serie 10 veces de cultivo madre vírico y se cultivaron durante 5 días a 37ºC en CO_{2} al 5%. Se evaluó el efecto citopático y a continuación se determino una dosis infectiva del cultivo del tejido del 50% (DICT_{50}/ml) y la multiplicidad de infección (MOI) derivada (Papi y Johnston, J Biol Chem, 1999; 274: 9707-9720). Como control negativo para todos los experimentos, se inactivó RV-16 mediante exposición a irradiación UV a 1200 \mul/cm^{2} de luz UV durante 30 minutos. Se confirmó la inactivación repitiendo las valoraciones víricas en células HeLa.

Se aplicó la concentración deseada de RV-16 a las células que se agitaron suavemente a 150 rpm a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se retiró el medio y se lavaron las células dos veces con 1 ml de Solución Salina Equilibrada de Hanks. A continuación se aplicó el medio reciente y se cultivaron las células a 37,5ºC y CO_{2} al 5% durante el tiempo deseado. Se trataron las células como controles negativos solo con medio y RV-16 inactivado con UV.

Se evaluó la confirmación de la infección de células epiteliales y la cuantificación de la producción vírica mediante el ensayo de valoración de HeLa (Papi y Johnston, J Biol Chem, 1999; 274: 9707-9720) y la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (PCRc), según se describe a continuación.

Análisis de la viabilidad celular

Se evaluaron la viabilidad y la apoptosis mediante citometría de flujo según se ha descrito anteriormente (Puddicombe y col., Am J Respir Cell Mol Biol, 2003; 28: 61-68). De manera breve, 8 h después de la infección por RV, se eliminaron las células adherentes con tripsina y se añadieron a células no adherentes. Se tiñeron las células con Annexin-V conjugado con el flurocromo de la Ficoeritrina (FE) y el colorante vital 7-amino-actinomicina (7-AAD). Se analizaron los datos citométricos de flujo usando WinMDI 2.8. Se detectaron las formas activas de la caspasa 3/7 usando el Ensayo Apo-One Homogéneo de la Caspasa 3/7 (Promega, Maddison, EE.UU). Se plaquearon las células por cuadruplicado para cada condición. Se tiñeron dos pocillos con azul de metileno y se estimó la biomasa celular. Se lisaron otros dos pocillos con tampón de lisis y se leyeron en un lector de placas fluorescentes con una longitud de onda de excitación de 485 nm y emisión de 350. A continuación se corrigió la actividad de la caspasa de la biomasa celular. Se midió la lisis celular determinando la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante celular que se había retirado y almacenado a temperatura ambiente durante no más de 48 horas. Se midió la actividad de la LDH a 37ºC mediante un procedimiento de velocidad enzimática, usando piruvato como sustrato (Sigma, St Louis
EE.UU.).

PCR cuantitativa con transcripción inversa

Se llevó a cabo el análisis de la expresión génica de IL-8, TNF\alpha, ICAM-1, IFN\beta y RV usando ARN extraído de las BEC usando el reactivo TRIzol (Life Technologies, Paisley, Reino Unido); se eliminó el ADN contaminante mediante digestión con desoxirribonucleasa en RNeasy Mini Kits (Qiagen, Crawley, West Sussex, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. Se transcribió de manera inversa el ARN total (1 \mug) usando hexámeros aleatorios de cebadores de oligonucleótidos (dT)_{15} y la transcriptasa del virus de la mieloblastosis aviar a partir del Sistema de Transcripción Inversa (Promega, Southampton, Reino Unido), siguiendo el protocolo del fabricante. Se marcaron sondas fluorogénicas con el colorante indicador 6-carboxi-fluoresceína en 5' (FAM) y con el colorante secuestrante 6-carboxi-N,N,N',N'-tetrametilrodamina en 3' (TAMRA).

Se obtuvieron los cebadores génicos de expresión constitutiva y la sonda del ARN ribosómico de 18S de Eurogentech (Eurogentech, Southampton, Reino Unido). Se incluyeron también controles sin plantilla y muestras negativas de transcripción inversa como controles. El protocolo icycler de la PCR fue como sigue: 95ºC durante 8 min; seguido por 42 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 15 segundos seguido por hibridación a 60ºC durante 1 min y extensión a 72ºC durante 15 segundos. Se continuó con la cuantificación y la detección en tiempo real de la PCR en el sistema icycler de detección de secuencias, y tras la finalización de la PCR, se ajustaron los umbrales de los valores iniciales de emisión de fluorescencia de manera precisa por encima de los niveles de fondo en la FAM y en las capas VIC
(\sim 15 a 20 ciclos).

Se calcularon las curvas estándar a partir de la delta CT y se construyeron para los genes diana y el control endógeno del ARNr de 18S, y se calcularon las cantidades de diana y de control endógeno. Se normalizaron los datos usando la relación de la cantidad del gen diana respecto al control endógeno. Se hicieron las comparaciones después de 8 horas de infección, ya que este fue el tiempo de inducción máxima del ARNm para IL-8.

La cuantificación de RV-16 difirió de la anterior. Los cebadores usados para detectar RV fueron 0,05 \muM de Oligo Directo de Picornavirus (5'-GTG AAG AGC CCGC AGTG TGC T-3') y 0,30 \muM de Oligo Inverso de Picornavirus (5'-GCT CGCA GGG TTA AGG TTA GCC-3'). Se construyó una curva estándar para cuantificar RV usando el amplicón OL-26 - OL-27 (producto de los cebadores OL-26 y OL-27 clonados en la PCR 2.1 TOPO (Invitrogen). Se hizo crecer el plásmido en la cepa XL-1azul de E. coli (Stratagene), purificada mediante un procedimiento maxiprep usando reactivos comercialmente disponibles (Qiagen), resuspendidos en tampón Tris EDTA pH 8,0 a 1 \mug/\mul y se almacenaron a -80ºC.

Expresión de ICAM-1

Se midió la expresión de ICAM-1 sobre las células en los valores iniciales, inmediatamente después de la infección y hasta 24 h después de la infección por RV mediante citometría de flujo según se describe anteriormente usando un anticuerpo monoclonal para ICAM-1 (CD54 de eBioscience dirigido contra ser humano) y un FITC marcado secundariamente (Dako, Dinamarca).

Medida de los mediadores inflamatorios mediante ELISA

Se midió la liberación de interleucina (IL)-8 y el Factor alfa de necrosis Tumoral (TNF-\alpha) (R&D systems, Abingdon, Reino Unido) y de interferón-beta (IFN-\beta) (Biosource Nivelles Bélgica) en los sobrenadantes de los cultivos usando ensayos inmunosorbentes unidos a enzima (ELISA) según las instrucciones del fabricante.

Análisis estadístico

Se analizaron los datos usando la versión 10.1 de SPSS (SPSS Inc). Como el tamaño de la muestra era pequeño y las variables no se distribuían normalmente, se han analizado las diferencias entre los grupos usando pruebas no paramétricas; se analizaron las diferencias entre dos variables dependientes usando la prueba de los rangos con signo, las variables independientes de la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon y comparaciones múltiples de la prueba de Kruskal Wallis. Se consideró significativo un valor p de < 0,05.

Resultados

Para comparar las respuestas de las células epiteliales bronquiales normales y asmáticas (BEC), se hicieron crecer cultivos primarios procedentes de los exudados obtenidos mediante broncoscopia mediante fibra óptica a partir de voluntarios clínicamente caracterizados. Se optimizaron la dosis y los curos de tiempo para la infección de las BEC midiendo inicialmente la liberación de IL-8 en los sobrenadantes de los cultivos obtenidos de células infectadas. A partir de estos experimentos, se seleccionó una dosis de RV-16 con una MOI estimada de 2 para el estudio detallado (no se muestran los datos).

Respuesta inflamatoria de las BEC normales y asmáticas a la infección por RV-16

Para investigar las diferencias entre las células epiteliales bronquiales normales y asmáticas, se reclutaron 14 sujetos con asma y 10 controles sanos normales (véase la Tabla 2) para experimentar la broncoscopia mediante fibra óptica. Los dos grupos de sujetos eran similares en términos de edad y sexo. Todos los asmáticos tenían síntomas persistentes leves-moderados y usaban corticoesteroides inhalados regularmente. Se compararon las respuestas de los cultivos BEC primarios a la infección por RV-16 midiendo en primer lugar la inducción de IL-8 y la expresión del ARNm de TNF\alpha y la liberación de la proteína (Figura 1a, c). Las BEC de los controles tanto sanos como asmáticos mostró una inducción significativa de IL-8 y del ARNm de TNF\alpha 8 h después de la infección por RV y hubo un significativo aumento en la liberación de IL-8 y de la proteína TNF\alpha 48 h después de la infección (Figura 1b, d), no hubo diferencias significativas entre los dos grupos. RV inactivado con UV no estimula una respuesta proinflamatoria.

Ya que las células se trataron con un grupo RV principal, se esperaba que la susceptibilidad a la infección fuera dependiente en la expresión de ICAM-1, el receptor del grupo RV principal. Para determinar si esta difería entre las células asmáticas y normales, se evaluaron los niveles de ICAM mediante citometría de flujo. Antes de la infección, la expresión de ICAM-1 no fue significativamente diferente en cualquier grupo (Figura 1e). En las 24 h que siguieron a la infección, la expresión fue similar en ambos grupos (Figura 1f).

Infección, rendimientos víricos y lisis celular, de las células epiteliales bronquiales primarias

Tras la infección por RV-16 de los cultivos de BEC, se determinó la recuperación de RV viables mediante la transmisión de la infección y el efecto citopático (CPE) en células HeLa Ohio procedentes del sobrenadante infectado de las BEC. No se observó CPE usando los sobrenadantes obtenidos hasta 8 h después de la infección sino después del rendimiento del virión que sigue a la infección de los cultivos primarios, pero a partir de entonces, aumentó de manera continua hasta las 48 h. En contraste a las respuestas proinflamatorias, las BEC asmáticas tuvieron un aumento significativamente mayor en el RV-16 detectado en las 24 h y las 48 h según se midió mediante la DICT_{50} (Figura 2a). Hubo también un mayor rendimiento del ARNm de RV-16 8 h después de la infección en asma en comparación con los controles sanos (Figura 2b). Esto sugiere que los niveles equivalentes dados de expresión de ICAM-1 de factores diferentes a la susceptibilidad inmediata a la infección tuvieron influencia sobre el rendimiento vírico de las células infectadas.

En paralelo con la liberación del virus, hubo un progresivo aumento en la lisis celular, según se midió por la actividad de la LDH, replicando el aumento en el rendimiento de RV; en 48 h, este fue significativamente mayor en las células asmáticas (Figura 2c). Aunque no hubo aumento significativos en la actividad de la LDH en las células tratadas únicamente con SFM en las 48 h, hubo un pequeño pero significativo aumento en las células tratadas con RV-16 inactivado con UV (no se muestran los datos), sin embargo, este fue pequeño en comparación con el observado en los cultivos de virus activos. Estos resultados apuntan a una relación entre el rendimiento vírico y la lisis celular y conducen a la investigación de si tempranos cambios en la viabilidad celular podrían predecir el rendimiento vírico.

Viabilidad de las BEC tras la infección por RV-16

Como la apoptosis es una defensa natural que protege a las células de la replicación vírica, los inventores caracterizaron la naturaleza de la muerte celular en respuesta a RV-16 usando Annexin-V (AxV) y la tinción nuclear, 7-aminoactinomicina D (7AAD), para discriminar la fosfatidil serina que se ha externalizado de la capa externa de las células apoptóticas. El análisis mediante citometría de flujo desveló que hubo una significativa reducción en el número de células viables (es decir, AxV^{-}/7AAD-) 8 h después de la infección por RV-16 de las BEC normales. No se observó esto en las células tratadas solo con medio o RV-16 inactivado con UV sugiriendo una relación directa entre la infección y la muerte celular (Figura 3a). En contraste, la infección de las BEC asmáticas con RV-16 tuvo un efecto más pequeño sobre la viabilidad a las 8 h (Figura 3ª). Comparando las células AxV+/7AAD- (es decir, las células apoptóticas) y las células AxV+/7AAD+ (es decir, las células necróticas), se encontró que la diferencia en la viabilidad global entre las BEC normales y las asmáticas era debida a un significativo aumento en la apoptosis en los cultivos normales (Figura 3b). Se confirmó la inducción de la apoptosis en células infectadas demostrando la permeabilidad alterada de la membrana mitocondrial usando el sensor de Membrana Mitocondrial ApoAlert (Clontech, Palo Alto Ca, EE.UU.) (no se muestran los datos) y midiendo la activación de la caspasa 3/7 activa. En el último caso, hubo una caspasa significativamente menos activa en las BEC asmáticas infectadas con RV-16 que en las BEC normales (Figura 4a).

Efectos de inhibición de la apoptosis y producción de RV-16

Ya que el aumento en la producción de viriones por las BEC asmáticas estaba asociado con su capacidad para sortear la apoptosis, los inventores investigaron si la supresión de la apoptosis en BEC normales infectadas con RV-16 era suficiente para facilitar la producción de viriones. De esta manera, se trataron las BEC con el inhibidor de la caspasa 3 (C3I), ZVD-fmk, antes y después de la infección con RV-16. El inhibidor condujo a una marcada reducción en la apoptosis en las células control sanas pero tuvo un mínimo efecto en las células asmáticas en comparación solo con la infección (Figura 4b). El tratamiento de las células de los controles sanos con C3I tuvo también un impacto directo sobre la producción de RV-16, con un significativo aumento en la infección transmisible a las 48 h, no se observó un aumento similar en las células asmáticas tratadas con C3I (Figura 4c). Estos datos proporcionan una relación directa entre la inhibición de la apoptosis temprana y el aumento del rendimiento vírico.

Evaluación de la respuesta antivírica innata de las células epiteliales asmáticas

Para investigar el mecanismo subyacente relacionado con la respuesta antivírica anormal por las BEC asmáticas, los inventores analizaron la expresión del interferón de tipo I (IFN), IFN-\beta, que se ha implicado como regulador clave de la apoptosis en respuesta a la infección vírica (Samuel, Clin Microbiol Rev, 2001; 14: 778-809; Takaoka y col., Nature, 2003; 424: 516-523). Como se observó con las citocinas proinflamatorias, hubo un significativo aumento en la expresión del ARNm de IFN-\beta por las BEC normales 8 h después de la infección por RV-16, sin embargo, no se observó un aumento similar en las células asmáticas (Figura 5a); hubo también menor producción de IFN-\beta por las células asmáticas 48 h después de la infección por RV-16 (Figura 5b). Para confirmar que esta diferencia en la producción de IFN-\beta era funcionalmente relevante, los inventores ensayaron la capacidad de IFN-\beta exógeno de inducir la apoptosis en las BEC asmáticas infectadas con IFN-\beta. La Figura 5c muestra que el pretratamiento de las células con IFN-\beta (100 UI) con RV-16 produjo una duplicación en el número de células apoptóticas. IFN-\beta solo no tuvo significativo efecto sobre el índice apoptótico, pero produjo una marcada inducción de la apoptosis en respuesta a la exposición a poli(I):poli(C) sintético, indicando un requerimiento de otras señales que implica el reconocimiento del ARN de doble cadena para comprometer la apoptosis en respuesta a IFN-\beta. En línea con su capacidad para inducir la apoptosis de las BEC asmáticas infectadas víricamente, IFN-\beta produjo una significativa reducción en la producción de viriones de RV-16 (Figura 5d).

Estos resultados proporcionan en el primer momento una explicación de la tendencia de los sujetos asmáticos de tener persistentes problemas en el tracto respiratorio inferior como consecuencia de la infección por RV. De esta manera, con respecto al estado asmático, la diseminación de RV desde el tracto respiratorio superior al inferior puede dar como resultado la infección de las células epiteliales bronquiales y la inducción de una respuesta inflamatoria aguda. Aunque la infección adicional está limitada en sujetos no asmáticos por una respuesta antivírica innata y por la inducción de la apoptosis en las células infectadas, una deficiencia de IFN-\beta en el asma facilita la replicación de viriones y la citolisis con resultados adversos. Estos incluyen un aumento en el riesgo de infección de las células vecinas y una exagerada respuesta inflamatoria a los efectos citolíticos del virus. Crucialmente, se puede restaurar este defecto in vitro mediante el suministro de IFN-\beta exógeno, que puede proporcionar un freno sobre la replicación vírica y minimizar el ciclo autoperpetuante de la infección y la inflamación. Puede esperarse que IFN-\beta, o los agentes que inducen IFN-\beta, tengan utilidad terapéutica durante una exacerbación de asma inducida víricamente.

Ejemplo 2 Estudio de células epiteliales bronquiales procedentes de pacientes con COPD

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica es otro ejemplo de una enfermedad de las vías aéreas en la que el virus del resfriado común produce agravamientos (Seemungal TA, Harper-Owen R, Bhowmik A, Jeffries DJ, Wedzicha JA.Detection of rhinovirus in induced sputum at exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. (2000) 16, 677-83) requiriendo los afectados frecuentemente, hospitalización (MacNee W. Acute exacerbations of COPD. Swiss Med Wkly. (2003) 3 de Mayo; 133 (17-18):247-57). Basándose en el hallazgo de que las células epiteliales bronquiales procedentes de sujetos asmáticos tienen una respuesta defectiva al interferón de Tipo I, se postuló que una deficiencia similar en la COPD explicaría la gravedad de los síntomas del tracto respiratorio inferior en este grupo de pacientes. Para investigar esta posibilidad, se ensayaron muestras de archivo de células epiteliales bronquiales cultivadas para su respuesta a la infección por RV-16. Se hicieron crecer estas células a partir de exudados bronquiales cosechadas de dos sujetos con COPD (un varón y una mujer, edades 61 y 57) y un control con correspondencia de edad sin COPD (varón edad 64). Se cultivaron los exudados según se describe para los estudios de asma, excepto que en el paso 0, se crioconservaron las células a -170 y -180ºC en medio BEGM que contenía DMSO al 10% como agente crioconservador. La crioconservación se usa de manera rutinaria durante el almacenamiento a largo plazo de cultivos celulares.

Cuando se requieren para la experimentación, los cultivos celulares congelados se descongelan rápidamente en 1 ml d BEGM precalentado y a continuación se resiembran en matraces de cultivo que contienen medio reciente para permitir la expansión al paso 2, como, para los cultivos d células epiteliales bronquiales de los sujetos normales y asmáticos descritos en el ejemplo 1. En el paso 2, se sembraron las células en bandejas de 12 pocillos y se cultivaron hasta una confluencia del 80%. A continuación se expusieron a RV-16 usando los mismos protocolos descritos anteriormente.

Para comparar la respuesta inmune innata de los cultivos de BEC primarios de un paciente con COPD y uno sin COPD, se midió la inducción del ARNm de IFN-\beta en respuesta a la infección con RV-16 (2 moi). Según se muestra en la Figura 6, las BEC del paciente sin COPD mostraron una inducción de 25 veces del ARNm de IFN\beta 8 h después de la infección por RV-16 mientras que la respuesta de las BEC con COPD fue inferior de un tercio de esto. Consistente con esta mala respuesta inmune innata, la producción de viriones a las 24 horas fue un orden de magnitud mayor en las células procedentes del sujeto con COPD (Figura 7).

Se ensayó a continuación si el IFN-\beta exógeno podría proteger las BEC de un paciente con COPD frente a la replicación vírica. Según se muestra en las Figuras 8 y 9, las células de un segundo paciente con COPD mostraron también una mala inducción de IFN-\beta en respuesta a la infección por RV-16. Sin embargo, fueron capaces de responder al IFN-\beta exógeno con una vigorosa inducción del ARNm de IFN-\beta. Esto estuvo acompañado por una marcada supresión de la replicación de RV-16, con una reducción de cien veces en la DICT_{50} que fue inferior de la observada en las células procedentes del voluntario sin COPD.

Estos resultados sugieren que, según se encuentra en los estudios anteriormente descritos de las BEC procedentes de sujetos asmáticos, las BEC procedentes de pacientes con COPD tienen también una mala respuesta inmune. Esto podría ayudar a explicar porqué estos pacientes tienen persistentes problemas en el tracto respiratorio inferior como consecuencia de la infección por RV. Basándose en el hecho de que IFN-\beta puede inducir su propia expresión y suprimir la replicación de RV-16, se puede esperar que IFN-\beta, o los agentes que inducen IFN-\beta, tengan utilidad terapéutica durante el agravamiento de la COPD inducida víricamente, así como en el asma.

<110> UNIVERSIDAD DE SOUTHAMPTON

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<120> TERAPIA ANTIVÍRICA PARA ENFERMEDADES RESPIRATORIAS

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<130> JCI.P53241WO

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<160> 4

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 757

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (64) .. (564)

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<400> 1

3

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<210> 2

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 720

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> fuente

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<223> Interferón beta-1b

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<220>

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<221> CDS

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<222> (64) .. (569)

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<400> 3

5

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<210> 4

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> fuente

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<223> Interferón beta-1b

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<400> 4

7

Claims (10)

1. Un agente seleccionado entre

(a) interferón-\beta (IFN-\beta); o

(b) un polinucleótido que es capaz de expresar IFN-\beta

para su uso en el tratamiento de la exacerbación de una enfermedad respiratoria inducida por rinovirus seleccionada entre asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), en el que dicho tratamiento es mediante administración en las vías aéreas de dicho medicamento.

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2. Un agente para su uso según la reivindicación 1 en el que dicha enfermedad respiratoria es asma.

3. Un agente para su uso según la reivindicación 1 en el que dicha enfermedad respiratoria es COPD.

4. El agente para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es IFN-\beta.

5. El agente para su uso de la reivindicación 4 que comprende la secuencia de:

(a) IFN\beta-1a humano (SEC DE ID nº 2) o

(b) IFN\beta-1b humano (SEC DE ID nº 4).

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6. Un producto combinado que proporciona un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 y 5 y un corticoesteroide inhalado para su uso en el tratamiento de la exacerbación de asma inducida por rinovirus, en el que dicho agente y dicho corticoesteroide se administran simultánea, separada o secuencialmente.

7. Uso de un agente según se define en la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de la exacerbación de una enfermedad respiratoria inducida por rinovirus seleccionada entre asma y COPD, en el que dicho tratamiento es mediante la administración en las vías aéreas de dicho medicamento.

8. Uso según la reivindicación 7 en el que dicha enfermedad respiratoria es asma.

9. Uso según la reivindicación 7 en el que dicha enfermedad respiratoria es COPD.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en el que dicho agente es IFN-\beta.