ES2342707A1

ES2342707A1 - Proteina morfogenetica de hueso-2 (bmp-2) con un dominio de union especifico a colageno tipo i, procedimiento de obtencion y aplicaciones.

Info

Publication number: ES2342707A1
Application number: ES200900050A
Authority: ES
Inventors: Pilar Maria Arrabal Garcia; Rick Visser; Manuel Cifuentes Rueda; Jose Becerra Ratia
Original assignee: Universidad de Malaga; Centro de Investigacion Biomedica en Red en Bioingenieria Biomateriales y Nanomedicina CIBERBBN; Fundacion Progreso y Salud
Current assignee: Universidad de Malaga; Centro de Investigacion Biomedica en Red en Bioingenieria Biomateriales y Nanomedicina CIBERBBN; Fundacion Progreso y Salud
Priority date: 2008-12-31
Filing date: 2008-12-31
Publication date: 2010-07-12
Anticipated expiration: 2028-12-31
Also published as: ES2342707B1

Abstract

Proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I, procedimiento de obtención y aplicaciones. La presente invención comprende la producción y aplicación de una proteína de fusión que consiste en una rhBMP-2 modificada para unirse específicamente a colágeno con un dominio de unión a colágeno derivado del factor de von Willebrand. La proteína de fusión resultante (rhBMP-2 - CBD) presenta mayor afinidad por el colágeno, siendo esa unión muy estable en el tiempo, y reteniendo la actividad osteoinductiva, siendo capaz se inducir la formación de hueso nuevo incluso a concentraciones por debajo de las conocidas para la rhBMP-2 nativa. Además, en combinación con un transportador colagénico libre de ningún otro factor de crecimiento, como una esponja absorbible de colágeno, bajas concentraciones de rhBMP-2 - CBD son capaces de inducir la formación de hueso nuevo cuando es implantada in vivo.

Description

Proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I, procedimiento de obtención y aplicaciones.

Sector de la técnica

La presente invención se enmarca dentro de áreas de conocimiento tales como la biología, la biotecnología, la ciencia de materiales, la farmacología, la medicina, la ingeniería o la nanotecnología entre otras. Sus aplicaciones van destinadas fundamentalmente a los sectores de la salud y la biomedicina, pudiéndose emplear en la mejora de tratamientos y terapias en medicina regenerativa de tejidos óseos.

Estado de la técnica

Las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) son una familia de factores de crecimientos implicados en gran variedad de funciones durante el desarrollo y en la regeneración tisular [1]. Además del papel tan importante que ejercen en procesos no relacionados con el desarrollo óseo, las BMPs ejercen funciones únicas durante el desarrollo y regeneración del sistema esquelético [2], presentando algunas de ellas la capacidad exclusiva de inducir la formación de hueso ectópico cuando son implantadas en vertebrados adultos [3,4].

La reparación de defectos óseos y fracturas es uno de los mayores problemas clínicos y económicos en la sociedad actual, realizándose anualmente más de 3 millones de injertos óseos. A pesar de las buenas propiedades de los autoinjertos [5], la alta morbilidad asociada a esta; aproximación y la cantidad limitada de material que se puede obtener de cada donante, han propiciado el desarrollo de nuevos productos para la reparación del tejido óseo dañado o perdido [6-10].

Las BMPs recombinantes deben ser utilizadas en combinación con un material transportador para favorecer su retención en el lugar del implante [11,12], lo que además permite que la liberación de la proteína al medio extracelular sea más lenta. Dos de los transportadores más utilizados en la actualidad son la matriz ósea desmineralizada (DBM) y el colágeno. La DBM presenta buenas propiedades para la retención y liberación de las BMPs [13]. De hecho, la DBM, por sí sola, tiene la capacidad de inducir la formación de hueso ectópico debido a la gran cantidad y variedad de factores de crecimiento que retiene tras la desmineralización [14, 15, 16], los efectos biológicos observados no pueden ser atribuidos únicamente a la proteína de fusión; además, otros estudio sugieren que la DBM contiene proteínas que pueden bloquear parcialmente la actividad de las BMPs [17]. Por otro lado, los efectos locales de los implantes de DBM son impredecibles, pudiendo incluso ser rechazados tras un periodo de tiempo, como ocurre frecuentemente con los aloinjertos cuando se usan en las cirugías óseas.

Por el contrario, el colágeno es considerado en la actualidad como uno de los mejores materiales osteoconductores, dada su versatilidad, alta biocompatibilidad y baja inmunogenicidad. El primer producto aprobado por la FDA compuesto por una BMP recombinante humana (rhBMP) para el tratamiento de fusiones espinales y fracturas tibiales abiertas, consiste en una combinación de esponja absorbible de colágeno (ACS), como matriz transportadora, y rhBMP-2 (INFUSE®, Medtronic, Minneapolis, MN, USA) o OP-1. Dado que la rhBMP-2 presenta baja afinidad natural por el colágeno, esta aproximación requiere el uso de altas dosis (miligramos) de BMPs [18, 19], lo cual no sólo puede tener efectos adversos colaterales, sino que eleva muchísimo el coste de estos tratamientos [20, 21].

Gracias a la tecnología de ADN recombinante, se han modificado muchas proteínas de interés terapéutico, con el fin de favorecer su unión a diversos biomateriales [22-24] y reducir la pérdida de moléculas efectivas, ya sea por difusión o por degradación enzimática, manteniéndolas en el lugar de aplicación a la concentración farmacológica adecuada. Una de estas modificaciones consiste en la producción de una proteína de fusión constituida por el factor de crecimiento de interés y un dominio de unión a colágeno procedente del factor de von Willebrand (vWF). Se ha demostrado que esta aproximación aumenta de manera efectiva la capacidad de unión de algunas proteínas a colágeno [25-29].

A pesar de que la producción de una rhBMP-2 modificada para favorecer su unión a colágeno ya ha sido abordada por otros autores [34, 35], todas esas proteínas han sido producidas con dominios adicionales para su purificación, y sus propiedades osteoinductoras sólo han sido demostradas en combinación con DBM. En particular, y en relación a secuencias adicionales que faciliten la purificación de proteínas, dichos dominios pueden inducir el desplegamiento de las proteínas a los que son añadidos, la pérdida de actividad de la proteína, y imposibilitar el uso de requerimientos para su aplicación terapéutica [37]. En particular, un dominio de histidinas (His-tag) puede alterar las características de unión de las proteínas recombinantes que lo incorporan [38, 39].

Descripción detallada de la invención

La BMP-2 es uno de los factores de crecimientos osteoinductores más potentes y además, ejerce múltiples funciones en otros muchos tejidos distintos al hueso. Por otro lado, el colágeno es la proteína más abundante de la matriz extracelular animal y es el único material osteoconductor que ha sido autorizado para su uso clínico, en combinación con BMP-2, para la reparación ósea. Dada su baja afinidad por el colágeno, la BMP-2 debe ser utilizada a concentraciones muy por encima de los niveles fisiológicos, lo cual puede tener efectos adversos colaterales, como la reabsorción por parte de osteoclastos [20] o dar lugar a una osificación poco homogénea, lo cual tiene como consecuencia la pérdida de fuerza mecánica [21]. Una aproximación efectiva para aumentar y limitar la concentración local de proteína al lugar del implante, es aumentar la capacidad específica de unión de la BMP-2 al colágeno. En este sentido, algunos factores de crecimiento han sido ya modificados con dominios adicionales a unión al colágeno derivados del factor de von Willebrand [26, 28, 29, 33, 34], de colagenasa [22, 35], o de fibronectina [23, 36].

La presente invención comprende la producción y aplicación de una proteína de fusión que consiste en una rhBMP-2 modificada para unirse específicamente a colágeno, con el fin de mejorar la reparación y formación de hueso. La proteína rhBMP-2 modificada comprendida en la presente invención ha sido modificada únicamente con un dominio de unión a colágeno, derivado del factor de von Willebrand. Para evitar errores en la formación de puentes disulfuro durante el proceso de replegamiento in vitro, la Cys-7 que se encuentra en la secuencia original del decapéptido ha sido reemplazada por una metionina [26]. No se han añadido secuencias de purificación con el fin de evitar cualquier posible alteración en el factor de crecimiento como los ya comentado en el estado de la técnica [37, 38, 39].

Los resultados obtenidos evidencian que la proteína de fusión rhBMP-2-CBD presenta mayor afinidad por el colágeno, y demuestran que esa unión es muy estable durante un largo periodo de tiempo y retiene la actividad osteoinductiva, siendo capaz se inducir la formación de hueso nuevo incluso a concentraciones por debajo de las conocidas para la rhBMP-2 nativa. Además, en combinación con un transportador colagénico libre de ningún otro factor de crecimiento, como una esponja absorbible de colágeno, material aprobado por la FDA para su uso clínico en la inducción de hueso ectópico, bajas concentraciones de rhBMP-2-CBD son capaces de inducir la formación de hueso nuevo cuando es implantada in vivo.

Por todo ello, la presente invención supone una alternativa mejor y más segura al uso de rhBMP-2 nativa en su aplicación en medicina regenerativa de tejido óseo. De este modo, la proteína de fusión objeto de la misma (rhBMP-2-CBD) sería una buena candidata para su uso clínico, dado que podría utilizarse a menor concentración ya que permanecería retenida en el lugar de aplicación de manera más eficiente, y no sólo induce la formación de más hueso sino que este hueso es más maduro, según la cantidad y tamaño de las trabéculas, cavidades medulares y vasos sanguíneos observados; además, permite la producción de hueso nuevo utilizando concentraciones de proteína por debajo de la menor concentración osteoinductiva (460 ng) establecida por Wang y col. [9]. Por último, la formación de hueso nuevo, con osteocitos embebidos en una matriz mineralizada compacta, muestra que la rhBMP-2-CBD mantiene la capacidad osteoinductora de la BMP-2 nativa cuando se combina con otros materiales osteoconductores distintos al colágeno, como es la hidroxiapatita (HA).

Descripción de los dibujos

Figura 1.- Representación esquemática de la proteína de fusión rhBMP-2-CBD. El dominio de unión a colágeno constituido por el decapéptido WREPSFMALS es añadido al extremo N terminal de una proteína BMP-2 madura. La cisterna original es sustituida por una metionina. Una glicina adicional actúa como nexo.

Figura 2.- Análisis de la producción, renaturalización y purificación de la proteína de fusión rhBMP-2-CBD: (A) SDS-PAGE con tinción azul de Coomassie. Línea 1, contenido proteína celular total de E. coli transformada con el vector pET17b-BMP-2-CBD, después de 4 h de inducción con 1 mM IPTG. Línea 2, proteínas insolubles y cuerpos de inclusión recuperados tras lavar en presencia de Tritón X-100. Línea 3, proteína rhBMP-2-CBD tras 72 h del replegamiento in vitro. Línea 4, fracción libre de cromatografía de heparín-sefarosa. Línea 5, dímeros de rhBMP-2-CBD purificados mediante cromatografía de heparín-sefarosa. (B) Western blot con un anticuerpo anti-BMP-2. Línea 1, rhBMP-2 producida por células CHO (R&D Systems). Línea 2, dímeros purificados de rhBMP-2-CBD no reducida. Línea 3, rhBMP-2-CBD reducida.

Figura 3.- Propiedades de unión a colágeno de la proteína rhBMP-2-CBD: discos de colágeno son incubado con diferentes concentraciones de rhBMP-2 o rhBMP-2-CBD. Las moléculas unidas son detectadas usando un anticuerpo anti-BMP-2 después de 2 h (A) ó 7 días (B) lavando con PBST. Análisis densitométrico. Los datos representados son media ± SD, usando una escala relativa (0-255) y n = 5; * p<0,001 frente a rhBMP-2.

Figura 4.- Actividad ALP inducida por rhBMP-2 y rhBMP-2-CBD en mioblastos de ratón C2C12. Las células son crecidas durante 72 h con 0, 50, 100, 200, 300, 500 ó 1000 ng/ml de cada factor de crecimiento. Los datos representados son media \pm SD y n = 5; * p<0,01.

Figura 5.- Formación de hueso ectópico in vivo: (A, B) esponjas de colágeno con 0,5 y 10 microgramos de rhBMP-2-CBD, respectivamente. (C, D) esponjas de colágeno con 0,5 y 10 microgramos de rhBMP-2, respectivamente. (E, F) implantes de HA con 10 microgramos rhBMP-2-CBD y 10 microgramos rhBMP-2, respectivamente. (G) implante de HA (control negativo). Asterisco: trabéculas de hueso maduro. Flechas: osteoblastos sintetizando nueva matriz osteoide. MC: células mesenquimáticas indeferenciadas. BM: médula ósea, v: vasos sanguíneos, m: músculo. HA: hidroxiapatita. Barra de escala = 100 \mum.

Figura 6.- Formación de hueso ectópico in vivo a concentraciones baja de proteína: (H) tinción de von Kossa de esponja de colágeno incubada con 400 ng de rhBMP-2-CBD, mostrando un nódulo mineralizado. (I) Petroleoquímica con anti-osteopontina y contratinción con hematoxilina del mismo implante, mostrando un núcleo de osteoblastos positivos embebidos en una abundante matriz osteoide. (J) A mayor aumento se pueden observar grupos de células expresando osteopontina (preosteoblastos), todavía indistinguibles morfológicamente respecto de las células indiferenciadas de alrededor. Flechas: preosteoblastos expresando osteopontina. Barra. de escala = 30 \mum en (H) e (I), 20 \mum en (J).

Modos de realización de la invención

A continuación se procede a detallar el modo de realización de la invención, que comprende la: obtención de la invención, su caracterización funcional, y la evaluación de su aplicabilidad.

Producción de la proteína de fusión rhBMP-2-CBD Células, proteínas recombinantes y anticuerpos

Las células de osteosarcoma humana U-2 OS (HTB-96) se obtienen de la ATCC (American Type Culture Collection). Las células mioblasto de ratón C2C12 (91031101) se obtienen de la ECACC (European Collection of Cell Cultures). La BMP-2 recombinante humana (rhBMP-2) producida por células CHO es suministrada por R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). El anticuerpo monoclonal anti-BMP-2 y el anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa (HRP) son suministrados por Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany). El anticuerpo monoclonal anti- osteopontina es obtenido del Banco de Hibridomas (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, IA, USA). El anticuerpo monoclonal anti-IgG de ratón biotinilado es suministrado por Abcam (Cambridge, MA, USA).

Construcción de los vectores de expresión para rhBMP-2 y rhBMP-2-CBD

Se realiza la extracción del ARN total a partir de las células de osteosarcoma humano U-2 OS, las cuales se sabe que secretan BMPs [30]. El ADNc que codifica para la secuencia de la hBMP-2 se obtiene mediante RT-PCR utilizando oligonucleótidos específicos:

1

El ADNc obtenido se clona en el vector de expresión pBIISK (+) (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Los clones seleccionados se utilizan para amplificar la secuencia que codifica para el: dominio maduro de la BMP-2 humana, a la cual se añade la secuencia del CBD en el extremo amino (Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe-Met-Ala-Leu-Ser) (figura 1). Para la rhBMP-2, el oligonucleónido sentido es 5'-TTCATATGCAAGCCAAACACAAACAGC-3'. Para la rhBMP-
2-CBD, es 5'-TTCATATGTGGCGCGAACCGAGCTTCATGGCTCTGAGCGGTGCAAGCCAAACACAAACAGC-3'. En ambos casos, el oligonucleótido antisentido es 5'-AGAATTCCTGTACTAGCGACACCCAC-3'. Ambos productos se clonan en el vector de expresión pET-17b (EMD Biosciences/Merck Chemicals, Darmstadt, Germany).

Expresión, replegamiento y purificación de rhBMP-2 y rhBMP-2-CBD

Las proteínas recombinantes rhBMP-2 y rhBMP-2-CBD se expresan en E. coli, se repliegan in vitro, y se purifican según el método previamente descrito [31, 32] con ligeras modificaciones. Brevemente, las construcciones obtenidas pET-17b-BMP-2 y pET-17b-BMP-2-CBD se utilizan para transformar células de la cepa de E. coli Rosetta^{TM} (DE3). Los cultivos se realizan a 37ºC y en agitación y la inducción de la expresión de proteína recombinante se realiza mediante la adición de 1 mM de IPTG. Tras 4 h de inducción, se recuperan las células mediante centrifugación y se aíslan los cuerpos de inclusión mediante homogenización, centrifugación y varios lavados en presencia de Tritón X-100. Los cuerpos de inclusión obtenidos se solubilizan con 6 M de guanidinio hidrocloruro (Gnd-HCl), y las proteínas rhBMP-2 y rhBMP-2-CBD se repliegan durante 72 h a 10ºC en presencia de Gnd-HCl, ácido 2-(cyclohexylamino)ethanosulfonico (CHES) y glutation reducido:oxidado (GSH:GSSG) en una proporción 2:1. Tras el replegamiento, las proteínas diméricas obtenidas rhBMP-2 y rhBMP-2-CBD se purifican mediante cromatografía de afinidad por heparina, utilizando columnas de heparin-sefarosa HiTrap^{TM} (GE Healthcare, Uppsala, Sweden).

La adición de 1 mM de IPTG a los cultivos de células E. coli Rosetta (DE3) transformadas con la construcción pET-17b-BMP-2-CBD, favorece un alto rendimiento en la expresión de una proteína insoluble de unos \sim15 Kda, correspondiente al peso molecular esperado para los monómeros de rhBMP-2-CBD. El lavado de los extractos bacterianos con Tritón X-100 permite la obtención de la fracción insoluble de proteína constituida mayoritariamente por la forma de \sim15 KDa, la cual se encuentra en forma de cuerpos de inclusión. Tras la solubilización de las proteínas con Gnd-HCl, se realiza el plegamiento de las mismas in vitro durante 72 h, lo que da lugar a los dímeros de rhBMP-2-CBD, con una eficiencia de 40%. Finalmente los homodímeros de rhBMP-2-CBD, de unos \sim29 KDa, se purifican mediante cromatografía de afinidad por heparina, separándolos de los monómeros no dimerizados y del resto de proteínas contaminantes (figura 2A). El análisis mediante electroforesis y Western blot bajo condiciones reductoras y no-reductoras, usando un anticuerpo monoclonal anti-BMP-2, confirma que la proteína purificada es rhBMP-2-CBD (figura 2B). Mediante este método de producción el rendimiento obtenido es de 30 mg de rhBMP-2-CBD dimérica pura por litro de cultivo bacteriano. Resultados parecidos se obtienen en el caso de la producción, plegamiento y purificación de rhBMP-2 (datos no mostrados).

Caracterización funcional Afinidad de la rhBMP-2-CBD a esponjas de colágeno

La afinidad de la rhBMP-2 y de la rhBMP-2-CBD por el colágeno tipo I se analiza in vitro, estudiando la capacidad de unión a ACS mediante el método de Kitajima y col. [23] ligeramente modificado. Para ello, se utiliza esponja absorbible de colágeno (derivada de piel bovina, cedida por el Dr. ME Nimni; patente US 5374539), que es cortada en discos de 5 mm de diámetro y 1 mm de grosor, y se lava con PBST (tampón fosfato salino con 0,1% de Tween 20). A cada disco se añaden 50 \mul de muestra y se incuba a 37ºC durante 2 h. Transcurrido el periodo de incubación las esponjas de colágeno se lavan con PBST y se inmuno tiñen con anti-BMP-2 y anti-IgG-HRP de ratón. La detección se realiza con el reactivo ECL (GE Healthcare). La cantidad de proteína unida a las esponjas de colágeno, se determina mediante densitometría, cuantificando la inmunorreactividad de las esponjas, utilizando el programa de sofware libre Image J (Rasband, WS., Image J, U.S. National Institute of Health, Bethesda, Maryland. USA) versión 1.38x. Para estudiar la estabilidad de la unión de la rhBMP-2-CBD, tras incubar las proteínas recombinantes durante 2 h a 37ºC, las esponjas de colágeno se lavan en PBST durante 7 días antes de realizar la inmunotinción con anticuerpos.

En relación a la capacidad de unión a colágeno, mucha más cantidad de proteína rhBMP-2-CBD que rhBMP-2 permanece unida a las esponjas tras el lavado de 2 h en PBST (figura 3A). En lo que respecta a la estabilidad de la unión de ambas proteínas, en el caso de la rhBMP-2-CBD casi toda la proteína permanece unida a la esponja tras 7 días de lavado con PBST (figura 3B). Por el contrario, en el caso de la rhBMP-2, apenas queda proteína retenida en las esponjas tras este extenso lavado. Estos resultados demuestran que la rhBMP-2-CBD presenta mayor afinidad por el colágeno, siendo esta afinidad de más del doble que la proteína nativa a su mayor concentración (200 ng), y estable incluso después de un largo periodo de lavados.

Actividad fosfatasa alcalina in vitro

La actividad biológica de las proteínas producidas rhBMP-2-CBD y rhBMP-2 se analiza in vitro mediante el ensayo de inducción de la actividad ALP en células C2C12. Estas células tienen la capacidad de diferenciarse hacia el linaje osteogénico en presencia de BMP-2. Las células mioblasto de ratón C2C12 se cultivan en DMEM suplementado con suero fetal de ternera 10% (v/v) y glutamina 2 mM, a 37ºC y en atmósfera de CO_{2} (condiciones estándar). Para realizar el ensayo de fosfatasa alcalina (ALP), las células se siembran en una placa de 96 pocillos (Nunclon, Nunc, Roskilde, Denmark) a una densidad de 3x10^{4} células/pocillo en medio DMEM con 2% FBS, 2 mM L-glutamine y rhBMP-2 o rhBMP-2-CBD. Como control se utiliza proteína rhBMP-2 producida por células CHO. Tras 72 horas de cultivo, las células se lavan con PBS y la actividad ALP se mide utilizando el método del p-nitrofenil fosfato (pNPP) (Sigma Fast^{TM} p-nitrophenyl phosphate tablets, Sigma-Aldrich).

La proteína de fusión rhBMP-2-CBD es capaz de inducir la actividad ALP en este tipo celular, de forma dosis dependiente, alcanzando valores similares a los obtenidos cuando se aplican las proteínas sin modificar rhBMP-2 producida en E. coli o producida por las células CHO (figura 4). No se observan diferencias significativas en ninguna de las concentraciones estudiadas. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que la adición del dominio de unión al colágeno no afecta a la actividad biológica de la proteína in vitro.

Evaluación de la aplicabilidad de rhBMP-2-CBD Formación de hueso ectópico in vivo

La actividad osteoinductora de la proteína de fusión producida, se analiza mediante el ensayo de inducción de hueso ectópico en rata, implantando junto al músculo dorsal, esponjas de colágeno incubadas con diferentes cantidades de rhBMP-2-CBD o rhBMP-2. El cuidado de los animales y los procedimientos utilizados, se realizan de acuerdo a la normativa internacional. En este estudio se utilizan ratas Wistar jóvenes (12 semanas). La ACS es cortada en disco de 5 mm de diámetro y 1 mm de grosor, que se incuban durante 2 h a 37ºC con soluciones de proteína que contienen 0,4, 0,5, 10 \mug rhBMP-2-CBD, ó 0,4, 0,5, 10 \mug rhBMP-2. Los controles negativos se incubaron con solución vehículo. Se realizan tres réplicas de cada una de las condiciones. Los animales son anestesiados, se desinfecta la región con solución de etanol al 70% y se procede a afeitar la piel de la región doral. Tras realizar una incisión en la zona media doral se colocan tres implantes con proteína en un lado del músculo dorsal y tres implantes control en el músculo contralateral. En otro grupo experimental, se realizan implantes con HA (ProOsteon 500®) impregnadas con 10 \mug de rhBMP-2-CBD o rhBMP-2. Tras 28 días de implante, los animales son sacrificados y los implantes extraídos y disecados del tejido circundante. El material extraído se fija con formaldehido al 4% durante 18 h y se procesa para su inclusión en parafina. Se realizan secciones transversales de 10 \mum de grosor que se tiñen con hematoxilina-eosina (H-E). Los implantes que contenían 0,4 \mug de proteína se estudian, además, mediante tinción de von Kossa e inmunohistoquímica, utilizando un anticuerpo monoclonal anti-osteopontina y un anti-IgG de ratón marcado con biotina.

Tras cuatro semanas en el animal, los implantes extraídos aumentan de tamaño y presentan mayor dureza. El porcentaje de recuperación es del 100%, salvo en los controles negativos, implantados sin proteína recombinante, y las esponjas impregnadas con 0,4 \mug de rhBMP-2, que son reabsorbidos no encontrándose vestigio de material en el lugar de implantación. El estudio histológico realizado de las esponjas impregnadas con 0,5 y 10 \mug de rhBMP-2-CBD, teñidas con H-E, muestra la formación de hueso nuevo que se extiende homogéneamente por todo el implante, invasión de gran cantidad de vasos sanguíneos y generación de una médula ósea aparente. Se observan numerosos osteocitos embebidos en la matriz mineralizada de apariencia trabecular. En la periferia de la formación ectópica, se localizan células mesenquimáticas indiferenciadas y osteoblastos, en contacto directo con el nuevo hueso formado, sintetizando nueva matriz osteoide (figura 5, A y B). En el caso de la rhBMP-2 los implantes también muestran la formación de hueso nuevo, pero de apariencia claramente diferente al anterior, con una matriz más desorganizada y menos compacta, pocas cavidades medulares y menor angiogénesis con pocos vasos sanguíneos y de menor calibre. Las células mesenquimales indiferenciadas se localizan no sólo en la periferia del nuevo tejido formado, sino también en el interior del implante entre la poca matriz ósea desorganizada (figura 5, C y D). Todas estas evidencias sugieren que el hueso ectópico producido por la rhBMP-2 es más inmaduro que el producido por la rhBMP-2-CBD.

Los implantes de HA, utilizados para comprobar la actividad de la rhBMP-2-CBD en combinación con un transportador no colagénico, teñidos con H-E, muestran la formación de hueso nuevo que tapiza las paredes de los poros de la HA, bastante compacto y con numerosos osteocitos embebidos en la matriz ósea, en asociación con un tejido medular. En este caso, no se observan diferencias entre la actividad osteoinductora de ambas proteínas en combinación con este transportador, lo cual demuestra que la adición del CBD no disminuye la actividad biológica de la BMP-2 cuando es combinada con otro material no colagénico (figura 5, E-G).

Los implantes con baja concentración de proteína, por debajo del límite efectivo, establecido por otros autores [9], sólo son recuperados en el caso de las esponjas de colágeno impregnadas con 400 ng de rhBMP-2-CBD. En este caso, la tinción con von Kossa pone de manifiesto la presencia de nódulos mineralizados de hueso nuevo en la región interna del implante (figura 6H). En estos nódulos, la inmunotinción con anti-osteopontina muestra grupos de osteoblastos que expresan este marcador temprano de la osteogénesis, embebidos entre abundante matriz osteoide (figura 6I). También pueden encontrarse pequeños grupos de preosteoblastos, entre las células mesenquimales indiferenciadas, característicos de la aparición de nuevos núcleos de osificación (figura 6J).

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Claims

1. Proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I caracterizada porque dicha proteína ha sido modificada únicamente con un dominio de unión a colágeno, derivado del factor de von Willebrand, que consiste en un decapéptido en el que la Cys-7 que se encuentra en la secuencia original del mismo ha sido reemplazada por una metionina, y no comprende ninguna secuencia adicional que facilite su purificación.

2. Proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según la reivindicación anterior caracterizada porque presenta mayor afinidad por el colágeno que la proteína rhBMP-2 nativa, porque su unión a colágeno es estable en el tiempo, y porque retiene la actividad osteoinductiva.

3. Proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según la reivindicación anterior caracterizada porque es capaz de inducir la formación de hueso nuevo a concentraciones por debajo de las conocidas para la proteína rhBMP-2 nativa, y porque no sólo induce la formación de más hueso que la rhBMP-2 nativa sino que este hueso es más maduro.

4. Método de obtención de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I conforme a cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a.: Extracción de ARN total a partir de células que secreten BMPs;

b.: Amplificación mediante RT-PCT usando los oligonucleótidos específicos 5'-TTTCTAGATGGACGCTCTTT CAATGGACG-3' y 5'-TTGGTACCCTAGCGACACCCACAACCCTCC-3' (sentido y antisentido, respectivamente);

c.: Clonación del ADNc obtenido en un vector de expresión, transformación de E. coli, y selección de clones;

d.: Amplificación de la secuencia que codifica para el dominio maduro de la BMP-2, a la cual se añade la secuencia del CBD en el extremo amino, a partir de los clones seleccionados usando los oligonucleótidos específicos 5'-TTCATATGTGGCGCGAACCGAGCTTCATGGCTCTGAGCGGTGCAAGCCAAACACAAACAGC-3' y 5'-AGAATTCCTGTACTAGCGACACCCAC-3' (sentido y antisentido, respectivamente);

e.: Clonación del producto resultante en un vector de expresión, y expresión de la proteína rhBMP-2-CBD en E. coli;

f.: Aislamiento y solubilización de los cuerpos de inclusión, y replegamiento de las proteínas rhBMP-2-CBD;

g.: Purificación de rhBMP-2-CBD mediante cromatografía de afinidad por heparina.

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5. Método de obtención de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según la reivindicación anterior caracterizado porque rhBMP-2-CBD es clonada en un vector de expresión inducible por IPTG.

6. Método de obtención de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5 caracterizado porque las E. coli transformadas con rhBMP-2-CBD clonada en un vector de expresión son E. coli Rosetta (DE3).

7. Método de obtención de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 caracterizado porque el aislamiento de los cuerpos de inclusión comprende varios lavados en presencia de Tritón X-100, y porque la solubilización de las proteínas contenidas en los cuerpos de inclusión comprende el uso de guanidinio hidrocloruro (Gnd-HCl).

8. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque dicha proteína se combina con un transportador colagénico libre de ningún otro factor de crecimiento apto para uso clínico.

9. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según la reivindicación anterior caracterizado porque el transportador colagénico es una esponja absorbible de colágeno.

10. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 para la preparación de un producto farmacéutico de aplicación en medicina regenerativa de tejido óseo.

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11. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque dicha proteína se combina con un material osteoconductor distinto al colágeno.

12. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según la reivindicación anterior caracterizado porque el material osteoconductor distinto al colágeno es hidroxiapatita.

13. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I conforme a cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12 para la preparación de un producto farmacéutico de aplicación en medicina regenerativa de tejido óseo.

14. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I obtenida conforme a cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 caracterizado porque dicha proteína se combina con un transportador colagénico libre de ningún otro factor de crecimiento apto para uso clínico.

15. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según la reivindicación anterior caracterizado porque el transportador colagénico es una esponja absorbible de colágeno.

16. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 para la preparación de un producto farmacéutico de aplicación en medicina regenerativa de tejido óseo.

17. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I obtenida conforme a cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 caracterizado porque dicha proteína se combina con un material osteoconductor distinto al colágeno.

18. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según la reivindicación anterior caracterizado porque el material osteoconductor distinto al colágeno es hidroxiapatita.

19. Uso de una proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) con un dominio de unión específico a colágeno tipo I según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18 para la preparación de un producto farmacéutico de aplicación en medicina regenerativa de tejido óseo.