ES2342271T3 - Identificacion de genes de la 3-cetoesteroide 9-alfa-hidroxilasa y microorganismos bloqueados de la actividad 3-cetoesteroide 9-alfa-hidroxilasa. - Google Patents
Identificacion de genes de la 3-cetoesteroide 9-alfa-hidroxilasa y microorganismos bloqueados de la actividad 3-cetoesteroide 9-alfa-hidroxilasa. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para construir una cepa genéticamente modificada de un microorganismo que degrada esteroides que carece de la capacidad de degradar el núcleo del esteroide, comprendiendo el método la inactivación de los genes que codifican la actividad-KSH, el gen kshA de la SEC ID Nº:1 y/o el gen kshB de la SEC ID Nº 2.
Description
Identificación de genes de la
3-cetoesteroide
9\alpha-hidroxilasa y microorganismos bloqueados
en la actividad 3-cetoesteroide
9\alpha-hidroxilasa.
La invención se refiere a secuencias
polinucleotídicas aisladas que codifican componentes de la
3-cetoesteroide
9\alpha-hidroxilasa, a microorganismos bloqueados
en la actividad de la 3-cetoesteroide
9\alpha-hidroxilasa, a un método para la
preparación de dichos microorganismos, y al uso de tales
microorganismos en \Delta^{1}-deshidrogenación
de esteroides.
Hasta la fecha se dispone de un conocimiento muy
limitado sobre la 3-cetoesteroide
9\alpha-hidroxilasa (KSH), la enzima que realiza
la 9\alpha-hidroxilación de la
4-androsteno-3,17-diona
(AD) y la 1,4
androstadieno-3,17-diona (ADD) en
la degradación de esterol/esteroides microbiana. No se ha encontrado
ninguna secuencia de nucleótidos de los genes que codifican los
componentes de KSH. Además, surgen dificultades durante los
procedimientos de purificación enzimática (Chang, F. N. et
al. Biochemistry (1964) 3:1551-1557; Strijewski,
A. Eur. J. Biochem. (1982) 128:125-135). Se ha
purificado parcialmente una monooxigenasa de tres componentes con
actividad KSH en Nocardia sp. M117 y se ha descubierto que
constituye un sistema enzimático de tres componentes, compuesto por
una flavoproteína reductasa y dos proteínas ferredoxinas
(Strijewski, A. Eur. J. Biochem. (1982)
128:125-135). En Arthrobacter oxydans 317, la
9\alpha-hidroxilación de la estructura de anillo
policíclica esteroidea parecía portada por un plásmido (Dutta, R.K.
et al. J. Basic Microbiol. (1992)
32:317-324). Sin embargo, no se presentó el
análisis de la secuencia del plásmido.
La ausencia de datos genéticos ha obstaculizado
la construcción de cepas mutantes definidas molecularmente con
propiedades deseadas (es decir, bloqueo de la
9\alpha-hidroxilación de esteroides) por la
ingeniería genética. Se han aislado mutantes por mutagénesis
clásica, pero estas cepas generalmente son inadecuadas en procesos
industriales mayoritariamente debido a la inestabilidad genética y/o
las bajas eficiencias de bioconversión. Los mutantes definidos
molecularmente tienen ventajas comparados a los mutantes generados
por mutagénesis clásica. Los mutantes construidos son genéticamente
estables y las mutaciones introducidas son modificaciones genéticas
bien conocidas. La construcción de cepas genéticamente modificadas
hace obsoleto el uso extendido de agentes químicos para bloquear la
9\alpha-hidroxilación (por ejemplo,
\alpha,\alpha-dipiridil,
o-fenantrolina). Los agentes químicos usados para
bloquear la actividad KSH mayoritariamente no son específicos de
reacción e inhiben otras importantes reacciones enzimáticas (por
ejemplo, la 26-hidroxilación de esterol en la
degradación de la cadena lateral de esterol), lo cual puede tener
efectos negativos en la eficiencia de bioconversión de esterol. El
uso de mutantes definidos por ingeniería genética soluciona estos
problemas.
La 3-cetoesteroide
9\alpha-hidroxilasa (KSH) es una enzima clave en
la ruta de apertura del anillo B de esteroides microbianos. La KSH
cataliza la conversión de AD en
9\alpha-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona
(9OHAD) y de ADD en el compuesto químicamente inestable [9OHADD].
Se ha encontrado actividad KSH en muchos géneros de bacterias
(Martin, C.K.A. Adv. Appl. Microbiol. (1977)
22:29-58; Kieslich, K. J Basic Microbiol. (1985)
25: 461-474; Mahato, S.B. et al. Steroids
(1997) 62: 332-345): por ejemplo Rhodococcus
(Datceva, V. K. et al. Steroids (1989) 54:
271-286; van der Geize et al. FEMS Microbiol.
Lett. (2001) 205; 197-202, Nocardia
(Strijewski, A. Eur. J. Biochem. (1982)
128:125-135), Arthrobacter (Dutta, R. K.
et al. J. Basic Microbiol. (1992)
32:317-324) y Mycobacterium (Wovcha, M. G.
et al. Biochim. Biophys. Acta (1978) 531:
308-321). Las cepas de bacterias sin actividad KSH
se consideran importantes en la biotransformación de
esterol/esteroide. Los mutantes bloqueados en la actividad KSH
podrán realizar sólo la reacción de la KSTD
(3-cetoesteroide
\Delta^{1}-deshidrogenasa, permitiendo de esta
manera la \Delta^{1}-deshidrogenación selectiva
de compuestos esteroideos. Son ejemplos la biotransformación de
cortisol en prednisolona y la biotransformación de la AD en ADD. La
bioconversión de esteroles por mutantes bloqueados a nivel de la
9\alpha-hidroxilación de esteroides puede también
conllevar una degradación selectiva de la cadena lateral de esterol,
acumulándose de esta manera AD y/o ADD que son excelentes
precursores para la síntesis de hormonas esteroideas bioactivas.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, ahora se proporcionan las secuencias polinucleotídicas
aisladas de dos genes, designadas kshA y kshB de
Rhodococcus erythropolis: SEC ID Nº:1 y SEQ ID NO:2,
respectivamente. La proteína kshA se codifica por los nucleótidos
499-1695 de SEC ID Nº:1 y la proteína kshB por los
nucleótidos 387-1427 de SEC ID Nº:2. Así, en
particular, se prefieren los polinucleótidos que comprenden las
secuencias de ADN codificantes completas de los nucleótidos
499-1695 de la SEC ID Nº:1 y de los nucleótidos
387-1427 de SEC ID Nº:2, respectivamente.
Además, para acomodar la variabilidad de
codones, la invención también incluye secuencias que codifican las
mismas secuencias de aminoácidos de la proteína KshA y de la
proteína KshB. También forman parte de la invención porciones de
las secuencias codificantes que codifican dominios individuales de
la proteína expresada, así como variaciones alélicas y de especie
de las mismas. Algunas veces, un gen se expresa como una variante de
corte y empalme, dando como resultado la inclusión de una secuencia
de exón adicional, o la exclusión de un exón. También puede
incluirse o excluirse una secuencia parcial de exón. Un gen puede
también transcribirse desde cebadores alternativos que están
localizados en diferentes posiciones dentro de un gen, dando como
resultado transcritos con diferentes extremos 5'. La transcripción
puede también terminar en diferentes sitios, dando como resultado
diferentes extremos 3' del transcrito. Es de esperar que estas
secuencias, así como las proteínas codificadas por estas
secuencias, desarrollen funciones iguales o similares y formen
también parte de la invención. La información de secuencia
proporcionada aquí no debería ser tan estrechamente interpretada
como para requerir la inclusión de bases identificadas
erróneamente. La secuencia específica revelada aquí puede usarse
fácilmente para aislar los genes completos que, as su vez, pueden
someterse fácilmente a análisis de secuencia adicionales para
identificar de esta manera errores de secuenciación.
La presente invención se refiere además a
polinucleótidos que tienen ligeras variaciones o que tienen sitios
polimórficos. Los polinucleótidos que tienen ligeras variaciones
codifican polipéptidos que conservan la misma función o actividad
biológica que la proteína madura natural.
El ADN de acuerdo con la invención puede
obtenerse a partir de ADNc usando sondas adecuadas derivadas de la
SEC ID Nº:1 o la SEC ID Nº:2. Alternativamente, la secuencia
codificante podría ser ADN genómico, o prepararse usando técnicas
de síntesis de ADN. El polinucleótido puede también estar en forma
de ARN. Sí el polinucleótido es ADN, puede ser monocatenario o
bicatenario. La cadena única podría ser la cadena codificante o la
cadena no codificante (anti-sentido).
La presente invención se refiere además a
polinucleótidos que tienen al menos el 70%, preferiblemente el 80%,
más preferiblemente el 90%, incluso más preferiblemente el 95%, aún
más preferiblemente el 98%, y todavía más preferiblemente al menos
el 99% de identidad con la secuencia entera de ADN de los
nucleótidos 499-1695 de SEC ID Nº:1 y de los
nucleótidos 387-1427 de la SEC ID Nº:2,
respectivamente. Tales polinucleótidos codifican polipéptidos que
conservan la misma función biológica o actividad que la proteína
madura natural. Alternativamente, también se incorporan en la
invención fragmentos de los polinucleótidos arriba mencionados que
codifican dominios de la proteína que todavía son capaces de unirse
a sustratos.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias
puede determinarse con programas tales como Clustal W 1.7 (Thompson
J.D., et al. Nucleic Acids Res. (1994)
22:4673-4680: "CLUSTALW: Improving the sensitivity
of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighing, position-specific gap penalties and weight
matrix.") usado en los ajustes por defecto. El porcentaje de
identidad generalmente se define por el número de restos idénticos
entre las dos secuencias dividido por el número total de restos de
la secuencia conocida.
Similarmente se define como una combinación de
identidad junto con todos los restos aminoacídicos semiconservados
en el alineamiento de acuerdo con los grupos definidos en ClustalW
1.7:
- "*" = identidad = indica posiciones que tienen un solo resto completamente conservado.
- ":" = semi-conservado = indica que uno de los siguientes grupos "fuertes" está totalmente conservado. STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW.
- "." = semi-conservado = indica que uno de los siguientes grupos "más débiles" está totalmente conservado. CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, FVLIM, HFY.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos son todos los posibles grupos de
puntuación positiva que existen en la matriz Gonnet Pam250.
También están dentro del alcance de esta
invención homólogos funcionales de los nuevos genes, por ejemplo,
de la familia de Actinomicetales (por ejemplo, Rhodococcus,
Nocardia, Arthrobacter, Corynebacterium y
Mycobacterium).
Para identificar genes similares con una acción
similar en otros microorganismos, en el presente documento se
incluye cualquier método de detección de (poli)nucleótidos
conocido en la técnica para tal propósito. Por ejemplo, pueden
considerarse métodos de elongación/métodos de amplificación de
nucleótidos, pero también, tal método puede comprender los pasos
de: hibridar con una muestra una sonda específica para un
polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos de KshA o
KshB en condiciones eficaces para que dicha sonda hibride
específicamente con dicho polinucleótido y determinar la hibridación
de dicha sonda a polinucleótidos de dicha muestra. El término
"específico" a este respecto significa que la mayoría de la
hibridación tiene lugar con un polinucleótido de esta invención.
Preferiblemente, dicha sonda comprende al menos 25 de los
nucleótidos de la SEC ID Nº:1 o la SEC ID Nº:2. Más preferiblemente
la sonda comprende 50, y de una forma particularmente preferida más
de 100 nucleótidos de la SEC ID Nº:1 o de la SEC ID Nº:2. Lo más
preferido es que la sonda consista en un polinucleótido de
nucleótidos seleccionados entre los nucleótidos
499-1695 de la SEC ID Nº:1 y de los nucleótidos
387-1427 de la SEC ID Nº:2, respectivamente. Las
condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación
de ADN, por ejemplo, cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6,0x a
aproximadamente 45ºC, seguido de un lavado de SSC 2,0x a 50ºC, se
conocen por los expertos en la materia o pueden encontrarse en
Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons,
N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la
concentración de sal en el paso de lavado puede seleccionarse entre
una baja rigurosidad de aproximadamente SSC 2,0x a 50ºC a una alta
rigurosidad de aproximadamente SSC 0,2x a 50ºC. Además, la
temperatura en el paso de lavado puede aumentarse desde condiciones
de baja rigurosidad a la temperatura ambiente, de aproximadamente
22ºC, a altas condiciones de rigurosidad de aproximadamente
65ºC.
Alternativamente, los polinucleótidos de esta
invención también pueden usarse para dirigir genes específicos, por
ejemplo, para alterar genes en otras especies (véase, por ejemplo,
el documento WO 01/31050 y referencias ahí citadas).
La secuencia del polinucleótido recién
identificado de la presente invención, SEC ID Nº:1 y SEC ID Nº:2,
también puede usarse en la preparación de moléculas de vector para
la expresión de la proteína codificada en células hospedadoras
adecuadas. En la clonación de las secuencias de ácido nucleico que
codifican las proteínas KshA o KshB o partes de las mismas puede
emplearse de forma útil una amplia diversidad de células
hospedadoras y combinaciones de vehículos de clonación. Por
ejemplo, los vehículos de clonación útiles pueden incluir secuencias
de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas tales como
diversos plásmidos bacterianos conocidos y plásmidos con una mayor
serie de hospedadores y vectores derivados de combinaciones de
plásmidos y ADN de fago o de virus. Los vehículos para uso en la
expresión de los polinucleótidos de la presente invención o una
parte de los mismos que comprende un dominio funcional comprenderán
además secuencias de control unidas operativamente a la secuencia
de ácido nucleico que codifica la proteína. Estas secuencias de
control generalmente comprenden una secuencia cebadora y secuencias
que regulan y/o mejoran los niveles de expresión. Por supuesto, las
secuencias de control y otras secuencias pueden variar dependiendo
de la célula hospedadora seleccionada.
Son vectores de expresión adecuados, por
ejemplo, plásmidos bacterianos o de levadura, plásmidos de una
amplia serie de hospedadores y vectores derivados de combinaciones
de ADN de plásmido y fago o virus. También se incluyen vectores
derivados de ADN cromosómico. Además, en el vector de acuerdo con la
invención puede estar presente un origen de replicación y/o un
marcador de selección dominante. Los vectores de acuerdo con la
invención son adecuados para transformar una célula hospedadora.
También pueden considerarse vehículos de expresión adecuados
vectores de integración. También forman parte de la presente
invención vectores de expresión recombinantes que comprenden ADN de
la invención así como células transformadas con dicho ADN o dicho
vector de expresión. Son células hospedadoras adecuadas de acuerdo
con la invención células hospedadoras bacterianas, de levadura u
otros hongos, insectos, plantas o células hospedadoras animales
tales como células de ovario de hámster chino o células de mono o
líneas celulares humanas. Así, también está dentro del alcance de la
invención una célula hospedadora que comprende ADN o un vector de
expresión de acuerdo con la invención. Las células hospedadoras
modificadas por ingeniería genética pueden cultivarse en medios
nutrientes convencionales que pueden modificarse, por ejemplo, para
la selección, amplificación o inducción de la transcripción
apropiada. Las condiciones de cultivo tales como la temperatura,
pH, nutrientes etc. son bien conocidas por los expertos habituales
en la materia.
Las técnicas para la preparación de ADN o del
vector de acuerdo con la invención, así como la transformación o
transfección de una célula hospedadora con dicho ADN o vector son
convencionales y bien conocidas en la técnica, véase, por ejemplo,
Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 2ª
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,
1989.
En otro aspecto de la invención se proporciona
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos codificada
por cualquiera de las moléculas de ADN arriba descritas.
Preferiblemente, la proteína de acuerdo con la invención comprende
una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos
499-1695 de la SEC ID Nº:1 o de los nucleótidos
387-1427 de la SEC ID Nº:2, respectivamente. También
forman parte de la invención proteínas resultantes del
procesamiento postraduccional, estando codificadas dichas proteínas
por el polinucleótido de esta invención.
También se incluyen en la invención equivalentes
funcionales, es decir, proteínas homólogas a secuencias de
aminoácidos de KshA y KshB o partes de las mismas, que tienen
variaciones de la secuencia aunque todavía mantienen las
características funcionales. Las variaciones que pueden producirse
en una secuencia pueden demostrarse por una o más diferencias de
aminoácidos en la secuencia total o por deleciones, sustituciones,
inserciones, inversiones, o adiciones de uno o más aminoácidos en
dicha secuencia. Se han descrito sustituciones de aminoácidos que
se espera que no alteren esencialmente las actividades biológicas.
Son reemplazos de aminoácidos entre aminoácidos relacionados o
reemplazos que han ocurrido frecuentemente en la evolución, entre
otros Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (véase Dayhof,
M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res.
Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3). Basándose en esta
información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la
comparación rápida y sensible de proteínas (Science, 1985, 227,
1435-1441) y la determinación de la similitud
funcional entre polipéptidos homólogos. Quedará claro que también
los polinucleótidos que codifican tales variantes son parte de la
invención. Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención
también incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de
aminoácidos codificada por los nucleótidos 499-1695
de la SEC ID Nº:1 o de los nucleótidos 387-1427 de
la SEC ID Nº:2, respectivamente, pero también polipéptidos con una
similitud de al menos el 70%, preferiblemente el 80%, más
preferiblemente el 90% e incluso más preferiblemente el 95%.
También se incluyen partes de tales polipéptidos todavía capaces de
conferir efectos biológicos.
Otro aspecto de la presente invención son
microorganismos genéticamente modificados. Para la construcción de
cepas mutantes incapaces de la
9\alpha-hidroxilación, deben identificarse los
genes que codifican la actividad KSH y debe conocerse su secuencia
de nucleótidos. Los dos genes de esta invención, designados kshA y
kshB, se identificaron en Rhodococcus erythropolis SQ1 y
codificaban KSH. Estos genes se clonaron por complementación
funcional de dos cepas mutantes UV designadas
RG1-UV26 y RG1-UV39, ambas
defectuosas en la 9\alpha-hidroxilación de
AD(D). Se aislaron por una exploración extensiva de células W
irradiadas de R. erythropolis de la cepa RG1 (van der Geize,
R. et al. FEMS Microbiol. Lett. Submitted 2001), un mutante
de deleción del gen kstD (que codifica la
3-cetoesteroide
\Delta^{1}-deshidrogenasa = KSTD1) de la cepa
SQ1. Las cepas RG1-UV26 y RG1-UV39
eran incapaces de crecer en AD y ADD, pero crecían normalmente en
9OHAD, indicando deficiencia de la actividad KSH.
Para la complementación funcional de las cepas
mutantes RG1-UV26 y RG1-UV39
deficientes en KHS y la clonación de los genes kshA y
kshB, se construyó una genoteca de R. erythropolis RG1
usando un vector lanzadera
Rhodococcus-E.coli pRESQ (Figura. 1). El ADN
cromosómico de R. erythropolis RG1 digerido con Sau3A se
ajustó con gradiente de sacarosa a 6-10 kb y se ligó
en pRESQ digerido con BglII. La transformación de E.
coli Top10F' (Invitrogen Corp.) con esta mezcla de ligamiento
generó una genoteca de aproximadamente 15.000 transformantes en la
que aproximadamente el 90% de las construcciones contenían insertos.
Se estimó un tamaño medio de inserto de 6 kb. No fueron evidentes
complicaciones con la estabilidad o reorganizaciones. La genoteca
representa el genoma completo (p>9,99) asumiendo un tamaño de
genoma de aproximadamente 6 Mb.
Al introducir la genoteca de R.
erythropolis RG1 en cepas RG1-UV39 y
RG1-UV26 y posteriormente explorar la
complementación de deficiencia de KSH, se obtuvo la clonación de dos
fragmentos de ADN independientes que contenían el gen kshA y
el gen kshB, respectivamente (Figura 2).
El análisis de estos genes reveló que
kshA codifica una proteína de 398 aminoácidos (KshA). KshA
mostró una alta similitud (58% de identidad; 84% de similitud) con
una proteína hipotética codificada por el gen Rv3526
(DDBJ/EMBL/Genbank, nº de acceso CAB0501) en Mycobacterium
tuberculosis (Cole, S.T. et al. Nature (1998)
393:537-544). Por lo tanto, es de esperar que Rv3526
sea el homólogo de kshA en M. tuberculosis. La comparación
de la secuencia de nucleótidos obtenida de kshA con bases de
datos reveló adicionalmente que kshA es idéntico (en un 97%)
a un gen hipotético (ORF12), encontrado por Maeda, M. et al.
(Appl. Environ. Microbiol. (1995) 61:549-555) en la
cepa TA421 de R. erythropolis (DDBJ/EMBL/GenBank, nº de
acceso D88013) aguas arriba de bphC1 (Fig. 3). En analogía
con la organización molecular encontrada en la cepa TA421, también
se identificó un hipotético ORF11, identificado en esta cepa aguas
abajo de ORF12, aguas abajo de kshA en la cepa SQ1. Por lo
tanto, se unieron las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de
ADN de la cepa SQ1 y de la cepa TA421 y la secuencia de nucleótidos
teórica resultante se usó para la construcción con éxito del
plásmido pKSH126 (Fig. 3) usado para la introducción de una deleción
del gen kshA en marco no marcado en la cepa SQ1 de R.
erythropolis (produciendo una cepa RG2) y la cepa RG8
(produciendo la cepa RG9).
El gen kshB codifica una proteína de 346
aminoácidos (KshB). Las búsquedas de similitud de las bases de
datos revelaron que KshB mostraba alta similitud con los componentes
de la ferredoxina reductasa de oxigenasas multicomponentes. La
mayor similitud (56% de identidad; 85% de similitud) se encontró con
Rv3571 de M. tuberculosis (DDBJ/EMBL/Genbank, nº de acceso
A70606).
La inactivación de kshA o kshB por
deleción de genes no marcados da cepas mutantes definidas
molecularmente y genéticamente estables capaces de realizar una
\Delta^{1}-deshidrogenación selectiva de AD
produciendo ADD que no se metaboliza adicionalmente debido a la
ausencia de actividad KSH (véase el documento WO 01/31050). Usando
el sistema de contraselección sacB (descrito en el documento
WO 01/3105), se construyeron tres cepas mutantes de deleción de
genes no marcados: un mutante kshA de RG2 de R.
erythropolis usando pKSH126 (Fig. 3), un mutante kshB de
R. erythropolis RG4 usando pKSH212 (Fig. 4) y un mutante
kstD kstD2 kshA de R. erythropolis RG9. Las cepas RG2
y RG4 proceden de R. erythropolis SQ1. La cepa RG9 procede
del mutante kstD kstD2 de R. erythropolis RG8 usando
pKSH126 (Fig. 3). La cepa RG8 carece de las dos isoenzimas
3-cetoesteroide
\Delta^{1}-deshidrogenasa (KSTD1 y KSTD2;
descritas en el documento WO 01/31050).
Así, otro aspecto de esta invención es un
microorganismo bloqueado en la actividad
3-cetoesteroide
9\alpha-hidroxilasa caracterizado por que es un
microorganismo genéticamente modificado, en particular de la familia
de los Actinomicetales, preferiblemente del género
Rhodococcus y más preferiblemente de Rhodococcus
erythropolis. También se prefiere una cepa en la que está
inactivado al menos un gen que codifica la actividad
3-cetoesteroide
\Delta^{1}-deshidrogenasa, preferiblemente por
una deleción de genes no marcados. En particular, se prefieren las
cepas RG2, RG4 y RG9.
También es un aspecto de la presente invención
un método para construir una cepa genéticamente modificada de un
microorganismo degradador de esteroides, que carezca de la capacidad
de degradar el núcleo del esteroide, comprendiendo el método la
inactivación de los genes que codifican la actividad KSH,
preferiblemente del gen kshA y/o el gen kshB.
Preferiblemente, la inactivación del gen o los genes se lleva a cabo
por deleción dirigida de genes, preferiblemente no marcados.
Otro aspecto más de la presente invención es el
uso de microorganismos genéticamente modificados en la
\Delta^{1}-deshidrogenación de esteroides, en
particular en la preparación de
1,4-androstadieno-3,17-diona
y prednisolona. Preferiblemente, el microorganismo para tal uso se
ha obtenido por inactivación de genes dirigida, preferiblemente
deleción de genes no marcados, de los genes que codifican la
actividad KSH en un microorganismo de la familia de los
Actinomicetales, preferiblemente el gen kshA y/o el gen
KshB. Los microorganismos preferidos para este uso se
seleccionan de las cepas genéticamente modificadas RG2, RG4 y
RG9.
Las cepas de microorganismos Rhodococcus
erythropolis RG2, RG4 y RG9 se han depositado en el Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ),
Mascheroder Weg 1b, D-35124 Braunschweig, Alemania,
con los números de acceso DSM, 14544, DSM 14545 y DSM 14546,
respectivamente. Estos depósitos se han realizado según los
términos del Tratado de Budapest.
Los métodos de construcción de vehículos para
usarse en el protocolo de mutagénesis son bien conocidos (Sambrook
et al. Molecular Clonning: a Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, última edición).
Además, las técnicas de mutagénesis dirigida, ligación de secuencias
adicionales, PCR, secuenciación del ADN y construcción de sistemas
de expresión adecuados son bien conocidas en la técnica en este
momento. Pueden construirse sintéticamente partes o todo el ADN que
codifica la proteína deseada usando técnicas convencionales de fase
sólida, preferiblemente para incluir sitios de restricción para
facilitar la ligación.
Las modificaciones y variaciones del método por
introducir mutaciones de genes fragmentados, inactivación dirigida
de genes y, en particular, deleción de genes no marcados, así como
la transformación y conjugación serán obvias para los expertos en
la materia a partir de la descripción detallada de la invención. Se
pretende que tales modificaciones y variaciones estén dentro del
alcance de la presente solicitud. Una persona experta en la materia
entenderá cómo usar los métodos y materiales descritos y citados en
este documento para construir microorganismos carentes de actividad
KSH.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos para la
invención y de ninguna manera deben considerarse limitantes del
alcance de la invención.
Figura 1. El vector lanzadera pRESQ de
Rhodococcus-E.coli basado en pZErO-2.1
(línea curva delgada) usado para construir una genoteca de R.
erythropolis RG1. Rep: región de 2,5 kb de pMVS301 que codifica
la replicación autónoma en Rhodococcus sp. (línea curva
gruesa), lacZ-ccdB: marcador de selección positiva
en E. coli.aphII: marcador de resistencia a kanamicina para
la selección en Rhodococcus y E. coli.
Figura 2. La estrategia de clonación e
identificación separadas de los genes kshA y kshB que
codifican la actividad KSH en R. erythropolis SQ1 por
complementación funcional de las cepas mutantes UV
RG1-UV39 (A) y RG1-UV26 (B),
respectivamente, usando varias construcciones derivadas de
pRESq.
Figura 3 (A). Visión general del fragmento de
ADN de 2,6 kb de R. erythropolis SQ1 que codifica kshA
y su homólogo de 4,1 kb en R. erythropolis TA421. La barra
gris del ORF12, junto con la flecha negra (tamaño de ORF12
propuesto por Maeda et al. (1995)), representa el verdadero
tamaño de ORF12 en R. erythropolis TA421, que es idéntico
(97%) a kshA. La "X" indica el punto de fusión de las
dos secuencias. (B) Esquema de las secuencias de nucleótidos
teóricamente unidas de los fragmentos de ADN de la cepa SQ1 y la
cepa TA421, y su uso en la construcción del plásmido pKSH126 para
la deleción del gen kshA en marco no marcado en la cepa SQ1
y la cepa RG8. Los números 1-4 indican los cebadores
usados para obtener los productos de PCR 1 y 2 para la construcción
del plásmido pKSH126 usado para la deleción del gen kshA no
marcado en la cepa parental SQ1 y la cepa mutante de kstD
kstD2 RG8.
Figura 4. Esquema de clonación para la
construcción del plásmido pKSH212 usado en la construcción de la
cepa mutante de deleción del gen kshB no marcado RG4 a
partir de la cepa parental SQ1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un derivado de
pZErO-2.1 (Invitrogen Corp. San Diego, Calif.) en el
que el sitio BamHI se reemplazó por un sitio BglII
(Fig. 1). Un fragmento SacI-StuI de
pZErO-2.1, que contenía el gen
lacZ-ccdB, se duplicó por PCR usando un
cebador directo mutagénico (5' ACCGAGCTCAGATCTACTAGTAACGGC
3', SEC ID Nº:3), que contenía el sitio de restricción BglII
deseado (subrayado doble) y un sitio de restricción SacI
(subrayado), y un cebador inverso (5'
ATTCAGGCCTGACATTTATATTCCCC 3', SEC ID Nº:4) con un sitio de
restricción StuI (subrayado). El producto obtenido de PCR se
digirió con enzimas de restricción SacI y StuI y se
ligó al pZErO-2.1 digerido con
SacI-StuI (pRES 14). El gen aphII de pWJ5
(Jäger, W.A. et al. (1992). J Bacteriol
174:5462-5465) se clonó como fragmento romo
HindIII-BamHI (relleno con Klenow) en pBlueScript
(II) KS digerido con EcoRV para construir pBsKm1. El sitio
único BglII en pBsKml se destruyó por digestión con
BglII seguido de relleno de Klenow (pRES4). El cassette de
ampicilína presente en pRES4 se retiró por autoligación seguida de
digestión con BspHI (pRES9). Un fragmento de 2,5 kb
BglII-XbaI de pMVS301 (Vort-Singer,
M.F. et al., (1988) J. Bacteriol. 170:
638-645), que contenía la región de replicación
autónoma en Rhodococcus sp., posteriormente se ligó a pRES9
digerido con BamHI-XbaI para construir pRES11. La
construcción de pRESQ (6,55 kb) se completó por ligación a un
fragmento de 4,15 kb BspHI/NcoI de pRES11 en pRES14
digerido con BspHI-NcoI.
\vskip1.000000\baselineskip
Células (2 x 10^{8} UFCs\cdotml^{-1}) de
la fase exponencial tardía de R. erythropolis RG1 (= mutante
kstD) cultivadas en medio mineral con glucosa 10 mM se
sometieron a tratamientos ultrasónicos durante un corto periodo de
tiempo para obtener células individuales. Se extendieron muestras
diluidas (10^{4}) en medio agar mineral con glucosa y se
irradiaron durante 15-20 seg con una lámpara UV
(Philips TAW 15W) a una distancia de 27 cm, resultando como
resultado una destrucción media de las células del 95%. Después de
4 días de incubación, las colonias que habían aparecido se
cultivaron de forma replicada en medio agar mineral con AD (0,5
g\cdotl^{-1} solubilizado en DMSO (50 mg\cdotml^{-1})). Una
selección de mutantes deficientes en el crecimiento en AD(D)
de R. erythropolis RG1 capaces de crecer en medio mineral
90HAD produjo dos mutantes que tenían claramente impedida la
reacción de la KSH. Estos mutantes, denominados cepa
RG1-UV26 y cepa RG1-UV39, no
mostraron crecimiento después de 3-4 días con AD o
ADD como única fuente de carbono y de energía, mientras que el
crecimiento en medio agar mineral 9OHAD fue normal.
\vskip1.000000\baselineskip
La genoteca de la cepa RG1 de R.
erythropolis se introdujo en la cepa RG1-UV39
por electrotransformación para complementar su fenotipo mutante
(Fig. 2). Se aisló un clon que contenía un inserto de 6 kb (pKSH101)
que era capaz de restaurar el crecimiento de la cepa
RG1-UV39 en medio agar mineral con AD. El análisis
del mapa de enzimas de restricción, la subclonación en pRESQ y los
experimentos de complementación posteriores dieron como resultado
la identificación de un fragmento de ADN de 1,8 kb
BamHI-Sau3A (pKSH106) que todavía era capaz de
complementar la cepa RG1-UV39 (Fig. 2). Este inserto
de 1, 8 kb se clonó en pBlueScript(III) KS y se determinó su
secuencia de nucleótidos. El análisis de la secuencia de nucleótidos
reveló un solo ORF de 1.197 nt (kshA,
499-1695 de la SEC ID Nº:1) que codificaba una
supuesta proteína de 398 aa (KshA).
La complementación de R. erythropolis
RG1-UV26 con la genoteca de la cepa RG1 tuvo como
resultado el aislamiento del clon pKSH200 capaz de restaurar el
crecimiento de la cepa RG1-UV26 en medio agar
mineral con AD (Fig. 2). Mediante los experimentos posteriores de
análisis del mapa de restricción, subclonación y complementación de
pKSH200 se identificó un fragmento de 2,8 kb
BglII-Sau3A (pKSH202) que todavía era capaz de
restaurar el fenotipo mutante de la cepa RG1-UV26
(Fig. 2). Este fragmento se subclonó en pBlueScript (II) KS y se
determinó su secuencia de nucleótidos. El ORF responsable de
complementar el fenotipo mutante RG1-UV26 se
identificó a partir de un experimento de complementación posterior.
Se usó un sitio de restricción Asp718 mapeado en el
fragmento de 2,8 kb para construir pKSH205, que ya no podía
complementar el fenotipo mutante (Fig. 2). De esta manera, la
enzima de restricción Asp718 se localiza dentro del ORF
responsable de la complementación. El ORF identificado de 1.041 nt
se denominó kshB (387-1427 de SEC ID Nº:2;
contenido en GC, 62,3%) que codifica una supuesta proteína de 346
aminoácidos con un peso molecular calculado de 37,1 kDa (KshB).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la deleción en marco de genes no marcados
de kshA (\DeltakshA), se construyó pKSH126. Se
obtuvo un fragmento de 1,3 kb (producto 1 de PCR 1) a partir de
pKSH101 usando un cebador (Fig. 3 cebador 1) que hibridaba con
secuencias aguas arriba de kshA (5' CGCGGGCCCATCGAGAGCACGTT
3', SEC ID Nº:5), y un cebador (Fig. 3 cebador 2) que hibridaba con
el extremo-5' del gen kshA (5'
GCGCCCGGGTCCGAGTGCCATGTCTTC 3', SEC ID Nº:6) que contenía un
sitio SmalI (subrayado). Los cebadores para el producto 2 de
PCR se desarrollaron usando la secuencia de nucleótidos de las
secuencias fusionadas de la cepa SQ1 y la cepa TA421
(DDBJ/EMBL/GenBank, nº de acceso D88013). El producto 2 de la PCR
(840 pb) se obtuvo a partir del ADN cromosómico de SQ1 usando un
cebador directo (Fig. 3 cebador 3) que hibridaba con el extremo 3'
del gen kshA (5' GCGCCCGGGACAACCTCCTGATTCGCAG
TC 3', SEC ID Nº:7), que incluye un sitio de restricción SmaI (subrayado), y un cebador reverso (Fig. 3 cebador 4) que hibridaba con el ORF11 (5' GCGTCTAGAGTGGAAGAGCATTCCCTCGCA 3', SEC ID Nº:8), que incluye un sitio de restricción XbaI (subrayado). El sitio de restricción SmaI se introdujo para dar una deleción en marco de kshA después de la ligación de este fragmento de PCR detrás del gen kshA truncado en posición 5' a partir del producto 1 de la PCR. Finalmente, un fragmento SalI-XbaI de 2,05 kb procedente de pKSH125 se ligó en el vector pK18mobsacB (pKSH126).
TC 3', SEC ID Nº:7), que incluye un sitio de restricción SmaI (subrayado), y un cebador reverso (Fig. 3 cebador 4) que hibridaba con el ORF11 (5' GCGTCTAGAGTGGAAGAGCATTCCCTCGCA 3', SEC ID Nº:8), que incluye un sitio de restricción XbaI (subrayado). El sitio de restricción SmaI se introdujo para dar una deleción en marco de kshA después de la ligación de este fragmento de PCR detrás del gen kshA truncado en posición 5' a partir del producto 1 de la PCR. Finalmente, un fragmento SalI-XbaI de 2,05 kb procedente de pKSH125 se ligó en el vector pK18mobsacB (pKSH126).
La deleción en marco no marcada del gen
kshA se obtuvo por introducción del vector mutagénico pKSH126
en la cepa SQ1 seguida de la contraselección de sacB
(documento WO 01/31050). El gen kshA de tipo silvestre se
redujo a un ORF (\DeltakshA) de 30 nt, que codificaba solo
9 aminoácidos (MALGPGTTS). La deleción génica de kshA se
confirmó por el análisis Southern de ADN cromosómico digerido con
BamHI usando el inserto de 2 kb de pKSH126 como sonda: un
fragmento BamHI de ADN de tipo silvestre de 2,05 kb se
redujo a 0,88 kb en las cepas mutantes de deleción génica. La cepa
resultante se denomina R. erythropolis RG2.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la deleción en marco de genes no marcados
de KshB, se construyó pKSH212 (Fig. 4). Para este propósito,
pKSH201 se fusionó con un producto de PCR (1.275 pb) obtenido a
partir de pKSH202 como una plantilla. El producto de PCR se obtuvo
con un cebador directo 5' GCGGGTACCGATCGCCTGAAGATCGAGT 3' (SEC ID
Nº: 9) y un cebador inverso 5' GCGAAGCTTGCCGGCGTCGCAGCTCTGTG 3'
(SEC ID Nº 10) y ligado (romo) en pBlueScript (II) KS digerido con
EcoRV (pKSH210). En el extremo 5'-terminal
de este producto de PCR se introdujo un sitio de restricción
Asp718, que precede al codón de parada de kshB (véase
el cebador directo) para asegurar la deleción en marco adecuada de
kshB después de la ligación con el sitio de restricción
Asp718 de pKSH201. En el extremo 3'-terminal
se añadió un sitio de restricción HindIII (véase el cebador
reverso), compatible con el sitio de restricción HindIII de
pKSH201, para propósitos de clonación. El producto de PCR se aisló a
partir de pKSH210 por digestión con Asp718-HindIII
(1.263 pb) y se ligó a pKSH210 digerido con
Asp718-HindIII (Fig. 2) (pKSH211), introduciendo de
esta manera la deleción en marco deseada kshB (Fig. 4).
Finalmente, un fragmento de ADN BamHI-HindIII (2,2
kb) que contenía la deleción de kshB se ligó a pK18mobsacB
(véase el documento WO 01/31050) digerido con BamHI y
HindIII (pKSH212).
El plásmido pKSH212 se introdujo en R.
erythropolis SQ1 por conjugación, usando Escherichia coli
S17-1. Se obtuvo una deleción del gen kshB
no marcado usando el sistema de contraselección de sacB
(documento WO 01/31050). Se exploraron los posibles mutantes
kshB por cultivo replicado en placas de agar mineral con AD,
lo cual permitió aislar mutantes de kshB incapaces de crecer
en AD. Se realizó un análisis Southern sobre el ADN cromosómico
digerido con Asp718 de tipo silvestre y tres mutantes
deficientes en el crecimiento con AD. La hibridación con el gen
kshB completo mostró que kshB no estaba presente en el
genoma de los supuestos mutantes de kshB. Se encontró una
clara señal de hibridación (fragmento de 4,3 kb) exclusivamente con
ADN cromosómico de tipo silvestre. Análisis adicionales de Southern
con una sonda alternativa, que era el inserto de 2,2 kb de pKSH212
que comprendía las dos regiones flanqueantes de kshB,
confirmó adicionalmente la deleción del gen kshB: un
fragmento de ADN de 4,3 kb de Asp718 que contenía el gen
kshB se redujo a 3,3 kb en un mutante de kshB,
demostrando la sustitución del gen kshB de 1,041 pb por un
resto en marco de kshB de 30 nt (que codifica MTTVEVPIA). La
cepa resultante se denomina R. erythropolis RG4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron cepas RG2 y RG4 en medios de agar
mineral que contenían AD, ADD o 9OHAD como única fuente de carbono
y de energía. Ambas cepas mostraron ausencia de crecimiento en
AD(D), mientras que el crecimiento en 9OHAD era comparable a
la cepa SQ1. Estos fenotipos están de acuerdo con los encontrados
con cepas mutantes UV RG1-UV26 y
RC1-UV39. La bioconversión de AD (1
g\cdotl^{-1}) con la cepa SQ1 tiene como resultado la
utilización de AD, pero no la acumulación de ADD u otros
metabolitos. La bioconversión de AD (1 g\cdotl^{-1}) por la
cepa RG2 o la cepa RG4 dio como resultado niveles comparables de
acumulación de ADD (que variaban entre 0,3-0,5
g\cdotl^{-1} después de 168 h). Por lo tanto, la
9\alpha-hidroxilación de AD(D) se bloquea
por inactivación de kshA o kshB, demostrando el papel
esencial tanto de kshA como de kshB en la actividad
KSH en R. erythropolis SQ1. En los experimentos de
bioconversión de AD con la cepa RG9, no se observó ni una bajada de
la concentración inicial de AD ni la formación de 90HAD. La cepa
mutante RG9 confirma así que kshA codifica la actividad
9\alpha-hidroxilasa de AD y que, al contrario de
las isoenzimas de KSTD, no están presentes más isoenzimas de KSH en
R. erythropolis SQ1.
<110>
\vskip0.400000\baselineskip
<120>
delta-1-deshidrogenación microbiana
de esteroides
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> versión 3.1 de la patente
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº:1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1770
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus erythropolis
SQ1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº:2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus erythropolis
SQ1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccgagctca gatctactag taacggc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº:4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattcaggcct gacatttata ttcccc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº:5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgggccca tcgagagcac gtt
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº:6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcccgggt ccgagtgcca tgtcttc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº:7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcccggga caacctcctg attcgcagtc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº:8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtctagag tggaagagca ttccctcgca
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº:9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgggtaccg atcgcctgaa gatcgagt
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº:10
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<210> 10
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> artificial: cebador
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgaagcttg ccggcgtcgc agctctgtg
\hfill
Claims (7)
1. Un método para construir una cepa
genéticamente modificada de un microorganismo que degrada esteroides
que carece de la capacidad de degradar el núcleo del esteroide,
comprendiendo el método la inactivación de los genes que codifican
la actividad-KSH, el gen kshA de la SEC ID
Nº:1 y/o el gen kshB de la SEC ID Nº2.
2. El método de reivindicación 1, en el que la
inactivación del gen o los genes se realiza por una deleción de
genes dirigida y preferiblemente sin marcar.
3. Un microorganismo con la actividad
3-cetoesteroide
9\alpha-hidroxilasa bloqueada caracterizado
por que es un microorganismo genéticamente modificado,
preferiblemente de la familia de los Actinomicetales, obtenible por
el método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.
4. El microorganismo de la reivindicación 3, que
es del género Rhodococcus.
5. El microorganismo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en el que también se
inactiva al menos un gen que codifica la actividad
3-cetoesteroide \Delta^{1-}deshidrogenasa,
preferiblemente por una deleción de genes sin marcar.
6. El microorganismo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 3-5, que se
selecciona entre los microorganismos genéticamente modificados RG2,
RG4 y RG9, DSM 14544, DSM 14545 y DSM 14546 respectivamente.
7. Un uso de los organismos genéticamente
modificados de acuerdo con las reivindicaciones 3-6
en la \Delta^{1}-deshidrogenación de
esteroides, preferiblemente en la preparación de
1,4-androstadieno-3,17-diona
y prednisolona.
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