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ES2341126T3 - Proteina de fusion del anticuerpo l19 contra fibronectina ed-b e interleucina 12. - Google Patents

Proteina de fusion del anticuerpo l19 contra fibronectina ed-b e interleucina 12. Download PDF

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ES2341126T3
ES2341126T3 ES06742774T ES06742774T ES2341126T3 ES 2341126 T3 ES2341126 T3 ES 2341126T3 ES 06742774 T ES06742774 T ES 06742774T ES 06742774 T ES06742774 T ES 06742774T ES 2341126 T3 ES2341126 T3 ES 2341126T3
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ES
Spain
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conjugate
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conjugated
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ES06742774T
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English (en)
Inventor
Dario Neri
Verena Gafner
Cornelia Halin
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Philogen SpA
Original Assignee
Philogen SpA
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Publication date
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Abstract

Conjugado que comprende un heterodímero IL12 que tiene una primera y segunda subunidades, en el que la primera y segunda subunidades están cada una conjugada con una molécula de anticuerpo, en el que la molécula de anticuerpo es una cadena simple de Fv (scFv) o un anticuerpo de dominio (dAb).

Description

Proteína de fusión del anticuerpo L19 contra fibronectina ED-B e interleucina 12.
Esta invención se refiere a la localización de un fármaco en un sitio in vivo deseado mediante la conjugación de un elemento de unión específico para el objetivo específico. La invención está especialmente dirigida a conjugados entre IL12 y moléculas de anticuerpos para aplicaciones terapéuticas tales como la inhibición de la angiogénesis patológica, incluyendo el tratamiento del cáncer y otros tumores, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad y angiomas.
La citocina interleuquina-12 heterodimérica (IL12) es un mediador clave de la inmunidad innata y celular con una potente actividad antitumoral antimetástica [4-6]. En la actualidad (primavera de 2005) se está probando en ensayos de fase II de desarrollo clínico para el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas. IL12 actúa fundamentalmente sobre las células T y NK, estimulando su actividad y la secreción de interferón-y (IFN-\gamma) [7]. Como con muchas otras citocinas, sin embargo, la administración de IL12 humana recombinante se asocia con toxicidad severa, incluso en dosis tan bajas como 1 \mug/kg/día [8, 9], lo que limita su desarrollo como medicamento contra el cáncer.
Una entrega marcada de IL12 al ambiente tumoral puede utilizarse para aumentar el índice terapéutico de la citocina.
Los científicos en Lexigen han descrito la fusión de citocinas tales como IL2 e IL12 en inmunoglobulinas para marcar específicamente las citocinas [17, 49-51]. Sin embargo, nosotros, los presentes inventores, creemos que existen limitaciones en estas aproximaciones. Reconocemos que las fusiones de IgG-citocinas son en realidad proteínas multifuncionales, por lo que, además de la actividad de unión de antígenos y de citocinas, estas proteínas de fusión basadas en IgG pueden activar el complemento e interactuar con receptores Fc. En nuestra opinión esta es una característica no deseada de las fusiones IgG-citocinas, ya que las citocinas pueden ser llevadas en proximidad de las células (tales como macrófagos, neutrófilos y células asesinas naturales) llevando receptores Fc, lo que dificulta la localización tumoral y causa la activación de células no específicas. Consideramos que es más conveniente utilizar una molécula de anticuerpo que carezca de Fc, tal como un fragmento de anticuerpo de cadena única Fv (scFv), en lugar de la inmunoglobulina completa.
Previamente hemos demostrado en modelos de cáncer de roedores que el potencial terapéutico de IL12 puede aumentar considerablemente mediante la fusión de un polipéptido de cadena única que codifica secuencialmente las subunidades p40 y p35 de la citocina IL12 murina ("scIL12") con el fragmentos de anticuerpo Fv de cadena simple humano Fv L19 ("scFv(L19)"). ScFv(L19) ha demostrado ser capaz de marcar tumores selectivos en pacientes con cáncer [16]. L19 se une específicamente al dominio ED-B de la isoforma de fibronectina B-FN, que es uno de los mejores marcadores conocidos de angiogénesis [14, 25]. ED-B es un dominio adicional de 91 aminoácidos que se encuentra en la isoforma B-FN y es idéntico en ratón, rata, conejo, perro y hombre. B-FN se acumula alrededor de las estructuras neovasculares en tumores agresivos y otros tejidos que sufren angiogénesis, tal como el endometrio en la fase proliferativa y algunas estructuras oculares en condiciones patológicas, pero de otro modo no es detectable en tejidos adultos normales [1-3].
La proteína de fusión scFv-scIL12 (L19), mostró un índice terapéutico muy superior a scIL12 fusionado en un scFv de especificidad irrelevante en ratones, y en IL12 murina recombinante. Estos experimentos demostraron claramente el potencial de las proteínas de fusión basadas en anticuerpos de citocinas como una vía para mejorar el potencial terapéutico de IL12 [15]. El potencial terapéutico de estos resultados es considerable.
La localización de IL12 al nivel de los vasos sanguíneos del tumor, tal como mediante el uso de L19, es terapéuticamente beneficioso por una serie de razones. En primer lugar, la neovasculatura tumoral es más accesible a los agentes terapéuticos administrados por vía intravenosa que las células tumorales, lo que ayuda a evitar los problemas asociados con la hipertensión intersticial de los tumores sólidos [10]. En segundo lugar, la angiogénesis (crecimiento de nuevos capilares de los vasos sanguíneos preexistentes) es un rasgo característico de la mayoría de los tumores sólidos agresivos [11]. La localización de IL12 en la neovasculatura debería permitir la inmunoterapia de una variedad de tipos de tumores diferentes. En tercer lugar, IL12 muestra una actividad anti-angiogénica, conferida por su mediador IP-10 posterior [12, 13].
Ya hemos estudiado extensivamente el rendimiento de la localización tumoral de scIL12-scFv(L19), y también el de scFv(L19) fusionado a otra citocina antitumoral, IL2("scFv (L19)-IL2") [18]. ScFv(L19)-IL2 muestra un excelente rendimiento de localización tumoral en ratones con tumores, con relaciones tumor:sangre y tumor:órganos tan alta como 30:1 veinticuatro horas después de la inyección intravenosa. Por el contrario, la capacidad de la localización tumoral de scIL12-scFv(L19) en los mismos modelos animales es más modesto, con relaciones tumor:sangre y tumor:órganos generalmente peores de 10:1 a las 24 h, y con pobres relaciones tumor:hígado y tumor:bazo [15]. Estos resultados de localización, sin embargo, eran superiores en comparación con una proteína de fusión scFv-scIL12(HyHEL10), específica de la lisozima de huevo de gallina, pero carece de reconocimiento específico del antígeno en el ratón.
Las propiedades de localización tumoral de scFv(L19) se han mostrado que mejoran cuando scFv(L19) fue dimerizado a través de un dominio CH4 de IgE humano, creando una estructura de mini-anticuerpo, también llamada "pequeña proteína inmune" o SIP. Las propiedades de la localización tumoral de SIP(L19) se han descrito previamente [21].
La presente invención se basa en el trabajo en el que nosotros, los inventores, comparadas las capacidades de la localización de tumores de tres conjugados de IL12 y scFv(L19), cada uno con un formato diferente de la citocina y/o el anticuerpo, y se encontró que la capacidad de localización tumoral de scIL12-scFv(L19) se puede mejorar cambiando el formato del conjugado de una manera particular.
Un formato probado fue scIL12-scFv(L19), ilustrado en la figura 1A. Este conjugado mostró una modesta capacidad de localización tumoral, consistente con los resultados de la técnica anterior.
Otro formato utilizado fue la construcción dimérica SIP(L19) antes mencionada para crear un homodímero de scIL12-SIP (L19), ilustrado en la Figura 1B. Sin embargo, a pesar de la indicación de la técnica anterior que las propiedades de localización tumoral de L19 pueden mejorarse utilizando el formato SIP, no se observó una captación tumoral mayor de este conjugado.
Otro formato fue un heterodímero de las subunidades IL12 p40 y p35, en el que cada subunidad se fusionó en scFv (L19), formando un heterodímero scFv(L19)-p35/p40-scFv(L19) como se ilustra en la figura 1C. Con este formato heterodimérico logramos una notable mejora en la captación tumoral del conjugado.
Así, hemos descubierto que un nuevo formato de proteína de fusión con anticuerpo IL12, que consiste en dos fragmentos scFv heterodimerizados a través de las subunidades p40 y p35 de IL12, mantiene la actividad completa de IL12 y muestra una excelente capacidad de localización tumoral.
Estos resultados tienen importantes implicaciones terapéuticas para mejorar la localización de IL12 en tumores y en otros sitios de angiogénesis patológica, por ejemplo, para el tratamiento de artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad y angiomas. La utilidad de esta invención se extiende no sólo a la fusión de IL12 y scFv(L19), sino también a conjugados entre otros miembros de unión específica y otros fármacos y sustancias. Por ejemplo, los conjugados pueden construirse con elementos de unión específicos diferentes de scFv(L19) conjugados a subunidades IL12, tales como otros fragmentos de anticuerpos específicos para los antígenos asociados a tumores, por ejemplo isoformas de tenascina-C, y se utilizan para localización tumoral y terapia del cáncer. Las implicaciones más amplias también incluyen una variedad de otros usos que implican la localización de sustancias in vivo, procedimientos de diagnóstico, así como la prevención y el tratamiento de enfermedades y otras condiciones patológicas.
La invención en varios aspectos se refiere a nuevos conjugados, procedimientos para su producción, ácidos nucleicos que codifican los conjugados o sus componentes, composiciones farmacéuticas que contienen los conjugados, y la utilización de los conjugados en procedimientos de tratamiento.
En un aspecto, la invención es un conjugado que comprende un heterodímero IL12 que tiene una primera y segunda subunidades, en el que la primera y segunda subunidades están cada una conjugada en una molécula de anticuerpo, en el que la molécula de anticuerpo es una cadena simple Fv (scFv) o un anticuerpo de dominio (dAb).
Por lo tanto, el conjugado normalmente tiene el siguiente formato:
[elemento de unión específico]-[primera subunidad]-[segunda subunidad]-[elemento de unión específico]
en donde los elementos de unión específicos son moléculas de anticuerpos scFv o dAb. Las moléculas de anticuerpos de cadena simple Fv (scFv) se prefieren particularmente en la presente invención, debido a su pequeño tamaño, que proporciona ventajas fisiológicas y terapéuticas para el uso in vivo de los conjugados. Además, un scFv con falta de región Fc, reduce potencialmente las reacciones antiidiotípicas y también minimiza las propiedades indeseables relacionadas con la activación del complemento y la interacción con los receptores Fc que pueden dificultar la localización tumoral y la activación de células no específicas.
Así, un formato preferido del conjugado es:
[ScFv]-[primera subunidad]-[segunda subunidad]-[ScFv]
Alternativamente, el elemento de unión específico puede ser un único anticuerpo de dominio. Los elementos de unión específicos y las moléculas de anticuerpos se describen con más detalle a continuación.
El conjugado puede ser o puede comprender una proteína de fusión, es decir, un polipéptido que es un producto de traslación resultante de la fusión de dos o más genes o secuencias de codificación de ácido nucleico en un marco de lectura abierta (ORF). Los productos de expresión fundidos de los dos genes o ORFs se puede conjugar mediante un enlace de péptido (un tramo de residuos de aminoácidos corto 2 a 20, preferiblemente 2 a 15). En una realización, el enlace de péptido es una secuencia de 6-residuos GSADGG (SEQ ID NO: 15). La proteína de fusión puede comprender la secuencia de péptido señal, normalmente situado antes (5') del elemento de unión específico y subunidad.
En los conjugados de la invención, la primera y segunda subunidades están generalmente enlazadas, por ejemplo pueden estar enlazadas de manera covalente, por ejemplo, a través de uno o más enlaces de disulfuro. La primera y segunda subunidades en el conjugado podrán asociarse entre sí en su forma natural. La invención, por lo tanto, permite el uso y el mantenimiento de un formato natural de la proteína IL-12 en el conjugado. Esto evita cualquier necesidad de construir o utilizar una variante de cadena única del fármaco y aumenta el potencial del fármaco para conservar su plena actividad en el conjugado. Además, la conjugación entre las subunidades permite construir el conjugado convenientemente y montarse al permitir que la primera y segunda subunidades se asocien (dimericen) en el oligómero. Por lo tanto, la primera y segunda subunidades pueden, cada una, conjugarse en un miembro de unión específico, formando un par construcciones de elementos de unión específicos y subunidades (heterodímeros) que se asocian a través de las subunidades. En una realización preferida, la primera subunidad se conjuga en un elemento de unión específico como una primera proteína de fusión, y la segunda subunidad se conjuga en un elemento de unión específico como segunda proteína de fusión.
Preferentemente, el conjugado tiene un peso molecular de 250 kDa o menos, más preferiblemente 200 kDa, 150 kDa, 125 kDa, 120 kDa o 115 kDa o menos (es decir, un Mr de o menor de 250 000, 200 000, 150 000, 125 000, 120 000 o 115 000). Este puede ser el peso molecular real medido (con o sin glicosilación), o un valor estimado a partir de, por ejemplo, el peso molecular esperado del conjugado (con o, normalmente, sin) glicosilación. Un tamaño relativamente pequeño del conjugado aumenta su capacidad de penetrar en los tejidos y acceder al sitio diana (por ejemplo, el sitio de la angiogénesis, un tumor o enfermedad), aumentando así su eficacia terapéutica y reduciendo de la dosis requerida, sin dejar de lograr una unión multivalente (generalmente bivalente) del conjugado con el objetivo.
En general, el elemento de unión específico se selecciona de acuerdo con el uso previsto del conjugado. Como se mencionó anteriormente, IL12 es adecuado para tratar el cáncer, inhibir el crecimiento tumoral y la metástasis, y para tratar otras condiciones asociadas con la angiogénesis patológica. Uno o ambos elementos de unión específica de un conjugado pueden unirse específicamente a un marcador asociado con crecimiento neoplásico y/o angiogénesis (especialmente tumor), por ejemplo, un marcador situado en el sitio del crecimiento neoplásico y/o angiogénesis. Los componentes de la matriz extracelular pueden ser marcadores de crecimiento neoplásico y/o angiogénesis, ya que la matriz extracelular se remodela durante estos procesos.
Un ejemplo es la isoforma B-FN de la fibronectina que, como se explicó anteriormente, contiene un dominio extra ED-B. Un elemento de unión específico de la invención preferentemente se une específicamente a ED-B de la isoforma B-FN de fibronectina. El elemento de unión específico puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias VH CDR1 (SEQ ID NO: 25), VH CDR2 (SEQ ID NO: 26) y/o CDR3 VH (SEQ ID NO: 27) de L19 y/o las secuencias VL CDR1 (SEQ ID NO: 28), VL CDR2 (SEQ ID NO: 29) y/o VL CDR 3 (SEQ ID NO: 30) de L19. Por ejemplo, el elemento de unión específica puede ser un scFv tener un dominio VH con una secuencia de aminoácidos que comprende VH CDR1, CDR2 VH y/o CDR3 VH de L19, y un dominio VL con una secuencia de aminoácidos que comprende VL CDR1, VL y CDR2/o VL CDR3 de L19. Un elemento de unión específico puede comprender un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de L19 de dominio VH según lo establecido en SEQ ID NO: 22, y/o comprende un dominio VL con una secuencia de aminoácidos con al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, el 95% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de L19 de dominio VL según lo establecido en SEQ ID NO: 23. Preferiblemente, el elemento de unión específico es un scFv (L19) que contiene un dominio VH L19 (SEQ ID NO: 22) y un L19 de dominio VL (SEQ ID NO: 23). En una realización preferida, el elemento de unión específico es scFv (L19) que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 (Figura 10).
Otro ejemplo es la tenascina-C (CNC), que existe en diferentes isoformas. En los tejidos neoplásicos TnC contienen dominios adicionales se expresan de manera más extendida que en los tejidos normales, especialmente las isoformas que contienen dominio C (cTN C-) [33]. Por lo tanto, un elemento de unión específico en los conjugados de la invención puede unirse específicamente a isoformas de tenascina-C asociadas con los tejidos neoplásicos, especialmente cTN-C. El elemento de unión específico puede ser TN11 scFv que tiene una secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 21 (Figura 11) [33].
El elemento de unión específico en conjugados de la invención, alternativamente, puede unirse a otros antígenos asociados al tumor, es decir, antígenos más frecuentes en un ambiente tumoral (tal como una célula tumoral) que en un entorno celular normal (tal como en células no tumorales).
Normalmente, los dos elementos de unión específicos en un conjugado son idénticos, o por lo menos los dos específicos para el mismo objetivo, antígeno o epítope.
En una realización particularmente preferida de la invención, el conjugado comprende un heterodímero IL12 humano conjugado entre dos elementos de unión específicos, preferentemente scFv (L19); en el que
el heterodímero tiene una primera (normalmente p40) subunidad y una segunda (normalmente p35) subunidad;
la primera o subunidad p40 está conjugada con un primer elemento de unión específico como una primera proteína de fusión;
la segunda o subunidad p35 está conjugada con un segundo elemento de unión específico como segunda proteína de fusión,
en donde los elementos de unión específicos son moléculas de anticuerpos scFv o dAb.
Como se señaló anteriormente, la primera y segunda subunidades están típicamente enlazadas de manera covalente, por ejemplo, unidas con disulfuro.
Preferiblemente, la primera o subunidad p40 se fusiona en el N-terminal con el elemento de unión específico, es decir, la subunidad está antes del elemento de unión específico en la proteína de fusión y en el ácido nucleico que la codifica. De esta forma, el N-terminal de p40, por lo tanto, puede ser libre (no fundido), que se cree que maximiza su actividad.
Preferiblemente, la segunda o subunidad p35 se fusiona en el C-terminal con el elemento de unión específico, es decir, la subunidad está después del elemento de unión específico de la proteína de fusión y en el ácido nucleico que la codifica. Esto puede aumentar la expresión de la proteína de fusión, ya que el elemento de unión específico, especialmente con un péptido de señal N-terminal anterior, se puede expresar fácilmente y así permitir la expresión eficiente de la proteína de fusión.
Preferiblemente, la primera proteína de fusión tiene la secuencia de aminoácidos de p40-scFv (L19) como se muestra en SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la segunda proteína de fusión tiene el aminoácido de scFv (L19)-p35, como se muestra en SEQ ID NO: 2.
Los conjugados de la invención pueden producirse en cualquier procedimiento disponible, por ejemplo, utilizando técnicas recombinantes, por ejemplo, expresando la totalidad o parte del conjugado como una proteína de fusión.
Por ejemplo, un conjugado se puede producir en un procedimiento que comprende:
expresar una primera proteína de fusión que comprende la primera subunidad y un elemento de unión específico;
expresar una segunda proteína de fusión que comprende la segunda subunidad y un elemento de unión específico; y
conjugar la primera y segunda subunidades.
Normalmente, el procedimiento comprende la purificación de la primera y segunda proteínas de fusión después de la expresión.
Normalmente, la expresión se realiza en una célula huésped que contiene ácido nucleico que codifica la proteína de fusión, por ejemplo, una célula eucariota cultivada, tal como HEK o una célula CHO, o una célula bacteriana, tal como Escherichia coli. La expresión, por lo tanto, comprende el cultivo de dicha célula huésped. Cuando la primera y segunda proteínas de fusión se expresan en la misma célula (por ejemplo, una célula co-transfectada con o que contiene ácidos nucleicos que codifican las dos proteínas de fusión), puede producirse la heterodimerización u oligomerización de las subunidades en la célula o durante la purificación de las proteínas de fusión de la célula. En otros casos, la primera y segunda proteínas de fusión se puede expresar por separado (por ejemplo, en diferentes células) y entonces llevarlas
juntas (combinadas) de manera que la primera y segunda subunidades se heterodimericen o asocien de otra manera.
La conjugación de las subunidades juntas puede ser un proceso activo o pasivo. La conjugación puede comprender exponer o someter la primera y segunda proteínas de fusión a condiciones en las que la primera y segunda subunidades se conjugan entre sí (por ejemplo, asociadas u oligomerizadas/heterodimerizadas). La conjugación puede comprender la formación de enlaces disulfuro entre las subunidades, o la formación de otro enlace covalente. La conjugación tal como la formación de enlaces disulfuro se puede producir en condiciones no reductoras, y por lo tanto la conjugación puede comprender la exposición de la primera y segunda proteínas de fusión a condiciones no reductoras.
Los procedimientos adecuados para expresar las proteínas de fusión y producir conjugados de acuerdo con la invención se presentan en detalle en los siguientes ejemplos.
Como etapa adicional, el procedimiento puede comprender la formulación de los conjugados en una composición farmacéutica. Generalmente esto implica la purificación del conjugado y su combinación con un portador fisiológicamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas se describen con más detalle a continuación.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican los conjugados y sus partes (por ejemplo, las proteínas de fusión de codificación) también forman parte de la invención.
En un aspecto, la invención es una composición que comprende
una primera molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende un scFv o dAb y una subunidad IL-12 p40; y
una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende un scFv o dAb y una subunidad IL-12 p35.
La molécula de ácido nucleico puede codificar un péptido de enlace entre el elemento de unión específico y la subunidad, de manera que en la proteína de fusión el elemento de unión específico y la subunidad están unidos por el enlace de péptido. Las proteínas de fusión particulares, subunidades, elemento de unión específico, y enlaces que se pueden codificar se describen con más detalle aquí en cualquier lugar. La primera y segunda subunidades son subunidades heterodiméricas IL12 (subunidades p40 y p35), respectivamente, y, preferentemente, el elemento de unión específico es un scFv, especialmente scFv(L19). En una realización, la primera molécula de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos de IL12p40-scFv(L19) que figura en la SEQ ID NO: 1 y/o la segunda molécula de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos de scFv (L19)-IL12p35 indicada en la SEQ ID NO: 2.
La molécula de ácido nucleico puede ser un vector, por ejemplo, un plásmido adecuado para la expresión de la secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, la primera y segunda moléculas de ácido nucleico pueden ser el primer y segundo vectores. Normalmente, la secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada con un elemento regulador, tal como promotor para la transcripción.
La primera y segunda moléculas de ácido nucleico pueden estar contenidas en una célula huésped, que puede ser una célula cotransfectada con moléculas de ácido nucleico o una hija de esa célula. Las células, especialmente las células eucariotas, por ejemplo, células HEK y CHO, o células bacterianas, por ejemplo Escherichia coli, que contienen las moléculas de ácido nucleico también forman parte de la invención.
Después de expresión de los ácidos nucleicos, las proteínas de fusión pueden conjugarse a través de las subunidades para formar conjugados de la invención, tal como se describe aquí en cualquier lugar.
Los conjugados según la invención pueden ser utilizados en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal, tal como un procedimiento de tratamiento (que puede incluir el tratamiento profiláctico) de una enfermedad o trastorno en un paciente (normalmente un paciente humano) que comprende la administración del conjugado al paciente.
Las condiciones tratables con los conjugados incluyen cáncer, otros tumores y enfermedades neoplásicas. Los conjugados pueden usarse para inhibir la angiogénesis y, por lo tanto, tratar artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, angiomas y tumores, incluyendo el cáncer. El tratamiento puede incluir tratamiento profiláctico. Los conjugados también pueden administrarse en procedimientos de diagnóstico, por ejemplo, localización y diagnóstico de la angiogénesis, que puede estar asociada con cualquiera de las condiciones anteriores.
En consecuencia, otros aspectos de la invención proporcionan compuestos para su uso en procedimientos de tratamiento que comprenden la administración de un conjugado de la invención, composiciones farmacéuticas que comprenden un conjugado, y la utilización de este conjugado en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una condición o enfermedad, por ejemplo, en un procedimiento de fabricación de un medicamento o composición farmacéutica que comprende la formulación del conjugado con un portador o excipiente fisiológicamente acepta-
ble.
De acuerdo con la invención, las composiciones previstas se pueden administrar a un paciente. La administración es preferentemente en una "cantidad terapéuticamente efectiva", lo cual es suficiente para mostrar un beneficio para el paciente. Dichos beneficios pueden ser por lo menos la mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada, y la velocidad y transcurso temporal de la administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que está siendo tratado. La prescripción de tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificación, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros médicos. Las dosis adecuadas de anticuerpos son bien conocidas en la técnica [26, 27].
Los conjugados de la invención, los que comprenden un dominio de unión antígeno-anticuerpo, se pueden administrar a un paciente en necesidad de tratamiento por cualquier vía adecuada, usualmente mediante inyección en el torrente sanguíneo y/o directamente en el sitio a tratar, por ejemplo, el tumor o la vasculatura tumoral. La dosis precisa y su frecuencia de administración dependerán de una serie de factores, la vía de tratamiento, el tamaño y la ubicación de la zona a tratar (tumor, por ejemplo), la naturaleza precisa de los anticuerpos (por ejemplo, molécula scFv), y la naturaleza de cualquier marca detectable u otra molécula contenida en el conjugado.
Una composición se puede administrar en solitario o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultánea o secuencialmente dependiendo de la condición a tratar. Otros tratamientos pueden incluir la administración de dosis adecuadas de fármacos para aliviar el dolor, tales como fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (por ejemplo, aspirina, paracetamol, ibuprofeno o quetoprofeno) u opiáceos tales como morfina, o antieméticos.
Así, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, y para la utilización según la presente invención, pueden comprender, además del ingrediente activo (conjugado), un excipiente farmacéuticamente aceptable, portador, tampón, estabilizador u otros materiales conocidos por los expertos en la técnica. Estos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral o por inyección, por ejemplo, por vía intravenosa. Para la inyección intravenosa o inyección en el sitio de la aflicción, el ingrediente activo será en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que está libre de pirógenos y tiene un pH adecuado, isotonicidad y estabilidad.
La proteína IL-12 puede ser interleucina-12 (IL12) nativa o recombinante. IL12 útil en la invención puede ser derivado de cualquier animal, por ejemplo, humano, roedor (por ejemplo, rata, ratón), caballo, vaca, cerdo, oveja, perro, etc. Se prefiere IL12 humano en conjugados para la administración a humanos. IL12 se produce naturalmente como proteína heterodimérica compuesta de una subunidad de 40 kDa (p40) y una subunidad de 35 kDa (p35). Los pesos moleculares reales de las subunidades pueden variar, por ejemplo, cuando se expresan en las distintas especies y en función de si la proteína es glucosilada y del patrón de glicosilación. Los términos "p40" y "P35", por lo tanto, no implican que las subunidades tengan pesos moleculares de exactamente 40 y 35 kDa respectivamente. En su lugar, estos términos se utilizan para identificar y distinguir las dos subunidades heterodiméricas de IL12, que se pueden definir con mayor precisión en términos de sus secuencias de aminoácidos. IL12 heterodimérico comprende una primera y una segunda subunidades polipeptídica homólogas o idénticas a la subunidad p40 y a la subunidad p35 de IL12 humano, respectivamente. Típicamente, la primera subunidad de IL12 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la subunidad de IL12 humano p40 que se indica en la SEQ ID NO: 3. Típicamente, la segunda subunidad de IL12 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la subunidad de IL12 humano p35, tal como se indica en la SEQ ID NO: 4. IL12 en conjugados de la invención mantiene una actividad biológica de IL12, por ejemplo, una capacidad de actuar como factor de crecimiento para células T y NK activadas, para mejorar la actividad lítica de células asesinas NK/activadas con linfocinas, para estimular la producción de IFN-\gamma mediante PMBC restante, para inhibir la angiogénesis (por ejemplo, a través del mediador IP-10 posterior), y/o para inhibir el crecimiento tumoral y/o la metástasis.
Un elemento de unión específico es un elemento de un par de moléculas que tiene especificidad de unión entre sí. Los elementos de una pareja de unión específica pueden ser de origen natural o producirse total o parcialmente de forma sintética. Un elemento del par de moléculas tiene un área sobre su superficie, o una cavidad, que se une específicamente y, por lo tanto, es complementaria a una determinada organización espacial y polar del otro elemento del par de moléculas. Así, los elementos de la pareja tienen la propiedad de unirse específicamente entre sí.
El elemento de unión específico comprende una molécula de anticuerpo scFv o dAb.
El tamaño pequeño de un elemento de unión específico puede conferir propiedades fisiológicas útiles, tales como la capacidad de entrar en las células, penetran profundamente en los tejidos o alcanzar objetivos dentro de otras estructuras, o de unirse a la proteína dentro de las cavidades del antígeno objetivo.
Las estructuras y las ubicaciones de los dominios de inmunoglobulina variable pueden determinarse en referencia a Kabat et al. [35], y sus actualizaciones, ahora disponibles en Internet (http://immuno.bme.nwu.edu o encontrar "Kabat" por medio de cualquier motor de búsqueda).
Una molécula de anticuerpo es una inmunoglobulina, ya sea natural o producida parcial o totalmente de manera sintética. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que comprende un sitio de unión con el antígeno anticuerpo.
Es posible tener anticuerpos monoclonales y otros y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que mantienen la especificidad del anticuerpo original. Estas técnicas pueden implicar la introducción de ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina o los CDRs, de un anticuerpo en las regiones constantes, o regiones constantes más regiones de marco, de una inmunoglobulina diferente [37, 38, 39]. Un hibridoma u otra célula que produzca un anticuerpo pueden estar sujetas a mutación genética u otros cambios, que pueden o no pueden alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.
Como los anticuerpos pueden modificarse de muchas maneras, el término "molécula de anticuerpo" debe entenderse que cubra cualquier elemento de unión específico o sustancia que tenga un sitio de unión con el antígeno anticuerpo con la especificidad requerida. Por lo tanto, este término cubre fragmentos de anticuerpos y derivados, incluyendo cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión de antígeno anticuerpo, ya sea natural o total o parcialmente sintético. Las moléculas quiméricas que comprenden un sitio de unión de antígeno anticuerpo, o equivalente, fusionados a otro polipéptido están, por lo tanto, incluidas. La clonación y la expresión de los anticuerpos quiméricos son bien conocidas [40, 41].
Otras técnicas disponibles en la técnica de la ingeniería de anticuerpos han hecho posible aislar anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, hibridomas humanos pueden hacerse tal como se describió previamente [36]. Visualización de fagos, otra técnica establecida para la generación específica de elementos de unión ha sido descrita en detalle [36, 42]. Se pueden usar ratones transgénicos en los que los genes del anticuerpo del ratón se inactivan y se reemplazan funcionalmente con genes de anticuerpos humanos, dejando intactos los otros componentes del sistema inmune del ratón, para aislar los anticuerpos humanos [43].
Se pueden crear moléculas sintéticas de anticuerpos mediante expresión de los genes generados por medio de oligonucleótidos sintetizados y unidos con vectores de expresión adecuados [44, 45].
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Se ha demostrado que scFv o dAb pueden realizar la función de los antígenos de unión. Se eligen en conjugados de la invención, debido a su pequeño tamaño e interacción minimizada con otras moléculas y receptores (por ejemplo, receptor Fc). Particularmente preferidas son las moléculas Fv de cadena simple (scFv), donde un dominio VH y un dominio VL están unidos por un enlace péptido que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión del antígeno [46, 47]. scFv puede estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL [48].
Otro pequeño fragmento de anticuerpo de unión de antígeno es un dAb (anticuerpo de dominio), a saber, la región variable de un anticuerpo de cadena pesada o ligera [28]. dABs VH se encuentran naturalmente en camélidos (por ejemplo, camello, llama) y pueden producirse mediante la inmunización de un camélido con un antígeno objetivo, aislando las células B de antígeno específicas y clonando directamente los genes dAb de las células B individuales. dABs también se pueden producir en cultivos celulares. Su pequeño tamaño, buena solubilidad y estabilidad de temperatura las hacen especialmente útiles y adecuadas fisiológicamente para selección y maduración de afinidad.
Anticuerpos de dominio único, tal como dAbs, pueden utilizarse en la invención, y están disponibles comercialmente, por ejemplo por parte de Domantis, Phylos, Pieris y Affibody.
Un sitio de unión de antígeno es la parte de una molécula que se une y es complementaria a la totalidad o a parte del antígeno objetivo. En una molécula de anticuerpo que se conoce como sitio de unión de antígeno anticuerpo, y comprende la parte del anticuerpo que se une específicamente y es complementaria de la totalidad o a parte del antígeno objetivo. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo solamente puede unirse a una parte específica del antígeno, cuya parte se denomina un epítope. Un sitio de unión de antígeno anticuerpo puede proporcionarse por uno o más dominios variables de anticuerpos. Preferiblemente, un sitio de unión de antígeno anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo.
El término "específico" puede utilizarse para referirse a la situación en la que un elemento de un par de unión específico no mostrará ninguna unión significativa a otras moléculas de su(s) socio(s) de unión específico(s). El término también es aplicable cuando por ejemplo, un sitio de unión de antígeno es específico para un epítope particular que es llevado por una serie de antígenos, en cuyo caso el elemento de unión específico que lleva el sitio de unión de antígeno será capaz de unirse a los diversos antígenos que llevan el epítope.
L19 es un anticuerpo recombinante humano específico para el dominio ED-B de la isoforma de fibronectina B-FN. Este anticuerpo y su secuencia se han descrito previamente [20]. Fv de cadena simple L19 también se ha descrito, y se utiliza preferentemente en los conjugados de la invención. ScFv(L19) es un scFv que comprende un dominio VH de L19 y un dominio VL de L19, en la que el VH y VL se conjugan en una sola cadena polipeptídica mediante una secuencia de enlace de péptidos. El dominio VH contiene secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 VH, y el dominio VL contiene secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 VL, tal como se muestra en la Figura 10. La secuencias L19 CDR son:
1
El dominio VH puede tener una secuencia de aminoácidos que figura en la SEQ ID NO: 22, y el dominio VL puede tener una secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 23 (Figura 10). Los dominios VH y VL están normalmente unidos mediante un enlace de péptido como el enlace de residuos 12 SEQ ID NO: 24 (Figura 10). Preferiblemente, el scFv(L19) tiene la secuencia de aminoácidos que figura en la SEQ ID NO: 5.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 (A) muestra scIL12-scFv (L19); (B) muestra homodímero scIL12-SIP (L19); (C) muestra heterodímero p40-scFv (L19)/scFv (L19)-p35.
La Figura 2 (A) muestra el análisis de SDS-PAGE de la proteína de fusión scIL12-scFv (L19) en condiciones de reducidas y no reducidas; (B) muestra el perfil de la filtración en gel de la proteína de fusión scIL12-scFv (L19) en condiciones nativas mostrando dímeros.
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La Figura 3 muestra la localización in vivo de scIL12-scFv (L19) evaluado con experimentos de biodistribución. La acumulación se expresa en % de dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g) después de (A) 4 y (B) 24 h. Los tejidos representados son (de izquierda a derecha): tumor, bazo, hígado, pulmón, corazón, intestino, sangre y riñones.
La Figura 4 (A) muestra el análisis de SDS-PAGE de la proteína de fusión scIL12-SIP (L19) bajo condiciones reducidas y no reducidas; (B) muestra el perfil de filtración en gel de la proteína de fusión scIL12-SIP (L19) en condiciones nativas, que demuestren que es un dímero.
La Figura 5 muestra la localización in vivo de scIL12-SIP (L19) evaluado con experimentos de biodistribución y la acumulación expresada en % de dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g) después de (A) 4 y (B) 24 h. Los tejidos representados son (de izquierda a derecha): tumor, bazo, hígado, pulmón, corazón, intestino, sangre y riñones.
La Figura 6 (A) muestra el análisis SDS-PAGE de la proteína de fusión p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 bajo condiciones reducidas y no reducidas; (B) muestra el perfil de filtración en gel de la proteína de fusión p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 en condiciones nativas demostrando ser un dímero.
La Figura 7 muestra la localización in vivo de p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 evaluado con experimentos de biodistribución y la acumulación expresada en % de dosis inyectadas por gramo de tejido (%ID/g) después de (A) 4 y (B) 24 h. Los tejidos representados son (de izquierda a derecha): tumor, bazo, hígado, pulmón, corazón, intestino, sangre y riñones.
La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1. La secuencia contiene, desde el terminal N al C:
(i) un péptido de señal;
(ii) subunidad IL12 p40 humana (que se muestra partida subrayada - SEQ ID NO: 3);
(iii) enlace de péptido (SEQ ID NO: 15);
(iv) scFv(L19) (mostrado subrayado - SEQ ID NO: 5); y
(v) myc;
es decir, la señal de péptido humano p40-enlace-L19-myc. En la secuencia de ácido nucleico de codificación empleada, la etiqueta myc fue seguida por tres codones de detención.
La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2. La secuencia contiene, desde el terminal N al C:
(i) un péptido de señal;
(ii) scFv(L19) (mostrado subrayado - SEQ ID NO: 5);
(iii) enlace de péptido (SEQ ID NO: 15);
(iv) subunidad IL12 p35 humana (mostrada partida subrayada - SEQ ID NO: 4); y
(v) etiqueta 6His;
es decir, la señal de péptido-L19-enlace-p35 humano-6xHis. En la secuencia de ácido nucleico de codificación que usamos, las seis histidinas fueron seguidas por tres codones de detención.
La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de scFv(L19) (SEQ ID NO: 5). Los dominios VH y VL se muestran por separado (SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23, respectivamente). Las secuencias CDR1, 2 y 3, en los dominios VH y VL se muestran subrayadas. Los dominios VH y VL están separados por una secuencia de enlace de 12 residuos de péptidos (SEQ ID NO: 24).
La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos de anti-tenascina-C scFv TN11 (SEQ ID NO: 21).
Aspectos y realizaciones de la invención se ejemplifican ahora en la sección experimental siguiente.
Ejemplos
Aquí se describe la producción y la caracterización de conjugados IL12-L19 en tres formatos diferentes, demostrando la marcada superioridad del formato tal como se reivindica aquí para la localización in vivo.
Los tres formatos, tal como se ilustra en la Figura 1 A, B y C, respectivamente, son scIL12-scFv(L19), homodímero scIL12-SIP (L19) y heterodímero p40-scFv(L19)/scFv (L19)-p35.
scIL12-scFv(L19), mostrado en la Figura 1 A, es una proteína de fusión de scIL12 y scFv(L19). Este conjugado es monovalente respecto al sitio scFv único de unión al antígeno por molécula.
El homodímero scIL12-SIP(L19), representado en la figura 1 B, es un homodímero de dos proteínas de fusión, conteniendo cada proteína de fusión scIL12, scFv(L19) y el dominio CH4 de IgE humana, respectivamente. El conjugado se dimeriza a través de enlaces de disulfuro entre los dos dominios CH4, formando un mini-anticuerpo o estructura SIP. Este conjugado es bivalente, debido a la presencia de dos sitios de unión de antígeno scFv(L19) por molécula.
El heterodímero p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35, que se muestra en la Figura 1 C, es un heterodímero de dos proteínas de fusión diferentes. La primera proteína de fusión contiene la subunidad p40 IL12 humana fusionada en el terminal N del scFv (L19) a través de un enlace de péptido de 6 aminoácidos GSADGG (SEQ ID NO: 15). La segunda proteína de fusión contiene scFv(L19) fusionada en el extremo N terminal de la subunidad p35 IL12 humana a través de un enlace de péptiudo de 6 aminoácidos GSADGG (SEQ ID NO: 15). Las dos proteínas de fusión se heterodimerizan a través de enlaces de disulfuro entre la subunidad p40 y p35, para formar el p40-scFv(L19)/scFv (L19)-p35 heterodimérico. El conjugado es bivalente, debido a la presencia de dos sitios de unión de antígeno scFv(L19) por molécula.
scIL12-scFv(L19), sin una etiqueta FLAG
Como la proteína de fusión original tal como se describió previamente [15] fue clonada con una etiqueta FLAG terminal C ("scIL12-scFv(L19)-FLAG"), debemos considerar la posibilidad de que la etiqueta FLAG que contiene tirosina puede contribuir a artefactos en experimentos de biodistribución. Cuando las tirosinas de la proteína están radiomarcadas, la tirosina expuesta al solvente de la etiqueta FLAG se puede yodar también. La etiqueta FLAG se podrá proteolizar posteriormente in vivo. Con el fin de estudiar mejor las propiedades de la localización tumoral de esta proteína de fusión, hemos clonado y expresado proteína de fusión scIL12-scFv(L19) sin una etiqueta FLAG.
Clonación y expresión de scIL12-scFv(L19)
El fragmento de ADN de scIL12-scFv(L19) fue amplificado utilizando el vector pCH33 que contiene el gen para scIL12-scFv(L19)-FLAG [15] como plantilla. La reacción de PCR se realizó con el iniciador sp40backEco (5' ccg gaattc atg tgt cct cag aag cta acc atc 3') (SEQ ID NO: 6), que se recuece en la secuencia de secreción endógena de p40 y agrega un sitio de restricción para la endonucleasa EcoR1 en su extremo 5', y el cebador L19stopNotfor (5' ttt tcc ttt t gcggccgc cta tca tca ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3') (SEQ ID NO: 7) agregando 3 codones de detención seguidos por un lado la restricción para la endonucleasa Not1 en el extremo 3' de la proteína de fusión scIL12-L19, y con ello eliminar la etiqueta FLAG. El fragmento de ADN se clonó en el vector de expresión de célula de mamífero del vector pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Basilea, Suiza), utilizando los sitios de restricción EcoR1 y Not1 del vector.
293 células HEK fueron transfectadas con el vector y se seleccionaron transfectantes estables en presencia de G418 (500 \mug/ml). Los clones de células resistentes a G418 fueron cribadas para la expresión de la proteína de fusión por ELISA, utilizando dominio recombinante ED-B de la fibronectina humana como antígeno. La proteína de fusión se purificó del medio de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad sobre columna de antígeno, tal como se describió previamente [19, 20] y se desaló mediante diálisis durante la noche a 4ºC. La proteína de fusión se congeló en alícuotas a -20ºC. El tamaño de la proteína de fusión scIL12-scFv(L19) fue analizada bajo condiciones de reducción y no reducción sobre SDS-PAGE y bajo condiciones nativas mediante filtración de gel FPLC en una columna Superdex S-200 (Amersham Pharmacia Biotech) (Figura 2). A diferencia de la proteína de fusión original monomérica scIL12-scFv(L19)-FLAG, aproximadamente un tercio de la fracción de la proteína IL12-L19 mostró ser un dímero.
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Caracterización de scIL12-scFv(L19)
La localización in vivo de scIL12-scFv(L19) sin una etiqueta FLAG fue evaluado con experimentos de biodistribución. Por lo tanto, la fracción monomérica de la proteína de fusión se purificó por filtración en gel FPLC sobre una columna Superdex S-200. La fracción fue yodada inmediatamente después de la purificación e inyectada en ratones inmunocompetentes 129SvEv teniendo tumores murinos teratocarcinoma F9. Los ratones fueron sacrificados 4 y 24 horas después de la inyección, los órganos fueron pesados y se contó la radioactividad. La acumulación en órganos representativos y el tumor fue expresado en % de dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g) (Figura 3). Después de 24 horas no se pudo observar acumulación en el sitio del tumor. Por lo tanto, consideramos que la etiqueta FLAG no molestó a los resultados de la biodistribución.
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Homodímero scIL12-SIP (L19)
Las propiedades de localización de tumores de scFv (L19) se ha demostrado que se mejoran cuando scFv(L19) fue dimerizado gracias al dominio CH4 de IgE humana, creando una estructura de mini-anticuerpo, también llamada "pequeña proteína inmune" o SIP. Las propiedades de localización de los tumores de SIP(L19) se han descrito previamente [21]. Por lo tanto, se construyó un homodímero de scIL12-SIP(L19) para probar si este formato también mejoraría la localización de IL12 en los tumores.
Construimos la proteína de fusión scIL12-SIP(L19) por fusión del dominio CH4 de una inmunoglobulina IgE humana en el c-terminal de la proteína de fusión scIL12-scFv(L19)-FLAG [22].
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Clonación y expresión de homodímero scIL12-L19-SIP
La fusión del dominio CH4 en el C-terminal del fragmento scIL12-L19 se realizó mediante una ronda de PCR e insertando el fragmento de PCR en un vector que ya contiene el dominio CH4.
El fragmento scIL12-scFv(L19) se amplificó a partir del vector pCH33 que contiene el gen para scIL12-scFv(L19)-FLAG [15]. Los sitios de restricción se intercambiaron con el cebador sp40backHind (5'ccgta aagctt atg cct cag tgt aag cta acc atc 3') (SEQ ID NO: 8) de recocido en el extremo 5' de la secuencia de secreción p40 y cambia EcoR1 a un sitio de restricción HindIII, y el prímero L19forAgelBsp (5' tgt ggg accggt ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3') (SEQ ID NO: 9) de recocido en el extremo 3', eliminando la etiqueta FLAG e introduciendo un sitio de restricción Age1 que proporciona extremos cohesivos con BspE1. Una vez ligado, el sitio de restricción Age1/BspE1 no se puede volver a separar más con BspE1. Esta etapa es necesaria porque la secuencia scIL12 contiene un sitio de restricción BspE1. Usando las endonucleasas HindIII y BspE1, el fragmento fue clonado ahora en un vector de expresión de célula de mamífero pcDNA3.1(+), que ya contiene un dominio CH4 con un sitio de restricción BspE1 en su extremo 5' [21].
El procedimiento de transfección, expresión y purificación para la scIL12-SIP(L19) se realizó tal como se describe anteriormente para la proteína de fusión scIL12-scFv(L19). El tamaño de la proteína de fusión IL12-SIP(L19) se analiza también bajo condiciones de reducción y de no reducción sobre SDS-PAGE y bajo condiciones nativas por filtración de gel sobre una columna FPLC Superdex S-200 (Figura 4).
Caracterización del homodímero scIL12-SIP(L19)
La proteína scIL12-SIP(L19) se purificó en una segunda etapa en una filtración en gel en columna Superdex S-200 y la fracción de dímero de radio se yodó inmediatamente después de su recogida. La proteína marcada se inyectó en ratones inmunocompetentes 129SvEv soportando tumores murinos teratocarcinoma F9. Los ratones fueron sacrificados 4 y 24 horas después de la inyección, los órganos fueron pesados y se contó la radioactividad. La acumulación en órganos representativos y el tumor fue expresado en % de dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g) (Figura 5). Aunque la proteína scIL12-SIP(L19) mostró una unión mejorada a ED-B en Biacore, no se pudo observar una captación tumoral aumentada y la captación tumoral permaneció pobre.
Heterodímero p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35
El heterodímero p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 consiste en dos subunidades. Una contiene un fragmento scFv(L19), fundido en el extremo N-terminal de la subunidad p35 de IL12 (scFv(L19)-p35). En la segunda, la subunidad p40 de IL12 se funde en el extremo N-terminal de scFv(L19) (p40-scFv(L19)). Las proteínas de fusión generan entonces el p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 heterodimérico a través de las uniones disulfuro entre p40 y p35.
Este conjugado de proteína de fusión anticuerpo- citocina heterodimérica se espera que tenga un tamaño de 114 kD cuando no está glicosilada. Debido a los distintos estados de glicosilación, el peso molecular del conjugado puede variar en función de la especie en que se expresa, debido a diferentes patrones de glicosilación. Los tamaños teóricos de las proteínas de fusión, basados en la longitud de la secuencia de ADN sin glicosilación post-translacional, fue de 65 kDa para p40-L19, 49 kDa para L19-p35 y 114 kDa para el heterodímero p40-L19/L19-p35.
Clonación y expresión de p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35
Las dos subunidades p40-scFv(L19) y scFv(L19)-p35 fueron clonadas por separado en dos vectores diferentes, la primera conteniendo una etiqueta myc para la detección y la segunda conteniendo una marca his para la detección.
El fragmento p40-scFv(L19)-myc fue producido por unión PCR utilizando como plantillas el vector pCH33 que contiene el gen que codifica la proteína scIL12-scFv (L19)-FLAG [15] y el vector de PLB que contiene el gen que codifica el fragmento SIP (L19) [21]. Un primer fragmento A que contiene la fracción p40 se construyó utilizando pCH33 como una plantilla. La reacción PCR se realizó con un primer cebador HindSp40back (5' ccc aagctt atg tgt cct cag aag cta acc atc 3') (SEQ ID NO: 10) de recocido a la secuencia de secreción de la subunidad p40 de IL12 introduciendo un sitio de restricción para la endonucleasa HindIII en su extremo 5' y con un segundo cebador Sp40HaLifor ( 5' acc tcc atc agc gct tcc gga tcg gac cct gca gg 3') (SEQ ID NO: 11) de recocido al extremo 3' de p40, añadiendo una parte del enlace (GSADGG), que se fusiona con el segundo fragmento B. Este fragmento B que contribuye a la fracción scFv(L19) fue construido en 2 rondas de PCR, utilizando la plantilla pLB con un primer cebador LinkL19back (5' gga agc gct gat gga ggt gag gtg cag ctg ttg gag tc 3') (SEQ ID NO: 12) de recocido al extremo 5' de la scFvL19 añadiendo una parte del enlace (GSADGG) (SEQ ID NO: 15) y un segundo prímero L19mycstoBamfor (5' att cag atc ctc ttc tga gat gag ttt ttg ttc ttt gat ttc cac ctt ggt ttg 3') (SEQ ID NO: 13) de recocido al extremo 3' de scFv(L19) añadiendo un etiqueta myc C-terminal. Este fragmento se terminó en una segunda ronda de PCR utilizando el cebador LinkL19back y un tercer cebador mycstoBamfor (5' cgc ggatcc cta tca tca att cag atc ctc ttc tga gat ttt 3') (SEQ ID NO: 14) añadiendo 3 codones de detención y un sitio de restricción para BamH1 en el extremo 5' del fragmento B. Usando los dos fragmentos como plantillas, se realiza una unión de PCR con los cebadores HindSp40back y mycstoBamfor para fusionar el fragmento p40 con el N-terminal del fragmento de anticuerpo scFv(L19) conectado mediante el enlace flexible GSADGG produciendo el fragmento p40-GSADGG-L19-myc. Usando HindIII y BamH1 como sitios de restricción, se clonó el fragmento a continuación, en un vector de expresión de mamífero pcDNA3.1+/Hygro proporcionando una resistencia de higromicina para la selección. Las células CHO fueron transfectadas con el vector y fueron seleccionados transfectantes estables con higromicina (500 \mug/ml). Los clones positivos fueron cribados con ELISA usando ED-B recombinante como antígeno y anticuerpo anti-myc para la detección. La proteína fue expresada y purificada del medio de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad de antígeno, tal como se describió previamente [19, 20] y se desaló mediante diálisis durante la noche a 4ºC. La proteína de fusión se congeló en alícuotas a -20ºC: Un análisis de tamaño SDS PAGE mostró que la proteína era de un 50% de monómeros aproximadamente en dos estados diferentes de glicosilación y aproximadamente un 50% de homodímero [23].
El fragmento scFv(L19)-p35-His fue producido mediante unión PCR, así como utilizando los mismos plásmidos pCH33 y pLB como plantillas. Un primer fragmento C correspondiente a la fracción scFv(L19) fue construida a partir de la plantilla pLB con un primer cebador EcoLonSL19back (5' ccg gaattc gct tgt cga cca tgg gct g 3') (SEQ ID NO: 16) de recocido a la secuencia de secreción de scFvL19, introduciendo un sitio de restricción para la endonucleasa EcoR1 en su extremo 5' y un segundo cebador L19HaLifor (5' acc tcc agc gct tcc ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3') (SEQ ID NO: 17) de recocido al extremo 3' de scFv(L19), introduciendo una parte del enlace (GSADGG). Un segundo fragmento D que contienen la fracción p35 fue construido en dos rondas de PCR, utilizando la plantilla pCH33 con un primer cebador HaLip35back (5' gga agc gct gat gga ggt agg gtc att cca gtc tct gga 3') (SEQ ID NO: 18) de recocido en el extremo 5' de la subunidad p35 madura añadiendo una parte del enlace (GSADGG) a su extremo 5' y un segundo cebador p35hisfor (5' gtg atg gtg atg atg atg ggc gga gct cag ata gcc 3') (SEQ ID NO: 19) de recocido en el extremo 3' de la subunidad p35 añadiendo una etiqueta his. En una segunda ronda de PCR, se añadieron 3 codones de detención y un sitio de restricción para Not1 en el extremo 3' del fragmento D con usando el cebador HaLip35back y un tercer cebador p35hisstoNotlfor (5' ttt tcc ttt t gcggccgc cta tca tca gtg atg atg atg ggc 3') (SEQ ID NO: 20). La subunidad p35 de citocina se fusionó ahora con el c-terminal del fragmento scFv(L19) mediante unión PCR utilizando los cebadores EcoLonSL19back y p35hisstoNotlfor produciendo L19-GSADGG-p35-his. El fragmento fue clonado ahora en un vector de expresión de mamífero pcDNA 3.1 proporcionando una resistencia de neomicina utilizando los sitios de restricción EcoR1 y Not1. Las células HEK 293 fueron transfectadas y se seleccionaron transfectantes estables con G418 (500 \mug/ml). Las células transfectadas se cribaron para los clones resistentes que expresan la proteína de fusión mediante ELISA, utilizando EDB recombinante humano como antígeno y anticuerpos anti-his para la detección. La proteína de fusión se purificó a partir del medio de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad sobre una columna de antígeno tal como se describió previamente [19, 20] desalada mediante dialización durante la noche a 4ºC. Un análisis SDS PAGE mostró que la expresión sea muy débil y la proteína se mostró que consistía en monómeros, dímeros y oligómeros de mayor orden.
La cotransfección de las células HEK 293 con los dos vectores que codifican scFv(L19)-p35 y p40-scFv(L19) se realizó a continuación simultáneamente. La selección de transfectantes estables que contienen proteínas de fusión se realizó con G418 (500 \mug/ml) e higromicina (500 \mug/ml). Las células fueron cribadas para la expresión de ambas proteínas con ELISA usando EDB recombinante como antígeno y anticuerpo anti-myc, así como anticuerpo anti-his para la detección. Las proteínas de fusión fueron purificadas en una primera etapa mediante cromatografía de afinidad sobre una columna de antígeno ED-B como se describió previamente [19, 20] y se desaló por diálisis durante la noche a 4ºC. Esta primera fracción fue purificada a continuación en una segunda etapa en una columna HisTrap HP 1 ml Ni^{2+} (Amersham Biosciences) eliminando los fragmentos libres de p40-scFv (L19) no unidos en el heterodímero (p40-scFv (L19)/scFv (L19)-p35). Para el almacenamiento, se añadió un 0,1% de Tween 80 a la proteína, que se congeló a continuación, en alícuotas a -80ºC. Un análisis SDS PAGE mostró en condiciones no reducidas que la proteína era un dímero en dos estados de glicosilación y en condiciones reducidas los dos monómeros hetero de diferentes tamaños, donde el monómero p40-L19 aparece en sus dos estados diferentes de glicosilación. Mediante la realización de filtración en gel con una columna Superdex S-200, la proteína mostró ser un dímero puro bajo condiciones nativas (Figura 6).
Caracterización de p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35
El correcto plegamiento de la proteína de fusión y la construcción de las uniones disulfuro correctas se determinaron mediante la actividad de IL12 de la proteína heterodimérica purificada.
La actividad de IL-12 se determinó mediante la realización de un ensayo de proliferación de células T [24]. En resumen, los restantes monocitos de sangre periférica humana (CMSP) se cultivaron con mitógeno (fitohemaglutinina (PHA) y IL-2) durante 3 días y a continuación se incubaron con diluciones en serie de proteínas de fusión o IL-12 murino recombinante disponible comercialmente, como estándar (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Reino Unido). La proliferación se midió posteriormente mediante incorporación de [^{3}H]timidina.
Se realizaron experimentos de biodistribución con la proteína p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35, que se purificó en una columna de gelfiltration FPLC Superdex S-200 y se radioyodinó. La proteína marcada se inyectó en ratones inmunocompetentes 129SvEv teniendo tumores murinos teratocarcinoma F9. Los ratones fueron sacrificados 4 y 24 horas después de la inyección, los órganos fueron pesados y la radioactividad se contó. La acumulación en órganos representativos y el tumor fue expresado en % de dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g). Con el formato heterodimérico hemos logrado una captación tumoral de casi el 10% a las 24 horas (Figura 7).
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
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Claims (35)

1. Conjugado que comprende un heterodímero IL12 que tiene una primera y segunda subunidades, en el que la primera y segunda subunidades están cada una conjugada con una molécula de anticuerpo, en el que la molécula de anticuerpo es una cadena simple de Fv (scFv) o un anticuerpo de dominio (dAb).
2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que la primera y segunda subunidades de la proteína heterodimérica están enlazadas covalentemente a través de una unión de disulfuro.
3. Conjugado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la molécula de anticuerpo es una cadena simple de Fv (scFv).
4. Conjugado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo de dominio simple (dAb).
5. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera subunidad se conjuga a la molécula de anticuerpo como una primera proteína de fusión, y la segunda subunidad se conjuga a la molécula de anticuerpo como una segunda proteína de fusión.
6. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el conjugado tiene un peso molecular de 250.000 o menos.
7. Conjugado según la reivindicación 6, en el que el conjugado tiene un peso molecular de 150.000 o menos.
8. Conjugado según la reivindicación 7, en el que el conjugado tiene un peso molecular de 120.000 o menos.
9. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las dos moléculas de anticuerpo son idénticas.
10. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 9, que comprende un conjugado heterodímero IL12 humano a y entre dos moléculas de anticuerpo scFv o dAb; en donde
el heterodímero IL12 tiene una primera y una segunda subunidades;
la primera subunidad se conjuga en una molécula de anticuerpo scFv o dAb como una primera proteína de fusión; y
la segunda subunidad se conjuga en una molécula de anticuerpo scFv o dAb como una segunda proteína de fusión.
11. Conjugado según la reivindicación 10, en el que las dos moléculas de anticuerpo son scFv.
12. Conjugado según la reivindicación 10, en el que las dos moléculas de anticuerpo son dAbs.
13. Conjugado según la reivindicación 11, en el que la primera proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEQ ID NO: 1.
14. Conjugado según la reivindicación 10 o la reivindicación 13, en el que la segunda proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEQ ID NO: 2.
15. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que una o dos moléculas de anticuerpo se unen específicamente a un componente de matriz extracelular asociada con crecimiento neoplásico y/o angiogénesis.
16. Conjugado según la reivindicación 15, en el que el componente de matriz extracelular es fibronectina ED-B.
17. Conjugado según la reivindicación 16, en el que la molécula de anticuerpo es scFv(L19) que tiene un dominio VH que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27, y un dominio VL que comprende la secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30.
18. Conjugado según la reivindicación 17, en el que la molécula de anticuerpo es scFv(L19) que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEQ ID NO: 5.
19. Conjugado según la reivindicación 15, en el que el componente de matriz extracelular es una isoforma de tenascina-C.
20. Conjugado según la reivindicación 19, en el que la molécula de anticuerpo es scFv(TN11) que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEQ ID NO: 21.
21. Procedimiento de producción de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 20, que comprende:
expresar la primera y segunda proteínas de fusión; y
conjugar la primera y segunda subunidades para formar el heterodímero IL12.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, que comprende expresar la primera y segunda proteínas de fusión en una célula que contiene ácido nucleico que codifica las dos proteínas de fusión.
23. Procedimiento según la reivindicación 21 o la reivindicación 22, que también comprende formular el conjugado en una composición farmacéutica.
24. Composición que comprende
una primera molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende una molécula de anticuerpo scFv o dAb y una subunidad p40 IL12; y
una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende una molécula de anticuerpo scFv o dAb y una subunidad p35 IL12.
25. Composición según la reivindicación 24, en la que la molécula de anticuerpo es un scFv.
26. Composición según la reivindicación 24, en la que la molécula de anticuerpo es un dAb.
27. Composición según la reivindicación 24, en la que la molécula de anticuerpo es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20.
28. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en la que la primera y segunda moléculas de ácido nucleico son un primer y segundo vectores.
29. Célula huésped que contiene una primera y una segunda molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28.
30. Composición farmacéutica que comprende un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
31. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
32. Conjugado según la reivindicación 31 para su uso en la inhibición de la angiogénesis y/o el crecimiento neoplásico en un paciente.
33. Conjugado según la reivindicación 32 para su uso en el tratamiento de un tumor, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad o angioma.
34. Utilización de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20 en la fabricación de un medicamento para inhibir la angiogénesis y/o el crecimiento neoplásico en un paciente.
35. Utilización según la reivindicación 34, en el que el medicamento es para tratar un tumor, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad o angioma.
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