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ES2340472T3 - Procedimiento para estimar la cantidad de tipos celulares de neutrofilos especificos. - Google Patents

Procedimiento para estimar la cantidad de tipos celulares de neutrofilos especificos. Download PDF

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ES2340472T3 ES02780858T ES02780858T ES2340472T3 ES 2340472 T3 ES2340472 T3 ES 2340472T3 ES 02780858 T ES02780858 T ES 02780858T ES 02780858 T ES02780858 T ES 02780858T ES 2340472 T3 ES2340472 T3 ES 2340472T3
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Abstract

Un procedimiento para estimar in vitro la cantidad de células específicas en una muestra de un paciente, en el que se usan moléculas con especificidad celular para calcular el número de células específicas, que comprende a) extraer una alícuota de dicha muestra; y b) medir la concentración de dos moléculas con especificidad celular en dicha muestra extraída por medio de un ensayo inmunológico y determinar la relación entre las concentraciones de dichas moléculas, en el que las moléculas con especificidad celular son proteínas de neutrófilos.

Description

Procedimiento para estimar la cantidad de tipos celulares de neutrófilos específicos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la estimación de la cantidad de subtipos de células específicas, por ejemplo el número de ciertos subtipos de leucocitos, por medio de mediciones de proteínas únicas en extractos de sangre y otro material biológico. El conocimiento del número o cantidad de subtipos específicos de glóbulos blancos es importante en el diagnóstico clínico y la vigilancia de sujetos con enfermedades inflamatorias entre las que se incluyen enfermedad infecciosa, cáncer, alergia/asma, etc.
Antecedentes de la invención
La estimación del número de diversos leucocitos en la sangre y en otros fluidos corporales es una de las herramientas usadas más ampliamente en medicina. La forma tradicional de obtener esta información es el recuento y diferenciación de las células con un microscopio óptico. Esta técnica se complementa por el recuento automático en contadores de células basados en el principio de recuento del número de partículas en el fluido y la medición de diversos parámetros físicos tales como el tamaño y la dispersión hacia delante y lateral, pero también por tinción histoquímica de células. Una extensión de estas técnicas es el principio del citómetro de flujo en el que se usan anticuerpos para identificar células individuales basándose en sus antígenos de la superficie celular o por medio de su contenido de antígenos intracelulares después de la permeabilización de las células.
En el documento WO 00/58726 se describe un procedimiento para cuantificar la cantidad de leucocitos en sangre entera. Sin embargo, este procedimiento no cuantifica diferentes subtipos específicos de leucocitos respecto al número o relación.
Sumario de la invención
Existe la necesidad de ensayos fáciles de usar, baratos y fiables para estimar el número de diversos glóbulos blancos tales como neutrófilos y eosinófilos, en la sangre y en otros fluidos corporales, aplicables en el sitio de atención, ayudando de esta manera al médico en su toma de decisiones inmediata.
El presente inventor ha descubierto que la extracción de sangre entera con, por ejemplo, detergentes tales como CTAB (bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio) y la posterior medición por inmunoensayos específicos de las proteínas de neutrófilos MPO (micloperoxidasa), HNL (lipocalina de neutrófilos humanos) o lactoferrina, o las mediciones específicas de proteínas de eosinófilos tales como EPX (proteína x de eosinófilos) o EPO (peroxidasa de eosinófilos) identificarán de forma precisa el número de eosinófilos presentes en la sangre. La estimación del número de neutrófilos es útil en el diagnóstico y monitorización de sujetos con enfermedades inflamatorias tales como infecciones o enfermedades reumatoides, pero también junto con el tratamiento médico, en particular el tratamiento citostático, en el que puede producirse una reducción de la producción de neutrófilos, es decir, neutropenia como efecto adverso grave del tratamiento. La estimación del número de eosinófilos es útil en pacientes con enfermedad alérgica, enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades parasitarias y ciertos cánceres tales como la enfermedad de Hodking, pero también como un indicador general de enfermedad, ya que pueden aparecer números elevados de eosinófilos en varias enfermedades por razones desconocidas.
La invención se refiere a la estimación de poblaciones en diversas fases de maduración de células mieloides, ya que algunas proteínas intracelulares se producen principalmente por células inmaduras y otras proteínas principalmente por células más maduras.
De esta manera, la invención se refiere a un procedimiento para estimar in vitro la cantidad, refiriéndose la cantidad al número o relación de subtipos de células específicas en una muestra de un paciente, que comprende
a)
extraer una alícuota de dicha muestra; y
b)
medir la concentración de dos moléculas con especificidad celular en dicha muestra extraída mediante un ensayo inmunológico y determinar la relación entre las concentraciones de dichas moléculas,
en el que las moléculas con especificidad celular son proteínas de neutrófilos.
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La muestra preferentemente es sangre u otro fluido corporal. Se extrae una cantidad muy pequeña de muestra, tal como 1-10 \mul de muestra, pero podrían considerarse volúmenes mayores.
La extracción preferentemente se realiza con detergentes catiónicos. El tiempo de extracción es muy corto, por ejemplo, 1 minuto. Preferentemente, el detergente es CTAB.
\newpage
Preferentemente, la medición en la etapa b) es por medio de un inmunoensayo, tal como ELISA, EIA, FEIA o RIA.
La molécula o moléculas con especificidad celular son proteínas de neutrófilos tales como MPO (mieloperoxidasa), HNL (lipocaína de neutrófilos humanos) o lactoferrina para medir neutrófilos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describirá con más detalle a continuación en asociación con los dibujos adjuntos en los que
la Fig. 1 muestra una correlación entre el número de neutrófilos sanguíneos y la concentración de proteína MPO en sangre entera extraída con detergente.
La Fig. 2 muestra la relación entre MPO y lactoferrina en sangre entera extraída con detergente.
La Fig. 3 muestra una correlación entre el número de eosinófilos y la concentración de proteína EPO en sangre entera extraída con detergente.
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Sección experimental Aislamiento y purificación de proteínas de gránulos de eosinófilos y neutrófilos humanos
Se prepararon gránulos a partir de la capa leucocitaria de granulocitos obtenidos de donantes de sangre sanos usando una modificación del procedimiento descrito por Peterson y col. (Eur. J. Haematol. 40 (1988) 415-423). En resumen, los glóbulos rojos se dejaron sedimentar usando Dextrano T-500 antes de recoger el plasma rico en leucocitos. Los leucocitos se lavaron dos veces en Sacarosa 0,34 M y se suspendieron en 5 volúmenes de Sacarosa 0,34 M. Los leucocitos se cavitaron usando N_{2} a una presión de 750 psi (5,17 MPa) durante 30 min a +4ºC (Klempner y col., J. Cell. Biol. 86 (1980) 21-28; y Borregaard y col., J. Cell. Biol. 97 (1983) 52-61). El cavitado se suspendió en Sacarosa 0,34 M y NaCl 0,17 M y se centrifugó durante 20 min a 450 xg a +4ºC.
Es sobrenadante se centrifugó durante 20 min a 10.000 xg a +4ºC para sedimentar los gránulos. A partir de los extractos de gránulos se purificó mieloperoxidasa (MPO) de acuerdo con Olsson y col. (Scand. J. Haematol. 9 (1972) 483-491) y Cooray y col. (Vet. Immunol. Immunopathol. 38 (1993) 261-272). La preparación final fue completamente homogénea de acuerdo con la relación de absorbancia A430 nm/A280 nm, que fue 0,80 (Agner Acta. Chem. Scand. 12 (1958) 89-94).
Se purificó lipocalina de neutrófilos humanos (HNL) como se describe (Xu y col., Scand J Clin Lab Invest 54 (1994) 365-376). La HNL se purificó hasta la homogeneidad de acuerdo con la electroforesis en SDS-PAGE y tinción con plata y el antígeno no reaccionaba con anticuerpos contra las otras proteínas de neutrófilos, MPO; Lactoferrina, Catepsina G, Elastasa y Lisozima. La Lactoferrina se purificó como se describe (Reiter Int. J. Tissue React. 5 (1983) 87-96). La Peroxidasa de Eosinófilos (EPO) se purificó como se describe (Carlson y col. J. Immunol. 134 (1985) 1875-1879) y la preparación final fue homogénea de acuerdo con la relación de absorbancia A415 nm/A280 nm, que fue 1,15. La proteína de eosinófilos (EPX) se purificó hasta la homogeneidad como se describe (Peterson y col., Immunol. 50 (1983) 19-26). La preparación final aparecía como una banda en la electroforesis SDS-PAGE y no reaccionaba con anticuerpos contra la proteína catiónica de eosinófilos (ECP), elastasa, catepsina G, MPO y EPO.
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Producción de anticuerpos Anticuerpos policlonales
Se indujeron anticuerpos contra MPO, HNL, EPO y EPX en conejos mediante inyecciones intracutáneas en múltiples sitios en conejos de 50-100 \mug en total de las proteínas purificadas suspendidas en adyuvante completo e incompleto de Freund. La especificidad de los anticuerpos se evaluó por inmunodifusión doble (Ouchterlony Acta Pathol. Microbiol. Scand 26 (1949) 507-) en agarosa y se ensayó frente a extractos de gránulos de neutrófilos y eosinófilos y las siguientes proteínas purificadas: catepsina G, elastasa, MPO, lisozima, lactoferrina, ECP, EPX; EPO.
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Anticuerpos monoclonales
Se inmunizaron ratones Balb/c hembra por vía subcutánea con proteína purificada. La sensibilización se realizó por inyección de 50 \mug de proteína pura mezclada con adyuvante completo de Freund. Se realizaron tres refuerzos con aproximadamente 50 \mug de proteína pura en PBS (solución salina tamponada con fosfato). Se fusionaron células de bazo como se describe (Galfré y col., Nature 266 (1977) 550-552) con células de mieloma Sp2/0. Se exploraron los anticuerpos en los sobrenadantes de los cultivos celulares usando una técnica ELISA con pocillos recubiertos de antígeno. También se exploró la especificidad de los anticuerpos presentes en los sobrenadantes por proteínas de gránulos respectivas y se localizaron los epítopes en BIAcore® (BIAcore, Uppsala, Sweden). Se seleccionaron hibridomas de acuerdo con los experimentos ELISA y BIAcore y se clonaron, expandieron y purificaron. Todos los anticuerpos seleccionados fueron del subtipo IgG1.
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Inmunoensayos
La HNL se evaluó usando un radioinmunoensayo como se describe (Xu y col., J. Immunol. Methods 171 (1994) 245-252. Las variaciones entre y dentro de los ensayos fueron menores del 10% y el límite de detección fue menor de 4 \mug/l.
Se midió EPX y Mieloperoxidasa usando radioinmunoensayos disponibles en el mercado (Pharmacia Diagnostics AB, Uppsala, Sweden). Las variaciones entre y dentro de los ensayos fueron menores del 10% y el límite de detección fue menor de 3 y 8 \mug/l, respectivamente.
La EPO se midió usando un ensayo inmunofluorométrico prototipo que utiliza el Pharmacia CAP System® como se describe (Nielsen y col., Allergy 53 (1998) 778-785. Las variaciones entre y dentro de los ensayos fueron menores del 8% y el límite de detección fue menor de 0,5 \mug/l.
La lactoferrina se estimó como se describe (Olofsson y col., Scand J Haematol 18 (1977) 73-80). Las variaciones entre y dentro de los ensayos fueron menores del 8% y el límite de detección fue menor de 2 \mug/l.
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Muestras de sangre
Se recogieron aleatoriamente muestras de sangre que contenían EDTA extraídas de pacientes en el Hospital Universitario, Uppsala, Sweden. Se realizaron recuentos de células sanguíneas en cada muestra por medio de un contador de células Coulter SAKS (Beckman Coulter, Inc.).
Las proteínas de los gránulos se extrajeron a partir de granulocitos por medio de la adición de CTAB (bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio) a una concentración final del 0,05-0,5% a una pequeña alícuota de sangre, 1-10 \mul. La mezcla después se incubó durante al menos 1 minuto y después se almacenó congelada a -20ºC antes del análisis.
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Evaluación estadística
Se realizó un análisis de regresión usando el paquete estadístico Statistica (Statsoft, Tulsa, USA).
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Ejemplo 1 Estimación del número de neutrófilos en sangre
La presente invención muestra que la extracción de una pequeña alícuota de sangre, 1-10 \mul, con CTAB, concentración final del 0,05-0,5%, durante al menos 1 minuto y la posterior medición de la proteína de neutrófilos MPO por medio de un inmunoensayo específico estima de forma exacta del número de neutrófilos en la sangre.
Como se muestra en la figura 1, la concentración de MPO en el extracto se correlacionaba de forma significativa y lineal (r=0,96) con el número de neutrófilos en la sangre extraída, como se estima por medio de un contador de células Coulter STKS (Beckman Coulter, Inc.). A partir de la ecuación de la línea de regresión es evidente que la desviación desde el origen era mínima, indicando la especificidad celular de la medición. Los resultados se obtuvieron a partir de una población mixta de pacientes hospitalizados (n=275) con niveles tanto elevados como reducidos de neutrófilos en su sangre. De esta manera, algunos pacientes tenían niveles muy elevados debido a infecciones bacterianas agudas y otros tenían niveles seriamente reducidos debido a leucemia o al tratamiento con fármacos citostáticos. A pesar de la inclusión de estos extremos en el cálculo, la relación entre el número de neutrófilos y la concentración de MPO fue lineal a lo largo de todo el intervalo medido. Cuando se midió HNL, la correlación correspondiente fue r=0,93 y también con una relación lineal con el número de neutrófilos a lo largo todo el intervalo. La medición de lactoferrina también mostró una relación lineal a lo largo de todo el intervalo y un coeficiente de correlación de r=0,82.
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Ejemplo 2 Estimación del grado de maduración de la población de neutrófilos
Es bien sabido que la MPO se almacena en los gránulos primarios de los neutrófilos, mientras que la lactoferrina y la HNL se almacenan en gránulos secundarios. Esto se debe a que la producción de MPO se realiza principalmente durante las primeras fases de maduración, es decir, por mieloblastos y promielocitos, mientras que la lactoferrina y la HNL se producen principalmente durante las últimas etapas de maduración, es decir, por los mielocitos. También se sabe que la producción de MPO está menos afectada por una mayor necesidad de neutrófilos en la circulación, tal como en caso de infecciones agudas, que la producción de lactoferrina y HNL. Por lo tanto, la relación entre el contenido de proteínas de gránulos secundarios y MPO proporcionaría a los presentes inventores una estimación del tamaño relativo de las diversas etapas de maduración de los neutrófilos en la sangre y una indicación de la renovación de los neutrófilos por la médula ósea.
En la fig. 2 se muestra que la relación entre la concentración de MPO y la concentración de lactoferrina en sangre entera extraída varía aproximadamente 20 veces entre pacientes, teniendo los pacientes con leucemia mieloide las mayores relaciones.
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Ejemplo 3 Estimación del número de eosinófilos sanguíneos
En este ejemplo se muestra que la extracción de una pequeña alícuota de sangre, 1-10 \mul, con CTAB, 0,05-0,5% durante al menos 1 minuto y la posterior medición de la proteína de eosinófilos EPO por medio de un inmunoensayo específico estima de forma precisa el número de eosinófilos en la sangre.
Como se muestra en la figura 3, la concentración de EPO en el extracto estaba significativa y linealmente correlacionada (r=0,95) con el número de eosinófilos en la sangre extraída, según se estima por medio de un contador de células Coulter STKS (Beckman Coulter, Inc.). A partir de la ecuación de la línea de regresión, es evidente que la desviación desde el origen era mínima, indicando la especificidad celular de la medición. Los resultados se obtuvieron a partir de una población mixta de pacientes hospitalizados (n=275) con niveles tanto elevados como reducidos de eosinófilos en su sangre. De esta manera, algunos pacientes tenían números elevados por alergia y asma, enfermedades inflamatorias crónicas, cáncer, etc. y algunos tenían números reducidos debido, entre otras cosas, a infecciones agudas.
A pesar de la inclusión de estos extremos en el cálculo, la relación entre el número de eosinófilos y la concentración de EPO fue lineal en todo el intervalo medido. Cuando se midió EPX, la correlación correspondiente fue r=0,93 y también con una relación lineal con el número de eosinófilos en todo el intervalo.
Los ejemplos anteriores 1-3 describen neutrófilos, diferentes formas de maduración de neutrófilos y eosinófilos. Sin embargo, la invención no debe considerarse limitada a estos tipos celulares.
Por ejemplo, la proteína de basófilos BB1 puede medir basófilos.
Marcadores de la superficie celular tales como CD20 pueden medir linfocitos B y linfocitos T CD3. Los marcadores de la superficie celular CD4 y CD8 pueden usarse para medir diferentes poblaciones de linfocitos.
Los monocitos pueden medirse por CD14 o lisozima.
Los trombocitos puede medirse por \beta-tromboglobulina.
Como se describe en el Ejemplo 2, la determinación de relaciones es especialmente interesante para células mieloides, pero también para diversas subpoblaciones de linfocitos.
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Referencias
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Claims (5)

1. Un procedimiento para estimar in vitro la cantidad de células específicas en una muestra de un paciente, en el que se usan moléculas con especificidad celular para calcular el número de células específicas, que comprende
a)
extraer una alícuota de dicha muestra; y
b)
medir la concentración de dos moléculas con especificidad celular en dicha muestra extraída por medio de un ensayo inmunológico y determinar la relación entre las concentraciones de dichas moléculas,
en el que las moléculas con especificidad celular son proteínas de neutrófilos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la extracción se realiza con un detergente catiónico.
3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el detergente es CTAB (bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio).
4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra del paciente es sangre entera.
5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las moléculas con especificidad celular son MPO (mieloperoxidasa), HNL (lipocalina de neutrófilos humanos) o lactoferrina.
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