ES2239246T3

ES2239246T3 - Receptor soluble de celulas t.

Info

Publication number: ES2239246T3
Application number: ES02755287T
Authority: ES
Inventors: Bent Karsten Avidex Limited Jakobsen; Meir Glick
Original assignee: Avidex Ltd
Current assignee: Avidex Ltd
Priority date: 2001-08-31
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2005-09-16
Anticipated expiration: 2022-08-30
Also published as: US20080125369A1; WO2003020763A3; IL160359A; JP4317940B2; US20050009025A1; PL368980A1; WO2003020763A9; AU2002321581C1; CA2457652C; NZ531208A; US20080153131A1; CN1561343A; NO20041325L; PT1421115E; CN1561343B; WO2003020763A2; AU2002321581B2; EP1421115B1; ATE290020T1; JP2005514006A

Abstract

Un receptor soluble de células T (sTCR), que comprende (i) toda o parte de una cadena á de TCR, excepto el dominio transmembrana de la misma, y (ii) toda o parte de una cadena â, excepto el dominio transmembrana de la misma, en el que cada (i) y (ii) comprende un dominio variable funcional y al menos una parte del dominio constante de la cadena de TCR, caracterizado porque (i) y (ii) están unidos mediante un enlace disulfuro entre residuos de cisteína sustituidos por: Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01.

Description

Receptor soluble de células T.

La presente invención se refiere a receptores solubles de células T (TCRs).

Como se describe en el documento WO 99/60120, los TCR median el reconocimiento de complejo principal de complejos histocompatibilidad (MHC)-péptido por células T y, como tales, son esenciales para el funcionamiento del brazo celular del sistema inmune.

Los anticuerpos y los TCR son solamente dos tipos de moléculas que reconocen antígenos de una manera específica, y de este modo el TCR es el único receptor de los antígenos peptídicos particulares en MHC, el péptido foráneo a menudo siendo el único signo de anormalidad dentro de una célula. El reconocimiento de las células T se produce cuando una célula T y una célula presentadora de antígeno (APC) están en contacto físico directo, y se inicia mediante ligación de los TCR específicos de antígeno con complejos pMHC.

El TCR es una proteína de superficie celular heterodimérica de la superfamilia de las inmunoglobulinas que está asociada a las proteínas invariantes del complejo CD3 implicado en la mediación de la trasducción de la señal. Los TCR existen en las formas \alpha\beta y \gamma\delta, que son estructuralmente similares pero las células T que las expresan tienen localizaciones anatómicas y probablemente funciones completamente distintas. La porción extracelular del receptor consta de dos dominios constantes proximales de membrana, y dos dominios variables distales de membrana que llevan bucles polimórficos análogos a las regiones determinantes complementarias (CDR) de anticuerpos. Son estos bucles los que forman el sitio de unión de la molécula de TCR y determinan la especificidad peptídica. La clase I de MHC y ligandos de la clase II son también las proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas pero se especializan para la presentación de antígenos, con un sitio de unión peptídico polimórfico que les permite presentar una serie diversa de fragmentos peptídicos cortos y la superficie celular de la APC.

Los TCR solubles son útiles, no solamente para el propósito de investigación de interacciones específicas TCR-pMHC, sino también potencialmente como una herramienta de diagnóstico para detectar infección, o para detectar marcadores de enfermedades. Los TCR también tienen aplicaciones en tinción, por ejemplo, para teñir células para determinar la presencia de un antígeno peptídico particular presentado en el contexto del MHC. De manera similar, los TCR solubles se pueden usar para distribuir un agente terapéutico, por ejemplo un compuesto citotóxico o un compuesto inmunoestimulante, a las células que presentan un antígeno particular. Los TCR solubles también se pueden usar para inhibir las células T, por ejemplo, las que reaccionan con un antígeno peptídico auto-inmune.

Las proteínas que están hechas de más de una subunidad polipeptídica y que tienen un dominio transmembrana pueden ser difíciles de producir en forma soluble debido a que, en muchos casos, la proteína se estabiliza mediante su región transmembrana. Éste es el caso del TCR, y se refleja en la bibliografía científica que describe formas truncadas de TCR, conteniendo bien solamente dominios extracelulares o dominios extracelulares y citoplásmicos, que se pueden reconocer por anticuerpos específicos de TCR (indicando que la parte del TCR recombinante reconocida por el anticuerpo se ha plegado correctamente), pero que no se puede producir con un buen rendimiento, que no son estables a bajas concentraciones y/o que no pueden reconocer los complejos MHC-péptido. Esta bibliografía se revisa en el documento WO99/60120.

Numerosas publicaciones describen la producción de heterodímeros de TCR que incluyen el puente disulfuro nativo que conecta las subunidades respectivas (Garboczi, y col., (1996), Nature 384 (6605): 134-41; Garboczi, y col., (1996), J. Inmunol 157 (12): 5403-10; Chang y col., (1994), PNAS USA 91: 11408-11412; Davodeau y col., (1993), J. Biol. Chem. 268 (21): 15455-15460; Golden y col., (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169; patente de Estados Unidos Nº 6080840). Sin embargo, aunque tales TCR se pueden reconocer por anticuerpos específicos de TCR, no se mostraron ninguno que reconocieran su ligando nativo a cualquier otra concentración relativamente alta y/o no eran estables.

En el documento WO 99/60120, un TCR soluble se describe que está correctamente plegado de manera que es capaz de reconocer su ligando nativo, es estable durante un período de tiempo, y se puede producir en cantidades razonables. Este TCR comprende una dominio extracelular de cadena \alpha o \gamma de TCR dimerizado a un dominio extracelular de la cadena \beta o \delta de TCR respectivamente, mediante un par de péptidos de dimerización C-terminales, tales como cremalleras de leucina. Esta estrategia de producción de los TCR es aplicable generalmente a todos los
TCR.

Reiter y col., Immunity, 1995, 2: 281-287, detalla la construcción de una molécula soluble que comprende dominios variables \alpha y \beta de TCR estabilizados por disulfuro, uno de los cuales se une a una forma truncada de exotoxina de Peudomonas (PE38). Una de las razones establecidas para producir esta molécula era vencer la inestabilidad inherente de los TCR de cadena sencilla. La posición del enlace disulfuro novedoso en los dominios variables de TCR se identificó mediante homología con los dominios variables de anticuerpos, en los que éstos se habían introducido previamente (por ejemplo véase Brinkmann, y col., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7538-7542, y Reiter, y col., (1994) Biochemistry 33: 5451-5459). Sin embargo, como no hay tal homología entre anticuerpo y los dominios constantes de TCR, tal técnica no se puede emplear para identificar sitios apropiados para nuevos enlaces disulfuro intercadena entre los dominios constantes de TCR.

Dada la importancia de los TCR solubles, sería deseable proporcionar una forma alternativa de producir tales moléculas.

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor de células T solubles (sTCR), que comprende (i) toda o parte de una cadena \alpha de TCR, excepto el dominio transmembrana del mismo, y (ii) toda o parte de la cadena \beta de TCR, excepto el dominio transmembrana del mismo, en el que (i) y (ii) cada uno de ellos comprende un dominio variable funcional y al menos una parte del dominio constante de la cadena de TCR, caracterizado porque (i) y (ii) están unidos mediante un enlace disulfuro entre residuos cisteína por:

Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o

Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un receptor de células t de la forma \alpha\beta soluble (sTCR), en el que un enlace disulfuro covalente se une a residuos sustituidos por:

Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o

Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un receptor de las células T soluble (sTCR), que comprende (i) toda o parte de una cadena \alpha de TCR, excepto el dominio transmembrana del mismo, y (ii) toda o parte de la cadena \beta de TCR, excepto el dominio transmembrana del mismo, en el que (i) y (ii) cada uno comprende un dominio variable funcional y al menos una parte del dominio constante de la cadena de TCR, y están unidos mediante un enlace disulfuro entre los dominios de residuos cisteína que no está presente en TCR nativo y en el que un enlace disulfuro intercadena en TCR nativo no está presente.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona un receptor soluble de las células T (sTCR) de forma \alpha\beta, en el que un enlace disulfuro covalente se une a un residuo de la región de inmunoglobulina del dominio constante de la cadena \alpha a un residuo de la región de inmunoglobulina del dominio constante de la cadena \beta, en el que un enlace disulfuro intercadena en TCR nativo no está presente.

Los sTCR de la presente invención tienen la ventaja de que no contienen polipéptidos heterólogos que pueden ser inmunogénicos, o que pueden dar como resultado los sTCR que se eliminan rápidamente del cuerpo. Además, los TRC de la presente invención tienen una estructura tridimensional que es altamente similar a los TCR nativos de los que se derivan y, debido e esta similitud estructural, no son probablemente inmunogénicos. Los sTCR de acuerdo con la invención pueden ser para reconocer los complejos de la clase I de MHC-péptido o los complejos de la clase II de MHC-péptido.

Los TCR de la presente invención son solubles. En el contexto de esta solicitud, solubilidad se define como la capacidad del TCR de purificarse como un heterodímero monodisperso en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (KCl 2,7 mM, KH_{2}PO_{4}1,5 mM, NaCl 137 mM y Na_{2}PO_{4} 8 mM, pH 7,1-7,5. Life Technologies, Gibco BRL) a una concentración de 1 mg/ml y para > 90% de dicho TCR que queda como un heterodímero mono disperso después de la incubación a 25ºC durante 1 hora. Con el fin de determinar la solubilidad del TCR, primero se purifica como se describe en el ejemplo 2. Después de esta purificación, 100 \mug del TCR se analizan mediante cromatografía de exclusión por tamaño, por ejemplo usando una columna Superdex 75 HR de Pharmacia equilibrada en PBS. 100 \mug adicionales del TCR se incuban a 25ºC durante 1 hora y después de analizan mediante cromatografía por exclusión de tamaño como antes. Las pequeñas cantidades por exclusión de tamaño se analizan después mediante integración y las áreas bajo los picos que corresponden al heterodímero mono disperso se comparan. Los picos relevantes se pueden identificar mediante comparación con la posición de elución de los patrones de proteínas de peso molecular conocidos. El TCR soluble heterodimérico mono disperso tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa. Como se ha indicado anteriormente, los TCR de la presente invención son solubles. Sin embargo, como se explica en más detalle más adelante, los TCR se pueden acoplara un resto de manera que el complejo resultante sea insoluble, o se pueden presentar en la superficie de un soporte sólido insoluble.

La numeración de los aminoácidos de TCR usados en esta memoria descriptiva sigue el sistema IMGT descrito en The T Receptor Factsbook, 2001, LeFranc y LeFranc, Academis Press. En este sistema, el dominio constante de la cadena \alpha tiene la siguiente notación: TRAC*01, en el que "TR" indica gen receptor de las células T; "A" indica gen de la cadena \alpha; C indica región constante; y "01" indica alelo 1. El dominio constante de la cadena \beta tiene la siguiente notación: TRBC201. En este caso, existen dos posibles genes de la región constante "C1" y "C2". El dominio traducido codificado por cada alelo puede estar hecho a partir del código genético de varios exones; por lo tanto también están especificados. Los aminoácidos están numerados según el exón del dominio particular en los que están presentes.

La porción extracelular del TCR nativo consta de dos polipéptidos (\alpha\beta y \gamma\delta) cada uno de los cuales tiene un dominio constante proximal de membrana, y un dominio variable distal de membrana (véase la figura 1). Cada uno de los dominios constante y variable, incluye un enlace disulfuro intracadena. Los dominios variables contienen bucles altamente polimórficos análogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de anticuerpos. CDR3 del TCR interactúa como el péptido presentado por MHC, y las CDR 1 y 2 interactúan con el péptido y el MHC. La diversidad de las secuencias de TCR se genera mediante transposición somática de genes variables (V), de diversidad (D), de unión (J), y constantes. Los polipéptidos funcionales de la cadena \alpha se forman mediante las regiones V - J - C transpuestas, mientras que las cadenas \beta constan de las regiones V - D - J - C. El dominio constante extracelular tiene una región proximal de membrana y una región de inmunoglobulina. La región proximal de membrana esta constituida por los aminoácidos entre el dominio transmembrana y el residuo cisteína proximal de membrana. El dominio de inmunoglobulina constante está constituido por el resto de los residuos de aminoácidos del dominio constante, que se extienden desde la cisteína proximal de membrana hasta el comienzo de la región de la unión, y se caracteriza por la presencia de un pliegue de tipo de inmunoglobulina. Existe un dominio constante de la cadena \alpha individual, conocido como C\alpha1 o TRAC*01, y dos dominios constante \beta diferentes, conocidos como C\beta1 o TRNC1*01 y C\beta2 o TRNC2*01. La diferencia entre estos dominios constantes \beta diferentes es con respecto a los residuos 4, 5 y 37 del exón 1. De este modo, TRBC1*01 tiene 4N, 5K y 37 en el exón 1 del mismo, y TRBC2*01 tiene 4K, 5N y 37Y en el exón 1 del mismo. La extensión de cada uno de los dominios extracelulares es algo variable.

En la presente invención, el enlace disulfuro se introduce entre los residuos localizados en los dominios constantes (o partes de los mismos) de las respectivas cadenas. Las cadenas respectivas del TCR comprenden suficientes dominios variables de los dominios variables de los mismos que son capaces de interactuar con su complejo pMHC. Tal interacción se puede medir usando un instrumento BIAcore 3000™ o BIAcore 2000™ como se describe en el ejemplo 3 en esta memoria descriptiva o en el documento WO 99/6120 respectivamente.

En una realización, las cadenas respectivas de los sTCR de la invención también comprende los enlaces disulfuro de la cadena intracadena de los mismos. El TCR de la presente invención puede comprender toda la región Ig constante extracelular de las cadenas de TCR respectivas, y preferiblemente todo el dominio extracelular de las respectivas cadenas, es decir incluyendo la región proximal de membrana. En el TCR nativo, existe un enlace disulfuro que une las regiones proximales de membrana conservadas de las cadenas respectivas. En una realización de los primero y segundo aspectos de la presente invención y en un tercer y cuarto aspectos de la invención, este enlace disulfuro no está presente. Esto se puede lograr mediante mutación de los residuos cisteína apropiados (el aminoácido 4, exón 2 del gen TRAC*01 y el aminoácido 2 de tanto los genes TRBC*01 como TRBC2*01 respectivamente) a otro aminoácido, tal como serina o alanina, o truncando las cadenas respectivas de manera que los residuos cisteína no están incluidos. Un TCR soluble preferido según la invención comprende las cadenas \alpha y \beta de TCR nativo truncadas en el extremo C de manera que los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena nativo están excluidos, es decir truncados en el residuo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 N-terminal a los residuos cisteína. Sin embargo hay que tener en cuenta que el enlace disulfuro intercadena nativo puede estar presente en los TCR de la presente invención, y que, en ciertas realizaciones, solamente las cadenas del TCR tienen el residuo cisteína nativo que forma en enlace disulfuro intercadena nativo. Esta cisteína se puede usar para unir restos al TCR.

Sin embargo, las cadenas de TCR respectivas pueden ser más cortas. Debido a que los dominios constantes no están implicados directamente en contactos con los ligandos péptido-MHC, el punto de truncamiento C-terminal se puede alterar sustancialmente sin pérdida de funcionalidad.

Como alternativa, se prefiere en esta memoria descriptiva que pueda estar presente un fragmento mayor de los dominios constantes, es decir los dominios constantes necesitan no estar truncados justo antes de las cisteínas formando el enlace disulfuro de intercadena. Por ejemplo, el dominio constante entero excepto el dominio transmembrana (es decir, los dominios extracelular y citoplasmático) pueden estar incluidos. Puede ser ventajoso en este caso mutar uno o más de los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena en el TCR celular a otro residuo de aminoácido que no está implicado en la formación del enlace disulfuro, o suprimir uno o más de estos residuos.

El péptido señal se puede omitir si el TCR soluble se expresa en células procarióticas, por ejemplo E. coli, ya que no sirve cualquier propósito en el TCR maduro para su capacidad de unión a ligando, y puede en algunas circunstancias prevenir la formación de un TCR soluble funcional. En la mayoría de los casos, el sitio de escisión en el que el péptido señal se elimina de las cadenas de TCR maduras se predice pero no se determina experimentalmente. Modificando genéticamente las cadenas del TCR expresado de manera que sean unos pocos, es decir, hasta aproximadamente 10 por ejemplo, los aminoácidos más largos o más cortos en el extremo N-terminal pueden no tener significación para la funcionalidad (es decir, la capacidad de reconocer pMHP) del TCR soluble. Se pueden añadir ciertas adiciones que no están presentes en la secuencia proteica original. Por ejemplo, se puede añadir una secuencia marca corta que puede ayudar en la purificación de las cadenas de TCR, con tal que no interfiera con la estructura correcta y plegamiento del sitio de unión a antígeno del TCR.

Para la expresión en E. coli, un residuo de metionina se puede modificar por ingeniería genética en el punto de partida N-terminal de la secuencia proteica madura predicha con el fin de permitir el inició de traducción.

Todos los residuos lejos de los dominios variables de las cadenas de TRC son esenciales para la especificidad y funcionalidad antigénica. De este modo, un número significativo de mutaciones se puede introducir en este dominio sin afectar a la especificidad y funcionalidad antigénica. Todos los residuos lejos en los dominios constantes de las cadenas de TCR son esenciales para la especificidad y funcionalidad antigénica. De este modo, un número significativo de mutaciones se puede introducir en este dominio sin afectar a la especificidad y funcionalidad antigénica.

La cadena \beta del TCR contiene un residuo de cisteína que no está apareado en el TCR celular o nativo. Se prefiere si este residuo de cisteína se elimina o se muta a otro residuo para evitar el apareamiento intracadena o intercadena incorrecto. Las sustituciones de este residuo de cisteína por otro residuo, por ejemplo serina o alanina, puede tener un efecto significativo positivo sobre las eficacias de replegamiento in vitro.

En el tercero y cuatro aspectos, se puede formar el enlace disulfuro intercadena mutando los residuos no cisteína en las cadenas respectivas a cisteína, y que hacen que el enlace se forme entre los residuos mutados. Los residuos cuyos respectivos carbono \beta están aproximadamente 6 \ring{A} (0,6 nm) o menos, y preferiblemente en el intervalo entre 3,5 \ring{A} (0,35 nm) y 5,9 \ring{A} (5,9 nm) separados en el TCR nativo, de manera que se pueda formar un enlace disulfuro entre residuos de cisteína introducidos en lugar de los residuos nativos. Se prefiere que si el enlace disulfuro esté entre residuos en la región inumoglobulina constante, aunque puede estar entre residuos de la región proximal de membrana. Los sitios preferidos donde se pueden introducir cisteínas para formar el enlace disulfuro son los siguientes residuos en el exón 1 de TRAC*01 para la cadena \alpha de TCR y TRBC1*01 o TRBC2*01 para la cadena \beta de
TCR:

Cadena \alpha de TCR	Cadena \beta de TCR	Separación de carbonos \beta nativos (nm)
Thr 48	Ser 57	0,473
Thr 45	Ser 77	0,533
Tyr 10	Ser 17	0,359
Thr 45	Asp 59	0,560
Ser 15	Glu 15	0.59

Un sTCR de la presente invención se deriva del TCR A6 Tax (Garboczi y col, Nature, 1996, 384 (6605); 134-141). En una realización, el sTCR comprende el total de la cadena \alpha de TCR, que es N-terminal del exón 2, residuo 4 de TRAC*01 (residuos de aminoácidos 1-182 de la cadena \alpha según la numeración usada en Garboczi y col) y el total de la cadena \beta de TCR que es N-terminal del exón 2, residuo 2 de tanto TRBC*01 como TRCB2*01 (residuos aminoácidos 1-210 de la cadena \beta según la numeración usada en Garboczi y col.,). Con el fin de formar el enlace disulfuro, la treonina 48 del exón 1 en TRAC*01 (treonina 158 de la cadena \alpha según la numeración usada en Garboczi y col.,) y la serina 57 del exón 1 en tanto TRBC1*01 como TRBC2*01 (la serina 172 de la cadena \beta según la numeración usada en Garboczi y col.,) puede cada una estar mutada a cisteína. Estos aminoácidos se localizan en la hebra D \beta del dominio constante de las cadenas \alpha y \beta del TCR respectivamente.

Hay que indicar que, en las figuras 3 a y 3b, residuo 1 (según la numeración usada en Garboczi y col.,) es K y N respectivamente. El residuo metionina N-terminal no está presente en el TCR A6 Tax, como se ha mencionado anteriormente, está algunas veces presente cuando las cadenas respectivas se producen en sistemas de expresión bacterianos.

Ahora que los residuos en los TCR humanos que se pueden mutar a residuos cisteínas para formar un nuevo enlace disulfuro intercadena se han identificado, los expertos en al técnica serán capaces de mutar cualquier TCR de la misma manera que para producir una forma soluble del TCR que tiene un nuevo enlace disulfuro intercadena. En los seres humanos, los expertos en la técnica necesitan buscar los siguientes motivos en las respectivas cadenas de TCR para identificar el residuo a mutar (el residuo sombreado es el residuo para mutación a cisteína).

1

En otras especies, las cadenas de TRC pueden no tener una región que tiene 100% de identidad a los motivos anteriores. Sin embargo, los expertos en la técnica serán capaces de tener de usar motivos para identificar la parte equivalente de la cadena \alpha o \beta del TCR y por lo tanto el residuo a mutar a cisteína. Las técnicas de alineación se pueden usar en este respecto. Por ejemplo, ClustalW, disponible de la página web del Instituto de Bioinformática Europeo (http://www.ebi.ac.uk/index.html) se puede usar para compra los motivos anteriores a una secuencia de la cadena de TCR particular con el fin de localizar la parte relevante de la secuencia de TCR para mutación.

La presente invención incluye dentro de su alcance los TCR \alpha\beta unidos por disulfuro humanos, así como los TCR \alpha\beta unidos por disulfuro de otros mamíferos, incluyendo pero sin limitación, ratón, rata, cerdo, cabra y oveja. Como se ha mencionado anteriormente los expertos en la técnica serán capaces de determinar sitios equivalentes a los sitios humanos descritos anteriormente en los que los residuos cisteína se pueden introducir para formar un enlace disulfuro intercadena. Por ejemplo, lo siguiente muestra las secuencias de aminoácidos de los dominios solubles C\alpha y C \beta de ratón, junto con los motivos que muestran los residuos murinos equivalentes a los residuos humanos mencionados anteriormente que se pueden mutar a cisteínas para formar un enlace disulfuro intercadena de TCR (donde los residuos relevantes están sombreados):

Dominio soluble C\alpha de ratón:

2

Dominio soluble C\beta de ratón:

3

4

5

En una realización preferida de la presente invención, (i) y (ii) del TCR cada uno comprende el dominio variable funcional del primer TCR condensado a todo o parte del dominio constante de un segundo TCR, el primer y segundo TCR siendo de la misma especie y el enlace disulfuro intercadena estando entre los residuos en dicho todo o parte del dominio constante respectivo no presente en TCR nativo. En una realización, el primer y segundo TCR son humanos. En otras palabras, los dominios constantes unidos por enlace disulfuro actúan como un marco conservado sobre el que los dominios variables se pueden condensar. El TCR resultante será sustancialmente idéntico al TCR nativo a partir del cual se obtiene el primer TCR. Tal sistema permite la fácil expresión de cualquier dominio variable funcional sobre un marco conservado del dominio constante estable.

Los dominios constantes del sTCR A6 Tax, o de hecho los dominios constantes de cualquiera de los TCR \alpha\beta que tienen un nuevo enlace disulfuro intercadena descrito anteriormente, se puede usar como marco conservado en el que los dominios variables heterólogos se pueden condensar. Se prefiere si la proteína de fusión conserva tanto de la conformación de los dominios variables heterólogos como sea posible. Por lo tanto, se prefiere que los dominios variables heterólogos estén unidos a los dominios constantes en cualquier punto entre los residuos cisteína introducidos y el extremo N del dominio constante. Para el TCR A6 Tax, los residuos cisteína introducidos sobre las cadenas \alpha y \beta se localizan preferiblemente en la treonina 48 del exón 1 en TRAC*01 (treonina 158 de la cadena \alpha según la numeración usada en Garboczi y col) y la serina 57 del exón 1 tanto en TBRC1*01 como en TRBC2*01 (serina 172 de la cadena \beta según la numeración usada en Garboczi y col.,) respectivamente. Por lo tanto se prefiere si los puntos de unión de los dominios variables de las cadenas \alpha y \beta heterólogos están entre los residuos 48 (159 según la numeración usada en Garboczi y col.,) o 58 (173 según la numeración usada en Garboczi y col.,) y el extremo N de los dominios constantes \alpha y \beta respectivamente.

Los residuos en los dominios constantes de las cadenas \alpha y \beta heterólogos a los puntos de alineación en el TCR A6 Tax se pueden identificar por homología de secuencia. La proteína de fusión se construye preferiblemente para que incluya toda la secuencia heteróloga N-terminal al punto de unión.

Como se describe en más detalle más adelante, el sTCR de la presente invención se puede derivatizar con, o condensarse a, un resto como su extremo C o N. Se prefiere el extremo C ya que es distal del dominio de unión. En una realización, una o ambas de las cadenas de TCR tienen un residuo cisteína en su extremo C y/o N al que tal resto se puede condensar.

Un TCR soluble (que es preferiblemente humano) de la presente invención se puede proporcionar en forma sustancialmente pura, o como una preparación purificada o aislada. Por ejemplo, se puede proporcionar en una forma que esté sustancialmente libre de otras proteínas.

Se puede proporcionar una pluralidad de TCR solubles de la presente invención en un complejo multivalente. De este modo, la presente invención proporciona, en un aspecto, un complejo de los receptores de las células T (TCR) multivalente, que comprende una pluralidad de los receptores de las células T solubles como se describe en esta memoria descriptiva. Cada uno de la pluralidad de los TCR soluble es preferiblemente idéntico.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento APRA detectar complejos MHC-péptido dicho procedimiento comprende:

(i): proporcionar un receptor de las células T soluble o un complejo de los receptores de las células T multivalente como se describe esta memoria descriptiva;

(ii): poner en contacto el receptor de las células T soluble o complejo de los TCR multivalente con los complejos MHC-péptido; y

(iii): detectar la unión del receptor de las células T soluble o un complejo de los TCR multivalente a los complejos MHC-péptido.

En el complejo multivalente de la presente invención, los TCR pueden estar en la forma de multímeros, y/o puede estar presente en o asociado con una bicapa lipídica, por ejemplo, un liposoma.

En su forma más simple, un complejo de TCR multivalente según la invención comprende un multímero de dos o tres o cuatro o más moléculas del receptor T asociado (por ejemplo, covalentemente o de otra manera unido) con otro, preferiblemente mediante una molécula de engarce. Las moléculas de engarce adecuadas incluyen, pero sin limitación, moléculas de unión multivalente tales como avidina, estreptavidina, neutravidina y extravidina, cada una de las cuales tiene cuatro sitios de unión para biotina. De este modo, las moléculas de TCR biotiniladas se pueden formar en los multímeros de los receptores de las células T que tienen una pluralidad de sitios de unión. El número de moléculas de TCR en el multímero dependerá de la cantidad de TCR en relación a la cantidad de la molécula engarce usada para preparar los multímeros, y también en la presencia o ausencia de cualquier otra molécula biotinilada. Los multímeros preferidos son complejos diméricos, triméricos o tetraméricos de TCR.

Las estructuras que son mucho más grandes que los tetrámeros de TRC se pueden usar en el rastreo o dirección de células que expresan el complejo específico MHC-péptido. Preferiblemente las estructuras están en el intervalo entre 10 nm y 10 \mum de diámetro. Cada estructura puede mostrar múltiples moléculas de TCR a una suficiente distancia separadas que permiten que dos moléculas de TCR en la estructura se unan simultáneamente a dos o más complejos MHC-péptido en una célula y de este modo incrementen la avidez del resto de unión multimérico por la célula.

Las estructuras adecuadas para uso en la invención incluyen estructura de membrana tales como liposomas y estructura sólidas que son preferiblemente partículas tales como perlas, por ejemplo, perlas de látex. Otras estructuras que se pueden revestir externamente con moléculas de los receptores de las células T son también adecuadas. Preferiblemente, las estructuras se revisten con multímeros de los receptores de las células T mejor que moléculas de los receptores de las células T.

En el caso de liposomas, las moléculas de los receptores de las células T o los multímeros de las mismas se pueden unir a o por lo demás asociarse con la membrana. Las técnicas para esto las conocen bien los expertos en al técnica.

Un marcador o cualquier otro resto, tal como un resto tóxico o terapéutico, se puede incluir en un complejo de TCR multimérico de la presente invención. Por ejemplo, el marcador u otro resto se pueden incluir en un multímero de la molécula mezclado. Un ejemplo de tal molécula multimérica es un tetrámero que contiene tres moléculas de TCR y una molécula de peroxidasa. Esto se puede lograr mezclando el TCR y la enzima a una relación molar de 3:1 para generar complejos tetraméricos, y aislando el complejo deseado a partir de cualquier complejo que no contenga la relación correcta de moléculas. Estas moléculas mezcladas pueden contener cualquier combinación de moléculas, con tal que el impedimento estérico no comprometa o no comprometa significativamente la función deseada de las moléculas. El posicionamiento de los sitios de unión sobre la molécula de estreptavidina es adecuado para tetrámeros mezclados ya que el impedimento estérico no es probable que se produzca.

Pueden ser posibles medios alternativos de biotinilación del TCR. Por ejemplo, se puede usar la biotinilación química. Como alternativa se pueden usar marcas de biotinilación, aunque ciertos aminoácidos en la secuencia de marca de biotina son esenciales (Schatz, (1993). Biotechnology NY 11: (10): 1138-43). La mezcla usada para biotinilación también se puede variar. La enzima requiere Mg-ATP y baja resistencia iónica, aunque ambas de estas condiciones se pueden variar por ejemplo, puede ser posible usar una resistencia iónica mayor y un mayor tiempo de reacción. Puede ser posible usar una molécula distinta de avidina o estreptavidina para formar multímeros del TCR. Cualquier molécula que se una a biotina de una manera multivalente sería adecuada. Como alternativa, un enlace enteramente diferente se podría proyectar (tal como una marca de poli-histidina a un ion de níquel quelado (Quiagen Product Guide, 1999, capítulo 3 "Protein Expresión, Purification, Detection and Assay" p. 35-37). Preferiblemente, la marca se localiza hacia el extremo C de la proteína de manera que minimiza la cantidad de impedimento estérico en la interacción con complejos péptido-MHC.

Una o ambas de las cadenas del TRC se pueden marcar con un marcador detectable, por ejemplo un marcador que sea adecuado para propósitos de diagnóstico. De este modo, la invención proporciona un procedimiento para detectar complejos MHC-péptido dicho procedimiento comprende poner en contacto los complejos MHC-péptido con un TCR o complejo de TCR multimérico de acuerdo con la invención que es específico para el complejo MHC - péptido; y detectar la unión del TCR multimérico o complejo de TCR multimérico al complejo MHC-péptido. En el TCR tetramérico formado usando heterodímeros biotinilados, se puede usar estreptavidina fluorescente (comercialmente disponible) para proporcionar un marcador detectable. Un tetrámero marcado fluorescentemente es adecuado para uso en análisis de FACS, por ejemplo para detectar células presentadoras de antígeno que llevan el péptido para el que TCR es específico.

Otra manera en la que los TCR solubles de la presente invención se pueden detectar es mediante el uso de anticuerpos específicos de TCR, en particular anticuerpos monoclonales. Existen muchos anticuerpos anti-TCR comercialmente disponibles, tales como \alphaF1 y \betaF1, que reconocen las regiones constantes de la cadena \alpha y \beta respectivamente.

El TCR (o complejo multivalente del mismo) de la presente invención puede alternativamente o adicionalmente estar asociado con (por ejemplo, covalentemente o de otra manera unido a) una gente terapéutico que puede ser por ejemplo, un resto tóxico para usar en la muerte de células, o un agente inmunoestimulante tal como una interleucina o una citocina. Un complejo de TCR multivalente de la presente invención puede tener potenciada la capacidad de unión para un pMCH comparado con un heterodímero receptor de las células T no multimérico. De este modo, los complejos de TCR multivalentes según la invención son particularmente útiles para rastrear o dirigir células que presentan antígenos particulares in vitro o in vivo, y son también útiles como intermedios para la producción de complejos de TCR multivalentes adicionales que tienen tales usos. El TCR o complejo de TCR multivalente se puede por lo tanto proporcionar en una formulación farmacéuticamente aceptable para uso in vivo.

La invención también proporciona un procedimiento para distribuir una agente terapéutico a una célula diana, dicho procedimiento comprende poner en contacto células diana potenciales con un TCR o complejo de TCR multivalente de acuerdo con la invención en condiciones que permiten la unión del TCR o complejo de TCR multivalente a la célula diana, dicho TCR o complejo de TCR multivalente siendo específico para los complejos MHC-péptido y teniendo el agente terapéutico asociado a ellos.

En particular, el TCR o complejo de TCR multivalente se puede usar para distribuir agentes terapéuticos al lugar de células que presentan un antígeno particular. Esto sería útil en muchas situaciones y, en particular, contra tumores. Un agente terapéutico se puede distribuir de manera que ejerza su efecto localmente pero no solamente sobre la célula a la que se une. De este modo, una estrategia particular contempla moléculas antitumorales unidas a receptores de células T o complejos de TCR multivalentes específicos para antígenos de tumores.

Muchos agentes terapéuticos se pueden usar para este uso, por ejemplo compuestos radiactivos, enzimas, perforina por ejemplo) o agentes quimioterapéuticos (cis-platina por ejemplo). Para asegurar que los efectos tóxicos se ejercen en el lugar deseado la toxina puede estar en el interior de un liposoma ligado a estreptavidina de manera que el compuesto se libere lentamente. Esto evitará los efectos perjudiciales durante el transporte en el cuerpo y asegurará que la toxina tiene máximo efecto después de la unión del TCR a las células presentadoras de antígeno relevantes.

Otros agentes terapéuticos adecuados incluyen:

\bullet: agentes citotóxicos de pequeña molécula, es decir compuestos con la capacidad de destruir células de mamífero que tiene un peso molecular menor de 700 daltons. Tales compuestos podrían también contener metales tóxicos capaces de tener un efecto citotóxico. Además, se debe entender que estos agentes citotóxicos de pequeñas moléculas también incluyen profármacos, es decir, compuestos que se descomponen o se convierten en condiciones fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Los ejemplos de tales agentes incluyen cis-platina, derivados de maitansina, raquelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etopósido, gemcitabina, ifosfamida, irinotecan, melfalan, mitoxantrona, sorfimer sodiofotofrina II, temozolmida, topotecan, trimetreato glucuronato, auristatina E vincristina y doxorubicina;

\bullet: citotoxinas petídicas, es decir, proteínas o fragmentos de las mismas con la capacidad de destruir células de mamíferos. Los ejemplos incluyen ricina, toxina de difteria exotoxina A bacteriana de pseudomonas, ADNasa y ARNasa;

\bullet: radio-nuclidos, es decir isótopos inestables de elementos que se descomponen con la emisión simultánea de una o más partículas \alpha o \beta, o rayos \gamma. Los ejemplos incluyen yodo 131, renio 186, indio 111, itrio 90, bismuto 210 y 213, actinio 225 y astatina 213;

\bullet: profármacos, tales como profármacos de enzimas dirigidos a anticuerpos;

\bullet: inmuno-estimulantes, es decir, restos con respuesta inmune estimulada. Los ejemplos incluyen citocinas tales como IL-2, quimiocinas tales como IL-8, factor 8 de plaquetas, proteína estimuladora del crecimiento de melanomas, etc, anticuerpos o fragmentos de los mismos, activadores de complemento, dominios proteicos xenogénicos, dominios proteicos alogénicos, dominios proteicos virales bacterianos y péptidos virales/bacterianos.

Los TCR solubles o complejos de TCR multivalentes de la invención se pueden unir a una enzima capaz de convertir un profármaco en un fármaco. Estro permite que el profármaco se convierta en el fármaco solamente en el sitio donde se requiere (es decir, dirigido por el sTCR).

Los ejemplos de dianas MHC-péptido para el TCR según la invención incluyen, pero sin limitación a, epítopes virales tales como epítopes de HTLV-1 (por ejemplo, el péptido Tax restringido por HLA-A2; HTLV-1 se asocia con lecucemia), epítopes de VIH, epítopes de VBE, epítopes de VCM; epítopes de melanoma (por ejemplo, epítope restringido de HLA-A1 MAGE-1) y otros epítopes específicos de cáncer (por ejemplo, el carcinoma de células renales asociado a antígeno G250 restringido por HLA-A2); y epítopes asociados con trastornos autoinmunes, tales como artritis reumatoide. Además se identifican las dianas de pMHC asociadas a enfermedad, adecuados para uso en la presente invención, se enumeran en el HLA Factbook (Barclay (Ed) Academic Press), y muchos otros.

Una multitud de tratamientos patológicos se pueden potencialmente mejorar localizando el fármaco a través de la especificidad de TCR solubles.

Las enfermedades virales para las que el fármaco existe, por ejemplo, VIH, VIS, VBE, VCM, se beneficiarían del fármaco que se libera o activa en la proximidad cercana de las células infectadas. Para cáncer, la localización en la proximidad de tumores o metástasis potenciaría el efecto de las toxinas o inmunoestimulantes. En las enfermedades autoinmunes, los fármacos inmunosupresores se pueden liberar lentamente, teniendo más efecto local durante un período de tiempo extendido mientras que afecta mínimamente afectando a la capacidad inmune global del sujeto. En la prevención del rechazo de injertos, el efecto de fármacos inmunosupresores se puede optimizar de la misma manera. Para la distribución de vacunas, el antígeno de vacunas se puede localizar en la proximidad de las células presentadoras de antígeno, de este modo potenciando la eficacia del antígeno. El procedimiento también se puede aplicar para propósitos de formación de imágenes.

Los TCR solubles de la presente invención se pueden usar para modular la activación de células T mediante la unión a pMHC específicos y por lo tanto inhibiendo la activación de células T. Las enfermedades autoinmunes que implican inflamación mediada por células T y/o lesión en el tejido serían responsables de este planteamiento, por ejemplo, diabetes de tipo I. El conocimiento del epítope peptídico específico presentado por el pMHC relevante se requiere para este uso.

Los medicamentos de acuerdo con la invención se suministrarán como parte de una composición estéril, farmacéutica que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede ser de cualquier forma adecuada, (dependiendo del procedimiento deseado de administración a un paciente). Se puede proporcionar en forma de dosificación unitaria, se proporcionará generalmente en un recipiente sellado y se puede proporcionar como parte de un kit. Tal kit incluirá normalmente (aunque no necesariamente) instrucciones para uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas de dosificación unitaria.

La composición farmacéutica se puede adaptar para administración mediante una vía apropiada, por ejemplo, mediante la vía oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual o trandérmica), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Tales composiciones se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica de farmacia, por ejemplo, mediante la mezcla del ingrediente activo con el (los) vehículo (s) o excipiente (s) en condiciones estériles.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración oral se pueden presentar en forma de unidades discretas tales como cápsulas o comprimidos; en forma de polvos o gránulos; en forma de soluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos o no acuosos; o en forma de espumas o batidos comestibles; o en forma de emulsiones). Los excipientes adecuados para comprimidos o cápsulas de gelatina duras incluyen lactosa, almidón de maíz o derivados de los mismos, ácido esteárico, o las sales de los mismos. Los excipientes adecuados para uso con cápsulas de gelatina blanda incluyen por ejemplo aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos o líquidos, etc.

Para la preparación de suspensiones y jarabes los excipientes que se pueden usar incluye por ejemplo, agua, polioles y azúcares. Para la preparaciones de suspensiones se pueden usar aceites (por ejemplo, aceites vegetales) para proporcionar suspensiones aceite en agua o agua en aceite. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración transdérmica se pueden presentar en forma de parches discretos destinados a permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un tiempo prolongado de tiempo. Por ejemplo, el ingrediente activo se puede distribuir a partir del parche mediante iontoforesis como se describe generalmente en Pharmacia Research, 3 (6): 318 (1986). Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica se pueden formular en forma de pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles o aceites. Para las infecciones del ojo u otros tejidos externos, por ejemplo boca y piel, las composiciones se aplican preferiblemente en forma de pomada o crema tópica. Cuando se formula en una pomada, el ingrediente activo se puede emplear con bien una base parafínica o de pomada miscible en agua. Como alternativa, el ingrediente activo se puede formular en una crema con una base de crema de aceite en agua o una base de agua en aceite. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica al ojo incluyen gotas de ojos en las que el ingrediente activo se disuelve o se suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica en la boca incluyen grageas, pastillas y composiciones de enjuague bucal.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración rectal se pueden presentar en forma de supositorios o enemas. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal en las que el vehículo es un sólido incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula por ejemplo en el intervalo entre 20 y 500 micrómetros que se administra de la manera en la que se esnifa, es decir, mediante inhalación rápida a través del paso nasal desde un recipiente en el que se mantiene el polvo cerrado hasta la nariz. Las composiciones adecuadas en las que el vehículo es un líquido, para la administración en forma de una pulverización nasal o en forma de gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración mediante inhalación incluyen polvos en partículas finas o nieblas que se pueden que se pueden generar por medio de diversos tipos de aerosoles, nebulizadores o insufladores presurizados de dosis medida. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración vaginal se pueden presentar en forma de formulaciones de pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizaciones. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen solución acuosa y no acuosa estéril que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación sustancialmente isotónica con la sangre del receptor propuesto; y las suspensiones acusas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Los excipientes que se pueden usar para soluciones inyectables incluyen, por ejemplo, agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales. Las composiciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o multi-dosis, por ejemplo, ampollas y viales cerradas, y se pueden almacenar en una condición secada por congelación (liofilizada) que requiere solamente la adición del líquido estéril llevado, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de usar. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, perfumes, sales (sustancias de la presente invención se pueden proporcionar ellas mismas en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable), tampones, agentes de revestimiento o antioxidantes. También pueden contener agentes terapéuticamente activos además de la sustancia de la presente invención.

Las dosificaciones de las sustancias de la presente invención pueden variar entre limites amplios, dependiendo de la enfermedad o trastorno a tratar, y la edad y condición del individuo a tratar, etc, y un médico determinará por último las dosificaciones apropiadas a usar. La dosificación se puede repetir tan a menudo como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios la cantidad y/o frecuencia de la dosificación se puede reducir, de acuerdo con la práctica clínica normal.

Se pueden usar técnicas de clonación de genes para proporcionar un sTCR de la invención, preferiblemente en forma sustancialmente pura. Estas técnicas, se describen, por ejemplo, en J. Sambrook y col Molecular Cloning edición 2ª, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). De este modo, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una cadena del TCR soluble de la presente invención, o una secuencia complementaria a ella. Tales secuencias de ácido nucleico se pueden obtener aislando ácido nucleico que codifica TCR a partir de clones de las células T y realizando mutaciones apropiadas (mediante inserción, supresión o sustitución).

La molécula de ácido nucleico puede estar en forma aislada o recombinante. Se puede incorporar en un vector y el vector se puede incorporar en una célula hospedadora. Tales vectores y hospedadores adecuados forman todavía aspectos adicionales de la presente invención.

La invención también proporciona un procedimiento para obtener una cadena de TCR y después purificar el polipéptido.

Los TCR solubles de la presente invenciones pueden obtener mediante la expresión de una bacteria tal como E. coli como cuerpos de inclusión, y posterior replegamiento in vitro.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para obtener un receptor de células T solubles (sTCR), dicho procedimiento comprende:

incubar una célula hospedadora que comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica (i) todo toda o parte de una cadena \alpha de TCR, excepto el dominio transmembrana de la misma, y una célula hospedadora que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica (ii) toda o parte de una cadena \beta de TCR, excepto el dominio transmembrana de la misma en condiciones que producen expresión de (i) y (ii), en el que (i) y (ii) cada uno comprenden un dominio variable funcional y al menos una parte del dominio constante de la cadena de TCR;

purificar (i) y (ii); y

mezclar (i) y (ii) en condiciones de replegamiento de manera que se unen mediante un enlace disulfuro entre residuos de dominios constantes que no está presente en el TCR nativo.

Todavía en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para obtener un receptor de las células T \alpha\beta soluble (sTCR), dicho procedimiento comprende:

incubar una célula hospedadora que comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena \alpha de TCR en condiciones que producen la expresión de las cadenas de TCR respectivas;

purificar las cadenas respectivas de TCR; y

mezclar las cadenas respectivas de TCR en condiciones de replegamiento de manera que un enlace disulfuro covalente se une a un residuo de la región inmunológica del dominio constante de la cadena \beta.

El replegamiento de las cadenas de TCR puede tener lugar in vitro en condiciones adecuadas de replegamiento. En una realización particular, un TCR con la correcta conformación se logra mediante replegamiento de las cadenas de TCR solubilizadas en un tampón de replegamiento que comprende un agente solubilizante, por ejemplo urea. De manera ventajosa, la urea puede estar presente a una concentración de al menos 0,1 M o al menos 1 M o al menos 2,5 M, o aproximadamente 5 M. Un agente solubilizante alternativo que se puede usar es guanidina, a una concentración entre 0,1 M y 8 M, preferiblemente al menos 1 M o al menos 2,5 M. Antes del replegamiento, se emplea un agente reductor para asegurar la completa reducción de residuos de cisteína. Se pueden usar, según se necesiten, agentes desnaturalizantes adicionales tales como DTT y guanidina. Se pueden usar agentes desnaturalizantes y reductores diferentes antes de la etapa de replegamiento (por ejemplo, urea, \beta-mercaptoetanol). Como alternativa se pueden usar parejas redox durante el replegamiento, tal como una pareja redox cistamina/cistamina, DDT o \beta-mercaptoetanol/oxígeno atmosférico, y cisteína en formas reducidas y oxidadas.

La eficacia de plegamiento también se puede aumentar mediante la adición de otros ciertos componentes proteicos, por ejemplo proteínas de chaperona, a la mezcla de replegamiento. El replegamiento mejorado se ha logrado pasando la proteína a través de columnas con mini-chaperonas proteína (Altamirano, y col., (1999). Nature Biotechnology 17: 187-191; Altamirano, y col., (1997). Proc. Natl. Acad Sci USA 94 (8): 3576-8).

Como alternativa, el TCR de la presente invención se puede obtener mediante la expresión en un sistema celular eucariótico, tal como células de insecto.

La purificación del TCR se puede lograr por muchos medios diferentes. Se pueden emplear modos alternativos de intercambio iónico o purificación de proteínas tales como cromatografía por filtración en gel o cromatografía de afinidad.

Los TCR solubles y complejos de TCR multivalentes de la presente invención también encuentran uso en la selección de agentes, tales como compuestos químicos pequeños, que tienen la capacidad de inhibir la unión del TCR a su complejo de pMHC. De este modo, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para seleccionar un agente que inhiba la unión de un receptor de células T a un complejo péptido-MHC, que comprende el control de la unión de un receptor de células T soluble de la invención con un complejo péptido-MHC en presencia de un agente; y agentes de selección que inhiben tal unión.

Las técnicas adecuadas para tal procedimiento de selección incluyen el procedimiento basado en resonancia de plasmón superficial descrita en el documento WO 01/22084. Otras técnicas bien conocidas que podrían formar la base de este procedimiento de selección son análisis de centelleo por proximidad (SPA) y ensayo por proximidad luminiscente amplificado.

Los agentes seleccionados mediante procedimientos de selección de la invención se pueden usar como fármacos, o como la base de un programa de desarrollo de fármacos, estando modificado o de otra manera mejorado para que tenga características que les hace más adecuados para administración como medicamento. Tales medicamentos se pueden usar para el tratamiento de afecciones que incluyen un componente de respuestas de células T no deseado. Tales afecciones incluyen cáncer (por ejemplo, renal, de ovarios, de cabeza y cuello, testicular, de pulmón, cervical, de próstata o melanoma), enfermedad autoinmune, rechazo de injertos y enfermedad de hospedador frente a injerto.

Las características preferidas de cada aspecto de la invención son para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandi. Los documentos de la técnica anterior mencionados en esta memoria descriptiva se incorporan en el máximo grado permitido por la ley.

Ejemplos

La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención de ninguna manera.

En lo siguiente se hace referencia a los dibujos acompañantes en los que:

La figura 1 es un diagrama esquemático de un TCR soluble con un enlace disulfuro intercadena introducido de acuerdo con la invención:

Las figuras 2 a y 2 b muestran respectivamente las secuencias de ácido nucleico de las cadenas \alpha y \beta de un TCR A6 soluble, mutado de manera que introduce un codón de cisteína. El sombreado indica el codón de cisteína introducido;

La figura 3a muestra la secuencia de aminoácidos extracelular de la cadena \alpha del TCR A6, incluyendo la mutación T48 \rightarrow C (subrayada) usada para producir el enlace intercadena disulfuro novedoso, y la figura 3b muestra la secuencia de aminoácidos extracelular de la cadena \beta del TCR A6, incluyendo la mutación S57 \rightarrow C (subrayada) usada para producir el enlace intercadena disulfuro novedoso;

La figura 4 es una pequeña cantidad obtenida después de la cromatografía de intercambio aniónico del TCR A6 soluble, que muestra la elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ que usa un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

Figura 5-A. SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de las fracciones del desarrollo de la columna en la figura 4, como se indica. B. SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) o fracciones de la columna desarrollada en la figura 4, como se indica. El pico 1 claramente contiene principalmente cadena \beta unida por puente no disulfuro, el pico 2 contiene heterodímero de TCR que está unido por disulfuro intercadena, y el hombro se debe a contaminantes de E. coli, en mezcla con el sTCR unido con disulfuro intercadena, que es escasamente visible tras esta reproducción;

La figura 6 es una pequeña cantidad obtenida a partir de la cromatografía de tamaño por exclusión de fracciones reunidas del pico 1 en la figura 5. La proteína eluye en forma de un único pico principal, correspondiente al heterodímero;

La figura 7 es una curva de respuesta BIAcore de la unión específica del TCR soluble A6 unido por disulfuro al complejo HLA-A2 tax. La inserción muestra la respuesta de unión comparada con el control para una sola inyección de TCR soluble A6 unido por disulfuro;

La figura 8a muestra la secuencia de la cadena \alpha del TCR A6 que incluye el residuo de cisteína novedoso mutado para incorporar un sitio de restricción BamH1. El sombreado indica las mutaciones introducidas para formar el sitio de restricción BamH1. Las figuras 8b y 8c muestran la secuencia de ADN de la cadena \alpha y \beta del TCR JM22 mutado para incluir residuos de cisteína adicionales para formar un enlace disulfuro no nativo;

Las figuras 9a y 9b muestran respectivamente las secuencias de aminoácidos extracelulares de las cadenas \alpha y \beta del TCR JM22 producidas a partir de lasa secuencias de ADN de las figuras 8a y 8b;

La figura 10 es una pequeña cantidad obtenida después de la cromatografía de intercambio aniónico del TCR JM22 unido por disulfuro soluble que muestra elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

La figura 11a muestra un SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de las fracciones de la columna desarrollada en la figura 10, como se indica y la figura 11b muestra un SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) de las fracciones de la columna desarrollada en la figura 10, como indica. El pico 1 claramente contiene el heterodímero TCR que está unido por disulfuro intercadena.

La figura 12 es una pequeña cantidad obtenida de la cromatografía de exclusión por tamaño de las fracciones del pico 1 en la figura 10. La proteína eluye como un solo pico principal al heterodímero. El rendimiento es 80%;

Figura 13-A. Curva respuesta BIAcore de la unión específica del TCR soluble JM22 unido por disulfuro al complejo HLA-Flu. B. Respuesta de unión comparada con el control para una sola inyección de TCR soluble JM22 unido por disulfuro;

Las figuras 14a y 14b muestran la secuencia de ADN de la cadena \alpha y \beta del NY-ESO mutado que incluye residuos cisteína adicionales para formar un enlace disulfuro no nativo;

Las figuras 15a y 15b muestran respectivamente las secuencias de aminoácidos de las cadenas \alpha y \beta del TCR NY-ESO producidas a partir de las secuencias de ADN de las figuras 14a y 14b;

La figura 16 es una pequeña cantidad obtenida a partir de una cromatografía de intercambio aniónico del TCR unido por disulfuro NY-ESO soluble que muestra la elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

Figura 17-A. SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de las fracciones de la columna desarrollada en la figura 16, como se indica B. SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) de las fracciones de la columna desarrollada en la figura 16, como indica. El pico 1 y 2 claramente contienen el heterodímero TCR que está unido por disulfuro intercadena.

Figura 18. Cromatografía de tamaño por exclusión de las fracciones reunidas del pico 1 (A) y el pico (B) en al figura 17. La proteína eluye como un solo pico principal, correspondiente al heterodímero;

La figura 19 muestra una curva de respuesta BIAcore de la unión específica de TCR soluble NY-ESO unido por disulfuro al complejo HLA-NYESO. A. Pico 1, B. pico 2;

Las figuras 20a y 29b muestran respectivamente las secuencias de ADN de las cadenas \alpha y \beta de un TCR NY-ESO soluble, mutado de manera que introduce un codón de cisteína novedoso (indicado por sombreado). Las secuencias incluyen la cisteína implicada en el enlace intercadena disulfuro nativo (indicado por el codón en letra negrita);

Las figuras 21a y 21b muestran respectivamente las secuencias de aminoácidos extracelulares de las cadenas \alpha y \beta del TCR NY-ESO producidas a partir de las secuencias de ADN de las figuras 20a y 21b;

La figura 22 muestra una pequeña cantidad obtenida a partir de una cromatografía de intercambio aniónico del TCR\alpha^{cys} \beta^{cys} NY-ESO que muestra la elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

La figura 23 muestra una pequeña cantidad obtenida a partir de una cromatografía de intercambio aniónico del TCR\alpha^{cys} NY-ESO que muestra la elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

La figura 24 muestra una pequeña cantidad obtenida a partir de una cromatografía de intercambio aniónico del TCR \beta^{cys} NY-ESO que muestra la elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

La figura 25 muestra un SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de las fracciones TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}, TCR\alpha^{cys}, y TCR\beta^{cys} NY-ESO a partir de los desarrollos de la columna de intercambio aniónico en las figuras 22-24 respectivamente. Las bandas 1 y 7 son marcadores de peso molecular, la banda 2 es el pico NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys \beta (EB/084/033); la banda 3 es el pico pequeño NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys \beta (EB/084/033), la banda 4 es NYESOdsTCR1g4 \alpha \beta-cys (EB/084/034); la banda 5 es el pico pequeño NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys \beta-cys (EB/084/035), y la banda 6 es el pico NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys \beta-cys (EB/084/035);

La figura 26 muestra un SDS-PAGE no-reductor (teñido por Coomassie) de NY-ESO de las fracciones TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}, TCR\alpha^{cys}, y TCR\beta^{cys} NY-ESO a partir de los desarrollos de la columna de intercambio aniónico en las figuras 22-24 respectivamente. Las bandas 1 y 7 son marcadores de peso molecular, la banda 2 es el pico NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys \beta (EB/084/033); la banda 3 es el pico pequeño NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys \beta (EB/084/033), la banda 4 es NYESOdsTCR1g4 \alpha \beta-cys (EB/084/034); la banda 5 es el pico pequeño NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys \beta-cys (EB/084/035), y la banda 6 es el pico NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys \beta-cys (EB/084/035);

La figura 27 es una pequeña cantidad obtenida a partir de una cromatografía de intercambio aniónico del
TCR\alpha^{cys}\beta^{cys} NY-ESO soluble que muestra la elución de proteína de la figura 22. La proteína eluye en forma de un solo pico principal, correspondiente al heterodímero;

La figura 28 es una pequeña cantidad obtenida a partir de una cromatografía de intercambio aniónico del TCR\alpha^{cys}
NY-ESO soluble que muestra la elución de proteína a partir de la figura 22. La proteína eluye en forma de un solo pico principal, correspondiente al heterodímero;

La figura 29 es una pequeña cantidad obtenida a partir de una cromatografía de intercambio aniónico del TCR\beta^{cys} NY-ESO soluble que muestra la elución de proteína de la figura 22. La proteína eluye en forma de un solo pico principal, correspondiente al heterodímero;

La figura 30 es una curva respuesta de la unión específica del TCR\alpha^{cys}\beta^{cys} NY-ESO al complejo HLA-NY-ESO;

La figura 31 es una curva respuesta de la unión específica del TCR\alpha^{cys}NY-ESO al complejo HLA-NY-ESO;

La figura 32 es una curva respuesta de la unión específica del TCR\beta^{cys}NY-ESO al complejo HLA-NY-ESO;

Las figuras 33a y 33b muestran respectivamente las secuencias de ADN de las cadenas \alpha y \beta del TCR AH-1.23, mutado de manera que introduzca un codón de cisteína novedoso (indicado por el sombreado). Las secuencias incluyen la cisteína implicada en el enlace intercadena disulfuro nativo (indicado por el codón en letra negrita)

La figura 34a y 34b muestra respectivamente las secuencias de aminoácidos de las cadenas \alpha y \beta del TCR AH-1.23 producido a partir de las secuencias de ADN de las figuras 33a y 33b;

La figura 35 es una pequeña cantidad obtenida a partir de la cromatografía de intercambio aniónico del TCR AH-1.23 soluble, que muestra la elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ que usa un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

La figura 36 es un SDS-PAGE reductor (Bis-Tris gel al 10%, teñido por Coomassie) de las fracciones AH-1.23 a partir del desarrollo de una columna de intercambio aniónico en la figura 35. Las proteínas examinadas son las fracciones de intercambio aniónico de TCR 1.23 S-S de replegado 3. La banda 1 es marcadores de peso molecular, la banda 2 es B4, la banda 3 es C2, la banda 4 es C3, la banda 5 es C4, la banda 6 es C5, la banda 7 es C6, la banda 8 es C7, la banda 9 es C8, y la banda 10 es C9.

La figura 37 es un SDS-PAGE no-reductor (Bis-Tris gel al 10%, teñido por Coomassie) de las fracciones AH-1.23 a partir del desarrollo de una columna de intercambio aniónico en la figura 35. Las proteínas examinadas son las fracciones de intercambio aniónico de TCR 1.23 S-S de replegado 3. La banda 1 es marcadores de peso molecular, la banda 2 es B4, la banda 3 es C2, la banda 4 es C3, la banda 5 es C4, la banda 6 es C5, la banda 7 es C6, la banda 8 es C7, la banda 9 es C8, y la banda 10 es C9.

La figura 38 es una pequeña cantidad obtenida a partir de la cromatografía de intercambio por exclusión de tamaño del TCR AH-1.23 soluble, que muestra la elución de proteína de las fracciones reunidas de la figura 35. La proteína eluye en forma de un solo pico principal, correspondiente al heterodímero;

Las figuras 39a y 39b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 48 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 40a y 40b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 45 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 41a y 41b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 61 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 42a y 42b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 50 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 43a y 43b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 10 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 44a y 44b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 15 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 45a y 45b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 12 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 46a y 46b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 22 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 47a y 47b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 52 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 48a y 48b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 43 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 49a y 49b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 57 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 50a y 50b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 77 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 51a y 51b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 77 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 52a y 52b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 13 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 53a y 53b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 59 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 54a y 54b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 79 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 55a y 55b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 14 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 56a y 56b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 55 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 57a y 57b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 63 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 58a y 58b muestra respectivamente las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6 soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el residuo 15 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido subrayado indica la cisteína introducida;

Las figuras 59-64 son pequeñas cantidades obtenidas a partir de la cromatografía de intercambio aniónico del TCR A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedoso entre: los residuos 48 del exón 1 de TRAC*01 y 57 del exón 1 de TRBC2*01; residuos 45 del exón 1 del TRAC*01 y 77 del exón 1 de TRBC2*01; residuos 10 del exón 1 de TRAC*01 y 17 del exón 1 de TRBC2*01; residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y exón 59 de TRBC2*01; residuos 52 del exón 1 del TRAC*01 y 55 del exón 1 de TRBC2*01; residuos 15 del exón 1 de TRAC*01 y 15 del exón 1 de TRBC2*01, respectivamente, que muestra la elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

Las figuras 65a y 65b son, respectivamente, SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedoso entre los residuos 48 del exón 1 de TRAC*01 y 57 del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura 59;

Las figuras 66a y 66b son, respectivamente, SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y 77 del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura 60;

Las figuras 67a y 67b son, respectivamente, SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los residuos 10 del exón 1 de TRAC*01 y 17 del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura 61;

Las figuras 68a y 68b son, respectivamente, SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y 59 del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura 62;

Las figuras 69a y 69b son, respectivamente, SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los residuos 52 del exón 1 de TRAC*01 y 55 del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura 63;

Las figuras 70a y 70b son, respectivamente, SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los residuos 15 del exón 1 de TRAC*01 y 15 del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura 64;

La figura 71 es una pequeña cantidad obtenida a partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedoso entre los residuos 48 del exón 1 de TRAC*01 y 57 del exón 1 de TRBC2*01, que muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir de una columna de intercambio aniónico en la figura 59;

La figura 72 es una pequeña cantidad obtenida a partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y 77 del exón 1 de TRBC2*01, que muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir de una columna de intercambio aniónico en la figura 60;

La figura 73 es una pequeña cantidad obtenida a partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los residuos 10 del exón 1 de TRAC*01 y 17 del exón 1 de TRBC2*01, que muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir de una columna de intercambio aniónico en la figura 61;

La figura 74 es una pequeña cantidad obtenida a partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y 59 del exón 1 de TRBC2*01, que muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir de una columna de intercambio aniónico en la figura 62;

La figura 75 es una pequeña cantidad obtenida a partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los residuos 52 del exón 1 de TRAC*01 y 55 del exón 1 de TRBC2*01, que muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir de una columna de intercambio aniónico en la figura 63;

La figura 76 es una pequeña cantidad obtenida a partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los residuos 15 del exón 1 de TRAC*01 y 15 del exón 1 de TRBC2*01, que muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir de una columna de intercambio aniónico en la figura 64; y

Las figuras 77-80 son curvas respuesta BIAcore que muestran, respectivamente, la unión de TCR A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedoso entre: los residuos 48 del exón 1 de TRAC*01 y 57 del exón 1 de TRBC2*01; residuos 45 del exón 1 del TRAC*01 y 77 del exón 1 de TRBC2*01; residuos 10 del exón 1 de TRAC*01 y 17 del exón 1 de TRBC2*01; y residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y exón 59 de TRBC2*01 a HLA-A2-tax pMHC.

La figura 81 en una pequeña cantidad de BIAcore que muestra la unión no específica de TCR A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedoso entre los residuos 52 del exón 1 de TRAC*01 y 55 del exón 1 de TRBC2*01 a HLA-A2-tax y a HLA-A2-NY-ESO pMHC;

La figura 82 en una curva respuesta de BIAcore que muestra la unión de TCR A6 soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedoso entre los residuos 15 del exón 1 de TRAC*01 y 15 del exón 1 de TRBC2*01 a HLA-A2-tax pMHC;

La figura 83a es un mapa de densidad electrónica alrededor del modelo con secuencia 1BD2 (cadena A Thr 164, cadena B Ser 174). El mapa trazado en 1,0, 2,0 y 3,0 \sigma. La figura 83 b es un mapa de densidad electrónica después de refinamiento con Cys en las dos posiciones A164 y B174. El mapa está trazado en los mismos niveles de \sigma que en la figura 83a;

La figura 84 compara las estructuras del TCR 1BD2 con un TCR NY-ESO de la presente invención mediante solapamiento de dichas estructuras en las representaciones de banda y espiral;

Las figuras 85a y 85b muestran las secuencias de aminoácidos y ADN respectivamente de la cadena \beta del TCR NY-ESO que incorpora un sitio de reconocimiento de biotina. El sitio de reconocimiento de biotina está subrayado;

Las figuras 86a y 86b muestran las secuencias de aminoácidos y ADN respectivamente de la cadena \beta del TCR NY-ESO que incorpora la diana hexa-histidina. La diana hexa-histidina está subrayada;

La figura 87 ilustra la elución de TCR NY-ESO soluble que contiene un enlace disulfuro novedoso y una secuencia de reconocimiento de biotina a partir de una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ que usa un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

La figura 88 ilustra la elución de TCR NY-ESO soluble que contiene un enlace disulfuro novedoso y una marca hexa-histidina a partir de una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ que usa un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

La figura 89 es un perfil de elución de proteína a partir de una cromatografía de filtración en gel de fracciones reunidas a partir del desarrollo de la columna de intercambio aniónico de NY-ESO-biotina marcado ilustrado en la figura 87;

La figura 90 es un perfil de elución de proteína a partir de una cromatografía de filtración en gel de fracciones reunidas a partir del desarrollo de la en columna de intercambio aniónico de NY-ESO-hexa-histidina marcado ilustrado en la figura 88;

Las figuras 91a-h son histogramas FACS que ilustran la intensidad de tinción producida a partir de 25.000 casos para la línea celular B transformada por EBV positivo HLA-A2 (PP LCL) incubada con las siguientes concentraciones de tetrámeros de TCR NY-ESO péptido y NY-ESO fluorescente respectivamente: TCR 0 NYESO 5 \mug, TCR 10^{-4} M NYESO 5 \mug, TCR 10^{-5} M NYESO 5 \mug, TCR 10^{-6} M NYESO 5 \mug, TCR 0 NYESO 10 \mug, TCR 10^{-4} M NYESO 10 \mug, TCR 10^{-5} M NYESO 10 \mug, TCR 10^{-6} M NYESO 10 \mug;

La figura 92 es la secuencia de ADN de la cadena beta de TCR A6 que incorpora la región constante TRBC*01;

La figura 93 es una pequeña cantidad de cromatografía de intercambio aniónico de TCR A6 que incorpora la región constante TRBC1*01 que muestra la elución de proteína de una columna POROS 50HQ que usa un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

Figura 94-A. SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de fracciones de la columna desarrollada en la figura 93. B. SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) de las fracciones de la columna desarrollada en la figura 93, como se indica;

Figura 95-cromatografía por exclusión de tamaño de las fracciones reunidas del pico 2 en la figura 93. El pico 1 contiene el heterodímero TCR que está unido por disulfuro intercadena;

Figura 96-A. Análisis BIAcore de la unión específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro a complejo HLA-Flu. B. Respuesta de unión comparada con el control para una sola inyección de TCR soluble A6 unido por disulfuro;

La figura 97 muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena beta mutada del TCR A6 que incorpora la cisteína "libre";

Figura 98 - cromatografía de intercambio aniónico del TCR A6 soluble que incorpora la cisteína "libre" que muestra la elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

Figura 99-A. SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de fracciones de la columna desarrollada en al figura 98, como se indica. B. SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) de fracciones de la columna desarrollada en al figura 98, como se indica.

Figura 100 - cromatografía por exclusión de tamaño de las fracciones reunidas del pico 2 en la figura 98. El pico 1 contiene el heterodímero TCR que es que está unido por disulfuro intercadena;

Figura 101-A. Análisis BIAcore de la unión específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro que incorpora la cisteína "libre" a complejo HLA-Flu. B. Respuesta de unión comparada con el control para una sola inyección de TCR soluble A6 unido por disulfuro;

La figura 102 muestra al secuencia de ácido nucleico de la cadena beta mutada del TCR A6 que incorpora un residuo serina mutado para la cisteína "libre";

Figura 103 - cromatografía de intercambio aniónico de TCR A6 soluble que incorpora un residuo serina mutado en la cisteína "libre" que muestra la elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;

Figura 104-A. SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de fracciones de la columna desarrollada en al figura 103, como se indica. B. SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) de fracciones de la columna desarrollada en al figura 103, como se indica. El pico 2 claramente contiene el heterodímero TCR que está unido por disulfuro intercadena.

Figura 105 - cromatografía por exclusión de tamaño de las fracciones reunidas del pico 2 en la figura 103. El pico 1 contiene el heterodímero TCR que es que está unido por disulfuro intercadena;

Figura 106-A. Análisis BIAcore de la unión específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro que incorpora un residuo serina mutado por la cisteína "libre" a complejo HLA-Flu. B. Respuesta de unión comparada con el control para una sola inyección de TCR soluble A6 unido por disulfuro;

La figura 107 muestra la secuencia de nucleótidos de pYX112;

La figura 108 muestra la secuencia de nucleótidos de pYX122;

La figura 109 muestra la secuencias de ADN y proteína del factor alfa de pre - pro apareamiento condensado a la cadena \alpha de TCR;

La figura 110 muestra la secuencias de ADN y proteína del factor alfa de pre - pro apareamiento condensado a la cadena \beta de TCR;

La figura 111 muestra una transferencia de Western de TCR soluble en la cepa SEY62510 de S. cerevisiae. La banda C contiene 60 ng de TCR NY-ESO soluble purificado como control. Las bandas 1 y 2 contienen las proteínas recogidas de los dos cultivos de levaduras transformados de TCR separados;

La figura 112 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del KpnI a la inserción EcoRI del plásmido pEX172. El resto del plásmido es pBluescript II KS-;

La figura 113 es un diagrama esquemático de las cadenas de TCR para clonación en baculovirus;

La figura 114 muestra la secuencia de ácido nucleico de la construcción de TCR \alpha A6 disulfuro como una inserción BamHI para la inserción en el plásmido de expresión pAcAB3;

La figura 115 muestra la construcción de TCR \beta A6 como una inserción en el plásmido de expresión pAcAB3; y

La figura 116 muestra un gel teñido por Coomassie y transferencia de Western contra el TCR A6 disulfuro producido bacterianamente y el TCR A6 disulfuro de insecto.

En todos los siguientes exactos, salvo que se establezca de otra manera, las cadenas de TCR producidos están truncados inmediatamente C-terminal a los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena nativo.

Ejemplo 1 Diseño de cebadores y mutagénesis de las cadenas \alpha y \beta de TCR Tax A6

Para mutar la treonina 48 de Tax A6 del exón 1 en TRAC*01 a cisteína, se diseñaron los siguientes cebadores (mutación mostrada en el caso más abajo)

5'-C ACA GAC AAA tgT GTG CTA GAC AT

5'-AT GTC TAG CAG Aca TTT GTC TGT G

Para mutar la serina 57 de Tax A6 del exón 1 en tanto TRBC1*01 como TRBC2*01 a cisteína, se diseñaron los siguientes cebadores (mutación mostrada en el caso más abajo)

5'-C AGT GGG GTC tGC ACA GAC GC

5'-GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT G

Mutagénesis por PCR

La expresión de los plásmidos que contienen los genes para la cadena \alpha y \beta del TCR A6 Tax se mutaron usando los cebadores de la cadena \alpha o los cebadores de la cadena \beta respectivamente, como sigue. 100 ng del plásmido se mezclaron con 5 \mu de dNTP 10 mM, 25 \mul de tampón 10xPfu (Stratagene), 10 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene) y el volumen final se ajustó hasta 240 \mul con H_{2}O. 48 \mul de esta mezcla se suplementó con cebadores diluidos para proporcionar una concentración final de 0,2 \muM en 50 \mul de volumen de reacción final. Después de una etapa de desnaturalización inicial de 30 segundos a 95ºC, la mezcla de reacción se sometió a 15 rondas de desnaturalización (95ºC, 30 segundos), hibridación (55ºC, 60 segundos), y elongación (73ºC, 8 minutos) en una máquina de PCR exprés Hybaid PCR. Después el producto se digirió durante 5 horas a 37ºC con 10 unidades de enzima de restricción Dpnl (New England Biolabs). 10 \mul de la reacción digerida se transformó en bacteria XL1-Blue competente y se hizo crecer durante 18 horas a 37ºC. Se cogió una colonia individual y se hizo crecer durante toda una noche en 5 ml de YTP + ampicilina (16 g/l de Bacto-Tristona, 16 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de Na ClNa, 2,5 de K_{2}HPO_{4}, 100 mg/l de ampicilina). El ADN de plásmido se purificó en una columna de Qiagen mini-prep según las instrucciones del fabricante y la secuencia se verificó mediante secuenciación automática en las instalaciones de secuenciación del departamento de bioquímica de la Universidad de Oxford. Las secuencias respectivas de aminoácidos y ADN se muestran en las figuras 2a y 3a para la cadena \alpha y las figuras 2b y 3b para la cadena \beta.

Ejemplo 2 Expresión, replegamiento y purificación de TCR soluble

Los plásmidos de expresión que contienen la cadena \alpha y la cadena \beta respectivamente se transformaron separadamente en la cepa de E. coli BL2pLysS, y las colonias individuales resistentes a ampicilina se hicieron crecer a 37ºC en medio TYP (100 \mug/ml de ampicilina) hasta una DO_{600} de 0,4 antes de inducir la expresión de proteína con IPGT 0,5 mM. Las células se recogieron tres horas después de la inducción mediante centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en un Beckman J-6B. Los sedimentos celulares se volvieron a suspender en un tampón que contenía Tris 50 mM - HCl, sacarosa al 25% (p/v), Na EDTA 1 mM, NaAzida al 0,1% (p/v), DTT 10 mM, pH 8,0. Después de toda una noche de etapa de congelación-descongelación las células se sonicaron en impulsos de 1 minuto durante un total de aproximadamente 10 minutos en un sonicador Milsonix XL2020 usando una sonda de 12 mm de diámetro convencional. Los sedimentos de los cuerpos de inclusión se recuperaron mediante centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21. Se llevaron a cabo tres lavados de detergente para retirar los desechos celulares y componentes de membrana. Cada momento el sedimento de los cuerpos de inclusión se homogenizó en un tampón Triton (Tris 50 mM - HCl, Triton-X100 al 0,5%, NaCl 200 mM, NaEDTA 10 mM, NaAzida al 0,1% (p/v), DTT 2 mM, pH 8,0) antes de sedimentarse mediante centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en un Beckman J2-21. Después se retiró la sal y detergente mediante un lavado similar en el siguiente tampón: Tris 50 mM - HCl, NaEDTA 1 mM, NaAzida al 0,1% (p/v), DTT 2 mM, pH 8,0. Finalmente, los cuerpos de inclusión se dividieron en alícuotas de 30 mg y se congelaron a -70ºC. La proteína de los cuerpos de inclusión producida se cuantificó solubilizando con guanidina 6 M - HCl y la medición con un ensayo de unión a tinte Bradford (PerBio).

Aproximadamente 30 mg (es decir, 1 \mumol) de cada cadena de cuerpos de inclusión solubilizada se descongeló de las existencias congeladas, después se mezclaron muestras y la mezcla se diluyó en 15 ml de una solución de guanidina (guanidina 6 M - clorhidrato, acetato sódico 10 mM, EDTA 10 mM), para asegurar la desnaturalización de la cadena completa. La solución de guanidina que contiene las cadenas de TCR reducidas y desnaturalizadas completamente se inyectaron después en 1 litro del siguiente tampón de replegamiento: Tris 100 mM pH 8,5, L-Arginina 400 mM, EDTA 2 mM, glutatión 5 mM reducido, glutatión oxidado 0,5 mM, urea 5 M, PMSF 0,2 mM. La solución se dejó durante 24 horas. Después el replegamiento se dializó dos veces, primeramente contra 10 litros de urea 100 mM, en segundo lugar contra 10 litros de urea 100 mM, tris 10 mM pH 8,0: Tanto la etapa de replegamiento como la de diálisis se llevaron a cabo a 6-8ºC.

sTCR se separó de los productos de degradación e impurezas cargando el replegamiento dializado en una columna de intercambio aniónico POROS 50 HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM en 50 volúmenes de columna usando un purificador Akta (Pharmacia) como en la figura 4. Las fracciones de los picos se almacenaron a 4ºC y se analizaron mediante SDS-PAGE teñido por Coomassie (figura 5) antes de reunirse y concentrarse. Finalmente el sTCR se purificó y caracterizó usando una columna de filtración en gel Superdex 200HR (figura 6) preequilibrada en tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,5 mM, nonidet p40 al 0,05%). El pico que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se reunió y se concentró antes de caracterización por análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore.

Ejemplo 3 Caracterización de resonancia de plasmón superficial de la unión de sTCR a pMHC específico

Se uso un biosensor de resonancia de plasmón superficial (BIAcore 3000™) para analizar la unión de un sTCR a su ligando péptido-MHC. Esto se facilitó por la producción de complejos individuales pMHC (descritos más adelante) que se inmovilizaron a una superficie de unión revestida por estreptavidina de una manera semiorientada, que permite el análisis eficaz de la unión de un receptor de células T soluble hasta a cuatro pMHC diferentes (células de flujo inmovilizadas o separadas) simultáneamente. La inyección manual de complejo de HlA permite el nivel preciso de moléculas de la clase I inmovilizada que se va a manipular fácilmente.

Tales complejos inmovilizados son capaces de unirse a tanto los receptores de las células T como el correceptor CD8\alpha\alpha, los cuales se pueden inyectar en la fase soluble. La unión específica de TCR se obtiene incluso a bajas concentraciones (al menos 40 \mug/ml), que implica que el TCR es relativamente estable. Las propiedades de unión de pMHC del sTCR se observan que son cualitativamente y cuantitativamente similares si se usa sTCR bien en la fase soluble o en la inmovilizada. Esto es un control importante para la actividad parcial de especies solubles y también sugiere que los complejos pMHC biotinilados son biológicamente tan activos como los complejos no biotinilados.

Los complejos HLA-A2-péptido de la clase I biotinilada se replegaron in vitro a partir de cuerpos de inclusión expresados bacterianamente que contienen las proteínas de las susbunidades constituyentes y péptido sintético, seguido de la purificación y biotinilación enzimática in vitro (O'Callaghan y col., (1999) Anal Biochem. 266: 9-15). La cadena pesada de HLA se expresó con una marca de biotinilación C-terminal que reemplaza los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína en una construcción apropiada. Se obtuvieron niveles de expresión de los cuerpos de inclusión de aproximadamente 75 mg/litro de cultivo bacteriano. También se expresó la cadena ligera de HLA o la microglobulina \beta2 como cuerpos de inclusión en E. coli a partir de una construcción apropiada, a un nivel de aproximadamente 500 mg/litro de cultivo bacteriano.

Se lisaron células de E. coli y los cuerpos de inclusión se purificaron hasta aproximadamente 80% de pureza. La proteína de los cuerpos de inclusión se desnaturalizaron en guanidina 6 M, - HCl, Tris 50 mM pH 8,0,NaCl 100 mM, DTT 10 mM, EDTA 10 mM, y se replegó a una concentración de 30 mg/litro de cadena pesada, 30 mg/litro de \beta2 en L-arginina 0,4 M - HCl, Tris 100 mM pH 8,1, cistamina 3,7 mM, cistamina 0M, 4 mg/ml de péptido (por ejemplo, tax 11-19), mediante la adición de un solo pulso de proteína desnaturalizada en tampón de replegado a < 5ºC. El replegamiento se dejó que alcanzara la terminación a 4ºC durante al menos 1 hora.

El tampón se intercambió mediante diálisis en 10 volúmenes de Tris 10 mM pH 8,1. Fueron necesarios dos cambios de tampón para reducir la resistencia iónica de la solución de manera suficiente. La solución de proteína se filtró después a través de filtro de acetato de celulosa de 1,5 \mum y se cargó en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ (8 ml de volumen de lecho). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-500 mM. El complejo HLA-A2-péptido eluyó a aproximadamente NaCl 250 mM, y se recogieron las fracciones pico, se añadió un cóctel de inhibidores de proteasa (Calbiochem) y las fracciones se enfriaron en hielo.

Los complejos de HLA marcados por bionialción se intercambiaron en tampón en Tris 10 mM pH 8,1, NaCl 5 mM usando una columna desaladora ultra-rápida de Pharmacia equilibrada en el mismo tampón. Inmediatamente después de la elución, las fracciones que contienen proteínas se enfriaron sobre hielo y se añadió el cóctel de inhibidores de proteasas (Calbiochem). Después se añadieron reactivos de biotinilación: biotina 1 mM, ATP 5 mM (tamponado hasta pH 8), MgCl_{2} 7,5 mM y 5 \mug/ml de enzima BirA (purificada según O'Callaghan y col., (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Después la mezcla se dejo que se incubara a temperatura ambiente durante toda una noche.

Los complejos de HLA biotinilados se purificaron usando cromatografía de filtración sobre gel. Una columna Superdex 75 HR 10/30 de Pharmacia se preequilibró con PBS filtrado y se cargó 1 ml de la mezcla de reacción de biotinilación y la columna se desarrolló con PBS a 0,5 ml/min. Los complejos de HLA biotinilados eluidos en forma de un solo pico a aproximadamente 15 ml. Las fracciones que contenían proteína se reunieron, se enfriaron en hielo, y se añadió el cóctel de inhibidores de proteasas. La concentración de proteína se determinó usando un ensayo de unión de Coomassie (PerBio) y se almacenaron congelados complejos de HLA biotinilados a -20ºC. Se inmovilizó estreptavidina mediante procedimientos de acoplamiento de amina normalizados.

Las interacciones entre sTCR A6 Tax que contenía un enlace intercadena novedoso y su complejo ligando/MHC o una combinación HLA-péptido irrelevante, la producción de los cuales se ha descrito anteriormente, se analizaron en un biosensor de resonancia de plasmón superficial (SPR) BIAcore 3000™. SPR mide los cambios en los índices de refracción expresados en unidades de respuesta (RU) cerca de una superficie sensora dentro de una célula de flujo pequeño, un principio que se puede usar para detectar interacciones de receptor de ligando y analizar su afinidad y parámetros cinéticos. Las células de flujo de sonda se prepararon inmovilizando los complejos individuales HLA-péptido en células de flujo separadas mediante la unión entre la biotina entrecruzada en \beta2m y estreptavidina que se había entrecruzado químicamente a la superficie activa de las células de flujo. Después el ensayo se realizó mediante pase de sTCR en las superficies de las diferentes células de flujo a un caudal constante, midiendo la respuesta de SPR haciendo esto. Inicialmente, la especificidad de la interacción se verificó pasando sTCR a un flujo constante de 5 \mul/min sobre dos superficies diferentes; uno revestido con aproximadamente 5000 RU de complejo péptido-HLA específico, el segundo revestido con aproximadamente 5000 RU de complejo-péptido HLA no específico (inserción en la figura 7): Las inyecciones de sTCR soluble a un caudal constante y diferentes concentraciones sobre el complejo péptido-HLA se usaron para definir la resonancia de fondo. Los valores de estas mediciones de control se sustrajeron de los valores obtenidos con complejo péptido-HLA específico y se usaron para calcular las afinidades de unión expresadas como la constante de disociación, Kd (Price y Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemist (edición 2ª) 1979, Clarendon Press, Oxford), como en la figura 7.

El valor de Kd obtenido (1,8 \muM) está cerca del reseñado para la interacción entre el sTCR A6 Tax sin el enlace disulfuro novedoso y pMHC (0,91 \muM - Ding y col., 1999, Immunity 11: 45-56).

Ejemplo 4 Producción de TCR JM22 que contiene un enlace disulfuro novedoso

La cadena \beta del TCR A6 soluble preparada en el ejemplo 1 contiene en la secuencia un sitio de restricción BgIII (AAGCTT) adecuado para uso como sitio de ligación.

La mutagénesis por PCR se llevó a cabo como se detalla más adelante para introducir un sitio de restricción BamH1 (GGATCC) en la cadena \alpha del TCR A6 soluble, 5' del codón de cisteína novedosos. La secuencia descrita en al figura 2a se usó como molde para esta mutagénesis. Se usaron los siguientes cebadores:

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Se mezclaron 100 ng del plásmido con 5 \mul de dNTP 10 mM, 25 \mul de tampón 10xPfu (Stratagene), 10 unidades de Pfu polimerada (Stratagene) y el volumen final se ajustó hasta 240 \mul con H_{2}O. Se suplementaron 48 \mul de esta mezcla con cebadores diluidos para proporcionar una concentración final de 0,2 \muM en 50 \mul de volumen de reacción final. Después de una etapa de desnaturalización inicial de 30 segundos a 95ºC, la mezcla de reacción se sometió a 15 rondas de desnaturalización (95ºC, 30 segundos), hibridación (55ºC, 60 segundos), y elongación (73ºC, 8 minutos) en una máquina de PCR exprés Hybaid PCR. Después el producto se digirió durante 5 horas a 37ºC con 10 unidades de enzima de restricción Dpnl (New England Biolabs). 10 \mul de la reacción digerida se transformó en bacteria XL1-Blue competente y se hizo crecer durante 18 horas a 37ºC. Se cogió una colonia individual y se hizo crecer durante toda una noche en 5 ml de YTP + ampicilina (16 g/l de Bacto-Tristona, 16 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 2,5 g/l de K_{2}HPO_{4}, 100 mg/l de ampicilina). El ADN de plásmido se purificó en una columna de Qiagen mini-prep según las instrucciones del fabricante y la secuencia se verificó mediante secuenciación automática en las instalaciones de secuenciación del departamento de bioquímica de la Universidad de Oxford. Las mutaciones introducidas en la cadena \alpha se "silenciaron", por lo tanto las secuencias de aminoácidos de esta cadena permanecían sin cambiar a partir de lo detallado en la figura 3a. La secuencia de ADN para la cadena \alpha mutada se muestra en la figura 8a.

Con el fin de producir un TCR Jm22 soluble que incorpora un enlace disulfuro novedoso, los plásmidos de TCR A6 que contienen los sitios de restricción de la cadena \alpha BamH1 y BgIII de la cadena \beta.se usaron como moldes. Se usaron los siguientes cebadores:

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Las construcciones TCR JM22 de las cadenas \alpha y \beta se obtuvieron mediante clonación por PCR como sigue. Las reacciones de PCR se realizaron usando los cebadores como se ha mostrado anteriormente, y moldes que contienen las cadenas del TCR JM22. Los productos de PCR se digirieron por restricción con las enzimas de restricción relevantes, y se clonaron en pGMT7 para obtener plásmidos de expresión. La secuencia de las inserciones del plásmido se confirmó mediante secuenciación automática de ADN. Las figuras 8b y 8c muestran la secuencia de ADN de las cadenas \alpha y \beta mutadas de TCR JM22 respectivamente, y las figuras 9a y 9b muestran las secuencias de aminoácidos resultantes.

Las cadenas de TCR respectivas se expresaron, se co-replegaron y se purificaron como se describe en los ejemplos 1 y 2. La figura 10 ilustra la elución de la elución de proteína de TCR JM22 soluble unido por disulfuro a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos. La figura 11 muestra los resultados de geles tanto SDS-ELISA reductor (teñido por Coomassie) como SDS-ELISA no reductor (teñido por Coomassie) de las fracciones a partir del desarrollo de la columna ilustrada en la figura 10. El pico 1 contiene claramente el heterodímero de TCR que está unido por disulfuro intercadena. La figura 12 muestra elución de proteína a partir de una columna de tamaño por exclusión de las fracciones reunidas del pico 1 en la figura 10.

El análisis de BIAcore se la unión del TRC JM22 a pMHC se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 3. La figura 13a muestra análisis BIAcore de la unión específica del TCR JM22 soluble unido por disulfuro a complejo HLA-Flu. La figura 13b muestra la respuesta de unión comparada con el control para una sola inyección del TCR JM22 soluble unido por disulfuro para el complejo HLA-flu se determinó que era 7,9 \pm 0,51 \muM.

Ejemplo 5 Producción de TCR NY-ESO que contiene un enlace disulfuro novedoso

El ADNc que codifica el TCR NY-ESO se aisló a partir de las células T suministradas por Enzo Cerundolo (Instituto de medicina molecular, Universidad de Oxford) según técnicas conocidas. El ADNc que codifica el TCR NY-ESO se produjo mediante tratamiento del ARNm con transcriptasa inversa.

Con el fin de producir un TCR NY-ESO que incorpora un enlace disulfuro novedoso, los plásmidos de TCR A6 que contienen sitios de restricción de la cadena \alpha BamH1 y BgIII de la cadena \beta se usaron como moldes como se ha descrito en el ejemplo 4. Se usaron los siguientes cebadores:

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Las construcciones de las cadenas \alpha y \beta del TCR NY-ESO se obtuvieron mediante clonación por PCR. La reacciones de PCR se realizaron usando los cebadores como se ha mostrado anteriormente, y los moldes que contenían las cadenas de TCR NY-ESO. Los productos de PCR se digirieron por restricción con las enzimas de restricción relevantes, y se clonaron en pGMT7 para obtener plásmidos de expresión. La secuencia de las inserciones de plásmido se confirmaron mediante secuenciación de ADN automática. Las figuras 14a y 14b muestran la secuencia de ADN de las cadenas \alpha y \beta del TCR NY-ESO respectivamente, y las figuras 15a y 15b muestran las secuencias de aminoácidos resultantes.

Las respectivas cadenas de TCR se expresaron, se co-replegaron y se purificaron como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2, excepto para las siguientes alteraciones en el protocolo.

Desnaturalización de los TCR solubles: 30 mg del cuerpo de inclusión de la cadena \beta de TCR solubilizado y 60 mg del cuerpo de inclusión de la cadena \alpha de TCR solubilizado se descongelaron de las existencias congeladas. Los cuerpos de inclusión se diluyeron hasta una concentración final de 5 mg/ml en solución de guanidina 6 M, y DTT (solución madre 2 M) se añadió hasta una concentración final de 10 mM. La mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos.

Replegamiento de los TCR solubles: Se agitó vigorosamente 1 l de tampón de replegamiento a 5ºC \pm 3ºC. La pareja redox (2-mercaptoetilamina y cistamina) (hasta una concentración final de 6,6 mM y 3,7 mM, respectivamente) se añadieron aproximadamente 5 minutos antes de la adición de las cadenas de TCR desnaturalizadas. Después se dejó que la proteína se replegara durante aproximadamente 5ºC \pm 3ºC.

Diálisis de los TCR solubles replegados: El TCR replegado se dializó en una membrana Spectrapor 1 (Spectrum; producto nº 132670) contra 10 l de Tris 10 mM pH 8,1 a 5ºC \pm 3ºC durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el tampón de diálisis se cambió a Tris 10 mM reciente pH 8,1 (10 l) y se continuó la diálisis a 5ºC \pm 3ºC durante otras 20-22 horas.

La figura 16 ilustra la elución de la elución de proteína de TCR unido por disulfuro NY-ESO soluble a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos. La figura 17 muestra los resultados de geles de tanto SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) como SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) de fracciones a partir la columna desarrollada ilustrada por la figura 16. Los picos 1 y 2 claramente contienen heterodímero de TCR que está unido por disulfuro intercadena. La figura 18 muestra una cromatografía por exclusión de tamaño de fracciones reunidas del pico 1 (A) y el pico 2 (B) en la figura 17. La proteína eluye como un pico individual principal, correspondiente al heterodímero.

El análisis de BIAcore de la unión del TCR NY-ESO unido por disulfuro a pMHC se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 3. La figura 19 muestra el análisis de BIAcore de la unión específica de TCR soluble NY-ESO unido por disulfuro al complejo HLA-NYESO. A pico 1, B. pico 2.

La Kd de este TCR unido por disulfuro para el complejo HLA-NY-ESO se determinó que era 9,4 \pm 0,84 \muM.

Ejemplo 6 Producción de TCR NY-ESO soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos, y al menos uno de las dos cisteínas requeridas para formar el enlace intercadena disulfuro novedosos

Con el fin de producir un TCR NY-ESO soluble que incorpora un enlace disulfuro novedoso y al menos uno de los residuos cisteína implicados en el enlace intercadena disulfuro nativo, plásmidos que contienen los sitios de restricción BamH1 de la cadena \alpha y BgIII de la cadena \beta, se usaron como moldes como un marco conservado como se describe en el ejemplo 4. Se usaron los siguientes cebadores:

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Las construcciones de las cadenas \alpha y \beta del TCR NY-ESO se obtuvieron mediante clonación por PCR. La reacciones de PCR se realizaron usando los cebadores como se ha mostrado anteriormente, y los moldes que contenían las cadenas de TCR NY-ESO. Los productos de PCR se digirieron por restricción con las enzimas de restricción relevantes, y se clonaron en pGMT7 para obtener plásmidos de expresión. La secuencia de las inserciones de plásmido se confirmaron mediante secuenciación de ADN automática. Las figuras 20a y 20b muestran la secuencia de ADN de las cadenas \alpha y \beta del TCR NY-ESO respectivamente, y las figuras 21a y 21b muestran las secuencias de aminoácidos resultantes.

Para producir un TCR NY-ESO soluble que contiene tanto un enlace intercadena disulfuro no nativo como el enlace intercadena disulfuro nativo, se usó ADN aislado usando ambos cebadores anteriores. Para producir los TCR NY - ESO solubles con un enlace intercadena disulfuro no nativo y solamente uno de los residuos cisteína implicado en el enlace intercadena disulfuro nativo, se usó ADN aislado usando uno de los cebadores anteriores junto con el cebador apropiado del ejemplo 5.

Las respectivas cadenas de TCR se expresaron, se co-replegaron como se ha descrito en el ejemplo.

Las figuras 22-24 ilustran la elución de TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}NY-ESO soluble (es decir con cisteínas no nativas y nativas en ambas cadenas), TCR\alpha^{cys} (es decir con cisteínas no nativas en ambas cadenas pero la cisteína nativa en la cadena \alpha solamente), y TCR\beta^{cys} (es decir con cisteínas no nativas en ambas cadenas pero la cisteína nativa en la cadena \beta solamente) la elución de proteína a partir de columnas de intercambio aniónico POROS 50 HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos. Las figuras 25 y 26 respectivamente muestran los resultados de geles de SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) y SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) de los desarrollos de las fracciones de los desarrollos de las columnas TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}, TCR\alpha^{cys}, y TCR\beta^{cys} ilustrados en las figuras 22-24. Éstas claramente indican que se han formado los heterodímeros de TCR que están unidos por disulfuro intercadena. Las figuras 27-29 son perfiles de elución de proteínas a partir de cromatografía de filtración en gel de fracciones reunidas a partir de desarrollos de la columna de intercambio aniónico de TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}, TCR\alpha^{cys}, y TCR\beta^{cys} ilustrados en las figuras 22-24 respectivamente. La proteína eluye en forma de un solo pico principal, correspondiente al heterodímero de TCR.

Se llevó a cabo un análisis de BIAcore de unión de sTCR a pMHC como se ha descrito en el ejemplo 3. Las figuras 30-32 muestran análisis de BIAcore de la unión específica de TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}, TCR\alpha^{cys}, y TCR\beta^{cys} NY-ESO respectivamente a complejo HLA-NYESO.

TCR\alpha^{cys}\beta^{cys} tenía una K_{d} de 18,08 \pm 2,075, TCR\alpha^{cys} tenía una K_{d} de 19,24 \pm 2,01 \muM, y y TCR\beta^{cys} tenía una K_{d} de 22,5 \pm 4,0692 \muM.

Ejemplo 7 Producción del TCR AH-1.23 que contiene un enlace intercadena disulfuro novedoso

El ADNc que codifica AH-1.23 se aisló a partir de las células T suministradas por Hill Gaston (Medical School, Addenbrooke's Hospital, Cambridge) según técnicas conocidas. El ADNc que codifica el TCR NY-ESO se produjo mediante tratamiento del ARNm con transcriptasa inversa.

Con el fin de producir un TCR AH-1.23 que incorpora un enlace disulfuro novedoso, los plásmidos de TCR que contienen sitios de restricción de la cadena \alpha BamH1 y BgIII de la cadena \beta se usaron como un marco conservado como se ha descrito en el ejemplo 4. Se usaron los siguientes cebadores:

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Las construcciones de las cadenas \alpha y \beta se obtuvieron mediante clonación de PCR como sigue. Las reacciones de PCR se realizaron usando los cebadores como se ha mostrado anteriormente, y los moldes que contienen las cadenas de TCR AH-1.23. Los productos de PCR se digirieron por restricción con las enzimas de restricción relevantes, y se clonaron en pGMT7 para obtener plásmidos de expresión. La secuencia de las inserciones de plásmido se confirmaron mediante secuenciación de ADN automática. Las figuras 33a y 33b muestran la secuencia de ADN de las cadenas \alpha y \beta del TCR AH-1.23 respectivamente, y las figuras 34a y 34b muestran las secuencias de aminoácidos resultantes.

Las respectivas cadenas de TCR se expresaron, se co-replegaron y se purificaron como se ha descrito en el ejemplo 5.

La figura 35 ilustra la elución de la elución de proteína de TCR unido por disulfuro AH-1.23 soluble a partir de una columna de intercambio aniónico POROS 50 HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de puntos. Las figuras 36 y 37 muestran los resultados de los geles de SDS - PAGE reductor (teñido por Coomassie) y SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) respectivamente del desarrollo de las fracciones de la columna ilustrada en al figura 35. Estos geles claramente indican la presencia de un heterodímero de TRC que está unido por disulfuro intercadena. La figura 38 es el perfil de elución del desarrollo de una columna de filtración de gel Superdex 75 HR del desarrollo de las fracciones reunidas de la columna de intercambio aniónico ilustrado en la figura 35. La proteína eluye en forma de un solo pico principal, correspondiente al heterodímero.

Ejemplo 8 Producción de los TCR A6 solubles que contienen un enlace intercadena disulfuro novedosos en lasa posiciones alternativas dentro de la región inmunoglobulina del dominio constante

Se llevaron a cabo los siguientes experimentos con el fin de investigar si era posible formar los TCR solubles funcionales que incluyen un enlace disulfuro novedoso en la región de inmunoglobulina de TCR en una posición distinta de entre treonina 48 del exón 1 en TRAC*01 y serina 57 del exón en ambos TRBC*01 / TRBC2*01.

Para la mutación de la cadena \alpha de TCT A6, se usaron los siguientes cebadores (los números en los nombres de los cebadores se refieren a la posición del residuo de de aminoácidos a mutar en el exón 1 de TRAC*01, los residuos mutados se muestran en el caso a continuación):

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Para mutar la cadena \beta de TCR A6, se diseñaron los siguientes cebadores (los números en los nombres de los cebadores se refieren a la posición del residuo de de aminoácidos a mutar en el exón 1 de TRBC*01. Los residuos mutados se muestran en el caso a continuación):

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La mutagénesis de PCR, amplificación de la construcción de TCR \alpha y \beta, ligación y purificación de plásmido se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 1 usando la combinación apropiada de los cebadores anteriores con el fin de producir los TCR solubles incluyendo enlaces intercadena disulfuro novedosos entre los pares siguientes de aminoácidos:

Cadena \alpha de TCR	Cadena \beta de TCR	Cebador \alpha usado	Cebador \beta usado
Thr 48	Ser 57	T48 \rightarrow C	S 57 \rightarrow C
Tfr 45	Ser 77	T45 \rightarrow C	S 77 \rightarrow C
Ser 61	Ser 57	S 61 \rightarrow C	S 57 \rightarrow C
Leu 50	Ser 57	L 50 \rightarrow C	S 57 \rightarrow C
Tyr 10	Ser 17	Y 10 \rightarrow C	S 17 \rightarrow C
Ser 15	Val 13	S 15 \rightarrow C	V 13 \rightarrow C
Thr 45	Asp 59	T 45 \rightarrow C	D 59 \rightarrow C
Leu 12	Ser 17	L 12 \rightarrow C	S 17 \rightarrow C
Ser 61	Arg 79	S 61 \rightarrow C	R 79 \rightarrow C
Leu 12	Phe 14	L 12 \rightarrow C	F 14 \rightarrow C
Val 22	Phe 14	V 22 \rightarrow C	F 14 \rightarrow C
Met 52	Gly 55	M 52 \rightarrow C	G 55 \rightarrow C
Tyr 43	Leu 63	Y 43 \rightarrow C	L 63 \rightarrow C
Ser 15	Glu 15	S 15 \rightarrow C	E 15 \rightarrow C

Las figuras 39 a 58 muestran las secuencia de ADN y aminoácidos de las cadenas de TCR A6 mutadas amplificadas por los cebadores anteriores. Los codones que codifican las cisteínas mutadas están subrayados.

Las cadenas de TCR respectivas se expresaron, se co-replegaron y se purificaron como se describe en el ejemplo 5. Después de al purificación en una columna de intercambio aniónico POROS 50 HQ, las proteínas resultantes se desarrollaron en geles SDS-PAGE con el fin de valorar si se habían formado cualquier TCR replegado correctamente. Estos geles se valoraron también para averiguar la presencia o ausencia de cualquier proteína unida por disulfuro del peso molecular correcto en el material purificado. Los TCR en investigación que contienen los siguientes enlaces intercadena disulfuro novedosos no producían proteína unida por disulfuro del peso molecular usando este sistema de expresión bacteriano y éstos no se valoraron adicionalmente. Sin embargo, están disponibles sistema de expresión procarióticos o eucarióticos.

\newpage

Cadena \alpha de TCR	Cadena \beta de TCR
Ser 61	Ser 57
Leu 50	Ser 57
Ser 15	Val 13
Leu 12	Ser 17
Ser 61	Arg 79
Leu 12	Phe 14
Val 22	Phe 14
Tyr 43	Leu 63

Las figuras 59 a 64 ilustran respectivamente la elución de los TCR solubles que contienen enlaces intercadena disulfuro novedosos entre los siguientes residuos: Thr 48-Ser 57, Thr 45-Ser 77, Tyr 10-Ser 17, THr 45- Asp 59, Met 52-Gly 55 y Ser 15-Glu 15 a partir de una columna de intercambio aniónico POROS 200 HQ usando un gradiente de NaCl 0-500 mN, como se indica por la línea de puntos. Las figuras 65 a 70 muestran los resultados de geles SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) y no reductor (teñido por Coomassie) respectivamente de fracciones de los desarrollos de la columna ilustrados en las figuras 59 a 64. Estos geles indican claramente la presencia de heterodímeros de TCR que están unidos por disulfuro intercadena.

Las figuras 71 a 76 son perfiles de elución de una columna de filtración sobre gel Superdex 200 HR de las fracciones reunidas a partir de los desarrollos de la columna de intercambio aniónico ilustrados en las figuras 59 a 64.

El análisis de BIAcore de la unión de los TCR a pMHC se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 3. Las figuras 77-82 son pequeñas cantidades de BIAcore que demuestran la capacidad de los TCR solubles purificados para unirse a los complejos HLA-A2 tax pMHC.

Thr 48-Ser 57 tenía una K_{d} de 7,8 \muM, Thr 45-Ser 77 tenía una K_{d} de 12,7 \muM, Tyr 10-Ser 17 tenía una K_{d} de 34 \muM, Thr 45-Asp 59 tenía una K_{d} de 14,9 \muM, y Ser 15-Glu 15 tenía una K_{d} de 6,3 \muM. Met 52-Gly 55 era capaz de unirse a su "diana" nativa, el complejo HLA-A2 tax, aunque también unido de una manera similar a una diana "irrelevante", el complejo HLA-A2-NY-ESO (véase la figura 81).

Ejemplo 9 Cristalografía de rayos X del receptor de las células T NY-ESO unido por disulfuro, específico para el complejo NY-ESO-HLA-A2

El dsTCR NY-ESO se clonó como se ha descrito en el ejemplo 5, y se expresó como sigue.

Los plásmidos de expresión que contenían la cadena \alpha y cadena \beta mutadas respectivamente se transformaron separadamente en la cepa de E. coli BL21 pLysS, y las colinas resistentes a ampicilina individuales se hicieron crecer a 37ºC en medio TYP (ampicilina 100 \mug/ml) hasta DO_{600} de 0,7 antes de inducir la expresión de proteína con IPTG 0,5 mM. Las células se recogieron 18 horas después de la inducción mediante centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en un Beckman J-6B. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis que contiene Tris 10 mM - HCl pH 8,1, MgCl_{2} 10 mM, NaCl 150 mM, DTT 2 mM, glicerol al 10%. Para cada 1 l de cultivo de bacterias se añadieron 100 \mul de lisozima (20 mg/ml) y 100 \mul de ADNasa I (20 \mug/ml). Después de la incubación sobre hielo durante 30 minutos, la suspensión bacteriana se sonicó en pulsos de 1 minuto para un total de 10 minutos usando un sonicador Milsonix XL2020 con una sonda de 12 mm de diámetro convencional. Los sedimentos de los cuerpos de inclusión se recuperaron mediante centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21 (4ºC). Después se llevaron a cabo tres lavados en tampón de lavado Triton (Tris 50 mM - HCl, pH 8,1, Triton-X100 al 0,5%, NaCl 100 mM, NaEDTA 10 mM, 0,1% (p/v), DTT 2 mM) para retirar los desechos celulares y componentes de membrana. Cada vez, el sedimento de cuerpos de inclusión se homogenizó en tampón de lavado Tritón antes de centrifugarse por centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en un J2-21 Beckman. Después se retiró la sal y detergente mediante un lavado similar en tampón de resuspensión (Tris 50 mM - HCl, pH 8,1 NaCl 100 mM, NaEDTA 10 mM, DTT 2 mM. Finalmente, los cuerpos de inclusión se solubilizaron en tampón guanidina 6 M (guanidina 6 M - clorhidrato, Tris 50 mM pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 10 mM) se dividieron en alícuotas de 120 mg y se congelaron a -70ºC. Los cuerpos de inclusión se cuantificaron solubilizando con guanidina 6 M - HCl y la medición con un ensayo de unión a tinte Bradford (PerBio).

Aproximadamente 60 mg (es decir, 2,4 \mumoles) de cada cadena de la cadena alfa solubilizada se mezcló con 30 mg (es decir 1,2 \mumoles) de la cadena beta solubilizada congelada. La mezcla de TCR se diluyó hasta un volumen final de 18 ml con tampón guanidina 6 M y se calentó hasta 37ºC durante 30 minutos para asegurar la desnaturalización de la cadena completa. La solución de guanidina que contiene las cadenas de TCR reducidas y desnaturalizadas completamente se mezclaron después en 1 litro del tampón de replegamiento (Tris 100 mM pH 8,1, L-Arginina 400 mM - HCl, EDTA 2 mM, 2-mercaptoetilamina 6,6 mM, cistamina 3,7 mM, urea 5 M) con agitación. La solución se dejó durante 5 horas en la habitación enfriada (5ºC \pm 3ºC) para dejar que tuviera lugar el replegamiento. Después el replegamiento se dializó contra 12 litros de agua durante 18-20 horas, seguido de 12 litros de Tris 10 mM pH 8,1 durante 18-20 horas (5ºC \pm 3ºC). Spectrapor 1 (Spectrum Laboratories, producto nº 132670) membrana de diálisis que tiene un corte de peso molecular de 6-8000 kDa se usó para el procedimiento de diálisis. La proteína dializada se filtró a través de filtros de tamaño de poro de 0,45 \mum (Schleicher y Schuell, número de referencia, 10 404012) ajustada a una unidad de filtración Nalgene.

El TCR NY-ESO replegado se separó de los productos de degradación e impurezas cargando el replegamiento dializado en una columna de intercambio aniónico POROS 50 HQ (Applied Biosystems) usando un purificador ÄKTA (Amersham Biotech). Una columna POROS 50 HQ se preequilibró con 10 volúmenes de columna de tampón A (Tris 10 mM pH 8,1) antes de cargar con proteína. La proteína unida se eluyó con un gradiente de NaCl 0-500 mM. Las fracciones de los picos (1 ml) se analizaron sobre SDS-PAGE de desnaturalización usando tampón de muestra reductor y no reductor. Las fracciones de los picos que contenían el complejo heterodimérico alfa-beta se purificaron adicionalmente usando una columna de filtración en gel Superdex 75 HR preequilibrada en MES 25 mM pH 6,5. El pico de proteína que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se reunió, se concentró hasta 42 mg/ml en concentradores de centrífuga Ultrafree (Millipore, número de parte UFV2BGC40) y se almacenó a -80ºC.

La cristalización del TCR NY-ESO se realizó mediante la técnica de gota colgante a 18ºC usando 1 \mul de solución de proteína (8,4 mg/ml) en Mes 5 mM pH 6,5 mezclado con un volumen equivalente de tampón de cristalización. Los cristales aparecieron en varias condiciones diferentes usando tampones de selección de cristal (Hapton Research). Se desarrollaron cristales cúbicos individuales (< 100 \mum) en PEG 4000 al 30%, citrato de socio 0,1 M pH 5,6, tampón de acetato amónico 0,2 M y se usó para determinación de la estructura.

Los cristales del TCR NY-ESO se ultra-congelaron y se ensayaron para difracción en el haz de rayos X del sincrotron de Daresbury. Los cristales difractados a 0,25 nm (2,5 \ring{A}) de resolución. Un conjunto de datos de recogió y se procesó para proporcionar un 98,6% de conjunto completo de amplitudes que eran razonables a alrededor de 0,27 nm (2,7 \ring{A}), pero utilizable hasta 0,25 nm (2,5 \ring{A}). El factor R emergente, es decir el acuerdo entre las mediciones de reflexiones cristalográficamente equivalentes, era 10,8% para todos los datos. Esto es marginal en el caparazón de resolución más alto. El grupo espacial era P2_{1}, con dimensiones celulares a = 4,25 nm (42,5 \ring{A}), b = 5,95 nm (59,5 \ring{A}), c = 8,17 nm (81,7 \ring{A}), \beta = 91,5º. Las dimensiones celulares y significado de simetría eran dos copias en la célula. La unidad asimétrica, ua o el volumen mínimo que necesita estudiarse, tiene solamente 1 molécula, y la otra molécula en la célula se genera mediante la operación de simetría 2_{1}. El posicionamiento de la molécula en la ua es arbitraria en la dirección y. Siempre que esté en la posición correcta en el plano x-z, se puede traducir a voluntad en la dirección y. Esto se refiere a como un parámetro libre, en este grupo espacial "polar".

La base de datos PDB tiene solamente una entrada que contiene un TCR heterodimérico A/B, 1BD2. Esta entrada también tiene coordenadas del péptido HLA-afín en el complejo con el TCR. La cadena B del TCR era la misma en NY-ESO, pero la cadena A tenía pequeñas diferencias en el dominio C y diferencias significativas en el dominio N. Usando el modelo 1BD2 A/B para el reemplazo molecular, RM, proporcionó una solución incorrecta, como se muestra por solapamiento por extensión con moléculas equivalentes simétricas. El uso de la cadena B sola proporcionó una solución mejor que no tuvo conflictos significativos con los vecinos. El coeficiente de correlación era 49%, el 50% del factor R cristalográfico, y el planteamiento más cercano (centro de gravedad a c-o-g) era 0,49 nm (49 \ring{A}). La operación de rotación y traslación necesaria para transformar el modelo de la cadena B de partida al equivalente RM, se aplicó a la cadena A. La solución de RM híbrida así generada, se empaquetó bien en la célula, con conflictos mínimos.

Los mapas de densidad electrónica generalmente estaban de acuerdo con el modelo, y permitió su ajuste para emparejar la secuencia del TCR NY-ESO. Pero el modelo de partida tenía muchos huecos, específicamente perdiendo cadenas laterales, que son características de porciones escasamente ordenadas del modelo. Muchos de los bucles de alfiler del pelo entre las hebras tenían muy poca densidad, y eran difíciles para el modelo. El factor R de cristalización del modelo es 30%. El factor R es un residuo, es decir, es la diferencia entre las amplitudes calculadas y observadas.

Como demuestran las figuras 83a y 83b, la secuencia de entrada de IBD2 no coincidía con la densidad muy bien. El cambio del modelo por Cys en las posiciones 164 en la cadena A, y 174 en la cadena B, seguido de refinamiento adicional, mostró claramente que esta asignación de secuencia se ajusta mucho mejor a la densidad. Pero las diferencias en términos de tamaño de la cadena lateral son mínimas, de este modo había poca perturbación en el modelo. La densidad electrónica en esa región está poco cambiada.

El aspecto más importante en este trabajo es que el nuevo TCR es muy similar en estructura al modelo publicado (1BD2). La comparación podría incluir todo el TCR, los dominios constantes, o la parte pequeña próxima al punto de mutación.

Los valores de desviación r. c. m. se enumeran en la tabla más adelante. La comparación de las estructuras se muestra en la figura 84.

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	Cadena A	Cadena B	Cadena A	Cadena B	Alargamiento
	completa	completa	constante	constante	corto
Desplazamiento r. c. m.	2,831	1,285	1,658	1,098	0,613
Desplazamiento medio	2,178	1,001	1,235	0,833	0,546
Desplazamiento máximo	9,885	6,209	6,830	4,490	1,330
(Todas las unidades en \ring{A})

El alargamiento corto se refiere a la hebra sencilla de la cadena A (A157 a A 159) y la hebra sencilla de la cadena B (B170 a B183) que ahora se unen por el puente disulfuro. Las desviaciones se calcularon para solamente los átomos de la cadena principal.

Estos resultados muestran que la introducción del enlace disulfuro tiene efecto mínimo sobre la estructura local del TCR alrededor del enlace. Se observan grandes efectos cuando se compara la TCR con la estructura publicada (1BD2) del TCR A6, pero el incremento en el desplazamiento RMS se debe en gran medida a las diferencias en conformaciones de bucle (véase la figura 84). Estos bucles no forman parte de la estructura central del TCR, que se forma por una serie de hojas \beta que forman un pliegue de Ig característico. La desviación de RCS para el conjunto de la cadena \alpha es particularmente grande debido a la diferencia en la secuencia de los dominios variables entre los TCR A6 (1BD2) y el NY-ESO. Sin embargo, los TCR A6 y NY-ESO tienen el mismo dominio \beta variable y las desviaciones RCS para la cadena \beta total muestra que la estructura de este dominio variable también se mantiene en el TCR con el nuevo enlace disulfuro. Por lo tanto estos datos indican que la estructura central del TCR se mantiene en la estructura cristalina del TCR con el nuevo enlace disulfuro.

Ejemplo 10 Producción de los TCR NY-ESO que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos, y los sitios de marcaje de la cadena \beta C-terminal

Con el fin de producir un TCR NY-ESO soluble que incorpora un enlace disulfuro novedoso, los plásmidos TCR A6 que contienen los sitios de restricción BamHI de la cadena \alpha y BgIII de la cadena \beta se usaron como marcos conservados como se describe en el ejemplo 4.

Las construcciones de la cadena \beta de TCR NY-ESO se obtuvieron por clonación de PCR como sigue. Las reacciones de PCR se realizaron usando los cebadores como se muestra más adelante, y los moldes que contienen las cadenas de TCR NY-ESO.

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Los productos de PCR se digirieron por restricción con las enzimas de restricción relevantes, y se clonaron en pGMT7 que contiene la secuencia de reconocimiento de biotina para obtener la expresión de plásmidos. La secuencia de las inserciones de plásmido se confirmó por secuenciación automática. La figura 85a muestra la secuencia de ADN de la cadena \beta del TCR NY-ESO que incorpora el sitio de reconocimiento de biotina, y la figura 85b muestra la secuencia de aminoácidos resultante.

La construcción de la cadena \alpha se produjo como se describe en el ejemplo 5. Las cadenas de TCR respectivas se expresaron, se co-replegaron y se purificaron como se ha descrito en el ejemplo 5.

Con el fin de producir un TCR NY-ESO soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro no nativo y una marca de hexa-histidina sobre el extremo C de la cadena \beta, se usaron como se ha indicado anteriormente los mismos cebadores y molde NY-ESO. Los productos de PCR se digirieron por restricción con las enzimas de restricción relevantes, y se clonaron en pGMT7 que contiene la secuencia de hexa-histidina para obtener plásmidos de expresión. La figura 86a muestra la secuencia de ADN de la cadena \beta del TCR NY-ESO que incorpora la marca hexa-histidina, y la figura 86b muestra la secuencia de aminoácidos resultante.

La figura 87 ilustra la elución del TCR NY-ESO soluble que contiene un enlace disulfuro novedoso y la secuencia de reconocimiento de biotina a partir de la columna de intercambio aniónico POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500, como se indica por la línea de puntos. La figura 88 ilustra la elución del TCR soluble NY-ESO que contiene un enlace disulfuro novedoso y la marca hexa-histidina a partir de una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500, como se indica por la línea de puntos.

Las figuras 89 y 90 son perfiles de elución de proteína de la cromatografía de filtración de fracciones reunidas a partir de los desarrollos de la columna de intercambio aniónico marcada con biotina NY-ESO y con hexa-histidina NY-ESO ilustrados por las figuras 87 y 88 respectivamente. La proteína eluye en forma de un pico principal individual, que corresponde al heterodímero de TCR.

Un análisis BIAcore de sTCR que se une a pMHC se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 3. El TCR NY-ESO marcado con biotina tenía una Kd de 7,5 \muM. El TCR marcado con hexa-histidina NY-ESO tenía una Kd de 9,6 \muM.

Ejemplo 11 Tinción celular que usa tetrámeros marcados con fluorescente de TCR NY-ESO soluble que contienen un enlace intercadena disulfuro novedoso Preparación del tetrámero de TCR

Los TCR solubles NY-ESO que contienen un enlace disulfuro novedoso y una secuencia de reconocimiento de biotina prepara como en el ejemplo 10 se utilizaron para formar los tetrámeros de TCR solubles que usan lo requerido para la tinción celular. 2,5 ml de solución de TCR soluble purificado (aproximadamente 0,2 mg/ml) se intercambió usando tampón en tampón de reacción de biotinilación (Tris 50 mM pH 8,0, MgCl_{2} 10 mM) usando una columna PD-10 (pharmacia). El eluato (3,5) se concentró hasta 1 ml usando un concentrador centricon (Amicon) con un corte de peso molecular de 10 kDa. Esto se completó hasta 10 mM con ATP añadido de solución madre (0,1 g/ml ajustada hasta pH 7,0). Después se añadió un volumen de un cóctel de inhibidores de proteasa (cóctel de inhibidores de proteasa Conjunto 1, Calbiochem Biochemicals), suficiente para proporcionar una concentración de cóctel de proteasa final de 1/100 de la solución madre como se suministró, seguido de biotina 1 mM (añadida a partir de la solución madre 0,2 M) y 20 \mug/ml de enzima ( a partir de 0,5 mg/ml de solución madre). Después la mezcla se incubó durante toda una noche a temperatura ambiente. Se retiró el exceso de biotina de la solución por cromatografía por exclusión de tamaño en una columna S75 HR. El nivel de biotinilación presente en el TCR NY-ESO se determinó mediante un procedimiento basado en HPLC por exclusión de tamaño como sigue. Una alícuota de 50 ul del TCR NY-ESO biotinilado (2 mg/ml) se incubó con 50 ul de perlas de agarosa recubiertas con estreptavidina (Sigma) durante 1 hora. Después las perlas se centrifugaron, y 50 \mul de la muestra no unida se desarrollaron en una columna TSK 2000 SW (Tosoohaas) usando un caudal de 0,5 ml/minuto (Tampón fosfato 200 mM pH 7,0) durante 30 minutos. La presencia de del TCR NY-ESO biotinilado se detectó mediante un espectrómetro de UV a tanto 214 nm como 280 nm. El NY-ESO biotinilado se desarrolló contra un control de TCR NY-ESO no biotinilado. El porcentaje de biotinilación se calculó sustrayendo el área del pico de la proteína biotinilada de la de la proteína no biotinilada.

La tetramerización del TCR soluble biotinilado se logró usando conjugado neutravidina-ficoeritrina (Cambridge Biosciences, Reino Unido). La concentración de TCR soluble biotinilado se midió usando un ensayo de proteína Coomassie (Pierce), y una relación de TCR soluble 0,8 mg/mg de conjugado neutravidina-ficoeritrina se calculó para lograr la saturación de la neutravidina-PE por TCR biotinilado a una relación de 1:4. 19,5 \mul de una solución de 6,15 mg/ml de TCR soluble NY-ESO biotinilado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) se añadió lentamente a 150 \mul de 1 mg/ml de neutravidina-PE soluble sobre hielo con agitación suave. 1 Después se añadieron 100,5 \mul de PBS a esta solución para proporcionar una concentración de tetrámero de TCR NY-ESO de 1 mg/ml.

Protocolo de tinción

Se incubaron cuatro alícuotas de 0,3 x 10^{6} de línea celular B transformada por EBV positivo HLA-A2 (PP LCL) en 0,5 ml de PBS con concentraciones variables (0, 10^{-4}, 10^{-5} y 10^{-6} M) de péptido HLA-A2 NYESO (SLLMWITQC) durante 2 horas a 37ºC. Después estas células de PP LCL se lavaron dos veces en solución salina tamponada de Hanks (HBSS) (Gibco, Reino Unido).

Cada una de las cuatro alícuotas se dividieron igualmente y se tiñeron con TCR unido por disulfuro NY-ESO biotinilado tetramerizado recientemente con neutravidina-ficoeritrina. Las células se incubaron con bien 5 ó 10 \mug de complejos de dsTCR tetraméricos marcados con ficoeritrina sobre hielo durante 30 minutos y se lavaron con HBSS. Las células se lavaron otra vez, se volvieron a suspender en HBSS y se analizaron por FACSVantage. Se recogieron 25.000 casos y los datos de analizaron usando el software WinMIDI.

Resultados

Las figuras 91a-h ilustran en forma de histogramas los datos FACSVantage generados para cada una de las muestras preparadas como se ha descrito anteriormente. La tabla siguiente enumera el porcentaje de células teñidas positivamente observadas para cada una de las muestras:

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Muestra	Células teñidas positivas (%)
Péptido NY-ESO 0 0, 5 \mu	0,75
Péptido NY-ESO 10^{-4} M, 5 \mu de TCR	84,39
Péptido NY-ESO 10^{-5} M, 5 \mu de TCR	35,29
Péptido NY-ESO 10^{-6} M, 5 \mu de TCR	7,98
Péptido NY-ESO 0, 10 \mu de TCR	0,94
Péptido NY-ESO 10^{-4} M, 10 \mu de TCR	88,51
Péptido NY-ESO 10^{-5} M, 10 \mu de TCR	8,25
Péptido NY-ESO 10^{-6} M, 10 \mu de TCR	3,45

Estos datos indican claramente que la proporción de las células marcadas por los tetrámeros de NY-ESO se incrementa de una manera correlacionada con la concentración del péptido (SLLMWITQC) en el que se habían incubado. Por lo tanto, estos tetrámeros de TCR NY-ESO son restos adecuados parta el marcaje celular específico basándose en la expresión del complejo HLA-A2 NY-ESO.

En el presente ejemplo, se había usado un tetrámero de TCR NY-ESO conjugado fluorescente. Sin embargo, se esperarían niveles similares de unión celular si este marcador se reemplazara por un resto terapéutico adecua-
do.

Ejemplo 12 Producción de TCR A6 soluble con un enlace disulfuro novedosos que incorpora la región constante C\beta1

Todos los ejemplos anteriores describen la producción de los TCR solubles con un enlace disulfuro novedoso que incorpora la región constante C\beta2. El presente ejemplo demuestra que los TCR solubles que incorporan la región constante C\beta1 se pueden producir con éxito.

Diseño de cebadores para sutura de PCR del dominio V de la cadena \beta del TCR a C\beta1

Para la construcción de PCR del dominio V de la cadena \beta del TCR A6, se diseñaron los siguientes cebadores:

5'-GGAGATATACATATGAACGCTGGTGTCACT-3'

5'-CCTTGTTCAGGTCCTCTGTGACCGTGAG-3'

Para la construcción de PCR de C\beta1 del TCR A6, se diseñaron los siguientes cebadores:

5'-CTCACGGTCACAGAGGACCTGAACAAGG-3'

5'-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3'

La construcción VTCR beta y la construcción C\beta1 se amplificaron separadamente usando la tecnología de PCR convencional. Se conectaron entre sí usando una sutura de PCR. El ADN de plásmido se purificó en una columna mini-prep. de Qiagen según las instrucciones del fabricante y la secuencia se verificó mediante secuenciación automática en las instalaciones de secuenciación del departamento de biología, Universidad de Oxford. La secuencia para A6 + C\beta1 se muestra en la figura 92.

Por consiguiente, la cadena A6 + C\beta1 se apareó al TCR alfa A6 mediante enlace disulfuro intercadena después de introducir cisteína en el dominio C de ambas cadenas.

El TCR soluble se expresó y se replegó como se ha descrito en el ejemplo 2.

Purificación del TCR soluble replegado

El sTCR se separó de los productos de degradación e impurezas cargando el repliegue dializado en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM en 50 volúmenes de columna usando un purificador Akta (Pharmacia) como en la figura 93. Las fracciones de los picos se almacenaron a 4ºC y se analizaron por SDS-PAGE teñido por Coomassie (figura 94) antes de reunirse y concentrarse. Finalmente, el sTCR se purificó y se caracterizó usando una columna de filtración en gel Superdex 200HR (figura 95) preequilibrada en tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,5 mM, nonidet p40 al 0,05%). El pico que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se reunió y se concentró antes de la caracterización mediante análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore.

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Un análisis de BIAcore de la unión del TCR A6 unido por disulfuro se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 3. La figura 96 muestra el análisis de BIAcore de la unión específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro a sus pMHC afín.

El TCR A6 soluble con un enlace disulfuro novedoso que incorpora la región constante C\beta1 tenía una K_{d} de 2,42 \pm 0,55 \muM para su pMHC afín. Este valor es muy similar a la K_{d} de 1,8 \muM determinada para el TCR A6 soluble con un enlace disulfuro novedoso que incorpora la región constante C\beta2 como se ha determinado en el ejemplo
3.

Ejemplo 13 Protocolo de TCR A6 con un enlace disulfuro novedoso que incorpora la cisteína "libre" en la cadena \beta

Las regiones constantes de la cadena \beta de los TCR incluyen un residuo cisteína (residuo 75 en el exón 1 de TBRC1*01 y TRBC2*01) que no está implicado en la formación de enlace disulfuro bien intercadena o intracadena. Todos los ejemplos previos describen la producción de los TCR solubles con un enlace disulfuro novedoso en el que esta cisteína "libre" se ha mutado a alanina con el fin de evitar la posible formación de cualquier enlace disulfuro "inapropiado" que podría dar como resultado un rendimiento reducido de TCR funcional. El ejemplo presente demuestra que se puede producir los TCR solubles que incorporan esta cisteína "libre".

Diseño de cebadores y mutagénesis de la cadena \beta de TCR

La formulación de la alanina de la cadena \beta del TCR (residuo 75 en el exón 1 de TRBC1*01 y TRBC2*01) a cisteína, se diseñaron los siguientes cebadores (mutación mostrada en el caso más adelante):

5'-TGAC TCC AGA TAC tgT CTG AGC AGC CG

5'-CG GCT GCT CAG Aca GTA TCT GGA GTC A

La mutagénesis de PCR, expresión y repliegue del TCR soluble se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 2.

Purificación de TCR soluble replegado

El sTCR se separó de los productos de degradación e impurezas cargando el replegamiento dializado en una columna de intercambio aniónico POROS 50 HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM en 50 volúmenes de columna usando un purificador Akta (Pharmacia) como en la figura 98. Las fracciones de los picos se almacenaron a 4ºC y se analizaron mediante SDS-PAGE teñido por Coomassie (figura 99) antes de reunirse y concentrarse. Finalmente el sTCR se purificó y caracterizó usando una columna de filtración en gel Superdex 200HR (figura 100) preequilibrada en tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,5 mM, nonidet p40 al 0,05%). El pico que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se reunió y se concentró antes de caracterización por análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore.

Se llevó a cabo un análisis de BIAcore de la unión del TCR A6 unido por disulfuro como se ha descrito en el ejemplo 3. La figura 101 muestra el análisis de BIAcore de la unión específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro a sus pMHC afín.

El TCR A6 soluble con un enlace disulfuro novedoso que incorpora la cisteína "libre" en al cadena \beta tenía una K_{d} de 21,39 \pm 3,55 \muM para su pMHC afín.

Ejemplo 14 Producción de TCR A6 soluble con un enlace disulfuro novedoso en el que la cisteína "libre" en la cadena \beta se muta a serina

El presente ejemplo demuestra que los TCR solubles con un enlace disulfuro novedoso en el que la cisteína "libre" en la cadena \beta (residuo 75 en el exón 1 de TRBC1*01 y TRBC2*01) se muta a serina se puede producir con éxito.

Diseño de cebadores y mutagénesis de la cadena \beta de TRC

Para mutar la alanina de la cadena \beta de TCR que se había sustituido previamente por la cisteína nativa (residuo 75 en el exón 1 de TRBC1*01 y TRBC2*01) a serina, se diseñaron los siguientes cebadores (mutación mostrada en el caso más adelante):

5'-T GAC TCC AGA TAC tCT CTG AGC AGC CG

5'-CG GCT GCT CAG AGa GTA TCT GGA GTC A

La mutagénesis por PCR (que da como resultado una cadena beta mutada como se muestra e la figura 102), la expresión y replegamiento del TCR soluble se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 2.

Purificación de TCR soluble replegado

El sTCR se separó de los productos de degradación e impurezas cargando el replegamiento dializado en una columna de intercambio aniónico POROS 50 HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM en 50 volúmenes de columna usando un purificador Akta (Pharmacia) como en la figura 103. Las fracciones de los picos se almacenaron a 4ºC y se analizaron mediante SDS-PAGE teñido por Coomassie (figura 104) antes de reunirse y concentrarse. Finalmente el sTCR se purificó y caracterizó usando una columna de filtración en gel Superdex 200HR (figura 105) preequilibrada en tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,5 mM, nonidet p40 al 0,05%). El pico que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se reunió y se concentró antes de caracterización por análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore.

Se llevó a cabo un análisis de BIAcore de la unión del TCR A6 unido por disulfuro como se ha descrito en el ejemplo 3. La figura 106 muestra el análisis de BIAcore de la unión específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro a sus pMHC afín.

El TCR A6 soluble con un enlace disulfuro novedoso en el que la cisteína "libre" en al cadena \beta se mutó a serina tenía una K_{d} de 2,98 \pm 0,27 \muM para su pMHC afín.

Este valor es muy similar a la K_{d} de 1,8 \muM determinada para el TCR A6 soluble con un enlace disulfuro novedosos en el que la cisteína "libre" en la cadena \beta se mutó a alanina como se determina en el ejemplo 3.

Ejemplo 15 Clonación de las cadenas \alpha y \beta del TCR NY-ESO que contiene un enlace disulfuro novedoso en vectores de expresión de levaduras

Las cadenas \alpha y \beta del TCR NY-ESO se condensaron al extremo C de la secuencia del factor alfa de pre - pro apareamiento de Saccharomyces cerevisiae y se clonaron en los vectores de expresión pYX122 y pYX112 respectivamente (véanse las figuras 107 y 108).

Se diseñaron los siguientes cebadores para amplificar por PCR la secuencia alfa del factor de pre - pro apareamiento a partir de la cepa de S. cerevisiae SEY6210 (Robinson y col., (1991), Mol Cell Biol, 11 (12): 5813-24) para condensarse a la cadena \alpha del TCR.

5'-TCT GAA TTC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT AC-3'

5'-TCA CCT CCT GGG CTT CAG CCT CTC TTT TAT C-3'

Se diseñaron los siguientes cebadores para amplificar por PCR la secuencia del factor alfa de pre - pro apareamiento a partir de la cepa de S. cerevisiae SEY6210 para condensarse a la cadena \beta del TCR.

5'-TCT GAA TTC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT AC-3'

5'-GTG TCT CGA GTT AGT CTG CTC TAC CCC AGG C-3'

Se preparó ADN de levadura resuspendiendo una colonia de la cepa de S. cerevisiae SEY6210 en 30 \mul de SDS al 0,25% en agua y calentando durante 3 minutos a 90ºC. Las secuencias del factor alfa de pre - pro apareamiento para condensarse a las cadenas \alpha y \beta del TCR se generaron amplificando por PCR 0,25 \mul de ADN de levadura con los pares de cebadores respectivos mencionados anteriormente usando las siguientes condiciones de PCR. 12,5 pmoles de cada cebador se mezclaron con dNTP 200 \muM, 5 \mul de tampón 10x Pfu y 1,25 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene) en un volumen final de 50 \mul. Después de una etapa desnaturalización inicial de 30 segundos a 92ºC, la mezcla de reacción se sometió a 30 rondas de desnaturalización (92ºC, 30 segundos), hibridación (46,9ºC, 60 segundos), y elongación (72ºC, 2 minutos) en una máquina de PCR exprés Hybaid PCR.

Se diseñaron los siguientes cebadores para amplificar por PCR la cadena \alpha de TCR a condensarse a la secuencia del factor alfa de pre - pro apareamiento mencionada anteriormente.

5'-GGC TGA AGC CCA GGA GGT GAC ACA GAT TCC-3'

5'-CTC CTC TCG AGT TAG GAA CTT TCT GGG CTG GG-3'

Se diseñaron los siguientes cebadores para amplificar por PCR la cadena \beta de TCR a condensarse a la secuencia del factor alfa de pre - pro apareamiento mencionada anteriormente.

5'-GGC TGA AGC CGG CGT CAC TCA GAC CCC AAA AT-3'

5'-GTG TCT CGA GTT AGT CTG CTC TAC CCC AGG C-3'

Las condiciones de PCR para amplificar las cadenas \alpha y \beta del TCR eran las mismas que se han mencionado anteriormente excepto para los siguientes cambios: el molde de ADN usado para amplificar las cadenas \alpha y \beta eran las cadenas \alpha y \beta del TCR NY-ESO respectivamente (como se prepara en el ejemplo 5); y la temperatura de hibridación usada era 60,1ºC.

Después los productos de PCR se usaron en una reacción de sutura de PCR utilizando las secuencias de solapamiento complementarias introducidas en los productos de PCR iniciales para crear un gen quimérico de longitud completa. Los productos de PCR resultantes se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI y se clonaron en bien pXY122 o pYX112 digeridos con las mismas enzimas. Los plásmidos resultantes se purificaron en una columna mini-prep. Qiagen™ según las instrucciones del fabricante, y las secuencias verificadas mediante secuenciación automática en las instalaciones de secuenciación de Genetics Ltd, Queensway, New Milton, Hampshire, Reino Unido. Las figuras 109 y 110 muestran las secuencias de ADn y proteína de los productos quiméricos clonados.

Ejemplo 16 Expresión del TCR Ny-ESO que contiene un enlace disulfuro novedoso en levadura

Los plásmidos de expresión de levadura que contienen las cadenas \alpha y \beta de TCR respectivamente producidos como se ha descrito en el ejemplo 15 se co-transformaron en la cepa de S. cerevisiae SEY6210 usando el protocolo de Agatep y col., (1998) (Técnica Tips Online (http://tto.trends.com) 1: 51: P01525). Una colonia individual que crece en un agar mínimo sintético (SD) que contenía Histidina y Uracilo (Qbiogene, Ilqlich, Francia) se cultivó durante toda una noche a 30ºC en 10 ml de medio SD que contiene Histidina y Uracilo. El cultivo durante toda una noche se sub-cultivó 1:10 en el medio reciente de SD que contiene Histidina y Uracilo y se hizo crecer durante 4 horas a 30ºC. El cultivo se centrifugó durante 5 minutos a 3800 rpm en Heraeus Megafuge 2.0R (Kendro Laboratory Prodicts Ltd, Bishop's Stortford, Hertfordshire, Reino Unido) y se recogió el sobrenadante. Se mezclaron 5 \mul de resina StartClean (Stratagene) con el sobrenadante y se mantuvo en rotación en una "blood wheele" a 4ºC durante toda la noche. La resina StrataClean se centrífugo a 3800 rpm en una Heraeus Megafuge 2.0R y se desecho el medio. Se añadieron 25 \mul de tampón de muestra reductor (950 \mul de tampón de muestra Laemmli (Biorad) que contenía 50 \mul de DTT 2 M) a la resina y las muestras se calentaron a 95ºC durante 5 minutos y después de enfriaron en un baño de hielo antes de que 20 \mul de la mezcla se cargara en un gel SDS-PAGE a 0,8 mA constante/cm^{2} de superficie del gel durante 1 hora. Las proteínas en el gel se transformaron a membranas Inmuno-Blot PVDF (Bio-Rad) y se exploraron con anticuerpo anti cadena \alpha de TCR como se ha descrito en el ejemplo 17 más adelante excepto para los cambios siguientes. El anticuerpo primarios (anti cadena \alpha de TCR) y los anticuerpos secundarios se usaron a 1 y 200 y 1 y 1000 diluciones respectivamente. La figura 111 muestra una imagen de la membrana desarrollada. El resultado muestra que existe un nivel bajo de secreción de TCR mediante el cultivo de levadura en el medio.

Ejemplo 17 Expresión de las cadenas \alpha y \beta de TCR A6 Tax en baculovirus Estrategia de clonación

Las cadenas \alpha y \beta del TCR A6 Tax disulfuro se clonaron a partir de pGMT7 en un vector basado en pBluescript KS2 llamado el pEX172. Este vector se diseñó para clonación diferentes cadenas \beta de la clase II de MHC, para a expresión de células de insecto, usando la secuencia guía a partir de DBR1*0101, un sitio AgeI para la inserción de diferentes secuencias codificadoras de péptidos, una región de engarce, y después los sitios MluI y SalI para clonar las cadenas DR\beta en frente se la secuencia cremallera Jun Leucina. La secuencia donde pEX 172 difiere de pBluescript II KS-, localizada entre los sitios KpnI y EcoRI de pBluescript II KS-, se muestra en al figura 112. Para los propósitos de clonación las cadenas de TCR en células de insecto, este pEX172 se cortó con AgeI y SalI para retirar la región engarce y el sitio MluI, y las cadenas de TCR entran donde comenzaría la secuencia de péptidos. Las secuencias de TCR se clonaron a partir de pGMT7 con el sitio BspEI en el extremo 5' (esto tenía los extremos adherentes compatibles AgeI) y un sitio SalI en el extremo 3'. Con el fin de proporcionar el sitio de escisión para la separación de la secuencia guía DR\beta, los tres primeros residuos de la cadena DR\beta (GDT) se preservaron. Con el fin de prevenir la secuencia cremallera Jun Leucina que se transcribe, era necesario insertar un codón de parada antes del sitio SalI. Para un esquema de esta construcción, véase la figura 113. Una vez que las cadenas de TCR están en este plásmido, el fragmento BamHI se cortaron y se subclonaron en el vector pAcAB3, que tenía sitios de recombinación de homología para Baculovirus. El vector pAcAB3 tiene dos promotores divergentes, uno con un sitio BamHI y uno con un sitio de clonación BgIII. Existe un sitio BgIII en la cadena \beta de TCR A6, se manera que la cadena \alpha del TCR A6 se insertó en el sitio BgIII, y la cadena \beta se subclonó en el sitio BamHI.

De acuerdo con la estrategia de clonación anterior, se diseñaron los siguientes cebadores (homología a los vectores en el caso anterior):

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PCR, clonación y subclonación

Los plásmidos de expresión que contienen los genes para la cadena \alpha o \beta del TCR A6 Tax se usaron como moldes en las siguientes reacciones de PCR. Se mezclaron 100 ng de plásmido \alpha con 1 \mul de dNTP 10 mM, 5 \mul de tampón de tampón 10xPfu (Stratagene), 1,25 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene), 50 pmol de los cebadores A6\alpha anteriores, y el volumen final se ajustó hasta 50 \mul con H_{2}O. Se estableció una mezcla de reacción similar para la cadena \beta, usando el plásmido \beta y el par de cebadores \beta. Las mezclas de reacción se sometieron a 35 rondas de desnaturalización (95ºC, 60 segundos), hibridación (50ºC, 60 segundos), y elongación (72ºC, 8 minutos) en una máquina de PCR exprés Hybaid PCR. Después el producto se digirió durante 2 horas a 37ºC con 10 unidades de enzima de restricción BspEI después durante 2 horas adicionales con 10 unidades de SalI (New England Biolabs). Estas reacciones digeridas se ligaron en pEX172 que se habían digerido con AgeI y SalI, y éstas se transformaron en bacterias XL1-Blue competentes y se hicieron crecer durante 18 horas a 37ºC. Se cogió una colonia individual de cada una de las preparaciones \alpha o \beta y se hicieron crecer durante toda una noche en YTP + ampicilina (16 g/l de Bacto-Tristona, 16 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de Na ClNa, 2,5 de K_{2}HPO_{4}, 100 mg/l de ampicilina). El ADN de plásmido se purificó en una columna de Qiagen mini-prep según las instrucciones del fabricante y la secuencia se verificó mediante secuenciación automática en las instalaciones de secuenciación de Genetix. Las secuencias de aminoácidos de las inserciones BamII se muestran en las figuras 114 y 115 para la cadena \alpha y la cadena \beta, respectivamente.

Estas construcciones del TCR A6 Tax disulfuro \alpha o \beta en pEX172 se digirieron durante 2 horas a 37ºC con la enzima de restricción BamHI (New England Biolabs). La inserción BamHI de la cadena \alpha se ligó en el vector pAcAB3 (Pharmingen-BD Biosciences: 212 6P) que se había digerido con la enzima BgIII. Esto se transformó en bacterias HL1-Blue competentes y se hicieron crecer durante 18 horas a 37ºC. Se cogió una colonia individual de esta placa y se hizo crecer durante toda una noche en 5 ml de YTP + ampicilina y se purificó el ADN del plásmido como antes. Después este plásmido se digirió con BamHI y la inserción BamHI de la cadena \alpha se ligó, se transformó en bacterias XL1-Blue, se hicieron crecer durante toda una noche, se recogieron TYP-ampicilina, y se hicieron crecer antes de la minipreapración como antes usando una columna Qiagen mini-prep. La correcta orientación de ambas cadenas \alpha y \beta se confirmó mediante secuenciación usando los siguientes cebadores de secuenciación:

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Transfección, infección, expresión y análisis de TCR A6 en células de insecto

El plásmido de expresión que contenía la cadena \alpha y la cadena \beta se transfectaron en células sf9 (Pharmingen-BD Biosciences: 21300C) crecidas en el medio exento de suero (Pharmingen-BD Biosciences: 551411), usando el kit de transfección Baculo gold (Pharmingen-BD Biosciences: 21100K) según las instrucciones del fabricante. Después de 5 días a 27ºC, 200 \mul del medio de estas células transfectadas que se había crecido se añadieron a 100 ml de High Five cells a 1 x 10^{6} células/ml en medio exento de suero. Después de 6 días adicionales a 27ºC, 1 ml de este medio se retiró y se centrifugó a 13.000 rpm en Hereus microfuge durante 5 minutos para sedimentar los desechos celulares.

10 \mul de este sobrenadante de TCR unido por disulfuro A6 de insectos se desarrolló junto a controles positivos de 5 \mug y 10 \mug de TCR unido por disulfuro A6 bacteriano sobre un gel Tris al 4-20%/glicina pre-moldeado (Invitrogen: EC60252). Se prepararon muestras reducidas añadiendo 10 \mul de tampón de muestra reductor (950 \mul de tampón de muestra Laemmli (Bio-Rad: 161-0737) 50 \mul de DTT 2 M) y calentando a 95ºC durante 5 minutos, enfriando a temperatura ambiente durante 10 minutos y después cargando 20 \mul. Las muestras no reducidas se prepararon añadiendo 10 \mul de tampón de muestras Laemmli, y cargando 20 \mul.

El gel se desarrolló a 150 voltios durante 1 hora en un tanque de gel Novex - Xcell después de lo cual el gel se tiñó en 50 ml de tinte gel de Coomassie durante 1 hora con agitación suave (a 1,1 g de polvo de Coomassie en 500 ml de metanol con agitación durante 1 hora se añaden 100 ml de ácido acético y se completa hasta 1 litro con H_{2}O, se agita durante 1 hora, después de filtra a través de un filtro de 0,45 \mum). El gel se destiñó tres veces durante 30 minutos con agitación suave en 50 ml de distinción (como el tinte de gel de Coomassie pero omitiendo el polvo de Coomassie).

Se realizaron transferencias de Western desarrollando geles SDS-PAGE como antes pero las proteínas se transfirieron a membranas Inmuno-Blot PVDF (Bio-Rad: 162-0174) en lugar la tinción de los geles con Coomassie. Se cortaron seis papeles de filtro al tamaño del gel y se sumergieron en tampón de transferencia (2,39 g de glicina, 5,81 g de Tris Base, 0,77 g de DTT disueltos en 500 ml de H_{2}O, 200 ml de metanol se añadieron y se completó hasta 1000 con H_{2}O.) La membrana de PVDF se preparó sumergiendo en metanol durante 1 hora y después en tampón de transferencia durante 2 minutos. Se colocaron tres papeles de filtro en la parte superior seguido del gel y después finalmente tres papeles de filtro más sobre el lado del cátodo. La inmunotransferencia se desarrolló durante 1 hora a 0,8 mA constante/cm^{2}.

Después de la transferencia, la membrana se bloqueó en 7,5 ml de tampón de bloqueo (4 comprimidos de solución salina tamponada con Tris (Sigma: T5030), 3 g de leche deshidratada no grasa (Sigma: M7409), 30 \mul de Tween 20 completado hasta 30 ml con H_{2}O) durante 60 minutos con agitación suave. La membrana se lavó tres veces durante 5 minutos con tampón de lavado TBS (comprimidos 20 TBS, 150 \mul de Tween 20 completado hasta 300 ml con H_{2}O). Después la membrana se incubó en anticuerpo primario, dilución 1 en 50 del clon de la cadena \alpha 3A8 (Serotec: MCA987) o clon de la cadena \beta anti TCR 8A3 (Serotec: MCA988) en 7,5 ml de tampón de bloqueo durante 1 hora con agitación suave. La membrana se lavó como antes en tampón de lavado TBS. A continuación, una incubación de anticuerpo secundario de anticuerpo abti-ratón de cabra marcado con HPR (Santa Cruz Biotech: Sc-2005) dilución 1 en 1000 en 7,5 ml de tampón de bloqueo se llevó a cabo durante 30 minutos con agitación suave. La membrana se lavó como antes y después de lavó en 30 ml de H_{2}O con 2 comprimidos de TBS.

La unión de anticuerpo se detectó mediante detección colorimétrica Opti-4CN (Biorad: 170-8235) 1,4 ml de diluyente Opt-4CN, 16 ml de H_{2}O, 0,28 ml de sustrato de Opti-4CN). Las membranas se colorearon durante 30 minutos y después se lavaron en H_{2}O durante 15 minutos. Las membranas se secaron a temperatura ambiente, y las imágenes barridas se alinearon con una imagen del gel teñido por coomassie (figura 116).

Resultados

Puede observarse en la figura 116 que ambos TCR disulfuro se forman como un heterodímero que es estable en el gel de SADS. Ambos se descompusieron en las cadenas \alpha o \beta tras reducción. El heterodímero de TCR disulfuro de insecto tiene un peso molecular ligeramente más alto que la versión producida bacterianamente, presumiblemente debido a la glicosilación de las células de insecto. Puede observarse que en este caso las células de insecto producen la cadena \alpha en exceso, y la cadena \alpha libre se puede ver en la banda no reducida de la transferencia western anti \alpha.

Estos datos claramente demuestran que el sistema de expresión de baculovirus descritos anteriormente proporciona una alternativa viable a la expresión procariótica de los TCR solubles que contienen enlaces disulfuro novedosos.

Claims

1. Un receptor soluble de células T (sTCR), que comprende (i) toda o parte de una cadena \alpha de TCR, excepto el dominio transmembrana de la misma, y (ii) toda o parte de una cadena \beta, excepto el dominio transmembrana de la misma, en el que cada (i) y (ii) comprende un dominio variable funcional y al menos una parte del dominio constante de la cadena de TCR, caracterizado porque (i) y (ii) están unidos mediante un enlace disulfuro entre residuos de cisteína sustituidos por:

Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o

Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01.

2. Un sTCR según la reivindicación 1, en el que uno o ambos de (i) y (ii) comprenden todo el dominio extracelular de la cadena TCR.

3. Un sTCR según la reivindicación 1 ó 2, en el que uno o ambos de (i) y (ii) comprenden todo el dominio extracelular de la cadena TCR.

4. Un receptor de las células T de la forma \alpha\beta soluble (sTCR), en el que un enlace disulfuro covalente se une a residuos de cisteína sustituidos por:

Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o

Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01.

5. Un receptor soluble de células T (sTCR), que comprende (i) toda o parte de una cadena \alpha de TCR, excepto el dominio transmembrana de la misma, y (ii) toda o parte de una cadena \beta de TCR, excepto el dominio transmembrana de la misma, en el que (i) y (ii) cada uno comprende un dominio variable funcional y al menos una parte del dominio constante de la cadena de TCR, y están unidos por un enlace disulfuro entre los residuos de dominios constantes que no está presente en el TCR nativo y en el que no está presente un enlace disulfuro intercadena en el TCR nati-
vo.

6. Un sTCR según la reivindicación 5, en el que uno o ambos de (i) y (ii) comprenden todo el dominio Ig constante extracelular de la cadena TCR.

7. Un sTCR según la reivindicación 5 o reivindicación 6, en el que uno o ambos de (i) y (ii) comprenden todo el dominio extracelular de la cadena TCR.

8. Un receptor soluble (sTCR) de células T de la forma \alpha\beta, en el que un enlace covalente disulfuro se une a un residuo de la región de inmunoglobulina del domino constante de la cadena \alpha a un residuo de la región inmunoglobulina del dominio constante de la cadena \beta, en el que no está presente un enlace disulfuro intercadena en TCR nati-
vo.

9. Un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por los residuos cuyos átomos de carbono \beta están a menos de 0,6 nm de distancia en la estructura de TCR nativo.

10. Un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC02*01.

11. Un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC02*01.

12. Un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC02*01.

13. Un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC02*01.

14. Un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC02*01.

15. Un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que un enlace disulfuro intercadena TCR nativo no está presente.

16. Un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 15, en el que las cadenas de TCR \alpha y \beta nativas están truncadas en el extremo C de manera que los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena nativo están excluidos.

17. Un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 15, en el que los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena están sustituidos por otro residuo.

18. Un sTCR según la reivindicación 17, en el que los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena nativo están sustituidos por serina o alanina.

19. Un sTCR según cualquier reivindicación precedente, en el que un residuo cisteína no apareado presente en la cadena \beta de TCR nativo no está presente.

20. Un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5, 6 y 9 a 19, en el que (i) y (ii) cada uno comprende el dominio variable funcional de un primer TCR condensado a parte o todo el dominio constante de un segundo TCR, el primer y segundo TCR siendo de la misma especie.

21. Un sTCR según la reivindicación 20, en el que los dominios constantes del segundo TCR son N-terminal truncados a los residuos que forman el enlace disulfuro intercadena no nativo.

22. Un sTCR según cualquiera reivindicación anterior, en el que una o ambas cadenas se derivatizan con, o se condensan a, un resto en su extremo C o N.

23. Un sTCR según cualquiera reivindicación anterior, en el que una o ambas cadenas tienen un residuo cisteína en su extremo C y/o N al que se puede condensar un resto.

24. Un sTCR según cualquiera reivindicación anterior, que comprende además un marcador detectable.

25. Un sTCR según cualquiera reivindicación anterior asociado a un agente terapéutico.

26. Un complejo receptor de las células T (TCR) multivalente que comprende una pluralidad de sTCR según cualquier reivindicación precedente.

27. Un complejo según la reivindicación 26, que comprende un multímero de sTCR.

28. Un complejo según la reivindicación 27, que comprende dos, tres, cuatro o más moléculas receptoras de las células T asociadas entre sí, preferiblemente mediante una molécula engarce.

29. Un complejo según la reivindicación 26, 27 ó 28, en el que los sTCR o multímeros de sTCR están presentes en una bicapa lipídica o están unidos a una partícula.

30. Un procedimiento para detectar complejos MHC-péptido, que comprende:

(i): proporcionar un TCR soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 o un complejo de receptores de células T multivalente según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29;

(ii): poner en contacto el TCR soluble o complejo de TCR multivalente con los complejos MHC-péptido; y

(iii): detectar la unión del TCR soluble o complejo de TCR multivalente a los complejos MHC-péptido.

31. Una formulación farmacéutica que comprende un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, y/o un complejo de TCR multivalente según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica (i) o (ii) de un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, o una secuencia complementaria a la misma.

33. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 32.

34. Una célula hospedadora que comprende un vector según la reivindicación 33.

35. Un procedimiento para obtener (i) o (ii) como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, dicho procedimiento comprende incubar una célula hospedadora según la reivindicación 34 en condiciones que producen la expresión del péptido y después purificar el polipéptido.

36. Un procedimiento según la reivindicación 35, que comprende además mezclar (i) y (ii) en condiciones de replegamiento adecuadas.

37. Un procedimiento para obtener un receptor de las células T soluble (sTCR), dicho procedimiento compren-
de:

incubar una célula hospedadora que comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica (i) toda o parte de la cadena \alpha de TCR, excepto el dominio transmembrana de la misma, y una célula hospedadora que comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica (ii) toda o parte de la cadena \beta de TCR, excepto el dominio transmembrana de la misma en condiciones que producen la expresión de (i) y (ii), en el que (i) y (ii) cada uno comprende un dominio variable funcional y al menos una parte del dominio constante de la cadena de TCR;

purificar (i) y (ii); y

mezclar (i) y (ii) en condiciones de replegamiento de manera que se unen mediante un enlace disulfuro entre los residuos del dominio constante que no está presente en el TCR nativo.

38. Un procedimiento según la reivindicación 37, en el que uno o ambos (i) y (ii) comprenden todo el dominio Ig constante extracelular de la cadena TCR.

39. Un procedimiento según la reivindicación 37 ó reivindicación 38, en el que uno o ambos (i) y (ii) comprenden todo el dominio extracelular de la cadena TCR.

40. Un procedimiento para obtener un receptor de las células T soluble (sTCR) de la forma \alpha\beta, dicho procedimiento comprende:

incubar una célula hospedadora que comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena \alpha de TCR y una célula hospedadora que comprende un vector que comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena \beta de TCR en condiciones que producen la expresión las cadenas de TCR respectivas;

purificar las cadenas respectivas de TCR; y

mezclar las cadenas respectivas de TCR en condiciones de replegamiento de manera que un enlace disulfuro covalente se une a un residuo de la región inmunoglobulina del dominio constante de la cadena \alpha a un residuo de la región inmunoglobulina del dominio constante de la cadena \beta.

41. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40, en el que un enlace disulfuro intercadena en el TCR nativo no está presente.

42. Un procedimiento según la reivindicación 41, en el que las cadenas \alpha y \beta de TCR nativo se truncan en el extremo C de manera que los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena nativo están excluidos.

43. Un procedimiento según la reivindicación 41, en el que los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena nativo están sustituidos por otro residuo.

44. Un procedimiento según la reivindicación 43, en el que los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena nativo están sustituidos por serina o alanina.

45. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 44, en el que el residuo cisteína no apareado presente en la cadena \beta de TCR nativo no está presente.

46. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 45, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por los residuos cuyos átomos de carbono \beta están a menos de 0,6 nm de distancia en la estructura de TCR nativo.

47. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 46, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC02*01.

48. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 46, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC02*01.

49. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 46, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC02*01.

50. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 46, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC02*01.

51. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 46, en el que el enlace disulfuro que no está presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos por Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC02*01.

52. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37, 38 y 41 a 51, en el que (i) y (ii) cada uno comprende el dominio variable funcional del primer TCR condensado a todo o parte del dominio constante de un segundo TCR, el primer y segundo TCR siendo de la misma especie.

53. Un procedimiento según la reivindicación 52, en el que los dominios constantes del segundo TCR son N-terminal truncados a los residuos que forman el enlace disulfuro intercadena no nativo.

54. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 53, en el que una o ambas cadenas se derivatizan con, o se condensan a, un resto en su extremo C o N.

55. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 54, en el que una o ambas cadenas tienen un residuo cisteína en su extremo C y/o N al que se puede condensar un resto.

56. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 55, en el que el sTCR comprende además un marcador detectable.

57. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 57, en el que el TCR está asociado a un agente terapéutico.

58. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, que comprende además combinar una pluralidad de sTCR para formar un complejo receptor de las células T (TCR) multivalente.

59. Un procedimiento según la reivindicación 58, en el que los TCR se combinan para formar un multímero de sTCR.

60. Un procedimiento según la reivindicación 59, en el que dos, tres, cuatro o más moléculas receptoras de las células T se asocian entre sí, preferiblemente mediante una molécula engarce.

61. Un procedimiento según la reivindicación 58, 59 ó 60, en el que los sTCR o multímeros de sTCR se combinan en una bicapa lipídica o están unidas a una partícula.

62. Un procedimiento para detectar complejos MHC-péptido, que comprende:

(i): proporcionar un TCR soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 57 o un complejo de receptores de células T multivalente producido mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 58 a 61;

63. Una formulación farmacéutica que comprende un sTCR producido mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 57, y/o un complejo de TCR multivalente producido mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 58 a 61, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.