ES2237747T3 - Animales transgenicos no humanos que carecen de proteinas prionicas. - Google Patents
Animales transgenicos no humanos que carecen de proteinas prionicas.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A MAMIFEROS TRANSGENICOS Y PAJAROS QUE NO SON SUSCEPTIBLES DE ENCEFALOPATIA ESPONJIFORMES (POR EJEMPLO ENFERMEDADES DE PRION O SIMILARES A LEGRADO) DEBIDAS A LA AUSENCIA DE PROTEINA DE PRION FUNCIONALES ENDOGENAS ("PRP"). MAS PARTICULARMENTE, ESTA INVENCION SE REFIERE A MOLECULAS DE OBJETIVO DE ADN QUE ROMPE LOS GENES _PRP POR RECOMBINACION HOMOLOGA EN CELULAS ANIMALES TRANSFECTAS, PARA CULTIVAR CELULAS TRANSFORMADAS CON TALES MOLECULAS DE OBJETIVO DE ADN, Y A ANIMALES DERIVADOS DE ESTAS CELULAS TRANSFECTAS Y LA PROGENIE TRANSGENICA DE TALES ANIMALES.
Description
Animales transgénicos no humanos que carecen de
proteínas priónicas.
Esta invención se refiere a mamíferos no humanos
y aves ("animales") transgénicos que no son propensos a padecer
encefalopatías espongiformes (es decir, enfermedades de priones o
similares a la tembladera de las ovejas (encefalopatía espongiforme
ovina)), debido a la ausencia de la proteína priónica endógena
("PrP"). Más particularmente, esta invención se refiere a
moléculas de selección de diana que son capaces de alterar los genes
de PrP, genes de PrP que se alteran por tales moléculas de selección
de diana y que por tanto, son incapaces de expresar la proteína
priónica funcional, a células en cultivo transformadas que tienen
tales genes alterados, a los mamíferos no humanos y aves derivados
de esas células transformadas y a la progenie transgénica de tales
animales.
Los priones son patógenos infecciosos que
producen encefalopatías espongiformes en seres humanos y animales.
Los priones son distintos de las bacterias, virus y viroides. La
hipótesis predominante en la actualidad es que no es necesario
ningún componente de ácido nucleico para la infectividad de la
proteína priónica.
El kuru, la enfermedad de
Creutzfeldt-Jacob ("ECJ") y el síndrome de
Gerstmann-Sträussler-Scheinker
("GSS") son enfermedades neurodegenerativas humanas mortales
producidas por priones. La tembladera de ovejas y cabras es la
enfermedad priónica mejor estudiada. La encefalopatía espongiforme
bovina ("EEB" O "enfermedad de las vacas locas") es una
enfermedad priónica que amenaza en la actualidad a la industria de
ganado bovino en Gran Bretaña. La encefalopatía transmisible del
visón y la enfermedad del desgaste crónico del ciervo y el alce
también se cree que son enfermedades priónicas. Las características
patológicas de las enfermedades priónicas incluyen vacuolación
neuronal, gliosis astrocítica y placas amiloides con filamentos
compuestos por proteína priónica.
Un paso principal en el estudio de los priones y
las enfermedades que producen fue el descubrimiento y la
purificación de una proteína denominada proteína priónica
("PrP") (Bolton, et al., Science 218, págs.
1308-11 (1982); Prusiner et al.,
Biochemistry 21, págs. 6942-50 (1982);
McKinley et al., Cell 35, págs 57-62
(1983)). Desde entonces, los genes que codifican para la proteína
priónica completa se han clonado, secuenciado y expresado en
animales transgénicos. PrP^{c} está codificada por un gen huésped
de una única copia (Basler et al., Cell 46, pág.
417-28 (1986)) y normalmente se encuentra en la
superficie exterior de las neuronas. Una hipótesis destacada es que
las enfermedades priónicas resultan de la conversión de PrP^{c}
en una forma modificada denominada PrP^{Sc}.
La función biológica o fisiológica real de
PrP^{c} no se conoce. La sugerencia de que es idéntica a la
actividad de inducción del receptor de acetilcolina ("ARIA")
sigue sin confirmarse (Harris et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88, págs. 7664-68 (1991)). Sin embargo,
el gen de PrP se encuentra en todos los mamíferos examinados hasta
ahora, es decir, en el hámster (Basler et al., Cell
46, págs. 417-28 (1986)), ratón (Locht et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, págs.
6372-76 (1986)), ser humano (Kretzschmar et
al., DNA 5, 315-24 (1986); Puckett et
al., Am. J. Hum. Genet. 49, 320-29
(1991)), rata (Westaway y Prusiner, Nucl. Acids. Res. 14,
2035-44 (1986)), reses (Goldmann et al.,
J. Gen. Virol. 72, págs 201-04 (1991)), oveja
(Goldmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, págs.
2476-80 (1990)) y cabra (Westaway y Prusiner, citado
anteriormente). El gen de PrP también se encuentra en pollos (Harris
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, págs.
7664-68 (1991)). Además, dado que PrP^{c} se
expresa en las neuronas del cerebro (Kretzschmar et al.,
Am. J. Pathol. 122, págs. 1-5 (1986)), así
como en los linfocitos (Cashman et al., Cell 61, pág.
185-92 (1990)) y muestra una alta velocidad de
recambio (Caughey et al., J. Virol. 63, págs.
15-81 (1989); Borchelt et al., J Cell.
Biol. 110, págs. 743-52 (1990)), parecería ser
de importancia fisiológica considerable.
El papel fundamental de PrP^{c} en enfermedades
similares a la tembladera está indicado por varias líneas de
evidencia. El agente infeccioso se copurifica con PrP^{Sc}
mediante diferentes procedimientos (Prusiner, Science 216,
págs. 136-44 (1982); Diringer et al.,
Nature 306, págs. 476-78 (1983); McKinley
et al., Cell 35, págs. 57-62 (1983); Hope
et al., EMBO J. 5, págs. 2591-97
(1986)), incluyendo la purificación por afinidad en una columna de
anticuerpos anti-PrP (Gabizon et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, pág. 6617-21
(1988)), electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida
(Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, págs.
7240-44 (1990)) y HPLC (Safar et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, págs. 6373-77
(1990)). Además, la propensión de un huésped a la tembladera está
determinada, al menos en parte, por la naturaleza de sus alelos
Prn-p (Dickinson et al., J. Comp. Pathol. 78,
págs. 293-99 (1968); Dickinson y Meikle, Mol.
Gen. Genet. 112, págs. 73-79 (1971); Carlson
et al. Cell 46, págs. 503-11 (1988);
Hunter et al. J. Gen. Virol. 68, págs.
2711-16 (1987); Carlson et al., Proc.
Natl. Acad. Aci USA 86, págs. 7475-79 (1989);
Race et al., J. Gen. Virol. 71, págs.
493-97 (1990); Westaway et al., Neuron 7,
págs. 59-68 (1991)). Finalmente, ciertas mutaciones
en el gen de PrP, tales como un cambio de prolina por leucina en la
posición 102, están estrechamente relacionadas con la morbilidad en
algunas formas familiares de encefalopatías espongiformes (Hsiao
et al., Nature, 338, págs. 342-45
(1989); Hsiao y Prusiner, Neurology 40, págs.
1820-27 (1990)). Además, los ratones que portan un
transgén de PrP con el cambio de aminoácidos análogo sucumben a una
enfermedad espontánea similar a la tembladera (Hsiao et al.,
Science 250, pág. 1587-90 (1990)). Sin
embargo, hasta la fecha, no ha habido forma de prevenir la
enfermedad.
Esta invención resuelve el problema anterior. Se
refiere a mamíferos no humanos y aves que carecen de genes de PrP
funcionales y, por tanto, carecen de proteínas priónicas. Estos
animales transgénicos no sólo sobreviven y se desarrollan
normalmente, sino que no son propensos a padecer enfermedades
priónicas. Más particularmente, la invención se refiere a genes de
PrP que se alteran y, por tanto, son incapaces de expresar la
proteína priónica, a células de mamíferos no humanos o aves
transformadas con tales genes alterados y a mamíferos no humanos o
aves derivados de esas células transformadas y a la progenie
transgénica de tales animales.
La figura 1 representa la construcción del
plásmido pBluescriptPrP-2 a partir del cósmido
Westaway y el plásmido pBluescript.
La figura 2 representa la construcción del
plásmido pRVPrPneoPA2 a partir de los plásmidos
pBluescriptPrP-2 y pMClneo.
La figura 3 representa la construcción del
"fragmento 1" y "fragmento 2" utilizados para construir el
plásmido de selección de diana pRVPrP3.
La figura 4 representa la síntesis del
"fragmento 3" mediante el método de la reacción en cadena de la
polimerasa ("PCR"), utilizando pBluescript-PrP2
linealizado como molde. El "fragmento 3" se utiliza para
construir el plásmido de selección de diana pRVPrP3.
La figura 5 representa la construcción del
plásmido de selección de diana a partir de los fragmentos
1-3, y la escisión del fragmento de selección de
diana del plásmido de selección de diana.
En la descripción de la presente invención se
emplean los términos siguientes:
Sitio crítico - Sitio (o sitios) dentro de un gen
de PrP que se requiere para la expresión de la proteína priónica
funcional.
Secuencia de alteración - - Secuencia
nucleotídica en una molécula de selección de diana que altera un gen
diana con la integración específica de sitio de la molécula de
selección de diana, de manera que se evite la expresión de la
proteína PrP funcional.
Células ES - - Células madre embrionarias.
Secuencia de control de la expresión - -
Secuencia de nucleótidos que permite y regula la transcripción de
una secuencia nucleotídica cuando se une operativamente a esa
secuencia.
Recombinación homóloga - - Redisposición de
segmentos de ADN en un sitio (o sitios) específico de secuencia
dentro o entre moléculas de ADN mediante mecanismos de apareamiento
de bases.
Región homóloga - - Secuencia dentro del locus
del gen diana escogido para duplicación en la molécula de selección
de diana, que tiene una longitud y una homología suficientes para
proporcionar la integración específica de sitio de la molécula de
selección de diana en el locus del gen diana mediante recombinación
homóloga.
PCR - - Reacción en cadena de la polimerasa.
PrP - - Proteína priónica.
Prn-P - - Gen que codifica
para la proteína priónica.
Locus del gen diana - Sitio cromosómico del gen
diana, que incluye la secuencia que codifica para PrP, las
secuencias de control de la expresión de PrP, las secuencias no
traducidas de PrP en 3' y las regiones vecinas al gen de PrP en 5' y
3' en el cromosoma.
Fragmento de selección de diana - - Molécula de
selección de diana que consiste en el fragmento del plásmido de
selección de diana.
Molécula de selección de diana - molécula de ADN,
lineal o circular, capaz de alterar específicamente un gen diana de
PrP en una célula transfectada mediante recombinación homóloga, de
modo que se evite la expresión de la proteína PrP funcional.
Plásmido de selección de diana - Molécula
intermedia en la construcción del fragmento de selección de
diana.
La primera etapa en la producción de animales no
humanos transgénicos de esta invención es preparar una secuencia de
ADN ("molécula de selección de diana") que sea capaz de alterar
específicamente un gen de PrP en células animales que portan ese gen
y convertir ese gen en no funcional. La molécula de selección de
diana se utiliza entonces para transfectar células animales y para
alterar los genes de PrP funcionales en esas células. Las células
animales transgénicas pueden utilizarse entonces para producir los
mamíferos no humanos y aves transgénicos de esta inven-
ción.
ción.
Las moléculas de ADN de selección de dianas que
son capaces, según esta invención, de alterar un gen de PrP
funcional residente en las células pueden producirse utilizando
información y procedimientos bien conocidos en la técnica.
Cualquier molécula de ADN de selección de diana
de la presente invención tiene dos funciones esenciales. Esas
funciones esenciales son integrarse en un gen de PrP residente
nativo ("locus del gen diana") y alterar la expresión del gen
de PrP asociado con ese locus de manera que sea posible la expresión
de PrP no funcional. Esas dos funciones esenciales dependen de dos
características estructurales básicas de la molécula de selección de
diana.
La primera característica estructural básica de
la molécula de selección de diana es un par de regiones que son
homólogas a las regiones escogidas del locus del gen diana. Esta
homología (en lo que se refiere tanto a la longitud como a la
identidad de la secuencia) hace que la molécula de selección de
diana se integre mediante mecanismos de apareamiento de bases
("recombinación homóloga") en el sitio escogido en el locus del
gen diana en las células transfectadas.
La recombinación homóloga es la redisposición de
segmentos de ADN en un sitio (o sitios) específico de secuencia
dentro o entre moléculas de ADN, mediante mecanismos de apareamiento
de bases. La presente invención se refiere a una forma particular de
recombinación homóloga denominada a veces "selección de diana
genética". En la selección de diana genética, se introduce en las
células una "molécula de selección de diana" (o "fragmento de
selección de diana") exógena. La molécula de selección de diana
tiene una o más regiones de homología con un gen cromosómico que va
a modificarse o sustituirse ("gen diana"). Las regiones de
homología entre el gen diana y la molécula de selección de diana dan
como resultado la integración específica de sitio de la secuencia
exógena. Por supuesto, la secuencia exógena puede diseñarse para
corregir un defecto existente en el gen residente o para inutilizar
("alterar") un gen residente funcional. La presente invención
se refiere a la alteración de genes de PrP. Ha de distinguirse la
selección de diana genética, que afecta a la estructura de un gen
específico ya en una célula, de otras formas de transformación
estable en las que la integración de ADN foráneo para la expresión
no es específica de sitio y, por tanto, no afecta de manera
previsible a la estructura de ningún gen particular ya en la
célula.
La segunda característica estructural básica de
la molécula de selección de diana de esta invención es una secuencia
de alteración entre las regiones homólogas. La secuencia de
alteración evita la expresión de la proteína priónica funcional a
partir del gen diana de PrP tras la sustitución de una parte de ese
gen diana por la molécula de selección de diana integrada.
Un experto en la técnica reconocerá que pueden
construirse numerosas realizaciones de la molécula de selección de
diana del gen de PrP de la presente invención para cumplir los
requisitos estructurales y funcionales especificados anteriormente.
El ejemplo 1 (más adelante) describes la construcción real de una
molécula de selección de diana del gen de PrP utilizada para
producir los ratones transgénicos de la presente invención. La
siguiente discusión expone las consideraciones y los parámetros que
pueden utilizarse para diseñar otras moléculas de selección de diana
del gen de PrP que pueden utilizarse para producir ratones,
hámsters, conejos, ovejas, cerdos, reses, pollos y otros mamíferos y
aves transgénicos sin apartarse del alcance de la presente
invención.
Los parámetros de la molécula de selección de
diana que pueden variarse en la práctica de la presente invención
incluyen las longitudes de las regiones homólogas, qué regiones del
locus del gen diana van a duplicarse como las regiones homólogas de
la molécula de selección de diana, la longitud de la secuencia de
alteración, la identidad de la secuencia de alteración, y qué
secuencia del gen diana va a sustituirse por la molécula de
selección de diana.
La longitud de las regiones homólogas que
flanquean la secuencia de alteración de las moléculas de selección
de diana de esta invención puede variar considerablemente sin un
efecto significativo sobre la práctica de la invención. Las regiones
flanqueantes homólogas deben ser de longitud suficiente para la
formación de heterodúplex eficaces entre una cadena de la molécula
de selección de diana y una cadena de un cromosoma de una célula
transfectada, en el locus del gen diana de PrP. El aumento de la
longitud de las regiones homólogas potencia la formación del
heterodúplex y, por tanto, la eficacia en la selección de diana. Sin
embargo, se apreciará que el aumento de la eficacia en la selección
de diana que se acumula por par de bases homólogas adicional
disminuye finalmente y se compensa por las dificultades prácticas en
la construcción de la molécula de selección de diana, ya que las
regiones homólogas sobrepasan los varios miles de pares de bases. Un
intervalo preferido para la longitud de cada región homóloga es de
50 hasta 5.000 pares de bases, y aproximadamente 500 pares de bases
es lo más preferido. Además, debe observarse que la longitud precisa
de las regiones homólogas en la molécula de selección de diana de
ADN puede depender en la práctica de la localización de los sitios
de restricción en y alrededor del gen de PrP. Para una discusión
sobre la longitud de la homología requerida para la selección de la
diana genética en células madre embrionarias, véase Hasty et
al. (Mol. Cell Biol. 11, 5586-91
(1991)).
Hay una considerable libertad en la elección de
qué regiones del locus del gen diana se duplican como las regiones
homólogas en la molécula de selección de diana. Las limitaciones
básicas son que la secuencia del gen diana de PrP que va a
sustituirse por la región de alteración debe encontrarse entre las
regiones del locus del gen diana duplicado como las regiones
homólogas en la molécula de selección de diana, y que la sustitución
de la secuencia del gen diana debe dar lugar al gen de PrP no
funcional. Debe observarse que las secuencias nucleotídicas del
locus del gen diana escogidas por su homología en la molécula de
selección de diana permanecen inalteradas tras la integración de la
molécula de selección de diana. Estas secuencias del locus del gen
diana se sustituyen simplemente por secuencias duplicadas
(homólogas) en la molécula de selección de diana. La identidad entre
las regiones escogidas del locus del gen diana y las regiones
homólogas en la molécula de selección de diana es el medio por el
cual la molécula de selección de diana proporciona la secuencia de
alteración de manera precisa en el gen diana de PrP. Las regiones
escogidas de homología pueden encontrarse dentro de secuencia
codificante de PrP, pero no es necesario que ocurra así. Por
ejemplo, en una realización de la presente invención, una región
homóloga podría situarse en 5' del gen de PrP, y la otra región
homóloga podría situarse en 3' del gen de PrP. Preferiblemente, el
codón de iniciación de PrP y la región 5' terminal de la secuencia
codificante de PrP se encontrarán entre las regiones homólogas
escogidas y, de esta manera, se sustituirán por la secuencia de
interrupción, de manera que no pueda expresarse ninguna parte de la
proteína priónica. Incluso más preferido, cuando la secuencia de
interrupción contiene un marcador de selección (o cualquier otro
gen), es que hay un codón de terminación en sentido 3' de la
secuencia codificante del marcador mínima requerida, y en marco con
la secuencia codificante del marcador, para evitar la ultralectura
en la traducción que podría dar lugar a una proteína de fusión de
PrP con actividad PrP. Como materia práctica, distinta a la
necesidad de que algún sitio crítico del gen de PrP se encuentre
entre las regiones homólogas (de manera que se alterará), las
limitaciones principales en la elección de las regiones homólogas es
la disponibilidad de secuencias clonadas y la existencia de sitios
de restricción en las mismas. Preferiblemente, las regiones
escogidas para ser regiones homólogas no incluirán secuencias más
largas de aproximadamente 20 nucleótidos que se sabe que se producen
en otras partes en el genoma que se está modificando. La amplia
homología entre la molécula de selección de diana y otros sitios (no
diana) en el genoma podría disminuir la eficacia de la selección de
diana desviando las moléculas de selección de diana hacia
heterodúplex no productivos en los sitios que no son diana.
La longitud de la secuencia de alteración que
separa las regiones homólogas en la molécula de selección de diana
también puede variar considerablemente sin un efecto significativo
sobre la práctica de la presente invención. La longitud mínima de la
secuencia de alteración es un par de bases. La inserción de un único
par de bases en la secuencia que codifica para PrP constituiría una
mutación de cambio de marco y, por tanto, podría evitar la expresión
de una proteína priónica funcional. Alternativamente, la sustitución
de un único par de bases podría dar como resultado: la sustitución
de un aminoácido en un sitio crítico en la proteína priónica y la
expresión sólo de la proteína priónica no funcional. Debe
reconocerse, sin embargo, que la alteración de un único par de bases
es susceptible de reversión a la secuencia de tipo natural a través
de una mutación espontánea. Por este motivo, se prefieren las
secuencias de alteración mayores de un par de bases. En el otro
extremo, una longitud excesiva en la secuencia de alteración sería
poco probable que confiriera ninguna ventaja con respecto a una
secuencia de alteración de longitud moderada y podría disminuir la
eficacia de la transfección o de la selección de diana. La longitud
excesiva en este contexto es muchas veces mayor que la distancia
entre las regiones homólogas escogidas en el gen diana. Una longitud
preferida para la secuencia de alteración es de desde 2 hasta 2.000
pares de bases. Una longitud más preferida para la secuencia de
alteración es una longitud aproximadamente equivalente a la
distancia entre las regiones del locus del gen diana que se aparean
con las regiones homólogas en la molécula de selección de diana.
Hay una gran libertad en la elección de la
secuencia de alteración, puesto que la función de alteración no es
específica de secuencia. Sin embargo, es necesario que la secuencia
nucleotídica de la región de alteración no exprese una proteína
priónica funcional y no exprese una proteína o polipéptido tóxico
para la célula transformada. También se prefiere que la secuencia de
alteración no sea exhaustivamente homóloga con los sitios en el
genoma de la célula transfectada. Tal homología disminuiría
probablemente la eficacia de la molécula de selección de diana, y
podría afectar gravemente a su función.
Para algunas realizaciones de la presente
invención se prefiere que la secuencia de alteración tenga una doble
función, es decir, que sea tanto un marcador de selección como una
secuencia de alteración. En estas realizaciones, la longitud y la
identidad de la secuencia de alteración se determinarán en gran
parte por la secuencia codificante del marcador de selección y las
secuencias asociadas de control de la expresión. El gen del marcador
de selección proporciona la selección positiva de las células
transfectadas que se han recogido e integrado en la molécula de
selección de diana. La necesidad de un marcador de selección
dependerá de los métodos escogidos para la transfección de las
células y la producción del animal transgénico. La elección de estos
métodos, a su vez, dependerá de la especie de animal en la que se
esté poniendo en práctica esta invención. Por ejemplo, un método
preferido para la producción de aves transgénicas (descrito más
adelante) no comprende un marcador de selección. En otro ejemplo
(ejemplos 1 y 2, más adelante), un método preferido para la
producción de ratones transgénicos incluye células ES murinas, y un
método preferido de transfectar células ES es la electroporación,
con la que se prefiere un marcador de selección. El marcador de
selección preferido es el gen de resistencia a antibióticos,
neomicina fosfotransferasa ("neo"). Un gen neo
con secuencias de control de la expresión de mamíferos está
disponible comercialmente (Stratagene Cloning Systems, La Jolla,
CA). Aunque se prefiere neo para la selección de células de
mamífero, pueden utilizarse otros genes de marcador, tales como
timidina cinasa, dihidrofolato reductasa, higromicina B
fosfotransferasa, xantina-guanina fosforribosil
transferasa, adenosina desaminasa, asparagina sintetasa y CAD
(carbamil fosfato sintetasa / aspartato transcarbamilasa /
dihidroorotasa) con los medios de cultivo apropiados.
En el plásmido pRVPrP3, el plásmido de selección
de diana de la presente invención descrito en el ejemplo 1 de más
adelante y en las figuras 1-5, el 72% (codones 4 a
187) de la secuencia codificante de PrP se sustituyó por un
fragmento que contenía un gen neo bajo el control del
promotor de TK (timidina cinasa) de HSV (virus Herpes simplex)
(Thomas y Capecchi, Cell 51, págs. 503-12
(1987)).
En esta discusión, la molécula de selección de
diana se describe como una molécula de ADN lineal. Sin embargo, debe
reconocerse que una molécula de selección de diana de la presente
invención también podría realizarse como una molécula de ADN
circular. Una molécula circular de selección de diana podría
comprender un par de regiones homólogas separadas por una región de
alteración, tal como se describe para una molécula lineal de
selección de diana. Alternativamente, una molécula circular de
selección de diana podría comprender una única región homóloga. Con
la integración en el locus del gen diana, la molécula circular se
linealizaría, con una parte de la región homóloga en cada extremo.
Por tanto, la región homóloga única se convertiría eficazmente en
dos regiones homólogas, tal como se describe en la discusión sobre
las moléculas lineales de selección de diana (véase Watson et
al., Molecular Biology of the Gene (4ª Ed.),
Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA, pág. 606). Un aspecto diferente
de una molécula circular de selección de diana con una única región
homóloga es que inserta la secuencia de alteración en el gen diana y
lo altera sin sustituir nada del gen diana. Un segundo aspecto
diferente es que la región homóloga única debe estar dentro del gen
diana y localizarse en 5' con respecto a al menos un sitio crítico
en la secuencia codificante de PrP.
La discusión anterior se centra en la alteración
del gen de PrP mediante recombinación homóloga, para la producción
de animales transgénicos no humanos que carecen de proteína
priónica: la realización preferida. Sin embargo, en otra
realización, la presente invención también proporciona animales no
humanos heterocigotos que tienen un gen que codifica para la
proteína priónica. Tales animales están protegidos, al menos
parcialmente, contra la tembladera. Producen la proteína priónica,
pero a un nivel reducido, debido a un efecto de dosis génica. (Los
animales de tipo natural tienen dos genes priónicos.) Y este nivel
reducido de proteína priónica confiere una resistencia significativa
frente a la encefalopatía espongiforme.
La reducción de los niveles de proteína priónica,
sin alteración del gen de PrP, es por tanto un medio alternativo de
producir resistencia a la encefalopatía espongiforme. Un experto en
la técnica puede, por ejemplo, reducir ventajosamente los niveles de
proteína priónica mediante la aplicación de técnicas antisentido
bien conocidas. Las técnicas antisentido pueden aplicarse, por
ejemplo, en cualquiera de dos enfoques diferentes. El primer enfoque
antisentido es la producción de animales transgénicos no humanos
cuyas células transcriben secuencias priónicas antisentido. El
segundo enfoque antisentido es la administración terapéutica de
oligonucleótidos antisentido a animales no transgénicos y a seres
humanos que tienen una encefalopatía espongiforme incipiente.
Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad
endorribonucleasa. Las secuencias de ribozima pueden combinarse con
secuencias antisentido para inhibir específicamente la producción de
una proteína particular. Un experto habitual en la técnica puede
reducir ventajosamente los niveles de proteína priónica uniendo
secuencias de ribozima a secuencias antisentido priónicas,
seleccionando así como diana la actividad endorribunucleasa
específicamente para el ARNm priónico, para inhibir la biosíntesis
de proteína priónica. Tal molécula de antisentido priónico -ARN de
ribozima puede proporcionarse indirectamente mediante la
transcripción de un constructo de ADN recombinante en las células de
animales transgénicos no humanos. Alternativamente, tal molécula de
antisentido priónico- ARN de ribozima puede proporcionarse
directamente mediante la administración terapéutica de la molécula
de ARN a animales no transgénicos o seres humanos. Para una
discusión general sobre la tecnología de ribozimas, véase, entre
otros: Cech, "Ribozymes and Their Medical Implications", J.
American Medical Association, vol. 260, págs.
3030-34 (1988); Haseloff y Gerlach, "Simple RNA
Enzymes with New and Highly Specific Endoribonuclease
Activities", Nature, vol. 334, págs.
585-91 (1988).
Debe reconocerse a partir de la discusión
anterior que la práctica de la presente invención requiere un clon
de ADN que comprende al menos una parte del gen diana de PrP o
clones de ADN que comprenden secuencias entre las que se encuentra
al menos una parte del gen diana de PrP. Tales clones de ADN
necesarios para la práctica de la presente invención pueden
obtenerse mediante una variedad de medios. Se han clonado y
secuenciado los genes de PrP de ratón (Locht et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 83, págs. 6372-76
(1986)), hámster (Basler et al., Cell, 46, págs.
417-28 (1986)), oveja (Goldmann et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, págs. 2476-80
(1990)), vaca (Goldmann et al., J. Gen. Virol. 72,
págs. 201-04 (1991)) y ser humano (Kretzschmar et
al., DNA 5, págs. 315-24 (1986)). Los
clones de ADN adecuados para la práctica de la presente invención en
estas especies pueden obtenerse siguiendo los métodos de clonación
del gen de PrP de explicados en las publicaciones citadas
anteriormente, mediante el uso de las secuencias publicadas en las
mismas para la síntesis química de genes de PrP o de partes de los
mismos, o mediante el uso de las secuencias publicadas para la
síntesis química de sondas de oligonucleótidos que pueden utilizarse
en procedimientos bien conocidos para aislar secuencias del gen de
PrP de una biblioteca de ADNc o una biblioteca genómica. La
secuencia nucleotídica publicada de un gen de PrP de una especie
puede utilizarse para obtener un gen de PrP de otra especie, sin
experimentación excesiva, debido a que las secuencias nucleotídicas
de todas las regiones codificantes de PrP conocidas están sumamente
conservadas (idénticas en un 80% - 90%). Además, incluso las
regiones no traducidas en 3' están conservadas en hámsters, ovejas y
seres humanos. El uso de la secuencia del gen de PrP procedente de
una secuencia para aislar un gen de PrP de una especie diferente se
ha demostrado por Goldmann et al. (citado anteriormente), que
aisló un gen de PrP de oveja mediante la detección de una biblioteca
genómica de oveja con un ADNc de PrP de hámster.
El método preferido de obtención de una secuencia
clonada de gen de PrP es:
- (a)
- utilizar los datos publicados de la secuencia del gen de PrP para sintetizar cebadores de oligonucleótido (que representan los extremos del fragmento de ADN deseado), utilizando técnicas conocidas, y
- (b)
- utilizar los cebadores preparados en (a) en procedimientos de PCR conocidos, en los que el ADN de la especie animal de interés sirve como molde.
Las moléculas de ADN de selección de diana
construidas para alterar los genes de PrP según la presente
invención pueden utilizarse para transfectar células animales
utilizando técnicas bien conocidas. Tal transfección da como
resultado las secuencias de ADN de esta invención que alteran los
genes funcionales de PrP en esas células animales. El tipo celular
escogido para la transfección con la molécula de selección de diana
de PrP debe ser pluripotencial. La característica que define a las
células pluripotenciales es la plasticidad en el desarrollo, que es
necesaria para la producción de un animal transgénico no humano.
Ejemplos de células pluripotenciales no humanas son los ovocitos, el
esperma y las células embrionarias. Los ovocitos y las células
embrionarias se prefieren en la práctica de la presente invención.
La especie animal es un factor importante en la elección del tipo de
célula pluripotencial que va a utilizarse en la práctica de la
presente invención. Por ejemplo, los métodos de cultivo de células
ES no están completamente desarrollados para todas las especies.
Los embriones unicelulares (también denominados
cigotos) se prefieren para la transfección y la producción de
mamíferos no humanos transgénicos tales como cerdos, ovejas y reses.
Los embriones unicelulares o bien se obtienen quirúrgicamente o bien
se producen mediante fertilización in vitro. Las células
madre embrionarias mantenidas en cultivo se prefieren para la
producción de pequeños mamíferos transgénicos como los ratones y los
hámsters. Las células embrionarias de un huevo recién puesto se
prefieren para la producción de aves transgénicas, tales como los
pollos.
El método de Krimpenfort et al.
(Bio/Technology 9, págs. 844-47 (1991)) se
prefiere para la producción de reses transgénicas y de otros
mamíferos grandes no humanos según la presente invención. En este
método, se recogen ovocitos inmaduros mediante la aspiración de los
folículos en los ovarios de animales sacrificados. Los ovocitos no
humanos se fertilizan in vitro mediante técnicas habituales.
La molécula de selección de diana de ADN se sitúa en el pronúcleo en
el embrión unicelular mediante microinyección en un intervalo de
tiempo apropiado tras la fertilización del ovocito (entre 16 y 23
horas para las reses). La microscopía diferencial de contraste de
interferencia se prefiere para la microinyección de cigotos bovinos,
debido a su opacidad. Los embriones se cultivan durante un periodo
apropiado tras la microinyección (nueve días para las reses), y
después se evalúan para determinar su desarrollo y aspecto normal.
Un animal no humano que comenzó el ciclo menstrual el mismo día en
que se fertilizaron los ovocitos se utiliza como receptor de uno o
dos embriones en cultivo que se han desarrollado hasta el estadio de
mórula compacta o blástula temprana.
En un enfoque de microinyección alternativo para
producir mamíferos transgénicos no humanos, incluyendo ovejas y
reses, los embriones tempranos se obtienen quirúrgicamente de los
oviductos de mamíferos inseminados artificialmente y que
experimentan superovulación, sometidos a microinyección de la
molécula de selección de diana de PrP, y se transfectan de nuevo a
la hembra donante u otra hembra fisiológicamente receptora para la
gestación (Ebert et al., Bio/Technology 9, págs.
835-38 (1991)). El uso de embriones recuperados tras
la fertilización in vivo puede producir un número algo mayor
de animales no humanos transgénicos por embrión, pero el método
requiere mucho más trabajo que el método de Krimpenfort et
al., descrito anteriormente. Para una discusión sobre las
técnicas quirúrgicas utilizadas para obtener embriones unicelulares
procedentes de la oveja, véase la publicación de patente PCT WO
90/08832.
El cultivo de células ES puede utilizarse para
producir los animales no humanos transgénicos de la presente
invención sin microinyección. Para una discusión sobre el cultivo de
las células ES y su uso en la producción de animales no humanos
transgénicos, véase la publicación de patente PCT WO 90/0154. Las
células ES se prefieren para la producción de pequeños mamíferos
transgénicos con cortos intervalos de generación y grandes tamaños
de camada. El intervalo de generación y el tamaño de la camada son
factores que han de considerarse, porque el método con células ES da
lugar a animales quiméricos. Las ventajas del método con células ES
son que las células ES pueden mantenerse en cultivo en grandes
números, y pueden transformarse eficazmente mediante técnicas
habituales de electroporación. Tras la electroporación, los clones
transformados de células ES se aíslan mediante el uso de la
selección positiva para un gen marcador dentro de la molécula de
selección de diana de ADN. Antes de su uso en la producción de
animales no humanos transgénicos, los clones de células ES
seleccionados se analizan para determinar la presencia de genes de
PrP alterados. Las células ES procedentes de un clon que se encontró
que tiene un gen de PrP alterado se inyectan en blastocistos en
cultivo. Tras la implantación de los blastocistos en el
útero, las células ES se convierten en parte del embrión y dan
lugar a animales quiméricos. En los animales no humanos quiméricos,
sólo son transgénicos los tejidos corporales derivados de las
células ES transgénicas. Sin embargo, las células reproductoras
transgénicas transmiten el transgén a las crías según los principios
hereditarios normales.
La fusión con protoplastos bacterianos, la
transfección mediada por calcio-fosfato y la
transfección mediada por DEAE
(dietilaminoetil)-dextrano se han utilizado para
introducir ADN foráneo dentro de células de mamífero. Aunque pueden
utilizarse estos métodos en la presente invención, no son
preferidos.
Se han producido pollos transgénicos (Salter
et al., Virology, 157, págs. 236-40
(1987); Bosselman et al., Science 243,
533-35 (1989); publicación de patente europea
0424044A1). Sin embargo, la anatomía y la fisiología de las aves
hacen que la manipulación y el cultivo de los embriones tempranos
sean poco prácticos. Por tanto, las técnicas tales como la
microinyección directa del pronúcleo de células individuales o la
electroporación de células ES, que se prefieren para los sistemas de
mamíferos, no son adecuadas para los sistemas de aves. Para la
práctica de la presente invención en los sistemas de aves, se
prefiere el método de Bosselman et al., descrito más
adelante.
Aun cuando el embrión de un huevo de ave fértil
recién puesto haya experimentado un desarrollo significativo,
todavía es pluripotencial. La inyección de un virus de leucosis
aviar modificado que porta el ADN foráneo ("transgén") en la
yema, cerca del embrión, da como resultado la infección de las
células embrionarias y la integración del transgén en el genoma de
esas células. Las aves resultantes (generación
"G-0") son quiméricas y portan el transgén en
sus células reproductoras en una frecuencia útil. Entonces, se
aplica la selección genética de las aves G-O seguida
por pruebas convencionales de reproducción y descendencia con
animales para obtener aves homocigotas para el transgén. El método
preferido para la producción de aves transgénicas que carecen de
genes de PrP comprende:
- (1)
- insertar el fragmento de selección de diana de ADN en un vector derivado de retrovirus aviar mediante técnicas convencionales de ADN recombinante,
- (2)
- inyectar el retrovirus que porta el fragmento de selección de diana en la yema de un huevo fértil recién puesto, cerca del embrión,
- (3)
- seleccionar los polluelos recién salidos del cascarón (G-0) que tengan el fragmento de ADN de selección de diana / proviral integrado (por ejemplo, mediante un procedimiento de dot-blot (transferencia de puntos),
- (4)
- aparear aves macho virémicos G-0 seleccionadas en la etapa (3) con hembras específicas libres de patógeno,
- (5)
- seleccionar los polluelos (generación "G-1") producidos en la etapa (4) que tengan el fragmento de ADN de selección de diana / proviral integrado,
- (6)
- aparear las aves G-1 entre sí, y
- (7)
- seleccionar los polluelos (generación "G-2") producidos en la etapa (6) que tengan la integración específica de sitio del fragmento de selección de diana (por ejemplo, mediante técnicas de PCR o análisis de hibridación Southern).
La discusión anterior se centra en las
diferencias entre la producción de mamíferos transgénicos y aves
transgénicas. Debería ser evidente que la práctica de la presente
invención con especies de aves requiere un gen de PrP clonado
adecuado para la construcción del fragmento de selección de diana.
Tal gen puede obtenerse mediante técnicas convencionales de ADN
recombinante, incluyendo el uso de secuencias publicadas de
aminoácidos parciales de la proteína PrP de pollo para sintetizar
sondas de oligonucleótidos, para seleccionar una biblioteca de ADN
de ave. Otro método de obtención de un gen de PrP de ave supone
seleccionar una biblioteca de ADN de ave con un fragmento de un gen
de PrP de mamífero clonado previamente. Un experto en la técnica
también reconocerá que, puesto que no participa ningún marcador de
resistencia a antibióticos en el método descrito anteriormente para
la producción de un ave transgénica, no es necesario que la
secuencia de alteración insertada en el gen de PrP clonado durante
la construcción de la molécula de selección de diana sea un gen de
resistencia a antibióticos.
En vista de lo anterior, debería ser evidente que
la práctica de esta invención no se limita a una especie animal
particular, a un tipo de célula pluripotencial particular para
transformación por el ADN foráneo, o a una técnica particular para
introducir ADN foráneo en la célula pluripotencial. Un experto en la
técnica seleccionará fácilmente los sistemas de cultivo celular y
administración de ADN apropiados para la especie animal.
El ratón es un sistema modelo conveniente para la
presente invención. Además de la economía obvia en la alimentación y
el mantenimiento que acompañan a la utilización de una especie de
mamíferos pequeños, el gran tamaño de la camada y el corto periodo
de gestación son consideraciones importantes para el rápido progreso
de la invención. Además, la transmisión experimental de tembladera a
ratones y hámsters (Chandler, Lancet 1, págs.
1378-79 (1961); Zlotnik y Rennie, J. Comp.
Pathol. 75, págs. 147-57 (1965)) ha
proporcionado un modelo de laboratorio valioso para la determinación
de la naturaleza del agente infeccioso y el estudio de la
enfermedad. Aunque los ejemplos expuestos más adelante se refieren a
experimentos realizados en ratones, por los motivos anteriores, la
tecnología de transferencia génica necesaria para la práctica de
esta invención se ha extendido ya a animales de cría comercialmente
importantes tales como ovejas, cabras, cerdos y reses (Pursel et
al. Science 244, págs. 1281-88).
Con el fin de que la invención descrita en el
presente documento pueda entenderse más completamente, se exponen
los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos son para
fines ilustrativos únicamente y que no han de interpretarse como
limitantes de esta invención en modo alguno. Durante la totalidad de
estos ejemplos, todas las reacciones de clonación molecular se
llevaron a cabo según los métodos expuestos en T. Maniatis et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory (1982) o J. Sambrook et al., Molecular
Cloning - A Laboratory Manual. 2ª Ed., Cold Spring Harbor Press
(1989), utilizando enzimas disponibles comercialmente, excepto
cuando se especifique lo contrario.
Se construyó el vector pRVPrP-3
de selección de diana (figuras 1-5) sustituyendo los
codones 4 a 187 del marco de lectura abierta del codón 254 de PrP
(552 pb que se extienden desde el nucleótido 10 hasta el 562), por
un fragmento de 1,1 kb que contenía el promotor TK de HSV seguido
por un gen de neomicina fosfotransferasa ("neo"). El gen
neo confiere resistencia a neomicina, kanamicina y G418
(Genecitin®). Los materiales de partida de ADN consistieron en el
cósmido Westaway (una donación de David Westaway) (descrito más
adelante), el plásmido pBluescript, un plásmido de expresión de
mamíferos disponible comercialmente (véase Short et al.,
Nuc. Acids Res. 16, pág. 7583 (1988); información del
producto de Strategene Cloning Systems) y pMClneoPA, un plásmido de
resistencia a neomicina disponible comercialmente (véase Thomas y
Capecchi, Cell, 51, págs. 503-12 (1987);
información del producto de Strategene Cloning Systems).
El cósmido Westaway consiste en pUC18 (escindido
por BamHI y EcoRI) (véase la información del producto
de GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD;
Yanisch-Perron et al., Gene 33, pág. 103
(1985)) con un inserto genómico de ratón de 8,9 kb
BamHI-BamHI que contiene el exón 3 de
Prn-p (que codifica para la totalidad de la
proteína priónica) y parte del intrón adyacente. Se subclonó un
fragmento de 4,2 kb BamHI-EcoRI que contenía el exón 3
y el intrón parcial en el sitio de clonación múltiple ("MCS")
escindido por BamHI y EcoRI de pBluescript, para
producir un primer plásmido intermedio, pBluescriptPrP2 (figura 1).
Se escindió el gen neo y sus secuencias de control de la
expresión ("casete de expresión neoPA") a partir de pMC1neo con
XhoI y SalI y se insertó mediante una ligación de
extremo romo en el sitio BstEII (cerca del codón 187) del
exón 3, para producir un segundo plásmido intermedio, pRVPrPneoPA2
(figura 2).
La etapa final en la construcción del plásmido de
selección de diana, pRVPrP3, supuso la ligación de 3 fragmentos
(figura 5). El "fragmento 1", el fragmento de 5,5 kb
PstI-ClaI de pBluescriptPrP2, contiene el vector
Bluescript y la secuencia del intrón de PrP entre el sitio
BamHI y el sitio PstI (figura 3). El "fragmento
2", el fragmento de 1,7 kb XhoI-ClaI de
pRVPrPneoPA-2 contiene el casete de expresión neoPA
seguido por el resto de la secuencia codificante de PrP en sentido
3' desde las secuencias no codificantes, eliminadas, BstEII,
que se extienden hasta el sitio EcoRI; y parte de la región
MCS de Bluescript (figura 3). El "fragmento 3", requerido para
la reconstrucción de la región entre el sitio PstI en el
intrón y el sitio XhoI en el extremo 5' del casete neoPA, se
generó mediante la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"),
utilizando pBluescript-PrP2 linealizado como molde.
El cebador en el extremo 5' terminal, "P5" (SEQ ID Nº: 1):
(5') GCTTTCTTCA AGTCCTTGCT CCTGCTGTAG (3'),
es complementario a las secuencias de intrón en
sentido 5' del sitio PstI. El cebador del extremo 3',
"PrP-Xho" (SEQ ID Nº: 2):
(5') TGACTCGAGG GTTCGCCATG ATGACT
(3'),
es complementario al límite intrón - exón y tiene
un sitio artificial XhoI (subrayado) cerca de su extremo 5'.
Se obtuvo el "fragmento 3" de 0,49 kb mediante la digestión del
producto de reacción con PstI y XhoI. El "fragmento
3" se extiende desde el sitio PstI hasta la posición +10
(en relación con el codón de iniciación de PrP).
Se aisló el fragmento ClaI-SacII de
4,8 kb de pRVPrP-3, para su utilización como un
fragmento de selección de diana en transfecciones (figura 5). El
fragmento de selección de diana comprende el casete neoPA flanqueado
en un extremo por la secuencia de intrón de ratón y parte de la
secuencia no codificante de PrP en 5', y en el otro extremo, por un
28% de la secuencia codificante de PrP en 3' y la región no
codificante del gen de PrP en 3'.
Se cultivaron células madre embrionarias
("ES") murinas de la cepa AB-1 (derivadas de
ratones sv129 agouti) sobre células de alimentación SNL76/7 que
expresan el factor inhibidor de la leucemia ("LIF") irradiadas,
resistentes a G418* y con 1/6
pases cada 2 días en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco)
con 20% de FCS (suero bovino fetal). Ambas líneas celulares se
proporcionaron por A. Bradley (McMahon y Bradley, Cell 62,
1073-85, (1990)).
Se distribuyeron aproximadamente 3 x 10^{7}
células digeridas con tripsina en 1,4 ml de PBS (solución salina
tamponada con fosfato) en 2 cubetas y se sometieron a
electroporación con aproximadamente 10 \mug del fragmento
purificado ClaI-SacII de selección de diana descrito
en el ejemplo 1 (anteriormente), en cada cubeta. Para la
electroporación, se utilizaron técnicas habituales (véase
generalmente, Chu et al., Nuc. Acids. Res. 15, pág.
1311 (1987)) y un aparato disponible comercialmente (BioRad Gene
Pulser). Los parámetros de la electroporación fueron 240 v/500
\muF.
Se utilizó una estrategia de selección de 2
etapas para identificar clones de ES con el fragmento de selección
de diana integrado en el locus apropiado mediante recombinación
homóloga. Puesto que el fragmento de selección de diana contiene el
casete neoPA, las células que integran ese fragmento en un
cromosoma, ya sea mediante inserción al azar o mediante
recombinación homóloga, expresan resistencia a neomicina. Tras la
electroporación, se sembraron en placa las células en (10) placas
de alimentación de 90 mm. Tras 24 horas, se añadieron 0,3 mg de
G418/ml de medio, como la primera etapa de selección. Tras
10-12 días, se recogieron las colonias resistentes
a G418 en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos, se
digirieron con tripsina y se resuspendieron. Se sembraron en placa
alícuotas de las suspensiones celulares sobre células de
alimentación irradiadas en placas maestras de 48 pocillos y se
reunieron las células restantes de cada pocillo en grupos de 12. Se
utilizaron técnicas de PCR (véase, generalmente, Sambrook et
al., (citado anteriormente), Capítulo 14) para identificar las
colonias resistentes a G418 con la secuencia de selección de diana
integrada mediante recombinación homóloga. Se lisaron
aproximadamente 50.000 células para cada análisis de PCR. Las
técnicas de PCR fueron esencialmente tal como se describen por
Saiki et al. (Science, 239, págs.
487-91 (1988)). Se realizaron ciclos de 35 veces
durante 1 min. a 94ºC, y 3 min. a 70ºC, con cebadores "P3" (SEQ
ID Nº: 3):
(5') ATTCGCAGCG CATCGCCTTC TATCGCC (3'),
que es complementaria al extremo 3'
del casete neoPA, y "P4" (SEQ ID Nº:
4):
(5') CCTGGGAATGAACAAAGGTTTGCTTTCAAC (3'),
que es complementaria a las
secuencias genómicas de PrP adyacentes al fragmento de selección de
diana (figura 5). Estos cebadores dan lugar a un producto de PCR de
850 pb sólo cuando el fragmento de selección de diana está integrado
en el locus de PrP. Se generó un control positivo de células ES
transformando células ES D3 con un constructo que contenía
secuencias flanqueantes adicionales en 3' (el segmento
EcoRI-XbaI de 1,3 kb mostrado en la figura
1), incluyendo el sitio de unión al cebador para P4, ausente en el
vector de selección de
diana.
Una vez que el clon
ES\DeltaP-37/10 de las células ES murinas
transformadas dio resultados positivos en la selección por PCR
(anteriormente), se utilizó un análisis de hibridación Southern
para confirmar que ese clon ES\DeltaP-37/10 tenía
un alelo Prn-p alterado por el fragmento de
selección de diana. La sonda en el análisis de Southern fue la
sonda A, un fragmento BstEII-EcoRI de 0,650 kb que se
mapea en el extremo 3' del fragmento de selección de diana, que se
hibrida con las secuencias de PrP tanto endógenas como
exógenas.
Se inyectaron blastocistos de ratones C57BL/6
(negros) con células ES\DeltaP-37/10 y se
implantaron los blastocistos en madres adoptivas (genotipo ICR),
esencialmente tal como se describe por Bradley ("Production and
Analysis of Chimaeric Mice", en Teratocarcinomas and Embryonic
Stem Cells: A Practical Approach, (E.J. Robertson, ed.) Oxford
IRL Press, págs. 113-51, (1987)). Aproximadamente
el 45% de las crías resultantes fueron parcialmente quiméricas y el
35% más del 90% quiméricas en el color del pelaje agouti.
Se aparearon machos quiméricos a la edad de 7
semanas con hembras C57BL/6J. De 22 machos fértiles, 9 de grado alto
y 3 de grado medio (20-30%) trasmitieron el
marcador agouti a sus crías. Se determinó el genotipo de la
descendencia mediante análisis por PCR de ADN de la cola (Hogan
et al., Maninulating the Mouse Embryo, Cold Spring
Harbor Press (1986)). Se utilizaron los cebadores P10 y P4 en
reacciones separadas para demostrar la presencia del alelo normal
PrP (banda de 1,1 kb). El cebador P10 (SEQ ID Nº: 5):
(5') GTACCCATAA TCAGTGGAAC AAGCCCAGC (3')
se hibrida con las secuencias de
PrP que se sustituyeron por el casete neoPA en el alelo
recombinado. Las muestras se volvieron a someter a ciclos de 35
veces durante 1 min. a 94ºC, 2 min. a 66ºC, 1 min. a 70ºC. Se
confirmaron los resultados del genotipo por PCR mediante análisis
de hibridación Southern. Para el análisis de Southern, se realizó
una inmunotransferencia y se hibridó ADN escindido con XbaI
con la sonda A (véase anteriormente) o una sonda que englobaba la
secuencia neoPA, derivada de pMC1neoPA
(Stratagene).
La selección de 147 crías agouti demostró que
aproximadamente el 50% eran heterocigotos para el alelo alterado
Prn-p. El análisis de hibridación Southern
confirmó la presencia del gen alterado
("Prn-p^{0}"). Sólo se había integrado una
única copia de la secuencia de selección de diana en el genoma del
ratón, tal como se demuestra por el hecho de que una sonda
específica para el gen neo sólo se hibridó con un único
fragmento XbaI de la longitud esperada, 4 kb. Dado que la
secuencia de selección de diana sólo contenía un único sitio
XbaI, cada acontecimiento de integración debería dar
fragmentos adicionales de 4,8 ó 5,4 kb, dependiendo de la
orientación relativa de unos con respecto a los otros.
El apareamiento de heterocigotos
Prn-p^{0/+} dio 103 descendientes
superficialmente indistinguibles. El análisis por PCR del ADN de los
103 descendientes reveló que el 23% era homocigoto para el gen de
PrP de tipo natural, el 52% era heterocigoto y el 25% era
homocigoto para el gen de PrP alterado. El análisis de hibridación
Southern confirmó el genotipo de los ratones homocigotos
Prn-p^{0/0}. El periodo de vida media de
estos homocigotos todavía no se ha determinado, pero no se
produjeron muertes espontáneas hasta las 13 semanas.
El análisis de Northern de ratones
Prn-p^{0/0} no reveló una cantidad
detectable de ARNm de PrP de longitud completa. Sin embargo, tal
como se esperaba, se detectó un transcrito de fusión neo-PrP
utilizando una sonda neo o una sonda A. De manera similar,
el análisis de Western de extractos cerebrales de ratones
Prn-p^{0/0}, utilizando anticuerpos
policlonales anti-PrP no reveló proteína priónica
detectable.
No se observaron anomalías macroscópicas en los
ratones homocigotos Prn-p^{0/0}. La
anatomía cerebral, tal como se evalúa mediante el examen
microscópico en secciones seriadas, parecía normal. Algunos ratones
mostraron vacuolización localizada en el hipocampo, pero la
incidencia fue similar en los animales de tipo natural, los
heterocigotos Prn-p^{0/+} y los homocigotos
Prn-p^{0/0}. Por tanto, la vacuolización
del hipocampo no está relacionada con la alteración del gen de
PrP.
Se sometieron 57 ratones homocigotos
Prn-p^{0/0} (que carecen de proteína
priónica) y 57 ratones Prn-p^{0/+}
(controles normales) a inoculación de tembladera. Se inocularon los
ratones de ambos grupos por vía intracerebral con una dosis alta
(aproximadamente 10^{7} unidades infecciosas) de la cepa Chandler
de priones adaptados para ratón. Se sacrificaron 4 animales de cada
grupo tras 4 días, y tras 2, 8, 12 y 20 semanas. De cada animal
sacrificado se recuperó el cerebro y el bazo para determinar la
infectividad. También se sometió el cerebro a examen
histológico.
Los ratones control normales demostraron síntomas
de tembladera a los 158 \pm 11 días y murieron a los 171 \pm 11
días. Los ratones que carecen de la proteína priónica parecían
sanos 252 días tras la inoculación, que fue 49 días después de que
los últimos controles Prn-p^{+/+}
murieran.
El experimento de tiempo - curso de infectividad
reveló que los extractos cerebrales de los ratones control, a las
12 semanas tras la inoculación, dieron lugar a enfermedad en los
ratones con indicador CD-1 tras 140 días. En las
pruebas correspondientes con extractos de cerebro o bazo de ratones
que carecían de proteína priónica, no se produjo transmisión
detectable de tembladera.
Los resultados anteriores demuestran que los
ratones que carecen de proteína priónica están completamente
protegidos frente a la encefalopatía espongiforme. Los resultados
anteriores también indican que los ratones que carecen de proteína
priónica no pueden propagar la tembladera.
Los ratones heterocigotos
Prn-p^{0/+} sólo tienen un gen que codifica
para la proteína priónica, en lugar de dos. Tales heterocigotos
producen proteína priónica, pero a un nivel reducido, debido a un
efecto de dosis génica.
Para probar la resistencia a la tembladera que
resulta de un nivel de proteína priónica inferior al normal (pero no
de cero), se inoculó un heterocigoto
Prn-p^{0/+} por vía intracerebral con
aproximadamente 10^{7} unidades infecciosas de la cepa Chandler
de priones adaptados para ratón. El ratón heterocigoto parecía sano
260 días tras la inoculación. En una prueba similar de resistencia
a la tembladera que incluyó un grupo de ratones heterocigotos
Prn-p^{0/+}, los ratones heterocigotos
parecían sanos a los 150 días tras la inoculación.
La demostración de que los ratones heterocigotos
Prn-p^{0/+} son mucho más resistentes a la
tembladera que los ratones de tipo natural (es decir,
Prn-p^{+/+}) indica que incluso una
reducción moderada en la síntesis de proteína priónica confiere al
menos una protección parcial frente a la encefalopatía
espongiforme.
Para demostrar de manera concluyente que la
resistencia observada a la infección y transmisión de la tembladera
estaba producida por la ausencia de proteína priónica, se
reintrodujeron genes priónicos en la cepa de ratón transgénico
Prn-p^{0/0} y se probaron para determinar
la restauración de la propensión a la tembladera. En este
experimento, se utilizaron ratones tgHaPrn-p.
La cepa tgHaPrn-p (producida por Stanley
Prusiner et al.) es homocigota para un cromosoma que porta 30
- 50 copias del gen Prn-P de hámster sirio.
La cepa de ratón tgHaPrn-p es sumamente
susceptible a los priones de hámster y algo menos susceptible a los
priones de ratón que los ratones de tipo natural
(Prn-p^{+/+}). Se aparearon ratones
Prn-p^{0/0} con ratones
tgHaPrn-p y se identificaron los
descendientes Prn-p^{0/+}/
HaPrn-p^{0/+}. Se volvieron a cruzar estos
descendientes con ratones Prn-p^{0/0} y se
identificaron los individuos Prn-p^{0/0}/
HaPrn-p^{0/+}. Se inocularon (tal como se
describió anteriormente) grupos de 9-11 ratones
Prn-p^{0/0}/
HaPrn-p^{0/+} con priones de tembladera de
ratón de la cepa Chandler o priones de hámster de la cepa Sc237.
Los ratones inoculados con la cepa Sc237 de prión de hámster
mostraron síntomas neurológicos tras 56 \pm 3 días y murieron tras
59 \pm 5 días. A partir de los 140 días tras la inoculación, los
ratones que recibieron los priones de ratón carecieron de síntomas
de la enfermedad.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Weissmann, Charles
\hskip3,9cm Bueler, Hansruedi
\hskip3,9cm Aguet, Michel
\hskip3,9cm Fischer, Marek
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANIMALES TRANSGÉNICOS QUE CARECEN DE PROTEÍNAS PRIÓNICAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: c/o FISH & NEAVE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 875 Third Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 10022
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-NOV-1991
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO / AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Haley Jr., James F.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 27.794
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE COMUNICACIONES A DISTANCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (212) 715-0600
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (212) 715-0674
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 14-8367
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTTCTTCA AGTCCTTGCT CCTGCTGTAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGACTCGAGG GTTCGCCATG ATGACT
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTCGCAGCG CATCGCCTTC TATCGCC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTGGGAATG AACAAAGGTT TGCTTTCAAC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTACCCATAA TCAGTGGAAC AAGCCCAGC
\hfill29
Claims (16)
1. Molécula de ADN seleccionada del grupo que
consiste en:
- (a)
- una molécula de selección de diana capaz de alterar específicamente secuencias génicas de proteína priónica en células de mamíferos o aves, en la que dicho gen es incapaz de expresar la proteína priónica funcional;
- (b)
- el plásmido pRVPrP3, cuya construcción se representa en las figuras 1 a 5; y
- (c)
- el fragmento ClaI-SacII de 4,8 kb del plásmido
2. Célula de mamífero no humano o ave que
comprende la molécula de selección de diana según la reivindicación
1.
3. Mamífero no humano o ave transgénicos que
comprende la célula según la reivindicación 2.
4. Mamífero no humano o ave transgénicos según la
reivindicación 3, que se vuelve no propenso a enfermedades debidas
a la proteína priónica por la falta de proteína priónica.
5. Mamífero no humano o ave transgénicos según la
reivindicación 3 ó 4, en el que uno o más de los genes que
codifican para la proteína priónica en sus células reproductoras o
somáticas se han alterado mediante una molécula de selección de
diana, en la que dicho(s) gen(es) alterado(s)
es (son) incapaz(ces) de expresar la proteína priónica
funcional.
6. Mamífero no humano transgénico según una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 que pertenecen a un género
seleccionado del grupo que consiste en:
- (a)
- Mus;
- (b)
- Rattus;
- (c)
- Mesocricetus;
- (d)
- Oryctolagus;
- (e)
- Sus;
- (f)
- Ovis; y
- (g)
- Bos.
7. Uso de la molécula de ADN según la
reivindicación 1, para la preparación de una composición
farmacéutica para tratar o prevenir encefalopatías
espongiformes.
8. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha
encefalopatía espongiforme es el kuru, la enfermedad de
Creutzfeldt-Jacob, el síndrome de Gerstmann-
Sträussler-Scheinker, la tembladera, la
encefalopatía espongiforme bovina, la enfermedad de desgaste
crónico o la encefalopatía transmisible del visón.
9. Método para la producción de una molécula de
ADN que comprende la etapa de construir:
- (a)
- una molécula de selección de diana capaz de alterar específicamente secuencias génicas de proteína priónica en células de mamíferos o aves, en la que dicho gen es incapaz de expresar la proteína priónica funcional; o
- (b)
- el plásmido pRVPrP3, cuya construcción se representa en las figuras 1 a 5; o
- (c)
- el fragmento ClaI-SacII de 4,8 kb del plásmido.
10. Método para la producción de una célula de
mamífero no humano o ave transgénicos, que comprende transfectar
la molécula de selección de diana según la reivindicación 9 en
dicha célula de mamífero no humano o ave.
11. Método para la producción de un mamífero no
humano o ave, que comprende utilizar la célula según la
reivindicación 10 para producir un mamífero no humano o ave.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
dicho mamífero no humano o ave se vuelve no propenso a enfermedades
debidas a la proteína priónica por la falta de proteína
priónica.
13. Método según la reivindicación 11 ó 12, en el
que en dicho mamífero no humano o ave transgénicos, uno o más de
los genes que codifican para la proteína priónica en sus células
reproductoras o somáticas se han alterado mediante una molécula de
selección de diana, en la que dicho(s) gen(es)
alterado(s) es (son) incapaz(ces) de expresar la
proteína priónica funcional.
14. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, en el que dicho mamífero no humano
transgénico pertenece a un género seleccionado del grupo que
consiste en:
- (a)
- Mus;
- (b)
- Rattus;
- (c)
- Mesocricetus;
- (d)
- Oryctolagus;
- (e)
- Sus;
- (f)
- Ovis; y
- (g)
- Bos.
15. Procedimiento para la fabricación de un
agente para tratar o prevenir las encefalopatías espongiformes,
caracterizado por el uso, como un constituyente esencial de
dicho agente, de la molécula de ADN según la reivindicación 9.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que dicha encafalopatía espongiforme es el kuru, la enfermedad de
Creutzfeldt-Jacob, el síndrome de
Gerstmann-Sträussler-Scheinker, la
tembladera, la encefalopatía espongiforme bovina, la enfermedad de
desgaste crónico o la encefalopatía transmisible del visón.
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