ES2236919T3 - Metodo para preparar composiciones farmaceuticas de particulas lipidicas que comprenden un agente lipidico y una proteina. - Google Patents

Abstract

Un método para preparar una composición de partículas lipídicas que comprende un agente lipídico y una proteína, en el que la proteína es una apolipoproteína, caracterizada por: (i) introducir una preparación de proteína y un agente lipídico en una instalación de homogeneización; (ii) someter mezcla fluida resultante de proteína y agente lipídico a homogeneización a alta presión; y (iii) recoger la composición así formada de partículas lipídicas.

Description

Método para preparar composiciones farmacéuticas de partículas lipídicas que comprenden un agente lipídico y una proteína.

Campo de invención

La presente invención se refiere a un método para la preparación de composiciones farmacéuticas de apolipoproteínas y lípidos por medio de homogeneización a presión alta, así como composiciones farmacéuticas obtenibles por el procedimiento.

Fundamentos de la invención

Se considera un problema de necesidad definir y desarrollar un método para preparar una composición de una proteína con propiedades farmacéuticas, adecuado para producción farmacéutica a gran escala y que dé como resultado un producto farmacéutico seguro, eficaz y clínicamente aceptable. Un problema es conservar la estabilidad de la proteína durante la preparación, el almacenamiento y la manipulación. Otro problema es asegurar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas deseadas de la proteína. Se ha sugerido a menudo que los sistemas lipídicos dispersados constituirían vehículos adecuados para productos farmacéuticos incluyendo proteínas y los problemas mencionados son en muchos aspectos los mismos también para tales sistemas dispersados. Sería deseable por lo tanto ser capaz de proporcionar un método de unión de proteínas y lípidos y superar de ese modo los problemas mencionados que en muchos casos también se refieren a los lípidos dispersados. En particular, sería deseable ser capaz de asociar la proteína con un vehículo lipídico para mejorar la estabilidad de las proteínas y el suministro de una formulación de distribución de fármacos específicamente diseñada. En ciertas aplicaciones, sería también deseable por ejemplo alargar la semivida in vivo en el sistema de circulación de la proteína bioactiva que de otro modo se arriesgaría a que se degradase enzimáticamente antes de que alcanzara el objetivo en que debería ejercer su actividad beneficiosa.

Se han dedicado muchos esfuerzos a encontrar formas de administración adecuadas tales que mantengan la bioactividad de la proteína, aunque evitando al mismo tiempo la implicación de vehículos y adyuvantes de formulación que puedan causar efectos secundarios clínicos. Se han sugerido imitaciones de las partículas de transporte de lípidos y proteínas, naturales, en el torrente circulatorio como un modelo atractivo para diseñar sistemas de administración para proteínas bioactivas. Algunas formas importantes de estas partículas lipídicas son quilomicrones, los transportadores de triglicéridos que aparecen en el torrente circulatorio después de la ingestión de alimento rico en lípidos, partículas VLDL, LDL- y HDL (por sus siglas en inglés). Estas partículas se componen principalmente de colesterol libre y esterificado, triglicéridos, fosfolípidos y otros diversos componentes lipídicos minoritarios y proteínas. Las partículas LDL sirven como transportadoras de colesterol y otros lípidos a las células, mientras que las partículas HDL transportan estos materiales al hígado por eliminación. Una partícula HDL tiene a menudo una forma de disco con una superficie exterior cubierta por una capa de fosfolípidos y un núcleo hidrófobo. Las proteínas anfifílicas tales como apolipoproteína A-I y A-II, están unidas a la superficie por medio de interacción de la cara hidrófoba de su dominio alfa-helicoidal con la parte hidrófoba de los fosfolípidos.

Los productos del tipo quilomicrones sintéticos han encontrado uso en particular como sustancias nutritivas parenterales. Es una tecnología extensamente establecida para preparar emulsiones de lípidos a partir de un aceite triglicerídico purificado (predominantemente aceite de soja y de cártamo) y fosfolípidos (de yema de huevo o sojas), que se consideran como clínicamente aceptables para uso parenteral debido a sus gotitas de emulsión de tipo quilomicrones, generalmente del tamaño entre 0,1 y 1 \mum. También existen diversos productos comerciales en que se usan tales emulsiones como vehículos para fármacos lipófilos que se disuelven en la fase lipídica dispersada, tal como Diazemuls® y Diprivan®. Sin embargo, una complicación práctica con este tipo de vehículos de emulsión es su relativa inestabilidad física que a menudo se debilita por la adición del fármaco hidrófobo y conduce a una ruptura de la emulsión y haciéndolo así peligroso de administrar debido al riesgo de embolia lipídica. Ha habido muchos intentos para resolver este problema por adición de estabilizantes que, sin embargo, con frecuencia están relacionados con efectos secundarios no deseados. La inestabilidad de tales emulsiones, también con respecto a la esterilización por vapor a alta presión, es decir, esterilización en autoclave y durante almacenamiento posterior, con frecuencia ha inhibido su uso como vehículos de fármacos parenterales de fármacos. Generalmente, los procedimientos de esterilización en autoclave también tienden a dañar a muchos productos farmacéuticos inestables que se tienen que incorporar con emulsiones como, por ejemplo, muchas proteínas.

Se han sugerido a menudo liposomas como vehículos adecuados para distribución parenteral de proteínas, como por ejemplo se describe en el artículo por A L Weiner en Immunomethods, 1.994, Vol. 4, págs. 201-209. Un vehículo de liposomas sería ventajoso, por ejemplo, cuando se desea una solubilización mejorada, una liberación prolongada (o semivida alargada) o una elección de objetivo de la proteína mejorada. Se reconoce, sin embargo, en el mencionado artículo que muchos métodos usados a menudo para diseñar sistemas de liposomas implican con frecuencia procedimientos que se arriesgan a destruir la actividad de proteínas sensibles, por ejemplo por desnaturalización y oxidación.

Por otra parte, en Liposome Technology, 1.993 por CRC Press Inc., Vol. 1, Cap. 3, págs. 49-63: MM Brandl et al, se describe cómo utilizar homogeneización a alta presión para preparar liposomas de calidad unilaminar pequeña e idoneidad de esta técnica para la reducción de tamaño de vesícula, extensión de la distribución de tamaño y laminabilidad de dispersiones de vesículas multilaminares preformadas. También se describe la inclusión de proteínas y péptidos, específicamente hemoglobina e insulina, sin embargo el pequeño tamaño de las vesículas resultantes es desventajoso y son bajas las eficacias de la inclusión de las proteínas. Por otra parte, se relata que se mantiene la integridad y la función biológica de la hemoglobina, al menos durante exposiciones cortas a estados de estrés.

Se describe otro tipo de sistema de distribución de un agente lipídico dispersado que se sugiere como adecuado para proteínas, en la patente internacional WO 93/06921. Este sistema comprende partículas lipídicas coloidales con una fase no laminar interior de lípidos tal como una fase hexagonal o fase cúbica, inversa, que se puede asociar con una proteína.

Por otra parte, muchas proteínas en forma purificada son tristemente difíciles de formular. Por ejemplo, la somatotropina humana (SH) presenta deficiente estabilidad en solución acuosa durante el almacenamiento, razón por la que se aconseja almacenar las preparaciones en una forma liofilizada hasta su administración, cuando se reconstituye a una solución inyectable. Sin embargo, una exposición involuntaria a fuerzas de cizallamiento debido a un procedimiento de reconstitución descuidado conducirá irrevocablemente a una pérdida de actividad biológica. Por esta razón se han desarrollado medios especialmente diseñados para llevar a cabo una reconstitución suave para la somatotropina humana, como se describe en la patente europea EP 0 298 067.

Hay muchas descripciones de partículas HDL sintéticas en la bibliografía que se refieren a su capacidad para recoger y retirar material lipídico no deseado en el torrente circulatorio y desde los vasos sanguíneos haciéndolos así potencialmente útiles en el tratamiento de la ateroesclerosis, reduciendo el colesterol de las placas arteriales y para eliminar toxinas solubles en lípidos tales como endotoxinas.

En Experimental Lung Res. 1.984, Vol. 6, págs. 255-270: A Jonas, se describen con detalle estados experimentales de formación de complejos de las apolipoproteínas parcialmente hidrófobas y los fosfolípidos. Se encontró que, poniendo en contacto apolipoproteínas con vesículas de fosfatidilcolina preformadas, se formaban espontáneamente partículas lipídicas que se podían usar como análogos de partículas HDL. Mezclando fosfatidilcolina y ácidos biliares a una dispersión micelar y poniendo en contacto la mezcla resultante con apolipoproteínas conformadas específicamente, se formaban partículas lipídicas discoidales y termodinámicamente estables, por medio de un método de diálisis, denominado con posterioridad el "método de diálisis de colato".

En la patente de EE.UU. 4.643.988 a Research Corporation se describen péptidos sintéticos útiles en el tratamiento de la ateroesclerosis con una hélice anfifática mejorada y una capacidad para formar espontáneamente partículas lipídicas discoidales estables con fosfolípidos que se parecen a complejos de HDL naturales. Las partículas lipídicas se pueden formar poniendo en contacto vesículas de fosfatidilcolina preparadas por exposición a los ultrasonidos. Sin embargo, tal método de producción que incluye exposición a los ultrasonidos sólo es adecuado para lotes más pequeños de partículas lipídicas y no para producción farmacéutica a gran escala.

En la patente de EE.UU. 5.128.318 a Rogosin Institute se describe la producción de partículas que contienen lipoproteína reconstituida (partículas HDL) a partir de apolipoproteínas procedentes del plasma que se transforman en partículas sintéticas para administración parenteral con la adición de fosfatidilcolina de colato y de yema de huevo. Un método similar se describe también en la solicitud de patente japonesa JP 61-152632 a Daiichi Seiyaku KK.

También en la patente internacional WO 87/02062 a Biotechn. Res. Partners LTD, se describe cómo obtener una formulación estabilizada por incubación de una solución de proteína de unión a lípidos, producida recombinantemente, tal como apolipoproteína humana, con una emulsión lipídica convencional para nutrición parenteral.

El artículo por G. Franceschini et al. en J. Biol. Chem., 1.985, Vol. 260 (30), págs. 16.231-25 considera la formación espontánea de partículas lipídicas entre apolipoproteína A-I y fosfatidilcolina. En este artículo, también se revela que Apo A-IM (Milano), la variante de la apolipoproteína A-I transportada por individuos muestra tener una frecuencia muy baja de ateroesclerosis, tiene una afinidad más alta (tasa de asociación) a dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC, por sus siglas en inglés) que Apo A-I normal. Se sugiere que la Apo A-IM mutante tiene una exposición ligeramente mayor de restos hidrófobos que pueden contribuir tanto a un catabolismo acelerado como a una capacidad mejorada de absorción de los lípidos de tejidos, de tales partículas de Apo A-IM/DMPC.

En la solicitud de patente canadiense CA 2138925 a la Swiss Red Cross se describe un método, más industrialmente aplicable, mejorado, para producir partículas de lipoproteínas de alta densidad reconstituidas, sintéticas, (rHDL), a partir de apolipoproteínas de suero purificadas y fosfolípidos, que evita disolventes orgánicos al tiempo que da como resultado menos fosfolípidos no complejados, libres, no unidos (es decir, un rendimiento mayor de partículas de lipoproteína). En la presente memoria, se sugiere mezclar una solución acuosa de apolipoproteínas con una solución acuosa de fosfolípido y ácidos biliares, después de lo cual se incuba la mezcla resultante y se forman espontáneamente partículas de proteína y fosfolípido cuando se retiran ácidos biliares de las micelas de fosfolípido/ácido biliar con diafiltración.

El método que emplea el uso de ácidos biliares para preparar una dispersión micelar del lípido de acuerdo con el método de diálisis de colato tiene diversas ventajas para la producción de partículas lipídicas, puesto que requiere una etapa de separación específica de la mezcla resultante. Adicionalmente, se puede sospechar que los restos de ácido biliar incluso en pequeñas cantidades inducen efectos secundarios después de administración parenteral y también pueden constituir un riesgo de contaminación vírica. Por otra parte, los métodos referidos anteriormente para preparar partículas de lipoproteína y lípido experimentan en general deficiente reproducibilidad y tamaños de partícula no definibles. En particular, ninguno de estos métodos es adecuado en un procedimiento industrial a gran escala bajo condiciones bien controladas.

Un método sorprendentemente ventajoso se demuestra por la presente invención, que satisface estos requerimientos y resuelve numerosos problemas que de otra manera están asociados con la formulación de proteínas, especialmente en producción a gran escala.

Descripción de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para producción a gran escala de complejos de apolipoproteínas y lípidos que simplemente y económicamente dé como resultado productos de partículas lipídicas en alto rendimiento, formando así una composición con bioactividad de la proteína esencialmente mantenida que se pueda transformar fácilmente en una formulación adecuada para utilidad terapéutica, especialmente para administración parenteral, sin emplear en la mayor extensión posible ninguno de los aditivos tales que puedan tener potenciales efectos secundarios en el tratamiento.

También es un objeto de la presente invención proporcionar un método versátil que pueda formar una categoría seleccionada de partículas lipídicas que comprenda una proteína bioactiva, adecuada para un gran número de proteínas y agentes lipídicos adecuados, designados, de una manera simple posible para integrarse con el proceso aguas abajo existente o normal de producción de proteína recombinante.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de fabricación para complejos de proteínas y lípidos en la forma de partículas lipídicas que evite someter a las proteínas a tratamientos que conduzcan a la pérdida de su bioactividad debido a temperaturas excesivas, alteraciones de pH que podrían infligir desnaturalización, agregación o precipitación.

Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de fabricación para complejos de proteínas y lípidos en la forma de partículas lipídicas después de lo cual la proteína mantenga su identidad química debido a la oxidación de aminoácidos sensibles como metionina y cisteína y desamidación.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un procedimiento para preparar partículas lipídicas que comprendan una proteína bioactiva que tenga un alto rendimiento, evitando así restos de grandes cantidades de proteínas libres y lípido libre.

Es un objeto aún adicional de la presente invención proporcionar un procedimiento para producción a gran escala de partículas lipídicas que comprenda una proteína bioactiva que dé como resultado composición que se pueda transformar fácilmente en un producto farmacológico, por ejemplo, en la forma de una formulación liofilizada.

Es un objeto aún adicional de la presente invención permitir un procedimiento que dé como resultado un producto farmacológico de partículas lipídicas y una proteína bioactiva que proporcione condiciones asépticas mejoradas sin introducir métodos de esterilización que se arriesguen a destruir una proteína lábil.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento que pueda estabilizar y modificar partículas lipídicas en una dispersión lipídica por su asociación con una proteína adecuada.

Estos objetos de invención se obtienen por el método inventivo dirigido a la preparación de una composición de partículas lipídicas que comprenda una proteína que sea capaz de ser sometida a altas fuerzas de cizallamiento sin pérdida sustancial de actividad y un lípido. El método inventivo se caracteriza generalmente por las etapas de: introducir una preparación de proteínas y un agente lipídico en una instalación de homogeneización; someter la mezcla resultante de proteína y el agente lipídico juntos a una homogeneización a alta presión y finalmente recoger la composición así formada de partículas lipídicas.

Además, la presente invención también se dirige a una composición sólida de una proteína bioactiva obtenible por el método inventivo así como un equipo de herramientas que contenga tal composición sólida y un fluido de reconstitución acuoso.

Se dan a continuación detalles adicionales de los métodos, los componentes que están formando la partícula lipídica y otros adyuvantes técnicos que constituyen diferentes realizaciones de la presente invención, en las reivindicaciones adjuntas y en la descripción detallada de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención en su forma más general, se dirige a un método para preparar una composición de partículas lipídicas que comprende una proteína, capaz de ser sometida a altas fuerzas de cizallamiento sin pérdida sustancial de actividad y un agente lipídico. Los elementos de caracterización del método son: la introducción de una preparación de proteínas y un agente lipídico en una instalación de homogeneización, después de lo cual la mezcla fluida resultante de proteína y agente lipídico se somete a homogeneización a alta presión. Las partículas lipídicas así formadas se recogen durante un procedimiento además opcional en una formulación farmacéutica.

La preparación proteínica es preferiblemente una solución acuosa de la proteína y se puede obtener a partir de transformación aguas abajo después de la producción recombinante o cualquier otra fuente de producción de proteínas y puede comprender concentraciones variables de proteína con pureza variable de la proteína bioactiva deseada. Alternativamente, la preparación proteínica está en forma sólida, tal como una composición liofilizada convencional. La preparación proteínica se puede introducir simplemente independientemente de lípido en una instalación de homogeneización, por ejemplo, por conductos independientes, a un equipo de homogeneización funcionando.

Se tiene que entender que es concebible introducir diversas combinaciones de preparación de proteínas y agente lipídico que dé como resultado una mezcla fluida, a la instalación de homogeneización de acuerdo con el método inventivo. Se puede introducir la proteína a la instalación de homogeneización tanto como una solución acuosa o como preparación sólida liofilizada, mientras el agente lipídico puede estar en forma de una solución acuosa o se puede disolver en un disolvente orgánico. El agente lipídico también puede estar en la forma de una dispersión de un lípido en disolvente acuoso o puede estar al menos parcialmente en forma sólida. Es una condición previa que cualquiera de tales combinaciones de preparación proteínica y agente lipídico debe dar como resultado fluido homogeneizable y que se pueda retirar cualquier disolvente orgánico utilizado con métodos eficaces que no interfieran con los requerimientos clínicos del producto posterior.

En ciertas solicitudes se prefiere que se mezclen la preparación proteínica y el agente lipídico en una dispersión o solución homogénea antes de que se someta a las altas fuerzas de cizallamiento de una homogeneización a alta presión. Se tiene que entender que el tratamiento de mezclamiento previo según la presente invención, se puede alargar para minimizar la exposición de la proteína al tratamiento de homogeneización en casos en que la proteína es sensible (es decir, pérdida de bioactividad) durante exposición prolongada a las altas fuerzas de cizallamiento durante la homogeneización. Por la misma razón, se puede introducir opcionalmente una etapa de incubación entre el mezclamiento previo y la homogeneización. Alternativamente, el mezclamiento previo se alarga para minimizar la homogeneización alargada por razones de economía de procedimiento. Se tiene que entender que el mezclamiento previo se puede llevar a cabo en el mismo envase en que se lleva a cabo la homogeneización o en una instalación independiente antes de que se introduzca en la instalación de homogeneización.

El agente lipídico puede estar, al menos parcialmente, en una forma sólida proporcionando una dispersión con la solución acuosa de proteína. Por ejemplo, se puede mezclar lípido en forma de polvo en una dispersión homogénea antes de la homogeneización con un equipo de mezclamiento convencional, al tiempo que, por otra parte, en muchas aplicaciones se puede introducir agente lipídico formado de polvo o formado de polvo parcialmente, directamente a la instalación de homogeneización.

En la presente solicitud se define lípido como un término general para compuestos naturales o sintéticos que consisten en vehículos de grupo acilo tales como glicerol, esfingosina, colesterol y otros, a los cuales están o podían estar unidos uno o más ácidos grasos. También se pueden incluir moléculas similares que contengan una porción hidrocarbonada sustancial.

Los agentes lipídicos usados en la presente invención se pueden clasificar en diferentes clases de lípidos dependiendo de su polaridad.

Lípidos no polares sin grupos de cabeza polar. Son ejemplos de tales lípidos no polares: hidrocarburos o anfifilos que no se hinchan, tales como mono-, di- o triacilgliceroles (glicéridos), ésteres alquílicos de ácidos grasos, alcoholes grasos o ésteres de colesterol.

Los lípidos polares tienen grupos de cabeza polar y presentan actividad superficial, tales como fosfolípidos y glucolípidos. Dependiendo de sus interacciones específicas con agua se subdividen además en las categorías de anfifilos que se hinchan y solubles.

Los lípidos anfipáticos o anfifílicos son tensioactivos y se ejemplifican por fosfolípidos y glucolípidos.

Los lípidos polares con frecuencia son capaces de hincharse en presencia de agua para formar fases cristalinas lipídicas, en una estructura con desorden de corto alcance y desorden de gran alcance. Hay diversas fases cristalinas de líquidos diferentes. Muchos lípidos biológicos tales como fosfatidilcolina (FC), fosfatidilinositol (FI) y esfingomielina pueden formar estructuras de bicapa, siempre que las moléculas en cuestión sean de dimensión más o menos cilíndrica. Sin embargo también es verdad que muchos componentes lipídicos principales de sistemas biológicos no forman estructuras de bicapa cuando se aíslan y se ponen en sistemas acuosos. Esto se ha explicado por el hecho de que las moléculas de lípidos tienen una conformación de un cono o de un cono invertido y así se pueden observar estructuras micelares o micelares invertidas. También se han observado diversos sistemas lípido-agua, cúbicos, de lípidos anfifílicos y hay indicio de importantes funciones biológicas de estos sistemas lípido-agua.

Según la presente invención, el agente lipídico comprende un lípido anfifílico que es capaz de formar partículas lipídicas discretas en un medio acuoso, junto con la proteína o independientemente de la presencia de la proteína después de que se haya sometido a una homogeneización a alta presión.

Las partículas lipídicas se estabilizan generalmente por los lípidos polares y su morfología variará considerablemente debido a la naturaleza de la proteína y el agente lipídico, así como las cantidades relativas de estos constituyentes básicos. La presente invención es adecuada en la producción de partículas lipídicas con una estructura liposomal (bicapa), partículas de lípido con la estructura de una gota de aceite en emulsión de aceite en agua o complejos discoidales entre una lipoproteína y un fosfolípido así como otros sistemas de partículas lipídicas discretas estabilizadas en una solución acuosa tales como: micelas, microemulsiones, nanopartículas y fases hexagonales dispersadas.

De acuerdo con la presente invención se prefiere que el agente lipídico comprenda un agente anfifílico. Más preferiblemente, el agente anfifílico es capaz de formación de bicapa, por ejemplo, una membrana de liposomas, en un medio acuoso y se selecciona entre al menos uno de los compuestos del grupo de fosfolípidos, glucolípidos y colesteroles. Son glucolípidos adecuados: palmitoil, estearil o miristoil glicósidos, colesteril maltósido, colesteril glicósido, diversos gangliósidos y similares. Son ejemplos de colesteroles: colesterol, acetato de colesterol, dihidrocolesterol, fitosterol, sitosterol y similares.

En la presente invención, los agentes anfifílicos preferidos son fosfolípidos que pueden ser de origen natural tales como fosfolípidos de yema de huevo o de soja o de origen sintético o semisintético. Los fosfolípidos se pueden purificar o fraccionar parcialmente para comprender fracciones puras o mezclas de: fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilinositoles, ácidos fosfatídicos, fosfatidilserinas, esfingomielina o fosfatidilgliceroles. De acuerdo con realizaciones específicas de la presente invención, se prefiere seleccionar fosfolípidos con radicales de ácidos grasos definidos, tales como dipalmitoil fosfatidilcolina, dioleil fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidilcolina, diestearoil fosfatidilcolina, oleilpalmitoil fosfatidilcolina y las fosfatidilcolinas similares con grupos acilo definidos seleccionados de ácidos grasos que se encuentran en la naturaleza, generalmente con 8 a 22 átomos de carbono. De acuerdo con una realización específica de la presente invención se prefieren las fosfatidilcolinas que tienen sólo restos de ácidos grasos saturados entre 14 y 18 átomos de carbono y se prefieren especialmente las de dipalmitoil fosfatidilcolina.

Además del agente anfifílico, el agente lipídico puede comprender en diversas cantidades al menos un componente no polar que se puede seleccionar entre aceites farmacéuticos aceptables (triglicéridos) ejemplificados por los aceites vegetales empleados comúnmente tales como: aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de sésamo, aceite de borraja, aceite de ricino y aceite de semilla de algodón o aceites de otras fuentes como aceites de parafina o aceites marinos incluyendo triglicéridos hidrogenados y/o fraccionados de tales fuentes. También se pueden usar triglicéridos de cadena media (aceites MCT, por ejemplo, Miglyol®) y diversos mono-, di- o triglicéridos sintéticos o semisintéticos tales como los lípidos no polares definidos, descritos en la patente internacional WO 92/05571, en la presente invención, así como monoglicéridos acetilados o ésteres alquílicos de ácidos grasos, tales como miristato de isopropilo, oleato de etilo (véase la patente europea EP 0 353 267) o alcoholes de ácidos grasos tales como: alcohol oleílico, alcohol cetílico o diversos derivados no polares de colesterol, tales como ésteres de colesterol.

Se puede añadir uno o más agentes tensioactivos complementarios al agente lipídico en esta invención, por ejemplo como complementos a las características de agente anfifílico o para mejorar su capacidad estabilizadora de partículas lipídicas o permitir una solubilización mejorada de la proteína. Tales agentes complementarios pueden ser tensioactivos no iónicos farmacéuticamente aceptables que son preferiblemente derivados de óxido de alquileno de un compuesto orgánico que contiene uno o más grupos hidroxílicos. Por ejemplo están comúnmente disponibles compuestos de alcohol o de éster etoxilado y/o propoxilado o mezclas de los mismos y se conocen bien como tales complementos por los expertos en la materia. Son ejemplos de tales compuestos: ésteres de sorbitol y ácidos grasos, tales como monooleato de sorbitán o monopalmitato de sorbitán, ésteres de sacarosa oleosos, ésteres grasos de polioxietileno y sorbitán, ésteres grasos de polioxietileno y sorbitol, ésteres grasos de polioxietileno, éteres alquílicos de polioxietileno, éteres de polioxietileno y esterol, éteres polipropoxialquílicos de polioxietileno, polímeros de bloque y éter cetílico, así como derivados de aceite de ricino de polioxietileno o de aceite de ricino hidrogenado y ésteres grasos de poliglicerol. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, diversos grados de: Pluronic®, Poloxamer®, Span®, Tween®, Polysorbate®, Tyloxapol®, Emulphor® o Cremophor® y similares. Los agentes tensioactivos complementarios también pueden ser de una naturaleza iónica tales como agentes de las vía biliares, ácido cólico o desoxicólico sus sales y derivados o ácidos grasos libres, tales como ácido oleico, ácido linoleico y otros. Otros agentes tensioactivos iónicos se encuentran entre lípidos catiónicos como alquilaminas o alcanolamina C_{10}-C_{24} y ésteres de colesterol catiónicos.

Se pueden añadir también otros componentes farmacológicamente aceptables al agente lipídico cuando se desee, tales como antioxidantes (ejemplificados por alfa-tocoferol) y adyuvantes de solubilización (ejemplificado por alcohol bencílico).

Como se indicó anteriormente, el agente lipídico preferiblemente ya se formula y se mezcla antes de que se ponga en contacto con la solución proteínica en la etapa de mezclamiento previo o directamente en la instalación de homogeneización. Sin embargo, también es concebible dentro del alcance de la invención añadir sucesivamente uno o más constituyentes del agente lipídico y/o la proteína escalonadamente o sucesivamente durante estos dos procedimientos.

Según la presente invención las características de las partículas de proteína y lípido formadas variarán en gran medida dependiendo de la composición de agente lipídico y particularmente de la relación entre lípidos polares y no polares. En ciertas aplicaciones de la presente invención, una cantidad dominante de lípidos polares y formadores de bicapa pueden producir estructuras de liposomas unidas a proteína. Por ejemplo, sólo los lípidos polares en la forma de fosfolípidos junto con lipoproteínas seleccionadas pueden formar partículas parecidas a un disco, específicas, con el método inventivo. Si se usa por ejemplo Apolipoproteína Al, estas partículas tienen considerable estabilidad y se parecen a estructuras de partículas HDL naturales, de manera que las características de la proteína también influirán considerablemente en la naturaleza de las partículas lipídicas. Por otra parte, una cantidad dominante de lípidos no polares (es decir, glicéridos) formará partículas lipídicas que se parezcan a gotitas de emulsión que se estabilicen por los lípidos polares (es decir, fosfolípidos). También las características y la cantidad de la proteína influirá en la constitución de la partícula lipídica y es evidente que depende de la naturaleza física y química de la proteína y resultará la composición de los diferentes tipos de agentes lipídicos de partículas lipídicas del procedimiento inventivo. Está dentro de la capacidad del experto en la materia predecir la morfología de la partícula en la composición resultante a partir de dichas características de los principales ingredientes y los parámetros del procedimiento restantes. El experto en la materia será capaz por consiguiente de diseñar agentes lipídicos individuales de acuerdo con el conocimiento general de distribución de fármacos lipídicos y por medio del método inventivo se forman partículas lipídicas que comprenden una proteína diseñada. Por estas razones la expresión general "partícula lipídica" usada en la presente memoria, debería dar un amplio significado y considerar que incluye complejos proteínicos estabilizados con agente lipídico que se dispersan en una solución acuosa.

Además del requerimiento para resistir las fuerzas de cizallamiento de flujo turbulento y cavidades que resultan de la homogeneización a alta presión del procedimiento inventivo sin pérdida sustancial de actividad biológica y con estructura sustancialmente mantenida, las proteínas deben tener un grado de compatibilidad al agente lipídico para proporcionar partículas estables que comprendan agente lipídico y proteína.

De acuerdo con la presente invención se define "proteína" como cualquier proteína bioactiva, polipéptido u oligopéptido, que se encuentre en la naturaleza o producido recombinantemente o de otro modo sintéticamente, que sea capaz de una interacción hidrófoba suficiente con un agente lipídico como se definió previamente. Interacción hidrófoba suficiente querrá decir que la proteína interactúa al menos parcialmente con el agente lipídico para formar partículas lipídicas predominantemente por fuerzas hidrófobas más bien que atracción electrostática. En los productos resultantes la proteína puede, por ejemplo, estar parcialmente embebida en la partícula lipídica, penetrar en el núcleo de la partícula lipídica o constituir otras formas de complejos de lípido y proteína. Esto también excluye que la proteína esté incluida simplemente en la fase acuosa de un liposoma, como se describe en la mencionada Liposome Technology, 1.993 por CRC Press Inc., Vol. 1, Cap. 3, págs. 49-63: M M Brandl et al. y por A L Weiner en Immunomethods. 1.994, Vol. 4, págs. 201-209. Las proteínas adecuadas pertenecen preferiblemente a las categorías 2 y 3 como se define por Y-L Lo et al. en la página 805, columna 2 del artículo en Journ. Of Pharm. Sci, 1.995, Vol. 84(7), págs. 805-814. Las proteínas especialmente adecuadas son proteínas de membrana, como se define en las páginas 274-275 en Principles of Biochemistry, 7ª Ed, E L Smith et al y lipoproteínas de acuerdo con W V Rodrigueza et al. en Advanced Drug Delivery Reviews, 1.998, Vol. 32, págs. 31-43 que interactúan espontáneamente a menudo con partículas lipídicas de tipo liposomas para formar nuevas partículas lípido-proteína integradas.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención la proteína contribuye a proporcionar las partículas lipídicas con propiedades fisicoquímicas o biológicas deseadas, tales como estabilidad mejorada en un sistema dispersado, funciones de objetivo y funciones que afectan a su distribución biológica y eliminación. En este aspecto, el agente lipídico puede comprender un agente terapéuticamente activo disuelto o dispersado en dicho agente lipídico que puede emplear el sistema dispersado resultante como un sistema de distribución de fármacos mejorado. En tal caso se puede llevar a cabo una reducción del tamaño de partícula lipídica. Al mismo tiempo la asociación de la proteína a la superficie de la partícula lipídica se facilita con interacciones hidrófobas como se describió anteriormente. Esto ejemplificado por formación de una emulsión de lípidos convencional para uso parenteral con proteína asociada a la superficie que puede tener ciertas partes embebidas en la monocapa de fosfolípido superficial o el núcleo oleoso de la partícula. Se entiende que tal emulsión puede comprender un agente terapéutico específico asociado con las partículas de emulsión de maneras bien conocidas para los expertos en esta materia.

Para ser capaces de interacción hidrófoba, se prefiere que la proteína sea al menos parcialmente lipófila, es decir tenga un dominio lipófilo y/o sea capaz de interactuar con lípidos formadores de bicapa. Un ejemplo de tales proteínas adecuadas son las que ejercen su capacidad bioactiva con respecto a una superficie de una membrana biológica, es decir proteínas de membrana. Tales proteínas están implicadas en funciones enzimáticas, de transporte, receptoras y otras asociadas con membranas celulares. Muchas de tales proteínas por lo tanto tienen dominios que se pueden asociar con membranas de fosfolípidos, como se ejemplifica por las denominadas proteínas integrales que están directamente integradas en la bicapa de una membrana lipídica. Se tiene que entender que análogos y fragmentos funcionales de tales proteínas que se encuentran en la naturaleza, se pueden emplear con la presente invención si satisfacen los requerimientos de suficiente interacción hidrófoba con el agente lipídico.

Más preferiblemente, la proteína tiene propiedades al menos parcialmente anfifílicas en una hélice y una alta capacidad de interacción con lípidos formadores de bicapa, como se ejemplifica por las lipoproteínas asociadas con transporte de lípidos en el sistema circulatorio. Se puede esperar que tales proteínas tengan un alto número de restos hidrófobos expuestos tendrán una tasa de asociación favorable en la formación de partículas lipídicas con el agente lipídico. Ejemplos de proteínas especialmente preferidas son proteínas de membrana o lipoproteínas tales que tienen una parte de alfa-hélice hidrófoba.

Son ejemplos de proteínas preferidas de acuerdo con aspectos específicos de la presente invención, las apolipoproteínas A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D y E o análogos funcionales y derivados de los mismos, tales como los péptidos pequeños descritos en la patente de EE.UU. 4.643.988, mencionada y similares. De estas apolipoproteínas, la apolipoproteína A-I (ApoA-I) y sus variantes naturales tales como apolipoproteína A-IM (Milano) (Apo A-IM) se pueden preparar por tecnología de separación convencional a partir de suero o con tecnología recombinante, descrito por ejemplo en la patente internacional WO 9312143, la patente internacional WO 9413819 o en la patente internacional WO 9807751.

De acuerdo con la realización preferida de la presente invención, las apolipoproteínas que tienen una hélice anfifílica, como se definió anteriormente, se usarán como la proteína y el agente lipídico será sustancialmente sólo fosfolípidos. El procedimiento dará entonces como resultado partículas lipídicas en forma de disco o discoidales que se parezcan a partículas HDL naturales, esencialmente similares a las mencionadas en los artículos anteriores.

Es el objetivo particular del método inventivo facilitar la interacción hidrófoba entre el agente lipídico y la proteína mientras que al mismo tiempo se dispersa agente lipídico en partículas. Para llevar a cabo esto, es un elemento importante y característico de la presente invención que la solución proteínica y el agente lipídico bien mezclados previamente o independientes, se introduzcan en una homogeneización a alta presión y se sometan a homogeneización a alta presión en condiciones suficientes para formar partículas lipídicas discretas que comprendan proteína en un alto rendimiento, así que sustancialmente no queden o queden sólo pequeñas cantidades de agente lipídico libre y proteína libre. La homogeneización a alta presión sirve para proporcionar los componentes con una cantidad adecuada de energía mecánica para aumentar su compatibilidad y capacidad para interactuar. Más específicamente, el enriquecimiento de energía durante la homogeneización facilitará la interacción de las partes hidrófobas del agente lipídico y la proteína que de otro modo se podían proteger en un entorno acuoso.

Como se mencionó previamente, una instalación de homogeneización según la presente invención comprende un homogeneizador, pero también puede incluir medios para llevar a cabo una etapa de mezclamiento previo de la solución proteínica y el agente lipídico. En el tratamiento de mezclamiento previo, todos los componentes se añaden manualmente o automáticamente y se co-mezclan usando un mezclador adecuado como Ystral GmbH y tipos similares de mezcladores convencionales.

Para el tratamiento de homogeneización, se puede emplear un único homogeneizador y la homogeneización se puede llevar a cabo por una operación en una etapa, por una operación de pasos múltiples o por una operación continua. También, se pueden emplear múltiples homogeneizadores en una configuración en serie, llevando a cabo cada uno un paso de homogeneización. Se pueden usar muchos homogeneizadores comercialmente disponibles capaces de que se hagan funcionar a una presión alta, de acuerdo con la presente invención, por ejemplo homogeneizador de alta presión de Rannie, Avestin, homogeneizadores Gaulin, Microfluidizadores y similares.

Los recipientes adecuados para la homogeneización son preferiblemente recipientes comercialmente disponibles, convencionales, para fabricación farmacéutica, preferiblemente recipientes con camisa de acero inoxidable. La regulación de la temperatura se puede conseguir por reguladores de temperatura comercialmente disponibles, como regulador de temperatura de reactor Julabo ATS 2. Para proporcionar una atmósfera inerte durante el procedimiento de fabricación, se usa preferiblemente gas N_{2} filtrado

Para llevar a cabo el método de preparación de las partículas lipídicas que comprenden proteína y llevar a cabo con éxito la presente invención, es importante que se hagan funcionar los homogeneizadores a una presión alta que exceda la de 2x10^{7} Pa (200 bar), pero esté por debajo de 2x10^{8} Pa (2.000 bar). Preferiblemente, se hace funcionar el homogeneizador a 6x10^{7} a 1,2x10^{8} Pa (600 a 1.200 bar).

En el caso de una operación continua, el tiempo de homogeneización se determina principalmente por el rendimiento de partícula lipídica y proteína, la homogeneidad, el tamaño de partícula y el potencial zeta, en asociación con la temperatura y presión de homogeneización. En el caso de operación en pasos múltiples, en la que la proteína y el agente lipídico se someten a diversos ciclos de homogeneización, es decir, diversos pasos, es más bien el número de pasos de homogeneización lo que se optimiza en vez del tiempo de homogeneización. Generalmente, el experto en la materia se da cuenta de que una homogeneización según la presente invención requiere una adaptación de presión, tiempo y temperatura de fabricación para cada sistema individual de proteína de lípidos para conseguir los resultados deseados en términos de rendimiento y eficacia de procedimiento, así como actividad proteínica mantenida.

De acuerdo con los procedimientos inventivos, el volumen de los lotes puede variar desde producción a pequeña escala en el intervalo de 1 ml a 5 l, al tiempo que se consigue fácilmente hasta aproximadamente 20000 l para producción a gran escala normal.

Para acceder a tal potencialmente perjudicial influencia a partir de la única homogeneización a alta presión, está dentro del alcance de la presente invención introducir ciclos de homogeneización plurales a presión un tanto menor, más suave, y permitir uno o diversos periodos de descanso intermedios en medio. El experto en la materia no tendrá dificultades para diseñar operaciones de funcionamiento individuales para proteínas específicamente sensibles y de ese modo ser capaz de aplicar el procedimiento inventivo para un gran número de composiciones para formar partículas lipídicas que comprendan proteína.

Un aspecto importante, adicional, de la presente invención es la posibilidad de obtener condiciones asépticas mejoradas con el método inventivo, puesto que muchos microorganismos no resistirán homogeneización a alta presión. De acuerdo con una realización de la presente invención, se puede llevar a cabo por lo tanto la homogeneización en al menos dos secuencias con un periodo de incubación intermedio. El uso de ciclos repetidos de homogeneización a alta presión con periodos de reposo o de incubación intermedios, sucesivamente, puede reducir la cantidad de microorganismos viables en la formulación final de partículas lipídicas, sin introducir cualquier otra forma de medidas de esterilización tales como calor o irradiación, que se arriesga a destruir la proteína o añadir tales agentes conservantes complementarios, que puedan conducir a problemas con la tolerabilidad del producto.

Otro aspecto de la presente invención es permitir una etapa de incubación durante un cierto periodo de tiempo adecuado, posterior al procedimiento de homogeneización pero antes de la recogida de las partículas lipídicas resultantes para elaboración además opcional en un producto farmacéutico. Siendo la razón que hay una tendencia de que el rendimiento pueda aumentar durante tal periodo.

Como se mencionó, se deben optimizar la formulación y los parámetros del procedimiento con respecto a cada composición elegida de proteína y agente lipídico. Es de gran importancia considerar el comportamiento de la fase, especialmente a diferentes temperaturas, de tanto la proteína como los componentes del agente lipídico. Por otra parte, se debe considerar cuidadosamente la capacidad de la proteína para resistir sin que se debilite la estructura y/o la actividad de las altas fuerzas de cizallamiento que resultan de la homogeneización a alta presión. El desarrollo local de calor durante el tratamiento también se debe considerar, puesto que normalmente las temperaturas en el procedimiento de homogeneización no se encuentran en el intervalo de 10 a 95ºC.

Por otra parte, los parámetros de procedimiento del tratamiento de homogeneización, principalmente presión, temperatura, tiempo de funcionamiento, número de ciclos de homogeneización e incubación y similares, también afectará al tamaño de partícula lipídica, su distribución de tamaños y el rendimiento de agente lipídico y proteína complejados. Por ejemplo, generalmente se podía esperar que el rendimiento aumentará con más ciclos de homogeneización, pero el experto en la materia debería ser capaz de comprometerse entre esta ventaja y otros aspectos que resultan del tratamiento de homogeneización.

De acuerdo con la realización particular de la presente invención en que el agente lipídico consiste esencialmente en un fosfolípido, se prefiere hacerlo funcionar a una temperatura próxima a, o por encima de, la temperatura de transición de fase (Tc), a la cual se transfiere el fosfolípido de la forma de gel a forma cristalina líquida. Las características de la proteína también influirán en la eficacia de la formación de partículas lipídicas, puesto que un número mayor de restos expuestos hidrófobos de la proteína conducirán a una tasa de asociación mayor con el fosfolípido, al tiempo que menor peso molecular de la proteína también aumentará la tasa de formación de partículas estables. Por lo tanto, para el caso en que la proteína sea una apolipoproteína, es predecible que la tasa de asociación esté más rápido cerca de la temperatura de transición del fosfolípido. En el caso en que se seleccionen los fosfolípidos entre fosfolípidos de ácidos grasos saturados sólo, se prefiere que la temperatura durante la homogeneización esté por encima de 42ºC para dipalmitoil fosfatidilcolina y por encima de 24-25ºC para dimiristoil fosfatidilcolina.

De acuerdo con una primera realización específica de la presente invención el agente lipídico comprende esencialmente fosfolípidos y la proteína tiene propiedades anfifílicas tales como lipoproteínas. Un aspecto importante de esta realización es permitir una protección de la proteína anfifílica por el agente lipídico y proporcionarlo con características funcionales mejoradas incluyendo estabilidad durante la preparación, purificación, manipulación y almacenamiento y la introducción de propiedades biológicas específicas tales como modulación de absorción y distribución en el cuerpo, actividad, tasa de degradación y similares. En ciertas aplicaciones, con frecuencia es suficiente emplear cantidades más bien relativamente pequeñas de agente lipídico que sirva para interactuar de manera protectora con dominios hidrófobos locales de la proteína. Por otra parte, ciertas proteínas requieren una interacción con complejos lipídicos de tipo membrana que se tienen que estabilizar y/o adquieren una bioactividad deseada (obtener una orientación apropiada en estructuras de bicapa lipídica) que quiere decir que se debe añadir una cantidad relativamente mayor de agente lipídico de acuerdo con los métodos inventivos. Preferiblemente los fosfolípidos de esta realización de la invención comprenden esencialmente fosfatidilcolinas separadas de fosfolípidos de origen natural, tales como fosfolípidos de soja o de yema de huevo o es fosfatidilcolina sintética o semisintética con contenido controlado de grupos acilo. Los más preferidos son: fosfatidilcolina procedente de soja, dipalmitoil fosfatidilcolina y dimiristoil fosfatidilcolina. La proteína es preferiblemente una lipoproteína humana, tal como una apolipoproteína y las partículas lipídicas resultantes del método inventivo encontrarán uso en tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades relacionadas con lípidos o sustancias lipoidales incluyendo la disminución de cantidades de colesterol y endotoxinas. Las apolipoproteínas más preferidas son las apolipoproteínas A o E incluyendo sus variantes naturales o sintéticas tales como apolipoproteína A-I_{Milano} mutante producida recombinantemente. Los fosfolípidos se añaden preferiblemente a una solución proteínica acuosa en una etapa de mezclamiento previo en relación de peso de lípido a proteína de 1:100 a 10:1 (p/p). Como una referencia al límite inferior de relación de lípido a proteína se refiere a albúmina en su función transportadora de ácido graso natural donde la relación lípido a proteína es 1:100 (p/p). Preferiblemente, la cantidad de agente lipídico a proteína de acuerdo con esta realización de la presente invención es de 1:4 a 4:1 y más preferiblemente entre 1:1 y 3:1. Generalmente, se dirige a obtener un rendimiento de complejo lípido-proteína por encima de 90% y preferiblemente próximo a 100%, de manera que se obtenga poco o casi nada de proteína o agente lipídico, no asociados, en la composición de partícula lipídica resultante. También es altamente deseable tener cantidades de fosfolípidos tan bajas como sea posible en cualquier preparación inyectable puesto que cantidades excesivas pueden producir vesículas de bicapa (por ejemplo, liposomas) que posiblemente podían inducir efectos secundarios en la materia que recibe tal preparación. La homogeneización a alta presión se lleva a cabo durante un tiempo y temperatura, adecuados, a una presión adecuada en el intervalo de 2x10^{7} Pa a 1,5x10^{8} Pa (200 bar a 1.500 bar), preferiblemente de 6x10^{7} Pa a 1,2x10^{8} Pa (600 a 1.200 bar) y. La homogeneización se puede llevar a cabo en uno o en diversos periodos con un periodo de reposo intermedio de una duración adecuada con una etapa de incubación posterior opcional. Este método da como resultado un alto rendimiento de 90 a 100% de partículas lipídicas discoidales constituidas por fosfolípidos y proteína con un tamaño de partícula que oscila de 7 a 25 nm. La proteína incorporada en las partículas lipídicas formadas por el método inventivo ha mantenido su identidad química en términos de oxidación y desamidación. Las partículas lipídicas por lo tanto serán capaces de ejercer la misma actividad biológica como proteína no sometida a homogeneización, cuando se incorpora en una preparación farmacéutica final.

De acuerdo con una segunda realización específica de la invención, se pone en contacto la solución de una proteína anfifílica con una dispersión lipídica acuosa, preferiblemente una emulsión de aceite en agua (emulsión de lípidos) en un método que incluye homogeneización a alta presión. La dispersión de lípidos es preferiblemente una emulsión convencional para uso parenteral que tenga aceptación clínica tal como Intralipid, Liposyn u otras emulsiones basadas en un aceite de triglérido de origen vegetal (aceites de soja, de cártamo) y un emulsificador clínicamente aceptable, tales como fosfolípidos de yema de huevo o de soja. El experto en la materia será capaz de variar el contenido y la composición de la emulsión, por ejemplo de acuerdo con la discusión de lípidos no polares, adecuados, anterior. Se prefiere que la emulsión comprenda 1 a 50% (p/p) de una fase oleosa y 0,05 a 30% (p/p) de un emulsificador de fosfolípidos y que la fase oleosa comprenda aceites triglicéricos (triglicéridos preferiblemente de ácido graso saturado o insaturado de cadena larga y/o ácidos grasos de cadena media) o ésteres alquílicos de ácidos grasos adecuados para administración parenteral. El experto en la materia en tecnología de emulsiones encontrará fácilmente emulsiones lipídicas adecuadas que sean aplicables en el método inventivo. La relación entre agente lipídico (lípido no polar y emulsionante) y proteína puede variar típicamente entre 500:1 y 10:1 (p/p) y preferiblemente entre 60:1 y 20:1. Sin embargo, el experto en la materia será capaz de desviarse de estas recomendaciones en ciertas aplicaciones requeridas por las características del agente lipídico y la proteína y la utilidad clínica específica del producto. Por ejemplo, puede ser deseable conservar un alto valor nutricional de la composición de partículas lipídicas o comprender una cantidad alta de un lípido para ser capaz de incorporar un agente terapéutico adicional soluble en lípidos, en las partículas lipídicas. Alternativamente, los lípidos tienen un valor terapéutico y diagnóstico de por sí, por ejemplo como vehículos de ácidos grasos beneficiosos o valor diagnóstico o como agentes de contraste con, por ejemplo, ácidos grasos yodados para la distribución a un órgano objetivo. En tales aplicaciones, el método inventivo es útil para unir proteínas a los lípidos y modificar de ese modo la distribución y la eliminación de las partículas lipídicas resultantes. El método inventivo se puede usar de acuerdo con este aspecto para obtener un recubrimiento de proteínas de las partículas lipídicas que contengan una cantidad relativamente baja de proteína comparado con lípido. Tal recubrimiento de la partícula lipídica puede dar como resultado una interacción modificada con el reconocimiento natural del sistema inmunitario, como se lleva a cabo por anticuerpos de unión a los lípidos con el método inventivo. En tal caso, la relación lípido a proteína puede ser extremadamente alta, puesto que es concebible que sean suficientes tan poco como menos de mil moléculas de proteína para asociar a la región exterior de la partícula lipídica y obtener aún resultados significativos. Por otra parte, también se pueden emplear las proteínas para cambiar las características fisicoquímicas de las partículas lipídicas dispersadas por el uso del método inventivo. Para este caso se puede requerir una carga proteínica mayor dando como resultado una relación lípido a proteína más pequeña. La homogeneización a alta presión de emulsión lipídica y proteína se lleva a cabo durante un tiempo adecuado y a una temperatura adecuada a una presión alta que preferiblemente no exceda la de 2x10^{8} Pa (2.000 bar), estando más preferiblemente en el intervalo de 2x10^{7} Pa (200 bar) a aproximadamente 1,5x10^{8} Pa (1.500 bar) y lo más preferiblemente de 6x10^{7} a 1,2x10^{8} Pa (600 a 1.200 bar). La proteína es preferiblemente una apolipoproteína que encontrará uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades relacionadas con lípidos o sustancias lipoidales, incluyendo disminución de cantidades de colesterol y endotoxinas. Las apolipoproteínas más preferidas consisten en apolipoproteínas A o E incluyendo sus variantes naturales o sintéticas tales como apolipoproteína A-I_{Milano} mutante producida recombinantemente. Las partículas lipídicas que resultan de la homogeneización con una emulsión tienen preferiblemente un tamaño medio de partícula menor que aproximadamente 1 \mum y preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 0,5 \mum. Las partículas lipídicas con proteína asociada tendrán con diferentes grados un potencial zeta modificado en comparación con las partículas lipídicas de la emulsión original que puede proporcionar la preparación resultante con una estabilidad física mejorada que también es un indicio de que la proteína anfifílica (al menos parcialmente) está asociada con la capa superficial de las partículas lipídicas. Generalmente, se debería evitar un potencial zeta no favorable debido a riesgos de agregación de partículas lipídicas que podía infligir embolia después de administración intravenosa. Con frecuencia es, por lo tanto, necesario inducir una contribución a la carga neta de las partículas lipídicas resultantes. Esto se puede llevar a cabo por mediciones convencionales, tales como un cambio de pH, introducción de un agente cargado estabilizador suplementario y similares.

Después de que termina la etapa de homogeneización de los métodos inventivos referidos anteriormente, termina, se recogen las partículas lipídicas de cada lote con mediciones y equipo convencionales que pueden incluir centrifugación o filtración para mejorar la concentración y la purificación del producto de partículas lipídicas así como elaboración convencional para obtener un producto aséptico.

El producto así formado se puede someter entonces a liofilización convencional opcionalmente con la adición de excipientes adecuados, de manera que se forme un producto sólido farmacéutico final, adecuado para almacenamiento a largo plazo y posterior reconstitución con un fluido acuoso, justo antes de su administración parenteral, por ejemplo por inyección intravenosa. La reconstitución se puede llevar a cabo por adición de solución amortiguadora que contenga excipientes adecuados con respecto a tonicidad así como velocidad de disolución. Los amortiguadores adecuados incluyen fosfato de sodio, histidina y similares. Los excipientes incluyen: polioles, como manitol, glicerol, sacarosa y aminoácidos.

De acuerdo con una realización de la presente invención la liofilización se puede llevar a cabo de modo discontinuo, in-situ, en cámaras diseñadas de cartuchos de cámaras múltiples, convencionales o alternativamente directamente en una cámara situada en el cilindro de un dispositivo de inyección de cámaras múltiples. Estos dispositivos formarán equipos de herramientas que comprendan la dosificación o dosificaciones plurales de composición sólida en una cámara separada de una cámara vecina, almacenando un fluido de reconstitución administrable por vía parenteral, acuoso, por medio de una pared movible que se pueda desplazar para formar un fluido inyectable justo antes de la administración deseada. El experto en la materia puede encontrar fácilmente diversos ejemplos de tales jeringas o cartuchos que se pueden hacer funcionar por dispositivos de jeringa de tipo bolígrafo (véase por ejemplo, la patente europea EP 298 067).

Descripción ejemplificante de la invención

La Fig. 1 demuestra mapas peptídicos de la apolipoproteína A-I_{Milano} mutante antes de homogeneización junto con fosfolípidos.

La Fig. 2 demuestra un mapa peptídico de la apolipoproteína A-I_{Milano} mutante después de homogeneización a alta presión con fosfolípidos.

La Fig. 3 demuestra una cromatografía de fase inversa (HyTach) de la apolipoproteína A-I_{Milano} mutante reducida, antes de homogeneización junto con fosfolípidos.

La Fig. 4 demuestra una cromatografía de fase inversa (HyTach) de la apolipoproteína A-I_{Milano} mutante, reducida, después de homogeneización a alta presión con DPPC.

La Fig. 5 muestra un diagrama IEF que compara apolipoproteína A-I_{Milano} tratada con lípido y homogeneizada de acuerdo con la presente invención en comparación con la misma proteína, no tratada.

La Fig. 6 muestra potencial zeta de una emulsión de soja al 20% que comprende apolipoproteína A-I_{Milano} cuando se compara con referencias.

La Fig. 7 muestra tamaños de partícula zeta de una mezcla incubada que comprende una emulsión de soja al 20% y apolipoproteína A-I_{Milano}, cuando se compara con referencias.

Ejemplo 1

Se mezclaron 0,687 g SPC (fosfatidilcolina de soja, por sus siglas en inglés) en una etapa de mezclamiento previo, en un recipiente con camisa con 45,80 g de una solución de proteínas que comprendía apolipoproteína A-I_{Milano}, (Apo A-IM) obtenida del procedimiento aguas abajo de la producción recombinante con una concentración proteínica de 12 mg/ml, en amortiguador de fosfato de sodio. La relación lípido a proteína fue así 1,25:1. Se reguló la temperatura a 60ºC por un regulador de temperatura de reactor Julabo ATS 2. Se usó un mezclador Ystral en una configuración de rotor y estator como mezclador con velocidad de agitación controlada a 209 rad/s (2.000 rpm). Después de 10 minutos de mezclamiento previo, se homogeneizó la mezcla en un homogeneizador mini Rannie, tipo 7,30 VH, Mini-Lab, a una presión de 1x10^{8} Pa (1.000 bar), 60ºC, continuamente durante 5 minutos. Este método dio como resultado la formación de solución transparente de partículas lípido-proteína con una estructura que se parecía a complejo de tipo HDL natural de forma de disco. El rendimiento de proteína incorporada en complejos lipídicos cuando se detectó por PAGE natural fue 98% (de acuerdo con el método descrito a continuación). En un experimento replicado el rendimiento fue 100%, demostrando la reproducibilidad del procedimiento.

Ejemplo 2

Se añadieron 0,47 g de apolipoproteína A-I_{Milano}, recombinante (Apo A-IM), (9,6 mg de proteína/ml en un amortiguador de fosfato) y fosfatidilcolina de soja (SPC) a relación lípido/proteína 1:1 (p/p), se mezcló previamente a 60ºC, durante 10 minutos y después se homogeneizó durante 5 minutos, a 60ºC y 1x10^{8} Pa (1.000 bar) en el homogeneizador mini-Rannie del Ejemplo 1. Se incorporaron todas las proteínas en partículas de lípido-proteína de 8 nm cuando se midió por n-PAGE (de acuerdo con el método descrito a continuación). De acuerdo con esto, se demuestra que se obtiene una incorporación alta de apolipoproteína A-I_{Milano} en partículas de lípido-proteína en el procedimiento de homogeneización aunque se usó una relación baja de lípido a proteína.

Se llevó a cabo un experimento similar con los mismos componentes y durante las mismas condiciones que anteriormente, salvo que la homogeneización se llevó a cabo a 5,6x10^{7} Pa (560 bars), durante 7 minutos, a 60ºC. De acuerdo con análisis cromatográficos y electroforéticos realizados con posterioridad la proteína no había cambiado esencialmente en el procedimiento. Esto se ejemplifica en la Fig. 1 y la Fig. 2, que revelan datos de cartografía peptídica (de acuerdo con el método descrito a continuación) de la apolipoproteína A-I_{Milano} y la misma proteína después de homogeneización con lípido para formar complejos proteína-lípido.

Ejemplo 3

Se homogeneizaron 69,00 g de una solución de Apo A-IM producida recombinantemente (solución de 19,8 mg/ml en agua) junto con 4,485 g de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC, por sus siglas en inglés) a 42ºC y 1x10^{8} Pa (1.000 bar) durante 60 minutos, con un homogeneizador Mini Rannie. Antes de la homogeneización, se mezcló previamente la mezcla durante 5 minutos a 42ºC, a 209 rad/s (2.000 rpm) en una atmósfera de nitrógeno. La relación DPPC: Apo A-IM fue 3,3:1 (p/p). Se hizo análisis para desnaturalización de proteínas (desamidación, oxidación o agregación) por cartografía peptídica, isoelectroenfoque, cromatografía de exclusión por tamaños y cromatografía de fase inversa (HyTach). Los datos para la proteína Apo A-IM en el material elaborado eran conformes al material proteínico que no se sometió a homogeneización, como se demuestra por datos HyTach en la Fig. 3 y la Fig. 4 (medido con un método descrito a continuación). La cantidad de proteína incorporada en partículas de lipoproteínas (en el intervalo de tamaño 7,7-15,7 nm) fue 100% de acuerdo con exploraciones densimétricas de geles marcados de n-PAGE (véase a continuación). El radio hidrodinámico correspondiente de la proteína de referencia se estimó en 7,3 nm. Para confirmar que las partículas contenían fosfolípido también, los geles de n-PAGE también se marcaron por lípidos. Este ejemplo demuestra la formación eficaz de complejos de lípido-proteína a una composición y condición de procedimiento, diferentes y el hecho de que la proteína no se vé afectada esencialmente por el tratamiento mecánico junto con lípido.

Ejemplo 4

Se homogeneizaron 75 g de una solución de Apo A-IM producido recombinantemente, 15 mg/ml con dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) añadido en una relación de 2,9:1 (p/p) en fosfato de sodio 10 mM (pH=7,5) después de una etapa de mezclamiento previo, de 5 minutos, bajo las mismas condiciones que en el Ejemplo 3. La homogeneización se llevó a cabo con un primer periodo de homogeneización de 7,5 minutos, a 60ºC y 1x10^{8} Pa (1.000 bar) seguido por un segundo periodo de homogeneización de 5 minutos, a 40ºC y 1x10^{8} Pa (1.000 bar). Después del primer periodo de homogeneización la cantidad de proteína incorporada en partículas lípido-proteína de 7,7 a 25 nm fue 78%, que aumentó a 94% después del segundo periodo de homogeneización.

No hubo agregación, truncamiento, desamidación u oxidación observada por métodos cromatográficos o electroforéticos en las proteínas sometidas al procedimiento de homogeneización en dos etapas.

Ejemplo 5

Se añadieron 263 g de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) a 6,7 kg de una solución de Apo A-IM producida recombinantemente, 13 mg/ml, en fosfato de sodio 10 mM (pH 7,5). El material se mezcló previamente durante 10 minutos, a 50ºC, con un equipo de mezcla Ystral X 20 D. Después de eso se homogeneizó el material a 42ºC y 9x10^{7} Pa (900 bar) en una homogeneización a alta presión del tipo Lab. Rannie 12,51-H. La homogeneización se llevó a cabo durante 35 pases en que cada pase tenía una duración de 3 minutos. Después de la homogeneización, se añadieron 243 g de sacarosa y 31 g de manitol y se disolvieron, después de lo cual se filtró la solución estéril, se cargó asépticamente y se liofilizó. Los análisis electroforéticos y cromatográficos posteriores del producto después de su reconstitución mostraron que la proteína era conforme al material proteínico no sometido a homogeneización. Esto se demuestra con los datos IEF (Fig. 5) de una muestra de la preparación proteínica final, homogeneizada, de acuerdo con este ejemplo en comparación con una proteína no tratada (de acuerdo con un método descrito a continuación). La eficacia del procedimiento se muestra por ensayos n-PAGE en que se incorporó 99% de la proteína en partículas de lipoproteína en el intervalo de tamaño de 7,7 a 25 nm. Este ejemplo demuestra que se pueden producir complejos de proteína-lípido de alta calidad en un procedimiento eficaz con una relación lípido/proteína comparativamente baja en un procedimiento de crecimiento de escala.

Ejemplo 6

Se añadieron 0,72 g de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) a 48,10 g de solución de Apo A-IM producido recombinantemente, en un mezclador Ystral, dando una relación de lípido: proteína de 1:1. Se llevó a cabo mezclamiento previo durante 3 minutos, a 60ºC y 209 rad/s (2.000 rpm) bajo atmósfera de nitrógeno antes de una homogeneización durante 7 minutos a la misma temperatura, a 5,6x10^{7} Pa (560 bar) en un homogeneizador Rannie. Las partículas lípido-proteína así preparadas se enfriaron a menos de 30ºC. El radio hidrodinámico equivalente de los complejos discoidales se determinó a 15,1 nm (z medio), por equipo de dispersión luminosa dinámica Malvern 4.700.

El análisis del complejo proteína-lípido de acuerdo con la invención por cromatografía de fase inversa de la proteína reducida (análisis HyTach) verificó la integridad mantenida de la proteína en el procedimiento descrito. Así el nivel de proteína oxidada estuvo por debajo del nivel de cuantificación para el método (0-3%), mientras que el nivel total de proteína modificada fue 12%, comparado con 8% en una muestra de referencia de la proteína.

Ejemplo 7

Este ejemplo comprende la preparación de una formulación de emulsión de aceite de soja en agua, con la proteína r-ApoA-1M usando un dispositivo de alto cizallamiento. La formulación se comparó con una emulsión de referencia preparada sin proteína añadida y también con una emulsión incubada con la misma proteína.

Preparación

Se preparó una emulsión de ensayo (aceite de soja al 20% y fosfolípidos de huevo al 1,2%) que contenía r-ApoA-IM y una correspondiente emulsión de referencia sin proteína, en dos etapas. Primero se preparó una emulsión gruesa, concentrada, por dispersión de 60 g de aceite de soja y 3,6 g de fosfolípidos de huevo purificados en 113 g de agua destilada, seguido por homogeneización gruesa en un homogeneizador Rannie (tipo 7,30 VH) a 60ºC, con una pequeña adición de una solución de NaOH 1 N. La emulsión gruesa se dividió en dos partes, una de las cuales se mantuvo a 60ºC. A la otra parte (92,7 g) se añadieron 62,1 g de agua destilada y se homogeneizó la emulsión a 8x10^{7} Pa (800 bar) de presión en el mismo homogeneizador Rannie, durante 6 minutos, a 60º. La emulsión de referencia resultante (A), se enfrió a temperatura ambiente y se distribuyó en viales de 20 ml.

La primera parte de la emulsión gruesa anterior, se volvió a introducir en el homogeneizador y se añadieron 62,2 g de una solución de r-ApoA-IM en agua destilada (22,5 mg por ml). La emulsión se homogeneizó a 8x10^{7} Pa (800 bar) de presión en el homogeneizador Rannie, durante 6 minutos, a 60º. La emulsión de ensayo resultante (B), se enfrió a temperatura ambiente y se distribuyó en viales de 20 ml.

En un experimento de incubación similar, se preparó una muestra de incubación (preparación C) de Intralipid 20% y r-ApoA- IM por mezclamiento suave de 8 g de Intralipid 20% con 2 g de la solución de r-ApoA-1M anterior (que contenía 22,5 mg de r-ApoA-1M por ml), a temperatura ambiente. Se preparó una preparación de referencia (D) de una manera similar, usando agua destilada en vez de la solución de proteínas.

Evaluación

Las preparaciones A, B y C se evaluaron inmediatamente con respecto al tamaño de partícula y carga de partícula, medios, usando un MALVERN Zeta Sizer 4, con las muestras diluidas en un amortiguador de TAPS 2 mM, pH 8,4. La preparación B también se evaluó después de 60 horas de almacenamiento de las preparaciones a 55ºC (B, incubada). Las preparaciones C y D se almacenaron a 25ºC durante 20 horas y a 55ºC durante 60 horas adicionales. Se evaluó la estabilidad a la agitación en viales separados de preparación A y B, por agitación durante 66 horas a temperatura ambiente.

Resultados

Los resultados se demuestran en la Fig. 6 (tamaños de partícula) y la Fig. 7 (carga superficial de partícula) para las emulsiones en las Preparaciones A, B, antes y después de incubación (B).

Para la preparación C y D, no hubo cambio de tamaño de partícula durante el periodo de incubación. Durante el periodo de incubación la carga de partícula en la preparación C aumentó por 8 mV en comparación con 4 mV para la referencia (D). Hay así un indicio claro de absorción de r-ApoA-1M a las partículas de la emulsión durante la incubación. Sin embargo, el procedimiento de absorción fue muy lento y requirió temperaturas elevadas.

La preparación B, mostró una reducción destacable en tamaño de partícula (180,9 nm) comparable con A, la preparación de referencia (247,5 nm) y el tamaño no cambió durante la etapa de incubación posterior. Similarmente, hubo una gran diferencia en la carga de la partícula de la emulsión en la homogeneización (48,5 mV para la preparación de ensayo B comparable con 38,1 mV para la preparación A) y la carga continuó aumentando a 61,7 mV durante la etapa de incubación posterior.

Estos datos indican que ApoA-IM producida recombinantemente se adsorbe a, e interactúa con las partículas de la emulsión, en gran medida, durante la homogeneización. Esto influye no sólo en la carga de las gotitas de emulsión sino que la proteína también actúa como un emulsionante, que permite que las gotitas de emulsión asuman una curvatura mayor superficial, que conduce a un tamaño de partícula medio más pequeño. Durante la incubación posterior a 55ºC, el aumento continuado en la carga de la partícula indica una adsorción continuada de proteína a la superficie de las partículas de la emulsión. En el experimento en que se incubó la proteína con una emulsión similar, la interacción fue bastante diferente, en el sentido que el tamaño de partícula no cambió esencialmente durante el periodo de incubación prolongado y la carga de la partícula cambió en mucha menor medida durante la incubación.

Un indicio adicional de una alta adsorción de proteína a las gotitas de emulsión en la preparación B se da por el ensayo de agitación de la preparación A y B. Después del periodo de agitación (66 horas), la preparación A mostró una gotita de aceite grande sobre la superficie de la emulsión y también grandes cantidades de aceite sobre la superficie de vidrio, mientras que la preparación B no tenía esencialmente aceite visible. Esta diferencia se explica por la estabilización de la emulsión que contiene proteína debido a la mayor carga (como se indicó anteriormente) sobre las gotitas de emulsión.

Estos experimentos demuestran, que se puede llevar a cabo asociación eficaz de una proteína parcialmente hidrófoba a partículas de emulsión, cuando se facilita la interacción entre los componentes por el uso de un dispositivo de alto cizallamiento y también seguido por un periodo de incubación.

Procedimientos de evaluación analítica

Se estimaron la distribución de tamaño y la cantidad relativa de la lipoproteína A-IM recombinante formulada/fosfolípido, por evaluación densitométrica después de separación por electroforesis de gradiente en gel de poliacrilamida no desnaturalizada (n-PAGE) sobre geles Novex con un gradiente lineal de 4-20% de acrilamida. La separación se basó en tamaño y la distribución de tamaño se estimó por comparación de las muestras con proteínas globulares con diámetros de Stoke conocidos, hechos sobre cada gel. Después de electroforesis los restos proteínicos se visualizaron por marcado con Azul Brillante de Coomassie. Los geles marcados se exploraron en un densitómetro después de lo cual las imágenes del gel se procesaron y se evaluaron por el software ImageMaster. Se calcularon los tamaños aparentes y las cantidades relativas de las bandas marcadas de proteína.

La cartografía peptídica para ensayo de identidad de apolipoproteína A-IM se llevó a cabo con una fragmentación con enzima de digestión Lys-C de endoproteinasa y análisis por HPLC de fase inversa usando una columna Zorbax SB- C8 de 2,1 mm de d.i. Los fragmentos peptídicos se separaron y se llevó a cabo detección con detección UV a 220 nm. El péptido de muestra se comparó con digerido de material clásico. Se observaron formas oxidadas, formas truncadas y valores máximos nuevos desconocidos, con este método. Esta técnica de separación se basó en cromatografía de fase inversa, a pH 2, con un gradiente de etapa de acetonitrilo al 3% a aproximadamente 38%. Se usó una columna Zorbax Staplebound con diámetro interno de 2,1 mm con producción de 0,21 mm durante un análisis de 90 minutos.

La determinación cuantitativa y la pureza de apolipoproteína A-IM recombinante se llevó a cabo con HPLC de fase inversa utilizando una columna HyTach. Este método se dirigió a diferenciar entre: i) la forma monomérica de apolipoproteína A-IM recombinante (r-ApoA-IM) y formas monoméricas modificadas de la proteína y ii) la forma dímera intacta y las formas dímeras modificadas de la proteína. La diferenciación entre formas intactas y modificadas de la proteína se hizo posible por reducción primero de la proteína con mercaptoetanol para asegurar que no estaban presentes formas dímeras. El contenido de impurezas de las muestras de r-ApoA-IM se expresó como el porcentaje de área de formas monoméricas cambiadas, incluyendo valores máximos desconocidos del área del valor máximo total vista en el intervalo de gradiente. Para diferenciar entre dímero intacto y variantes dímeras de r-ApoA-IM, se omitió el procedimiento de reducción. Las formas dímeras se separaron de las monoméricas, así se determinaron todas las formas r-ApoA-IM presentes en el análisis. La técnica de separación, cromatografía de fase inversa, separó principalmente de acuerdo con diferencias hidrófobas de la molécula. Esto es útil para la separación de formas truncadas y formas degradadas de proteína intacta, debido a diferencias en hidrofobicidad. La cuantificación del monómero de r-ApoA-IM intacto (después de la reducción de la proteína) se determinó sobre el valor máximo correspondiente a monómero intacto sólo. La concentración se determinó por construcción de una gráfica de calibración con material de referencia de r-ApoA-IM a cuatro niveles. La separación se llevó a cabo con partículas de sílice modificada de 18 átomos de carbono, no porosas de 2 \mum. La fase móvil consistió en ácido trifluoroacético al 0,25% en mezcla de agua e isopropanol. La proteína se eluyó en un gradiente que funcionó con disolvente orgánico creciente de 52 a 62%.

El análisis IEF de r-ApoA-IM se llevó a cabo sobre el gel Immobiline DryPlate 4-7, un gel de poliacrilamida con un gradiente de pH lineal inmovilizado. Las proteínas se separaron electroforéticamente en el gradiente de pH de acuerdo con sus puntos isoeléctricos (pI), es decir, cuando la carga neta dentro de la molécula fue cero.

Claims (36)

1. Un método para preparar una composición de partículas lipídicas que comprende un agente lipídico y una proteína, en el que la proteína es una apolipoproteína, caracterizada por:

(i)

introducir una preparación de proteína y un agente lipídico en una instalación de homogeneización;

(ii)

someter mezcla fluida resultante de proteína y agente lipídico a homogeneización a alta presión; y

(iii)

recoger la composición así formada de partículas lipídicas.

2. Un método según la reivindicación 1, caracterizado por mezclar la preparación de proteínas y el agente lipídico a una mezcla fluida homogénea antes de la homogeneización.

3. Un método según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la preparación de proteínas es una solución acuosa de la proteína.

4. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que la homogeneización a alta presión se lleva a cabo a una presión de menos de 2x10^{7} Pa (200 bar), pero no excediendo la de 2x10^{8} Pa (2.000 bar).

5. Un método según la reivindicación 4, en el que la homogeneización a alta presión se lleva a cabo a presión de 6x10^{7} a 1,2x10^{8} Pa (600 a 1.200 bar).

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la homogeneización se lleva a cabo en al menos dos secuencias con un periodo de incubación intermedio.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que permite un periodo de incubación después de la homogeneización, pero antes de recoger las partículas lipídicas.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el agente lipídico, al menos parcialmente, puede estar en forma sólida proporcionando una dispersión con la preparación de proteínas antes de la homogeneización.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el agente lipídico comprende compuestos anfifílicos.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que el agente lipídico comprende esencialmente fosfolípidos.

11. Un método según la reivindicación 10, en el que los fosfolípidos consisten en fosfatidilcolina de origen natural o sintético con una composición de ácido graso, definida.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que la fosfatidilcolina se selecciona entre fosfatidilcolinas de yema de huevo o de soja o una fosfatidilcolina que tenga grupos acilo de ácidos grasos con, entre 14 y 18 átomos de carbono.

13. Un método según la reivindicación 12, en el que la fosfatidilcolina es dipalmitoil fosfatidilcolina.

14. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el agente lipídico además de compuestos anfifílicos comprende además al menos un lípido no polar.

15. Un método según la reivindicación 14, en el que el lípido no polar se selecciona entre: ésteres glicerílicos, ésteres alquílicos y colesterol incluyendo sus derivados no polares.

16. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que la cantidad de agente lipídico en relación a proteína es 1:100 a 10:1 (plp).

17. Un método según la reivindicación 16, en el que la cantidad de agente lipídico en relación a proteína es 1:4 a 4:1.

18. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizando porque el agente lipídico es una dispersión de lípidos en un medio acuoso.

19. Un método según la reivindicación 18, caracterizando porque la dispersión de lípidos es una emulsión de aceite en agua.

20. Un método según la reivindicación 19, caracterizando porque la emulsión comprende 1 a 50% (p/p) de una fase oleosa y 0,5 a 10% (p/p) de un emulsionante de fosfolípido.

21. Un método según la reivindicación 20, caracterizando porque la fase oleosa comprende aceites triglicéridos o ésteres alquílicos de ácidos grasos adecuados para administración parenteral.

22. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, que da como resultado partículas lipídicas con un tamaño medio de partícula menor que
1 \mum.

23. Un método según la reivindicación 22, en el que las partículas lipídicas obtenidas tienen un intervalo de tamaño medio de partícula de 0,1 a 0,5 \mum.

24. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que la cantidad de agente lipídico en relación a proteína es 500:1 a 10:1 (p/p).

25. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que un agente terapéuticamente activo se disuelve o se dispersa en las partículas lipídicas.

26. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que un agente adicional seleccionado de un grupo que consiste en polioles, mono-, di- y polisacáridos y aminoácidos, se añade a la mezcla de proteína y lípido.

27. Un método según la reivindicación 1, en el que la proteína es capaz de interacción hidrófoba con el agente lipídico.

28. Un método según la reivindicación 27, en el que la proteína es al menos parcialmente lipófila.

29. Un método según la reivindicación 28, en el que la proteína se selecciona entre proteínas de membrana y lipoproteínas o fragmentos activos de la misma.

30. Un método según la reivindicación 27, en el que la proteína tiene un dominio de alfa-hélice capaz de interacción hidrófoba con el agente lipídico.

31. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en el que la proteína es bioactiva y capaz de ser sometida a fuerza de alto cizallamiento sin pérdida sustancial de su actividad biológica.

32. Un método según las reivindicaciones 1 a 7 ó 18 a 31, en el que la proteína ejerce una influencia estabilizadora en las partículas lipídicas resultantes.

33. Un método según la reivindicación 1, en el que dicha proteína se selecciona de un grupo de apolipoproteínas que consiste en apolipoproteína A o E, incluyendo sus variantes naturales o sintéticas.

34. Un método para preparar una composición de partículas lipídicas que contenga al menos proteína parcialmente lipófila capaz de ser sometida a energía mecánica sin pérdida sustancial de acuerdo con cualquier reivindicación previa caracterizada por purificar y concentrar la composición de partículas lipídicas a una composición farmacéuticamente aceptable.

35. Un método según cualquier reivindicación precedente, caracterizado por liofilizar la composición así formada a un producto farmacéutico final.

36. Una composición de lípido y una proteína bioactiva como se obtiene por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, caracterizada porque la proteína esencialmente ha mantenido su identidad química sin que se someta a oxidación o desamidación.