ES2234031T3 - Uso de oligonucleotidos modulares como sondas o cebadores en ensayos basados en acidos nucleicos. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SUMINISTRA UN PROCEDIMIENTO PARA MEJORAR LA UNION DE UNA SERIE DE BASES CONSECUTIVAS DE NUCLEOTIDOS A UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO COMPLEMENTARIA DE OBJETIVO EN UNA MUESTRA, EN DONDE EL PROCEDIMIENTO COMPRENDE AL MENOS EL PASO O LOS PASOS DE UNIR UN OLIGONUCLEOTIDO MODULAR COMPLEMENTARIO DE AL MENOS DOS PARTES (MODULOS) QUE INCLUYEN LAS BASES DE NUCLEOTIDO CON LAS UNIONES ADYACENTES DE LA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO DE OBJETIVO EN LA MUESTRA, ESPECIALMENTE PROCEDIMIENTOS DE DETECCION/AISLAMIENTO Y UN PROCEDIMIENTO EN EL CUAL EL OLIGONUCLEOTIDO MODULAR ES UN INICIADOR, LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A OLIGONUCLEOTIDOS MODULARES EN SI MISMO Y A SU UTILIZACION EN LOS PROCEDIMIENTOS DE LA INVENCION.

Description

Uso de oligonucleótidos modulares como sondas o cebadores en ensayos basados en ácidos nucleicos.

El presente invento se refiere a un método para mejorar la unión de una serie de bases nucleotídicas consecutivas a una molécula complementaria de ácido nucleico, especialmente para el uso de mejorar la unión de oligonucleótidos de captura, de oligonucleótidos modulares, y kits para ejecutar métodos del invento.

La unión de bases nucleotídicas complementarias unas con otras representa uno de los descubrimientos más importantes y fundamentales de la ciencia de este siglo y anunciaba el rápido desarrollo del campo de la bioquímica. A la par que ha permitido comprender los mecanismos en los que se basa la continuación de la vida, el descubrimiento ha proporcionado también la base para el desarrollo de valiosas herramientas de la biología molecular.

El aislamiento y secuenciación de las moléculas de ácidos nucleicos presentes en la naturaleza es un objetivo común de los biólogos moleculares. El uso de oligonucleótidos complementarios a moléculas de ácidos nucleicos aisladas es una práctica habitual. Así mismo, los oligonucleótidos complementarios se utilizan frecuentemente para unirse a moléculas de ácidos nucleicos monocatenarios y actuar como cebadores en reacciones de extensión para producir cadenas complementarias al molde y constituyen la base de procedimientos experimentales tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las reacciones de secuenciación.

Sin embargo, la especificidad de unión de los oligonucleótidos a un molde o a un DNA diana depende de varios parámetros, cualquiera de los cuales puede producir una eficiencia de unión baja y en consecuencia unos resultados experimentales malos. La especificidad de la interacción puede determinarse convenientemente calculando la T_{m}, temperatura a la que los dúplex se disocian. Esta temperatura, sin embargo, depende también de otros parámetros, por ejemplo, del tampón en el que la reacción tiene lugar. En el caso de un sistema experimental particular, la T_{m} vendrá afectada por varios factores que incluyen el grado de complementariedad, la secuencia de la diana y/o del oligonucleótido, el derivado del oligonucleótido y la longitud del oligonucleótido. La unión de los oligonucleótidos puede mejorarse por lo tanto, como se evidencia por medio de una T_{m} aumentada en las mismas condiciones experimentales, alterando estos parámetros. Sin embargo, la variación que puede conseguirse alterando estos parámetros es limitada. Se necesitan por lo tanto nuevos métodos que mejoren la unión de los oligonucleótidos a un DNA diana.

De manera inesperada, ahora se ha encontrado que las sondas o cebadores modulares compuestos por al menos dos módulos (oligonucleótidos) que se unen a regiones adyacentes del DNA diana, exhiben una unión mejorada en relación con la de un oligonucleótido único que se extiende por la misma longitud que los módulos separados. Por ejemplo, se ha encontrado que dos oligonucleótidos adyacentes de 18 mer se unen de manera más eficiente al DNA diana que el oligonucleótido compuesto de 36 mer.

Tosoh Corp. (Database WPI week 9218 Derwent Publications Ltd., Londres; documento AN 92-145512, documento XP 002054939 y documento JP 04084 899 A, 18 de Marzo de 1992) han descrito el tratamiento de moléculas de ácido nucleico diana con ondas ultrasónicas para fragmentar el ácido nucleico en fragmentos grandes para obtener una hibridación más rápida. El documento WO 92/14442 ha descrito sondas de ácidos nucleicos, múltiples pero espacialmente separadas, para detectar Neisseria gonorrhoeae.

El uso de cebadores compuestos por módulos adyacentes con fines de secuenciación ha sido descrito con anterioridad (Kotler y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4241-4245; Kieleczawa y col., 1992, Science, 258, 1787-1791 y Szybalski, 1990, Gene, 90, 177-178, documento US 5.547.843 y Beskin y col., 1995, Nucl. Acids Res., 23(15), 2881-2885). Sin embargo, en estos casos los cebadores modulares se utilizaron para sustituir a cebadores más largos de manera que las genotecas de todas las secuencias de los cebadores más cortos pudieran presintetizarse de manera práctica ya que estos cebadores presentaban menos permutaciones posibles en la secuencia que los cebadores más largos. En todos los casos, los cebadores modulares fueron los únicos que se observó que presentaban, en reacciones de secuenciación realizadas en las mismas condiciones, una eficacia tan buena como la de los cebadores más largos. Por contraste, en el presente invento, de manera inesperada, se obtiene una unión incluso mejor, cuando un oligonucleótido único se escinde parte en componentes separados. Además, el trabajo previo indica que el efecto de los cebadores modulares sólo puede obtenerse si los módulos carecen de una (o más) base(s) entre ellos cuando se están unidos al molde. Para obtener una unión mejorada de la manera que aquí se describe, no es aplicable ninguna restricción de este tipo aunque se observa una unión incluso mejor cuando no existen espacios entre los módulos.

Lin y col., (Lin y col., 1989, Biochemistry, 28, 1054-1061) describen que un efecto cooperativo, probablemente debido al apilamiento de bases, se produce entre oligonucleótidos adyacentes unidos, efecto que aumenta la T_{m}. Este efecto, sin embargo, se compara únicamente en el caso de la unión de uno solo de los módulos del cebador modular y no en el caso de un cebador compuesto que tenga la longitud completa del cebador modular. Los descubrimientos que aquí se presentan, representan por lo tanto un considerable avance en relación con la técnica anterior y tienen muchas aplicaciones en casos en los que se requiere una unión mejorada de un oligonucleótido a una molécula de ácido nucleico diana.

Así, contemplado desde uno de los aspectos, el presente invento proporciona un método para mejorar la unión de una serie de bases nucleotídicas consecutivas a una molécula complementaria de ácido nucleico diana presente en una muestra, comprendiendo dicho método al menos la etapa o etapas de unir un oligonucleótido modular complementario, de al menos dos partes que incluyen dichas bases nucleotídicas, a extensiones adyacentes de dicha molécula de ácido nucleico diana presente en dicha muestra, en el que dicho oligonucleótido modular exhibe una unión mejorada en relación con la de un oligonucleótido único, complementario con la región de la molécula diana que se extiende por el oligonucleótido modular.

Contemplado de manera alternativa, el presente invento proporciona un método para unir una serie de bases nucleotídicas consecutivas a una molécula complementaria de ácido nucleico diana presente en una muestra, comprendiendo dicho método al menos la etapa o etapas de unir un oligonucleótido modular complementario, de al menos tres partes que incluyen dichas bases nucleotídicas, a extensiones adyacentes de dicha molécula de ácido nucleico diana presente en dicha muestra.

Según aquí se utiliza, el término "mejorar" en relación con una unión quiere indicar una especificidad, estabilidad o capacidad aumentadas de unión a moléculas de ácido nucleico diana. La "unión" puede determinarse conforme a cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, como aquí se describe) y dependerá, como resultará manifiesto para el experto en la técnica al que el invento va dirigido, del tampón apropiado, de la temperatura y de otras condiciones que se establezcan. La unión del oligonucleótido modular puede llevarse a cabo uniendo todas sus partes simultáneamente o como alternativa, pueden llevarse a cabo etapas sucesivas que implican unir uno o más de los módulos en cada una de las etapas. "Complementaria" según aquí se utiliza quiere incluir toda serie de bases nucleotídicas consecutivas, el oligonucleótido o ácido nucleico diana/molde, según sea el caso, que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico en cuestión, o su correspondiente RNA, DNA o análogo de ácido nucleico, ácido nucleico peptídico (PNA). Los módulos del oligonucleótido modular pueden constituirse como una composición de las diferentes moléculas de ácido nucleico, p. ej., DNA y PNA. Como alternativa, los módulos individuales pueden estar compuestos exclusivamente por RNA, DNA o PNA, pero los diferentes módulos incluidos en la sonda modular pueden estar constituidos por un ácido nucleico diferente. Así, por ejemplo, un módulo de PNA puede utilizarse como sonda de captura mientras que los módulos adyacentes pueden estar formados por DNA de manera que los procedimientos de extensión (p. ej., RT-PCR, secuenciación de DNA, etc.) pueden realizarse utilizando el módulo de DNA. La complementariedad de las moléculas de ácido nucleico incluye dentro de este alcance, una complementariedad no absoluta en la que puede producirse algún desapareamiento, aunque los ácidos nucleicos, o los oligonucleótidos o las series de nucleótidos "complementarios", según sea el caso, se unan entre sí en condiciones de rigurosidad alta. Esos oligonucleótidos son los que se unen en condiciones no rigurosas (p. ej., SSC 6x/formamida al 50% a temperatura ambiente) y se lavan en condiciones de rigurosidad alta (p. ej., SSC 2x, 65ºC), en las que SSC = NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,2.

"Molécula de ácido nucleico" quiere incluir, entre otras, RNA, mRNA, DNA, cDNA p. ej. procedente de un RNA retrovírico, DNA genómico, DNA mitocondrial, etc. y PNA. El DNA puede ser monocatenario o bicatenario. Cuando se utiliza un DNA bicatenario, pueden ser necesarios procedimientos apropiados para permitir que tenga lugar la unión del oligonucleótido modular, por ejemplo, mediante calentamiento para romper la estructura y obtener la forma monocatenaria. Ácido nucleico "diana" incluye moléculas que se detectan o aíslan según métodos del invento, además de moléculas que se utilizan como molde para determinadas reacciones moleculares, por ejemplo, amplificación, secuenciación o transcripción para la preparación de otras moléculas distintas. Las bases nucleotídicas o los nucleótidos que se unen a la molécula de ácido nucleico diana pueden estar modificadas o ser derivados, con la condición de que conserven la capacidad de satisfacer los requerimientos de complementariedad anteriormente descritos. Por ejemplo, pueden utilizarse bases metiladas, etiladas o carboxiladas u otras bases así modificadas o bases inusuales. Como alternativa, la cadena principal del ácido nucleico puede estar modificada, p. ej., unidades de PNA. Como alternativa, la base puede portar un marcador, por ejemplo, un hapteno tal como biotina, o un colorante. "Oligonucleótidos" incluye todo trozo de DNA (o de RNA después de una transcripción inversa), RNA o PNA, y se extiende también al uso de quimeras de RNA, DNA y/o PNA.

"Oligonucleótido modular" se refiere al oligonucleótido cebador/sonda que está compuesto por más de una parte. Cada parte es un oligonucleótido al que se le da el nombre de módulo del oligonucleótido total. "Adyacente" según aquí se utiliza, quiere indicar regiones no solapantes de la molécula de ácido nucleico que están próximas unas de otras, por ejemplo, que están separadas por menos de 100 ó 50 bases nucleotídicas, preferiblemente que están separadas por 10 bases, preferiblemente y de manera especial, que están separadas por menos de 2 bases, y muy preferiblemente no hay bases entre ellas, es decir, son justamente adyacentes. Según esto, el "oligonucleótido único" anteriormente nombrado, que comprende el oligonucleótido modular, puede incluir más nucleótidos que la suma de las bases nucleotídicas de todas las partes del oligonucleótido modular, ya que las bases complementarias a la región situada entre el sitio de unión de cada módulo del oligonucleótido modular, estarán también incluidas en los casos en los que los módulos, cuando están unidos, no son justamente adyacentes.

El método del invento aquí descrito puede utilizarse para cualquier aplicación en la que se requiera una unión mejorada de bases nucleotídicas, preferiblemente en forma de un oligonucleótido, a una molécula de ácido nucleico diana. Aunque sin estar obligado por la teoría, sucede que el uso de oligonucleótidos modulares permite la ruptura de las estructuras terciarias de las moléculas de ácidos nucleicos que se encuentran presentes no sólo en el tRNA sino también en otras moléculas de ácidos nucleicos. Esas estructuras terciarias no parecen romperse de manera tan efectiva cuando se utilizan oligonucleótidos más largos en los que las partes del oligonucleótido modular se sintetizan unidas en forma de una molécula única. Por lo tanto, las aplicaciones que requieren una unión mejorada a áreas de moléculas de ácidos nucleicos que tienen una estructura terciaria que evitaría o disminuiría la unión de un oligonucleótido a esta región, se beneficiarán de este invento. El presente invento se extiende por lo tanto, pero sin limitarse a ellas, a aplicaciones en las que el oligonucleótido modular se utiliza como cebador en métodos que incluyen replicación, amplificación, transcripción, transcripción inversa y/o secuenciación, o en los que el oligonucleótido modular se utiliza como sonda para la detección y/o captura o aislamiento de moléculas de ácido nucleico diana. Se apreciará que en las circunstancias apropiadas, los oligonucleótidos modulares pueden utilizarse para ambas funciones anteriormente mencionadas, p. ej., utilizándose como cebador y también como sonda de captura/detección de los productos ácido nucleicos, p. ej., un DNA amplificado, así producidos.

En el caso de las reacciones de secuenciación, puede encontrarse que un cebador, independientemente de su longitud, sea incapaz de proporcionar los productos de reacción requeridos. Este problema puede solucionarse con el uso de un cebador modular como alternativa al uso de un cebador compuesto. Esto puede conseguirse incluyendo simplemente un segundo cebador en la reacción de secuenciación además del primer cebador, que se une delante o detrás del primer cebador (de secuenciación), según convenga, y que permite una unión mejorada del primer cebador al molde, produciendo o mejorando de este modo una reacción de secuenciación apropiada. Esa unión mejorada, conforme a la definición de este invento, no se observaría si el segundo cebador estuviera simplemente ligado al extremo terminal del primer cebador de secuenciación. Como alternativa, si el cebador de secuenciación que produce un resultado bajo, es suficientemente largo, puede utilizarse un cebador modular en el que el cebador de secuenciación esté dividido en al menos dos partes. Si uno de los módulos del cebador se inmoviliza sobre un soporte sólido, las reacciones de secuenciación pueden tener lugar directamente sobre el soporte (secuenciación de Sanger con DNA-polimerasa de T7) o usarse en una secuenciación por ciclos (con DNA-polimerasa Taq).

De manera similar, el uso de un cebador modular puede mejorar o producir la replicación, amplificación, transcripción inversa o transcripción de una molécula de ácido nucleico molde, de una manera superior a la que usa un cebador único compuesto por los módulos separados.

La introducción de módulos que se unen adyacentes al cebador en esas reacciones, puede mejorar por lo tanto las reacciones, aumentando por ello la sensibilidad global. Según se ha indicado anteriormente, este invento puede ser el resultado de la desorganización de las estructuras terciarias de las moléculas de ácidos nucleicos. Se ha publicado que las estructuras terciarias tienen una importancia crítica en la reacción catalizada por la Q-beta-replicasa (Kramer y Lizardi, 1989, Nature, 339, 401-402). Así, en un aspecto preferido, el invento proporciona un método de replicación, amplificación, transcripción, transcripción inversa y/o secuenciación de una molécula de ácido nucleico diana presente en una muestra, comprendiendo dicho método la unión de un oligonucleótido modular complementario, según se ha definido aquí, utilizado como cebador en el método.

Las aplicaciones preferidas del presente invento incluyen la detección y/o captura de moléculas de ácido nucleico diana, en la que la unión de una sonda al ácido nucleico diana se mejora con el uso de una sonda modular que tiene al menos dos partes. Una de esas aplicaciones puede ser, por ejemplo, en análisis de transferencia Southern para detectar moléculas de ácido nucleico diana a las que una sonda compuesta no se une de manera efectiva. Según aquí se utiliza, una composición quiere significar ese oligonucleótido que resultaría de la síntesis de los módulos apropiados en forma de un oligonucleótido continuo, incluyendo la inserción de las bases nucleotídicas necesarias, complementarias a las bases del ácido nucleico diana, entre los módulos que no son justamente adyacentes. Esto puede mejorarse con el uso de una sonda modular. Así, por ejemplo, si un oligonucleótido de diez mer no se une de manera efectiva a una molécula diana, este oligonucleótido puede reemplazarse por dos oligonucleótidos de cinco mer, o puede añadírsele un oligonucleótido de cinco mer. De este modo, la unión de las sondas modulares (que comprenden en total, en este ejemplo, 10 ó 15 nucleótidos) mejora en relación con la unión de una sonda compuesta de esos 10 ó 15 nucleótidos (o de más si las partes de la sonda no son justamente adyacentes una vez unidas a la diana), respectivamente.

Se ha encontrado que este método es enormemente efectivo para la detección y aislamiento o captura de un DNA diana en disolución. En este método, se utiliza una sonda modular compuesta por al menos dos módulos. Uno de los módulos de la sonda modular es el módulo de captura o de detección (o un oligonucleótido). Los otros módulos (moduladores) ayudan mejorando la unión del módulo de captura a la molécula diana.

Así, contemplado desde un nuevo aspecto, el presente invento proporciona un método para detectar y/o aislar una molécula de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho método al menos la etapa o etapas de unir un oligonucleótido modular complementario, de al menos dos partes, a extensiones adyacentes de dicha molécula de ácido nucleico diana presente en dicha muestra.

Preferiblemente en este método, si el módulo de captura o detección y el módulo(s) modulador(es) fueran a formar una sonda oligonucleotídica única, la eficiencia de la unión disminuiría en relación con la unión del módulo de captura o de detección a la diana en presencia de los módulos moduladores libres.

Así, contemplado desde otro aspecto más, el presente invento proporciona un método para detectar y/o aislar una molécula de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho método al menos la etapa o etapas de unir un oligonucleótido modular complementario, de al menos dos partes, a extensiones adyacentes de dicha molécula de ácido nucleico diana presente en dicha muestra, en el que dicho oligonucleótido modular exhibe una unión mejorada en relación con la de un oligonucleótido individual, complementario con la región de la molécula diana abarcada por el oligonucleótido modular.

"Aislar" según aquí se utiliza, quiere incluir la captura del ácido nucleico diana, incluso cuando éste no está separado de la muestra en la que está presente, es decir, cuando la separación física o la purificación no se realiza necesariamente. Estos métodos implican la "captura" de la diana en la muestra en la que está contenida, uniendo a ella un oligonucleótido, aislándola así de manera efectiva de otras moléculas de DNA presentes en la muestra. En los métodos de aislamiento, el módulo de captura actúa también como módulo de aislamiento, permitiendo que las moléculas diana unidas a él sean aisladas.

También se proporciona según el invento un método de replicación, amplificación, transcripción y/o transcripción inversa de una molécula de ácido nucleico diana presente en una muestra, comprendiendo dicho método al menos la etapa o etapas de unir un oligonucleótido modular complementario, de al menos dos partes, a extensiones adyacentes de dicha molécula de ácido nucleico diana presente en dicha muestra.

Preferiblemente, cuando se contempla el aislamiento o captura, el módulo de captura está inmovilizado o lleva un medio de inmovilización. Aunque los módulos moduladores pueden ser inmovilizados o portar un medio de inmovilización, se valorará que estos módulos en ese caso actúen de manera efectiva como módulo de captura.

El medio de inmovilización puede constituir de manera inherente parte de la secuencia de ácido nucleico del módulo de captura, por ejemplo, puede proporcionarse una cola de poli T para que se una a un soporte sólido que porta una secuencia de oligo dA complementaria. Se apreciará que no es aconsejable usar un módulo de captura con una cola de poli A para que se una a un soporte que porta una secuencia de oligo dT, porque hacer eso puede conducir a la captura de un mRNA que puede estar presente en la muestra. Otras secuencias específicas que sean complementarias a secuencias que pueden ir unidas directa o indirectamente a un soporte de inmovilización, pueden también formar parte del módulo de captura para los fines de la inmovilización.

Los métodos anteriores incluyen la adición de más nucleótidos al módulo de captura que los requeridos para la unión al ácido nucleico diana. Las extensiones en este sentido no siempre son necesarias y el medio de inmovilización pueden introducirse durante o después de la síntesis del oligonucleótidos en los nucleótidos del módulo de captura para permitir la unión directa o indirecta a un soporte de inmovilización a través de una pareja de unión. A conveniencia, durante la síntesis pueden utilizarse derivados de nucleótidos para proporcionar la primera pareja apropiada del par de unión. La segunda pareja del par de unión la porta en ese caso el soporte sólido. Oligonucleótidos de captura derivados convenientemente incluyen por lo tanto los que portan biotina para su unión a avidina o a estreptavidina, los que portan epítopos o haptenos (p. ej., digoxigenina) para su unión a anticuerpos (que pueden ser monoclonales o policlonales) o a fragmentos de anticuerpos, o que portan secuencias de DNA para su unión a DNA o a proteínas de unión a PNA (p. ej., la unión de la proteína represora de lac I a la secuencia del operador lac que está unida al oligonucleótido). Otros pares de unión adecuados incluyen proteína A-anticuerpo, proteína G-albúmina de suero humano (HSA) y sus partes funcionales. Se apreciará que o bien las parejas de los pares de unión anteriormente indicadas, o sus partes funcionales, pueden unirse al oligonucleótido. El sistema de unión estreptavidina/biotina se utiliza muy frecuentemente en biología molecular, debido a la relativa facilidad con la que la biotina puede ser incorporada en secuencias de nucleótidos, y desde luego a la disponibilidad comercial de nucleótidos marcados con biotina, y por ello este sistema representa uno de los métodos preferidos para la unión del módulo de captura al soporte.

En la técnica son muy conocidos numerosos soportes adecuados para la inmovilización de oligonucleótidos, y métodos para unir nucleótidos a ellos, y se encuentran ampliamente descritos en la literatura. Así por ejemplo, pueden utilizarse soportes en forma de láminas, geles, filtros, membranas, tiras de microfibra, placas, pocillos de microtitulación, tubos, varillas, partículas, fibras o capilares, fabricados de un material polimérico, por ejemplo, de agarosa, celulosa, alginato, teflón, látex o poliestireno. Generalmente se prefieren los materiales en partículas, especialmente las bolitas. Por ejemplo, pueden utilizarse bolitas de Sepharose o poliestireno. Ventajosamente, el soporte puede comprender partículas magnéticas, p. ej., las bolitas supermagnéticas producidas por Dynal AS (Oslo, Noruega) y comercializadas con la marca registrada DYNABEADS. Como soportes sólidos pueden utilizarse chips para proporcionar sistemas experimentales en miniatura, según se describen por ejemplo en Nilsson y col. (1995, Anal. Biochem., 224, 400-408).

El soporte sólido puede portar grupos funcionales tales como hidroxilo, carboxilo, aldehído o grupos amino, responsables de la unión del módulo de captura. Estos grupos pueden en general ser producidos mediante tratamiento del soporte para proporcionar un revestimiento de superficie de un polímero que porta uno de esos grupos funcionales (p. ej., poliuretano junto con un poliglicol para proporcionar grupos hidroxilo, o un derivado de celulosa para proporcionar grupos hidroxilo, un polímero de un copolímero de ácido acrílico o de ácido metacrílico para proporcionar grupos carboxilo o un polímero aminoaalquilado para proporcionar grupos amino. La patente de EE.UU. n.º 4.654.267 describe la introducción de muchos revestimientos de superficie.

Como alternativa, el soporte puede portar otros restos para la unión, tal como avidina o estreptavidina, proteínas de unión a DNA o anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Las DYNABEADS revestidas de estreptavidina se encuentran comercialmente disponibles procedentes de Dynal AS. Preferiblemente, se producen oligonucleótidos de inmovilización que portan un resto de biotina, que puede utilizarse para unirse a estreptavidina sobre un soporte sólido.

Cuando se contempla la detección del ácido nucleico diana, que puede seguir o no a un método de aislamiento o captura según el invento, al menos uno de los módulos del oligonucleótido modular puede estar marcado.

El término "marcador" según aquí se utiliza, se refiere a cualquier marcador que puede ser determinado cualitativa o cuantitativamente, directa o indirectamente, p. ej., en virtud de sus propiedades enzimáticas, emisión de radiaciones, propiedades de dispersión o absorción, o de su capacidad para cooperar con, o unirse a, un agente complementario para producir un efecto detectable, p. ej., interaccionar con una enzima para producir una señal, evolución de gases, emisión de luz, cambio de color, turbidez, precipitaciones, etc. Esos marcadores o medios de marcaje son muy conocidos, especialmente en el campo de los análisis clínicos, e incluyen por ejemplo, enzimas, cromóferos o fluoróforos (p. ej., colorantes tales como fluoresceína y rodamina), marcadores radiactivos, compuestos quimioluminiscentes o reactivos de alta densidad electrónica tales como la ferritina, hemocianina u oro coloidal. Puede utilizarse un marcador que use una actividad enzimática para generar un color en el caso de las determinaciones espectrofotométricas, por ejemplo, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, el cual con la adición de un sustrato adecuado puede generar una señal adecuada para la detección.

Los marcadores se introducen convenientemente en las partes del oligonucleótido modular durante o después de su síntesis. Esto puede conseguirse de manera similar proporcionando un medio de inmovilización, por ejemplo, preparando el oligonucleótido junto con una de las parejas de un par de unión (antes o después de la síntesis), y uniendo después una segunda pareja de unión proporcionada con un marcador. La primera pareja puede ser una pareja de un par de unión convencional, por ejemplo, biotina:estreptavidina, o puede ser parte de la propia secuencia del oligonucleótido, a la que una segunda molécula se unirá de manera específica. Como alternativa, un derivado de nucleótido que porta un marcador, por ejemplo, un nucleótido marcado radiactivamente, puede utilizarse en la síntesis del oligonucleótido o puede formarse el derivado después de la síntesis. Como alternativa, puede sintetizarse un módulo que lleve una porción que no sea complementaria con el ácido nucleico diana, y que puede portar de manera inherente un marcador, p. ej., un marcador radiactivo, o que puede ser adecuada para la unión de un marcador. Esas extensiones hechas al módulo no se consideran parte del módulo cuando se determina si se observa una unión mejorada en el caso de un oligonucleótido modular en comparación con la de un oligonucleótido único que incluye estos módulos, según la definición del invento.

Aunque la detección puede realizarse utilizando uno o más módulos del oligonucleótido modular marcados para indicar la unión, este método tiene el inconveniente de que los módulos marcados unidos al ácido nucleico diana deben ser separados necesariamente de la mezcla de la reacción de unión para que sea posible obtener una detección por encima de los niveles del fondo. Aunque esta separación en muchos casos puede realizarse con facilidad, un método de detección alternativo implica el uso de marcadores que van en módulos que se unen a extensiones adyacentes de la diana, los cuales por su proximidad generan una señal (en sentido negativo o positivo) que puede ser detectada. Este tipo de marcador presenta la ventaja, no sólo de que para la detección no es necesario realizar separación, aunque ésta puede realizarse adicionalmente si se requiere, sino también que la señal se crea solamente cuando los módulos se unen unos adyacentes a otros, disminuyendo así el ruido de fondo. Por ejemplo, pueden utilizarse módulos con marcadores diferentes, en los cuales los marcadores están lo suficientemente próximos y son del tipo adecuado para que cuando los módulos están unidos al ácido nucleico diana, extingan la posible fluorescencia del otro marcador. Así por ejemplo, pueden utilizarse dos módulos con marcadores diferentes, uno de los cuales es un colorante de extinción y el otro es un colorante fluorescente. Cuando no estén unidos uno adyacente al otro, se producirá fluorescencia, mientras que cuando están unidos adyacentes puede tener lugar un descenso en fluorescencia cuantificable. Opcionalmente, el ácido nucleico diana que lleva unidos módulos de extinción, puede separarse de los módulos no unidos presentes en la mezcla. Las moléculas unidas pueden luego soltarse p. ej., mediante calentamiento para romper la unión, produciéndose de este modo fluorescencia a medida que los marcadores presentes en los módulos se separan, permitiendo la producción de una fluorescencia detectable que puede correlacionarse con la cantidad del módulo unido, y por lo tanto con la cantidad del DNA diana. Ese tipo de marcadores se utilizan en el ensayo TaqMan (Perkin
Elmer).

Se apreciará sin embargo que la detección no siempre se basa en el marcaje de los módulos. Por ejemplo, puede utilizarse la tecnología de chips, según aquí se describe, en la que el módulo de captura de la sonda modular está unido a la superficie del chip (véase por ejemplo, Nilsson y col., 1995, supra). Cuando el módulo de captura se une al DNA diana (en presencia de los módulos moduladores) se produce un cambio en el índice de refracción en la superficie del sensor. Este cambio se correlaciona con la cantidad de la diana unida al chip y por ello puede utilizarse como método de detección y/o aislamiento o captura. Este método representa una particularidad preferida del invento.

Para la ejecución del invento, el método puede incluir adicionalmente la etapa posterior de unir un módulo de captura a un soporte sólido en los casos en los que el módulo dispone de un medio de inmovilización, antes o después de la unión del oligonucleótido de captura al ácido nucleico diana, poniendo en contacto la muestra que contiene la molécula diana con el oligonucleótido de captura inmovilizado. Una vez unido a un soporte sólido, pueden realizarse etapas de lavado del modo conveniente, especialmente con fines de purificación o para retirar el fondo en las etapas de detección. Preferiblemente, el oligonucleótido de captura se une a un soporte sólido antes de la adición de una muestra que contiene las moléculas del ácido nucleico diana.

En los métodos del invento, los módulos moduladores se adicionan preferiblemente a, o se ponen en contacto con, una muestra que contiene las moléculas de ácido nucleico diana, antes de la adición del módulo de captura libre o inmovilizado, por ejemplo mezclándolos a 54ºC durante 45 minutos, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente para hacer que se produzca la hibridación.

En procedimientos en los que se utilizan métodos del invento, especialmente procedimientos analíticos, etapas adicionales de aislamiento, separación, purificación, determinación y/o comparación pueden realizarse según convenga para obtener los resultados deseados. Así, por ejemplo un método del invento puede comprender al menos una de las siguientes etapas adicionales:

a) unir el módulo de captura del oligonucleótido modular a un soporte sólido en los casos en los que el módulo de captura va provisto con un medio de inmovilización;

b) poner en contacto la muestra que contiene el ácido nucleico diana con el oligonucleótido modular;

c) poner en contacto la muestra que contiene el ácido nucleico diana con los módulos moduladores del oligonucleótido modular;

d) poner en contacto la muestra que contiene el ácido nucleico diana con el oligonucleótido de captura inmovilizado para posibilitar la unión del oligonucleótido con el ácido nucleico diana;

e) separar de la muestra el ácido nucleico diana unido al módulo de captura.

f) lavar el ácido nucleico diana separado en la anterior etapa e);

g) determinar la presencia o cantidad de marcador asociado con el ácido nucleico diana, cuando se utilizan módulos marcados, o determinar la presencia o cantidad del ácido nucleico diana unido al módulo de captura cuando no se utiliza marcador; y

h) comparar la cantidad de marcador, o de ácido nucleico diana unido de la etapa (g), con los niveles de
control.

Se apreciará que no todas las etapas anteriores pueden incorporarse a un procedimiento determinado, como por ejemplo, las etapas (c) y (d) ejecutan esencialmente la etapa (b) en dos partes. En la etapa (g), la determinación del marcador o de las moléculas diana unidas puede realizarse alternativamente determinando el marcador no asociado con moléculas diana, o determinando el ácido nucleico no marcado, y los valores pueden luego sustraerse de los valores totales del marcador o del ácido nucleico utilizado, para obtener el valor requerido de marcador o de ácido nucleico diana unido. Aunque estos valores pueden correlacionarse con curvas estándar apropiadas para obtener valores absolutos, esto no es esencial, y el término "determinación" según aquí se utiliza, incluye tanto la cuantificación en el sentido de obtener un valor absoluto de la cantidad de ácido nucleico diana presente en una muestra, como también la obtención de una determinación semicuantitativa o cualitativa, por ejemplo, para indicar simplemente las presencia del ácido nucleico diana en la muestra sometida al estudio. La determinación puede incluir también la generación de más moléculas para la detección, por ejemplo, por medio de reacciones de secuenciación y/o amplificación. Con respecto a la etapa (h), los niveles de control adecuados serán los establecidos utilizando los mismos procedimientos experimentales aplicados a muestras no pertenecientes al estudio o a muestras normales. Está claro que pueden utilizarse etapas secuenciales diferentes para obtener la unión del oligonucleótido modular. Por ejemplo, una parte del oligonucleótido modular puede ponerse en contacto con la muestra y luego unirse, seguido de la puesta en contacto y unión de otras partes del oligonucleótido modular. Como alternativa las etapas de puesta en contacto pueden realizarse simultáneamente.

En un aspecto preferido del invento, el método puede comprender las etapas de:

1) poner en contacto la muestra que contiene el ácido nucleico diana con todos los módulos del oligonucleótido modular;

2) unir dichos módulos mediante hibridación;

3) añadir un soporte sólido y unir al menos uno de dichos módulos provisto con un medio de inmovilización a dicho soporte sólido;

4) separar el ácido nucleico diana unido a dicho soporte sólido;

5) lavar dicho soporte sólido;

6) amplificar dicho ácido nucleico diana; y

7) determinar la presencia o cantidad de ácido nucleico amplificado.

Se apreciará que los oligonucleótidos modulares que presentan utilidad según el invento, pueden estar constituidos por 2-3 módulos sin espacios entre ellos cuando están unidos a moléculas de ácido nucleico diana, de los que cada uno puede tener un tamaño diferente. Aunque se ha encontrado que este invento presenta utilidad cuando el ensayo se realiza en diferentes sitios del DNA diana, alguna modificación apropiada en el número de módulos y/o en el tamaño de los módulos puede ser apropiada para obtener una unión óptima en un sitio determinado y en unas condiciones experimentales particulares. Esa optimización es dentro de la capacidad del destinatario experto en la técnica, y en ella pueden utilizarse experimentos de ensayo y error del tipo de los que aquí se ilustran. Preferiblemente el oligonucleótido modular contiene un total de más de 10 nucleótidos, preferiblemente de al menos 18 nucleótidos, por ejemplo, 18, 24, 27, 29, 31, 33 ó 36. Los módulos, cuando están unidos al ácido nucleico diana, carecen de bases entre ellos.

Los oligonucleótidos modulares de uso en el invento son los que tienen 2 ó 3 módulos, con >5 nucleótidos cada módulo, preferiblemente con \geq 9 \leq 13, p. ej., 9, 11 ó 13 nucleótidos. Cuando se utilizan 3 módulos, pueden utilizarse módulos ligeramente más cortos que cuando se utilizan dos módulos. Los nucleótidos totales en los oligonucleótidos modulares de 3 partes son preferiblemente > 23, preferiblemente \geq 27, p. ej. 27, 31, 33 ó 36.

Los módulos de los oligonucleótidos modulares pueden prepararse mediante síntesis química u otra síntesis apropiada muy conocidas en la técnica. Varios oligonucleótidos útiles se encuentran comercialmente disponibles con una molécula de biotina unida, encargada de la inmovilización (p. ej. KEBO, Estocolmo, Suecia).

El método presenta utilidad especialmente en relación con ácidos nucleicos diana víricos, por ejemplo, del virus de la Hepatitis C (HCV) y puede utilizarse para realizar el seguimiento o diagnosticar infecciones víricas u otras infecciones. Los oligonucleótidos modulares adecuados para utilizar en los métodos del invento incluyen oligonucleótidos modulares que tienen una de las siguientes secuencias:

Para detección, aislamiento o captura de HCV en las posiciones 291-341:

1

Preferiblemente, en los anteriores oligonucleótidos modulares, el último módulo listado es el módulo de captura (es decir, C1, C2 u OMD2) y puede portar un resto encargado de la inmovilización, preferiblemente una molécula de biotina en el extremo 5'. Estos oligonucleótidos modulares de uso en los métodos del invento, constituyen nuevos aspectos del invento. Por lo tanto, todavía en otro aspecto más, el presente invento proporciona métodos del invento para detectar y/o aislar HCV, en los que dichos oligonucleótidos comprenden una de las siguientes secuencias de nucleótidos:

2

o sus análogos o derivados en los que las bases nucleotídicas están modificadas o son bases derivadas.

El invento presenta también utilidad en relación con identificar y/o aislar un ácido nucleico diana de HIV. A este respecto, se han diseñado sondas modulares dirigidas a la región de la polimerasa del HIV-1, que permiten la captura y/o aislamiento del genoma de RNA de HIV con fines diagnósticos. Aunque el RNA de HIV contiene poli A que posibilita la purificación mediante su unión a un soporte sólido que porta un oligo dT, cuando se usa convenientemente el método del invento, se usa un oligonucleótido de captura que se une justo al lado del sitio en el que se situarían los cebadores de la RT-PCR, de manera que los efectos de las RNasas se minimizan.

El invento presenta también utilidad en relación con identificar y/o aislar productos de secuenciación generados por la extensión de los cebadores, por ejemplo del cebador de secuenciación universal (USP). Esos productos necesitan ser purificados y/o enriquecidos después de la síntesis, antes de cargarlos en un sistema de electroforesis. Aunque la precipitación en alcohol se utiliza como método de rutina, no es fácil de automatizar. El uso de sondas modulares permite la captura de esos productos, generados, por ejemplo, mediante una secuenciación tradicional con DNA-polimerasa de T7 o mediante protocolos de secuenciación cíclica. Se apreciará que esto puede adaptarse para usar con respecto a diferentes cebadores utilizados para sintetizar productos de extensión. Así, para la captura de los productos de las reacciones de extensión en las que se utiliza el cebador universal, los oligonucleótidos modulares adecuados para usar en los métodos del invento incluyen oligonucleótidos modulares que tienen una de las siguientes
secuencias:

3

Preferiblemente en los anteriores oligonucleótidos modulares, el último módulo listado es el módulo de captura (es decir, JL-C1/USP, JL-C2/USP) y puede portar un resto encargado de la inmovilización, preferiblemente una molécula de biotina en el extremo 5'. Estos oligonucleótidos modulares de uso en los métodos del invento, constituyen nuevos aspectos del invento. Por lo tanto, todavía en otro aspecto más, el presente invento proporciona métodos del invento para detectar y/o aislar productos de la extensión de cebadores, especialmente del cebador USP, en los que dichos oligonucleótidos comprenden una de las siguientes secuencias de nucleótidos:

4

o sus análogos o derivados en los que las bases nucleotídicas están modificadas o son bases derivadas.

Esos análogos y derivados incluyen bases nucleotídicas modificadas o derivadas, u oligonucleótidos como los anteriormente mencionados, que conservan su capacidad para satisfacer los requerimientos de complementariedad aquí descritos y que incluyen por ejemplo, nucleótidos que portan marcadores o medios encargados de la inmovilización. Como alternativa, las bases particulares anteriormente definidas pueden ser sustituidas por otras bases no complementarias o por bases derivadas que no impidan la unión al ácido nucleico diana en una extensión tal que caigan fuera de la definición de complementariedad según aquí se ha descrito.

En un aspecto más, el invento también proporciona los oligonucleótidos modulares según aquí se han descrito y su uso en los métodos del invento.

El presente invento también se extiende a kits para ejecutar los métodos del invento, que comprenden al menos uno de los siguientes oligonucleótidos modulares:

5

o

6

o sus análogos o derivados en los que las bases nucleotídicas están modificadas o son bases derivadas.

Preferiblemente, al menos uno de los módulos está inmovilizado en un soporte sólido o lleva un medio encargado de la inmovilización. Al menos uno de los módulos puede estar marcado para permitir la detección del ácido nucleico diana. Adicionalmente, pueden proporcionarse tampones apropiados y/o un soporte sólido.

Los siguientes Ejemplos se dan solamente a modo de ilustración, con referencia a las siguientes Figuras en las que:

La Figura 1 muestra un sensorgrama típico;

La Figura 2A muestra una representación esquemática de una captura vírica con un módulo oligonucleotídico (= sonda de hibridación) (de 18-5 mer) inyectado sobre un oligonucleótido de captura inmovilizado, de 18 mer, (= sonda inmovilizada) en la superficie de un chip;

La Figura 2B muestra los resultados de la captura utilizando el oligonucleótido de captura de 18 mer (* indica los datos de captura cuando había un espacio de 18 nucleótidos entre el oligonucleótido de captura y el módulo oligonucleotídico - columna 11);

La Figura 3A muestra una representación esquemática de una captura vírica con dos módulos oligonucleotídicos de la sonda modular (de 9 mer y de 18-5 mer) inyectada sobre un oligonucleótido de captura inmovilizado, de 9 mer (* indica los datos de captura en ausencia del módulo oligonucleotídico H4 - columna 1; la columna 12 presenta los datos de captura cuando había un espacio de 18 nucleótidos entre los módulos oligonucleotídicos);

La Figura 3B muestra los resultados de la captura utilizando el oligonucleótido de captura de 9 mer.

La Figura 4A es igual que la Figura 3A excepto por la presencia de un espacio de 1 nucleótido entre el primer oligonucleótido de captura y el primer oligonucleótido adyacente de la sonda modular, o entre los dos módulos oligonucleotídicos no de captura de la sonda modular;

La Figura 4B muestra los resultados de la captura utilizando una sonda modular con espacios entre los módulos;

Las Figuras 5A y 5B muestran el efecto del diferente número de módulos que constituyen la sonda modular;

La Figura 6 muestra el efecto de los módulos en la localización 2 del genoma del HCV;

La Figura 7 muestra una representación esquemática del uso de oligonucleótidos modulares para capturar DNA o RNA de HCV;

La Figura 8 muestra los resultados de la captura de DNA de HCV sobre bolitas magnéticas, en ausencia o presencia de un módulo oligonucleotídico;

La Figura 9 muestra los resultados de un análisis con BIAcore, de la captura de RNA de HCV sobre la superficie de un chip en ausencia o presencia de un módulo oligonucleotídico;

La Figura 10 muestra los resultados de captura de RNA de HCV sobre bolitas magnéticas en ausencia o presencia de un módulo oligonucleotídico después de una PCR sencilla;

La Figura 11 muestra los resultados de captura de RNA de HCV sobre bolitas magnéticas en ausencia o presencia de un módulo oligonucleotídico después de una PCR interna (anidada);

La Figura 12 muestra los resultados de la captura de RNA de HCV procedente de muestras de laboratorio de hepatitis C, sobre bolitas magnéticas en ausencia o presencia de un módulo oligonucleotídico después de una PCR simple; y

La Figura 13 muestra los resultados de un análisis con BIAcore, de la captura de DNA de HIV-1 en ausencia o presencia de un módulo oligonucleotídico en la superficie de un chip.

Ejemplo 1 Captura de ssDNA utilizando un oligonucleótido de captura y al menos un oligonucleótido adicional como sonda modular

Este ejemplo ilustra el aumento en muchas veces MANYFOLD en la captura de ssDNA con un oligonucleótido de captura inmovilizado cuando módulos oligonucleotídicos específicos se han hibridado previamente con el DNA. El oligonucleótido de captura (mencionado en este ejemplo como oligonucleótido de captura u oligonucleótido inmovilizado) y un oligonucleótido hibridado con el DNA (mencionado en este ejemplo como módulos oligonucleotídicos), juntos constituyen los módulos de la sonda modular.

Se utilizaron diferentes combinaciones de oligonucleótidos de captura y módulos oligonucleotídicos para la unión al DNA. Así, oligonucleótidos de captura de 18 mer se utilizaron junto con un solo módulo oligonucleotídico de 18, 15, 13, 11, 9 ó 5 mer (Figura 2B), oligonucleótidos de captura de 9 mer se utilizaron con un módulo oligonucleotídico de 9 mer en presencia o ausencia de un segundo módulo oligonucleotídico (de 18, 15, 13, 11, 9 ó 5 mer (Figura 3B). También se realizaron ensayos con sondas modulares que presentaban un espacio de 1 nucleótido entre los sitios de reasociación de los módulos (Figura 4B y 5A). Para investigar mejor el efecto de los módulos, un oligonucleótido biotinado de 36 mer (que comprende el oligonucleótido de captura C1 de 18 mer y el módulo oligonucleotídico H1-18 de 18 mer), se diseñaron y ensayaron para determinar su eficiencia en la captura de HCV (Figura 5B).

Materiales y métodos Amplificación por PCR (Generación del molde)

Clones que contenían la región en 5' que no se traduce (NTR) (del inglés, " Non-Translated Region") de dos genotipos (2b y 3a) del virus de la hepatitis C (HCV) en los vectores pGEM®-T (Promega, Madison, WI, USA), se utilizaron como molde en la PCR para generar un fragmento de 324 pb para el análisis el biosensor. La amplificación por PCR se realizó con una concentración 0,2 \muM de cada uno de los cebadores OU49 y OD66;

7

La amplificación se realizó en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, Tween® 20 al 0,1%, los dNTP 0,2 mM y 0,5 U de DNA-polimerasa AmpliTaq® (Perkin-Elmer, Foster City, CA), utilizando un termociclador Perkin-Elmer 9600 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). El perfil de temperaturas fue de 94ºC durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de (94ºC durante 15 segundos, 62ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 60 segundos) y finalizando con 72ºC durante 10 minutos.

Preparación de DNA monocatenario

Los productos biotinados resultantes de la PCR se inmovilizaron sobre bolitas paramagnéticas revestidas con estreptavidina (Dynabeads® M-280 Streptavidin; Dynal, Oslo, Noruega) y mediante una elución específica de cadena se obtuvo un molde puro para la hibridación (Hultman y col., 1989, Nucl. Acids Res., 17, 4937-4946). Cincuenta microlitros de producto de PCR se capturaron mediante una incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente con una proporción de 5 mg/ml de las bolitas en 50 \mul de tampón de unión/lavado (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, NaCl 2 M, \beta-mercaptoetanol 1 mM, Tween® 20 al 0,1%). Después de lavar y retirar el sobrenadante, las cadenas se separaron mediante una incubación con 10 \mul de NaOH 0,1 M durante 5 minutos. El sobrenadante alcalino que contiene la cadena no biotinada se neutralizó con 6 \mul de HCl 0,1667 mM y con 1 \mul de Tris-HCl 280 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 100 mM. Con el fin de prevenir que hebras biotinadas coeluidas interaccionen con la estreptavidina presente sobre el chip sensor, se mezcló una segunda ronda de bolitas de estreptavidina sedimentadas (250 \mug) y se recogió el sobrenadante. Con el fin de disminuir las diferencias entre las muestras individuales de un mismo experimento, el DNA monocatenario eluido se distribuyó por lotes. El DNA monocatenario preparado se analizó luego cualitativa y cuantitativamente con una PAGE al 10%-15% con tiras PhastSystem™ y PhastGel® DNA Buffer Strips y con un kit DNA Silver Staining Kit (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia).

Oligonucleótidos

Los oligonucleótidos biotinados destinados a ser inmovilizados sobre el chip sensor y los oligonucleótidos encargados de la hibridación al producto monocatenario ssHCV resultante de la PCR, se adquirieron procedentes de KEBO, Estocolmo, Suecia. Las secuencias de los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 1 en el caso de la posición 1 y en la Tabla 2 en el caso de la posición 2.

Análisis con un biosensor

Un instrumento BIAcore® 2000 (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Suecia) se utilizó en todos los experimentos. Se utilizaron chips sensores SA (Pharmacia Biosensor), prerevestidos con aproximadamente 4.000 RU de estreptavidina (1.000 RU corresponden a aproximadamente 1 ng/mm^{2} de estreptavidina). Los experimentos se realizaron a 25ºC con SSPE 6X (NaCl 0,9 M (pH 7,4), NaH_{2}PO_{4} 60 mM, EDTA 7,5 mM y Tensioactivo P20 (Pharmacia Biosensor) al 0,005% (v/v)) como tampón de inyección y tampón de desarrollo. Los oligonucleótidos biotinados encargados de la captura sobre el chip sensor fueron inmovilizados hasta alcanzar un nivel de aproximadamente 500 RU - 1.000 RU (1.000 RU corresponden aproximadamente a 1 ng/mm^{2} (Stenberg y col., 1991. J. Colloid Interface Sci., 143, 513-526) mediante inyección de 50 \mul de SSPE 6X que contenían oligonucleótido biotinado 1 \muM, a una velocidad de flujo de 30 \mul/min. Antes y después de su uso en los experimentos de hibridación, los chips sensores se trataron con tres pulsos de NaOH 50 mM (5 \mul, 5 \mul/min) para regenerar (R) la superficie. Una celda de flujo, sin oligonucleótido inmovilizado, se utilizó como referencia.

Hibridación y captura de DNA monocatenario

Los módulos oligonucleotídicos se hibridaron con el ssDNA diana mediante una incubación en una estufa de hibridación durante 45 minutos a 54ºC, con rotación constante, y luego se enfriaron a temperatura ambiente. La hibridación se realizó en 100 \mul de SSPE 6X que contenían aproximadamente ssDNA 200 nM y oligonucleótidos 500 nM.

Cuarenta \mul de la mezcla de hibridación se inyectaron sobre el oligonucleótido de captura inmovilizado a una velocidad de flujo de 5 \mul/min. Las muestras de control, con ausencia de sondas de hibridación, se trataron exactamente de la misma manera. La superficie del oligonucleótido se regeneró con NaOH 50 mM (5 \mul, 5 \mul/min).

Resultados

Un fragmento de 324 pares de bases (bp) de la región que no se traduce (NTR) de HCV se generó por PCR. El dsDNA se desnaturalizó aparte mediante separación con bolitas magnéticas para obtener un ssDNA adecuado para su captura por los oligonucleótidos inmovilizados sobre un chip sensor situado en el biosensor. Este ssDNA se hibridó con los módulos oligonucleotídicos antes de la inyección sobre el chip sensor, lo que da como resultado una captura de alta eficiencia del DNA de HCV.

En este ejemplo se utilizó la tecnología de biosensores que permite que eventos biológicos puedan ser seguidos en tiempo real (Jönsson y col., 1991, BioTechniques, 11, 620-672). Este método utiliza un chip sensor como soporte sólido de la inmovilización. La detección se basa en la resonancia de plasmones en superficie (SPR) para seguir los cambios en el índice de refracción a lo largo del tiempo en la superficie del sensor. Los cambios son proporcionales a la masa de las moléculas unidas sobre la superficie y se muestran en el denominado sensorgrama en forma de unidades de resonancia (RU) a lo largo del tiempo. Un sensorgrama representativo se encuentra dibujado en la Figura 1, y muestra la inyección (A) de C1 biotinado (oligonucleótido de captura de 18 mer). La inmovilización es rápida y la cantidad de oligonucleótido unido se determina que es de 700 RU comparando las unidades de respuesta antes y después del pulso inyectado. Después de la regeneración (R) de la superficie del sensor con NaOH 50 mM, el oligonucleótido de captura inmovilizado se usó para capturar el DNA diana monocatenario mediante hibridación. Como se muestra en la Figura 1 (B), cuando se inyecta únicamente DNA diana monocatenario sobre el chip sensor, sólo se hibridan cantidades indetectables (< 20 RU). Por el contrario, cuando la diana monocatenaria a la que se había asociado previamente un módulo oligonucleotídico H1 (18 mer), diseñado para que sea adyacente al oligonucleótido de captura, se hizo pasar sobre el chip sensor (C), quedaron retenidas cantidades significativas
(250 RU).

Investigación del efecto de los módulos cuando se utiliza un oligonucleótido de 18 mer como sonda de captura en la posición 1

Un oligonucleótido de captura biotinado (C1), de 18 mer, se inmovilizó sobre un chip sensor con estreptavidina. DNA monocatenario de HCV, con y sin módulos oligonucleotídicos previamente hibridados, se inyectó sobre el chip sensor según se describe en la sección de Métodos. El protocolo experimental se ilustra en forma de esquema en la Figura 2A y los resultados se muestran en la Figura 2B. Los resultados representan valores normalizados de experimentos independientes, como consecuencia de la variación de las respuestas absolutas entre chips sensores diferentes, que dependen de la cantidad de estreptavidina que reviste la superficie del chip, y que afecta por lo tanto a la cantidad del oligonucleótido de captura inmovilizado y a la eficiencia de la captura. La baja eficiencia de la captura con un ssDNA inyectado sobre un oligonucleótido de captura inmovilizado (C1) de 18 mer, se presenta en la Figura 2B, columna 1. Una captura baja similar se obtuvo también incluso cuando se utilizó un fragmento espaciador de 10 adeninas en 5' con el oligonucleótido de 18 mer (C1x10A, Tabla 1) (datos no mostrados). En los experimentos de captura posteriores, se utilizó un complejo prehibridado formado por un ssDNA diana y módulos oligonucleotídicos. Los módulos oligonucleotídicos tenían una longitud de variaba de 18 a 5 nucleótidos, pero todos ellos se diseñaron para que se reasociaran adyacentes al extremo 3' del oligonucleótido de captura inmovilizado (Tabla 1). Utilizando los módulos oligonucleotídicos específicos (H1-18, 15, 13, 11; de 18 a 11 mer) se observó un aumento significativo de la captura (de 230 RU a 320 RU) (Figura 2B, columnas 2-5), en comparación con los experimentos realizados sin un módulo oligonucleotídico (columna 1). Sin embargo, la eficiencia de la captura disminuyó enormemente y a veces quedó anulada cuando H1 tenía una longitud menor que 9 nucleótidos (Figura 2B, columna 6 y 7). Los diferentes controles indican claramente la especificidad en la hibridación entre el oligonucleótido de captura inmovilizado y el complejo DNA monocatenario/módulo oligonucleotídico, ya que las respuestas que resultan de interacciones de los oligonucleótidos o de DNA inespecífico fueron indetectables (Figura 2B, columnas de 8 a 11). La columna 11 muestra que la captura no se produce cuando existe un espacio de 18 nucleótidos entre los diferentes
módulos.

Investigación del efecto de los módulos cuando se utiliza un oligonucleótido de 9 mer como sonda de captura

Un oligonucleótido de captura biotinado (C2) de 9 mer, se inmovilizó sobre un chip sensor SA, y los módulos oligonucleotídicos se fraccionaron en módulos más pequeños. El protocolo experimental se ilustra en forma de esquema en la Figura 3A y los resultados se muestran en la Figura 3B. Como era de esperar, no se observó captura de DNA cuando se utilizó un nonámero de captura inmovilizado (C2) en solitario (Figura 3B, columna 1). Cuando se utilizaron el módulo oligonucleotídico nonámero (H4) y el módulo oligonucleotídico (H1 - 18, 15, 13, 11, 9), el ssDNA fue capturado con éxito (Figura 3B, columnas 3-7). Sin embargo, al igual que en la Figura 2B, la captura asistida por módulos utilizando el módulo corto pentámero (H1-5) no se consiguió (columna 8), lo mismo que cuando se usa un módulo oligonucleotídico nonámero (H4) (columna 2). Estos resultados junto con los datos de las Figuras 5A y 5B, sugieren que la longitud del oligonucleótido de captura no es el parámetro más importante, sino que éste depende del número y de la longitud de los módulos oligonucleotídicos que se utilizan. Se llevaron a cabo experimentos de control tanto en el caso del oligonucleótido de captura de 18 mer como en el de 19 mer, para verificar el concepto. En primer lugar, se estudiaron las interacciones inespecíficas inyectando un DNA inespecífico de tamaño similar sobre el oligonucleótido de captura (Figura 2B, columna 8, y Figura 3B, columna 10) e inyectando el módulo nucleotídico con él (Figura 2B, columna 9, y Figura 3B, columna 11). No se observó aumento en la respuesta. En segundo lugar, el DNA inespecífico se coincubó con el DNA diana y con el módulo oligonucleotídico. La captura fue todavía específica y no se observó interferencia alguna a causa del DNA inespecífico (Figura 2B, columna 10; Figura 3B, columna 9). Por lo tanto la estrategia modular presenta la capacidad de capturar una diana específica sin disminución en la señal cuando ésta se expone con un DNA no relacionado. La columna 12 indica que la captura no tiene lugar cuando hay un espacio de 18 nucleótidos entre los módulos oligonucleotídicos que no son de
captura.

Efecto de los espacios entre los módulos oligonucleotídicos

En los experimentos anteriores quedaron claros los efectos perjudiciales sobre la eficiencia de la captura cuando existen espacios de 18 nucleótidos de longitud entre los módulos oligonucleotídicos (Figura 3B, columna 12) y/o en la sonda de captura inmovilizada (Figura 2B, columna 11). Para analizar con más detalle las restricciones en la estrategia de captura asistida con módulos oligonucleotídicos, se introdujeron espacios nucleotídicos unitarios entre los módulos de la sonda modular. El oligonucleótido de captura H1-11, de 11 mer, y los dos módulos oligonucleotídicos nonámeros (H4 y H1-9) se reconstruyeron y sus sitios de reasociación se desplazaron un nucleótido hacia el extremo 5' del DNA diana, y se les asignó la nueva denominación de H2, H5 y H3 respectivamente (Tabla 1). La comparación mostró que las sondas discontinuas eran capaces de capturar una diana monocatenaria, aunque con una eficiencia más baja (Figura 4A, B).

Fragmentación de oligonucleótidos largos en módulos más cortos

Este experimento se realizó para investigar mejor si la eficiencia pudiera mejorarse mediante la fragmentación de los oligónucleótidos de captura extendidos en unidades modulares más cortas. Según se ilustra en la Figura 5A (columnas 1, 2 y 3) cuando para la captura se utilizó un oligonucleótido inmovilizado de 27 mer, o cuando se utilizaron dos oligonucleótidos con una longitud total de reasociación de 27 nucleótidos, la captura de DNA fue escasa. Sin embargo, cuando esta extensión de 27 nucleótidos se fragmentó en tres nonámeros, se observó una captura muy eficiente (Figura 5A, columna 4). Esto fue posteriormente confirmado con un oligonucleótido de captura de 36 nucleótidos (C4) (Tabla 1) que no consiguió capturar eficientemente un DNA diana monocatenario Figura 5B, columna 1), mientras que el uso de módulos oligonucleotídicos y de una sonda de captura inmovilizada más corta mejora significativamente la captura (Figura 5B, columnas 2, 3 y 4).

Para investigar si este efecto se observa en otra posición del genoma del HCV (posición 2), un segundo oligonucleótido de captura de 18 mer se diseñó junto con un módulo oligonucleotídico de 18 mer. Las secuencias de los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 2.

Investigación del efecto de los módulos en la posición 2 del genoma del HCV

Un oligonucleótido de captura biotinado (OMD2) de 18 mer se inmovilizó sobre un chip sensor SA según se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 6. La inyección se un ssDNA que llevaa un módulo oligonucleotídico de 18 mer (OMD6) produjo un aumento de 400 RU (columna 2) mientras que el ssHCV solo no fue capturado (columna 1).

Conclusiones

Este ejemplo ilustra que el ssHCV es capturado en poca cantidad o no es capturado en absoluto por el oligonucleótido de 18 mer inmovilizado sobre el chip (Figura 2B, columna 1, Figura 4B, columna 3 y Figura 5B, columna 5). Cuando el ssHCV se incubó con un módulo oligonucleotídico de 18, 15, 13 ó 12 nucleótidos, se observó un aumento significativo en la captura (Figura 2B, columnas 2-5). Sin embargo, la incubación del DNA de ssHCV con un módulo oligonucleotídico de 9 mer o 5 mer no produjo un aumento en la captura (Figura 2B, columnas 6-7). Cuando un oligonucleótido de captura de 36 mer se usó en lugar del oligonucleótido de captura de 18 mer y del módulo oligonucleotídico de 18 mer, se observó una captura escasa de HCV (Figura 5B, columna 1). Estos resultados confirman de nuevo el efecto modular. La hibridación inespecífica del DNA de HCV se estudió inyectando un producto ss de PCR, de tamaño similar y no de HCV (tratado de la misma manera), sobre el oligonucleótido de captura (Figura 2B, columna 8). Se estudió la hibridación inespecífica de los módulos oligonucleotídicos y también fue descartada (Figura 2B, columna 9).

No se observó captura de DNA cuando un oligonucleótido de captura inmovilizado, de 9 mer, se usó en solitario para la captura (Figura 3B, columna 1) o se usó junto con un único módulo oligonucleotídico de 9 mer (Figura 3B, columna 2). Sin embargo, cuando los dos módulos oligonucleotídicos de 9 mer se incubaron con el DNA, se observó una captura muy eficiente por parte del oligonucleótido de 9 mer inmovilizado (Figura 3B, columna 7). Estos oligonucleótidos se reasocian en la misma posición del DNA que el oligonucleótido de captura de 18 mer acompañado con el módulo oligonucleotídico de 9 mer (Figura 2B, columna 6) pero la hibridación sólo se observa cuando se utilizan 2 módulos oligonucleotídicos en vez de 1 módulo oligonucleotídico.

Cuando se insertó un espacio de 18 y un espacio de 9 nucleótidos entre los oligonucleótidos segundo y tercero de las sondas modulares, el efecto modular quedó anulado (Figura 3B, columna 12, no se muestran los datos correspondientes al espacio de 9 nucleótidos). Para investigar mejor el efecto de insertar un espacio entre los módulos, se diseñaron tres oligonucleótidos de 9 mer con un espacio de un solo nucleótido entre ellos. Estos espacios de un solo nucleótido sí parecen producir una captura ligeramente menor del DNA de HCV pero de todos modos se obtuvieron señales de una buena hibridación, de aproximadamente de 50 a 100 RU (Figura 4B, columnas 5 y 6). El espacio entre el oligonucleótido de captura y el primero módulo oligonucleotídico (columna 5) produjo una captura ligeramente más eficiente que la del espacio entre los módulos segundo y tercero (columna 6). Un único espacio entre los módulos de una sonda modular de dos módulos produjo una captura mejorada en relación con la de la sonda no modular, pero la captura se redujo en relación con la de una sonda modular de dos módulos sin espacio entre los módulos (Figura 4B, columnas 1 y 2).

Los resultados de los experimentos en los que se utilizan sondas modulares complementarias a la posición 2, confirman de nuevo la teoría modular, ya que se observó un aumento de la señal de unas 200 veces cuando el módulo oligonucleotídico de 18 mer se hibridaba con el DNA antes de la captura por el oligonucleótido inmovilizado (Figura 6).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 2 Captura de ssDNA de HIV utilizando un oligonucleótido de captura y al menos un oligonucleótido adicional como sonda modular

Los métodos para la identificación y/o captura de un ácido nucleico diana de HIV se llevan a cabo de manera análoga a los descritos en el Ejemplo 1 para el HCV, utilizando las siguientes sondas modulares:

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en las que OMD83 y OMD82 son oligonucleótidos de captura.

Ejemplo 3 Captura de productos de secuenciación generados por el cebador USP utilizando un oligonucleótido de captura y al menos un oligonucleótido adicional como sonda modular

Los métodos para la identificación y/o captura de los productos de secuenciación generados por la extensión del cebador de secuenciación universal (USP) se llevan a cabo de manera análoga a los descritos en el Ejemplo 1 para el HCV, utilizando las siguientes sondas modulares:

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en las que JL-C1/USP + Jl-C2/USP son oligonucleótidos de captura.

Ejemplo 4 Uso de oligonucleótidos modulares para capturar DNA o RNA de HCV Materiales y métodos Bolitas magnéticas que portan el oligonucleótido de captura C1

Un oligonucleótido de captura C1, específico para el virus de la hepatitis C (Tabla 1), se acopló covalentemente a bolitas paramagnéticas (Dynal, AS). Las bolitas magnéticas (10 mg/ml) se acondicionaron lavándolas dos veces en tampón de unión/lavado (B/W) (del inglés, " Binding/Washing buffer") (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), HCl 1 mM, NaCl 2 M, \beta-mercaptoetanol 1 mM, Tween 20 al 0,1%). Para disminuir la adsorción inespecífica de los ácidos nucleicos, 1 \mug de tRNA de E. coli (Boehringer Mannheim, Alemania), se añadió a las bolitas y éstas se resuspendieron después en SSPE 6X (NaCl 0,9 M (pH 7,4), NaH_{2}PO_{4} 60 mM y EDTA 7,5 mM) hasta alcanzar una concentración final de 10 mg/ml.

Construcción de una diana recombinante de la hepatitis C

RNA de la hepatitis C se extrajo de muestras de suero procedentes de individuos infectados y se llevó a cabo una RT-PCR de la manera descrita por Yun y col., 1993 (J. Med. Virol., 39, 57-61) utilizando los cebadores OU49 y OD66 (véase el Ejemplo 1). Esta PCR generó un fragmento de 324 pb que contiene la región que no se traduce en 5' (NTR) del HCV (nucleótidos 18-341 del genoma del HCV, base de datos GenBank, Registro: M62321) que inicialmente se subclonó en el vector pGEM®-T (Promega, Madison, WI, USA) y después se insertó y se clonó entre los sitios de restricción SphI y SalI del conector de policlonación del plásmido pGEM®-4Z (Promega, Madison, WI, USA).

Preparación de DNA monocatenario y recombinante de hepatitis C

Se prepararon dianas de DNA monocatenario mediante amplificación por PCR del 5'NTR del HCV clonado en pGEM®-4Z, utilizando los cebadores OU49 y OD66 según se describe en el Ejemplo 1.

Hibridación en fase sólida (bolitas) de DNA monocatenario

El DNA diana monocatenario de diluyó en serie de razón 10 veces (DNA de HCV, desde 10^{13} hasta 10^{4} copias/ml) en un tampón que contenía tRNA de E. coli, 0,2 \mug/ml. Un procedimiento de prehibridación se ejecutó mediante incubación de 30 \mul de ssDNA a 54ºC durante 15 minutos en 100 \mul de SSPE 6X que contenían 1 \mug de tRNA de E. coli y una concentración 0,5 \muM del módulo oligonucleotídico H1-18 (Tabla 1). Se prepararon en paralelo muestras de control que no llevaban la prehibridación de este oligonucleótido. Las muestras de DNA (con y sin oligonucleótido de prehibridación) se hibridaron luego en las bolitas magnéticas previamente preparadas (que llevaban acoplado C1) incubando la mezcla de hibridación con 250 \mug de bolitas durante 1,5 horas a temperatura ambiente y con rotación constante. Después de la etapa de hibridación, las bolitas se lavaron 6 veces en tampón de B/W (y se cambiaron a un nuevo tubo Eppendorf antes de la etapa de lavado final) y se resuspendieron en 100 \mul de H_{2}O. La suspensión de las bolitas que llevaban DNA unido, o bien se utilizó inmediatamente en una PCR, o bien se almacenó a 4ºC. La amplificación por PCR se realizó con una concentración 0,2 \muM del módulo oligonucleotídico de prehibridación (H1-18) y del cebador aguas arriba (OU 49) en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, los dNTP 0,2 mM y 0,5 U de DNA-polimerasa AmpliTaq® (Perkin-Elmer, Foster City, CA). La mezcla se cubrió con 50 \mul de aceite mineral ligero (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) y 5 \mul de las bolitas resuspendidas se añadieron a través de esta capa de aceite mineral. La PCR se realizó con un termociclador Perkin-Elmer 9600 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) utilizando un perfil de temperaturas de 94ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 62ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 1 minuto y finalizando con 72ºC durante 10 minutos. Una PCR interna semi-anidada se realizó con H1-18 e IU50 (5'-GGA ACT ACT GTC TTC ACG CAG A-3') sobre 5 \mul del producto de la PCR externa, utilizando las mismas condiciones anteriores de los ciclos, excepto con una temperatura de reasociación de 55ºC. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Durante la PCR, se incluyeron múltiples controles negativos en ausencia de DNA molde. Para evitar contaminación, se utilizaron habitaciones distintas para realizar la mezcla de reactivos, la adición de la muestra y el análisis de PCR.

Preparación de RNA recombinante de hepatitis C

El plásmido purificado en el clon pGEM®-4Z que contiene la 5'-NTR de HCV, se linearizó aguas debajo de la secuencia del inserto digiriendo 5 \mug de DNA con NarI durante 6 horas a 37ºC. Se llevaron a cabo una extracción en fenol-cloroformo y una precipitación en etanol. El sedimento de DNA resultante se disolvió en 50 \mul de H_{2}O tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). La transcripción desde el promotor de T7 se llevó a cabo sobre 1,5 \mug de DNA linearizado, a 37ºC, durante 1 hora, en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía 30 Unidades de RNA-polimerasa de T7 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), Tris-HCl 40 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 30 mM, \beta-mercaptoetanol 10 mM, los dNTP 0,4 mM, 5 \mug de BSA (libre de RNasa y DNasa, Boehringer Mannheim, Alemania), DTT 10 mM y aproximadamente 40 Unidades de RNAguard Ribonuclease Inhibitor (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), y se generó un transcrito de 649 nucleótidos de longitud. Después de la transcripción, el DNA molde se fragmentó mediante una digestión con enzima de restricción (AvaI) y tratamiento con 8 unidades de DNasa I libre de RNasa (Boehringher Mannheim, Alemania) a 37ºC, durante 45 minutos. Después de una extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol, el sedimento resultante se resuspendió en 50 \mul de H_{2}O tratada con DEPC. El RNA transcrito in vitro se analizó luego por electroforesis en gel y se cuantificó midiendo la OD_{260}. El cociente OD_{260}/OD_{280} de la preparación obtenida de RNA fue 1,87 \pm 0,1. Después se prepararon series de diluciones del RNA de razón 5 veces y 10 veces, en una concentración de 10 ng/\mul de tRNA de Escherichia coli.

Análisis con biosensores de RNA recombinante de la hepatitis C

Los experimentos con biosensores se realizaron utilizando un instrumento BIAcore 2000 según se describe en el Ejemplo 1, usando C1 (Tabla 1) como módulo de captura, con la excepción de que el volumen de inyección se aumentó a 60 \mul y se inyectó a una velocidad de flujo de 30 \mul/minuto. Seis microlitros de un transcrito de RNA se prehibridaron con un módulo oligonucleotídico (H1-18) 0,5 \muM en 100 \mul de SSPE 6X mediante una incubación a 54ºC durante 15 minutos, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente. Cuarenta microlitros de esta mezcla de hibridación se inyectaron sobre el oligonucleótido de captura inmovilizado (C1) a una velocidad de flujo de 2 \mul/minuto. Las muestras que no llevaban el oligonucleótido de prehibridación se trataron exactamente de la misma manera.

Hibridación en fase sólida (bolitas) y detección de RNA recombinante de la hepatitis C

El procedimiento de captura de RNA sobre bolitas es el mismo que el explicado para la captura de DNA, concretamente, la prehibridación del módulo oligonucleotídico a 30 \mul de RNA a 54ºC durante 15 minutos, seguido de la captura sobre bolitas magnéticas (unidas a la sonda de captura C1 específica de HCV) mediante rotación a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El RNA se diluyó en serie de razón de 5 veces (desde 5x10^{7} hasta 1,6x10^{4} copias/ml) en una concentración de tRNA de E. coli de 0,2 \mug/\mul. Las bolitas que portaban el mRNA capturado se lavaron 4 veces en tampón de B/W y dos veces en tampón de RT-PCR frío (se cambiaron a un nuevo tubo Eppendorf antes de la etapa de lavado final) y se resuspendieron en 100 \mul de H_{2}O tratada con DEPC antes de ser utilizadas en la RT-PCR. Cuando la suspensión de las bolitas no se iba a utilizar inmediatamente para la RT-PCR, se almacenó a -70ºC. Durante la transcripción y captura del RNA, todo el material de vidrio y las disoluciones (con la excepción de los tampones de Tris) se trataron con DEPC para evitar una posible contaminación con RNasa. La transcripción inversa y la PCR externa se realizaron en un único tubo de ensayo. La transcripción inversa se llevó a cabo sobre 5 \mul de bolitas resuspendidas a 37ºC durante 1 hora (con rotación continua) utilizando 0,5 Unidades de Transcriptasa Inversa de MMLV, seguido de la amplificación por PCR con 2 Unidades de Ampli Taq Gold® (Perkin-Elmer, Foster City, CA) en un volumen total de reacción de 50 \mul. Las condiciones de reacción fueron las mismas que las anteriormente descritas para la PCR externa, con la adición de una etapa de precalentamiento a 94ºC durante 12 minutos para activar la Ampli Taq Gold®. Se incluyeron también 4 \mug de tRNA de E. coli para prevenir la inhibición de la actividad de la Taq polimerasa por la transcriptasa inversa (Sellner y col., 1992, Nucl. Acids Res., 20, 1487-1490). Se incluyeron controles positivos y negativos así como un control de transcriptasa no inversa. Cinco microlitros de la mezcla de la PCR externa se utilizaron en la PCR interna semi-anidada, con el módulo oligonucleotídico de prehibridación (H1-18) y el cebador aguas arriba IU50.

Captura asistida por módulos de hepatitis C en muestras de laboratorio utilizando bolitas como fase sólida

Se utilizaron muestras de suero procedentes de pacientes infectados por HCV, almacenadas a -20ºC. Se determinó el genotipo de las muestras (Yun y col., 1993, supra) y se cuantificaron utilizando un Amplicor HCV Monitor Test (Roche Molecular Systems). Inicialmente, una concentración 0,5 \muM de un módulo oligonucleotídico se prehibridó con 100 \mul de una muestra de suero en 1 ml de SSPE 6X que contenía 1 \mug de tRNA de E. coli y 500 \mul de disolución D (tiocianato de guanidina 4 M, citrato sódico 25 mM, pH 7, sarcosilo al 0,5%, \beta-mercaptoetanol 0,1 M) calentando a 60ºC durante 10 minutos, seguido de rotación a temperatura ambiente durante 45 minutos. Una de cada seis muestras fue un control negativo de un suero no perteneciente a pacientes con HCV. Las bolitas (250 \mug) que llevan C1 acoplado covalentemente, preparadas según se ha descrito anteriormente, se añadieron entonces a esta mezcla de hibridación y se sometieron a rotación a temperatura ambiente durante 1 hora para facilitar la captura. Las bolitas se lavaron luego 4 veces en 100 \mul de tampón de B/W y dos veces en 100 \mul de tampón de PCR. Las bolitas se resuspendieron en 20 \mul de H_{2}O, se calentaron a 70ºC durante 3 minutos y se colocaron inmediatamente sobre hielo. La RT-PCR se llevó a cabo utilizando 10 \mul de una suspensión de bolitas, de la manera descrita por Yun y col., (1993, supra).

Resultados Hibridación sobre bolitas magnéticas de DNA monocatenario

Con el fin de estudiar el uso de sondas modulares en la preparación de muestras del virus de la hepatitis C, mediada por bolitas magnéticas, se estableció un sistema modelo, según se representa de manera esquemática en la Figura 7. El soporte sólido de estos experimentos fueron bolitas que llevaban acoplado covalentemente una sonda (C1) de 18 mer, complementaria a la diana vírica. Un módulo oligonucleotídico de 18 mer de longitud (H1-18) se diseñó y se sintetizó de manera que se reasociara adyacente a la sonda de captura inmovilizada. El DNA monocatenario correspondiente a la región que no se traduce (NTR) en 5' de la hepatitis C, se preparó mediante amplificación in vitro y separación de las cadenas en álcali, según el procedimiento de secuenciación en fase sólida. Los moldes de DNA monocatenario cuantificados se diluyeron en serie de razón 10 veces. Se realizó una etapa de prehibridación a 54ºC durante 15 minutos, que incluía el módulo oligonucleotídico y los moldes diluidos en serie. Las mezclas de hibridación se incubaron después con bolitas magnéticas para la captura en fase sólida a temperatura ambiente durante 90 minutos. Después de la incubación las bolitas se lavaron y se transfirieron a tubos para PCR que contenían los reactivos y cebadores para una amplificación simple de la región diana de la hepatitis C. La incubación de muestras de control en ausencia del módulo oligonucleotídico en la etapa de prehibridación se realizó en paralelo. En caso de que la amplificación se produjera, se esperaba obtener un fragmento de aproximadamente 320 pb. Los resultados obtenidos después de la amplificación están representados en la Figura 8. En la parte superior del recuadro que corresponde a muestras preparadas con un módulo oligonucleotídico, puede observarse un fragmento amplificado a diluciones inferiores a la etapa de dilución que contiene aproximadamente 10^{4} moléculas de partida, mientras que en ausencia del módulo oligonucleotídico se obtiene una sensibilidad 10 veces menor aproximadamente (se observa un fragmento tenue en la etapa de dilución correspondiente a 10^{5} moléculas de partida). Esto indica el beneficio de utilizar una sonda modular en la captura asistida por bolitas.

Hibridación del RNA analizado con BIAcore

El anterior grupo de experimentos se ha centrado en el uso de DNA dianas correspondientes a la cadena positiva del genoma de RNA del virus de la hepatitis C. Por lo tanto, para poder obtener una comparación más directa con muestras reales, se generaron muestras de RNA transcritas in vitro. Después de la transcripción in vitro de una construcción plasmídica linearizada que contenía la región diana, se extrajo y se cuantificó el transcrito de 649 nucleótidos de longitud. El RNA producido se utilizó como diana en una disposición similar al anterior análisis con BIAcore de DNA monocatenario. Así, el RNA se prehibridó con un módulo oligonucleotídico (500 nmoles) como el anteriormente utilizado (H1-18, 18 mer) y después se hizo pasar sobre el oligonucleótido de captura inmovilizado (C1, de 18 mer, biotinado) sobre la superficie del chip. Una muestra de control sin el módulo oligonucleotídico se procesó en paralelo. Estas dos muestras se hicieron pasar también sobre la superficie de un chip que no llevaba oligonucleótido de captura inmovilizado y que actuó como un blanco control. Los datos resultantes se presentan en forma de un trazado superpuesto de las dos muestras substraídas en la Figura 9. Los datos indican claramente que se captura significativamente más RNA diana cuando se ha utilizado una sonda modular. También es importante destacar que las reacciones no alcanzan la saturación durante el pulso inyectado (20 min) y por lo tanto es probable que las diferencias absolutas sean aún mayores.

Hibridación y detección de RNA sobre bolitas magnéticas

Como resultado del éxito del análisis con BIAcore, el sistema modelo se evaluó también sobre bolitas magnéticas con un oligonucleótido de captura (C1) unido covalentemente. Para facilitar la comparación, el RNA molde se diluyó en serie de razón 10, como se ha descrito previamente para los DNA moldes. Las diluciones se incubaron luego a 54ºC durante 15 minutos con la sonda de 18 mer (H1-18) en forma de módulo oligonucleotídico, seguido de una incubación posterior con bolitas magnéticas, a temperatura ambiente durante 90 minutos. Muestras de control sin H1-18 se procesaron en paralelo. Después de una etapa de lavado, en las muestras se llevó a cabo una RT-PCR en un tubo único. Los resultados se presentan en la Figura 10 y muestran un fragmento tenue en la dilución correspondiente a aproximadamente 10^{4} moléculas de RNA de partida, mientras que en ausencia de módulo oligonucleotídico se obtiene una sensibilidad aproximadamente 10 veces menor. Para estudiar mejor las diferencias cuantitativas, una serie de diluciones más próximas (de razón 5 veces) se utilizó en un experimento de RT-PCR interna (anidada). La PCR interna (anidada) permite obtener una comparación en el nivel de meseta de la PCR en el que todas las diluciones han alcanzado la saturación independientemente del número de copias de partida. La Figura 11 muestra que con una sonda en forma de módulo oligonucleotídico, pueden detectarse 140 copias de RNA de partida, mientras que en ausencia de la sonda en forma de módulo oligonucleotídico se requieren 700 copias para la detección. Estos resultados coinciden plenamente con los obtenidos utilizando moldes de DNA monocate-
narios.

Detección de hepatitis C en muestras de laboratorio utilizando la captura asistida por módulos

Los resultados alentadores obtenidos con estos dos sistemas modelo basados en dianas de DNA o de RNA, indicaron que las sondas modulares mejoraban la captura sobre la superficie de un chip o sobre una partícula sólida. Esto condujo a los autores del invento a evaluar la estrategia en muestras de laboratorio que contenían el virus de la hepatitis C. En primer lugar se analizaron dos muestras positivas a HCV (utilizando una estrategia similar a la anteriormente descrita) diluyendo las muestras en serie de razón 5 veces, seguido de una incubación en una disolución desnaturalizante que contenía 500 mmoles del módulo oligonucleotídico, a 60ºC durante 10 minutos. Estas muestras se incubaron luego a temperatura ambiente durante 45 minutos antes de la adición de las bolitas que llevaban acoplada covalentemente la sonda de captura, y se incubaron de nuevo a temperatura ambiente durante 60 minutos. Después de lavadas, las bolitas se transfirieron directamente a los tubos de RT-PCR según se ha descrito anteriormente. La Figura 12 expone una de las dos muestras en presencia y ausencia de un módulo oligonucleotídico y confirma la misma tendencia anteriormente demostrada, es decir, que la inclusión de un módulo oligonucleotídico mejora la ejecución de la captura. Asimismo, después de una amplificación adicional de estas dos muestras diluidas en serie, utilizando cebadores internos, se obtiene un valor absoluto aproximado que indica una sensibilidad hasta 25 veces más alta cuando se utiliza el módulo oligonucleotídico (datos no mostrados).

Por último, un total de 19 muestras de laboratorio se analizaron luego utilizando la estrategia descrita. Todas estas muestras habían sido previamente cuantificadas por medio de un ensayo comercial (Amplicor HCV Monitor Test, Roche). En 5 de estas 14 muestras, también fue posible hacer la comparación en presencia y ausencia de módulo oligonucleotídico. Los resultados están representados en la Tabla 3 y muestran una buena correlación entre el ensayo comercial y la captura asistida por módulos para todos los títulos del virus. Curiosamente, en una de las cinco muestras que se compararon, la captura vírica no tuvo lugar cuando se omitió la presencia del módulo oligonucleotídico. Esto confirma la tendencia observada con los sistemas modelos y demuestra realmente que la etapa de prehibridación aumenta también la sensibilidad de la detección en el caso de muestras de laboratorio.

Discusión

Este estudio muestra la utilidad de los oligonucleótidos modulares en la captura de moldes monocatenarios. Curiosamente, esta utilidad no se limita sólo a fragmentos cortos como los utilizados en el sistema modelo de los autores del invento, sino que también los genomas completos de la hepatitis C son capturados de manera más eficiente. No se observa ninguna diferencia entre DNA dianas y RNA dianas lo que pudiera esperarse debido a sus diferentes estructuras químicas. Por el contrario, se exhibieron patrones de captura idénticos cuando los ensayos se realizaron en presencia y ausencia de un módulo oligonucleotídico.

Estudios preliminares han sugerido también que el protocolo para la captura vírica podría acortarse combinando la prehibridación, la lisis de las muestras (en tiocianato de guanidina) y la captura con bolitas en una sola etapa. De esta manera solamente se requiere una etapa de lavado antes de la RT-PCR, haciendo al sistema muy atractivo para las estrategias automatizadas.

TABLA 3 Sumario de los resultados obtenidos utilizando muestras de laboratorio

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Ejemplo 5 Captura del virus HIV-1 asistida por módulos oligonucleotídicos

Se describen experimentos basados en un sistema modelo constituido por un fragmento clonado del genoma de HIV-1, la región pol (Tabla 4). La región pol es una diana frecuentemente utilizada en diferentes sistemas de diagnóstico para la detección y cuantificación del virus HIV-1.

Materiales y métodos Construcción de una diana recombinante de HIV y preparación de DNA monocatenario de HIV

Se llevó a cabo una PCR de la cepa provírica HIV-1_{MN} (Myers y col., 1991, Human Retrovirus and AIDS 1991, Los Alamos National Laboratory, Los Álamos, Nuevo Méjico), utilizando los cebadores JA 79 y TV 84 específicos de POL (Tabla 4). Esta PCR generó un fragmento de 378 pb que se clonó en el vector pGEM®-T. Se preparó DNA monocatenario mediante amplificación por PCR de este gen POL clonado utilizando los cebadores RIT 28 y RIT 29 específicos del vector. El fragmento biotinado resultante de 800 pb se sometió a una elución específica de cadena según se describe en el Ejemplo 1.

Análisis con biosensor de DNA recombinante de HIV

Un oligonucleótido biotinado específico de HIV (OMD82, véase el Ejemplo 2) se inmovilizó sobre un chip sensor, seguido de la inyección de 40 \mul de DNA monocatenario de HIV, prehibridado a OMD 81 (según se ha descrito para la diana de HCV). Una muestra de control en ausencia de módulo oligonucleotídico se procesó en paralelo. La secuencia diana en este caso es

5'-TCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGG-3' que corresponde a los nucleótidos 473-509 del genoma de HIV-1.

TABLA 4 Cebadores de PCR

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Resultados

Las dianas pol de DNA monocatenario se generaron de manera similar al del caso de la hepatitis C; es decir, con una elución específica de cadena de amplicones de PCR biotinados, utilizando bolitas magnéticas revestidas con estreptavidina. Las dianas de DNA monocatenario resultantes se inyectaron sobre la superficie de un chip sensor que contenía una secuencia de una sonda complementaria y la interacción de midió en tiempo real con el sistema del biosensor. Los experimentos de realizaron en presencia y ausencia de módulo oligonucleotídico. Los resultados (Figura 13) muestran de nuevo que las sondas modulares potencian la captura, según se determina por el trazado superpuesto resultante del experimento con biosensor.

Claims (18)

1. Un método para detectar y/o aislar una molécula de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho método al menos las etapas de unir un oligonucleótido modular complementario, de dos o tres partes (módulos), a extensiones justamente adyacentes de dicha molécula de ácido nucleico diana presente en dicha muestra, y detectar y/o aislar la molécula de ácido nucleico diana unida a dicho oligonucleótido, en el que cada módulo tiene > 5 \leq 13 nucleótidos, en el que dicho oligonucleótido modular exhibe una unión mejorada en relación con la de un oligonucleótido individual compuesto, complementario con la región de la molécula diana abarcada por el oligonucleótido modular, en el que al menos uno de los módulos (módulo de captura) está inmovilizado o tiene un medio de inmovilización, y en el que en los métodos de aislamiento, el módulo de captura permite obtener dicho aisla-
miento.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que cada módulo tiene \geq 9 \leq 13 nucleótidos.

3. Un método según la reivindicación 1, en el que cada módulo tiene > 5 \leq 9 nucleótidos.

4. Un método según la reivindicación 1, en el que cada módulo tiene 9, 11 ó 13 nucleótidos.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que dicho oligonucleótido modular está constituido por un total de al menos 18 nucleótidos.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que dicho oligonucleótido modular está constituido por el módulo de captura y módulos moduladores, y dichos módulos moduladores se adicionan a, o se ponen en contacto con, una muestra que contiene las moléculas del ácido nucleico diana, antes de la adición del módulo de captura libre o inmovilizado.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que la inmovilización se hace a través de un sistema de unión de estreptavidina: biotina.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que al menos uno de los módulos está marcado.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, que comprende las etapas de:

1) poner en contacto la muestra que contiene el ácido nucleico diana con todos los módulos del oligonucleótido modular;

2) unir dichos módulos mediante hibridación;

3) añadir un soporte sólido y unir al menos uno de dichos módulos provisto con un medio de inmovilización a dicho soporte sólido;

4) separar el ácido nucleico diana unido a dicho soporte sólido;

5) lavar dicho soporte sólido;

6) amplificar dicho ácido nucleico diana; y

7) determinar la presencia o cantidad de ácido nucleico amplificado.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9, en el que la extensión de la unión se determina por medio del cambio en el índice de refracción en la superficie de un sensor.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, para detectar y/o aislar un ácido nucleico de HCV, en el que dicho oligonucleótido modular comprende una de las siguientes secuencias de nucleótidos:

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o sus análogos o derivados en los que las bases nucleotídicas están modificadas o son bases derivadas.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, para detectar y/o aislar productos de la extensión de los cebadores.

13. Un método según la reivindicación 12, para detectar y/o aislar productos de secuenciación.

14. Un método según la reivindicación 12 ó 13, en el que dicho oligonucleótido modular comprende una de las siguientes secuencias de nucleótidos:

15

o sus análogos o derivados en los que las bases nucleotídicas están modificadas o son bases derivadas.

15. Un método según la reivindicación 11 ó 14, en el que el último módulo listado del oligonucleótido modular es el módulo de captura.

16. Un oligonucleótido modular como el definido en la reivindicación 11 ó 14.

17. El uso de un oligonucleótido modular como el definido en la reivindicación 16, en un método según el definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 15.

18. Un kit para realizar el método definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 15, que comprende al menos lo siguiente:

un oligonucleótido modular según el definido en la reivindicación 11 ó 14, en el que preferiblemente, al menos uno de los módulos está marcado para permitir la detección del ácido nucleico diana.