ES2231808T3 - Marcadores geneticos para cancer de mama y ovario. - Google Patents
Marcadores geneticos para cancer de mama y ovario.Info
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Abstract
SE UTILIZAN MUTACIONES BRCA1 ESPECIFICAS, CEBADORES DE PCR Y SONDAS DE HIBRIDACION EN PROCEDIMIENTOS BASADOS EN ACIDOS NUCLEICOS PARA EL DIAGNOSTICO DE LA SUSCEPTIBILIDAD DE CANCER DE MAMA HEREDITARIO. ADEMAS, SE UTILIZAN AGENTES DE UNION, TALES COMO ANTICUERPOS, ESPECIFICOS PARA LOS PEPTIDOS CODIFICADOS POR LOS MUTANTES BRCA1 DESCRITOS, PARA IDENTIFICAR PRODUCTOS DE EXPRESION DE MUTACIONES DE DIAGNOSTICOS/ALELOS RAROS EN MUESTRAS DE FLUIDO O TEJIDO DERIVADAS DE UN PACIENTE. SE UTILIZAN COMPOSICIONES CON UNA ELEVADA AFINIDAD DE UNION PARA LOS PRODUCTOS DE TRANSCRIPCION O TRADUCCION DE LAS MUTACIONES BRCA1 DESCRITAS Y LOS ALELOS, EN INTERVENCIONES TERAPEUTICAS. ESTOS PRODUCTOS INCLUYEN ACIDO NUCLEICOS ANTI POR LOS ACIDOS NUCLEICOS DESCRITOS, Y AGENTES DE UNION TALES COMO ANTICUERPOS, QUE SON ESPECIFICOS PARA TALES PEPTIDOS.
Description
Marcadores genéticos para cáncer de mama y
ovario.
El campo de la invención es el de los marcadores
genéticos para la sensibilidad al cáncer de mama hereditario.
La mayor proporción de cáncer de mama hereditario
descrito hasta ahora ha sido atribuido a un locus genético, el locus
BRCA1, en el cromosoma 17q21 (Hall et al. 1990
Science 250:1684-1689; Narod et al.
1991 Lancet 338:82-83; Easton et al.
1993 Am. J. Hum. Genet. 52:678-701). El
material de los antecedentes en los marcadores genéticos para la
identificación del cáncer de mama se encuentra en la publicación de
Science de 29 de enero de 1993, vol. 259, en especial en las
páginas 622 a 625; véase también King et al., 1993 J.
Amer. Med. Assoc. 269:1975-198. Otros artículos
de investigación relacionados incluyen King (1992) Nature
Genet. 2:125-126; Merette et al. (1992)
Amer. J. Human Genet. 50:515-519; NIH/CEPH
Collaborative Mapping Group (1992) Science
258:67-86.
Los riesgos del cáncer de mama en las mujeres que
heredan el locus son sumamente altos, excediendo del 50% antes de la
edad de 50 años y alcanzando el 80% a la edad de 65 (Newman et
al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:3044-3048; Hall et al. 1992 Amer. J.
Human Genet. 50:1235-1242; Easton et al.
1993). La prueba epidemiológica para la sensibilidad hereditaria al
cáncer de ovario es aún más fehaciente (Cramer et al. 1983
J. Natl. Cancer Inst. 71:711-716; Schildkraut
y Thompson 1988 Amer. J. Epidemiol.
128:456-466; Schildkraut et al. 1989 Amer.
J. Hum. Genet. 45:521-529). Según un estudio,
más del 90% de las familias con varios familiares con cáncer de
mama y de ovario presentan indicios de sensibilidad a la enfermedad
en el cromosoma 17q21 (Easton et al. 1993).
La conexión entre el riesgo creciente de cáncer
de mama y de ovario y la sensibilidad hereditaria a estas
enfermedades se basa en la aplicación de genética al diagnóstico y
a la prevención. La creación de herramientas moleculares para el
diagnóstico precoz y las vías de desarrollo para anular las
primeras etapas de la tumorigénesis pueden ser el medio más eficaz
de controlar el cáncer de mama y de ovario.
El laboratorio de los solicitantes cartografió
previamente el locus del gen de la sensibilidad hereditaria al
cáncer de mama (locus BRCA1) en una zona de 50 cM del cromosoma 17q
(Hall et al. 1990). Más recientemente, los solicitantes
desarrollaron nuevos polimorfismos en ERBB2 (Hall y King 1991
Nucl. Acids Res. 19:2515), THRA1 (Bowcock et al. 1993
Amer. J. Human Genet. 52:718-722), EDH17B
(Friedman et al. 1993 Hum. Molec. Genet. 2:821) y
muchos locus anónimos (Anderson et al. 1993 Genomics
17:616-623), desarrollando por último una
cartografía de alta densidad de 17q12-q21 (Anderson
et al. 1993; véase también, Simard et al. 1993
Human Molec. Genet. 2:1193-1199). Los
solicitantes añadieron asimismo familias al estudio genético;
existen ahora 100 familias para las cuales se han establecido
líneas de linfocitos transformados y todas las informaciones
relativas genotipadas. Se utilizaron nuevos marcadores de los
solicitantes y muchos polimorfismos del cromosoma 17q desarrollados
en los pasados tres años para probar la conexión en las familias de
los solicitantes, purificando la primera zona a 8 cM (Hall et
al. 1992), a continuación a 4 cM (Bowcock et al. 1993), a
continuación a 1 Mb basado en los polimorfismos de la cartografía
de alta densidad de los solicitantes (Anderson et al. 1939;
véase también Flejter et al., 1993 Genomics
17:624-631). Se da a conocer en esta memoria un
número de mutaciones en BRCA1 que se correlacionan con la
enfermedad.
La secuencia de aminoácidos predicha para un ADNc
de BRCA1 y los estudios familiares de este gen fueron descritos por
Miki et al. (1994) Science 266, 66-71
y Futeal et al. (1994) Science 266,
120-122. Un estudio de familias con cáncer
canadienses se describe en Simard et al. (1994) Nature
Genetics 8, 392-398. Un sondeo colaborador de
las mutaciones de BRCA1 se describe en
Shattuch-Eidens et al. (1995) JAMA
273, 535-541.
La invención da a conocer métodos, ácidos
nucleicos y productos para la traducción útiles para el diagnóstico
y tratamiento del cáncer de pecho y de ovario relacionados con las
mutaciones y/o alelos raros de BRCA1, gen con sensibilidad al
cáncer de mama. Se proporciona diagnóstico con sondas genéticas
específicas de la sensibilidad hereditaria al cáncer de mama y
métodos de utilización. Las sondas de ácido nucleico marcadas que
comprenden secuencias complementarias a los alelos de BRCA1
específicos están hibridadas con muestras clínicas de ácido
nucleico. Los análisis de acoplamiento y los modelos hereditarios
de los marcadores dados a conocer se utilizan para diagnosticar la
sensibilidad genética. Además, las mutaciones de BRCA1 y/o de
alelos raros se identifican directamente por hibridación,
polimorfismo y/o análisis de secuencias. En otra realización, los
anticuerpos marcados específicos para los péptidos codificados por
los ácidos nucleicos en cuestión se utilizan para identificar los
productos de expresión de las mutaciones para diagnóstico o los
alelos en el fluido procedente del paciente o en muestras de
tejido. Para la intervención terapéutica, existen composiciones
proporcionadas que pueden interferir funcionalmente con los
productos de transcripción o de traducción de las mutaciones
asociadas a la sensibilidad al cáncer de mama y de ovario y/o a
alelos raros en BRCA1. Tales productos incluyen los ácidos
nucleicos con cadena complementaria, los péptidos competitivos
codificados por los ácidos nucleicos en cuestión y los anticuerpos
específicos para p. ej., los productos de traducción de las
mutaciones de BRCA1 y de los alelos dados a conocer.
Se da a conocer en esta memoria métodos y
composiciones para determinar la presencia o ausencia de mutaciones
de BRCA1 y alelos raros o productos de traducción de los mismos que
son útiles para el diagnóstico de la sensibilidad al cáncer de mama
y de ovario. Los alelos tumorígenos de BRCA1 incluyen el alelo
BRCA1 nº 5803 (SEQ. ID nº: 1), nº 9601 (SEQ. ID nº: 2), nº 9815
(SEQ. ID nº: 3), nº 8403 (SEQ. ID nº: 4), nº 8203 (SEQ. ID nº: 5),
nº 388 (SEQ. ID nº: 6), nº 6401 (SEQ. ID nº: 7), nº 4406 (SEQ. ID
nº: 8), nº 10201 (SEQ. ID nº: 9), nº 7408 (SEQ. ID nº: 10), nº 582
(SEQ. ID nº: 11) o nº 77 (SEQ. ID nº: 12). Estos ácidos nucleicos o
fragmentos capaces de hibridarse únicamente con el correspondiente
alelo en presencia de otros alelos de BRCA1 en condiciones
restringidas hallan amplia aplicación de diagnóstico y terapéutica.
Los productos génicos del mutante descrito y/o de los alelos de
BRCA1 raros también hallan una amplia gama de aplicaciones
terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, el mutante y/o los
péptidos de BRCA1 alélicos raros se utilizan para generar
anticuerpos. Los anticuerpos se utilizan en el diagnóstico para
distinguir los productos naturales no tumorígenos y los de
traducción de BRCA1 tumorígenos.
Los ácidos nucleicos en cuestión (incluyendo sus
fragmentos) pueden ser de una sola o de dos cadenas y están
aislados, parcialmente purificados y/o recombinados. Un ácido
nucleico "aislado" está presente aparte de un cromosoma o
transcripción natural en su estado natural y aislado de (no unido en
secuencia a) al menos un nucleótido con el que normalmente está
asociado en un cromosoma natural; un ácido nucleico parcialmente
puro constituye al menos aproximadamente 10%, preferentemente al
menos aproximadamente 30% y más preferentemente al menos
aproximadamente 90% en peso del ácido nucleico total presente en una
fracción dada; y se une un ácido nucleico recombinado en la
secuencia con al menos un nucleótido con el que normalmente no está
asociado en un cromosoma natural.
Los fragmentos de los alelos dados a conocer son
suficientemente largos para utilizar como sondas de hibridación
específica para detectar alelos endógenos y particularmente para
distinguir los alelos raros o mutantes críticos descritos que se
correlacionan con la sensibilidad al cáncer de otros alelos de
BRCA1, incluyendo los alelos que codifican el producto de
traducción de BRCA1 presentado en Miki et al. (1994)
supra, en condiciones restrictivas. Los fragmentos
preferidos son capaces de hibridarse en el correspondiente alelo
mutante en condiciones de restricción caracterizadas por un tampón
de hibridación que comprende 0% de formamida en tampón de solución
salina 0,9 M/citrato de sodio 0,09 M (SSC) a una temperatura de
37ºC y continuar unidos cuando se someten a lavado a 42ºC con el
tampón SSC a 37ºC. Los fragmentos más preferidos se hibridarán en
un tampón de hibridación que comprende 20% de formamida en tampón
de solución salina 0,9 M/citrato de sodio 0,09 M (SSC) a una
temperatura de 42ºC y continuando unidos cuando se someten a lavado
a 42ºC con el tampón 2 \times SSC a 42ºC. En cualquier caso, los
fragmentos son necesariamente de longitud suficiente para ser
exclusivos para el correspondiente alelo; es decir, tiene una
secuencia de nucleótidos al menos lo bastante larga para definir un
nuevo oligonucleótido, normalmente al menos aproximadamente de 14,
16, 18, 20, 22 ó 24 bp de longitud, aunque dicho fragmento se puede
unir en la secuencia a otros nucleótidos que pueden ser nucleótidos
que flanquean de forma natural el fragmento.
En muchas aplicaciones, se marcan los ácidos
nucleicos con señales o medios directa o indirectamente detectables
para amplificar una señal detectable. Los ejemplos incluyen
radiomarcadores, marcas luminiscentes (p. ej. fluorescentes),
componentes de marcas amplificadas tales como anticuerpo marcado con
antígeno, combinaciones biotina-avidina, etc. Los
ácidos nucleicos se pueden someter a purificación, síntesis,
modificación, secuenciado, recombinación, incorporación a una
variedad de vectores, expresión, transfección, administración o a
los métodos de utilización dados a conocer en los manuales
habituales tales como Molecular Cloning, A Laboratory Manual
(2ª ed., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor),
Current Protocols in Molecular Biology (eds. Aufubel, Brent,
Kingston, More, Feidman, Smith y Stuhl, Greene Publ. Assoc.,
Wiley-Interscience, NY, NY, 1992) o que son
conocidos de otra manera en la técnica.
Los ácidos nucleicos en cuestión se utilizan en
una amplia variedad de métodos de diagnóstico basados en ácidos
nucleicos que son conocidos por los expertos en la técnica. Los
métodos ejemplares incluyen su utilización como sondas de
oligonucleótido específicas para el alelo (ASO), en los métodos
mediados por ligasa para detectar mutaciones, como cebadores en los
métodos basados en PCR, métodos de secuenciado directos en los que
la secuencia de ácido nucleico de BRCA1 clínico se compara con las
mutaciones descritas y con alelos raros, etc. Los ácidos nucleicos
en cuestión son capaces de detectar la presencia de un mutante
crítico o de un alelo de BRCA1 raro en una muestra y distinguir el
mutante o alelo raro de otros alelos de BRCA1. Por ejemplo, cuando
los ácidos nucleicos en cuestión se utilizan como cebadores de PCR
o sondas de hibridación, el cebador o sonda objeto comprende un
oligonucleótido complementario con una cadena del mutante o del
alelo raro de longitud suficiente para hibridarse únicamente con el
mutante o alelo raro. En general, estos cebadores y las sondas
comprenden al menos 16 bp a 24 bp complementarios con el mutante o
alelo raro y pueden ser tan grandes como sea conveniente para las
condiciones de hibridación.
Cuando la mutación crítica es una deleción de
secuencia natural, los cebadores/sondas útiles requieren secuencias
naturales flanqueando (ambos lados) de la deleción con al menos 2,
normalmente al menos 3, más frecuentemente al menos 4, aún con
mayor frecuencia al menos 5 bases. Cuando la mutación es una
inserción o sustitución que excede de aproximadamente 20 bp, no es
generalmente necesario incluir la secuencia natural en las
sondas/cebadores. Para las inserciones o sustituciones de menos de
5 bp, las partes preferidas del ácido nucleico comprenden y
flanquean la sustitución/inserción con al menos 2, preferentemente
al menos 3, más preferentemente al menos 4 aún más preferentemente
al menos 5 bases. Para las sustituciones o inserciones de
aproximadamente 5 a aproximadamente 20 bp, normalmente es necesario
incluir tanto la inserción/sustitución completa como al menos 2,
normalmente al menos 3, más frecuentemente al menos 4, con la máxima
frecuencia al menos 5 bases de la secuencia natural de al menos un
flanco de la sustitución/inserción.
Además de su utilización como sondas y cebadores
genéticos para diagnóstico, los ácidos nucleicos de BRCA1 se
utilizan para efectuar varias genoterapias. Véase, p. ej. Zhu et
al. (1993) Science 261, 209-211;
Gutiérrez et al. (1992) Lancet 339,
715-721; Gary Nabel lab (Dic. 1993), Proc. Nat'l.
Acad. Sci. USA. Por ejemplo, se utilizan ácidos nucleicos
terapéuticos para modular la expresión celular o la concentración
intracelular o la disponibilidad de un producto de traducción de
BRCA1 tumorígeno introduciendo en las células complementos de los
ácidos nucleicos descritos. Estos ácidos nucleicos son normalmente
de cadena complementaria: secuencias de una sola cadena que
comprenden complementos del mutante de BRCA1 relacionado descrito.
La modulación de la cadena complementaria de la expresión de un
mutante dado puede emplear ácidos nucleicos con cadena
complementaria ligados funcionalmente a las secuencias reguladoras
del gen. Se transfectan células con un vector que comprende dicha
secuencia con una secuencia del activador orientada de modo que la
transcripción del gen da un transcrito de cadena complementaria
capaz de unirse al alelo endógeno de BRCA1 tumorígeno o al
transcrito. La transcripción del ácido nucleico de cadena
complementaria puede ser constitutiva o inducible y el vector puede
proporcionar mantenimiento o integración extracromosómica estable.
Por otra parte, los ácidos nucleicos con cadena complementaria de
una sola cadena que se unen al ADN o al ARNm genómico se pueden
administrar a una célula diana, en o aislada temporalmente de un
anfitrión, a una concentración que produce una reducción sustancial
en la expresión del producto de traducción
dirigido.
dirigido.
Se pueden emplear varias técnicas para introducir
los ácidos nucleicos en las células viables. Las técnicas varían
dependiendo de si se está utilizando las composiciones objeto en
cultivo o in vivo en un anfitrión. Varias técnicas que se ha
observado que son eficaces incluyen la transfección con un
retrovirus, la transfección mediada por
proteína-liposoma de cabra vírica, véase Dzau et
al., Trends in Biotech 11, 205-210
(1993). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente
de ácido nucleico con un agente que dirija las células diana, tal
como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana de la
superficie en la célula diana, un ligando para un receptor en la
célula diana, etc. Cuando se emplean liposomas, se pueden utilizar
las proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la
superficie asociada a endocitosis para dirigir y/o facilitar la
absorción, p. ej. las proteínas de cápsido o sus fragmentos
trópicos para un tipo de célula determinado, los anticuerpos para
proteínas que experimentan interiorización en la ciclación,
proteínas que dirigen la localización intracelular y aumentan la
vida media intracelular. En los liposomas, la concentración de
señuelo en el lumen estará comprendida en general en el intervalo
de aproximadamente 0,1 \muM a 20 \muM. Para otras técnicas, la
frecuencia de aplicación se determina experimentalmente, utilizando
técnicas convencionales para determinar los intervalos deseados.
Normalmente, la aplicación de las terapias en cuestión será local,
con el fin de que sea administrada en el punto de interés. Se pueden
utilizar varias técnicas para proporcionar las composiciones en
cuestión en el punto de interés, tal como inyección, utilización de
catéteres, trocares, proyectiles, gel plurónico, endoprótesis
vasculares, polímeros de liberación lenta del fármaco u otro
dispositivo que proporcione acceso interno. También se puede
emplear la administración generalizada del ácido nucleico utilizando
lipofección y liposomas con direccionamiento al tejido (p. ej.
anticuerpo).
Se proporciona asimismo productos aislados de la
traducción de los alelos de BRCA1 expuestos que se distinguen del
producto del gen BRCA1 natural. Por ejemplo, para los alelos que
codifican el producto de traducción tumorígeno truncado, para
diferenciar BRCA1 natural se utiliza el terminal C. Por
consiguiente, se proporciona el producto de traducción del alelo de
BRCA1 nº 5803 (SEQ. ID nº: 13), nº 9601 (SEQ. ID nº: 14), nº 9815
(SEQ. ID nº: 15), nº 8203 (SEQ. ID nº: 17), nº 388 (SEQ. ID nº: 18),
nº 6401 (SEQ. ID nº: 19), nº 4406 (SEQ. ID nº: 20), nº 10201 (SEQ.
ID nº: 21), nº 7408 (SEQ. ID nº: 22), nº 582 (SEQ. ID nº: 23) o nº
77 (SEQ. ID nº: 24), o uno de sus fragmentos con terminal C
exclusivo para el alelo y el del nº 8403 (SEQ. ID nº: 16) o uno de
sus fragmentos exclusivo para el alelo que comprende Gly en la
posición 61.
El mutante objeto y/o los productos de traducción
alélicos raros de BRCA1 comprenden una secuencia de aminoácidos que
proporciona una diana para distinguir el producto del de otros
alelos de BRCA1. Los fragmentos preferidos son capaces de obtener
la producción de un anticuerpo específico para el péptido, in
vivo o in vitro, capaces de distinguir una proteína que
comprende el péptido inmunógeno de un producto de traducción de
BRCA1 natural. Los fragmentos son necesariamente exclusivos para el
producto de traducción del alelo expuesto en los que no se
encuentra en ninguna proteína conocida anteriormente y tiene una
longitud al menos lo bastante larga para definir un nuevo péptido,
desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 25 restos,
preferentemente de 6 a 10 restos de longitud, dependiendo de la
secuencia de aminoácido concreta.
Los productos de traducción en cuestión
(incluyendo los fragmentos) están aislados, es decir no acompañados
al menos por algunos de los materiales con los que se asocian en
estado natural); parcialmente purificados, es decir constituyendo
al menos aproximadamente el 1%, preferentemente, al menos
aproximadamente 10% y más preferentemente al menos aproximadamente
50% en peso del producto de traducción total en una muestra dada; o
puro, es decir al menos aproximadamente 60%, preferentemente al
menos 80% y más preferentemente al menos aproximadamente 90% del
peso del producto de traducción total. Están incluidos en el peso
de producto de traducción en cuestión algunos átomos, moléculas,
grupos, etc., acoplados por enlace covalente a los productos de
traducción en cuestión, tales como marcadores detectables,
glucosilaciones, fosforilaciones, etc. Los productos de traducción
en cuestión se pueden aislar, purificar, modificar o unir a otros
compuestos en varias formas conocidas por los expertos en la
técnica dependiendo de que estén presentes otros componentes en la
muestra y de que, si hay alguno, el producto de traducción esté
acoplado por enlace covalente.
Los anticuerpos específicos para los genes con
BRCA1 tumorígenos descritos y los productos génicos encuentran uso
particular en el diagnóstico del cáncer. El método seleccionado de
diagnóstico dependerá de la naturaleza de los mutantes de BRCA1
tumorígenos/alelo raro y de su(s) producto(s) de
transcripción o traducción. Por ejemplo, los productos solubles de
la traducción segregados de los alelos expuestos se pueden detectar
en varios fluidos fisiológicos utilizando un anticuerpo con un
marcador detectable tal como un radiomarcador, fluorescente, etc. La
detección de los productos unidos a la membrana o intracelulares
requiere en general el aislamiento previo de las células (p. ej.
células sanguíneas) o del tejido (p. ej. tejido de biopsia de
mama). Se puede utilizar una amplia variedad de análisis de
fijación específicos, p. ej. ELISA.
El mutante y/o los productos de traducción de
BRCA1 alélicos raros expuestos se utilizan como inmunógenos para
generar anticuerpos policlonales o monoclonales específicos. Véase,
Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, para métodos generales. Los anticuerpos
específicos se modifican fácilmente en una forma monovalente, tal
como Fab, Fab' o Fv.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a título de
ilustración y no a título de limitación.
YAC. Se utilizaron cebadores que flanquean
repeticiones polimórficas en la zona de 4 Mb de acoplamiento para
ampliar los grupos procedentes de los bancos CEPH, Universidad de
Washington y de CEPH megaYAC disponibles. Se seleccionaron 39 YAC.
De éstos, se probaron 23 para hibridación por FISH y se observó que
12 eran híbridos. Se alinearon los YAC entre sí para intentar
ampliar cada YAC con los pares de cebador de los puntos marcados
con la secuencia conocida (STSes). Se definieron más STSes
secuenciando los extremos de los YAC y estos nuevos STSes se
utilizaron para alineación adicional e identificación de YAC.
Cósmidos. Se preparó un banco de cósmido
reticulado del cromosoma 17. Los productos de PCR
Alu-Alu de los YAC se hibridaron con las parrillas
del cósmido y los cósmidos de hibridación positiva se utilizaron
para estudios posteriores. Se construyeron cóntigos de dos maneras.
Se alinearon cósmidos con los mismos modelos de restricción y, se
utilizaron como STSes las secuencias exclusivas que flanquean los
marcadores polimórficos y los ADNc secuenciados de los
solicitantes.
Cartografía física por electroforesis de gel
en campo pulsado. Se estimaron las distancias físicas por
electroforesis de gel en campo pulsado, utilizando ADN de líneas
celulares de linfocito de pacientes ligados a BRCA1 y de
referencias. Se digerieron las muestras de ADN con NotI, MluI,
RsrII, NruI, SacII y EcIXI. Se sondaron los filtros con secuencias
de una sola copia aisladas a partir de cósmidos y después con
clones de ADNc. Se identificaron varios pacientes ligados no
emparentados y referencias para detectar inserciones o deleciones
grandes asociadas a BRCA1. Se utilizaron los resultados de PFGE para
definir la primera zona utilizada para identificar bancos de ADNc
como \sim 1 Mb y la zona acoplada actual \leq 500 kb.
Identificación de bancos de ADNc. Se
comenzó la identificación del banco cuando la zona acoplada
definida por la recombinación meiótica era \sim 1 Mb. La primera
cuestión fue qué banco optimizaría la longitud de los clones de
ADNc, representación de ambos terminales 5' y 3' de los genes y las
posibilidades de que se expresase BRCA1. Se eligió utilizar un
banco de ADNc cebado al azar clonado en lgt10 procedente de
fibroblastos cultivados (no transformados) de una mujer. Se
seleccionó este banco porque tenía inserciones de 1,8 kb de
promedio, con 80% de inserciones entre 1 y 4 kb, se construye a
partir de fibroblastos cultivados conocidos que eran
"defectuosos" en la expresión del gen y se conocía que incluían
terminales 5' de los genes. Se cribó simultáneamente otros tres
bancos (de ovario, cerebro fetal y epitelio mamario de ratón). Con
una excepción (descrita a continuación), todas las transcritos de
estos bancos se hibridaron con cruce en transcritos del banco de
fibroblastos.
Se cribó el banco de fibroblastos con ADN de YAC
aislado por PFGE. Se cebó al azar ADN de YAC puro (100 nanogramos)
tanto con aP32-dATP (6000 mCi/mmol) como con
^{32}P-dCTP (3000 mCi/mmol) y se usaron
inmediatamente después del marcado. Los filtros del banco se
hibridaron previamente con ADN de placenta humana durante 24 a 48
horas. El ADN de YAC marcado se hibridó con los filtros durante 48
horas a 65ºC. Se seleccionaron 250 transcritos aproximadamente
cribando con 7 YAC y a continuación se hibridaron por cruce. Se
utilizó también grupos de cósmidos de la zona ligada para cribar el
banco de fibroblastos. Se seleccionó 122 transcritos y se
hibridaron por cruce con los clones detectados previamente por los
YAC.
Se identificaron al principio 24 genes en la zona
BRC1 de 1 Mb definida por la recombinación meiótica, las posiciones
respectivas del cóntigo de YAC, los puntos de los clones de ADNc
representativos, los números de las réplicas en el banco, los
tamaños de las transcripciones, las homologías con los genes
conocidos y las variantes detectadas. Se caracterizaron genes
experimentales de las siguientes maneras:
(1) Clones de hibridación por cruce. Los
clones de ADNc aislados del banco se hibridaron entre sí. Los
clones de hibridación por cruce se consideran "hermanos" del
clon utilizado como sonda y representan al mismo gen.
(2) Re-cartografiado. Al
menos un clon de cada hermandad se cartografió con el ADN genómico
humano total, en cósmidos, en los YAC y en las líneas celulares
somáticas híbridas, algunas de las cuales contienen deleciones de
17q y una de las cuales tiene el cromosoma 17 como su único
cromosoma humano.
(3) Subclonación y secuenciado. Uno de los
clones más largos de cada hermandad se subclona en M13 y se
secuencia manualmente por métodos normalizados, construyendo nuevos
cebadores y al final de cada fragmento para continuar el
secuenciado hasta que se alcance el final del clon.
(4) Ampliación de secuencias con hermanos.
Para hallar clones que contienen más del gen, el último cebador de
secuenciado para el clon y los cebadores construidos a partir de
\lambdagt10 se utilizan para ampliar los hermanos del primer
clon. Se seleccionan los hermanos que amplían los fragmentos más
largos, se subclonan y se hace el secuenciado. Este proceso se
continúa hasta que se alcanza el tamaño del transcrito definido por
la transferencia Northern y/o hasta que la secuencia en 3' es una
cola poliA y la secuencia en 5' presenta características del
comienzo de la zona de codificación.
(5) Transferencias Southern. Para
identificar las mutaciones de inserción o deleción, el ADN genómico
de 20 pacientes no emparentados de familias con cáncer de mama
ligados a 17q (es decir "pacientes ligados") y referencias se
digirieron con BamI/TaqI e independientemente con HindIII/HindfI.
Cada clon de ADNc se utiliza para identificar en transferencias
Southern. Se han detectado variantes en dos genes. Ambas variantes
son las RFLP, que se producen con igual frecuencia en pacientes
ligados y en referencias.
(6) Transferencias Northern. Para
identificar mutaciones de corte y empalme y/o mutaciones largas, se
preparó ARN completo y poliA + ARN de ADN de línea germinativa (de
líneas de linfoblastos) de 20 pacientes ligados no emparentados,
procedentes de tejidos de ovario y de mama, de fibroblastos, de una
línea celular de HeLa y de líneas celulares de cáncer de mama. Se
identificaron por transferencias Northern con cada gen.
(7) Detección de pequeñas mutaciones. Para
identificar las mutaciones puntuales de la línea germinativa en
pacientes sin intrones localizados, se preparó ADNc procedente de
poli-A+ARNm de líneas celulares de linfoblastos de
20 pacientes ligados no emparentados y de referencias. Se ha
preparado también ADNc a partir de 65 cánceres malignos de ovario
de pacientes no seleccionados por antecedentes familiares. Se
construyen cebadores cada \sim200 pares de bases a lo largo de la
secuencia y se utilizan para amplificar estos ADNc. También se ha
preparado ADN genómico a partir de líneas celulares procedentes de
todos los miembros de la familia (ligados y no ligados) de células
malignas y normales a partir de bloques de parafina procedentes de
sus intervenciones quirúrgicas de mama y ovario y de células
malignas y normales de 29 tumores de mama no seleccionados por
antecedentes familiares. Para las secuencias sin intrones, las
longitudes del ADNc y del ADNg son iguales y las muestras de ADNg
también se amplían.
Se utilizan dos métodos de detección de la
mutación para cribar cada secuencia. Se criban las SSCP de los
productos ampliados utilizando modificaciones que permiten hacer la
electroforesis solamente con una serie de condiciones de recorrido
(Keen et al. 1991 Trends Genet. 7:5; Soto y Sukumar
1992 PCR Meth. Appl. 2:96-98). Para
identificar los segmentos mayores de ADN, (100 a 1500 bp) y para
detectar las variantes perdidas por SSCP, se criban también las
secuencias de las mutaciones puntuales por CCM (Cotton 1993
Mutation Res. 285:125-144) utilizando
esencialmente el protocolo de Grompe et al. 1989 Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:5888-5892 una
endonucleasa desarrollada para la detección incompatible reduce la
toxicidad del método (Youil et al. 1993 Amer. J. Hum.
Genet. 53 (suplemento): resumen 1257).
(8) Polimorfismo o mutación. Se criban las
variantes en los casos y en las referencias para distinguir los
polimorfismos de una mutación crítica. El acoplamiento del cáncer de
mama a cada variante se determina en todas las familias
informativas.
La serie de familias incluye 20 familias
numerosas en las que el cáncer de mama y de ovario (y en una
familia con cáncer de próstata) están ligados a 17q21, con
puntuaciones lod individuales > 1,5. Como los pacientes ligados a
estas familias llevan mutaciones en BRCA1, se han identificado en
primer lugar sus mutaciones.
La Tabla 1 resume las mutaciones de BRCA1
críticas y los alelos raros:
De cada paciente con cáncer de mama, no
seleccionado por antecedentes familiares, se extrae una muestra de
30 ml de sangre completa en citrato dextrosa ácida. Se extrae el
ADN de la sangre y se almacena a -70ºC en 3 alícuotas. Se
identifican las mutaciones de la línea germinativa en BRCA1
utilizando los métodos descritos anteriormente y secuenciando
directamente nuevas mutaciones. Se identifican las alteraciones de
p53, HER2, PRAD1 y ER en muestras de tumor empapadas en parafina de
los mismos pacientes. Se determinan las mutaciones de BRCA1 de la
línea germinativa en los bloques tumorales.
Se obtiene una estimación preliminar del riesgo
asociado a diferentes mutaciones de BRCA1 de familiares de pacientes
con alteraciones en la línea germinativa. Para cada paciente con
una mutación en BRCA1 en la línea germinativa, de cada hermana y
madre superviviente (y de los pacientes ancianos, también de los
hermanos), se extrae ADN de una muestra de sangre y se determina la
presencia de la mutación de BRCA1 del probando. Para determinar los
hombres en situación de riesgo de cáncer de próstata, se entrevista
también a los hermanos de las pacientes con cáncer de mama
diagnosticado después de los 55 años y se toman muestras. Se
identifican también los bloques de parafina de los familiares
muertos que tenían cáncer. La frecuencia del cáncer de mama, de
ovario o de próstata entre los familiares que llevan mutaciones
BRCA1 es una primera estimación del riesgo de estos cánceres
asociados a mutaciones diferentes.
Se diseccionan células malignas procedentes de
células normales de bloques de parafina. Identificando las
mutaciones de BRCA1 en estas series, se estima la frecuencia de las
alteraciones somáticas de BRCA1, se determina las mutaciones de
BRCA1 características de alguna etapa particular de desarrollo
tumoral y se evalúa su relación con el pronóstico.
La función y el tipo de expresión del mutante o
del alelo raro BRCA1 durante el desarrollo se caracterizan
utilizando células transformadas que expresan el alelo y ratones
adormecidos o transgénicos. Por ejemplo, se determinan los cambios
fenotípicos en el animal o en la línea celular, tal como la
velocidad de crecimiento y la independencia del anclaje. Además, se
utilizan varios métodos para estudiar las mutaciones con pérdida de
función, incluyendo la sustitución de los genes normales por sus
alelos mutantes (BRCA1-/BRCA1-) por recombinación homóloga en
células madre embrionarias (ES) y sustituyendo los alelos mutantes
por sus contrapartidas normales en células cultivadas diferenciadas
(Capecchi 1989 Science 244:1288-1292;
Weissman et al. 1987 Science
236:175-180; Wang et al. 1993 Oncogene
8:279-288). Se identifica la mutación de las líneas
celulares de carcinoma de mama en el locus de BRCA1 y se selecciona
una línea de BRCA1 mutante. Los ADNc normal y mutante de BRCA1 se
subclonan en un vector de expresión que lleva genes que comunican
resistencia a la ampicilina y a la geneticina (Baker et al.
1990 Nature 249:912-915). Se transfectan
subclones en las células de cáncer de mama de BRCA1 mutante. Se
aíslan las colonias resistentes a la geneticina y se examina
cualquier cambio en el fenotipo tumorígeno, tal como la formación
de colonias en agar-agar blando, el aumento de la
velocidad de crecimiento y/o la formación de tumor en ratones
lampiños atímicos. Las demostraciones funcionales in vivo
implican la introducción del gen de BRCA1 normal en el mutante de la
línea celular del carcinoma de mama en BRCA1 y la inyección de
estas células BRCA1+ en ratones lampiños. Los cambios observados en
el crecimiento tumorígeno en comparación con los ratones lampiños
inyectados con células de carcinoma de mama mutantes BRCA1 se
observan fácilmente. Por ejemplo, corrigiendo el gen mutante
disminuye la capacidad de las células de carcinoma de mama para
formar tumores en ratones lampiños (Weissman et al. 1987;
Wang et al. 1993).
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
citadas en esta memoria están incorporadas a ella como referencia
como si cada publicación o solicitud de patente individual
estuvieran indicadas de manera específica e individual para ser
incorporadas como referencia. Aunque la invención anterior se ha
descrito con algún detalle a título de ilustración y ejemplo con
objeto de la claridad de comprensión, es obvio para los expertos en
la técnica a la luz de lo dado a conocer en esta invención que se
pueden realizar determinados cambios y modificaciones a la misma
sin apartarse del espíritu o del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: KING, Marie Claire
\hskip3,9cmFRIEDMAN, Lori
\hskip3,9cmOSTERMEYER, Beth
\hskip3,9cmROWELL, Sarah
\hskip3,9cmLYNCH, Eric
\hskip3,9cmSZABO, Csilla
\hskip3,9cmLEE, Ming
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MARCADORES GENÉTICOS PARA CÁNCER DE MAMA Y DE OVARIO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Science & Technology Law Group
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 268 Bush Street, Suite 3200
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94104
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- APODERADO / AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: OSMAN, Richard A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.637
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA / NÚMERO DE ETIQUETA: A-59563-3/RAO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (435) 343-4343
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (435) 343-4342
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5656 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5709 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5689 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5711 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 59 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº :5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCCTTAAA AGGTTGATAA TCACTTGCTG AGTGTGTTTC TCAAACAAGT TAATTTCAG
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5710 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5709 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5709 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5709 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5711 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5707 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5712 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Leu Ser Ala Leu Arg Val Glu Glu Val
Gln Asn Val Ile Asn}
\sac{Ala Met Gln Lys Ile Leu Glu Cys Pro
Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Leu Ser Ala Leu Arg Val Glu Glu Val
Gln Asn Val Ile Asn}
\sac{Ala Met Gln Lys Ile Leu Glu Cys Pro Ile Cys
Leu Glu Leu Ile Lys}
\sac{Glu Pro Val Ser Thr Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1863 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 80 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 312 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 765 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 900 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 914 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1202 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1363 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1852 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Un ácido nucleico aislado que comprende el
alelo de BRCA1 nº 5803 (SEQID nº: 1), nº 9601 (SEQ ID nº: 2), nº
9815 (SEQ ID nº: 2), nº 388 (SEQ ID nº: 6), o uno de sus
fragmentos, en el que dicho fragmento es capaz de
hibridarseúnicamente con dicho alelo en presencia de BRCA1
natural.
2. Un ácido nucleico aislado que comprende el
alelo de BRCA1 nº 5803 (SEQ ID nº: 1), o uno de sus fragmentos, en
el que dicho fragmento es capaz de hibridarse únicamente con dicho
alelo en presencia de BRCA1 natural.
3. Un ácido nucleico aislado que comprende el
alelo de BRCA1 nº 9601 (SEQ ID nº: 2), o uno de sus fragmentos, en
el que dicho fragmento es capaz de hibridarse únicamente con dicho
alelo en presencia de BRCA1 natural.
4. Un ácido nucleico aislado que comprende el
alelo de BRCA1 nº 9815 (SEQ ID nº: 3), o uno de sus fragmentos, en
el que dicho fragmento es capaz de hibridarse únicamente con dicho
alelo en presencia de BRCA1 natural.
5. Un ácido nucleico aislado que comprende el
alelo de BRCA1 nº 388 (SEQ ID nº: 6), o uno de sus fragmentos, en
el que dicho fragmento es capaz de hibridarse únicamente con dicho
alelo en presencia de BRCA1 natural.
6. Un producto de traducción aislado del alelo de
BRCA1 nº 5803 (SEQ ID nº: 13), nº 9601 (SEQ ID nº: 14), nº 9815
(SEQ ID nº: 15), nº 388 (SEQ ID nº: 18), o uno de sus fragmentos
con terminal C exclusivos del alelo.
7. Un producto de traducción aislado del alelo de
BRCA1 nº 5803 (SEQ ID nº: 13) o uno de sus fragmentos con terminal
C exclusivos del alelo.
8. Un producto de traducción aislado del alelo de
BRCA1 nº 9601 (SEQ ID nº: 14) o uno de sus fragmentos con terminal
C exclusivos del alelo.
9. Un producto de traducción aislado del alelo de
BRCA1 nº 9815 (SEQ ID nº: 15) o uno de sus fragmentos con terminal
C exclusivos del alelo.
10. Un producto de traducción aislado del alelo
de BRCA1 nº 388 (SEQ ID nº: 18) o uno de sus fragmentos con
terminal C exclusivos del alelo.
11. Un método de diagnóstico de la sensibilidad
al cáncer en un paciente, comprendiendo dicho método las etapas
de:
poner en contacto, con una muestra aislada de
dicho paciente y que comprende un primer ácido nucleico que
comprende al menos un alelo de BRCA1 o uno de sus fragmentos, un
segundo ácido nucleico según la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5 en
condiciones en las que dicho segundo ácido nucleico es capaz de
hibridarse específicamente con dicho primer ácido nucleico;
detectar la presencia o ausencia de hibridación
específica de dicho segundo ácido nucleico con dicho primer ácido
nucleico;
en el que la presencia de hibridación específica
de dicho segundo ácido nucleico con dicho primer ácido nucleico es
diagnóstico de una sensibilidad al cáncer.
12. Un método de diagnóstico de la sensibilidad
al cáncer en un paciente, comprendiendo dicho método las etapas
de:
poner en contacto, con una composición aislada de
dicho paciente y que comprende un producto de traducción de al menos
un alelo de BRCA1, un anticuerpo específico para una proteína o uno
de sus fragmentos con terminal C según la reivindicación 6, 7, 8, 9
ó 10 en condiciones en las que dicho anticuerpo es capaz de unirse
específicamente con dicho producto de traducción;
detectar la presencia o ausencia de complejos
unidos de manera específica de dicho anticuerpo o de dicho producto
de traducción;
en el que la presencia de dichos complejos se
correlaciona con una sensibilidad al cáncer.
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