ES2231460T3 - Procedimiento y dispositivo para la determinacion de parametros dependientes de la temperatura, tales como los parametros de asociacion/disociacion y/o la constante de equilibrio de complejos constituidos por al menos dos componentes. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la determinación paralela de parámetros dependientes de la temperatura, como los parámetros de asociación / disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, donde los primeros componentes (12), que se encuentran en una fase líquida, se ponen en contacto con un gran número de puntos de medición (10) en un medio de reacción excitable ópticamente y formado por segundos componentes (11) que se acoplan al medio de reacción sólido y enlazan específicamente con los primeros componentes (12), y ello mediante la puesta en contacto de la fase líquida y del medio de reacción (1) en condiciones de síntesis de complejos (13) y la excitación de colorantes fluorescentes próximos a la superficie, enlazados a los primeros componentes (12) y/o segundos componentes (11), para la emisión de luz fluorescente (7) mediante luz de excitación (4) irradiada y detección de la luz fluorescente emitida en un espectro de temperaturas variable, y la síntesis o la disgregación de los complejos, que incluyen primeros componentes (12) y segundos componentes (11), se observa como función de la temperatura.

Description

Procedimiento y dispositivo para la determinación de parámetos dependientes de la temperatura, tales como los parámetos de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos constituidos por al menos dos componentes.

La invención se refiere a un procedimiento y un dispositivo para determinar parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, donde los primeros componentes, que se encuentran en una fase líquida, se ponen en contacto con un gran número de puntos de medición en un medio de reacción excitable ópticamente mediante segundos componentes que se acoplan al medio de reacción sólido y enlazan específicamente con los primeros componentes, y bajo irradiación de luz de excitación, en particular luz de láser, se produce una luz fluorescente que se evalúa mediante un dispositivo de registro.

En los sistemas químicos y biológicos la síntesis (asociación) y la disgregación (disociación) de complejos tiene gran importancia. Por ejemplo, el nivel de azúcar en la sangre está regulado por el enlace de insulina en su receptor celular, esto es, mediante la síntesis de un complejo insulina/receptor. El complejo sintetizado efectúa en este caso una reducción del nivel de azúcar en la sangre. Otros ejemplos de complejos en sistemas biológicos son, por ejemplo, los complejos antígeno/anticuerpo y enzima/sustrato.

Para la actividad biológica y química del complejo son relevantes aquí tanto los parámetros cinéticos, esto es, la constante de asociación y de disociación, como también los parámetros termodinámicos, esto es, la constante de equilibrio. La dependencia respecto a la temperatura de las magnitudes mencionadas es conocida.

El ácido desoxirribonucleico (ADN) producido de forma natural se encuentra por lo general como cadena doble, esto es, como complejo formado por dos hebras separadas complementarias de ácidos nucleicos. La velocidad de los procesos de replicación y de trascripción depende mucho en este contexto de la distribución entre el complejo y las hebras separadas.

La disociación del complejo en dos hebras individuales separadas entre sí se denomina generalmente "fusión" y la temperatura, a la que se disocia un 50% aprox. del complejo en las hebras individuales separadas se denomina "temperatura de fusión". En general la tendencia a la fusión del complejo aumenta a medida que aumenta la temperatura.

Para determinar sustancias en muestras, en particular para comprobar determinadas secuencias de ADN en una muestra, se conoce la utilización de biochips. Éstos forman vehículos planares en cuya superficie quedan inmovilizados un gran número de puntos de medición, por ejemplo, formados por ácidos nucleicos (hebras individuales complementarias de ADN), donde esta superficie del chip se pone en contacto con una muestra que contiene las secuencias de ADN como sustancias que se pretende analizar y la muestra contiene los ácidos nucleicos que se pretende analizar. Dado que cada hebra individual de una molécula de ácido nucleico establece un enlace con su hebra complementaria, que se denomina hibridación, después de examinar los diferentes puntos de medición en relación con el enlace de moléculas de la muestra, obtenemos una información sobre las secuencias de ADN contenidas en la muestra. Una de las ventajas de la analítica del biochip consiste en que en un biochip se pueden efectuar y detectar en paralelo hasta varios miles de procesos de hibridación.

En correspondencia con el paralelismo de los procesos de hibridación se necesita un analizador para la evaluación del biochip, el cual, con una resolución local elevada, consigue una sensibilidad de detección igualmente elevada. Como se debe perseguir un gasto lo más reducido posible en el tratamiento previo de la muestra, interesa la posibilidad de reconocer de modo fiable un número también limitado de moléculas hibridizadas en los diferentes puntos de medición.

Los lectores de biochips disponibles actualmente en el comercio trabajan según el principio del escaneado. La luz para la excitación de la fluorescencia explora la superficie en forma secuencial. El biochip se mueve rápidamente con un rayo de luz fijo, o bien se utiliza, al menos para una dirección de movimiento, un escáner galvánico con el que se desvía el rayo de luz.

La luz emitida por los fluorocromos se detecta a continuación con un fotodetector sensible (por ejemplo, un fotomultiplicador). Los aparatos están diseñados como sistemas de medición en laboratorio para aplicaciones en la investigación de biología molecular. El límite de detección se sitúa en el intervalo entre unas pocas moléculas por \mum^{2} hasta unas 100 por \mum^{2}. Los tiempos de escaneado se sitúan entre 2 y 4 minutos aproximadamente. Los precios de los aparatos de este tipo oscilan entre unos 50.000 dólares USA para un aparato de gama económica hasta unos 350.000 dólares para aparatos de mayor calidad.

A modo de ejemplo se comentan aquí en detalle los dos aparatos que tienen supuestamente en la actualidad la mayor difusión. Se trata aquí del GeneArray Scanner de Hewlett-Packard, distribuido por la empresa norteamericana Affymetrix, y del ScanArray 3000 de GSI Lumonics. El GeneArray Scanner explora ópticamente la superficie del chip efectuando un desvío rápido del rayo de luz en una dirección del espacio. En la otra dirección el chip se mueve de forma gradual. Las dimensiones del aparato son de 66 cm \times 78 cm \times 42 cm. La fuente de luz es un láser de iones de argón (longitud de onda 488 nm). La detección se efectúa con un fotomultiplicador de rango entre 550 y 600 nm. El ScanArray 3000 tiene una óptica fija. El proceso de escaneado tiene lugar mediante un movimiento rápido del chip en una dirección del espacio y un desplazamiento gradual en la otra dirección. Se ofrecen hasta tres longitudes de onda de excitación diferentes para la excitación de fluorocromos diferentes. La detección se efectúa también en este caso con un fotomultiplicador. Todos los aparatos de medición evalúan el biochip una vez concluida la hibridación.

Todos estos aparatos tienen en común su incapacidad de registrar la dependencia respecto de la temperatura de los parámetros cinéticos y termodinámicos relevantes, como por ejemplo, la constante de asociación y disociación y la constante de equilibrio.

Además estos aparatos presentan problemas con la medición paralela del punto de fusión de un híbrido de ácido nucleico del que se inmoviliza una hebra en una fase sólida. El punto de fusión de ácidos nucleicos parcialmente complementarios sólo se puede calcular matemáticamente con gran imprecisión, en particular si los reactivos asociados a la fase sólida limitan el grado de libertad de la reacción.

Otra problemática inherente a estos aparatos consiste en la determinación de la cinética de hibridación de muestras complejas para el análisis y en la determinación de la concentración de varios ácidos nucleicos en una muestra analizada. La detección de ácidos nucleicos múltiples mediante hibridación está limitada por la problemática del punto de fusión de los híbridos. Si los puntos de fusión reales de los híbridos, a menudo diferentes de los puntos de fusión calculados, no se encuentran en un intervalo de temperaturas estrecho, una medición podrá ser, en términos cualitativos, erróneamente negativa o erróneamente positiva, y también cuantitativamente podrá presentar interferencias.

La patente EP-A-0 245 206 da a conocer un procedimiento y un dispositivo para la determinación de la temperatura de fusión de un ADN de doble cadena asociado a una superficie de guía de ondas de luz y marcado con un tinte fluorescente. El medio de reacción incluye un único punto de medición. D. I. Stimpson & J. Gordon (1996), Gen. Anal. Biomol. Engineer. 13, 73-80 y la patente US-A-5.599.668 dan a conocer un procedimiento y un dispositivo para el estudio de las reacciones de asociación/disociación, dependientes de la temperatura, de complejos de ADN de doble cadena. Los oligonucleótidos de cadena sencilla se inmovilizan como una pluralidad de puntos de medición en la superficie de un guiaondas de luz y se hibridizan con oligonucleótidos marcados (no fluorescentes). La luz de excitación se dispersa por las marcaciones, donde la luz dispersada se registra por medio de un aparato óptico de reproducción.

Por ello la invención se basa en el objetivo de mejorar un procedimiento y un dispositivo del tipo mencionado al principio, de manera que de una forma sencilla y sin plantear requisitos elevados al tratamiento previo de las muestras se consiga una determinación precisa de parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro asociación/disociación y/o la constante de equilibrio.

Este objetivo se resuelve según la invención mediante un procedimiento para la determinación de parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, donde los primeros componentes, que se encuentran en una fase líquida, se ponen en contacto con un gran número de puntos de medición en un medio de reacción excitable ópticamente, formado por segundos componentes acoplados al medio de reacción sólido, que se enlazan específicamente con los primeros componentes, y ello tiene lugar mediante la puesta en contacto de la fase líquida y del medio de reacción en condiciones de síntesis de complejos y mediante la excitación de colorantes fluorescentes próximos a la superficie, enlazados con los primeros y/o segundos componentes, para la emisión de luz fluorescente mediante luz de excitación irradiada y detección de la luz fluorescente emitida en un espectro de temperaturas variable, y donde la síntesis o la disgregación de complejos, que incluyen primeros y segundos componentes, se observa como función de la temperatura.

En una forma de realización preferida del procedimiento según la invención los primeros y/o segundos componentes son receptores y/o ligandos.

En este contexto la expresión "ligando" significa una molécula que enlaza con un receptor determinado. Los ligandos incluyen, entre otros, agonistas y antagonistas de receptores de la membrana celular, toxinas, toxinas biológicas, epítopos virales, hormonas (por ejemplo, opiáceos, esteroides), receptores hormonales, péptidos, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores, medicamentos, lectinas, azúcares, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, oligosacáridos, proteínas y anticuerpos.

En este contexto la expresión "receptor" significa una molécula que presenta una afinidad para un ligando. Los receptores pueden ser receptores producidos de forma natural o fabricados de forma sintética. Los receptores se pueden utilizar como monómeros o como heteromultímeros en forma de agregado junto con otros receptores. A modo de ejemplo, los receptores incluyen agonistas y antagonistas de receptores de la membrana celular, toxinas, toxinas biológicas, epítopos virales, hormonas (por ejemplo, opiáceos, esteroides), receptores hormonales, péptidos, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores, medicamentos, lectinas, azúcares, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, oligosacáridos, células, fragmentos de células, fragmentos de tejidos, proteínas y anticuerpos.

Los ligandos y/o receptores pueden estar enlazados de forma covalente o no covalente con el medio de reacción. El enlace puede efectuarse aquí de forma conocida para el especialista.

En otra forma de realización preferida los primeros y/o segundos componentes son hebras separadas de ácidos nucleicos. Son especialmente preferidas las hebras separadas de ácidos nucleicos complementarias entre sí al menos parcialmente. Las hebras separadas de ácidos nucleicos complementarias al menos parcialmente forman en condiciones apropiadas un híbrido de ácidos nucleicos. El procedimiento según la invención puede determinar tanto la síntesis dependiente de la temperatura como la disgregación (fusión) del híbrido de ácidos nucleicos.

El conocimiento exacto de los puntos de fusión de los complejos de ácidos nucleicos permite mejorar sustancialmente el análisis de mutaciones en biochips. De esta forma se pueden desarrollar datos de medición para un diseño racional de sondas para la analítica de ácidos nucleicos. De esta forma se pueden utilizar especialmente sondas para el análisis isotérmico paralelo.

En este sentido supone una ventaja el hecho de que la luz de excitación se acople en los guiaondas de luz por medio de un dispositivo óptico, por ejemplo, un prisma.

Además la luz de excitación puede producir, mediante reflexión total (ATR) o reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) de los rayos de luz, en una superficie de separación entre dos medios con distinta densidad óptica, un campo electromagnético en el medio ópticamente menos denso, donde el medio ópticamente más denso es una fase sólida y el medio ópticamente menos denso es una fase líquida, para la medición de la secuencia temporal de la reacción.

Un producto de este tipo permite una construcción muy sencilla del medio de reacción (biochip), preferiblemente mediante revestimiento de un cuerpo transparente con una capa guiaondas planar de alta refracción, y permite un dispositivo de análisis sencillo, en el cual, por ejemplo, una celda de flujo que contiene la muestra (o una cubeta o un cuerpo de ensayo fijo de otro tipo) se pone en contacto hermético con el medio de reacción, en particular un biochip, cuya superficie está configurada, al menos en su mayor parte, como guiaondas planar y conduce la luz de excitación que en un extremo del guiaondas planar se acopla en éste, donde la luz fluorescente excitada por el campo evanescente de la luz de excitación es registrada, a través del cuerpo transparente del medio, en el lado del medio de reacción o biochip opuesto al guiaondas planar y a la celda de flujo, por un aparato óptico de reproducción que contiene preferiblemente un filtro y es derivada hacia un detector correspondiente de alta resolución local, por ejemplo, un fotomultiplicador o una cámara CCD para la lectura del medio de reacción, en particular del biochip.

Para ello todos los puntos de medición situados en el lado superior del guiaondas planar del medio de reacción o biochip son excitados al mismo tiempo por el campo evanescente de la luz de excitación que se acopla en el guiaondas planar para la emisión de luz fluorescente, en combinación con una reacción entre los agentes inmovilizados en la superficie del chip, como por ejemplo, hebras separadas de ADN y las sustancias que se pretende detectar en el ensayo, como por ejemplo, hebras separadas de ADN.

Otros ejemplos de realización preferidos del procedimiento según la invención se describen en las demás subreivindicaciones.

El objetivo antes mencionado se resuelve además, por lo que respecta al dispositivo, mediante un dispositivo para la determinación de parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, con un medio de reacción cuya superficie excitable ópticamente presenta segundos componentes que forman los puntos de medición en el medio de reacción y que enlazan de forma específica con los primeros componentes, con un dispositivo para poner en contacto los primeros componentes que se encuentran en la fase líquida y los segundos componentes, acoplados al medio reactor y enlazados de forma específica a los primeros componentes, con un dispositivo para controlar la temperatura de los puntos de medición, con una fuente de luz para acoplar la luz de excitación para la excitación de la emisión de luz fluorescente dependiendo del enlace de los primeros componentes a los segundos componentes del medio de reacción, y con un detector para registrar la luz fluorescente emitida para determinar el enlace de los primeros componentes a los segundos componentes como función de la temperatura.

Además de la determinación exacta de los puntos de fusión antes mencionados, un dispositivo de este tipo puede medir la cinética de disociación/asociación de ácidos nucleicos mediante un gradiente de temperatura y ofrece, mediante las constantes de equilibrio calculables, una información clara sobre la entalpía de reacción y por tanto una determinación de la concentración de las muestras analizadas. Incluso resultan evaluables, mediante análisis matemático de la curva de hibridación, curvas de hibridación más complejas, por ejemplo, varios participantes en la hibridación en una sonda, esto es, ácidos nucleicos enlazados en la fase sólida, de modo que este método de análisis permite ahora registrar parámetros que hasta ahora no eran adecuados para el chip.

Además de la selección de reacciones bioquímicas, el dispositivo según la invención resulta apropiado también para la detección de sustancias inorgánicas. Un ejemplo de ello es la sensórica de gases.

En el pasado se propusieron diferentes sensores de gases que utilizan los llamados revestimientos sensibles. Éstos pueden ser, por ejemplo, películas de polímeros o capas de sol-gel que adsorben determinados gases. Si en esta capa se agregan sustancias y/o indicadores que reaccionan de forma específica con los analitos se puede detectar una modificación de una propiedad de la capa en presencia de gases determinados. Las características en cuestión de la capa pueden referirse, por ejemplo, a un cambio de color, una alteración de la densidad o del índice de refracción o una modificación de las características dieléctricas.

El dispositivo según la invención se puede utilizar de forma similar para la detección de gases cuando el analito emite luz fluorescente o bien cuando se desactiva ("quenching" de la fluorescencia) una fluorescencia del revestimiento por absorción del analito. La disposición óptica según la invención permite en estos casos la detección de un gran número de analitos utilizando varios revestimientos diferentes, que se encuentran estructurados sobre la superficie del guiaondas o del prisma. Además se detecta la secuencia temporal de la reacción.

Una información adicional importante la proporciona la dependencia de la temperatura de la absorción de gas del revestimiento, pues los gases que se pretende detectar por lo general se desorben de nuevo al aumentar la temperatura. El conocimiento de la temperatura a la que se encuentra en la película un componente determinado, que se pretende determinar, de la concentración de gases incrementa la especificidad del sensor. Esta información puede también aclarar el estado de la capa (por ejemplo, el envejecimiento de la capa). De este modo aumenta la fiabilidad de los datos de medición. En especial se pueden registrar los datos del sensor con independencia de las intensidades de fluorescencia absolutas. Y en relación al aumento de la temperatura es importante también, en el caso de una medición continua o casi continua, la posibilidad de expulsar de la capa a aquellos gases que no se desorben por sí mismos con un descenso de la concentración del entorno. La medición simultánea de la fluorescencia nos facilita información sobre si se ha producido o no la desorción del gas.

La esencia de la invención consiste en la determinación de parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, donde los primeros componentes, que se encuentran en una fase líquida, se ponen en contacto con puntos de medición situados en un medio de reacción excitable ópticamente y formados por segundos componentes que se acoplan al medio de reacción sólido y enlazan específicamente con los primeros componentes, y se observa la síntesis o la disgregación de los complejos como función de la temperatura.

Otras configuraciones preferidas del dispositivo según la invención se describen en las restantes subreivindicaciones.

A continuación se explica la invención con mayor detalle, sirviéndose de los ejemplos de realización y de los correspondientes dibujos. Éstos muestran:

Figura 1a un biochip en una representación esquemática en perspectiva;

Figura 1b un detalle de un biochip según la figura 1a para un punto de medición de una superficie con hebras separadas de ADN inmovilizadas;

Figura 1c una representación esquemática de la incorporación al punto de medición, según la figura 1a, de la muestra con las hebras separadas de ADN que se pretende analizar, y una representación de la interacción complementaria entre las hebras separadas de ADN inmovilizadas según la figura 1b y las hebras separadas de ADN contenidas en la muestra (hibridación);

Figura 2 una representación de la separación de fase enlazada y líquida según el principio de la ATR (reflexión total atenuada);

Figura 3 una representación esquemática del dispositivo para la lectura de un prisma de ATR mediante reflexión simple;

Figura 4 una representación esquemática para la lectura de un prisma de ATR mediante reflexión múltiple;

Figura 5 una representación esquemática del dispositivo aplicando el principio de una reflexión múltiple "homogeneizada" (iluminación completa de las superficies);

Figura 6 una representación esquemática del dispositivo con aplicación de un guiaondas de luz planar;

Figura 7 gráficas para la representación de la distribución de la fluorescencia y su derivada en función del tiempo; y

Figura 8 una estructura esquemática de una celda de flujo con control de temperatura.

Como primer ejemplo de realización del procedimiento y del dispositivo que constituyen el objeto de la presente solicitud de patente se elige la configuración y la lectura de un biochip tal como se utiliza para el análisis de secuencias de ADN que se encuentran en una muestra y que se ponen en contacto con una superficie de un biochip para el análisis de los ácidos nucleicos.

Por supuesto se trata solo de un ejemplo de realización, y aquí se pueden detectar también otras sustancias biológicas moleculares, biológicas y/o químicas, como por ejemplo, genes y anticuerpos.

En la figura 1a se muestra una representación esquemática de un biochip 1 de este tipo, que forma una pequeña placa en cuya superficie están inmovilizados un gran número de ácidos nucleicos 11 en puntos de medición aislados 10. En cada punto de medición aislado 10 se encuentra un oligonucleótido con una secuencia de bases definida. Esto está representado en la figura 1b. En la figura 1c los ácidos nucleicos objeto del análisis de la muestra sometida a estudio están designados con la cifra 12, y con una flecha se indica que éstos se ponen en contacto con los ácidos nucleicos complementarios 11 que se encuentran en el punto de medición 10. Dado que cada hebra aislada de una molécula de ácido nucleico 11 establece un enlace (hibridación) con su hebra complementaria 12 (véase la figura 1), después del examen de los diferentes puntos de medición 10 en relación con el enlace de moléculas 12 de la muestra se obtiene una información útil sobre las secuencias 12 de ADN existentes en la muestra. Las hebras separadas de ADN hibridadas se señalan en la figura 1c con la cifra 13.

Los siguientes ejemplos de realización utilizan la reflexión total atenuada (ATR) o bien la reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) Con la reflexión total de un rayo de luz en la superficie de separación entre dos medios de diferente densidad óptica se genera un campo electromagnético en el medio ópticamente menos denso. El medio ópticamente más denso puede ser aquí una fase sólida y el medio ópticamente menos denso una fase líquida. Este llamado campo evanescente sólo penetra algunos cientos de nm desde la superficie de separación en el medio del entorno líquido. De esta manera se detectan casi exclusivamente los tintes fluorescentes enlazados en la superficie. Los tintes disueltos en el medio del entorno contribuyen sólo en escasa medida a la señal de medición, como se puede ver en la figura 2. Esto permite la medición de la secuencia temporal de las reacciones.

En la figura 2 se puede ver claramente que los perfiles de intensidad de los campos evanescentes descienden muy marcadamente.

Aquí una celda de flujo calentable pone en contacto la fase líquida con la fase sólida y permite el control de la temperatura de los reactivos. Una celda de flujo 6 está acoplada con un sistema fluídico para la manipulación de la fase líquida. Debido al contacto permanente de la sonda, esto es, de los ácidos nucleicos enlazados a la fase sólida con la fase líquida existe la posibilidad de regeneración del biochip. Como chip de medición se utiliza un prisma
transparente 5.

En la disposición según la figura 3 el lado del prisma 5 se ilumina de forma plana. Una reflexión total simple en el lado de la base del prisma basta para mantener una superficie de medición de tamaño suficiente.

La figura 3 muestra además en representación esquemática un dispositivo para la lectura del biochip 1, que presenta una configuración como se ha descrito ya anteriormente. El biochip 1 está formado a su vez por un sustrato transparente y preferiblemente por un revestimiento de alta refracción agregado sobre el sustrato como guiaondas de luz planar. El guiaondas de luz lleva un campo de puntos de medición 10, y una luz de excitación 4 se acopla en el guiaondas de luz a través del prisma 5 y se conduce hacia el interior de éste. La sonda de medición está configurada en la forma ya explicada con ayuda de la figura 1b.

Para el análisis de los ácidos nucleicos de ADN en una muestra se lleva dicha muestra a la celda de flujo 6 y se pasa a través de ésta, como se indica con las flechas de flujo 6a y 6b. La celda de flujo 6 se coloca impermeabilizada sobre el guiaondas de luz y rodea en forma de marco e impermeable a los líquidos, el campo de medición con los puntos de medición 10, de modo que la muestra puede interactuar con todos los puntos de medición 10 para la posible hibridación. La detección de la radiación fluorescente 7 excitada por el campo evanescente de la luz de excitación 4 tiene lugar, por ejemplo, por medio de un aparato óptico de reproducción 8 en combinación con un filtro, no representado aquí, y de un detector 9 de alta resolución local, por ejemplo, una cámara CCD o un fotomultiplicador.

De esta manera se puede efectuar al mismo tiempo un registro de la hibridación y una lectura paralela del biochip 1 con todos los puntos de medición 10. Al mismo tiempo se produce una excitación selectiva de los fluorocromos enlazados en los puntos de medición 10. Así pues, este principio de medición permite, sin una preparación especial de las muestras, una evaluación y una detección del biochip 1 de gran exactitud y rapidez por lo que respecta a la resolución local y también por lo que respecta a la presencia de ácidos nucleicos hibridados.

En la disposición según la figura 4 se ilumina con un sistema óptico lineal un lado de un prisma 5a sustancialmente más delgado, con un espesor de 1 mm aproximadamente. Para ello están dispuestos varios prismas 5a unos junto a otros. Mediante reflexión múltiple en los lados superiores e inferiores de los prismas 5a se consigue una iluminación plana del campo de medición.

La detección de la radiación fluorescente emitida tiene lugar con un detector 9 de resolución local. En este caso actúa como fuente de luz un diodo de láser 3.

La medición en línea de la hibridación por medio de un analizador de ATR con fluídica calentable tiene lugar de la forma siguiente.

En primer lugar se describe la determinación del punto de fusión de un ADN. Aquí se pueden hibridar sondas con muestras sintéticas, esto es, oligonucleótidos, o naturales, esto es, ADNc. El registro de la intensidad de la señal a diferentes temperaturas permite determinar el punto de fusión Tm del ADN. Éste es la temperatura a la que se consigue el 50% de la intensidad máxima de señal. Esta prueba se puede efectuar con un gran número de sondas.

A continuación se describe la determinación de la constante de equilibrio. Con una concentración conocida de moléculas de la muestra analizada se puede medir la constante de velocidad de una reacción según la ley de acción de masas. Esto puede ocurrir en el chip con un gran número de puntos de análisis.

Si se conocen el punto de fusión y la constante de síntesis, la concentración de una o varias muestras analizadas en una muestra compleja se puede determinar mediante el registro de la curva de hibridación.

La figura 5 muestra, en cada una de las figuras 5a y 5b, las condiciones de irradiación hacia un prisma como medio de reacción, representando el rayo láser con reflexión múltiple en el prisma 5 de ATR (figura 5a) bajo irradiación debida a un diodo láser 3a, y en la figura 5b la posibilidad de conseguir en la práctica una irradiación total de la superficie del prisma 5 conduciendo la irradiación de la luz, debida a la fuente de luz 3c, hacia el prisma 5 a través de una lente cilíndrica 14.

Como se puede ver, de esta manera se consigue una iluminación básicamente en toda la superficie del prisma, mientras que con la iluminación del borde del prisma 5 con un rayo láser colimado ocurre que los lados superior e inferior del prisma 5 sólo se iluminan selectivamente en puntos determinados, y no se pueden evaluar puntos de medición que no se encuentran en las zonas iluminadas. En cambio, si se focaliza el rayo de luz con una lente cilíndrica 14 sobre el lado del prisma 5 se consigue que el rayo de luz continúe su recorrido dentro del prisma 5 en un sentido divergente. Después de un cierto trayecto el rayo se ha ensanchado tanto que en la práctica tenemos una iluminación homogénea de la superficie del biochip.

La figura 6 muestra en representación esquemática un dispositivo para la lectura de un biochip 1, que presenta una configuración como se ha descrito en la figura 2. El biochip 1 está formado a su vez por el sustrato transparente 1a y el revestimiento de alta refracción agregado sobre el sustrato como guiaondas de luz planar 1b. Los bordes 1c del biochip 1 quedan fuera de la estructura del guiaondas. El guiaondas de luz lleva un campo de puntos de medición 10 y la luz de excitación 4 se acopla en el guiaondas de luz a través de un retículo de acoplamiento 5 y se conduce en el interior de dicho guiaondas. Los puntos de medición 10 están configurados en la forma ya explicada con ayuda de la figura 1b y de la figura 2. Para el análisis de los ácidos nucleicos del ADN en una muestra se lleva, por ejemplo, dicha muestra a la celda de flujo 6 y se pasa a través de ésta, como se indica con las flechas de flujo 6a, 6b. La celda de flujo 6 se coloca impermeabilizada sobre el guiaondas de luz 1b y rodea en forma de marco, e impermeable a los líquidos, el campo de medición con los puntos de medición 10, de modo que la muestra puede interactuar con todos los puntos de medición 10 para la posible hibridación. La detección de la radiación fluorescente 7 excitada por el campo evanescente de la luz de excitación 4 tiene lugar, por ejemplo, por medio de un aparato óptico de reproducción 8 en combinación con un filtro (no representado aquí) y de un detector 9 de alta resolución local, por ejemplo, una cámara CCD o un fotomultiplicador. No obstante, la detección puede efectuarse también mediante radiación de la luz fluorescente hacia arriba, por encima del guiaondas 1b.

De esta manera se puede efectuar al mismo tiempo un registro "in situ" de la hibridación y una lectura paralela del biochip 1 con todos los puntos de medición 10. Al mismo tiempo se produce una excitación selectiva de los fluorocromos enlazados en los puntos de medición. Así pues, este principio de medición permite, sin una preparación especial de las muestras, una evaluación y una detección del biochip 1 de gran exactitud y rapidez por lo que respecta a la resolución local y también por lo que respecta a la presencia de ácidos nucleicos hibridados.

Es evidente que con una disposición del análisis según la figura 6 se deberá realizar un esfuerzo adicional para el acoplamiento de la luz de excitación 4 en el guiaondas 1b (aquí a través de un retículo 5). De esta manera se necesitan, por una parte, pasos de preparación adicionales en la fabricación del biochip 1 y, por otra parte, dispositivos de ajuste en el posicionamiento óptico entre la fuente luminosa de excitación (fuente láser) y el biochip. El consiguiente incremento de los costes del biochip, que como material de consumo resulta problemático, se puede evitar utilizando un posicionamiento de medición y de análisis de acuerdo con la representación esquemática según la figura 4, en la cual se produce una excitación de la fluorescencia en el lado superior del guiaondas de luz 1b, por ejemplo, desde el reverso del biochip 1, y por tanto desde el lado opuesto en relación con la celda de flujo 6, pero se prevé una detección de la luz fluorescente emitida por el fluorocromo enlazado mediante acoplamiento del mismo en el guiaondas planar 1b.

Como solución alternativa, la luz de excitación emitida por una fuente de rayo láser se conduce preferiblemente a través de una unidad deflectora 14 hacia un espejo deflector 15 y desde allí hacia el guiaondas 1b en la zona del campo de medición de los puntos de medición 10, en el cual se encuentra, por ejemplo, la celda de flujo 6. Aquí tiene lugar, con un dispositivo de escáner, un movimiento relativo en dos ejes entre el rayo de luz de excitación y el biochip. También en este caso el guiaondas planar 1b consigue una separación de fluorocromos enlazados y sueltos, pues sólo se acopla en el guiaondas planar 1b, y a continuación se detecta la luz fluorescente 7 emitida en la zona del campo evanescente de la luz de excitación 4. Los fluorocromos sueltos no producen intensidad de fondo alguna, pues esta luz no se aproxima al dispositivo de registro, sino solamente la luz fluorescente de los fluorocromos enlazados conducida en el guiaondas planar 1b. Las flechas de flujo 6a, 6b indican a su vez el flujo de muestras a través de la celda de flujo 6, mientras que el aparato óptico de reproducción 8 con filtro se representa conectado al guiaondas planar 1b, donde como detector de resolución local se utiliza un fotomultiplicador.

Dado que en este ejemplo de realización se tiene que realizar una lectura por filas, el biochip 1 se mueve en correspondencia en la dirección de la flecha A, tal como se indica.

Dado el caso también puede estar previsto, en el otro lado del guiaondas, un dispositivo de registro con equipo óptico de evaluación, filtro y fotomultiplicador para registrar la luz fluorescente que sale del guiaondas de luz 1b por el otro lado, o bien el detector puede estar acoplado directamente al borde del guiaondas de luz 1b.

Como guiaondas de luz se puede utilizar, también directamente, una placa de vidrio que forma ella misma el medio de reacción y al mismo tiempo el guiaondas de luz planar. En este caso se puede prescindir de un revestimiento separado de un sustrato para formar el guiaondas de luz.

La solución conforme a la invención permite la medición en tiempo real y la evaluación de biochips o también de otros medios de reacción en cuyo lado superior revestido de un guiaondas planar se efectúan, mediante reacción, análisis de sustancias en muestras.

Haciendo referencia a la figura 7 se describe a continuación otro ejemplo de realización.

Variando la temperatura se pueden determinar los puntos de fusión de oligonucleótidos inmovilizados, dado que se puede observar una separación o un enlace de las muestras al aumentar o reducir la temperatura, y a partir de la curva de fusión que se puede trazar con estos datos se puede determinar numéricamente el punto de fusión. La determinación del punto de fusión puede efectuarse al mismo tiempo para muchos oligonucleótidos en un planteamiento paralelizado en el chip.

Para la determinación de las curvas de fusión se utilizaron, por ejemplo, oligonucleótidos cuya secuencia se corresponde con un segmento del gen de la hemocromatosis. En este caso se probaron oligonucleótidos de diferentes longitudes y también varias sustituciones de bases en puntos diferentes. Cada uno de los oligonucleótidos fabricados de forma sintética estaba provisto aquí, en el extremo 5', de un espaciador de 10 bases de timina y un enlace amino C6. A través del grupo amino en el enlace los oligonucleótidos se acoplaron de forma covalente a portaobjetos de vidrio silanizado. Para la detección se hibridó con un oligonucleótido complementario marcado con fluorescencia (Cy5), o bien con un producto de PCR [Polymerase Chain Reaction] de pacientes de hemocromatosis, y se midió la cinética de la disociación en el lector de ATR con aumento de temperatura. En este caso los resultados obtenidos eran, por ejemplo, para oligonucleótidos con una longitud de 17 bases, que habían sido inmovilizados en un chip de vidrio, en una concentración de 2 \muM, y que tenían en posición central o bien la base G correspondiente al tipo salvaje
(5' ATATACGTGCCAGGTGG 3'; SEQ ID NO:1), que se corresponde con la curva 1 de la figura 5, o bien la base A correspondiente al mutante (5' ATATACGTACCAGGTGG 3'; SEQ ID NO:2), que se corresponde con la curva 2 de la figura 5, fueron los siguientes puntos de fusión con hibridación con un oligonucleótido equimolar complementario con una longitud de 31 bases, a temperatura ambiente y después de un aumento de la temperatura: el oligonucleótido complementario se disociaba antes (Tm 43º) de los oligonucleótidos que contenían una base sin sentido [missense] que del oligonucleótido correspondiente al tipo salvaje (Tm 46º).

La fluorescencia disminuye porque el oligonucleótido complementario marcado con fluorescencia se separa de la sonda de oligonucleótidos al aumentar la temperatura.

Esto se representa en la gráfica superior de la figura 5 con la curva 1 para el oligonucleótido inmovilizado de tipo salvaje, mientras que la curva 2 muestra el oligonucleótido inmovilizado que contiene la base sin sentido y que se corresponde con el mutante.

La curva 3 sirve para la medición de control y muestra la hibridación sin oligonucleótido.

La gráfica inferior de la figura 5 muestra la derivada de la fluorescencia en función del tiempo. En este caso, para una mejor visualización, se traza la derivada después del cambio de signo.

A continuación se describe un ejemplo de realización para la determinación de la dependencia respecto de la temperatura de la constante de equilibrio de complejos proteína/proteína o proteína/ligando.

El prisma se silanizó por ambos lados con un grupo aminosilano según un procedimiento conocido. Las proteínas y los ligandos que se pretendía acoplar fueron activados utilizando el procedimiento de carbodiimida-NHS, que produce grupos carboxi activados de las proteínas y los ligandos.

Las proteínas y ligandos activados fueron aplicados sobre el prisma en disposición de alineamiento con una impresora matricial (pinprinter). Después de la aplicación el prisma se incubó en una cámara húmeda a 37ºC durante dos horas. A continuación el prisma se incubó 30 minutos a temperatura ambiente en tampón de borato de 9,5 de pH para la hidrólisis de los grupos éster que permanecían activos, y a continuación 1 hora a temperatura ambiente en 1% de BSA (w/v) en 100 mM de PBS, pH 7,4 para el bloqueo de la superficie del prisma frente al enlace no específico.

El analito (proteínas y ligandos) fue marcado con fluorescencia con el kit de marcado Cy5 (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante.

A continuación se montó el prisma en el elemento detector de ATR y se lavó la celda de flujo con PBS para su posterior llenado con 1 mM de analito marcado con fluorescencia. Una vez alcanzado el estado de equilibrio se efectuó una absorción de 30 s. La temperatura de la celda de flujo se elevó gradualmente a XºC por minuto. Cada X minutos se efectuaron absorciones de 30 s. Una vez alcanzada la temperatura deseada se cuantificaron los diferentes puntos de medición en la disposición con el software SignalseDemo (GeneScan) Para determinar la dependencia respecto de la temperatura de la constante de equilibrio se estimó en los datos de medición una función de regresión apropiada con ayuda del programa Grafit (Erithacus Software).

La figura 8 muestra el control de la temperatura de la celda de flujo.

Para el trazado de curvas de fusión de ADN se necesita un control homogéneo de la temperatura de los híbridos sondas-muestras en la celda de flujo. La unidad de control de la temperatura deberá cubrir un intervalo de temperaturas amplio, para poder medir el punto de fusión de cadenas de nucleótidos muy cortas y muy largas. El intervalo de temperaturas entre 0ºC y 100ºC se puede conseguir fácilmente con una célula Peltier. La utilización de un elemento Peltier 24 permite además una estructura muy compacta. La figura 8 muestra la estructura esquemática de la celda de flujo con control de temperatura. El biochip 20 se presiona contra la celda de flujo con un portachip 21. Una cavidad en la celda de flujo forma el volumen de reacción 25, que se impermeabiliza mediante una junta tórica 22. La cara posterior 23 de la celda de flujo se pone en contacto con un elemento Peltier 24 para el control de la temperatura. El intercambio de calor con el entorno se efectúa mediante un bloque de cobre 26 con ventilador 27. Para la medición de la temperatura se utiliza un termómetro de resistencia 28 incorporado a la celda de flujo, y forma un circuito regulador junto con un regulador PID y el elemento Peltier 24.

<110> Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. et al.

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<120> Procedimiento y dispositivo para determinar los parámetros de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes como función de la temperatura.

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<130> PCT1310-031

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<140>

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<141>

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<150> DE 100 02 566.8

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<151> 2000-01-21

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: artificial sequence

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

atatacgtgc caggtgg

\hfill

17

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<210> 2

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: artificial sequence

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

atatacgtac caggtgg

\hfill

17

Claims (32)

1. Procedimiento para la determinación paralela de parámetros dependientes de la temperatura, como los parámetros de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, donde los primeros componentes (12), que se encuentran en una fase líquida, se ponen en contacto con un gran número de puntos de medición (10) en un medio de reacción excitable ópticamente y formado por segundos componentes (11) que se acoplan al medio de reacción sólido y enlazan específicamente con los primeros componentes (12), y ello mediante la puesta en contacto de la fase líquida y del medio de reacción (1) en condiciones de síntesis de complejos (13) y la excitación de colorantes fluorescentes próximos a la superficie, enlazados a los primeros componentes (12) y/o segundos componentes (11), para la emisión de luz fluorescente (7) mediante luz de excitación (4) irradiada y detección de la luz fluorescente emitida en un espectro de temperaturas variable, y la síntesis o la disgregación de los complejos, que incluyen primeros componentes (12) y segundos componentes (11), se observa como función de la temperatura.

2. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los primeros y/o segundos componentes son oligopéptidos o polipéptidos.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los primeros y/o segundos componentes son hebras separadas de ácidos nucleicos.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la luz de excitación (4) se acopla en un guiaondas, preferiblemente de luz, por medio de un dispositivo óptico, como por ejemplo, uno o varios prismas (5; 5a).

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la luz de excitación (4) produce, mediante reflexión total (ATR) o reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) de los rayos de luz en una superficie de separación entre dos medios con distinta densidad óptica, un campo electromagnético en el medio ópticamente menos denso, donde el medio ópticamente más denso es una fase sólida y el medio ópticamente menos denso es una fase líquida, para la medición de la secuencia temporal de la reacción.

6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque están previstos prismas (5a) que por reflexión múltiple en los lados superior e inferior de los prismas 5a producen, por medio de un sistema óptico lineal, una iluminación plana del campo de medición.

7. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, caracterizado porque con ayuda de la luz de excitación (4) acoplada en el guiaondas planar se produce una excitación simultánea de todos los puntos de medición (10).

8. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la luz fluorescente (7) de los segundos componentes (11), que enlazan de forma específica con los primeros componentes, (12) se conduce, por medio de un aparato óptico de reproducción que contiene preferiblemente un filtro (8a), hacia un detector (9) de resolución local, situado por encima o por debajo del biochip (o en el lado) para la lectura del biochip (1).

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fase líquida se desgasifica.

10. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la luz fluorescente es producida por el campo evanescente de la luz de excitación, en particular luz de láser, acoplada en un guiaondas planar.

11. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque la luz fluorescente es producida mediante luz de excitación, en particular luz de láser, desde el entorno de un elemento óptico que soporta los puntos de medición.

12. Dispositivo para la determinación de parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, con un medio de reacción (1) cuya superficie excitable ópticamente presenta segundos componentes (11) que enlazan de forma específica con los primeros componentes (12) y que forman un gran número de puntos de medición (10) en un medio de reacción, con un dispositivo (6) para poner en contacto los primeros componentes (12) que se encuentran en la fase líquida y los segundos componentes (11), acoplados al medio reactor y enlazados de forma específica a los primeros componentes, con un dispositivo para controlar la temperatura de los puntos de medición, con una fuente de luz (3) para acoplar la luz de excitación (4) para la excitación de la emisión de luz fluorescente (7) dependiendo del enlace de los primeros componentes (12) con los segundos componentes (11) del medio de reacción (1), y con un detector (9) para registrar la luz fluorescente (7) emitida para determinar el enlace de los primeros componentes (12) con los segundos componentes (11) como función de la temperatura.

13. Dispositivo según la reivindicación 12, caracterizado por dispositivos ópticos para el acoplamiento de la luz de excitación (4) en un guiaondas de luz, en particular planar.

14. Dispositivo según la reivindicación 13, caracterizado porque los dispositivos ópticos son uno o varios prismas (5; 5a).

15. Dispositivo según la reivindicación 14, caracterizado porque el prisma o los prismas (5; 5a) están diseñados para producir una reflexión simple o múltiple de la luz.

16. Dispositivo según la reivindicación 12 ó 15, caracterizada porque la fase sólida está formada por vidrio o plástico transparente.

17. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 16, caracterizado por una unidad de desgasificación integrada en el dispositivo para la desgasificación de la fase líquida.

18. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 15, caracterizado porque la temperatura del dispositivo para la puesta en contacto de los primeros componentes y segundos componentes se puede controlar, en particular calentar.

19. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 16, caracterizado porque el dispositivo (6) para la puesta en contacto de los primeros componentes (12) con los segundos componentes (11) es una celda de flujo, una cubeta o un recipiente de ensayo en unión hermética en la zona de los puntos de medición situada en la superficie del guiaondas planar (1b) del medio de reacción (1).

20. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 19, caracterizado porque el medio de reacción es un biochip (1) con un guiaondas de luz planar en su lado superior, que soporta los puntos de medición (10).

21. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 20, caracterizado porque el medio de reacción (1) es una placa de vidrio que forma ella misma el guiaondas de luz planar.

22. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 21, caracterizado porque la luz de excitación (4) incide sobre el medio de reacción desde uno de sus lados, y porque la luz fluorescente (7) emitida por los fluorocromos enlazados en la superficie del guiaondas planar se acopla en la zona del campo evanescente de la luz de excitación (4) en el guiaondas planar, es conducida dentro de éste y puede ser registrada por el dispositivo de registro (8; 9) dispuesto en al menos una superficie final del guiaondas de luz planar (1).

23. Dispositivo según la reivindicación 22, caracterizado porque el dispositivo de registro presenta un sistema óptico de reproducción (8) con un filtro (8b) así como un detector (9).

24. Dispositivo según la reivindicación 23, caracterizado porque el detector (9) es un fotomultiplicador o una cámara CCD.

25. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 24, caracterizado porque está previsto un dispositivo de escáner para la lectura del medio de reacción (1) y porque el medio de reacción y/o la luz de excitación procedente del entorno del medio de reacción (1) se pueden mover en relación con éste en al menos un plano.

26. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 12 a 25, caracterizado porque el dispositivo para la puesta en contacto de los primeros y segundos componentes se puede calentar.

27. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 26, caracterizado porque el medio de reacción soporta un guiaondas de luz, en particular planar, en cuya superficie se encuentran los puntos de medi-
ción.

28. Dispositivo según una de las reivindicaciones 12 a 27, caracterizado porque un biochip (20) se aprieta contra una celda de flujo y porque un volumen de reacción (25), formado entre la celda de flujo y el biochip, está estanqueizado mediante una junta tórica.

29. Dispositivo según la reivindicación 28, caracterizado porque un elemento de control de la temperatura para el volumen de reacción está formado por un elemento Peltier (24).

30. Dispositivo según la reivindicación 29, caracterizado porque el elemento Peltier está en contacto con un lado posterior de la celda de flujo.

31. Dispositivo según una de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque unido al elemento Peltier se encuentra un cuerpo metálico conductor del calor, en particular un bloque de cobre, cuyo intercambio de calor con el entorno se puede ver influido ventajosamente mediante un elemento ventilador (27) incorporado en un momento posterior.

\newpage

32. Dispositivo según una de las reivindicaciones 29 a 31, caracterizado porque la celda de flujo presenta un sensor de temperatura, en particular un termómetro de resistencia, que unido a un regulador, en particular un regulador PID y al elemento Peltier forma un circuito regulador.