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ES2231188T3 - Material alveolar lleno de una sustancia. - Google Patents

Material alveolar lleno de una sustancia.

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ES2231188T3
ES2231188T3 ES00927160T ES00927160T ES2231188T3 ES 2231188 T3 ES2231188 T3 ES 2231188T3 ES 00927160 T ES00927160 T ES 00927160T ES 00927160 T ES00927160 T ES 00927160T ES 2231188 T3 ES2231188 T3 ES 2231188T3
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ES
Spain
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matrix
macropores
pore
internal material
pore system
Prior art date
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ES00927160T
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English (en)
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Hans Berg
Mats Carlsson
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Cytiva Sweden AB
Original Assignee
Amersham Bioscience AB
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Publication date
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Abstract

Una matriz que comprende a) una matriz base, preferiblemente polimérica, que comprende macroporos (sistema de poro 1) y b) un material interno retenido en los macroporos, caracterizada porque el material interno se ha contraído en los macroporos para dejar un volumen libre en el material interno y la paredes del poro de los macroporos.

Description

Material alveolar lleno de una sustancia.
La presente invención se refiere a un nuevo tipo de matrices de soporte y al uso de las matrices de soporte en métodos de separación, cultivos celulares, síntesis en fase sólida de moléculas orgánicas, y reacciones catalíticas (tales como reacciones enzimáticas) y otros usos en los que se usan matrices de soporte porosas.
Tecnología antecedente
En cromatografía se permite pasar un flujo de líquido que contiene componentes a retirar del líquido a través de un medio de separación. Los componentes típicamente difieren en sus interacciones con el medio de separación lo que da como resultado una retención diferencial. Los componentes llegarán a separase al menos parcialmente entre sí. La eficacia de un medio de separación dependerá, entre otros, del área superficial disponible para el soluto.
Hay un deseo general de incrementar el área superficial disponible en contacto directo con el flujo líquido a su través. En el caso de que el líquido sea acuoso y el medio de separación esté basado en un material hidrófobo, se ha proporcionado un recubrimiento hidrófilo, por ejemplo. Se han sugerido diversos espesores para capas monomoleculares y más gruesas que permiten el flujo a su través en el centro de los poros (documentos EP 221.046 y WO 9719347, respectivamente) hasta llenar completamente los poros que atraviesa el flujo (documento EP 288.310).
Mediante el término "flujo líquido a su través" se quiere decir que el líquido proporciona transporte convectivo de masa. Las superficies accesibles por el flujo líquido a su través se llaman, por lo tanto, "superficies convectivas". De manera análoga, los sistemas de poros/poro accesibles por el flujo líquido a su través se llaman "sistemas de poro convectivos" (por ejemplo, el sistema de poro 1 descrito posteriormente). Los tamaños de poro de los sistemas de poro convectivos son típicamente \geq 0,1 \mum, tales como \geq 0,5 \mum, mediante el cual se quiere decir que una esfera \geq 0,1 \mum respectivamente \geq0,5 \mum en diámetro es capaz de pasar a su través. En el caso de que el medio esté en forma de perlas empaquetadas en un lecho, la proporción entre los tamaños de poro convectivo y el diámetro de las perlas típicamente está en el intervalo 0,01-0,3, con preferencia por 0,05-0,2.
Los poros que tienen tamaños \geq 0,1 \mum, tales como \geq 0,5 \mum, a menudo se denominan macroporos.
Los medios de separación también pueden tener sistemas de poros que son sólo accesibles por difusión del líquido y/o de los componentes presentes en el líquido (transporte difusivo de masa) ("sistema de poro difusivo", por ejemplo, el sistema de poro 2 como se describe posteriormente cuando son microporosos). Los sistemas de poro difusivos se caracterizan porque tienen aberturas en el sistema de poro convectivo, que no son suficientemente grandes para que el flujo de líquido pase a su través. Estas aberturas del sistema de poro 2 son típicamente de tal manera que sólo esferas con diámetros \leq 0,5 \mum, tales como \leq 0,1 \mum, pueden pasar a su través. Los poros que tienen tamaños \leq 0,5 \mum, tales como \leq 0,1 \mum, a menudo se denominan microporos.
Los datos para los tamaños de poro dadas en el contexto de la presente invención se refieren a valores obtenidos por SEM o ESEM (microscopía electrónica de exploración y microscopía electrónica de exploración ambiental, respectivamente) y/o por SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) utilizando, por ejemplo, poliestirenos y dextranos. Véase Hagel, "Pore Size Distribution" en "Aequeous Size-Exclusion Cromatography" Elsevier Science Publisher B.V., Ámsterdam, Holanda (1988) 119-155.
Los objetos de la invención
\bullet
Un primer objeto es aumentar la capacidad total de las matrices macroporosas.
\bullet
Un segundo objeto es aumentar la capacidad de penetración de las matrices que comprenden macroporos llenados con medio de separación.
La capacidad total y la capacidad de penetración se refieren a la capacidad de las matrices de interaccionar con una sustancia presente en un flujo líquido a través de las matrices. La interacción puede referirse a la afinidad de unión entre la sustancia y una estructura de ligando que tiene afinidad por la sustancia y que está presente en la matriz de soporte. La interacción puede también ser una permeación restringida estéricamente debido al tamaño y forma de la sustancia.
La invención
Se ha reconocido ahora que estos objetos pueden satisfacerse en el caso de los macroporos de una matriz base que comprenden un material interno que deja un volumen libre continuo entre el material interno y las paredes internas de los macroporos.
Un primer aspecto de la invención es una matriz de soporte que comprende a) una matriz base, preferiblemente polimérica, con macroporos (sistema de poro 1) y b) un material interno, posiblemente poroso (sistema de poro 2), retenido en los macroporos. El rasgo característico de la matriz es un volumen libre continuo entre el material interno y las paredes internas del poro. Las matrices de soporte pueden estar en un formato de lecho empaquetado o fluidizado o en forma de un lecho corto monolítico. En las variantes preferidas el volumen libre continuo permite al líquido fluir a través de la matriz, preferiblemente entre dos extremos opuestos de la matriz. Las dimensiones del volumen libre continuo se selecciona típicamente tal como al menos el 1%, tal como al menos el 4%, del líquido que pasará a través de la matriz en el volumen libre continuo. Para una matriz en forma de un lecho corto monolítico esto significa que el 100% del flujo líquido pasa a través de la matriz.
Sistemas de poro
Los tamaños de los macroporos de la matriz base vacía, sin material interno, típicamente están en el intervalo 0,1-1000 \mum, tal como 0,5-1000 \mum, con preferencia por 1-100 \mum (sistema de poro 1). La matriz base puede también contener un lote de menos poros (sistema de poro 3) que tiene poros en el intervalo de 10 \ring{A}-0,5 \mum, tal como de 10 \ring{A}-0,1 \mum.
El límite superior de tamaños de poro (sistema de poro 2) depende de los tamaños de poro del sistema de poro 1. En el caso de que los poros del sistema de poro 1 sean suficientemente grandes, el sistema de poro 2 puede contener un material interno que puede o puede no ser macroporoso (sistema de poro 4). El sistema de poro 2 está en las variantes preferidas de microporos, es decir, sus tamaños de poro son \leq 0,5 \mum, tales como \leq 0,1 \mum. En el caso de que los sistemas de poro 2 y 4 sean macroporosos, pueden considerarse como una parte del sistema de poro 1.
Este volumen libre presente en las matrices de la invención incrementará el área superficial convectiva. Esto significará un transporte de masa más rápido y una capacidad de penetración incrementada para las interacciones con solutos en un flujo líquido a su través. El área superficial convectiva de una matriz de acuerdo con la invención será, típicamente, al menos del 25%, tal como al menos del 50% o al menos del 75%, mayor que la superficie convectiva de la matriz base sin material interno.
Los sistemas de poro preferidos consisten en una red tridimensional de poros, cuya red comprende varios poros, ramificaciones porosas, bifurcaciones porosas, etc., y en las variantes preferidas también cavidades que comunican entre sí por medio de los poros. Esto se aplica a los sistemas de macroporos, que incluyen los sistemas de poro convectivos, así como los sistemas de microporos.
En las matrices base preferidas, el sistema de macroporos está constituido por cavidades en forma de esferas con poros de conexión entre las esferas. Los diámetros de las esferas pueden estar entre 1 \mum-100 \mum, tales como 1 \mum-25 \mum. Los diámetros de los poros de conexión son normalmente aproximadamente 1/10-1/3 de los diámetros de las esferas, por ejemplo, entre 0,1 \mum-10 \mum, tales como 0,5 \mum-10 \mum. En el caso de que las matrices estén en forma de perlas/partículas, las cavidades típicamente tienen diámetros de < 1/9 del diámetro de las partículas.
En algunas variantes preferidas, el material interno tiene un tamaño y/o forma que les impide salir de la matriz base, es decir, llamado también "material interno atrapado".
Matrices base
Las matrices base que tienen sistemas de poro constituidas por cavidades esféricas con poros de conexión entre las cavidades, están fácilmente disponibles en la técnica anterior. Véanse, por ejemplo, los documentos US 5.833.861 (PerSeptive Biosystems), EP 288.310 (Unilever), EP 68310 (Unilever), WO 9719347 (Amersham Pharmacia Biotech AB), US 5.334.310 (Cornell Research Foundation), WO 9319115 (Amersham Pharmacia Biotech AB), etc.
Las matrices base pueden, en principio, estar basadas en materiales que son conocidos per se en el campo de la fabricación de absorbentes cromatográficos en forma de lechos cortos monolíticos o partículas. De este modo, el constituyente principal en la matriz base puede basarse en polímeros orgánicos, tales como polímeros nativos (denominados también biopolímeros) y polímeros sintéticos, y material inorgánico. El material interno está basado principalmente en polímeros orgánicos que pueden ser nativos o sintéticos.
Los ejemplos ilustrativos de biopolímeros son polisacáridos tales como dextrano, agarosa, celulosa, carragenano, alginato, pululano, y almidón, incluyendo también formas químicamente modificadas. Las formas macroporosas de polisacáridos se obtienen mejor de acuerdo con el método descrito en el documento WO 9319115 (Amersham Pharmacia Biotech AB), es decir, se prepara inicialmente una solución acuosa que contiene el material polisacárido que después se suspende en un líquido orgánico inmiscible con agua para formar una emulsión que tras el enfriamiento da un bloque de macroporos. El método puede modificarse para dar perlas macroporosas. Las matrices polisacáridas macroporosas normalmente contendrán tanto un sistema de macroporos (sistema de poro 1) como un sistema de microporos (sistema de poro 3). Los tamaños de poro de los sistemas de poro pueden controlarse variando la cantidad relativa del líquido orgánico y por selección apropiada del emulsionante durante la fabricación de la matriz base. Los tamaños de poro del sistema de microporos pueden controlarse variando la concentración del polisacárido en la solución acuosa de partido. Las matrices pueden estabilizarse por reticulación, por ejemplo, usando reactivos que reaccionan bifuncionalmente con grupos hidroxi. Los bisepóxidos, las epihalohidrinas, etc. son agentes de reticulación típicos.
Los polímeros sintéticos están mejor ilustrados por los denominados también polímeros de vinilo, es decir, polímeros que se obtienen por polimerización de compuestos que muestran uno o más grupos alqueno polimerizables, tales como vinilbenceno, derivados del ácido acrílico/metacrílico (ésteres de ácidos, amidas, nitrilos etc.). La creación de la matriz base en forma de partículas puede tener lugar en emulsiones-o/w o suspensiones, por ejemplo, por polimerización con los monómeros que están inicialmente presentes en la fase oleosa. Se pueden obtener las matrices de lecho corto monolítico utilizando polimerización a granel. Se conseguirán matrices base que tienen diversos tipos de estructuras de poro incluyendo un líquido orgánico (porógeno) en el que los monómeros pueden disolverse pero no el polímero.
La matriz base también puede estar compuesta por otros polímeros sintéticos, por ejemplo, polímeros de condensación en los que los monómeros se seleccionan entre compuestos que muestran dos o más grupos seleccionados entre grupos amino, hidroxi, carboxi, etc. Los monómeros particularmente resaltados son monómeros de poliamino, monómeros de policarboxi (incluyendo haluros, ésteres y anhidros análogos reactivos), monómeros de polihidroxi, monómeros de amino-carboxi, monómeros de amino-hidroxi y monómeros de hidroxi-carboxi, en los que poli significa 2, 3 o más grupos funcionales a los que se hace referencia. Los compuestos que contienen un grupo funcional que es doblemente reactivo, por ejemplo, ácido carbónico o formaldehído, se incluyen en los compuestos polifuncionales. Los polímeros contemplados típicamente son policarbonatos, poliamidas, poliaminas, poliéteres, etc.
Los ejemplos de materiales inorgánicos que pueden ser útiles en formas macroporosas en las matrices base son sílice, óxido de circonio, grafito, óxido de tántalo, etc.
Las matrices preferidas carecen de grupos que son inestables frente a hidrólisis, tales como grupos silano, éster, amida y grupos presentes en sílice como tales.
El tipo preferido de matriz base se obtiene por polimerización de monómeros de vinilo del tipo mencionado anteriormente en una emulsión de fase interna alta (HIPE) dando una estructura macroporosa que comprende cavidades esféricas interconectadas abiertas del tipo descrito anteriormente. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 288.310 (Unilever), EP 68.310 (Unilever), WO 9719347 (Ambersham Pharmacia Biotech AB) y US 5.200.433. Este método se ha extendido previamente a emulsiones w/o/w en las que las emulsiones-w/o internas están en forma de gotas que contienen una HIPE. Véase, por ejemplo, el documento WO 9531485 que describe formas en perla de este tipo de matrices. Se formará, además del sistema de macroporos que comprende las cavidades esféricas, un sistema de microporos (sistema de poro 3) incluyendo un porógeno líquido. Véase el apartado "Sistemas de poro".
En algunas variantes, la matriz base puede consistir en varias partículas minoritarias que se pegan juntas de manera irreversible para formar aglomerados. Los intersticios entre las partículas minoritarias definen los sistemas de poro. Estas variantes pueden estar en forma de partículas grandes (por ejemplo, perlas) o lechos cortos monolíticos.
Las superficies de la matriz base (por ejemplo, del sistema de poro 1), que median el contacto directo con un líquido que pasa a su través, pueden ser hidrófobas o hidrófilas. Se contempla que, mediante una superficie hidrófila, la superficie muestra una pluralidad de grupos polares que contienen un oxígeno o un nitrógeno (grupos hidrófilos). Los grupos polares apropiados son hidroxi (alcohol y fenol), carboxi (-CCOH/-COO^{-}), éster, amida, éter (tal como en polioxietileno), etc. Mediante el término hidrófobo quiere decirse que hay sólo unos pocos o ninguno de los grupos hidrófilos mencionados anteriormente. En el contexto de la presente invención las superficies fuertemente hidrófilas tienen un ángulo de contacto con el agua < 30º.
Una matriz base que tiene superficies hidrófobas puede volverse fácilmente hidrófila de acuerdo con las técnicas conocidas per se. De manera análoga las superficies hidrófilas pueden volverse hidrófobas. Las superficies altamente hidrófobas tienen un ángulo de contacto con el agua > 50º.
Material interno
El material interno típicamente es un material polimérico que preferiblemente es poroso (sistema de poro 2).
El material interno se localiza principalmente en los macroporos de la matriz base en la que los macroporos tienen tamaños suficientes para proporcionar un volumen libre continuo como se definió anteriormente. Una porción del material interno puede localizarse en microporos más grandes o en macroporos que no tienen suficiente tamaño para proporcionar un volumen libre continuo.
El material interno puede, en principio, basarse en el mismo tipo de materiales que la matriz base. Véase lo anterior.
La distribución del tamaño de poro del sistema de poro 2 puede controlarse durante la formación del material de acuerdo con las mismas reglas que se utilizan para las matrices cromatográficas.
El material interno preferido está basado en polisacáridos.
El material interno se forma típicamente en los macroporos de la matriz base. Un método para conseguirlo comprende las etapas de:
i) llenado de los macroporos con una forma soluble del material interno,
ii) transformación de la forma soluble en los macroporos a una forma insoluble,
iii) contracción de la forma insoluble y
iv) estabilización irreversible del material en su forma contraída.
Este método está mejor ilustrado con polímeros de polihidroxi, tales como polisacáridos. Las soluciones acuosas pueden prepararse a partir de la mayoría de los polisacáridos, tanto en su forma nativa como en una forma apropiadamente derivatizada. Las soluciones acuosas de polímeros de polihidroxi a menudo se transforman fácilmente a geles como se conoce en la técnica, tanto por disminución de la temperatura como por derivatización química, por ejemplo, reticulación. La agarosa, por ejemplo, se sabe que se disuelve en agua templada pero sus soluciones gelifican cuando la temperatura se disminuye. De modo similar, el dextrano es altamente soluble en agua pero cuando se reticula forma un gel. La formación de geles, como se describió anteriormente en un sistema de macroporos, ayudará a la retención del polisacárido en el sistema de poro. Se sabe que este tipo de geles se puede forzar para contraerse. La contracción de un gel localizado en un sistema de macroporos formará, por lo tanto, un volumen libre continuo del tipo definido anteriormente. La agarosa en forma de gel sustituida apropiadamente, por ejemplo, se contraerá después de la reticulación bajo las condiciones apropiadas. Al mismo tiempo, la reticulación conduce a una forma geométrica estabilizada de manera irreversible. Véase, por ejemplo, el documento WO 9738018 (página 7, final del 3^{er} párrafo). De modo similar, un gel de dextrano reticulado hinchado con agua se contraerá en el caso de que el agua se reemplace por un líquido menos polar, tal como metanol. Después de la reticulación, por ejemplo, con bisepóxido o epihalohidrina, la forma contraída del gel de dextrano llegará a estabilizarse de manera irreversible.
El principio general resumido en el párrafo anterior es válido para formas solubles de otros polímeros a condición de que las formas solubles puedan transformarse (contraerse) en una forma insoluble que ocupe un volumen menor y que la forma contraída pueda estabilizarse a este volumen de manera irreversible. El espacio entre el material interno y las paredes internas de los macroporos será aquél que deje un volumen libre continuo, preferiblemente que permita al líquido fluir a través de la matriz. En el caso de una forma soluble del polímero, pueden usarse agua u otros líquidos. Las formas solubles a las que se hace mención también incluyen monómeros que son capaces de polimerizarse a un material interno.
Una primera alternativa para las etapas (ii)-(iv) anteriores comprende realizar estas etapas esencialmente de manera simultánea. Una segunda alternativa para las etapas (ii)-(iv) comprende la etapa (ii) seguida de la realización de las etapas (iii) y (iv) esencialmente de manera simultánea. Una tercera alternativa para las etapas (ii)-(iv) comprende ejecutar la secuencia etapa a etapa. La elección de la alternativa dependerá de la forma soluble de partida y puede determinarse como se resume en la parte experimental.
Los métodos típicos para transformar una forma soluble a una forma insoluble (etapa (ii)) comprenden disminución de la temperatura, derivatización química, por ejemplo reticulación, o intercambio disolvente/líquido. Los métodos típicos de contracción (etapa (iv)) comprenden reticulación, cambio de la fuerza iónica, o intercambio de líquidos. A los polímeros que contienen una pluralidad de grupos polares, a menudo les causa contracción el hecho de ir de un líquido más polar a un líquido menos polar. Para los polímeros que tienen una fuerte hidrofobicidad, por ejemplo, estando esencialmente libres de grupos polares, la contracción a menudo les requiere intercambiar un líquido menos polar con un líquido más polar. Los métodos típicos para la estabilización (etapa (v)) comprenden reticulación.
Una variante útil particular es utilizar un polisacárido alilado apropiadamente, tal como agarosa, y llevar a cabo la etapa (ii) de acuerdo con la segunda alternativa. La variante resumida anteriormente que utiliza polímeros solubles en agua, tales como dextrano, concuerda con la tercera alternativa.
Las superficies porosas (o los microporos y/o macroporos) pueden mostrar una pluralidad de ligandos de afinidad, es decir, estructuras con afinidad por un equivalente. Un ligando de afinidad es un miembro individual de un par de afinidad. Los ligandos de afinidad se usan habitualmente para unión de afinidad (adsorción de afinidad) con el otro miembro del par de la matriz de soporte. Los pares de afinidad bien conocidos son grupos positivos o negativos (intercambio iónico), anticuerpos y antígenos/haptenos, lectinas y estructuras de carbohidratos, proteínas de unión con IgG e IgG, grupos quelato y compuestos quelantes, ácidos nucleicos complementarios, grupos hidrófobos en el ligando o en el equivalente, etc. Este tipo de grupos puede introducirse en la matriz de soporte mediante técnicas bien conocidas en este campo. Los grupos de afinidad son de particular interés cuando se utilizan las matrices de soporte nuevas de la presente invención en métodos de separación basados en la afinidad por una sustancia que se quiere purificar o extraer de un líquido que contiene la sustancia. También puede ser de interés para matrices que se usan como soporte en cultivos celulares y en síntesis en fase sólida y como soporte para catalizadores, tales como
enzimas.
En el caso de que las matrices de soporte como se definieron anteriormente se usen para adsorción de afinidad, la matriz de soporte muestra un miembro de un par de afinidad como se definió anteriormente. El uso comprende llevar la matriz de soporte y un líquido polar, típicamente un líquido acuoso, o un líquido "no" polar que contiene el otro miembro del par de afinidad en contacto entre sí. Las condiciones se seleccionan para promover la unión de afinidad y en principio se consideran conocidas per se en este campo. Posteriormente la matriz de soporte se separa del líquido, y, si se desea, el miembro adsorbido por afinidad puede liberarse y procesarse posteriormente.
La invención se ilustrará ahora mediante ejemplos. La invención se define adicionalmente en las reivindicaciones de patente que forman parte de la memoria descriptiva.
Parte experimental Síntesis
Ejemplo 1A
Contracción controlada de agarosa
Preparación de la solución de agarosa. Se preparó una solución de agarosa en un reactor discontinuo añadiendo 20 g de agarosa a 300 ml de agua destilada con agitación durante 2 h a 95ºC. La solución se enfrió a 70ºC. Se añadieron 1,5 ml de NaOH al 50%, 0,04 g de NaBH_{4} y 4,0 ml de alil glicidil éter a la solución de agarosa. Se dejó que continuara la reacción durante 2 h con agitación a 70ºC. Después la solución se neutralizó con ácido acético al 60% y HCl a pH = 7-8.
Preparación del medio de emulsión. Se hizo en un reactor de emulsión añadiendo 35 g de de etilcelulosa (emulsionante N-50) (etilcelulosa, Hercules, U.S.A.) a 450 ml de tolueno con agitación a 60ºC (disolver N-50 en tolueno tarda aproximadamente 2 h).
Emulsión. La solución de agarosa se transfirió al medio de emulsión. La agitación se reguló a 120 rpm. De ese modo se formaron partículas de gel.
El tamaño de partícula máximo deseado de las perlas de agarosa fue 160 \mum. Si las partículas de gel de agarosa eran demasiado grandes la velocidad de rotación se incrementaba hasta 220 rpm y se añadía N-50 extra. El tamaño de partícula máximo se comprobó tomando muestras, que se analizaron en un microscopio con una graduación de tamaño controlado. Una vez logrado el tamaño de 160 \mum, la suspensión se enfrió. Se enfrió la suspensión de 60ºC a < 25ºC en aproximadamente 30 min. El gel se lavó con etanol al 99,5% y agua destilada.
Reticulación con epiclorhidrina (etapa de contracción). Se añadieron 53 g de Na_{2}SO_{4} a un reactor que contenía una mezcla de 300 ml de gel (escurrido) y 130 ml de agua destilada con agitación. La temperatura de reacción se incrementó a 50ºC y después de 1 h, se añadieron 7 g de NaOH al 50% y 0,5 g de NaBH_{4} a la suspensión así como 47 g de NaOH al 50% y 34 ml de epiclorhidrina, que se añadieron durante un periodo de 6-8 h. Se dejó continuar la reacción durante una noche (aprox. 16 h). El gel se lavó con agua destilada y ácido acético al 60% a pH = 5-7. Contracción (cálculos). Se midió el volumen del gel antes (V_{0}) y después (V_{ret}) de la reticulación y se calculó la contracción en porcentaje de acuerdo con la fórmula:
Contracción = (1 - (V_{ret}/V_{0})) x 100
Grado de derivatización versus comportamiento de contracción
Se repitió dos veces el estudio de contracción de acuerdo con el Ejemplo 1a con diferentes cantidades de alil glicidil éter. Los resultados se describen en la tabla 1 a continuación.
TABLA 1
Alil glicidil éter MI Contracción %
4,0 41
2,7 31
2,0 24
Ejemplo 1B
Contracción controlada de los geles de dextrano
Preparación de la suspensión de Sephadex G-200. Se añadieron 3 g de Sephadex G-200 (gel de dextrano reticulado con epiclorhidrina, Amersham Pharmacia Biotech AB, Suecia) a 400 ml de agua destilada. Se dejó que el gel se hinchara durante 24 h con agitación a 20-25ºC. El volumen del gel (escurrido) después de hincharse era de 100 ml.
Contracción y reticulación con diglicidil éter de 1,4-butanediol. Se añadieron 5,5 ml de gel de dextrano escurrido y 0,5 ml de agua destilada a un reactor que contenía 6,0 ml de metanol. Después de 1 h, se añadieron 3 ml diglicidil éter de 1,4-butanediol y 0,13 ml de NaOH al 50% a la suspensión. La temperatura de reacción se incrementó a 50ºC. Se dejó continuar la reacción durante una noche. El gel se lavó con agua destilada.
Contracción (cálculos). Véase Ejemplo 1A.
Cantidad de metanol frente al comportamiento de contracción
Se repitió dos veces el estudio de contracción de acuerdo con el Ejemplo 1A con diferentes cantidades de metanol. Los resultados se describen en la tabla 2 a continuación.
TABLA 2
Metanol MI Contracción %
6,0 46
5,0 27
4,0 9
Ejemplo 2 Fabricación de material macroporoso e hidrofilización del mismo
Matriz base macroporosa. Se preparó una matriz base macroporosa (perlas, diámetro de 40-500 \mum, sistema de poro en forma de cavidades esféricas internas conectadas) de acuerdo con el Ejemplo 1 en el documento WO 9719347 (Amersham Pharmacia Biotech AB) a partir de 10,8 g de estireno, 10,8 g de divinil benceno (calidad del 63%), 1,8 g de Span® 80 (monooleato de sorbitán, Fluka, Alemania), 0,8 g de Hypermer® (ICI, Inglaterra), 139 g de agua destilada (primera etapa) y 324 g de agua destilada (segunda etapa). Las partículas que eran mayores de 500 \mum y menores de 40 \mum se retiraron por cribado.
Modificación de la superficie por adsorción del polímero polihidroxi. Se añadieron 20 g de fenildextrano (grado de sustitución del 0,20 por unidad monosacárido) a un reactor que contenía una mezcla de 1500 ml de matriz macroporosa escurrida y 500 ml de agua destilada con agitación. Se dejó avanzar la reacción durante 2 h con agitación a 20-25ºC. El gel se lavó con agua destilada.
Reticulación del fenildextrano adsorbido. Se añadieron 180 g de Na_{2}SO_{4} a un reactor que contenía una mezcla de 1000 ml de una matriz macroporosa escurrida a la que se había adsorbido el fenildextrano y 300 ml de agua destilada con agitación. La temperatura de reacción se incrementó a 50ºC y, después de 1 h, se añadieron 40 g de NaOH al 50% y 32 ml de diglicidil éter de 1,4-butanediol a la suspensión. Se dejó continuar la reacción durante una noche (aprox. 16 h). El gel se lavó con agua destilada y ácido acético al 60% a pH = 5-7.
Ejemplo 3 Fabricación de matriz macroporosa que contiene en sus macroporos un material poroso que deja un volumen libre
Ejemplo 3A
Preparación de solución de agarosa
Se preparó una solución de agarosa en un reactor discontinuo añadiendo 120 g de agarosa a 900 ml de agua destilada con agitación durante 2 h a 95ºC. Después la solución se enfrió a 70ºC.
Ejemplo 3B
Preparación de matriz macroporosa llenada con gel de agarosa alilado. Se añadieron 150 g de matriz macroporosa escurrida del Ejemplo 2, 1,5 ml de NaOH al 50% y 3 ml de alil glicidil éter a 170 g de solución de agarosa del Ejemplo 3A. Se dejó continuar la reacción durante 2 h con agitación a 70ºC. Entonces se neutralizó la solución con ácido acético al 60% y HCl a pH = 7-8.
Preparación del medio de emulsión. Éste se preparó en un reactor de emulsión añadiendo 55 g de etilcelulosa (emulsionante N-50) a 450 ml de tolueno con agitación a 60ºC (disolver N-50 en tolueno tarda aproximadamente 2 h).
Retirada del exceso de gel de agarosa. Se transfirió la suspensión de agarosa/matriz escurrida al medio de emulsión. Se reguló la agitación a 180 rpm. De ese modo se formaron partículas del gel de agarosa y sus tamaños podían controlarse variando la velocidad de rotación en el agitador y la adición de N-50 extra.
El tamaño de partícula máximo deseado de los lechos de agarosa fue de 20 \mum. Si las partículas del gel de agarosa eran demasiado grandes, se podía incrementar la velocidad de rotación hasta 220 rpm y se podía añadir N-50 extra. El tamaño de partícula (de agarosa) máximo se controló tomando muestras que se analizaron en un microscopio con una graduación de tamaño controlado. Una vez que se alcanzó el tamaño de diámetro de 20 \mum, se enfrió la suspensión de 60ºC a < 25ºC en aproximadamente 30 min. El gel se lavó con etanol al 99,5% y agua destilada. Las partículas menores de 40 \mum (perlas de agarosa) se retiraron por cribado.
Reticulación con epiclorhidrina (contracción). Se añadieron 57 g de Na_{2}SO_{4} a un reactor que contenía una mezcla de 120 ml de material macroporoso (del Ejemplo 3b, escurrido) llenado con agarosa y 50 ml de agua destilada con agitación. La temperatura de reacción se incrementó a 50ºC y, después de 1 h, se añadieron 3 g de NaOH al 50% y 0,2 g de NaBH_{4} a la suspensión así como 18 g de NaOH al 50% y 17 ml de epiclorhidrina, que se añadieron durante un periodo de 6-8 h. Se dejó continuar la reacción durante una noche (aprox. 16h). El gel se lavó con agua destilada y ácido acético al 60% a pH = 5-7.
Inactivación de los grupos alilo
Bromación: se añadieron 50 g de NaAc x 3H_{2}O (acetato sódico) a un reactor que contenía una solución de 120 ml de gel reticulado con epiclorhidrina (escurrido) y 350 ml de agua destilada con agitación. Después de 5 min, se añadió bromo-agua (Br_{2}/H_{2}O) a la solución hasta que se obtuvo un color amarillo oscuro y se mantuvo durante más de 1 min. Se dejó continuar la reacción durante aproximadamente 15 min. A partir de ello, se añadió formiato sódico, dando al gel un color blanco.
Se añadieron 10 g de Na_{2}SO_{4}a un reactor que contenía el gel bromado. Después de 1 h, se añadieron 30 g de NaOH al 50% y 0,04 g de NaBH_{4} a la solución. La temperatura de reacción se incrementó a 40ºC y se dejó avanzar la reacción durante 16 h. El gel se lavó con agua destilada hasta pH = 7. Las partículas que eran mayores de 250 \mum y menores de 40 \mum se retiraron por cribado.
Preparación de solución de dextrano. Se añadieron 17 g de dextrano (T40 Pm 40.000 Amersham Pharmacia Biotech AB) a 14 ml de agua destilada con agitación a 20ºC (disolver dextrano en agua tarda aproximadamente 4 h).
Activación con epóxido de la matriz macroporosa llenada con agarosa. Se añadieron 6,4 g de NaOH (50%) a un reactor que contenía una solución de 40 ml de la matriz (escurrida) y 16 ml de agua destilada mientras se agitaba. Se enfrió la mezcla a 20ºC. Se añadieron 7,2 ml de epiclorhidrina. Se dejó continuar la reacción durante 2 h a 20ºC. Entonces se neutralizó la mezcla con ácido acético a pH = 6-7 y se lavó la matriz activada con agua destilada. El análisis mostró 13 \mumol de grupos epóxido/ml de gel.
Acoplamiento de dextrano. Se añadió el gel activado con epóxido al reactor que contiene la solución de dextrano. Se agitó la mezcla durante 1 h. Después se añadieron 3,2 g de NaOH (50%) y 0,02 g de NaBH y se permitió continuar la reacción durante una noche (aprox. 18 h). Entonces la mezcla se neutralizó con ácido acético a pH = 6-7 y se lavó la matriz con agua destilada. El contenido en dextrano de la matriz después de la reacción fue de 13 mg/ml de gel.
Introducción de grupos aminoetilo cuaternarios (grupos-Q) (intercambiador aniónico). Se añadieron 35 ml de cloruro de glicidiltrimetilamonio (70%) con agitación a una solución que contiene 20 ml de la matriz de la etapa anterior y 1,2 ml de NaOH (50%). Se incrementó la temperatura de la reacción a 30ºC y se permitió continuar la reacción durante 19 h. Después se neutralizó la mezcla con ácido acético a pH = 6-7 y se lavó la matriz resultante con agua destilada, NaCl 2 M y con agua destilada una vez más. La capacidad del ión cloruro del producto fue de 0,18 mmol/ml de gel.
Ejemplo 3c
Matriz macroporosa llenada con material interno poroso no contraído
Preparación de la matriz macroporosa llenada con gel de agarosa. Se añadieron 150 g de matriz macroporosa (escurrida) del Ejemplo 2 a 170 g de solución de agarosa del Ejemplo 3A. Se mantuvo la suspensión en agitación durante 2 h a 70ºC.
Preparación del medio de emulsión. Análogo al Ejemplo 3b. 70 g de etilcelulosa (emulsionante N-50), 450 ml de tolueno.
Retirada del exceso de gel de agarosa. Análogo al Ejemplo 3b. El mismo tipo de perlas de matriz.
Reticulación con epiclorhidrina. Análogo al Ejemplo 3b. 22 g de Na_{2}SO_{4}, 123 ml de perlas de matriz llenadas con agarosa, 57 ml de agua destilada, 2 g de NaOH al 50%, 0,2 g de NaBH_{4}, 19 g de NaOH al 50% y 18 ml de epiclorhidrina. Las partículas que eran mayores de 250 \mum y menores de 40 \mum se retiraron por cribado.
Preparación de la solución de dextrano. Análogo al Ejemplo 3b. 14,8 g de dextrano y 14 ml de agua destilada.
Activación con epóxido de la matriz macroporosa llenada con agarosa. Análogo al Ejemplo 3b. 6,4 g de NaOH (50%), 40 ml de la matriz y 16 ml de agua destilada, 7,2 ml de epiclorhidrina. El análisis mostró 29 \mumol de grupos epóxido/ml de gel.
Acoplamiento de dextrano. Análogo al Ejemplo 3b. 3,2 g de NaOH (50%) y 0,02 g de NaBH. El contenido en dextrano después de la reacción fue 17 mg/ml de gel.
Introducción de grupos aminoetilo cuaternarios (grupos-Q) (intercambiador aniónico). Análogo al Ejemplo 3b. 35 ml de cloruro de glicidiltrimetilamonio, 20 ml de la matriz y 1,2 ml de NaOH (50%). La capacidad de ión cloruro del producto fue de 0,29 mmol/ml de gel.
Métodos y análisis
Los contenidos en epóxido se determinaron en un Radiometer VIT 90 con HCl 0,1 M, punto final a pH fijo a un pH de 7.
Los contenidos en dextrano se determinaron calculando la diferencia entre el peso en seco del dextrano acoplado y el gel activado con epóxido. El peso en seco se determinó después de un secado de 18 h en un horno a 105ºC y se expresa como mg de dextrano por ml de gel.
La capacidad del ión cloruro se determinó en un Mettler DL40Gp Memo Tritator con AgNO_{3} 0,1 M.
La capacidad de penetración Q_{B} (C/C_{0} = 0,1) para BSA (albúmina de suero bovina) a 300 cm/h y 1200 cm/h.
Equipo:
Columna HR10/10 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Suecia)
Tampón-A; Tampón de carga Tris 50 mM, pH 8,0
Tampón-B; Tampón de elución NaCl 1,0 M en Tris 50 mM, pH 8,0
Proteína Albúmina de suero bovina, (Sigma, A-7030, St Louis, MO EEUU)
Procedimiento
La capacidad de penetración Q_{B} se determinó en una columna HR 10/10 (altura del lecho de 7,5 cm de gel). Se disolvió la proteína en tampón A, aproximadamente 2 mg/ml (determinado espectrofotométricamente a 280 nm). Inicialmente se evitó la columna y el flujo se liberaba directamente al monitor de UV, en el que se midió un valor de absorbancia a 280 nm de la solución de muestra no adsorbida (C_{0}), después de ello, se dejó pasar la solución de muestra adsorbida a través de la columna. Cuando la absorbancia del flujo a través de la columna fue del 10% de la absorbancia de C_{0}, se interrumpió el ensayo, El gel se lavó y se eluyó la BSA unida al gel con tampón B. Se recogió el eluido y se determinó su contenido en BSA, que a su vez dio una cantidad de BSA adsorbida por ml de gel (= la capacidad de abrirse paso (Q_{B}) para C/C_{0} = 0,1).
Los resultados de los Ejemplo 3A y 3B se presentan en la tabla 3.
TABLA 3
Nº de ejemplo Concordancia con la invención Q_{B} mg BSA por ml gel Q_{B} mg BSA/ml gel
Flujo: 300 cm/h Flujo: 1200 cm/h
Ejemplo 3b Sí 124 88
Ejemplo 3c No 63 36
Los resultados muestran una capacidad de penetración incrementada para la matriz preparada en el Ejemplo 3b.
Resultados de microscopía electrónica de exploración ambiental
Se atravesaron las perlas parcialmente antes de estudiarlas. Las fotos mostraron perlas rotas con cavidades y perlas más pequeñas del material interno. Las perlas más pequeñas se habían caído de las cavidades.

Claims (16)

1. Una matriz que comprende a) una matriz base, preferiblemente polimérica, que comprende macroporos (sistema de poro 1) y b) un material interno retenido en los macroporos, caracterizada porque el material interno se ha contraído en los macroporos para dejar un volumen libre en el material interno y la paredes del poro de los macroporos.
2. La matriz de la reivindicación 1, caracterizada porque el material interno es poroso (sistema de poro 2).
3. La matriz de la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el volumen libre continuo permite al líquido fluir a través de la matriz, preferiblemente entre dos extremos opuestos de la matriz, cuando se aplica un flujo líquido a una forma monolítica de la matriz o a un lecho empaquetado de la matriz en forma de partículas; al menos el 1%, tal como el menos el 4% del líquido que pasa a través de la matriz en el volumen libre continuo.
4. La matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque
a)
las paredes en el poro en el sistema de poro 1 y/o en el sistema de poro 2 y/o la superficie externa del material interno son hidrófilas, o
b)
las paredes del poro en el sistema de poro 1 y/o en el sistema de poro 2 y/o la superficie externa del material interno son hidrófobas.
5. La matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la matriz está en forma de lecho corto monolítico y porque el 100% del flujo líquido pasa a través de la matriz.
6. La matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque la matriz está en forma de partículas, tales como fibras y perlas, y porque, cuando las partículas están en forma de lecho empaquetado, al menos el 1%, preferiblemente como máximo el 50%, tal como el 4-50%, del flujo líquido pasa a través de las partículas.
7. La matriz de cualquiera de la reivindicaciones 1-6, caracterizada porque el diámetro de poro de los macroporos (sistema de poro 1) está en el intervalo de 0,1-1000 \mum, con preferencia por 1-100 \mum.
8. La matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-7 caracterizada porque está en forma de partículas (perlas) que tienen un tamaño medio en el intervalo 5-1000 \mum, tal como 50-1000 \mum o 100-500 \mum, y porque la proporción entre el diámetro de poro del sistema de poro 1 y el diámetro de partícula está en el intervalo 0,01-0,3, con preferencia por 0,05-0,2.
9. La matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque hay un tercer sistema de poro (sistema de poro 3) en la matriz base, uno o ambos de dichos sistemas 2 y 3 tienen aberturas en el volumen libre que sólo permiten el transporte difusivo de masa.
10. La matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque los macroporos (sistema de poro 1) sin material interno comprende cavidades esféricas vacías y poros vacíos que son más pequeños que las cavidades y que conectan cavidades individuales mediante aberturas en las superficies de las cavidades.
11. La matriz de la reivindicación 10, caracterizada porque el material interno está localizado principalmente en las cavidades con el volumen libre continuo que se extiende entre el material interno y las paredes internas de los macroporos.
12. La matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque la matriz base y/o el material interno son/es de origen inorgánico u orgánico, por ejemplo, si es orgánico, se basa en un polímero hidrófilo o hidrófobo seleccionado entre copolimerizados de monómeros de divinilo o monovinilo, tales como divinil y monovinil bencenos, y polihidroxipolímeros tales como polisacáridos.
13. La matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque el material interno y/o las paredes de los macroporos y/o, si está presente, las paredes de los poros en el sistema de poro 3 muestran estructuras de afinidad.
14. El uso de la matriz de las reivindicaciones 1-13 para propósitos de separación permitiendo que un líquido que contiene sustancias que se quieren retirar del líquido, fluya a través de la matriz.
15. Un método para fabricar una matriz que comprende una matriz base que tiene macroporos en los que se sitúa un material interno, caracterizado porque comprende las etapas de:
(i) proporcionar una matriz base que tiene macroporos;
(ii) llenar los macroporos con una forma soluble del material interno;
(iii) transformar la forma soluble a una forma insoluble;
(iv) contraer la forma insoluble; y
(v) estabilizar el material de manera irreversible en su forma contraída.
16. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque dicho material interno comprende un polihidroxipolímero, por ejemplo, un polisacárido, que ha sido modificado químicamente, si es necesario, para mostrar la propiedad de contracción a utilizar.
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