ES2230624T5 - Composicion farmaceutica que comprende un compuesto que tiene actividad anti-xa y un compuesto antagonista de la agregacion plaquetaria. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE COMPRENDE UN COMPUESTO DE ACTIVIDAD ANTI - XA, UN COMPUESTO ANTAGONISTA DE LA AGREGACION DE PLAQUETA Y UN VEHICULO FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLE. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN PROCEDIMIENTO QUE PERMITE TRATAR O PREVENIR, EN UN PACIENTE, UN ESTADO TROMBOGENO ASOCIADO CON UN TRASTORNO ISQUEMICO DEBIDO A UNA TROMBOSIS Y QUE CONSISTE EN ADMINISTRAR AL PACIENTE UNAS CANTIDADES FARMACEUTICAMENTE EFICACES DE UN COMPUESTO DE ACTIVIDAD ANTI - XA Y DE UN COMPUESTO ANTAGONISTA DE LA AGREGACION DE PLAQUETA. ESTA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A LA UTILIZACION DE CANTIDADES FARMACEUTICAMENTE EFICACES DE UN COMPUESTO DE ACTIVIDAD ANTI - XA Y DE UN COMPUESTO ANTAGONISTA DE LA AGREGACION DE PLAQUETA EN LA PREPARACION DE UN MEDICAMENTO DESTINADO AL TRATAMIENTO O A LA PREVENCION DE UN ESTADO FISIOLOGICO ASOCIADO CON UN TRASTORNO ISQUEMICO CAUSADO POR LA TROMBOSIS, COMPRENDIENDO DICHAS CANTIDADES VARIOS RECIPIENTES DE SEPARACION, MIENTRASQUE, POR LO MENOS, UNO DE DICHOS RECIPIENTES CONTIENE UN COMPUESTO QUE TIENE UN ACTIVIDAD ANTI XA Y, AL MENOS, OTRO DE DICHOS RECIPIENTES CONTIENE UN COMPUESTO ANTAGONISTA DE AGREGACION DE PLAQUETA Y DICHOS RECIPIENTES CONTIENEN UN VEHICULO FARMACEUTICO.

Description

Composición farmacéutica que comprende un compuesto que tiene actividad anti-Xa y un compuesto antagonista de la agregación plaquetaria.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y un compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, que presenta una actividad inesperadamente eficaz para tratar o prevenir un proceso fisiológico asociado con un trastorno isquémico relacionado con trombosis en un paciente. La invención se refiere también a un método para tratar o prevenir un proceso trombogénico asociado con un trastorno isquémico relacionado con trombosis en un paciente, que comprende administrar cantidades farmacéuticamente eficaces de un compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y de un compuesto antagonista de la agregación plaquetaria.

Se ha demostrado que los antagonistas del receptor plaquetario de fibrinógeno son agentes eficaces para inhibir la formación de trombos dependientes de las plaquetas en modelos animales de trombosis coronaria. Igualmente, los resultados de los estudios clínicos han demostrado que los antagonistas del receptor plaquetario de fibrinógeno reducen la incidencia conjunta de sucesos isquémicos mayores cuando se administran a pacientes de alto riesgo que sufren angioplastia coronaria transluminal percutánea. Sin embargo, el marco terapéutico es muy estrecho para esta clase de compuestos, en parte, debido a que el alto grado de inhibición de la agregación plaquetaria ex vivo requerido para la eficacia antitrombótica se asocia a menudo con un marcado incremento en el tiempo de sangría determinado con plantilla, que es un marcador de complicaciones indeseables de hemorragia.

En los últimos años se han usado de manera eficaz heparinas de bajo peso molecular (LMWHs) y compuestos heparinoides (HCs) para la prevención y tratamiento de la trombosis venosa y de la tromboembolia asociada. Sin embargo, las LMWHs y los HCs están penetrando gradualmente en el repertorio de tratamiento para los procesos trombóticos arteriales. Los resultados preliminares que favorecen el uso de LMWH o HCs sobre la heparina no fraccionada en los procesos trombóticos arteriales están apoyados por varias diferencias farmacodinámicas, farmacocinéticas, y mecánicas entre estas dos clases de compuestos. Por ejemplo, se puede conseguir una anticoagulación fiable y segura con LMWHHs o HCs mediante la administración subcutánea sin monitorización. Comparados con la heparina, las LMWHs y los HCs tienen una biodisponibilidad más alta, una semivida relativamente larga, y parece que tienen un perfil más seguro. Además, las LMWHs son más resistentes que la heparina a la neutralización por el factor 4 plaquetario, que se libera de las plaquetas activadas, presumiblemente en el sitio de la trombosis
arterial.

La hemostasis, la bioquímica de la coagulación sanguínea, es un fenómeno extremadamente complejo en el que la sangre entera normal y el tejido corporal detienen espontáneamente la hemorragia de los vasos sanguíneos lesionados. La hemostasis eficaz requiere la actividad combinada de factores vasculares, plaquetarios y plasmáticos así como un mecanismo de control para prevenir la coagulación excesiva. Los defectos, deficiencias, o excesos de cualquiera de estos componentes pueden llevar a consecuencias hemorrágicas o trombóticas.

La adhesión, dispersión y agregación plaquetaria sobre las matrices extracelulares son sucesos centrales en la formación de trombos. Estos sucesos están mediados por una familia de glucoproteínas adhesivas, es decir, fibrinógeno, fibronectina, y factor de von Willebrand. El fibrinógeno es un co-factor para la agregación plaquetaria, mientras que la fibronectina refuerza las reacciones de uniones y dispersiones de las plaquetas, y el factor de von Willebrand es importante en la unión y dispersión plaquetaria sobre las matrices subendoteliales. Los sitios de unión del fibrinógeno, fibronectina y factor de von Willebrand han sido localizados en el complejo proteínico de la membrana plaquetaria conocido como glucoproteína IIb/IIIa.

Las glucoproteínas adhesivas, como el fibrinógeno, no se unen con las plaquetas normales en reposo. Sin embargo, cuando una plaqueta es activada con un agonista tal como trombina o adenosin-difosfato, la plaqueta cambia su forma, haciendo quizás que el sitio de unión GPIIb/IIIa sea accesible al fibrinógeno. El bloqueo del receptor de fibrinógeno, inhibe por tanto la agregación plaquetaria y la subsiguiente formación de trombos, y es útil para la prevención y tratamiento de procesos trombogénicos patológicos, tales como el ictus, enfermedad arterial oclusiva periférica, coagulación intravascular diseminada, y síndromes coronarios agudos tales como angina inestable e infarto de
miocardio.

Sumario de la invención

La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende un compuesto que tiene actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, un compuesto antagonista de la agregación plaquetaria y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención se refiere también a un método para tratar o prevenir un proceso trombogénico asociado con un trastorno isquémico relacionado con la trombosis en un paciente, que comprende administrar a dicho paciente cantidades farmacéuticamente eficaces de un compuesto que tiene actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y de un compuesto antagonista de la agregación plaquetaria.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa una información con relación a las medidas hemodinámicas en diversos muestreos de sangre durante la administración de diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, N-(n-butilsulfonil)-4-(piperidin-4-ilbutiloxi)-L-fenilalanina (BSPBPA), y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 2 representa un gráfico del número de reducciones del flujo sanguíneo cíclico (CFR) para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 3 representa un gráfico del tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 4 representa un gráfico del tiempo de protrombina (PT) para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 5 representa un gráfico de la actividad anti-Xa para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 6 representa un gráfico de la actividad anti-IIa para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 7 representa un gráfico del tiempo de sangría con plantilla para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 8 representa un gráfico del recuento de plaquetas para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 9 representa un gráfico de la agregación plaquetaria ex-vivo inducida por colágeno para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 10 representa un gráfico de la agregación plaquetaria ex-vivo inducida por ADP para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 11 representa un gráfico de la agregación plaquetaria ex-vivo inducida por ácido araquidónico para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 12 representa un gráfico de la agregación plaquetaria ex-vivo inducida por la trombina para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 13 representa una información con relación a las medidas hemodinámicas en diversos muestreos de sangre durante la administración de diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, amiduro de N-[N-[N-(4-(piperidin-4-il)butanoil)-N-etilglicil]aspartil]-L-\beta-ciclohexil-alanina (PBGACA), y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 14 representa un gráfico del número de reducciones del flujo sanguíneo cíclico (CFR) para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 15 representa un gráfico del tiempo de tromboplastina parcial activada (APTI) para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 16 representa un gráfico del tiempo de protrombina (PT) para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 17 representa un gráfico de la actividad anti-Xa para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 18 representa un gráfico de la actividad anti-IIa para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 19 representa un gráfico del tiempo de sangría con plantilla para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 20 representa un gráfico del recuento de plaquetas para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 21 representa un gráfico de la agregación plaquetaria ex-vivo inducida por colágeno, para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 22 representa un gráfico de la agregación plaquetaria ex-vivo inducida por ADP para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 23 representa un gráfico de la agregación plaquetaria ex-vivo inducida por ácido araquidónico para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

La Figura 24 representa un gráfico de la agregación plaquetaria ex-vivo inducida por trombina para diferentes concentraciones del compuesto con actividad anti-Xa, Enoxaparina, del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA, y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo.

Descripción detallada de la invención

Como se han usado anteriormente, y se usan a lo largo de la descripción de la invención, los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, se debe entender que tienen los siguientes significados:

Definiciones

"Paciente" incluye tanto los seres humanos como otros mamíferos.

"Cantidad eficaz" se usa para describir una cantidad de la composición según la presente invención eficaz para producir el efecto terapéutico deseado.

"Compuesto antagonista de la agregación plaquetaria" (PAAC) significa un compuesto que se une al receptor plaquetario GPIIb/IIIa (antagonista del receptor GPIIb/IIIa ) e inhibe competitivamente la unión del fibrinógeno, fibronectina y factor de von Willebrand así como inhibe también la agregación de las plaquetas activadas.

"Compuesto con actividad anti-Xa" significa un compuesto heparinoide o una heparina de bajo peso molecular (LMWH), o sus derivados sintéticos.

Realizaciones preferidas

Según una realización preferida de la invención, las siguientes referencias, incorporadas aquí como referencia, describen PAACs útiles: Lynch et al. J. Pharm. Expt. Thera. 272(1) 20 (1995); Kereiakes et al. JACC 27(3), 536 (1996); Peerlinck et al. Circulation 88(4), 1512 (1993); Barrett et al. Clin. Pharmacol. Ther. 56(4) 377 (1994); Cook et al. Thromb. Haemostas. 70(5), 838 (1993); Plow. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8057-61 (1985); Ruggeri, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5708-12 (1986); Ginsberg, et al., J. Biol. Chem. 260, 3931-36 (1985); y Gartner, et al.. J. Biol. Chem. 260, 11,891-94 (1987); Plow, E.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3711-3715 (1982); Tjoeng, et al., U.S. Patent Nos. 5.037.808, 4.879.313 y 4.992.463; Adams, et al., U.S. Patent No. 4.857.508; Haverstick, D.M., et al., Blood 66(4), 946-952 (1985); Topol et al., The Lancet. 343, 881 (1994), French Application No. 86/17507; Zimmerman, et al., U.S. Patent No. 4.683.291; European Application Publication No. 0 319 506; U.S. Patent No. 5.023.233; U.S. Patent No. 4.952.562; International Publication No. WO 91/04746; United States Application Serial No. 5.086.069; International Publication No. WO 92/13117; U.S. Pat. No. 5.053.392; U.S. Pat. No. 5.064.814; U.S. Pat. No. 5.051.405; European Patent Application 0479.481; European Patent Application 0478.362; U.S. Pat. No. 5.292.756; International Publication No. WO 95/10295; e International Publication No. WO 89/11538. Los PAAC más preferidos son los descritos en International Publication No. WO 89/11538, International Publication No. WO 95110295 o U.S. Pat. No. 5.292.756; son preferidos también Reopro® (abciximab), N-[N-[N-(4-(piperidin-4-il)butanoil)-N-etilglicil]aspartil]-L-\beta-ciclohexil-alanina, amiduro de N-[N-[N-(4-(piperidin-4-il)butanoil)-N-etilglicil]aspartil]-L-\beta-ciclohexil-alanina (PBGACA) o N-(n-butilsulfonil)-4-(piperidin4-ilbutiloxi)-L-fenilalanina (BSPBPA).

Según una realización preferida de la invención, las siguientes referencias, incorporadas aquí como referencia, describen LMWHs útiles según la invención y métodos para preparar las LMWH: Eur. Pat. No. 0014184; Medicinal Research Reviews 12(4), 373 (1992); Drugs of the Future 12(1), 45 (1987); International Publication No. WO 92/19249; U.S. Pat. No. 4.692.435; Barrowcliffe, Thromb. Res. 12, 27-36 (1977); Eur. Pat. Appln. No. 37319; Eur. Pat. Appln. No. 76279; U.S. Pat. No. 4.804.652; WO 81/3276; Eur. Pat. Appln. No. 244235, Eur. Pat. Appln. No. 244236; U.S. Pat. No. 4.486.420; U.S. Pat. No. 4.692.435; U.S. Pat. No. 4.826.827; U.S. Pat. No. 3.766.167; Eur. Pat. Appln. No. 40144; Eur. Pat. Appln. No.347588, Eur. Pat. Appln. No. 380943; U.S. Pat. No. 4533549; U.S. Pat. No. 4.629.699; Eur. Pat. Appln. No. 269981. Por ejemplo, un compuesto con actividad anti-Xa se puede producir como sigue: enriquecimiento por fraccionamiento en etanol y/o tamices moleculares, por ejemplo, filtración por gel o filtración por membrana de la LMWH presente en heparina estándar y despolimerización química controlada (por ácido nitroso, \beta-eliminación u oxidación con peryodato) o enzimática (por heparinasas). Las condiciones para la despolimerización se pueden controlar cuidadosamente para obtener productos de los pesos moleculares deseados. Comúnmente se usa la despolimerización por ácido nitroso. También se emplea la despolimerización del éster bencílico de la heparina por \beta-eliminación, lo que da el mismo tipo de fragmentos que la despolimerización enzimática usando heparinasas. Las LMWH con baja actividad anticoagulante y que mantienen la estructura química básica se preparan por despolimerización usando la oxidación con peryodato o por separación de la fracción de LMWH que se une a la antitrombina, o se preparan por otros métodos, usando la antitrombina inmovilizada para adsorción.

También es preferida una LMWH que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 3000 a aproximadamente 6500. Las LMWH comercialmente disponibles útiles según la invención incluyen las siguientes: Clexane®/
Klexane®/Lovenox® (Enoxaparina (ENOX)) que tienen una masa molecular media de 4500 \pm 1000 Dalton (Da), una distribución de masa molecular que comprende componentes de <2000 Da (16,0 \pm 4,0%) y 2000 a 8000 Da (78,0 \pm 10,0%), una actividad anti-Xa (IU/mg en base seca) de 90 a 125, y una relación anti-Xa/anti-IIa de 3,3 a 5,3; Fraxiparin® (Nardroparina) que tiene una masa molecular media de 4300 \pm 700 Da, una distribución de masa molecular que comprende componentes de <2000 Da (<15%), 2000 a 4000 Da (45 \pm 10%) y 2000 a 8000 Da (85 \pm 10%), actividad anti-Xa (IU/mg en base seca) de 95 a 130, y una relación anti-Xa/anti-IIa de 2,5 a 4,0; Fragmin® (Dalteparina) que tiene una masa molecular media de 6000 \pm 400 Da, una distribución de masa molecular que comprende componentes de <3000 Da (5,0 a 13,0%) y >8000 Da (15,0 a 25,0%), actividad anti-Xa (IU/mg en base seca) de 110 a 210, y una relación anti-Xa/anti-IIa de 1,9 a 3,2; Embolex®/Monoembolex® (Certroparina) que tiene una masa molecular media de 5200 \pm 1000 Da, una distribución de masa molecular que comprende componentes de <2000 Da (10 a 25%) y <8000 Da (75 a 90%), actividad anti-Xa (IU/mg en base seca) de 80 a 120, y una relación anti-Xa/anti-IIa de 1,5 a 2,5; Fluxum®/Minidalton®/Lowhepa® (Parnaparina) que tiene una masa molecular media de 5000 \pm 1000 Da, una distribución de masa molecular que comprende componentes de <3000 Da (20 a 30%) y 3000 a 8000 Da (50 a 60%), actividad anti-Xa (IU/mg en base seca) de 75 a 110, y una relación anti-Xa/anti-IIa de 2,0 a 3,0; Logiparin® (Tinzaparina) que tiene una masa molecular media de 3400 a 5600 Da, una distribución de masa molecular que comprende componentes de <2000 Da (2,0 a 16,0%), 2000 a 4000 Da (66,0 \pm 6,0%) y >8000 Da (12,0 a 38,0%), actividad anti-Xa (IU/mg en base seca) >70, y una relación anti-Xa/anti-IIa de 1,5 a 2,5; Clivarine® (Reviparina) y Normiflo® (ardeparina/heparina RD /RDH). Una LMWH preferida según la invención se prepara según los procedimientos descritos en la patente de Estados Unidos No. 4.486.420 o la patente de Estados Unidos No. 4.692.435; siendo más preferida la enoxaparina.

Según otra realización preferida de la invención, un compuesto con actividad anti-Xa es un compuesto heparinoide. Las siguientes referencias, incorporadas aquí como referencia, describen un compuesto heparinoide útil según la invención y métodos para preparar el compuesto heparinoide: U.S. Pat. No. 4.438.108, Eur. Pat. No. EP 66908, Zammit et al. Thromb. Haemostas. 71(6), 759 (1994), y Gent et al. Circulation 93, 80 (1996). Un compuesto heparinoide preferido comercialmente disponible útil según la invención es Orgaran® (Danaparoid) que tiene una masa molecular media de aproximadamente 6500 Da, una actividad anti-Xa (IU/mg en base seca) de aproximadamente 10, y una relación anti-Xa/anti-IIa de aproximadamente 28.

Los procesos trombogénicos preferidos tratables o prevenibles según la invención incluyen ictus, ateroesclerosis, angiogénesis, trombosis, procesos tromboembólicos tales como trombosis venosa profunda, embolismo pulmonar o tromboflebitis, coagulación intravascular diseminada o síndromes tromboembólicos asociados con cáncer, sepsis o complicaciones obstétricas, enfermedad oclusiva arterial periférica, y síndromes coronarios agudos tales como angina inestable e infarto de miocardio, hemodiálisis, o requerimiento de circulación extracorpórea asociada con un procedimiento quirúrgico o daño de los tejidos causado por las fosfolipasas A2 (PLA_{2}); los más preferidos son la angina inestable y el infarto de miocardio.

Otra realización preferida según la invención es el uso en el curso de un procedimiento médico en el que hay una posibilidad de aparición de un proceso trombogénico patológico, tal como durante la cirugía de una derivación arterial coronaria o de angioplastia coronaria transluminal percutánea con o sin colocación de una endoprótesis intracoronaria; la más preferida es la angioplastia coronaria transluminal percutánea con o sin colocación de una endoprótesis intracoronaria.

Otra realización preferida según la invención es el uso de cantidades farmacéuticamente eficaces de un compuesto que tiene una actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y un antagonista de la agregación plaquetaria en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir un proceso fisiológico asociado con un trastorno isquémico relacionado con trombosis.

En el método de tratamiento o prevención según la invención el compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria se pueden administrar de diferentes maneras, tales como en terapias de combinación empleando opcionalmente procedimientos médicos. Por ejemplo, el compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria se pueden administrar a un paciente concomitantemente o a diferentes tiempos siempre que sean administrados de tal modo que en un periodo de tiempo estén presentes en el paciente cantidades farmacéuticamente eficaces de ambos compuestos de tal modo que resulte un efecto terapéutico según la invención.

Por tanto, es un objetivo adicional de la invención proporcionar un kit para tratar o prevenir un proceso fisiológico asociado con un trastorno isquémico relacionado con trombosis, comprendiendo dicho kit una pluralidad de recipientes separados, en el que al menos uno de dichos recipientes contiene un compuesto que tiene actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y al menos otro de dichos recipientes contiene un compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, y dichos recipientes contienen opcionalmente un vehículo farmacéutico, cuyo kit puede ser utilizado eficazmente para llevar a cabo terapias de combinación según la invención. Otra realización de un kit debe ser aquel con los mencionados recipientes en el que al menos uno de dichos recipientes debe contener el compuesto que tiene actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, sin la presencia del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, y al menos otro de dichos recipientes debe contener el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria sin la presencia del compuesto que tiene actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina.

En la práctica, el compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria se pueden administrar parenteralmente, tópicamente, rectalmente, transdérmicamente, intrapulmonarmente u oralmente, pero preferiblemente se administran parenteral y/o oralmente.

Las composiciones adecuadas que contienen los compuestos usados según la invención se pueden preparar por medios convencionales. Por ejemplo, los compuestos usados según la invención se pueden disolver o suspender en un vehículo adecuado.

Los compuestos usados según la invención se deben presentar en formas que permiten la administración por la vía más adecuada, y la invención se refiere también a una composición farmacéutica que contiene los compuestos usados según la invención que son adecuados para uso en medicina humana o veterinaria. Estas composiciones se pueden preparar según los métodos habituales, usando uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, que comprenden adyuvantes o excipientes. Los adyuvantes comprenden, entre otros, diluyentes, medios acuosos estériles y los diferentes disolventes orgánicos no tóxicos. Las composiciones se pueden presentar en forma de comprimidos, píldoras, cápsulas, comprimidos para chupar, pastillas para chupar, caramelos duros, gránulos, polvos, soluciones o suspensiones acuosas, soluciones inyectables, elixires o jarabes, polvos, solución o suspensión para administración intrapulmonar y pueden contener uno o más agentes elegidos del grupo que comprende edulcorantes, aromatizantes, colorantes, o estabilizantes con el fin de obtener preparaciones farmacéuticamente aceptables.

La elección del vehículo y el contenido de los compuestos usados según la invención en el vehículo se determinan generalmente de acuerdo con la solubilidad y propiedades químicas de los compuestos, el modo particular de administración y las provisiones a ser observadas en la práctica farmacéutica. Por ejemplo, para preparar comprimidos se pueden utilizar excipientes tales como agua estéril, solución de Ringer, lactosa, citrato de sodio, soluciones salinas isotónicas (fosfato de monosodio o de disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, o mezclas de tales sales), carbonato de calcio y agentes desintegrantes tales como almidón, ácidos algínicos y ciertos silicatos complejos combinados con lubrificantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco. Para preparar una cápsula, es ventajoso usar lactosa y polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se usan soluciones acuosas, éstas pueden contener agentes emulsionantes o agentes que facilitan la suspensión. Se pueden usar también diluyentes tales como sacarosa, etanol, polietilenglicol, propilenglicol, glicerol y cloroformo o sus mezclas.

Para la administración parenteral, son útiles emulsiones, suspensiones o soluciones de los compuestos usados según la invención en aceite vegetal, por ejemplo aceite de sésamo, aceite de cacahuete o aceite de oliva, o soluciones orgánicas-acuosas tales como agua y propilenglicol, ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo, así como soluciones acuosas estériles de las sales farmacéuticamente aceptables. Las soluciones de las sales de los compuestos usados según la invención son especialmente útiles para la administración por inyección intramuscular, intravenosa, intraarterial o subcutánea o por técnicas de perfusión. Las soluciones acuosas, que comprenden también las soluciones de las sales en agua destilada pura, se pueden usar para administración intravenosa con la condición de que su pH sea debidamente ajustado, de que sean prudentemente tamponadas y hechas isotónicas con una cantidad suficiente de glucosa o de cloruro de sodio y de que sean esterilizadas por calor, irradiación o microfiltración.

El compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria según la invención se pueden formular también de una manera que resiste el aclaramiento rápido desde la pared vascular (arterial o venosa) por convección y/o difusión, con lo que se aumenta el tiempo de residencia de la composición en el sitio de acción deseado. El efecto prolongado (depot) útil según la invención se puede conseguir en una matriz de copolímeros, tales como acetato de etilen-vinilo, o en un gel de poli(alcohol vinílico) rodeado por una cubierta Silastic. Alternativamente, el compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria se pueden administrar localmente a partir de un polímero de silicona implantado en la adventicia.

Un método alternativo para minimizar el periodo de lavado del compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria durante la administración percutánea, transvascular, comprende el uso de micropartículas no difusibles, que eluyen el fármaco. Las micropartículas pueden estar compuestas de una variedad de polímeros sintéticos, tales como polilactida por ejemplo, o sustancias naturales, incluyendo proteínas o polisacáridos. Tales micropartículas facilitan la manipulación estratégica de variables que incluyen la dosis total de un fármaco y la cinética de su liberación. Las micropartículas se pueden inyectar eficientemente en la pared arterial o venosa por medio de un catéter balón poroso o de una endoprótesis vascular en balón, y se retienen en la pared vascular y el tejido periadventicial durante al menos aproximadamente dos semanas. Las formulaciones y metodologías para la administración local, intravascular específica del sitio, de agentes terapéuticos se discuten en Reissen et al. (J. Am. Coll. Cardiol.. 1994; 23: 1234-1244), cuyos contenidos completos se incorporan aquí como referencia.

El medio para el compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria puede ser también un hidrogel que se prepara a partir de cualquier polímero (homo o hetero) biocompatible o no-citotóxico, tal como un polímero hidrófilo de poli(ácido acrílico) que puede actuar como una esponja que absorbe el fármaco. Tales polímeros han sido descritos, por ejemplo, en la solicitud WO 93/08845, cuyos contenidos completos se incorporan aquí como referencia. Algunos de ellos, tales como, en particular, los obtenidos de óxidos de etileno y/o de propileno están comercialmente disponibles.

En adición, el compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria se pueden administrar directamente a la pared de los vasos sanguíneos por medio de un balón de angioplastia que está recubierto con una película hidrófila (por ejemplo un hidrogel), o por medio de cualquier otro catéter que contiene una cámara de perfusión para los compuestos, que se puede aplicar por tanto de manera precisa al sitio a ser tratado.

El porcentaje del compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria usados según la invención puede ser variado. Los compuestos deben constituir una proporción tal que se pueda obtener una dosis adecuada. Evidentemente, se pueden administrar varias formas farmacéuticas unitarias. La dosis empleada será determinada por el médico, y depende del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración y de la duración del tratamiento, y del estado del paciente. En cada caso particular, las dosis se determinarán de acuerdo con los factores distintivos del sujeto a ser tratado, tales como la edad, peso, estado general de salud y otras características que pueden influir en la eficacia del medicamento.

En los adultos, las dosis del PAAC varían generalmente desde aproximadamente 0,0001 hasta aproximadamente 50, preferiblemente desde aproximadamente 0,0001 hasta aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal al día por inhalación, desde aproximadamente 0,001 hasta aproximadamente 100, preferiblemente de 0,01 a 70, más especialmente de 0,05 a 10 mg/kg de peso corporal al día por administración oral, y desde aproximadamente 0,0001 hasta aproximadamente 10, preferiblemente de 0,001 a 1 mg/kg de peso corporal al día por administración intravenosa.

En los adultos, las dosis del compuesto con actividad anti-Xa según la invención, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, son particularmente útiles en dosis de aproximadamente 10 a aproximadamente 25,000 unidades internacionales de actividad anti-Xa.

El compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria usados según la invención se pueden administrar tan frecuentemente como sea necesario con el fin de obtener el efecto terapéutico deseado. El régimen posológico para llevar a cabo el método de esta invención es aquel que asegura la máxima respuesta terapéutica hasta que se obtiene una mejoría y después el mínimo nivel eficaz que proporciona alivio. Algunos pacientes pueden responder rápidamente a una dosis más alta o más baja y pueden encontrar adecuadas dosis de mantenimiento mucho más débiles. En la invención se contemplan tanto los regímenes de tratamiento a corto plazo como los regímenes de tratamiento a largo plazo. Se contemplan también los tratamientos en la proporción de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 dosis al día, de acuerdo con los requerimientos fisiológicos de cada paciente particular, teniendo naturalmente en consideración, que en la selección de las dosis apropiadas en cada caso específico, se debe tener en cuenta el peso del paciente, el estado general de salud, la edad, y otros factores que pueden influir en la respuesta al fármaco. Por tanto, para otros pacientes, será necesario prescribir no más de una o dos dosis al día.

Los compuestos de la presente invención se pueden formular también para uso conjuntamente con otros agentes terapéuticos como tales agentes o en conexión con la aplicación de técnicas terapéuticas para tratar procesos farmacológicos que se pueden mejorar por la aplicación de un compuesto de la fórmula I, tal como en los siguientes casos:

Los compuestos de la presente invención se pueden usar en el tratamiento de la restenosis post-angioplastia usando cualquier dispositivo tal como un balón, ablación o técnicas con láser. Los compuestos de la presente invención se pueden usar en el tratamiento de la restenosis después de la colocación de una endoprótesis en el sistema vascular ya sea como 1) tratamiento primario del bloqueo vascular, o 2) en el caso en que la angioplastia que usa cualquier dispositivo falla para conseguir una arteria permeable. Los compuestos de la presente invención se pueden usar o bien oralmente, por administración parenteral o bien el compuesto se puede aplicar tópicamente por medio de la intervención de un dispositivo específico o bien como una cubierta formulada apropiadamente sobre un dispositivo de endoprótesis.

Los compuestos de la presente invención se pueden usar en el tratamiento de la restenosis en combinación con cualquier agente anticoagulante, antiplaquetario, antitrombótico o profibrinolítico. A menudo los pacientes son tratados de forma concurrente antes, durante y después de los procedimientos de intervención con agentes de estas clases, ya sea con el fin de realizar el procedimiento de intervención de una forma segura o ya sea para prevenir los efectos perjudiciales de la formación de trombos. Algunos ejemplos de clases de agentes conocidos como agentes anticoagulantes, antiplaquetarios, antitrombóticos o profibrinolíticos incluyen cualquier formulación de los inhibidores de trombina o inhibidores del Factor VIIa. Algunos ejemplos de clases de agentes conocidos como agentes anticoagulantes. antiplaquetarios, antitrombóticos o profibrinolíticos incluyen cualquier formulación de aspirina, inhibidores directos de la trombina, inhibidores directos del Factor Xa, o inhibidores del Factor Vlla.

Los compuestos de la presente invención se pueden usar en combinación con algún agente antihipertensivo o agente regulador del colesterol o de los lípidos en el tratamiento de la restenosis o ateroesclerosis concurrentemente con el tratamiento de la hipertensión o ateroesclerosis. Algunos ejemplos de agentes que son útiles en el tratamiento de la hipertensión incluyen compuestos de las siguientes clases; beta-bloqueantes, inhibidores de la ACE, antagonistas del canal del calcio y antagonistas de los alfa-receptores. Algunos ejemplos de agentes que son útiles en el tratamiento de niveles altos de colesterol o niveles no regulados de lípidos incluyen los compuestos conocidos como inhibidores de la HMGCoA-reductasa, compuestos de la clase fibratos.

El compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria usados según la invención presentan marcadas actividades farmacológicas según los ensayos descritos en la bibliografía, por cuyos resultados se entiende que hay correlación entre la actividad farmacológica en los seres humanos y en otros mamíferos. Los siguientes resultados de los ensayos farmacológicos son típicamente característicos del compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria usados según la invención.

Los siguientes ensayos farmacológicos evalúan la actividad del compuesto con actividad anti-Xa, es decir un compuesto heparinoide o enoxaparina, y del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria usados según la invención. Estos ensayos incluyen las medidas hemodinámicas durante la administración de diferentes concentraciones de un compuesto con actividad anti-Xa, de un compuesto antagonista de la agregación plaquetaria y de la composición de los mismos a lo largo del tiempo (Figuras 1 y 13). Más específicamente se tomaron medidas de la reducción del flujo cíclico (Figuras 2 y 14), tiempo de tromboplastina parcial activada (Figuras 3 y 15), tiempo de protrombina (Figuras 4 y 16), actividad anti-Xa (Figuras 5 y 17), actividad anti-IIa (Figuras 6 y 18), tiempo de sangría con plantilla (Figuras 7 y 19), recuento de plaquetas (Figuras 8 y 20), agregación plaquetaria ex-vivo inducida por colágeno (Figuras 9 y 21), agregación plaquetaria ex-vivo inducida por ADP (Figuras 10 y 22), agregación plaquetaria ex-vivo inducida por ácido araquidónico (Figuras 11 y 23), y agregación plaquetaria ex-vivo inducida por trombina (Figuras 12 y 24).

Las composiciones de la presente invención presentan una marcada actividad en los ensayos precedentes y se consideran útiles en la prevención y tratamiento de la trombosis asociada con ciertas enfermedades. La actividad antitrombótica en el ensayo de agregación plaquetaria canina ex vivo es predictiva de tal actividad en los seres humanos (véase, por ejemplo, Catalfamo, J. L., y Dodds, W. Jean, "Isolation of Platelets from Laboratory Animals", Methods Enzymol. 169, Part A, 27 (1989)).

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Materiales y métodos

Todos los procedimientos de este estudio se realizan cumpliendo las Animal Welfare Act Regulations y la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (DHEW Publication No. NIH 85-23, 1985).

El protocolo de ensayo que sigue es un modelo experimental de angina inestable.

Se anestesian perros Mongrel de cualquier sexo (15-21 kg) con pentobarbital sódico (30 mg/kg, i.v., con administración suplementaria si fuera necesario), se intuban, y se ventilan usando un respirador Harvard (Harvard Apparatus, S. Natick, MA). Se coloca un catéter tri-vascular (SAFEDWELLplus, Becton Dickinson, Sandy, UT) en la vena femoral derecha para la administración de los agentes de ensayo y de la anestesia suplementaria. Se canula la arteria femoral derecha para la medida de la tensión arterial y para obtener muestras de sangre.

Se realiza una toracotomía izquierda en el quinto espacio intercostal y se suspende el corazón en un puente pericárdico. Se aísla la arteria coronaria circunfleja izquierda (LCX) y se disecciona un trecho de 2 cm, ligando las ramas laterales cuando sea necesario. Se coloca una sonda electromagnética de flujo (Carolina Medical Electronics, 501D) en el vaso sanguíneo para monitorizar el flujo sanguíneo coronario y se coloca una ligadura de lazo en la porción distal del vaso sanguíneo para producir una oclusión mecánica temporal que se usa para ayudar a ajustar el grado de estenosis y para ayudar a validar las medidas a flujo cero.

En la posición distal a la sonda de flujo, se coloca un oclusor Lexan® con el fin de crear una estenosis crítica, que se confirma por la abolición de la respuesta hiperémica hasta una oclusión mecánica del vaso sanguíneo de 10 segundos. Las células del endotelio y las células del músculo liso vascular se dañan al comprimir el vaso sanguíneo con una pinza vascular. Estas condiciones dan como resultado la adhesión y la agregación plaquetaria en el área dañada, produciendo de este modo una disminución gradual del flujo sanguíneo coronario. Cuando el flujo llega a cero, se mueve el oclusor de adelante a atrás sobre el área dañada para desplazar mecánicamente el trombo rico en plaquetas, restableciendo de este modo el flujo sanguíneo. Este modelo repetitivo de disminución del flujo sanguíneo que se restablece por la rotura mecánica del trombo plaquetario se conoce como reducciones cíclicas del flujo sanguíneo (CFRs). El efecto antitrombótico de los agentes de ensayo se cuantifica comparando el número de CFRs que tienen lugar durante un periodo de control de 20 min con el número de CFRs durante 20 min para tres periodos consecutivos de 20 min después de la administración del fármaco. Una reducción significativa del número de CFRs se considera que representa un efecto antitrombótico.

Protocolo experimental a. Protocolo que usa BSPBPA

Se asignan treinta perros a uno de seis grupos de tratamiento complementarios. Los compuestos se administran como una inyección intravenosa en embolada solamente (para N-(n-butilsulfonil)-4-(piperidin-4-ilbutiloxi)-L-fenilalanina (BSPBPA) o vehículo de solución salina) o como una inyección intravenosa en embolada más una perfusión intravenosa constante (para heparina, enoxaparina (ENOX), o vehículo de solución salina. Los grupos de tratamiento son: 1) BSPBPA (30 \mug/kg), II) BSPBPA (300 \mug/kg), III) ENOX (0,5 mg/kg + 5 \mug/kg/min), IV) ENOX (0,5 mg/kg + 5 \mug/kg/min) más BSPBPA (30 \mug/kg), V) heparina (60 U/kg + 0,7 U/kg/min), y VI) heparina (60 U/kg + 0,7 U/kg/min) más BSPBPA (30 \mug/kg). Todos los compuestos se diluyen en solución salina y se preparan inyecciones en embolada usando un volumen de 5 ml y se preparan perfusiones constantes usando un volumen de 22 ml.

a. Protocolo que usa PBGACA

Se asignan treinta perros a uno de seis grupos de tratamiento complementarios. Los compuestos para estos experimentos implican la administración de los siguientes agentes como una inyección en embolada y como una perfusión constante (para amiduro de N-[N-[N-(4-(piperidin-4-il)butanoil-N-etilglicil]aspartil]-L-\beta-ciclohexil-alanina (PBGACA) o vehículo de solución salina) o como una inyección intravenosa en embolada más una perfusión intravenosa constante (para heparina, ENOX, o vehículo de solución salina. Los grupos de tratamiento fueron: I) PBGACA (10 \mug/kg + 0,15 \mug/kg/min), II) PBGACA (30 \mug/kg + 0,15 \mug/kg/min), III) ENOX (0,5 mg/kg + 5 \mug/kg/min), IV) ENOX (0,5 mg/kg + 5 \mug/kg/min) más PBGACA (10 \mug/kg + 0,15 \mug/kg/min), V) heparina (60 U/kg + 0,7 U/kg/min), y VI) heparina (60 U/kg + PBGACA (10,\mug/kg + 0,15 \mug/kg/min). Todos los compuestos se diluyen en solución salina y se preparan inyecciones en embolada usando un volumen de 5 ml y se preparan perfusiones constantes usando un volumen de 22 ml.

Una vez que se han establecido CFRs consistentes durante al menos 20 minutos, se administran los compuestos como se ha descrito antes y se monitoriza el flujo sanguíneo durante el periodo de perfusión de una hora. Se sacan muestras de sangre arterial antes de la administración de los agentes de ensayo (muestra control) y a los 5, 10, 30, y 60 min después de la administración de los compuestos. Se sacan muestras de sangre sobre un volumen 1/10 de citrato de trisodio al 3,8% y se usan para los ensayos de la agregación plaquetaria ex vivo, recuento de plaquetas, niveles anti-Xa, niveles anti-IIa, y tiempo de coagulación (tiempo de tromboplastina parcial activada, APTT, y tiempo de protrombina, PT). Las muestras de sangre (4,5 ml) obtenidas para análisis de los niveles anti-Xa y anti-IIa se recogen en jeringas enfriadas que contienen 0,5 ml de citrato de trisodio e inmediatamente se ponen sobre hielo. Durante la duración del protocolo se registran la tensión arterial media, el ritmo cardiaco y EKG (polígrafo Grass, modelo 7D, Grass Instruments, MA).

Tiempos de coagulación y tiempo de sangría con plantilla. El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) y el tiempo de protrombina (PT) se miden usando un Microsample Coagulation Analyzer (MCA210, Bio Data Corp, Horsham, PA) y reactivos Dade® (Tromboplastin-C Plus y Actin® FS Activated PTT reagent, Baxter Diagnostics. Inc., Deerfield, IL).

El APTT es el método más ampliamente usado para monitorizar la terapia de anticoagulación con heparina intravenosa. Es también un ensayo fundamental de cribado para deficiencias o anormalidades de los factores de coagulación intrínsecos: VIII, IX, XI, XII, y factores comunes tanto para las rutas intrínsecas como para las rutas extrínsecas: I (fibrinógeno), II, V, X. Cuando se usa conjuntamente con plasma sustrato deficiente, el APTT proporciona la base para la cuantificación de los factores de coagulación específicos.

La capacidad intrínseca de la sangre para formar un coágulo de fibrina requiere los factores de coagulación XII. XI, IX, VIII, X, V, II (protrombina), fibrinógeno, lípidos plaquetarios, y calcio.

Al añadir una sustancia que activa los factores XII y XI, los factores de contacto, el tiempo parcial de tromboplastina se convierte en el tiempo parcial de tromboplastina "activada" (APTT). Debido a que los puntos finales de la coagulación son más cortos y más agudos que con el PTT, se ha demostrado que el APTT es una medida más sencilla y altamente fiable del mecanismo intrínseco de la coagulación.

Procedimiento de ensayo

1.

Preincubar cloruro de calcio 0,025 M a 37ºC.

2.

Pipetear 0,1 ml de reactivo APTT reconstituido en una cubeta de ensayo.

3.

Añadir 0,1 ml de plasma de ensayo o plasma de control.

4.

Incubar a 37ºC durante 5 minutos exactamente.

5.

Añadir 0,1 ml del cloruro de calcio preincubado, y simultáneamente poner en marcha el cronómetro.

6.

Registrar el tiempo de coagulación.

El tiempo de protrombina es el método para monitorizar la terapia oral de anticoagulación. Es también un ensayo de cribado fundamental para una deficiencia o anormalidad del factor extrínseco de coagulación VII, y de los factores comunes a ambas rutas hemostásicas, intrínseca y extrínseca: fibrinógeno II, V y X. Cuando se usa conjuntamente con un plasma sustrato deficiente, el PT proporciona la base para la cuantificación de los factores de coagulación específicos.

La capacidad de la sangre para formar un coágulo de fibrina por medio de la ruta hemostásica extrínseca requiere tromboplastina tisular, calcio, factor VII, factor V, factor X, factor II (protrombina) y factor I (fibrinógeno). Cuando se añaden tromboplastina tisular y calcio a una muestra de plasma citratado, se evitan las acciones de los factores intrínsecos y la reacción se hace específica para los factores de coagulación implicados en las rutas extrínseca y común.

Procedimiento de ensayo

1.

Preincubar el reactivo PT reconstituido a 37ºC.

2.

Pipetear 0,1 ml de plasma de ensayo o plasma de control en una cubeta de ensayo.

3.

Incubar a 37ºC durante al menos 2 minutos, pero no más de 10 minutos.

4.

Inyectar 0,2 ml del reactivo preincubado, y simultáneamente poner en marcha el cronómetro.

5.

Registrar el tiempo de coagulación.

Las medidas del tiempo de sangría con plantilla se obtienen en los mismos puntos de tiempo que las muestras de sangre, como se ha mencionado previamente. El tiempo de sangría con plantilla se mide después de hacer una incisión uniforme en la membrana de la mucosa del interior del labio superior con un dispositivo de incisión Surgicutt® automático (ITC, Edison, NJ). Se coagula la sangre con papel de coagulación en el tiempo de sangría Surgicutt® cada 30 segundos, teniendo cuidado de no alterar el sitio de incisión. El tiempo de sangría con plantilla se mide desde el momento de la incisión hasta que la sangre no tiñe más el papel de coagulación. Se toman como máximos los tiempos de sangrías de 10 minutos.

Actividad anti-Xa y anti-IIa

Estas muestras se centrifugan a 1500 x g durante10 min a 4ºC. Se separa el plasma y se conserva a -70ºC hasta su ensayo. Se analizan las actividades anti-Xa y anti-IIa por métodos cromogénicos usando kits suministrados por American Diagnostica (actichrome® heparina y actichrome® heparina anti-IIa, Greenwich, CT), con modificaciones menores. Las incubaciones y reacciones se llevan a cabo a 37ºC. La actividad amidolítica (unidades milli-ópticas, o mOD) se determina usando un espectrofotómetro para placas de microtitulación SPECTRAmax y un software Softmax Pro (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA). Para construir las curvas estándar para medir la actividad anti-Xa y anti-IIa de la heparina y ENOX, se usa el 1st International LMWH Standard (National Institute for Biological Standards y Control, London; actividad anti-Xa 168 IU/mg y actividad anti-IIa 66,5 IU/mg). Se construyen las curvas usando un modelo de ajuste de curvas de cuatro parámetros (Softmax Pro, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los valores de la actividad anti-Xa y anti-IIa de la heparina y ENOX se registran en unidades internacionales.

Agregación plaquetaria

El ensayo de inhibición de la agregación plaquetaria ex-vivo se basa en el de Zucker. "Platelet Aggregation Measured by the Photoelectric Method", Methods in Enzymology 169, 117-133 (1989).

El plasma rico en plaquetas (PRP) se prepara por centrifugación de las muestras de sangre a 150 x g durante 10 min. Después de separar el sobrenadante que contiene PRP, se prepara el plasma pobre en plaquetas (PPP) por centrifugación de la muestra restante a 1000 x g durante10 min. Se determina el recuento de plaquetas con un contador de partículas Coulter ZM o Coulter ZBI (Coulter Instruments, Hialeah, FL). Cuando sea necesario, se ajusta el recuento de plaquetas a 3 x 10^{8} plaquetas/ml usando PPP autólogo. Se incuba el PRP (250 \mul) a 37ºC mientras se agita a 1200 rpm. Después de preincubación con epinefrina durante 1 min (1 \muM, Chrono-par 393, Chrono-log Corp., Havertown, PA), se induce la agregación plaquetaria por adenosin-difosfato (ADP, 10 \muM, Chrono-par 384, Chrono-log Corp., Havertown, PA), colágeno (tendón equino, 10 \mug/ml, Chrono-par 385, Chrono-log Corp., Havertown, PA), ácido araquidónico (1 mM, Biodata Corp, Horsham, PA) o trombina (4 Units/ml, Enzyme Research Institute, South Bend, IN; más Gly-Pro-Arg-Pro, un inhibidor de la polímerización de la fíbrina, 2 mM, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). La agregación plaquetaria se monitoriza espectrofotométricamente con un agregador plaquetario PAP-4C (Bio Data Corp, Horsham. PA). Los resultados se expresan como un porcentaje de inhibición de la tasa de agregación comparada con la respuesta de agregación previa al fármaco.

Estadística

Los datos obtenidos por muestreo múltiple durante el experimento se analizan mediante análisis de varianza de dos vías con medidas repetidas. Después de esto se realizan múltiples comparaciones de medios para controlar los valores dentro de los grupos de tratamiento, y la comparación de los datos de ENOX con otros grupos de tratamiento, usando el ensayo con la diferencia menos significativa. Un valor p menor de 0,05 se considera significativo.

Resultados

El uso combinado de un compuesto con actividad anti-Xa y un compuesto antagonista de la agregación plaquetaria usados según la invención, proporciona el uso de estos compuestos a dosis que deberían ser subeficaces si se usaran individualmente, a la vez que efectúa la inhibición de la formación repetitiva de trombos plaquetarios hasta el mismo punto que las dosis altas del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria sin aumentar de forma significativa el tiempo de sangría con plantilla (como comparación: un aumento de >5 veces en el tiempo de sangría con plantilla causado por una dosis alta del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, BSPBPA; y un aumento de \sim3 veces en el tiempo de sangría con plantilla causado por una dosis alta del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, PBGACA).

La combinación de una dosis baja de un compuesto antagonista de la agregación plaquetaria con heparina, a una dosis que aumenta el APTT de 2,0 a 2,5 veces sobre la línea base, no inhibió la formación repetitiva de trombos plaquetarios.

La presente invención puede ser realizada en otras formas específicas sin separarse del espíritu o atributos esenciales de la misma.

Claims (16)

1. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y cantidades farmacéuticamente eficaces de un compuesto heparinoide o enoxaparina y de un compuesto antagonista de la agregación plaquetaria.

2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el compuesto que tiene actividad anti-Xa es un compuesto heparinoide.

3. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el compuesto heparinoide es danaparoid.

4. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria es abciximab, N-[N-[N-(4-(piperidin-4-il)butanoil)-N-etilglicil]aspartil]L-\beta-ciclohexi]-alanina, amiduro de N-[N-[N-(4-(piperidin-4-il)butanoil)-N-etilglicil]aspartil]-L-\beta-ciclohexil-alanina o N-(n-butilsulfonil)-4-(piperidin-4-ilbutiloxi)-L-fenilalanina.

5. La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria es abciximab.

6. La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria es N-[N-[N-(4-(piperidin-4-il)butanoil)-N-etilglicil]aspartil]-L-\beta-ciclohexil-alanina.

7. La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria es amiduro de N-[N-[N-(4-(piperidin-4-il)butanoil)-N-etilglicil]aspartil]-L-\beta-ciclohexil-alanina.

8. La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria es N-(n-butilsulfonil)-4-(piperidin-4-ilbutiloxi)-L-fenilalanina.

9. El uso de cantidades farmacéuticamente eficaces de una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir un estado fisiológico asociado con un trastorno isquémico relacionado con trombosis.

10. El uso de la reivindicación 9, en el que el estado fisiológico se selecciona entre ictus, ateroesclerosis, angiogénesis, trombosis, un estado tromboembólico, coagulación intravascular diseminada, enfermedad oclusiva arterial periférica, hemodiálisis, un requerimiento de circulación extracorpórea asociada con un procedimiento quirúrgico, daño de los tejidos causado por las fosfolipasas A2, un síndrome coronario agudo, o un síndrome tromboembólico asociado con cáncer, sepsis o complicaciones obstétricas.

11. El uso según la reivindicación 9, en el que el estado fisiológico es el síndrome coronario agudo.

12. El uso según la reivindicación 11, en el que el síndrome coronario agudo es angina inestable o infarto de miocardio.

13. El uso según la reivindicación 9, en el que el tratamiento o prevención tiene lugar en el curso de una derivación quirúrgica de la arteria coronaria o de una angioplastia coronaria transluminal percutánea.

14. El uso según la reivindicación 9, en el que el tratamiento o prevención tiene lugar en el curso de una angioplastia coronaria transluminal percutánea.

15. Un kit para tratar o prevenir un estado fisiológico asociado con un trastorno isquémico relacionado con trombosis, comprendiendo dicho kit una pluralidad de recipientes separados, en el que al menos uno de dichos recipientes contiene enoxaparina y al menos otro de dichos recipientes contiene un compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, y dichos recipientes contienen opcionalmente un vehículo farmacéutico.

16. Un kit según la reivindicación 15, en el que de dichos recipientes, al menos uno de dichos recipientes debe contener enoxaparina sin la presencia del compuesto antagonista de la agregación plaquetaria, y al menos otro de dichos recipientes debe contener el compuesto antagonista de la agregación plaquetaria sin la presencia de enoxaparina.