ES2230561T3

ES2230561T3 - Nuevas criptoficinas de sintesis.

Info

Publication number: ES2230561T3
Application number: ES96910399T
Authority: ES
Inventors: Richard E. Moore; Marcus A. Tius; Russell A. Barrow; Jian Liang; Thomas H. Corbett; Frederick A. Valeriote; Thomas K. Hemscheidt; Trimurtulu Golakoti
Original assignee: University of Hawaii at Manoa; Wayne State University; University of Hawaii at Hilo
Current assignee: University of Hawaii at Manoa; Wayne State University; University of Hawaii at Hilo
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: PL185949B1; SK119997A3; NO974105L; OA10614A; JP4181632B2; EP0830136A4; BG101875A; AP737A; CN1183726A; HU225041B1; PL322507A1; NO326685B1; AP9701069A0; DE69633667D1; ATE279935T1; JPH11510476A; HUP9801880A3; MD2196B2; DE69633667T2; NO974105D0

Abstract

SE DESCRIBEN NUEVOS COMPUESTOS DE CRIPTOFICINA, JUNTO CON PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR CRIPTOFICINAS MEDIANTE SINTESIS TOTAL, Y PROCEDIMIENTOS PARA EL USO DE ESTAS CRIPTOFICINAS EN PRODUCTOS FARMACEUTICOS PARA INHIBIR LA PROLIFERACION DE CELULAS DE MAMIFERO Y PARA TRATAR LA NEOPLASIA.

Description

Nuevas criptoficinas de síntesis.

Esta invención se ha financiando en parte por el Gobierno de EE.UU., con los números de subvención CA12623 y CA53001 del Departamento de Salud y Servicios Humanos del Instituto Nacional del Cáncer. En consecuencia, el Gobierno de EE.UU. puede tener ciertos derechos sobre esta invención.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades neoplásicas, caracterizadas por la proliferación de células no sujetas al control normal del crecimiento celular, son una causa principal de muerte en seres humanos. La experiencia clínica con quimioterapia ha demostrado que es deseable conseguir fármacos nuevos y más eficaces para tratar estas enfermedades. Tal experiencia también ha demostrado que los fármacos que alteran el sistema de microtúbulos del citoesqueleto pueden ser eficaces en la inhibición de la proliferación de células neoplásicas.

El sistema de microtúbulos de las células eucariotas es un componente principal del citoesqueleto y está en un estado dinámico de ensamblaje y desensamblaje; es decir, heterodímeros de tubulina se polimerizan para formar microtúbulos y los microtúbulos se despolimerizan en sus componentes constituyentes. Los microtúbulos desempeñan un papel crucial en la regulación de la arquitectura, el metabolismo y la división celulares. El estado dinámico de los microtúbulos es fundamental para su función normal. Con relación a la división celular, la tubulina se polimeriza en microtúbulos que forman el huso mitótico. A continuación, los microtúbulos se despolimerizan cuando se ha cumplido el uso del huso mitótico. En consecuencia, los agentes que alteran la polimerización o la despolimerización de los microtúbulos, y por tanto inhiben la mitosis, constituyen algunos de los agentes quimioterapéuticos más eficaces en el uso clínico.

Tales agentes o toxinas antimitóticos pueden clasificarse en tres grupos sobre la base de su mecanismo de acción molecular, El primer grupo se compone de agentes, incluidos la colchicina y la colcemida, que inhiben la formación de microtúbulos mediante el secuestro de la tubulina. El segundo grupo se compone de agentes, incluidos la vinblastina y la vincristina, que induce la formación de agregados paracristalinos de tubulina. La vinblastina y la vincristina son fármacos anticancerosos bien conocidos: su acción de alteración de los microtúbulos del huso mitótico inhibe preferentemente las células hiperproliferativas. El tercer grupo se compone de agentes, incluido el taxol, que estimula la polimerización de la tubulina y, por tanto, estabiliza estructuras microtubulares.

Sin embargo, la simple actividad como agente antimitótico no garantiza eficacia frente a células tumorales, y ciertamente no frente a una célula tumoral que exhiba un fenotipo resistente a fármacos. Los alcaloides vinca tales como la vinblastina y la vincristina son eficaces frente a células neoplásicas y tumores, aunque carecen de actividad frente a algunas células y tumores resistentes a fármacos. Una base para las células neoplásicas que exhiben resistencia a fármacos (RF) o resistencia a múltiples fármacos (RMF) es a través de la sobreexpresión de glicoproteína P. Los compuestos que son malos sustratos para el transporte de la glicoproteína P deberían ser útiles en evadir tales fenotipos RF o RMF.

En consecuencia, la exhibición del fenotipo RF o MRF por parte de muchas células tumorales y el clínicamente probado modo de acción de los agentes antimicrotubulares frente a células neoplásicas requiere el desarrollo de agentes antimicrotubulares citotóxicos para las células neoplásicas sin resistencia a fármacos así como citotóxicos para las células neoplásicas con un fenotipo resistente a fármacos. Entre los agentes prometedores a este respecto se incluye una clase de compuestos conocidos como criptoficinas.

Trimurtula y col., en "Total structures of cryptophicins, potent antitumor depsipeptides from the blue-green alga nostoc sp. Strain GSV 224", Journal of the American Chemical Society, vol. 116, nº 11, 1994, páginas 4729-4737, describen compuestos de criptoficina aislados de la cepa de nostoc sp. GSV 224. Esta referencia también describe derivados y productos de la degradación de las criptoficinas naturales.

Con relación a los procedimientos de producir criptoficinas, en la actualidad no se produce ningún procedimiento para la síntesis total de criptoficinas. Actualmente, los compuestos de criptoficinas se producen a través del aislamiento a partir de algas verdiazuladas o son variaciones semisintéticas de tales compuestos naturales. La falta de un procedimiento sintético total necesariamente dificulta producir criptoficinas estereoespecíficas que puedan maximizar la actividad y aumentar la estabilidad del compuesto. Por ejemplo, la investigación ha mostrado que las criptoficinas con un anillo macrocíclico intacto son más activas. En consecuencia, sería deseable un procedimiento sintético total que pudiera producir criptoficinas con un anillo macrocíclico que sea más estable que las criptoficinas derivadas de forma natural. La presente invención resuelve estos problemas.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona nuevos compuestos de criptoficina que tienen la siguiente estructura:

1

en la que

Ar es metilo o fenilo o cualquier sencillo grupo heteroaromático o aromático no sustituido o sustituido;

R_{1} es halógeno, SH, amino, monoalquilamino, dialquilamino, trialquilamonio, alquiltio, dialquilsulfonio, sulfato o fosfato;

R_{2} es OH o SH; o

R_{1} y R_{2} pueden tomarse juntos para formar un anillo epóxido, un anillo aziridina, un anillo episulfuro, un anillo sulfato o un anillo monoalquilfosfato; o

R_{1} y R_{2} pueden tomarse juntos para formar un doble enlace entre C_{18} y C_{19};

R_{3}, R_{7} y R_{8} son cada uno grupos alquilo de uno a cinco átomos de carbono, incluidas cadenas de hidrocarburo lineales y no lineales;

R_{4} y R_{5} son H; o

R_{4} y R_{5} pueden tomarse juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14};

R_{6} es un grupo bencilo, hidroxibencilo, alcoxibencilo, halohidroxibencilo, dihalohidroxibencilo, haloalcoxibencilo o dihaloalcoxibencilo;

R_{9} y R_{10} son cada uno de forma independiente H o un grupo alquilo de uno a cinco átomos de carbono, incluidas cadenas de hidrocarburo lineales y no lineales; y

X e Y son cada uno de forma independiente O, NH o alquilamino.

La presente invención además proporciona procedimientos sintéticos totales para producir criptoficinas. La presente invención también proporciona el uso de criptoficinas en productos farmacéuticos para inhibir la proliferación de células de mamífero y para tratar neoplasias.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 proporciona una estructura general de compuestos de criptoficina seleccionados de la presente invención y un sistema de numeración para las unidades de hidroxiácido A y D y las unidades aminoacídicas B y C en formas de realización seleccionadas.

Las figuras 2ª y B representan gráficamente lis efectos de compuestos de criptoficina y de vinblastina sobre la proliferación de células Jurkat y la progresión del ciclo celular. Las células Jurkat se incubaron con las concentraciones indicadas de compuestos de criptoficina (A) o vinblastina (B) durante 24 horas. Para cada muestra, el número de células viables (\blacksquare) y el índice mitótico (\Box) se determinaron como se describe eb la Sección Experimental. Los valores representan las medias \pm la desviación estándar (de) para muestras por triplicado en uno de tres experimentos similares.

La figura 3 representa gráficamente la reversibilidad de los efectos de vinblastina, criptoficinas y taxol sobre el crecimiento celular. Las células SKVO3 se trataron con vinblastina 0,1 nM (\Box), criptoficinas 0,1 nM (\blacksquare) o taxol 1 nM 1000 en el tiempo 0. Estas concentraciones inhibieron el crecimiento celular en un 50% para cada compuesto. Tras 24 horas, las células se lavaron y se incubaron en medio sin fármaco durante el tiempo indicado. La densidad celular se determinó mediante tinción con sulforhodamina B (SRB) como se describe en la Sección Experimental y se expresa como la absorbancia media \pm de a 560 nm para muestras por triplicado en uno de tres experimentos.

La figura 4 proporciona isobologramas para determinar los efectos de la combinación de vinblastina y criptoficinas sobre la proliferación celular. Se trataron células SKOV3 con vinblastina (0-600 pM) y/o criptoficinas (1-100 pM) durante 48 horas. A continuación se determinó el número de células mediante tinción SRB como se describe en la Sección Experimental y la CI_{50} (\blacksquare) y la línea de aditividad (____) se determinaron para combinaciones de vinblastina y compuestos de criptoficina. Los valores representan las medias de dos experimentos, cada uno con muestras por triplicado;

La figura 5 proporciona un primer esquema para sintetizar criptoficinas de acuerdo con la presente invención.;

La figura 6 proporciona un esquema para producir una unidad A de hidroxiácido;

La figura 7 proporciona un esquema para producir la subunidad de una criptoficina que comprenda una unidad A de hidroxiácido y B de aminoácido;

La figura 8 proporciona un esquema para producir la subunidad de una criptoficina que comprenda una unidad C aminoacídica y D de hidroxiácido;

La figura 9 proporciona un primer esquema para sintetizar criptoficinas seleccionadas de acuerdo con la presente invención;

La figura 10 proporciona un segundo esquema para sintetizar criptoficinas seleccionadas de acuerdo con la presente invención;

La figura 11 proporciona un esquema para sintetizar una subunidad de una criptoficina que comprenda una unidad D hidroxiácido;

La figura 12 proporciona un tercer esquema para sintetizar criptoficinas seleccionadas de acuerdo con la presente invención;

La figura 13 proporciona un cuarto esquema para sintetizar criptoficinas seleccionadas de acuerdo con la presente invención; y

La figura 14 proporciona un quinto esquema para sintetizar criptoficinas seleccionadas de acuerdo con la presente invención;

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevos compuestos de criptoficina que poseen la siguiente estructura:

2

en la que

Ar es metilo o fenilo o cualquier sencillo grupo aromático o heteroaromático no sustituido o sustituido;

R_{1} es un halógeno, SH, amino, monoalquilamino, dialquilamino, trialquilamonio, alquiltio, dialquilsulfonio, sulfato o fosfato;

R_{2} es OH o SH; o

R_{1} y R_{2} pueden tomarse juntos para formar un anillo epóxido, un anillo aziridina, un anillo episulfuro, un anillo sulfato o un anillo monoalquilsulfato; o

R_{3}, R_{7} y R_{8} son, cada uno, grupos alquilo de uno a cinco átomos de carbono, incluidas cadenas de hidrocarburo lineales y no lineales;

R_{4} y R_{5} son H, o

R_{9} y R_{10} son cada uno de forma independiente H o un grupo alquilo de uno a cinco átomos de carbono incluidas cadenas de hidrocarburo lineales y no lineales; y

X e Y son cada uno de forma independiente O, NH o alquilamino.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, los siguientes términos tienen los significados indicados a menos que del uso en el contexto se deduzca claramente un significado distinto:

"Aminoácido-\beta inferior" significa cualquier aminoácido-\beta que tenga de tres a ocho carbonos e incluye cadenas de hidrocarburo lineales y no lineales; por ejemplo, ácido 3-amino-2-metilpropiónico.

"Aminoácido-\beta inferior esterificado" significa cualquier aminoácido-\beta que tenga de tres a ocho carbonos, donde el hidrógeno del grupo ácido carboxílico está sustituido con un grupo metilo; por ejemplo, metil éster de 3-amino-2-metilpropiónico.

"Grupo alcanoiloxi inferior" significa un grupo alcanoiloxi de uno a siete carbonos e incluye cadenas de hidrocarburo lineales y no lineales.

"Grupo \alpha-hidroxialcanoiloxi" inferior significa un grupo \alpha-hidroxialcanoiloxi de dos a siete carbonos e incluye cadenas de hidrocarburo lineales y no lineales; por ejemplo, ácido 2-hidroxi-4-metilvalérico.

"Grupo alcoxilo inferior" significa un grupo alquilo de uno a cinco carbonos unidos a un átomo de oxígeno.

"Grupo alquilo inferior" significa un grupo alquilo de uno a cinco carbonos e incluye cadenas de hidrocarburo lineales y no lineales incluidos, por ejemplo, grupos metilo., etilo, propilo, isopropilo, isobutilo, terc-butilo, sec-butilo, grupos butilo metilados, pentilo y terc-pentilo.

"Alqueno alílicamente sustituido" significa cualquier alqueno que contenga una sustitución alquilo.

"Anillo epóxido" significa un anillo de tres miembros cuya estructura consiste en dos carbonos y un átomo de oxígeno.

"Anillo aziridina" significa un anillo de tres miembros cuya estructura consiste en dos carbonos y un átomo de nitrógeno.

"Anillo episulfuro" significa un anillo de tres miembros cuya estructura consiste en dos carbonos y un átomo de azufre.

"Anillo sulfato" significa un anillo de cinco miembros compuesto por una estructura de carbono-carbono-oxígeno-azufre-oxígeno con dos átomos de oxígeno adicionales conectados al átomo de azufre.

"Anillo monoalquilfosfato" significa un anillo de cinco miembros compuesto por una estructura de carbono-carbono-oxígeno-fósforo-oxígeno con dos átomos de oxígeno adicionales, uno de los cuales lleva un grupo alquilo inferior, conectados al átomo de fósforo.

"Grupo aromático no sustituido simple" se refiere a anillos aromáticos comunes que tienen 4b+2 pi electrones en un sistema conjugado monocíclico (por ejemplo, furilo, pirrolilo, tienilo, piridilo) o un sistema conjugado bicíclico (por ejemplo, indolilo o naftilo).

"Grupo aromático sustituido simple" se refiere a un grupo fenilo sustituido con un grupo único (por ejemplo, un grupo alquilo inferior o un halógeno).

"Grupo heteroaromático" se refiere a anillos aromáticos que contienen uno o más sustituyentes distintos a carbono tales como oxígeno, nitrógeno o azufre.

"Halógeno" se refiere a los miembros del grupo de la tabla periódica históricamente conocidos como los halógenos. Entre los procedimientos de halogenación se incluyen, pero no se limita a ellos, la adición de haluros de hidrógeno, la sustitución a temperatura elevada, la fotohalogenación, etc., y tales procedimientos son conocidos para los expertos en la técnica.^{1,2}

En todas la memoria descriptiva se hace referencia a criptoficinas específicas por el número. A menos que se indique otra cosa, la criptoficina corresponde a los compuestos que poseen la siguiente estructura:

3

en la que los números se refieren a compuestos como se presentan en la siguiente tabla:

4

5

6

De= doble enlace (donde R_{4} y R_{5} juntos forman un doble enlace entre C_{13} y C_{14} o donde R_{1} y R_{2} juntos forman un doble enlace entre C_{18} y C_{19}), Me= metilo, 4-MB= 4-metoxi bencilo, 34CM= 3-cloro-4-metoxibencilo, 3C4OH= 2-cloro-4-hidroxibencilo, 3,5C4OH= 3,5-dicloro-4-hidroxibencilo y 3,5C4M= 3,5-dicloro-4-metoxibencilo.

\bullet C_{18} es el carbono final de la criptoficina 108. El C_{18} de la criptoficina 108 está sustituido del siguiente modo OHC_{18}-C_{17}. Véase la figura 13.

Otras criptoficinas a las que se hace referencia en la memoria descriptiva incluyen las criptoficinas 5, 6, 7, 10, 12, 14 y 26, que están representadas por las siguientes estructuras:

7

8

9

Como será evidente a partir de sus estructuras, los compuestos de criptoficina poseen grupos que son capaces de modificación química. El compuesto del género de la presente invención contempla las criptoficinas que exhiben actividad neoplásica. Por ejemplo, entre los derivados de los ejemplos de la presente invención se incluyen compuestos que tienen los grupos oxígeno epóxido o hidroxi en los C-7 o C-8 de la unidad A o el grupo de ácido leucico de la unidad B de la figura 1. Tales derivados de los compuestos nuevos y previamente descritos que muestran la deseada actividad antineoplásica están incluidos en la invención reivindicada.

Es más, la relación entre la estructura de los compuestos de criptoficina y la actividad antineoplásica se proporciona en la Sección Experimental más adelante.

En las patentes de EE.UU. números 5.955.423 y 5.945.315 se describen veintidós compuestos de criptoficina adicionales, designados en la presente memoria descriptiva criptoficinas 2, 4, 6, 7, 16-19, 21, 23, 24, 26, 28-31, 40, 43, 45, 50 y 54, siendo tales compuestos metabolitos aislados de una cepa de Nostoc sp. O habiéndose semisintetizados a partir de tales metabolitos. En estas solicitudes de patente también se describe la caracterización de compuestos de criptoficina seleccionados como agentes antimicrotubulares con actividad de tipo clínico expresada contra un amplio espectro de tumores implantados en ratones, incluidos tumores RF y RMF.

10

en la que

R_{2} es OH o SH; o

R_{4} y R_{5} son H; o

X e Y son cada uno de forma independiente O, NH o alquilamino.

En una forma de realización preferida de esta criptoficina, R_{8} de la criptoficina es etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo o isopentilo. En otra forma de realización preferida de esta criptoficina, R_{7} es H, R8 es metilo, R_{3} es metilo; X e Y no son ambos 0.

La presente invención proporciona otra forma de realización preferida de esta criptoficina, en la que R_{3} es etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo o isopentilo. En otra forma de realización preferida de esta criptoficina, R_{9} es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo o isopentilo. En otra forma de realización preferida de esta criptoficina, R_{10} es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo o isopentilo.

Esta invención además proporciona compuestos de criptoficina en los que al menos uno de los grupos unido a C_{3}, C_{6}, C_{10}, C_{16}, C_{17} y C_{18} posee una estereoquímica R. En otra forma de realización de la invención, al menos uno de los grupos unidos a C_{3}, C_{6}, C_{10}, C_{16}, C_{17} y C_{18} tiene una estereoquímica S.

Una forma de realización de un compuesto de criptoficina de la presente invención es cuando Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{18} y C_{19}, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14}, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno. La estructura de este compuesto, criptoficina 51, es del siguiente modo:

11

CRIPTOFICINA 51

Otra forma de realización de un compuesto de la presente invención es cuando Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un anillo R,R-epóxido, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14}, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno. La estructura de este compuesto, criptoficina 52, es del siguiente modo:

12

CRIPTOFICINA-52

Otra forma de realización de un compuesto de la presente invención es cuando Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un anillo S,S-epóxido, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14}, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno. La estructura de este compuesto, criptoficina 53, es del siguiente modo:

13

CRIPTOFICINA-53

Otra forma de realización de un compuesto de la presente invención es cuando Ar es fenilo, R_{1} es S-cloro, R_{2} es R-hidroxilo, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14}, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno. La estructura de este compuesto, criptoficina 55, es del siguiente modo:

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CRIPTOFICINA-55

Otra forma de realización de un compuesto de la presente invención es cuando Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un anillo R,R-epóxido, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} son hidrógeno, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno. La estructura de este compuesto, criptoficina 57, es del siguiente modo:

15

CRIPTOFICINA-57

Otra forma de realización de un compuesto de la presente invención es cuando Ar es fenilo, R_{1} es S-cloro, R_{2} es R-hidroxilo, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} son hidrógeno, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno. La estructura de este compuesto, criptoficina 58, es del siguiente modo:

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CRIPTOFICINA-58

Otra forma de realización de un compuesto de la presente invención es cuando Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un anillo R,R-episulfuro, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14}, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno. La estructura de este compuesto, criptoficina 61, es del siguiente modo:

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CRIPTOFICINA 61

Otra forma de realización de un compuesto de la presente invención es cuando Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un anillo R,R-aziridina, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} son hidrógeno, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno. La estructura de este compuesto, criptoficina 97, es del siguiente modo:

18

CRIPTOFICINA 97

La presente invención proporciona procedimientos para producir los anteriores compuestos de criptoficina, así como todas las criptoficinas previamente conocidas, mediante síntesis total.

La invención además proporciona que los nuevos metabolitos de criptoficina, así como los metabolitos de criptoficina previamente descritos, pueden sintetizarse usando los procedimientos proporcionados en esta invención.

La presente invención proporciona un procedimiento para producir una criptoficina de la estructura:

19

\vskip1.000000\baselineskip

en la que

R_{2} es OH o SH; o

R_{4} y R_{5} son H; o

X e Y son cada uno de forma independiente O, NH o alquilamino.

que comprende seleccionar un E alqueno alílicamente sustituido; reorganizar el E alqueno alílicamente sustituido mediante una reorganización estereoespecífica de Wittig; convertir este compuesto en un primer \delta-aminoácido o \delta-hidroxiácido; acoplar el primer ácido con un segundo primer \alpha-aminoácido para formar una primera subunidad; acoplar un tercer \beta-aminoácido a un cuarto \alpha-hidroxiácido o \alpha-aminoácido para formar una segunda subunidad; y acoplar la primera subunidad a la segunda subunidad para formar una de tales criptoficinas.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica útil para inhibir la proliferación de una célula de mamífero hiperproliferativa, que comprende una cantidad eficaz de una criptoficina con la siguiente estructura:

20

\vskip1.000000\baselineskip

en la que

R_{2} es OH o SH; o

R_{4} y R_{5} son H; o

X e Y son cada uno de forma independiente O, NH o alquilamino; junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una forma de realización preferida de la siguiente invención, la composición farmacéutica además comprende al menos un agente antineoplásico adicional.

La presente invención también proporciona el uso de un compuesto criptoficina que tiene la siguiente estructura:

21

en la que

R_{2} es OH o SH; o

R_{4} y R_{5} son H; o

R_{9} y R_{10} son cada uno de forma independiente H y X e Y son cada uno de forma independiente O, NH o alquilamino

en la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación de una célula de mamífero.

En una forma de realización preferida de la presente invención, el medicamento además comprende al menos otro agente antineoplásico.

La presente invención también proporciona el uso de un compuesto de criptoficina que tiene la siguiente estructura:

22

\vskip1.000000\baselineskip

en la que

R_{2} es OH o SH; o

R_{4} y R_{5} son H; o

X e Y son cada uno de forma independiente O, NH o alquilamino, en la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación de una célula de mamífero hiperproliferativa que posea un fenotipo resistente a múltiples fármacos.

En una forma de realización preferida de la presente invención, el medicamento además comprende al menos un agente antineoplásico adicional. En otra forma de realización preferida de la presente invención, la célula de mamífero es humana.

En una forma de realización preferida de la presente invención, el estado patológico se caracteriza por la formación de neoplasias. En otra forma de realización preferida de la presente invención, las neoplasias se seleccionan del grupo compuesto por neoplasias de mama, de pulmón de células pequeñas, colorrectal, leucemia, melanoma, adenocarcinoma pancreático, del sistema nervioso central (SNC), de ovarios, de próstata, sarcoma de tejidos blandos u óseo, de cabeza y cuello, gástrica, que incluye neoplasias pancreáticas y esofágicas, de estómago, mielomas, de vejiga, renal, neoplasias neuroendocrinas que incluyen de tiroides y enfermedad no Hodgkin y enfermedad Hodgkin.

El procedimiento para producir los compuestos de criptoficina se resume en el Esquema 1, como se representa en la figura 5. El material de partida es un alqueno 3-E (a) sustituido en C-2 con un grupo XH en la configuración S donde X es oxígeno o NH. L-alanina y ácido L-láctico sirven como fuentes económicas del material de partida (a). La etapa clave en la síntesis es una reorganización estereoselectiva de Wittig [2,3] (D. J-S. Tsai y col., J. Org. Chem. 1984, 49: 1842-1843; K. Mikami y col., Tetrahedron 1984, 25: 2303-2308; N. Sayo y col., Chem Lett. 1984, 259-262) del éter de propargilo de a (b) en el (3R, 4R)-3-(XH-sustituido)-4-alquilhept-5(E)-en-1-ino (c) donde X es un oxígeno o un nitrógeno protegido (por ejemplo, t-butildimetilsililamino). Después, el compuesto c se puede convertir en la unidad A \delta-hidroxi o aminoácido precursor de la criptoficina, metil (5S, 6R)-5-(XP-sustituido)-6-alquil-8-aril-octa-2E,7E-dienoato (d) donde P es un grupo protector adecuado, usando procedimientos conocidos para el experto habitual en la técnica.

Una estrategia para sintetizar una criptoficina, que está compuesta por una unidad A \delta-hidroxi o aminoácido, una unidad B \alpha-aminoácido, una unidad C \beta-aminoácido y una unidad D \alpha-hidroxi o aminoácido, es ensamblar el macrociclo procedente de dos precursores que representa restos de la molécula de criptoficina, por ejemplo un precursor A-B (e) que contiene la unidad \delta-hidroxi o aminoácido y la unidad B \alpha-aminoácido, y un precursor C-D (f) que contiene la unidad C \beta-aminoácido y la unidad D \alpha-hidroxi o aminoácido.

En el procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva, una criptoficina se ensambla a partir de los precursores A-B y C-D en dos etapas, mediante (1) la conexión del extremo de las unidades A y D en los precursores A-B y C-D para formar un producto intermedio C-D-A-B acíclico y (2) la conexión del extremo de las unidades B y C para formar el producto cíclico.

En la síntesis de la criptoficina 51 descrita en la Sección Experimental, se forma un enlace éster entre el grupo \delta-hidroxi de la unidad A en el resto A-B y el grupo de ácido carboxílico de la unidad D en el fragmento C-D para formar un producto intermedio acíclico C-D-A-B y después se forma un enlace amida entre el grupo de ácido carboxílico de la unidad B en el resto A-B y el grupo \beta-amino de la unidad C en el resto C-D- El compuesto K es el precursor resto A-B, el compuesto P es el precursor resto C-D y el compuesto R es el precursor acíclico C-D-A-B de la criptoficina 51. Los compuestos K y P tienen grupos protectores en el grupo de ácido carboxílico de la unidad B y el grupo \beta-amino de la unidad C para limitar el acoplamiento a la formación de éster entre unidades A y D en la etapa 1. Estos grupos protectores se eliminan del producto intermedio C-D-A-B de forma que se pueda producir la formación de amida entre las unidades B y C en la etapa 2.

La síntesis de metil (5S,6R)-5-t-butildimetilsililoxi-6-metil-8-fenil-octa-2E,7E-dienoato (G), el precursor de la unidad A de la criptoficina 51, se resume en el esquema 2 (figura 6). El material de partida, (S)-trans-3-penten-2-ol (A), se preparó mediante resolución enzimática del compuesto racémico. La reacción de A con cloruro de propargilo y una base en condiciones de transferencia de fase formó éter de propargilo B con un rendimiento del 86%.

El tratamiento de B con butil litio a -90ºC condujo al alcohol X con un rendimiento del 71%. El compuesto C 3R,4R anti fue el único producto formado en la reorganización de Wittig. Tras la protección del grupo hidroxilo de C como el terc-butildimetilsilil éter (o terc-butildimetilsilil éter), la hidroboración del enlace triple (H. C. Brown, Organic Synthesis Via Boranes, Wiley, 1975) condujo a un aldehído D con un rendimiento de C del 73%. Después, D se convirtió en el éster E trans \alpha, \beta-insaturado mediante una reacción de Horner-Emmons con un rendimiento del 90%. La ozonolisis selectiva del doble enlace C6-C7 en D dio el aldehído F con un rendimiento del 83%. Por último, una reacción de Wittig de F con cloruro de benciltrifenilfosfonio en presencia de butillitio produjo G con un rendimiento del 80%. El rendimiento de G a partir de A fue del 26%.

El acoplamiento del precursor G de la unidad A con la unidad B D-3 (3-cloro-4-metoxifenil)alanina para producir el precursor A-B (K) se resume en el Esquema 3 (figura 7). La hidrólisis del grupo éster de metilo en G con hidróxido de litio en acetona produjo ácido carboxílico H con un rendimiento del 95%. El acoplamiento de H con éster de tricloroetilo I para producir J podría llevarse a cabo con un rendimiento del 65% mediante el tratamiento de una solución de H en N,N-trimetilformamida (DMF) con un pequeño exceso de pentafluorofenildifenilfosfinato (FDPP), una cantidad equimolar de la sal trifluoroacetato de I, seguido por 3 equiv. de diisopropiletilamina (DIEA) a 25ºC (S. Chen y col., Tetrahedron Lett. 1991, 32: 6711-6714). A continuación, la fluorodesililación de J condujo a K con un rendimiento del 95%.

El aminoácido protegido I se preparó a partir de D-tirosina en cinco etapas. Primero se cloró la D-tirosina con cloruro de sulfurilo en ácido acético glacial (R. Zeynek, Hoppe-Seyler's Z f. Physiol. Chemie 1926, 144: 247-254). Después, se obtuvo N-(terc-butoxicarbonil)-3-(3-cloro-4-hidroxifenil)-D-alanina con un rendimiento del 94% mediante el tratamiento de una suspensión del aminoácido en dioxano acuoso al 50% con di-terc-butildicarbonato en presencia de trietilamina. El producto resultante se dimetiló con dimetilsulfato en presencia de carbonato potásico a reflujo en acetona con un rendimiento del 84%. A continuación se saponificó el éster de metilo con hidróxido sódico en dioxano acuoso para dar N-(terc-butoxicarbonil)-3-(3-cloro-4-metoxifenil)-D-alanina con un rendimiento del 86%. La exposición del aminoácido protegido con BOC a tricloroetanol, piridina y DCC en diclorometano produjo éster de tricloroetilo I con un rendimiento del 65%. El tratamiento de este material con ácido trifluoroacético condujo a un rendimiento cuantitativo de la sal trifluoroacetato de I.

La síntesis de ácido (2S)-2-[3'(terc-butoxicarbonil)amino-2-2'-dimetilpropanoiloxi]-4-metilpentanoico (P), el precursor C-D, se resume en el esquema 4 (figura 8). El punto de partida para la porción de unidad C de P fue el aminoalcohol L. La protección del grupo amino en L mediante tratamiento con di-terc-butildicarbonato en presencia de trietilamina (rendimiento del 93%), seguido por la oxidación del alcohol primario con tetraóxido de rutenio (P. H. J. Carlsen y col., J. Org. Chem. 1981, 46: 3936-3938) dio ácido carboxílico M (rendimiento del 66%). El ácido L-leucico se convirtió en éster de alilo N con un rendimiento del 93% en condiciones de transferencia de fase, mediante su exposición a una mezcla de bromuro de alilo en diclorometano y bicarbonato sódico acuoso que contiene cloruro de tetra-n-butilamonio (S. Friedrich-Bochnitscjek y col., J. Org. Chem. 1989, 54: 751-756). La reacción de acoplamiento de M con N se llevó a cabo con 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y diciclohexilcarbodiimida (DCC) en diclorometano, para producir O con un rendimiento del 75%. La escisión del éster de alilo en O se llevó a cabo en THF con morfolina y tetrakis(trifenilfosfina)-paladio catalítico para dar P con un rendimiento del 95% (P. D. Jeffrey y col., J. Org. Chem. 1982, 47: 587-590).

El acoplamiento del precursor A-B (K) y del precursor C-D (P) se llevó a cabo como se muestra en el Esquema 5 (figura 9). El tratamiento de K y P con DCC/DMAP en diclorometano dio el producto intermedio C-D-A-B (Q) completamente protegido con un rendimiento del 84%. La escisión reductora del grupo éster de tricloroetilo en Q se consiguió usando polvo de cinc activado en ácido acético. A continuación, el grupo protector BOC se eliminó con ácido tricloroacético para dar R como la sal trifluoroacetato con un rendimiento global del 91% a partir de Q.

La macrolactamización de R con FDPP condujo a criptoficina 61 con un rendimiento del 61% (J. Dudash, Jr. y col., Synth. Commun. 1993, 23: 349-356). El rendimiento global a partir de S-trans-3-penten-2-ol (A) fue del 7%.

La criptoficina 51 sirvió como precursor de la criptoficina 52, el R,R-epóxido, y de la criptoficina 53, el S,S-epóxido. A su vez, la criptoficina 52 sirvió como precursor de la criptoficina 55, la 18R,19S-clorhidrina, y la criptoficina 57, el análogo 13,14-diohidro. La criptoficina 57 sirvió como precursor de la criptoficina 58. La criptoficina 53 sirvió como precursor de la criptoficina 61 usando un procedimiento descrito por T. H. Chan y J. R. Finkenbine, J. Am. Chem. Soc, 1972, 94: 2880-2882 y la criptoficina 97 usando un procedimiento descrito por Y. Ittah y col., J. Org. Chem. 1978, 43: 4271-4273.

Para la síntesis de criptoficinas que tienen grupos Ar diferentes de fenilo, los precursores de la unidad A de estructura general d (esquema 1, R_{3}= Me) pueden prepararse mediante una reacción de Wittig de aldehído F (esquema 2; grupo protector TBS) o S (esquema 6; grupo protector TBS) con el adecuado cloruro de ariltrifenilfosfonio en presencia de butillitio. La criptoficina 81 se preparó a partir del precursor d (Ar= p-metoxifenilo, R_{3}= Me) como se muestra en los esquemas 6 y 7 (figuras 10 y 11).

El grupo Ar también puede introducirse en la nueva criptoficina en una etapa posterior en la síntesis. El primer precursor d (Ar= R1= Me) se convirtió en criptoficina 82 mediante el acoplamiento de los adecuados precursores A-B (e) y C-D (f), como se muestra en el esquema 8 (figura 12). La ozonolisis selectiva de la criptoficina 82 o la oxidación ácida periódica de los correspondientes epóxidos Criptoficinas 90 y 91 produjeron un aldehído, la criptoficina 108. Una reacción de Wittig de la criptoficina 108 con el adecuado cloruro de ariltrifenilfosfonio en presencia de butillitio dio la nueva criptoficina (esquema 9; figura 13). Usando este procedimiento se prepararon la criptoficina 110 (Ar= p-fluorofenilo), la criptoficina 112 (Ar= 2-tienilo) y la criptoficina 124 (Ar= p-clorofenilo). La criptoficina 110 sirvió como precursor de los epóxidos criptoficinas 115 y 116. La criptoficina 111 sirvió como precursor de los epóxidos criptoficinas 117 y 118 y de las clorhidrinas criptoficinas 128, 130 y 131. La criptoficina 112 sirvió como precursor de los epóxidos criptoficinas 119 y 120. La criptoficina 124 sirvió como precursor de los epóxidos criptoficinas 125 y 126 y de las clorhidrinas criptoficinas 132, 133 y 134.

Otra estrategia para sintetizar una criptoficina es ensamblar el macrociclo de tres precursores, por ejemplo, un precursor A-B (e) que contiene la unidad A \delta-hidroxi o aminoácido, un precursor que contiene la unidad D \delta-hidroxi o aminoácido y un precursor que contiene la unidad C \beta-aminoácido. En el procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva, una criptoficina se ensambla a partir de los precursores A-B, C y D en tres etapas mediante (1) la conexión de los extremos de las unidades A y D en los precursores A-B y D para formar un producto intermedio acíclico D-A-B, (2) la conexión de los extremos de las unidades D y C en los precursores D-A-B y C para formar un producto intermedio acíclico C-D-A-B y (3) la conexión de los extremos de las unidades B y C para formar el producto cíclico.

En la síntesis de la criptoficina 121 descrita en la Sección Experimental, se forma un enlace éster entre el grupo \delta-hidroxi de la unidad A en el resto A-B y el grupo de ácido carboxílico de la unidad D en el fragmento D para formar un producto intermedio acíclico D-A-B. Después se forma un enlace amida entre el grupo de ácido carboxílico de la unidad C y el grupo \alpha-amino de la unidad D en el fragmento D-A-B. Por último, se forma un enlace amida entre el grupo de ácido carboxílico de la unidad B en el resto A-B y el grupo \beta-amino de la unidad C en el resto C-D- El compuesto K es el precursor del resto A-B, el compuesto BOC-L-leucinahídrido en el precursor de la unidad D y el compuesto AL es el precursor de la unidad C. El compuesto A-K es el precursor C-D-A-B acíclico de la criptoficina 121 (Esquema 10; figura 14). Los compuestos K y BOC-L-leucinahídrido poseen grupos protectores en el grupo ácido carboxílico de la unidad B y el grupo \alpha-amino de la unidad D, para limitar la formación de éster entre las unidades A y D e la etapa 1. El grupo protector se elimina del grupo \delta-amino de la unidad D en el producto intermedio D-A-B, de forma que se puede producir la formación de amida entre el grupo amino de la unidad B y el ácido carboxílico C de la etapa 2. Estos grupos protectores se eliminan del producto intermedio C-D-A-B de forma que se pueda producir la formación de amida entre las unidades B y C de la etapa 2.

Los novedosos compuestos de criptoficina de la presente invención poseen anillos epóxido que se abren por nucleófilos a diferentes velocidades que el anillo epóxido de la criptoficina 1, o poseen funcionalidades clorhidrina que forman anillos epóxidos a diferentes velocidades que la funcionalidad clorhidrina de la criptoficina 8 se transforma en el anillo epóxido de la criptoficina 1. El anillo epóxido de la criptoficina 1 o de la funcionalidad clorhidrina (un anillo epóxido enmascarado) de la criptoficina 8 es esencial para una actividad óptima in vivo. Si se elimina el oxígeno epóxido (como se encuentra en la criptoficina 3) o el anillo epóxido se hidroliza en un diol (como se encuentra en la criptoficina 15), la actividad antitumoral disminuye mucho. La criptoficina 1 muestra, en comparación con la criptoficina 8, una toxicidad apreciable en animales. Esto se refleja en los valores T/C (principalmente >0%) y valores de muerte log aproximados (principalmente < 2,0) para la criptoficina 1 en comparación con los de la criptoficina 8 (fundamentalmente valores T/C de 0% y valores aproximados de muerte log de > 2,8). LA criptoficina 25, el correspondiente análogo bromohidrina, muestra valores T/C y valores aproximados de muerte log comparables a los de la criptoficina 1. Esta sorprendente diferencia en la actividad in vivo sugiere que la bromohidrina criptoficina 25 se convierte más rápidamente en criptoficina 1 in vivo que en criptoficina 8. Esto además sugiere que la criptoficina 8, menos tóxica, podría tener más tiempo para acumularse en el sitio del tumor antes de transformarse en el compuesto activo criptoficina 1. Es probable que el grupo epóxido de criptoficina 1 se una de forma covalente a su receptor diana en la célula tumoral. Las nuevas criptoficinas en la presente invención podrían potencialmente poseer mejor actividad in vivo que la criptoficina 1 y la criptoficina 8 al exhibir velocidades de formación de epóxido in vivo más favorables a partir de los correspondientes profármacos de clorhidrina y la unión covalente al receptor diana en la célula tumoral.

Los compuestos de la presente invención son más estables frente a la hidrólisis y a la solvolisis que las criptoficinas 1 y 21. El enlace éster de las unidades de conexión C y D en la criptoficina 1 son relativamente sensibles a la hidrólisis básica leve, escindiéndose a pH 11 a un hidroxiácido con una semivida de 0,83 horas. El enlace éster C-D en la criptoficina 21, que carece del grupo metilo en el C-2 de la unidad C, se abre a una velocidad mayor con una semivida de 0,25 horas. El enlace éster C-D también es sensible a la solvolisis. Cuando en el esquema de aislamiento se usa metanol, se produce una metanolisis considerable de las criptoficinas 1 y 21. La criptoficina 21 es mucho más susceptible a la metanolisis de la criptoficina 1. La criptoficina 1 muestra actividad antitumoral, mientras que la criptoficina 21 es inactiva, probablemente porque el enlace éster C-D de la criptoficina 21 se hidroliza más rápido que el enlace éster C-D de la criptoficina 1 in vivo. La hidrólisis del enlace éster C-D también puede explicar en parte la menor actividad in vivo de la criptoficina 1 mediante las vías de administración de fármacos intraperitoneal y subcutánea. El enlace éster C-D de las criptoficinas que poseen dos grupos metilo en el C-2 de la unidad C, tal como el que se encuentra en la criptoficina 52, es estable a pH 11.

Los compuestos de la presente invención y los compuestos de criptoficina previamente descritos pueden emplearse terapéuticamente como agentes antineoplásicos y, por tanto, usarse en procedimientos para tratar enfermedades neoplásicas. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "neoplásico" atañe a una neoplasia, que es un crecimiento anormal, produciéndose tal crecimiento a causa de una proliferación de células no sujetas a las limitaciones normales de crecimiento. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "agente antineoplásico" es cualquier compuesto, composición, agregado, coagregado o mezcla que inhiba, elimine, retrase o invierta el fenotipo neoplásico de una célula.

En la actualidad, en el tratamiento del cáncer se usa quimioterapia, cirugía, radioterapia, tratamiento con modificadores de la respuesta biológica e inmunoterapia. Cada forma de tratamiento tiene indicaciones específicas conocidas para el experto habitual en la técnica, u para intentar conseguir la destrucción total de las células neoplásicas se puede usar uno o todos ellos. La presente invención proporciona quimioterapia con una o más criptoficinas. Es más, la invención sujeto también proporciona la quimioterapia de combinación, quimioterapia en la que se usan criptoficinas combinadas con otros agentes neoplásicos, ya que, generalmente, la terapia de combinación es más eficaz que el uso de agentes antineoplásicos solos. Por tanto, otro aspecto de la presente invención proporciona composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto criptoficina nuevo de la presente invención, incluidas sales de adición inocuas del mismo, que son útiles para proporcionar los beneficios terapéuticos citados anteriormente. Tales composiciones también se pueden proporcionar junto con líquido fisiológicamente tolerable, geles o vehículos sólidos, diluyentes, adyuvantes y excipientes.

Tales vehículos, diluyentes, adyuvantes y excipientes pueden encontrase en la United States Pharmacopeia Vol. XXII y National Formulary Vol. XVII, U.S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD (1989). En la AHFS Drug Information, 1993, ed. Por el American Hospital Formulary Service, páginas. 522-660 se proporcionan otros modos de tratamiento.

La presente invención además proporciona que la composición farmacéutica usada para tratar enfermedades neoplásicas contiene al menos un compuesto criptoficina y al menos un agente antineoplásico adicional. Entre los compuestos antineoplásicos que se pueden utilizar en combinación con criptoficinas se incluyen los proporcionados en The Merck Index, 11ª ed. Merck & Co., Inc. (1989), pág. Ther 16-17. En otra forma de realización de la invención, los agentes antineoplásicos pueden ser antimetabolitos que pueden incluir, pero no se limita a ellos, metotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, arabinósido citosina, hidroxiurea y 2-clorodesoxiadenosina. En otra forma de realización de la presente invención, los agentes antineoplásicos contemplados son agentes alquilantes que pueden incluir, pero no se limita a ellos, ciclofosfamida, melfalán, busulfán, paraplatina, clorambucilo y mostaza de nitrógeno. En otra forma de realización de la invención sujeto, los agentes antineoplásicos son alcaloides vegetales que pueden incluir, pero no se limita a ellos, vincristina, vinblastina, taxol y etopósido. En otra forma de realización de la presente invención, los agentes antineoplásicos contemplados son antibióticos que pueden incluir, pero no se limita a ellos, doxorrubicina (adriamicina), daunorubicina, mitomicina c y bleomicina. En otra forma de realización de la invención sujeto, los agentes antineoplásicos contemplados son hormonas que pueden incluir, pero no se limita a ellos, calusterona, diomostavolona, propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, tamoxifen, poliestradiol fosfato, megesterol acetato, flutamida, nilutamida y trilotano. En otra forma de realización de la invención sujeto, entre los agentes antineoplásicos contemplados se incluyen enzimas, que pueden incluir, pero no se limita a ellas, L-asparaginasa o derivados de aminoacridina, que pueden incluir, pero no se limita a ellos, amsacrina. Entre otros agentes antineoplásicos se incluyen los proporcionados en Skell, Roland T., "Antineoplastic Drugs and Biological Response Modifier: Classification, Use and Toxicity of Clinically Useful Agents", Handbook of Cancer Chemotherapy (3ª ed.), Little Brown & Co. (1991).

Los presentes compuestos y composiciones de criptoficina se pueden administrar a mamíferos para uso veterinario, tales como para animales domésticos, y para uso clínico en seres humanos de un modo similar a otros agentes terapéuticos. En general, la dosis requerida para la eficacia terapéutica variará según el tipo de uso y la vía de administración, así como según los requerimientos particulares para cada huésped individual. Por lo general, las dosis variarán de aproximadamente 0,001 a 1000 mg/kg, más normalmente de 0,01 a 10 mg/kg, del peso corporal del huésped. Como alternativa, se pueden administrar dosis en estos intervalos mediante infusión constante durante un extenso periodo de tiempo, normalmente superior a 24 horas, hasta que se obtienen los beneficios terapéuticos deseados. De hecho, la dosis del fármaco, así como la vía de administración, debe seleccionarse sobre la base de eficacia relativa, toxicidad relativa, características del crecimiento del tumor y efecto de las criptoficinas sobre el ciclo celular, la farmacocinética del fármaco, la edad, el sexo, el estado físico del paciente y los tratamientos previos.

Los compuestos de criptoficina, con o sin agentes antineoplásicos adicionales, pueden formularse en composiciones terapéuticas como formas naturales o de sales.

Entre las sales inocuas farmacéuticamente aceptables se incluyen las sales de adición de base (formadas con carboxilo libre u otros grupos aniónicos) que pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares. Tales sales también pueden estar formadas como sales de adición se ácido con cualquier grupo catiónico libre, y generalmente estarán formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Otros excipientes que además proporciona la invención son los disponibles para un experto en la técnica, por ejemplo, los que se encuentran en la United States Pharmacopeia Vol. XXII and National Formulary Vol. XVII, U.S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD (1989).

La idoneidad de vehículos particulares para su inclusión en una composición terapéutica dada depende de la vía de administración preferida. Por ejemplo, se pueden formular composiciones antineoplásicas para administración oral. Tales compuestos se preparan típicamente como soluciones o suspensiones líquidas o en formas sólidas. Las formulaciones orales normalmente incluyen aditivos de uso habitual tales como ligantes, rellenos, vehículos, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes, tampones y excipientes como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman forma se soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos, y típicamente contienen 1-95% de ingrediente activo, preferentemente un 2-70%.

Las composiciones de la presente invención también se pueden preparar como inyectables, bien como soluciones líquidas, suspensiones o emulsiones; se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. Tales inyectables pueden administrarse por vía subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratecal o intrapleural. El ingrediente o ingredientes activos a menudo se mezclan con diluyentes o excipientes que son fisiológicamente tolerables y compatibles con el o los ingredientes activos. Son diluyentes y excipientes adecuados, por ejemplo, agua, suero salino, dextrosa, glicerol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, las composiciones pueden contener cantidades pequeñas de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes estabilizantes o de tamponamiento del pH.

La invención además proporciona compuestos de criptoficina abarcados por la estructura del género para la preparación de un medicamento que inhiba la proliferación de células de mamífero mediante el contacto de estas células con un compuesto de criptoficina en una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de la célula de mamífero. Una forma de realización preferida es un medicamento que inhiba la proliferación de células de mamífero hiperproliferativas. Para los propósitos de esta invención, "células de mamífero hiperproliferativas" son células de mamífero que no están sujetas a las limitaciones características del crecimiento, por ejemplo la muerte celular programada (apoptosis). Otra forma de realización preferida es cuando la célula de mamífero es humana. La invención además proporciona el contacto de la célula de mamífero con al menos un compuesto de criptoficina y al menos un agente antineoplásico adicional. Los tipos de agentes antineoplásicos contemplados son los mismos que los descritos anteriormente en la presente.

La invención además proporciona compuestos de criptoficina abarcados por la estructura del género para la preparación de un medicamento que inhiba la proliferación de células hiperproliferativas con fenotipos resistentes a fármacos, incluidas aquéllas con fenotipos con multirresistentes a fármacos, mediante el contacto de dicha célula con un compuesto de criptoficina en una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de una célula de mamífero hiperproliferativa. Una forma de realización preferida es cuando la célula de mamífero es humana. La invención además proporciona el contacto de la célula de mamífero con al menos un compuesto de criptoficina y al menos un agente antineoplásico adicional. Los tipos de agentes antineoplásicos contemplados son los mismos que los descritos anteriormente en la presente.

La composición farmacéutica de la invención se puede usar en un procedimiento para aliviar trastornos patológicos causados por células de mamífero en hiperproliferación, por ejemplo, una neoplasia, mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica proporcionada anteriormente en la presente para inhibir la proliferación de las células en hiperproliferación. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "trastorno patológico" se refiere a cualquier enfermedad causada por la proliferación de células de mamífero que no están sujetas a las limitaciones normales del crecimiento celular. Tal proliferación de células puede deberse a neoplasias, incluidos, aunque no limitados estas, las siguientes neoplasias; de mama, pulmonar de células pequeñas, pulmonar de células no pequeñas, colorrectal, leucemia, melanoma, del sistema nervioso central (SNC), de ovarios, de próstata, sarcoma de tejidos blandos u óseo, de cabeza y cuello, gástrico que incluye pancreáticas y esofágicas, de estómago, mieloma, de vejiga, renal, neuroendocrina que incluye de tiroides y linfoma, no Hodgkin y Hodgkin. En otra forma de realización de la invención, las células neoplásicas son humanas. La composición farmacéutica de la invención también se puede usar en procedimientos de alivio de tales trastornos patológicos utilizando criptoficina en combinación con otros tratamientos, así como otros agentes antineoplásicos. Tales tratamientos y su idoneidad para diferentes neoplásicas pueden encontrarse en Cancer Principles and Practice of Oncology, 4ª ed., Editores Devita, V., Hellman, S., y Rosenberg., S., Lippincott Co. (1993).

En la presente descripción, se muestra que los compuestos de criptoficina potencialmente alteran la estructura microtubular en células cultivadas. Además, y en contraste con los alcaloides Vinca, los compuestos de criptoficina parecen ser un mal sustrato para la glicoproteína P de la bomba de eflujo del fármaco. La criptoficina 1 es la principal citotoxina de las algas verdiazuladas (cianobacterias), cepa de Nostoc sp. Designada GSV 224, y muestra una excelente actividad frente a tumores implantados en ratones- Este didepsipéptido cíclico se había aislado previamente de Nostoc sp., con número de registro ATCC nº 53789 como agente antifúngico y previamente se determinó su estructura macroscópica. La estereoquímica relativa y absoluta de este potencialmente importante fármaco se ha establecido ahora usando una combinación de técnicas químicas y espectrales. De la cepa GSV 224 también se han aislado veinticuatro compuestos de criptoficina adicionales, las criptoficinas 2-7. 16-19, 21, 23, 24, 26, 28-31, 40, 43, 45, 49, 50 y 54, y se han determinado sus estructuras totales y sus citotoxicidades. Se describen varios derivados y productos de degradación, tanto química como farmacológicamente.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar ciertas formas de realización preferidas y aspectos de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma.

Sección experimental

En la siguientes descripción experimental, todos los pesos se proporcionan en gramos (g), miligramos (mg), microgramos (\mug), picogramos (pg), moles (mol) o milimoles (mmol), todas las concentraciones se dan en forma de porcentaje en volumen (%), molar (M), milimolar (mM), micromolar (\muM), nanomolar (nM), picomolar (pM) o normal (N), todos los volúmenes se dan en litros (l), mililitros (L) o microlitros (\mul) y las mediciones lineales en milímetros (mm), a menos que se indique otra cosa.

Los siguientes ejemplos demuestran el aislamiento y la síntesis de compuestos de criptoficina, así como su uso como agentes terapéuticos de acuerdo con la invención.

Ejemplo 1 Análisis de la actividad de despolimerización microtubular de los materiales de criptoficina

La vinblastina, la citocalasina B, el isotiocianato de tetranotilrodamina (TRITC)-faloidina, la sulforodamina B (SRB) y los anticuerpos frente a \beta-tubulina y la viementina se obtuvieron de Sigma Chemical Company. El medio basal Eagle con sales de Earle (BME) fue de Gibco y el suero bovino fetal procedía de Hyclone Laboratories.

Líneas celulares

La línea leucémica de células T Jurkat y las células de músculo liso aórtico de rata A-10 se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron en BME con 10% de FBS y 50 \mug/ml de sulfato de gentamicina. Las células de carcinoma ovárico humano (SKOV3) y una sublínea que se ha seleccionado por su resistencia a vinblastina (SKVLB1) fueron un generoso regalo del Dr. Victor Ling del Instituto de Cáncer de Ontario. Ambas líneas celulares se mantuvieron en BME con 10% de FBS y 50 \mug/ml de sulfato de gentamicina. Se añadió vinblastina hasta una concentración final de 1 \mug/ml a células SKVLB1 24 horas después del paso para mantener la presión de selección para las células que sobreexpresan glicoproteína P.

Ensayos de proliferación celular y parada del ciclo

Los ensayos de proliferación celular se llevaron a cabo como describen Skehan y col.^{11}. Para células Jurkat, los cultivos se trataron con los fármacos indicados como describe Skehan^{11} y los números de células totales se determinaron mediante recuento de las células en un hemacitómetro. El porcentaje de células en mitosis se determinó mediante tinción con Giemsa al 0,4% en PBS, seguida por tres lavados rápidos con PBS. Al menos 1000 células por tratamiento se clasificaron en busca de la presencia de figuras mitóticas y el índice mitótico se calculó como la proporción entre las células con figuras mitóticas y el número total de células contadas.

Ensayos de inmunofluorescencia

Se indujo el crecimiento de células A-10 hasta cerca de la confluencia en cubreobjetos de vidrio en BME/FBS al 10%. Se añadieron compuestos en PBS a las concentraciones finales indicadas y las células se incubaron durante otras 24 horas. Para la tinción de los microtúbulos y los filamentos intermedios, las células se fijaron con metanol frío y se incubaron con PBS con 10% de suero bovino para bloquear los sitios de unión inespecífica. A continuación las células se incubaron a 37ºC durante 60 minutos con anti-\beta-tubulina monoclonal o con antivimentina monoclonal a diluciones recomendadas por el fabricante. Posteriormente se visualizaron los anticuerpos primarios unidos mediante una incubación de 45 minutos con IgG antiratón de conejo conjugada con fluoresceína. Los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos para microscopio y se analizaron y fotografiaron los patrones de fluorescencia usando un Fotomicroscopio Zeiss III equipado con ópticas de epifluorescencia para fluoresceína. Para la tinción de los microfilamentos, las células se fijaron con paraformaldehído al 3%, se permeabilizaron con Triton-X-100 al 0,2% y se redujeron químicamente con borohidruro sódico (1 mg/ml). A continuación se añadió PBS con TRITC-faloidina 100 mM y la mezcla se dejó incubar durante 45 minutos a 37ºC. Las células se lavaron rápidamente tres veces con PBS antes de que los cubreobjetos se montaran e inmediatamente se fotografiaron como se ha descrito anteriormente.

Efectos de las criptoficinas y la vinblastina sobre la proliferación de células Jurkat y el ciclo celular

Las curvas de dosis-respuesta para los efectos de los compuestos de criptoficina y la vinblastina sobre la proliferación celular y el porcentaje de células en mitosis se indican en las figuras 2A y 2B, respectivamente. Menos del 3% de células sin tratar mostraron figuras mitóticas. Los compuestos de criptoficina y la vinblastina produjeron incrementos dependientes de la dosis en el porcentaje de células observadas en mitosis. El aumento del índice mitótico estaba estrechamente correlacionado con reducciones en la proliferación celular, es decir, las concentraciones de los compuestos de criptoficinas y de vinblastina que causaron la acumulación en mitosis del 50% de las células fueron virtualmente las mismas que la concentración que inhibió la proliferación celular en un 50%. Las CI_{50} para los compuestos de criptoficina y la vinblastina para estos efectos fueron de 0,2 y 8 nM, respectivamente.

Efectos de la citochalasina B, la vinblastina y las criptoficinas sobre el citoesqueleto

Se cultivaron células de músculo liso aórtico (A-10) sobre cubreobjetos de vidrio y se trataron con PBS, citochalasina 2 \muM, vinblastina 100 mM o criptoficina 10 nM. Después de 24 horas, se visualizron los microtúbulos y los filamentos intermedios de vimentina mediante inmunofluorescencia indirecta y los microfilamentes se tiñeron usando TRITC-faloidina. Se investigaron los efectos morfológicos de cada fármaco. Las células sin tratar exhibieron extensas redes de microtúbulos completas con centros peritubulares organizadores de microtúbulos. Los filamentos intermedios de vimentina también se distribuyeron de forma uniforme por todo el citoplasma, mientras que haces de microfilamentos se concentraron a lo largo del eje principal de la célula. La citochalasina B produjo la despolimerización completa de los microtúbulos junto con la acumulación de residuos paracristalinos. Este compuesto no afectó a la distribución de los microtúbulos ni de los filamentos intermedios. Tanto la vinblastina como el compuesto de criptoficina produjeron una marcada depleción de microtúbulos. Ningún compuesto afectó a la organización de los microfilamentos; sin embargo, los filamentos intermedios de vimentina colapsaron y formaron anillos concéntricos alrededor de los núcleos de las células tratadas con vinblastina o con un compuesto de criptoficina.

Efectos de las criptoficinas y la vinblastina sobre los microtúbulos estabilizados con taxol

Se trataron células A-10 durante 3 horas con taxol 0 ó 10 \muM antes de la adición de PBS, vinblastina 100 nM o compuesto de criptoficina 10 nM. Después de 24 horas, la organización microtubular se analizó mediante inmunofluorescencia como se ha descrito anteriormente. En comparación con los de las células control, los microtúbulos de las células tratadas con taxol estaban muy ramificados, especialmente en las regiones polares de la célula. Como antes, la vinblastina causó la completa despolimerización de los microtúbulos en las células que no se habían tratado previamente. Sin embargo, el tratamiento previo con taxol impidió la despolimerización de los microtúbulos como respuesta a la vinblastina. De igual forma, el pretratamiento con taxol estabilizó por completo los microtúbulos frente a la despolimerización inducida por criptoficina.

Reversibilidad de la despolimerización microtubular por vinblastina y criptoficina

Se trataron células A-10 con vinblastina 100 nM o con criptoficinas 10 nM durante 24 horas, lo que tuvo como resultado la despolimerización completa de los microtúbulos. Después, las células se lavaron e incubaron en medio sin fármacos durante periodos de 1 hora o de 24 horas. Los microtúbulos se repolimerizaron rápidamente después de la retirada de vinblastina y mostraron niveles significativos de microtúbulos después de 1 hora y la recuperación morfológica completa a las 24 horas. Por el contrario, los microtúbulos no volvieron a aparecer en células tratadas con compuestos de criptoficina ni a la hora ni a las 24 horas de la eliminación del compuesto.

Reversibilidad de la inhibición de la proliferación celular producida por criptoficinas, vinblastina y taxol

Las células SKVO3 se trataron durante 24 horas con dosis CI_{50} previamente determinadas de vinblastina, compuestos de criptoficina o taxol (es decir, valores determinados en experimentos resumidos en la tabla 5). Durante este tiempo, la densidad celular aumentó desde 0,4 a 0,5 \pm 0,05 unidades de absorbancia (Figura 3), lo que indica un incremento del 25% en el número de células para los tres tratamientos. La eliminación de los fármacos tuvo como resultado un crecimiento rápido de las células tratadas con vinblastina, de forma que su número se multiplicó aproximadamente por 3 en 24 horas. Por el contrario, las células tratadas con compuestos de criptoficina o taxol permanecieron paradas, multiplicándose sólo por 0,2 a 0,4 en las 24 horas posteriores a la eliminación del fármaco. La capacidad proliferativa de las células tratadas con criptoficina o taxol se restableció posteriormente, ya que en las siguientes 24 horas el número de células se dobló.

Efectos de las combinaciones de vinblastina y criptoficinas sobre la proliferación celular

Las células SKVO3 se trataron con combinaciones de criptoficinas y vinblastina durante 48 horas. A continuación se determinaron los porcentajes de células supervivientes y se calculó la CI_{50} para cada combinación. Los efectos de estos tratamientos combinatorios, así como de los tratamientos con fármacos únicos, se representan como un isobolograma (figura 4). Las CI_{50} para las combinaciones de compuestos de criptoficinas y vinblastina estaban muy cerca de la línea de aditividad, lo que indica que estos dos fármacos inducen sólo inhibiciones aditivas de la proliferación celular.

Toxicidad de las criptoficinas, la vinblastina y el taxol para las células SKVO3 y SKVLB1

Las células SKVLB1 son resistentes a los fármacos anticancerosos que son productos naturales debido a su sobreexpresión de glicoproteína P^{12}. Las capacidades de taxol, vinblastina y criptoficina para inhibir el crecimiento de las células SKVO3 y SKVLB1 se resumen en la tabla 5. El taxol causó una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de ambas líneas celulares con una CI_{50} para las células SKVO3 y SKVLB1 de 1 y 8000 nM, respectivamente. La vinblastina también inhibió el crecimiento de ambas líneas celulares, con una CI_{50} de 0,35 y 4200 mM para la células SKVO3 y SKVLB1, respectivamente. Se demostró que las criptoficinas tenían una CI_{50} de 7 y 600 pM para las células SKVO3 y SKVLB1, respectivamente. Los factores de resistencia resultantes para las células SKVLB1 a los compuestos se calculan como las CI_{50} para las células SKVLB1. Las CI_{50} para las células SKOV3 también se indican en la tabla 5.

Por tanto, se demuestra que la presente invención proporciona nuevos compuestos de criptoficina, así como compuestos de criptoficina previamente descritos, que son potentes inhibidores de la proliferación celular, actuando mediante la alteración de la red de microtúbulos y la inhibición de la mitosis. Los compuestos de criptoficina alteran la organización microtubular y, por tanto, las funciones celulares normales, incluidas las de la mitosis.

Los agentes antimicrotubulares clásicos, tales como colchicina y alcaloides vinca, detienen la división en la mitosis. Parecía adecuado comparar el efecto de uno de estos agentes sobre la proliferación celular con los compuestos de criptoficina. Para este propósito, el alcaloide vinca vinblastina se seleccionó como agente representativo de los agentes antimicrotubulares clásicos. En consecuencia se comparó el efecto de los compuestos de criptoficina y de la vinblastina sobre la proliferación y la progresión del ciclo celular de la línea celular leucémica de células T Jurkat. Ambos compuestos causaron inhibiciones paralelas dependientes de la dosis de la proliferación celular y la acumulación de células en mitosis.

Dado que los efectos antimitóticos normalmente están mediados por la alteración de los microtúbulos en los husos mitóticos, los efectos de los compuestos de criptoficina sobre las estructuras del citoesqueleto se caracterizaron mediante microscopia de fluorescencia. La tinción de inmunofluorescencia de células tratadas con un compuesto de criptoficina o con vinblastina demostró con claridad que ambos compuestos causaban la pérdida completa de microtúbulos. En estudios similares con células SKVO3 se ha demostrado que los efectos antimicrotubulares de los compuestos de criptoficina no son únicos de la línea de células de músculo esquelético. Ninguno de los fármacos afectó a los niveles o la distribución de los haces de microtúbulos, como se indujo fácilmente con citocalasina B, lo que indica que la pérdida de microtúbulos puede no deberse a un mecanismo inespecífico, por ejemplo la activación de proteasas o la pérdida de carga energética. La vinblastina y los compuestos de criptoficina también estim,ulan un marcado colapso de los filamentos intermedios de vimentina, de forma que se formaron anillos de tinción brillante alrededor del núcleo de la célula.

La eliminación de la vinblastina del medio de cultivo tuvo como resultado una rápida repolimerización de los microtúbulos. Por el contrario, las células tratadas con compuestos de criptoficina permanecieron con depleción de microtúbulos durante al menos 24 horas después de la retirada del compuesto de los cultivos.

La presente invención demuestra que los compuestos de criptoficina evitan la resistencia a múltiples fármacos mediada por la glicoproteína P. El transporte por la glicoproteína P limita la capacidad de los fármacos anticancerosos que son productos naturales para inhibir el crecimiento de las células tumorales con resistencia a fármacos adquirida o de novo. ^{13-15}Los alcaloides Vinca, aunque son muy útiles durante el curso inicial de la quimioterapia, son extremadamente buenos sustratos para el transporte por la glicoproteína P y, por tanto, tiene una utilidad muy limitada frente a los tumores RMF mediados por la glicoproteína P. Por tanto, la identificación de agentes que superen la resistencia a múltiples fármacos puede, debería conducir al desarrollo de agentes anticancerosos nuevos y útiles. Parece que los compuestos de criptoficina de la presente invención son tales agentes, ya que son sustratos malos para el transporte mediado por la glicoproteína P. Este hecho se refleja en el bajo factor de resistencia celular para los compuestos de criptoficina en comparación con la vinblastina, el taxol y otros fármacos productos naturales.

Síntesis total de criptoficinas

Las estructuras de los nuevos compuestos sintetizados, las criptoficinas 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58 y 61, se confirmaron de un modo directo usando metodología bien conocida para los expertos en la técnica. Los datos de los espectros de masa fueron consistentes con las composiciones moleculares. Los datos de RMN de protones y carbono fueron muy similares a los de la criptoficina 1 y estaban relacionados con los análogos naturales y semisintéticos.

Con los siguientes ejemplos se demuestra la síntesis total de compuestos de criptoficina así como su uso como agentes terapéuticos de acuerdo con la invención.

Ejemplo 2 Síntesis de Criptoficina 51 S-trans-3-penten-2-ol (A)

Una mezcla de trans-3-penten-2-ol racémico (933 mg, 11 mmol), laurato de trifluoroetilo (4,14 g, 15 mmol) y lipasa pancreática porcina (PPL, 2,0 g) en 25 ml de dietiléter anhidro se agitó durante 80 horas. A continuación se filtró la PPL y se lavó con éter tres veces. El filtrado del éter se evaporó y después el aceite pegajoso se sometió a destilación al vacío de trayecto corto. El S-trans-3-penten-2-ol (A) se condensó en una trampa de enfriamiento con nitrógeno líquido (383 mg). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 5,57 (4H, cd, -15,3/6,0), 5,47 (3-H, ddd, -15,3/6,4/1,2), 4,19 (2-H; 1:4:6:4:1 pentuplete, 6,4), 2,24 (OH; sa), 1,63 (5-H3; d, 6,0), 1,19 (1-H3; d, 6,4). RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 135,5 (3), 125,5 (4), 68,7 (2), 23,3 (5), 17,5 (1).

S-trans-2-(2-propinloxi)-3-penteno (B)

A una mezcla agitada enérgicamente de S-enantiómero A (628 mg, 7,3 mmol), hidrógeno sulfato de tetrabutilamonio (138 mg, 0,41 mmol) y NaOH al 40% en agua (5 ml) a 0ºC se añadió gota a gota cloruro de propargilo (767 mg, 10,3 mmol, 745 \mul). La agitación enérgica continuó durante la noche, tiempo tras el cual se neutralizó la mezcla con HCl a 0ºC y se extrajo el éter de propargilo en pentano. El extracto se evaporó y el éter de propargilo se purificó en una columna corta de gel de sílice (2% de dietiléter/pentano) para dar 778 mg de éter de propargilo B, [\alpha]_{D}-118,9º (c 2,0, CHCl_{3}); RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 5,70 (4-H'; cd. 18,5/6,5). 5,31 (3-H; ddd. 18,5/7,2/1,4). 4,15 (I'-H; dd, -15,6/2,1). 4,01 (1'-H; dd. -15,6/2,1), 4,01 (2-H; m). 2,38 (3'-H; t. 2,1). 1,73 (5-H; dd; 6,5/1,4), 1,25 (1H; d, 6,3).

(3R,4R)-4-metilhept-5(E)-en-1-in-3-ol (C)

Una alícuota de solución de butil litio hexano (2,5M, 5,1 ml, 12m8 mmol) se evaporó al vacío y el residuo de enfrió hasta -90ºC. Lentamente se añadió una solución de éter de propargilo B (454 mg, 3,66 mmol) en 10 ml de THF. Después de dejar que aumentara la temperatura hasta la temperatura ambiente durante la noche, la mezcla de reacción se inactivó con solución de NH_{4}Cl. La exrtacción con éter tres veces, la evaporación del extracto seco y la purificación del residuo en una columna de gel de sílice (5% de EtOAc/hexano) dieron 322 mg de alcohol C (rendimiento del 71%), [\alpha]_{D}+ 32,9º (c 3,0, CHCl_{3}); IR (NaCl)Vmax 3306, 2968, 1455, 1379, 1029, 975 cm-^{1}. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 5,61 (6-H; cd. 15,3/6,3). 5,38 (5-H; dd, 15,3/7,7). 4,13 (3-H; sa), 2,45 (I-H; d, 1,5), 2,38 (4-H; m). 2,20 (OH; da;3,3), 1,68 (7-H; d, 6,2), 1,09 (4CH_{3}; d. 6,8).^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta 131,5 (5), 127,9 (6), 83,5 (2), 73,6 (1), 66,2 (3), 43,4 (4), 18,1 (7), 15,7 (4-Me).

(3S,4R)-3-terc-butildimetilsililoxi-4-metilhept-5E-enal (D)

A una solución agitada de alcohol C (248 mg, 2 mmol) e imidazol (340 mg, 5 mmol) en 3 ml de DMF seco se añadió cloruro de terc-butildimetilsililo (452 mg, 3 mmol). Después de agitar la mezcla durante la noche, se añadieron 10 ml de NaOH al 10% para destruir el exceso de cloruro de terc-butildimetilsililo. El producto se extrajo en éter y el extracto se lavó sucesivamente con agua, HCl 0,5 M y agua, se secó y se evaporó. La purificación del residuo mediante cromatografía en gel de sílice con hexano dio 457 mg de (3R,4R)-3-terc-butildimetilsililoxi-4-metilhept-5(E)-en-1-ino (rendimiento del 96%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 5,50 (6-H; cd. 15,3/6,1), 5,38 (5-H; dd. 15,3/7,5), 4,16 (3-H; dd, 5,7/1,7), 2,37 (1-H; d, 1,7). 2,35 (4-H; m), 1,68 (7-H; d, 6,1), 1,07 (4-Me; d, 6,8). 0,90 (CMe_{3}, s), 0,12 (SiMe; s), 0,09 (SiMe; s). Usando el mismo procedimiento se formó el correspondiente derivado TBDPS, (3R,4R)-3-terc-butildifenilsililoxi-4-metilhept-5(E)-en-1-ino, con un rendimiento del 92%, [\alpha]_{D}+ 32,9º (c 3,0, CHCl_{3}); RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,72/7,38 (2Ph-H_{5}), 5.32 (6-H; m), 5,25 (5-H; dd, 16,2/7,3), 4,29 (3-H; dd, 5,2/2.0), 2,38 (4-H; m), 2,33 (1-H; d, 2,0), 1,64 (7-H; d, 5,3), 1,1 1 (4-Me; d, 6,9), 1,06 (CMe_{3}).^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta 136,1/135,9/133,6/129,7/129,6/127,5/127,3 (Ph), 132,4 (5), 126,1 (6), 83,3 (2), 73,5 (1), 68,0 (3), 43,6 (4), 26,9 (CMe_{3}), 19,4 (CMe_{3}), 18,0 (7), 14,7 (4-Me).

A 1,1 ml de solución de BH3 THF (1M, 1,1 mmol) se añadió 2-metilbuteno (1,15 ml, solución 2M en THF, 2,3 mmol) a 25ºC y la mezcla se agitó en un baño de hielo durante dos horas. Después la temperatura se enfrió hasta -50ºC y de una vez se añadió una solución de derivado TBS (238 mg, 1mmol) en 1 ml de THF. Se retiró el baño de enfriamiento y la mezcla de reacción se dejó calentar y reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se añadieron una solución 2,2M de KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} (4,8 ml) y H_{2}O_{2} al 30% (0,8 ml) a 0ºC. Una hora después, se evaporó el THF y el residuo se extrajo en éter. El extracto de éter seco se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (1% de EtOAc/hexano) para dar 194 mg de aldehído D (rendimiento del 76%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 9,78 (1-H; t, 2,3), 5,46 (6-H; cq, 15,36/6,1I), 5,34 (5-H; dd, 15,3/7,5). 4,13 (3-H; m), 2,47 (2-H; m), 2,1 (4-H; m), 1,66 (7-H; da, 6,1). 0,99 (4-Me; d, 6,8), 0,87 (CMe_{3}; s), 0,07 (SiMe; s), 0,04
(SiMe; s).

El derivado éter de terc-butildifenilsililo (TBDPS) del aldehído se formó con un rendimiento del 83%. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 9,52 (1-H; 1, 2,4), 7,69/7,40 (2Ph-H_{5}), 5,28 (6-H; m), 5,22 (5-H; dd, 16,2/6,2). 4,19 (3-H; m), 2,42 (2-H; m), 2,29 (4-H; m), 1,60 (7-H; d, 5,4), 1,07 (CMe_{3}), 1,02 (4-Me; d, 6,9). ^{13}C NMR(CDCl_{3}) \delta 202,0 (1), 136,1/133,6/133,3/130,2/129,7/127,7/127,6 (Ph), 132,3 (3), 126,2 (6) 72,8 (3), 47,6 (2), 42,2 (4), 27,1 (CMe_{3}), 19,6 (CMe_{3}), 18,3 (7), 14,9 (4-Me).

Metil (5S,6R)-5-terc-butildimetilsililoxi-6-metil-7-oxonona-2E,7E-dienoato (E)

A una solución agitada de aldehído D (0,74 g, 2,9 mmol) y fosfonoacetato de trimetilo (632 mg, 3,5 mmol) en 5 ml de THF enfriada hasta -78ºC se añadió tetrametilguanidina (435 \mul, 3,5 mmol). Tras 30 minutos, se retiró el baño de enfriamiento y la mezcla se agitó durante otras cuatro horas. La mezcla se neutralizó con HCl 1N y el producto se extrajo en éter. La evaporación del extracto en éter seco dejó un residuo que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (5% de EtOAc/hexano) para dar 0,814 g de E (rendimiento del 90%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 6,93 (3-H; td, 15,6/7,8), 5,62 (2-H; dd. 15,6/1,2), 5,37 (8-H, m), 5,37 (7-H, m), 3,71 (OCH_{3}, s), 3,61 (5-H, m), 2,29 (4-H_{2}, m), 2,22 (6-H, m), 1,66 (9-H_{3}, da, 6,1I), 0,99 (6-Me; d, 6,8), 0,88 (CMe_{3}; s), 0,03 (Sime; s), 0,01
(SiMe; s).

El derivado éter de terc-butildifenilsililo (TBDPS) del aldehído se formó con un rendimiento del 90%. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,68/7,38 (2Ph-H_{5}), 6,75 (3-H; td, 15,6/7,4), 5,62 (2-H; d, 15,6), 5,34 (8-H, m), 5,29 (7-H, m), 3,70 (5-H, m), 3,68 (OCH_{3} s), 2,28 (4-H_{2}, m), 2,20 (6-H, m), 1,62 (9-H_{3}; d, 5,3), 1,08 (CMe_{3}), 0,99 (6-Me; d, 6,9). ^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta 166,7 (l), 146,4 (3), 136,0/134,2/133,8/129,62/129,56/127,5/127,4 (Ph), 132,5 (7), 125,8 (8), 122,6 (2), 76,2 (5), 51,3 (OCH_{3}), 41,7 (6), 36,8 (4), 27,0 (CMe_{3}), 19,4 (CMe_{3}), 18,1 (9), 14,7 (6-Me).

Metil (5S,6R)-5-terc-butildimetilsililoxi-6-metil-7-oxohept-2(E)-enoato (F)

A través de una solución de éster de metilo E (328 mg, 10,0 mmol) y 97 \mul de piridina en 15 ml de CH_{2}Cl_{2} a -78ºC se pasó ozono y el progreso de la zonololisis se monitorizó mediante análisis TLC. Después de que consumió todo el éster de metilo se añadieron aproximadamente 500 mg de polvo de cinc y 1 ml de ácido acético glacial. Lentamente se incrementó la temperatura a 25ºC. La mezcla se filtró y el filtrado se lavó sucesivamente con soluciones de CuSO_{4} saturado y NaHCO_{3}. Tras la evaporación del disolvente, el aldehído F bruto (249 mg, 83%) se usó en la siguiente etapa sin más purificación. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 9,96 (7-H; t, 2,3), 6,96 (3-H; dt, 15,7/7,6), 5,90 (2-H; dd, l5,7/0,7), 4,05 (5-H; m), 3,74 (OMe; s), 2,51 (6-H; m), 2,45 (4-H_{2}; m), 1,09 (6-Me; d, 6,9). 0,88 (CMe3; s), 0,4 (SiMe; s), 0,03

\hbox{(SiMe; s).}

Metil (5S,6R)-5-t-butildimetilsililoxi-6-metil-8-fenil-octa-2E,7E-dienoato (G)

A una solución agitada de aldehído F (25,0 mg, 0,08 mmol) en 1,5 ml de THF a -78ºC se añadieron 0,80 ml de una mezcla fría (-78ºC) de cloruro de benciltrifenilfosfonio (268 mg, 0,69 mmol, en 6,9 ml de THF) y n-butillitio (280 \mul, 2,5M en hexano). Tras 15 minutos, se retiró el baño frío y la agitación continuó durante dos horas. La reacción se inactivó con una solución de cloruro amónico saturado y el THF se evaporó. El concentrado se extrajo con hexano dos veces y el extracto combinado se lavó con salmuera, se secó y se evaporó. El aceite residual, una mezcla 5:1 de los isómeros E y Z, se disolvió en 1,5 ml de benceno que contiene tiofenol (0,02M) y 1,1'-azobis(ciclohexanocarbonitrilo) (VAZO, 0,006M) y la mezcla se llevó a reflujo durante 5 horas. Después de enfriar hasta la TA se añadió hexano (15 ml) y la solución orgánica se lavó sucesivamente con NaOH al 10% y salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó. La cromatografía en gel de sílice del residuo (2% de EtOAc/hexano) produjo 24 mg (80%) de G. [\alpha]_{D}+ 68,2º (c 1,5, CHCl_{3}); EIEM m/z 374 (<1%; M^{+}), 359 (1; M^{+}-CH_{3}), 317 (10; M^{+}-Bu), 275 (10), 243 (73), 143 (20), 115 (10), 97 (64), 89 (31), 73 (100); HREMEM m/z 374,2232 (C_{22}H_{34}O_{3}Si, \Delta + 1,1 mmu), 317,1579 (C_{18}H_{25}O_{3}Si, \Delta + 4,5 mmu), 3,59,2031(C_{21}H_{31}O_{3}Si, \Delta + 1,1 mmu). 317,1579 (C_{18}H_{25}O_{3}Si, \Delta -0,6 mmu); UV (MeOH) \lambda_{max} (\varepsilon) 206 (33500), 252 (20100) nm; IR \nu_{max} 2952, 2855, 1725, 1657, 1435, 1257, 1168, 1097, 970, 836, 775 cm-1; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,2-7,4 (Ph-H_{5}; m); 6,6 (3-H; ddd, 15,6/7,8/7,5), 6,37 (8-H; d, 15,9), 6,16 (7-H; dd, 15,9/8,1), 5,84 (2-H; d, 15,6), 3,75 (5-H; ddd, 10,2/6,0/4,2), 3,72 (OMe; s), 2,44 (6-H; m), 2,36 (4-H_{2}; m), 1,10 (6-Me; d, 6,9), 0,91 (Si-CMe_{3}; s), 0,06 (Si-Me; s), 0,05 (Si-Me; s); ^{13}C RMN \delta 166,8 (1), 146,4 (3), 137,6 (Ph 1'), 131,9 (8), 130,4 (7), 128,5 (Ph 3'1/5'), 127,0 (Ph 4'), 126,0 (Ph 2'/6'), 122,9 (2), 75,0 (5), 51,4 (OMe), 42,8 (6), 37,6 (4), 25,9 (S i - CMe_{3}), 18,1 (Si-CMe,), 16,2 (6-Me), -4,4 (Si-Me), -4,5 (Si-Me). Calcd para C_{22}H_{34}O_{3}Si: C, 70,52; H, 9,17. Encomtrado: C, 70,72;
H, 9,42.

Ácido metil (5S,6R)-5-t-butildimetilsililoxi-6-metil-8-fenil-octa-2E,7E-dienoico (H)

A una solución de éster G (159 mg, 0,43 mmol) en 7 ml de acetona se añadieron 5 ml de LiOH ac. 1N. La mezcla se agitó a 25ºC durante 3 horas, se diluyó con 20 ml de Et_{2}O y se acidificó hasta \approx4 con HCl 1N. La capa orgánica se separó y se lavó con porciones de 20 ml de salmuera y agua, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó. La cromatografía en gel de sílice del aceite residual con EtOAc al 40% en hexano con 0,5% de AcOH dio como resultado un ácido puro H en forma de un aceite móvil de color amarillo claro (145 mg, rendimiento del 95%): [\alpha]_{D}+ 87,0º (c 1,4, CHCl_{3}); EIEM m/z 343(1; M^{+}-OH), 303 (5), 275 (9), 257 B(4), 229 (62), 213 (16), 171 (22), 143 (37), 131 (16), 115 (23), 97 (100), 91 (44); HREMEM m/z 343,2107 (C_{21}H_{31}O_{2}Si, \Delta + 1,3 mmu), 229,1220 (C_{15}H_{17}O_{2}Si, \Delta + 0,9 mmu); UV \lambda_{max} (\varepsilon) 206 (24500), 252 (15600) nm; IR \nu_{max} 3300-2800 (a), 2956, 2856, 1697, 1651, 1419, 1256, 1097, 836, 693 cm-1; RMN ^{1}H \delta 10,4 (CO_{2}H; s, W_{1/2}\approx100), 7,2-7,4 (Ph-Me_{5}; m), 7,09 (3-H; ddd, 15,6/7,6/7,6), 6,39 (8-H; d, 15,9), 6, I6 (7-H; dd, 15,9/8,1), 5,85 (2-H; d, 15,6). 3,78 (5-H; ddd, 6,0/6,0/4,2), 2,46 (6-H; m), 2,40 (4-H_{2}; m), 1,12 (6-Me; d, 6,9). 0,92 (Si-CMe_{3}; s), 0,07 (SiMe_{2}; s); ^{13}C RMN \delta 171,6 (1), 149,1 (3), 137,5 (Ph 1'), 131,8 (8), 130,5 (7), 128,5 (Ph 3'/5'), 127,1 (Ph 4'), 126,1 (Ph 2'/6'), 122, 7 (2), 74,9 (5), 42,9 (6), 37,6 (4), 25,8 (Si-CMe_{3}), 18,1 (Si-CMe_{3}), 16,1 (6-Me), -4,4 (Si-Me), -4,5 (Si-Me).

Éster 2,2,2,-tricloroetilo de 3-(3-cloro-4-metoxifenil)-D-alanina (I)

Una muestra del derivado D-clorotirosina BOC (160 mg, 0,35 mmol) se disolvió en 3 ml de ácido trifluoroacético neto y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. La eliminación del exceso de reactivo a presión reducida devolvió la amina I deseada como la sal trifluoroacetato (165 mg, rendimiento del 100%). [\alpha]_{D}+ 1,7º (c 5,2, CHCl_{3}); IR \nu_{max}3400-2500 (a), 1760, 1680, 0, 1500, 1200, 1130, 1070, 805, 710 cm^{-1}; RMN ^{1}H \delta 807 (NH2; ma, W_{1/2}\approx 45), 7.27 (5-H; s), 7,12 (9-H; d, 8,1, 6,88 (8-H; d, 8,1), 4,86/4,67 (CH_{2},CCl_{3}; AB C, -12,0), 4,41 (2-H; sa. W_{1/2}=20), 3,86 (OMe; s), 3,33 (3-H; dd, -14,4/3,6), 3,22 (3-H'; dd, -14,4/6,6); RMN ^{13}C \delta 167,6 (1), 155,0 (7), 130,9 (5), 128,8 (9), 125,4 (4), 123,1 (6), 112,7 (8), 93,4 (CCl_{3}), 75,3 (CH_{2}, CCl_{3}), 56, (OMe), 54,2 (2), 34,9 (3).

Compuesto J

A una solución agitada de H (25 mg, 0,07 mol) en 3 ml de DMF anhidra en atmósfera de argón se añadió sucesivamente pentafluorodifenilfosfinato (FDPP, 32 mg, 0,08 mmol), sal trifluoroacetato I (35 mg, 0,07 mmol) y diisopropiletilamina (DIEA), 27 mg, \approx 36 \mul, 0,21 mmol, \approx 3 equiv.). La agitación continuó a 25ºC durante 1 hora y después se extrajo la mezcla de reacción con 20 ml de Et_{2}O. El extracto éter se lavó con 10 ml de HCl 1N, seguido por 10 ml de NaHCO_{3} sat., 20 ml de salmuera y 20 ml de agua, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó. El aceite de color amarillo claro residual se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (EtOAc al 15% en hexano) para dar J en forma de un aceite incoloro (32 mg, rendimiento del 65%): [\alpha]_{D}+ 11,8º (c 1,2, CHCl_{3}); EIEM m/z; 644/646/648/650 (7/8/6/3; M+ -Bu), 570/572/574 (46/100/21), 536/538 (18/15), 394/396 (67/29), 275 (20), 155/157 (29/9); HREIEM m/z 644,0981 (C_{29}H_{34}Cl_{4}NO_{5}Si, \Delta -2,13 mmu); UV \lambda_{max} (\varepsilon) 204 (54900), 230 (23200), 248 (19200), 284 (3500) nm; IR \nu_{max} 3290, 2980, 1760, 1680, 1640, 1505, 1380, 1270, 1169, 990, 720 cm-1; RMN ^{1}H unidad A \delta 7,2-7,4 (Ph-H_{5}; m), 6.87 (3-H; ddd, 15,0/7,8/7,5), 6,37 (8-H; d, 16,2), 6,8 (7-H; dd, 16,2/8), 5,82 (2-H; d, 15,0), 3,75 (5-H; ddd, 9,9/6,0/4,8), 2,46 (6-H; m), 2,36 (4-H_{2}; m), 1,11 (6Me; d, 6,9), 0,91 (SiCMe_{3}; s), 0,07 (SiMe; s), 0,6. (SiMe; s); unidad B \delta 7,19 (5-H; d, 2,1), 7,04 (9-H; dd. 84/2,1), 6,85 (8-H; d, 8,4), 5,85 (NH; d, 7,8); 5,08 (2-H; ddd, 7,8/6,0/5,7), 4.81/4,4 (CH_{2}CCl_{3}: AB c, -11,7), 3,87 (OMe; s), 3,22 (3-H; dd, -14,1/5,7), 3,12 (3-H'; dd, -14,1/6,0). RMN ^{13}C unidad A \delta 165,1 (1), 143,0 (3), 137,6 (9), 132,0 (8), 13,4 (7), 128,5 (11/13), 127,0 (12), 126,0 (10/14), 124,7 (2), 75.0 (5), 42,6 (6), 3,6 (4), 25,9 (Si-CMe_{3}), 18,1 (Si-CMe_{3}), 16,5 (6-Me), -4,3 (Si-Me), 4,6 (Si-Me); unidad B \delta- 170,1 (1), 154,3 (7), 131,1 (5), 128,5 (4/9), 122,6 (6), 112,2 (8), 94,2 (CCl_{3}), 74,8 (CH_{2},CCl_{3}), 56,1 (OMe), 53,0 (2),
36,5 (3).

(1'R,5S,6R)-N-1'-(carbo-2'',2'',2''-(tricloroetoxi)-2'-(3-cloro-4-met hoxifenil)etil-5-t-butildimetilsililoxi-6-metil-8-fenil-octa-2E,7E-dienamida (K)

A una solución de J (50 mg, 0,07 mmol) en 4 ml de MeCN se añadieron 400 \mul de HF ac. al 50% y la mezcla se agitó durante 1 hora a 25ºC. La extracción en 30 ml de Et_{2}O, seguida por lavado del extracto de éter con porciones de 30 ml de NaHCO_{3} sat., salmuera y agua, secado (MgSO_{4}) y evaporación, dio alcohol K en forma de una espuma incolora (40 mg, rendimiento del 45%): [\alpha]_{D}-6,1º (c 1,3, CHCl_{3}); EIEM m/z (intensidad rel.); 587/589/591/593 (M+, <1%), 552/554/556 (1/2/0,5), 456/458/460/462 (1/2/1/0,2), 342/344/346 (7/8/4), 221/214 (15/5), 195/197 (6/2), 155/157 (99/34), 131 (100), 91 (77); HREIEM m/z 587,0721 (C_{27}H_{29}^{35}Cl_{4}NO_{5}, \Delta + 7,9 mmu); UV \lambda_{max} (\varepsilon) 204 (56500), 230 (22100), 248 (18100), 284 (3600) nm; IR \nu_{max} 3400, 3300, 2980, 1780, 1680, 1640, 1505, 1270, 1180, 1090, 1000, 770 cm-1; RMN ^{1}H unidad A \delta 7,2-7,4 (Ph-H5; m), 6,92 (3-H; ddd, 15,3/7,8/7,5), 6,46 (8-H d, 15,9), 6,4 (7-H; dd, 15,9/8,4), 5,90 (2-H; d, 15,3), 3,65 (5-H; ddd 7,8/5,6/4,0), 2,39 (6-H/4-H_{2}; ma), 1,78 (OH; sa, W_{1/2}i\approx 40 Hz), 1,14 (6-Me; d, 6,9); unidad B \delta 7,18 (5-H; d, 1,8), 7,03 (9-H; dd, 8,1/1,8), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,97 (NH; d, 7,8). 5,06 (2-H; ddd, 7,8/6,0/5,7), 4,79/4,72 (CH_{2}CCl_{3}; AB c, -12,0), 3,86 (OMe; s), 3,20 (3-H; dd, -14,1/5,7), 3,10 (3-H'; dd, -14,1/6,0). RMN ^{13}C unidad A \delta 165,3 (1) 142.6 (3), 137,0 (9), 131,7 (8), 131,0 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (12), 126,1 (10/14), 125,0 (2), 73,8 (5), 43,2 (6), 37,2 (4), 16,8 (6-Me); unidad B \delta 170,2 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 128,4 (9), 128,3 (4), 122,5 (6), 112,2 (8), 94,2 (CCl_{3}), 74,7 CH_{2}CCl_{3}), 56,1 (OMe), 53,0 (2),
36,5 (3).

Ácido 3-(terc-butoxicarbonil)amino-2,2-dimetilpropanoico (M)

A una solución de 3-amino-2,2-dimetilpropan-1-ol (L) (3,0 g, 29 mmol) en 51 ml de una solución al 10% de trietilamina en MeOH se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (6,7 g, 31 mmol) y la mezcla se agitó a 25ºC durante 1 hora. Después de eliminar el disolvente, el residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (30 ml) y la solución se lavó dos veces con KHSO_{4} 1M (pH 2) y una vez con una solución de NaCl saturado y se secó con (MgSO_{4}). La retirada del disolvente al vacío dio 5,8 g (rendimiento del 93%) de 3-(terc-butoxicarbonil)amino-2,2-dimetilpropan-1-ol en forma de un sólido blanco que se usó directamente para la siguiente etapa sin más purificación (pureza > 95% por análisis RMN), pf. 70.5-71,5ºC; IR \nu_{max} 3350, 1685, 1456 cm-1; RMN ^{1}H \delta 4,87 (NH; sa), 3,72 (OH, sa), 3,19 (1-H_{2}; d, 5,1), 2,95 (3-H_{2}; d, 6,0), 1,44 (CMe_{3}; s), 0,85 (2-Me_{2}; s); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 157,6 (BOC CO), 79,7 (CMe_{2}), 68,1 (1), 47,1 (3), 36,7 (2), 28,3 (CMe_{3}), 22,4 (2-Me_{2}).

A una solución de alcohol 3-(terc-butoxicarbonil)amino-2,2-dimetilpropan-1-ol (5,3 g, 25,9 mmol) y peryodato sódico (16,6 g, 77,7 mmol) en tetracloruro de carbono (52 ml), acetonitrilo (52 ml) y agua (78 ml) se añadió hidrato tricloruro de rutenio (122 mg) y la mezcla se agitó a 25ºC durante 1 hora. La mezcla se filtró a través de celite y se añadió una solución daturada de carbonato potásico en agua (50 ml). La capa de agua se separó, se lavó con éter (20 ml), se acidificó con HCl hasta un pH 2 a 0ºC y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (30 ml x 3). Los extractos combinados se lavaron con una solución de NaCl saturado y se secaron con (MgSO_{4}). La eliminación del disolvente al vadío dio un residuo que primero se sometió a cromatografía ultrarrápida de fase inversa en una columna de sílice C18 (DOS 120 \ring{A}, MeOH 50 a 90%) y después se cristalizó en éter para dar 3,7 g (rendimiento del 66%) de M en forma de un sólido blanco, pf. 106-108ºC; EIEM m/z (intensidad rel.) 217 (0,1), 161 (11), 98 (25), 88 (71), 57 (100); HREIEM m/z 217,1292 (C_{10}H_{19}NO_{4}, \Delta + 2,2 mmu); IR \nu_{max} 3450-2500, 1710, 1694, 1510 cm-1; RMN ^{1}H del componente principal \delta 5,03 (NH; sa), 3,26 (3-H_{2}; m), 1,45 (Cme3; s), 1,24 (2-Me_{2}; s); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 183,2 (1), 156,3 (BOC CO), 79,6 (CMe_{3}), 49,5/47,9 (2/3), 28,4 (CMe_{3}), 22,9 (2-Me_{2}).

(2S)-2-hidroxi-4-metilpentanoato de alilo (N)

A una solución de 2,66 g de ácido leucico (20 mmol) y 1,74 g de bicarbonato sódico (20 mmol) en 30 ml de agua a 0ºC se añadieron 30 ml de una solución CH_{2}Cl_{2} de 6,44 g de cloruro de tetrabutilamonio (20 mmol) y 1,74 ml de bromuro de alilo (20 mmol). Después de agitar enérgicamente la mezcla durante 24 horas se evaporó el CH_{2}Cl_{2}. Se añadieron aproximadamente 50 ml de agua y la fase acuosa se extrajo cuatro veces con Et_{2}O. La solución en éter se secó sobre sulfato sódico anhidro y después se evaporó. El residuo se pasó a través de una columna corta de Si para dar 3,21 g de éster de alilo N (rendimiento del 93%) en forma de un aceite incoloro, [\alpha]_{D}-8,4º (c 1,1, CHCl_{3}); IR \nu_{max} 3464, 2957, 1732, 1203, 1140, 1087 cm^{-1}; RMN ^{1}H \delta 5,92 (alilo 2-H; m), 5,34 (alilo 3-H_{2}; dd, 17,4/1,1), 5,28 (alilo 3-H?; dd, 10,5/1,1), 4,67 (alilo 1-H_{2}; d, 5,7), 4,23 (2-H; sa), 2,64 (OH; sa), 1,89 (4-H; m), 1,57 (3-H_{2}; m), 0,96 (5-H_{3}; d, 6,5), 0,95 (4-Me; d 6,7); RMN ^{13}C \delta 175,3 (1), 131,4 (alilo, C-2), 118,6 (3), 68,9 (2), 65,7 (alilo C-1), 43,2 (3), 24,1 (4), 23,0 (5), 21,3 (4-Me).

(2S)-2-[3'(terc-butoxicarbonil)amino-2',2'-dimetilpropanoiloxil-4-metilpentanoato de alilo (O)

A una solución de 0,8 g de M (3,7 mmol), 0,76 g de N (4,4 mmol) y 92 mg de DMAP en 10 ml de CH_{2}Cl_{2} seco a 0ºC se añadieron 0,84 g de DCC (4,1 mmol) en CH_{2}Cl_{2}. La mezcla se agitó a 25ºC durante 3 horas y se filtró. El filtrado se lavó con bicarbonato sódico acuoso saturado, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó al vacío. La cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, 5% de EtOAc/hexano) dio 1,0 g (rendimiento del 92%) de O puro en forma de un aceite incoloro, Rf 0,68 (EtoAc/hexano 17:83), [\alpha]_{D}-19,4º (c 18,1, CHCl_{3}); EIEM m/z (intensidad rel.) 371 (2, M+), 242 (13), 184 (12), 126 (20), 84 (100); HREIEM m/z 371,2317 (C_{19}H_{33}NO_{6}, \Delta -0,9 mmu; IR (neto) \nu_{max} 3385, 2963, 1731, 1720, 1513 cm^{-1}; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) unidad C \delta 5,39 (NH; sa oscuro), 3,33 (3-H; dd, -13,5/7,4), 3,27 (3-H?; dd, -13,5/5,9), 2,78 (2-H, m), 1,44 (CMe_{3}; s), 1,23 (2-Me; s), 1,22 (2-Me; s); unidad D \delta 5,91 (alilo 2-H; ddt, 16,6/10,3/6,0 Hz), 5,34 (alilo 3-H_{2}; db, 16,6), 5,27 (alilo 3-H_{2}; db, 10,3), 5,08 (2-H; dd, 9,6/3,6), 4,65 (alilo 1-H_{2}; m), 1,6-1,9 (3-H_{2}/4-H, m), 0,94 (5-H_{3}; d, 6,3), 0,94 (4-Me; d, 7,3); RMN ^{13}C unidad C \delta 176,5 (1), 156,3 (BOC-CO), 79,0 (CMe_{3}), 48,6 (3), 44,0 (2), 28,4 (CMe_{3}), 22,2/23,0 (2-Me_{2}); unidad D \delta 170,6 (1), 131,4 (alilo C-2), 119,1 (alilo C-3), 70,9 2), 66,0 (alilo C-1), 39,5 (3), 24,8 (4), 23,0 (5), 21,5 (4-Me).

Ácido (2S)-2-[3'(terc-butoxicarbonil)amino-2',2'-dimetilpropanoiloxi]-4-metilpentanoico (P)

A 10 ml de una solución de 180 mg (0,49 mmol) de O y 60 mg (0,05 mmol) de tetrakis(trifenilfosfina)paladio en THF seco (en atmósfera de argón) se añadieron lentamente 470 \mul (5,4 mmol) de morfolina seca durante 10 minutos. Después de agitar durante 50 minutos, se añadieron 40 ml de éter y la solución se lavó con HCl 1N (40 ml) y después se extrajo con bicarbonato sódico saturado (2 x 30 ml). El extracto acuoso se acidificó con HCl 0,5N y se extrajo con éter (40 ml). El extracto de éter se lavó con agua (2 x 30 ml), se secó (MgSO_{4}) y se evaporó al vacío para dar P en forma de un aceite móvil incoloro (152 mg, 95%);), [\alpha]_{D}-22,2º (c 2,2, CHCl_{3}); EIEM m/z (intensidad rel.) 331 (1, M+), 275 (1), 258 (4), 231 (9), 202 (36), 174 (13), 144 (31), 126 (16), 114 (14), 98 (54), 88 (50), 84 (100); HREIEM m/z 331,2004 (C_{16}H_{29}NO_{6}, \Delta -1,0 mmu; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) unidad C \delta 5,41 (NH; dd, 5,7/5,4), 3,30 (3-H_{2}; m), 2,68 (2-H; m), 1,43 (CMe; sa), 1,22 (2-Me; s), 1,21 (2-Me; s); unidad D \delta 6,47 (1-OH; sa, W_{1/2}\approx 35), 5,0 9 (2-H; dd, 9,3/2,7), 1,7-1,9 (3-H/4-H; m), 0,97 (5-H_{3}; d, 6,0), 0,94 (4-Me; d, 6,0); ^{13}C RMN (CDCl3) unidad C \delta 176,5 (1), 156,5 (BOC CO), 79,3 (CMe_{3}), 48,6 (3), 44,0 (2), 28,3 (CMe_{3}), 23,0 (2-M2), 22,2 (2-Me); unidad D \delta 175,4 (1), 70,6 (2), 39,5 (3), 24,8 (4), 23,0 (5), 21,4 (4-Me).

Compuesto O

A una solución de alcohol K (80 mg, 0,14 mmol), ácido P (68 mg, 0,21 mmol) y DMAP (4 mg) en CH_{2}Cl_{2} seco (4 ml) agitada a 0ºC en atmósfera de argón se añadió DCC (44 mg, 0,21 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (1 ml). La mezcla se agitó a 0ºC durante 30 minutos, tiempo durante el cual se desarrolló un precipitado de color blanco, y después se dejó calentar hasta la temperatura ambiente y se agitó durante otras 4 horas. El precipitado se filtró y el filtrado se diluyó con Et2O (40 ml) y se lavó sucesivamente con HCl diluido (1M, 40 ml), NaHCO3 saturado (40 ml) y salmuera (40 ml). La capa etérea se secó (MgSO4) y se evaporó al vacío, para dar un sólido cerúleo. La cromatografía (sílice, EtOAc:hexano, 1:3) condujo a compuesto Qpuro en forma de un aceite viscoso e incoloro (103 mg, 84%), [\alpha]_{D} -3,1º (c 2,9, CHCl_{3}): EIEM m/z 800/802/804/806 (< 1, M^{+} C_{5}H_{8}O_{2}), 415/417/419/421 (5/3/3/2), 342/344/346 (7/9/4). 286/288/290 (2/6/2), 207 (34), 178 (22). 155/157(66/24). 13 1 (36), 91 (70), 70 (100); HREIEM m/z 800,2179 (C_{38}H_{48}N_{2}O_{8}^{35}C_{l4}, \Delta-1,4 mmu); UV (MeOH) \lambda_{max}(\varepsilon) 204 (51200), 230 (18500), 248 (17200), 282 (2200) nm; IR NaCI) \nu_{max} 3376, 2965, 1755, 1728, 1712, 1678, 1504, 1258, 1150, 1067, 732 cm^{-1}. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta unidad A: 7,28-7,33 (10-H/14-H/11-H-13-H; m), 7.22 (12-H; m), 6,78 (3-H; ddd, 15,8/6,4/6,3), 6,40 (8-H; d, 15,8), 6,01 (7-H; dd, 15,8/8,7), 5,88 (2-H; d, 15,8), 5,06 (5-H; ma, W_{1/2},\approx 20 Hz), 2,62 (6-H; m), 2,53 (4H_{2}; ma, W_{1/2},\approx15 Hz), 1,12 (6CH_{3}, d, 6,8); unidad B 7,18 (5-H;d,2,0),7,05 (9-H; dd, 8,5/2,0), 6,83(8H; d, 8,5), 6,49 (NH; d, 7,9), 5,06 (2-H; ma, W_{1/2},\approx 20 Hz), 4,79/4,70 (CH_{2}CCl_{3}; AB c, -11,7), 3,85 (OCH_{3}; s), 3.20 (3-H_{b}; dd, -14,1/5,8), 3,07 (3-H_{a}, dd. -14,1/6,7); unidad C 5,38 (NH; ta. 6,5), 3,27 (3-H_{2}; d, 6,5), 1,20 (2-CH_{3}; s), 1,15 (2-CH_{3}'; s); unidad D 4,92 (2-H; dd, 10,0/3,8), 1,72 (4-H; ma, W_{1/2},\approx 20 Hz), 1,67 (3H_{b}; ddd, -14,1/10,0/5,0/), 1,56 (3-H_{a}; ddd, -14,1/9,1/3,8), 1,43 (CO_{2}Me_{3}; s), 0,86 (4-CH_{3}; d. 6,4), 0,82 (5-H_{3}; d, 6,4).^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta unidad A 165,4 (1), 139,3 (3), 136,9 (9), 131,7 (8), 130,1 (7), 128,6 (11/13), 127,5 (12), 126,2 (10/14), 125,4 (2), 76,5 (5), 41,1 (6), 33,4 (4), 16,7 (6-Me); unidad B 170,0 (1), 154, (7),131, 2 (5), 128,8 (4), 128,5 (9), 122,3 (6), 112,1 (8), 94,3 (CH_{2}CCl_{3}), 74,6 (CH_{2}CCl_{3}), 56,1 (7-OMe), 53,2 (2), 36,6 (3); unidad C 176,9 (1), 156,4 (CO_{2}CMe_{3}), 79,1 (CO_{2}CMe_{3}), 48,7 (3), 44,0 (2), 22,8 (2 -Me), 22,3 (2 -Me'); unidad D 170,7 (1), 71,4 (2), 39,5 (3), 28,4 (CO_{2}CMe_{3}), 24,8 (4), 23,0 (4-Me), 21,4 (5).

Aminoácido R

Al aminoácido Q (100 mg, 0,11 mmol) se añadió polvo de Zn activado (400 mg, exceso) y AcOH (4 ml). La mezcla heterogénea se sometió a ultrasonidos durante 45 minutos, se agitó durante otros 90 minutos a temperatura ambiente, después se vertió en una lámina de celite. El material orgánico se lavó de la lámina de celite con CH_{2}Cl_{2}. El disolvente se eliminó al vacío y se obtuvo el ácido carboxílico en forma de un sólido amorfo incoloro.

Sin purificar, el ácido bruto se disolvió en ácido trifluoroacético (TFA, 5 ml) y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de este tiempo, el TFA se eliminó al vacío y el sólido amorfo resultante se sometió a purificación por cromatografía (Sep-Pak™, sílice inicialmente CH_{2}Cl_{2} después 10% de MeOH/CH_{2}Cl_{2}), que proporcionó la sal amónica de trifluoroacetato del compuesto deseado. La liofilización repetida de una solución acuosa de la sal dio como resultado el aminoácido libre R en forma de un sólido amorfo incoloro (68 mg, 91% en dos etapas); IR (NaCl) \nu_{max} 3300, 3200, 2965, 1693, 1606, 1504, 1441, 1259, 1201, 1146, 1066, 727 cm-^{1}; RMN ^{1}H (CD_{3}OD) \delta unidad A: 7,33 (10-H/14-H; d, 7,4), 7,28 (11-H/13-H; t, 7,4), 7,18-7,23 (12-H; m), 6,69 (3-H; ddd, 15,6/7,7/7,0), 6,43 (8-H; d, 15,8), 6,04 (7-H; dd, 15,8/8,9), 6,00 (2-H; d, 15,6), 5,01 (5-H; ddd, 9,1/6,9/3,1), 2,64 (4-H_{b}; ma, W_{1/2}\approx30 Hz), 2,60 (6-H; ma, W_{1/2}\approx20 Hz), 2,49 (4-H_{a}; ddd, 15,8/9,1/7,7), 1,13 (6-Me; d, 6,7); unidad B 7,18-7,23 (5-H; m), 7,11 (9-H; dd, 8,3/1,6), 6,92 (8-H; d, 8,3), 4,59 (2-H; ma, W_{1/2}\approx 20 Hz), 3,81 (OCH_{3}; s), 3,14 (3 H_{b}; dd, -13,7/4,3), 2,96 (3-H_{a}; m, W_{1/2}\approx20 Hz); unidad C 2,96 (3-H_{2}; ma, W_{1/2}\approx 20 Hz), 1,31 (2-CH_{3}; s), 1,25 (2-CH_{3}'; s); unidad D 4,90 (2-H; dd, 9,6/4,0), 1,66 (4-H; ma, W_{1/2}\approx 25 Hz), 1,59 (3-H_{b}; ddd. -14,4/9,6/4,8), 1,53 (3-H_{a}, ddd. -14,4/9,1/4,0), 0,8 1 (4 -Me; d, 6,5), 0,74 (5-H_{3}; d, 6,5). RMN ^{13}C (CD_{3}OD) \delta unidad A 167,7 (1), 140,7 (3), 138,4 (9), 133,0 (8); 131,7 (7), 129,6 (11/13), 128,5 (12), 127.3 (10/14), 127,1 (2), 78,4 (5), 43,1 (6), 35,7 (4), 17,4 (6-Me); unidad B 179,8 (1), 155,2 (7), 132,3 (4), 132,1 (5), 130,1 (9), 123,0 (6), 113,4 (8), 56,6 (7- OMe), 56,6 (2), 37,8 (3); unidad C 176,8 (1),48,2 (3), 42,2 (2), 23,3 (2-Me), 23,3 (2-Me'); unidad D 172,0 (1), 73,4 (2), 40,7 (3), 26,0 (4), 23,1 (4-Me), 21,8. (5).

Criptoficina 51

A una solución agitada de aminoácido T (75 mg, 0,11 mmol) en DMF anhidro (20 ml) a temperatura ambiente en atmósfera de argón se añadió diisopropiletilamina (DIEA, 44 mg, 60 \mul, 0,34 mmol \approx 3 equiv.), seguido por pentafluorodifenilfosfinato (FDPP, 55 mg, 0,14 mmol, \approx 1,3 equiv.) en DMF (2 ml). La mezcla se agitó durante 12 horas, se añadió Et_{2}O (40 ml) y la capa de éter se lavó sucesivamente con HCl (1M, 40 ml), salmuera (40 ml) y H_{2}O (49 ml), se secó (MgSO_{4}) y se evaporó a presión reducida. El sólido cerúleo residual se purificó después mediante cromatografía de fase inversa (DOS, 10 \mu, 30% de H_{2}O/MeCN, 3 ml min-^{1}) para dar criptoficina 51 en forma de un sólido amorfo incoloro (45 mg, 61%), [\alpha]_{D} +26,4º (c 0,25, CHCl_{3}): EIEM m/z 652/654 (M^{+}3/1), 632/634 (3/2), 426/428 (51/15), 224 (64), 195/197 (64/22), 155/157 (71/15), 131(59), 91 (100); HREIEM m/z 652,2936 (C_{38}H_{45}N_{2}O_{7}^{35}C, \Delta-2,1 mmu); UV (MeOH) \lambda_{max}(\varepsilon) 204 (5200), 228(20400), 250 (13400), 284 (2800) nm; IR (NaCI) \nu_{max}3376, 3270, 2960, 1747, 1721, 1659, 1536, 1514, 1259, 1150, 1066, 1013, 980, 694 cm^{-1}; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta unidad A 7,32 (10-/14-H; dd, 8,0/1,5), 7,29 (11-H/13-H; t, 8,0), 7,24 (12-H; ma, W_{1/2}\approx 15 Hz), 6,77 (3-H; ddd, 15,2/10,8/4,3), 6,40 (8-H; d, 15,8), 6,01 (7-H; dd, 15,8/8,8), 5,76 (2-H; dd, 15,2/1,1), 5,04 (5-H; ddd, 11,1/6,4/1,9), 2,54 (4-H_{b}/6-H; ma, W_{1/2}\approx 15 Hz), 2,37 (4-H_{a}; ddd, -14,3/11,1/10,8), 1,13 (6-Me; d, 6,8); unidad B 7,20 (5-H; d, 2,0). 7,05 (9-H; dd, 8,4/2,0), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,61 (NH; d, 7,8), 4,74 (2-H; ddd, 7,8/7,6/5,4), 3,87(OMe;s), 3,11 (3-H_{b}; dd, -14,2/5,4),3,06 (3-H_{a}; dd,-14,2/7,6); unidad C 7,24 (NH; ma, W_{1/2}\approx 15 Hz), 3,40 (3-H_{b}; dd, -13,5/8,5), 3,12 (3H_{a}; dd, -13,5/3,6), 1,22 (2-Me; s), 1,15 (2-Me', s); unidad D 4,85 (2-H; dd, 10,2/3,6), 1,66 (3H_{b}; ddd, -14,0/10,2/4,6), 1,61 (4-H; ma W_{1/2}\approx 20,0 Hz), 1,33 (3-H_{a}; ddd, -14,0/9,0/3,6), 0,74 (4-Me; d, 6,6), 0,72 (5-H_{3}; d, 6,6). 'RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta unidad A 165,1 (1), 142,2 (3), 136,7 (9), 131,7 (8), 130,1 (7), 128,6 (11/13), 127,5 (12), 126,1 (10/14), 124,6 (2), 77,0 (5), 42,2 (6), 36,5 (4), 17,3 (6-Me); unidad B 170,3 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,3 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (7-OMe), 54,2 (2), 35,3 (3); unidad C 178,0 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,8 (2-Me), 22,6 (2-Me'); unidad D 170,6 (I), 71,5 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (4-Me), 21,2 (5).

Ejemplo 3 Síntesis de critpoficina 52 y criptoficina 53

A una solución agitada de criptoficina 51 (75 mg, 0,12 mmol) en diclorometano anhidro (7,5 ml) a 0ºC en atmósfera de argón se añadió una solución de ácido m-cloroperbenzoico (mCPBA, 50 mg, 0,23 mmol, \approx 2 equiv., con base de 80% de oxígeno activo) en diclorometano (1 ml). Después de 30 minutos la mezcla de reacción se dejó calentar hasta la temperatura ambiente y se agitó durante otras 12 horas. Después, el disolvente se eliminó a presión reducida para dar una mezcla de 1,8:1 de critoficinas 52 y 53 (mediante análisis RMN), respectivamente, en forma de un sólido amorfo. La mezcla de epóxidos regioisoméricos se disolvió en acetonitrilo mínimo y se sometió a cromatografía en fase inversa (YMC-ODS, 10 \mu, 250 mm x 22,5 mm, 30% de H_{2}O/MeCN, 6 ml min-1) para separar la criptofinica 52 (37 mg, 48%) de la critpoficina 53 (19 mg, 25%).

Datos del espectro de critoficina 52

[\alpha]_{D} +19,9º (c 0,5, CHCl_{3}): EIEM m/z 668/670 (4/2, M^{+}), 445 (35), 244 (12), 227 (22), 195/197 (66/27), 184 (45), 155/157 (38/10), 91 (100); HREIEM m/z 668,2873 (C_{36}H_{45}N_{2}O_{8}^{35}C, \Delta-0,91 mmu), 445,2497 (C_{25}H_{35} NO_{6}, \Delta-3,3 mmu) UV (MeOH) \lambda_{max}(\varepsilon) 204 (35100), 218(20900) nm; IR (NaCI) \nu_{max}3415, 3270, 2960, 1748, 1721, 1650, 1536, 1504, 1260, 1192, 1150, 1066, 1013, 800, 698 cm^{-1}; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta unidad A 7,33-7,38 (10-H/12-H/13-H; ma, W_{1/2}\approx 25 Hz), 7,24 (10-H/14-H; m, W_{1/2}\approx 15 Hz), 6.76 (3-H; ddd, 15,1/10,8/4,3), 5,71 (2-H; dd, 15,1/1,7), 5,20 (5-H; ddd, 11,0/5,0/1,8), 3,68 (8-H; d, 1,9). 2,92 (7-H; dd, 7,5/1,9), 2,57 (4-H_{b}; ddd, -14,6/1,8/1,7), 2,45 (4-H_{a};ddd, -14,6/11,0/10,8), 1,78 (6-H; ma, W_{1/2}\approx15 Hz), 1,14 (6-Me; d, 6,9); unidad B 7,18 (5-H; d, 2,2), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,2), 6,83 (8-H; d, 8,4), 5,56 (NH; d, 7,9), 4,73 (2-H; ddd, 7,9/7,4/5,3), 3,87 (OMe; s), 3,09 (3-H_{b}; dd, -14,6/5,3), 3,05 (3H_{a}; dd, -14,6/7,4); unidad C 7,20 (NH; dd, 8,6/3,2), 3,41 (3-Hb; dd, -13,4/8,6), 3,10 (3 Ha; dd, -13,4/3,2), 1,22 (2-Me; s), 1,15 (2-Me'; s); unidad D 4,82 (2-H; dd, 10,2/3,5), 1,73 (3-H_{b}; ma, W_{1/2}\approx20 Hz), 1,66 (4-H; ma, W_{1/2}\approx20 Hz), 1,31 (3-H_{a}; ddd, -13,8/9,1/3,5), 0,84 (4-Me; d, 6,6), 0,82 (5-H_{3}; d, 6,6); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta unidad A 164,9 (1), 141,8 (3), 136,7 (9), 128,7 (11/13), 128,3 (12), 125,6 (10/14), 124,7 (2), 75,9 (5), 63,0 (7), 59,0 (8), 40,7 (6), 36,9 (4), 13,5 (6-Me), unidad B 170,3 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,5 (9), 122,6 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3), unidad C 178,0 (1), 46,5 (3), 42.8 (2), 22,8 (2-Me), 22.8 (2 -Me'), unidad D 170,5 (I), 71,2 (2), 39,3 (3), 24,6 (4), 22,7 (4-Me), 21,2 (5).

Datos del espectro de critoficina 53

[\alpha]_{D} +20,8º (c 1,7, CHCl_{3}): EIEM m/z 668/670 (5/4, M^{+}), 445 (32), 244 (15), 227 (24), 195/197 (64/21), 184 (60), 155/157 (33/9), 91 (100); HREIEM m/z 668,2853 (C_{36}H_{45}N_{2}O_{8}^{35}C, \Delta-1,1 mmu); UV (MeOH) \lambda_{max}(\varepsilon) 204 (38700), 218 (20900) nm; IR (NaCI) \nu_{max}3415, 3280, 2917, 2849, 1748, 1722, 1660, 1504, 1465, 1260, 1190, 1150, 1066, 755 cm^{-1}; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta unidad A 7,29-7,36 (11-H/12-H/13-H, ma, W_{1/2}\approx 20 Hz), 7,23 (10-H/14-H; dd, 8,3/1,7), 6,77 (3-H; ddd, 15,1/10,9/4,3), 5,81 (2-H; dd, 15,1/1,3), 5,17 (5-H; ddd, 11,2/4,9/1,8), 3,58 (8-H; d, 1,7), 2,90 (7-H; dd, 7,8/1,7), 2,67 (4-H_{b}; ddd, 14,7/11,2/10,9), 2,56 (4-H_{a}; dddd, 14,7/4,3/1,8/1,3), 1,67-1,78 (6-H; ma, W_{1/2}\approx-45), 1,03 (6-CH_{3}; d, 7,1); unidad B 7,21 (5-H; d, 2,1), 7,07 (9-H; dd, 8,5/2,1), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,90 (2-NH; d, 7,9), 4,75 (2-H; ddd, 7,9/7,9/4,9), 3,85 (7-OCH_{3}; s), 3,14(3-H_{b}; dd, 14,5/4,9), 3,03 (3-H_{a}; dd, 14,/7,9); unidad C 7,29-7,36 (3-NH; ma, W_{1/2}\approx 25), 3,43 (3-H_{b}; dd, 13,7/8,8), 3,10 (3-H_{a};dd, 13,7/3,4), 1,23(2-CH_{3}; s), 1,17 (2CH_{3}'; s); unidad D 4,92 (2-H: dd, 10,3/3,2), 1,67-1,78 (3 Hb,/4-H; rna, W_{1/2}\approx 45), 1,48 (3-H_{a}: ddd, 13,9/8,8/3,2), 0,89 (4-CH_{3}; d, 6,6), 0,86 (5-H_{3}; d, 6,6). RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta unidad A 165,1 (1), 142,0 (3), 137,0 (9), 128,5 (11/13), 128,5 (12), 125,3 (10/14), 124,6 (2), 76,7 (5), 63,2 (7), 56,2 (8), 40,8 (6), 36,7 (4), 13,4 (6-Me); unidad B 170,4 (1), 154,0 (7), 130,8 (5), 129.7 (4), 128.2 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (7-OMe), 54,4 (2), 35,3 (3); unidad C 177,9 (1), 46,4 (3), 42,7 (2), 23,0 (2-Me), 22,7 (2-Me'); unidad D 170,5 (1), 71,3 (2), 39,2 (3), 24,7 (4), 22,8 (4-Me), 21,3 (5).

Ejemplo 4 Síntesis de criptoficina 55

A una solución de cirptoficina 52 (6 mg, 0,009 mmol) en 0,6 ml de 2:1 1,2-dimetoxietano/agua se añadieron 2 \mul de HCl 2N. La solución se dejó agitar a temperatura ambiente durante 20 horas, se neutralizó con carbonato potásico, se filtró a través de un filtro de 5 \mu y se evaporó. El material soluble en acetonitrilo se purificó mediante HPLC de fase inversa en C18 (columna de 250 x 10 mm) usando MeOH/H_{2}O 4:1 para obtener 3,0 mg de criptoficina 55 (48%). [\alpha]_{D} +42,5º (c 1,1, CHCl_{3}): EIEM m/z 704/706/708 (M^{+} < 1), 668/670 (1,5/0,5, M^{+}-HCl), 445 (6), 226 (8), 195/197 (16/5), 184 (10), 155/157 (33/11), 135 (100), 91 (99), 77 (30); HREIEM m/z 668,2873 (M^{+}-HCl, C_{36}H_{45}N_{2}O_{8}^{35}C, \Delta-0,8 mmu); UV (MeOH) \lambda_{max}(\varepsilon) 204 (48400), 218 (29200), 284 (1600) nm; IR (NaCI) \nu_{max}3410, 3286, 2959, 1748, 1723, 1666, 1538, 1504, 1455, 1275, 1178, 1066, 753 cm^{-1}; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta unidad A 7,35-7,42 (10-H/11-H/12-H/13-H/14-H; m), 6,78 (3-H; ddd, 15,1/10,6/4,5), 5,78 (2-H; dd, 15,1/1,7), 5,16 (5-H; ddd, 11,1/8,3/2,1), 4,65 (8-H; d, 9,7), 4,01 (7-H; da, 9,7), 2,69 (4-H_{b}; ddd, -14,5/4,5/2,1/1,7), 2,50 (6-H; ma, W_{1/2}\approx15), 2,38 (4-Ha; ddd, -14,5/11,1/10,6), 1,53 (7-OH, s), 1.04 (6-M2, d, 7,1); unidad B 7,21 (5-H; d, 2,2), 7,07 (9-H; dd, 8,5/2,2), 6,85 (8-H; d, 8,5), 5,57 (2-NH; d, 7,8), 4,74 (2-H; ddd, 7,8/7,6/5,2), 3,88 (7-OCH_{3}; s), 3,13 (3-H_{b}; dd, 14,5/5,), 3,05 (3-H_{a}; dd, 14,5/7,6); unidad C 7,21 (3-NH, m), 3,38 (3-H_{b}, dd, 13,5/8,3), 3,17 (3-H_{a}; dd, 13,5/4,1), 1,23 (2-CH_{3}, s), 1,17 (2-CH_{3}; s); unidad D 4,93 (2-H; dd, 10,1/3,5), 1,78 (3-H_{b}; ddd 13,5/10,1/5,0), 1,72 (4-H; ma, W_{1/2}\approx20), 1,43 (3-H_{a}: ddd, 13,5/8,8/3,5), 0,92 (4-CH_{3}; d, 6,6), 0,92 (5-H_{3}, d, 6,4). RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta unidad A 165,1 (C-1), 142,4 (C-3), 138, 4 (C-9), 129,0 (C-11/13), 128,3 (C-12), 128,0 (C-10/14), 124,6 (C-2), 76,1 (C-5), 74,1 (C-7), 62,0 (C-8), 38,4 (C-6), 36,5 (C-4), 8,6 (6-Me); unidad B 170,3 (C-1), 154,1 (C-7), 130,9 (C-5), 129,6 (C-4), 129.2 (C-9), 122,6 (C-6), 112,3 (C-8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (C-2), 35,3 (C-3); unidad C 177,8 (C-1), 46,5 (C-3), 42,8 (C-2), 22,9 (2-Me), 23,0 (C-2-Me'); unidad D 170,3 (C-1), 71,3 (C-2), 39,7 (C-3), 24,8 (C-4), 22,7 (4-Me) 21,6 (C-5).

También se obtuvo el correspondiente diol, criptoficina 56 (2,8 mg, rendimiento del 44%).

Ejemplo 5 Síntesis de criptoficina 57

Una pequeña cantidad de PtO2 (\approx 1 mg) se añadió a un matraz con 0,5 ml de CH2Cl2. Se evacuó el aire del matraz, se introdujo H_{2} y la mezcla se agitó a temperatura ambiente duranate 20 minutos. Se añadió una solución con 10,2 mg de criptoficina 52 (0,015 mmol) en CH2Cl2 (0,3 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante otros 30 minutos. El catalizador se eliminó mediante filtración a través de celite/algodón y el disolvente se eliminó al vacío. La HPLC de fase inversa del residuo (DOS, 10 \mu, 250 x 22,5 mm, MeCN/H_{2}O (3:1), 5 ml min-1) dio criptoficina 57 pura (9,1 mg, 89%). %). [\alpha]_{D} +3,4 (c=4,5, CHCl_{3}): EIEM m/z 670/672 (M^{+} 9/3), 447 (10), 246 (63), 229 (20), 195/197 (78/25), 184 (58), 155/157 (39/13), 128 (21), 91 (100), 77 (23); HREIEM m/z 670.3037 (C_{36}H_{47}N_{2}O_{8}^{35}C, \Delta-1,6 mmu); UV (MeOH) \lambda_{max}(\varepsilon) 204 (31400), 218 (12000), 284 (1200) nm; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta unidad A 7,30-7,37 (11/12/13-H, ma), 7,23 (10/14-H; dda, 7,9, 1,9), 5,03 (5-H, ddd, 9,0, 5,6, 3,4), 3,66 (8-H; d, 2,1), 2,89 (7-H; dd, 7,7, 2,1), 2,27 (2-H_{b}; ddd, 14,3. 8,7, 6,2), 2,04 (2-H_{a}, ddd, 14,3, 8,8, 6,8), 1,64-1,75 (6-H/4-H_{2}, ma), 1,61 (3-H_{2}, ma, W_{1/2}\approx 25), 1,11 (6-CH_{3}, d, 7,1), unidad B 7,19 (5-H; d, 2,1), 7,04 (9-H; dd, 8,3, 2,1), 6,83 (8-H; d, 8,3), 5,55 (2-NH; d, 8,3), 4,65 (2-H; ddd, 8.3, 7,3, 5,3), 3,87 (7-OCH_{3}; s), 3,16 (3-H_{b}; dd, 14,3, 7,3), 3,08 (3-H_{a}; dd, 14,3, 5,3); unidad C 6,91 (3-NH, dd, 6,4, 6,4), 3,41 (3-H_{b}, dd, 13,5/6,4), 3,30 (3-H_{a}; dd, 13,5, 6,4), 1,21 (2-CH_{3}, s), 1,13 (2-CH_{3}';s); unidad D 4,80 (2-H; dd, 9,8, 4,1), 1,64-1,75 (3-H_{b}/4-H, ma), 1,34 (3H_{a}, ddd, 15,4, 10,1, 4,1), 0,86 (4-H_{3}, d, 6,5), 0,84 (5-H_{3}, d, 6,5); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta unidad A 172,6 (1), 136,9 (9), 128,7 (11/13), 128,5 (12), 125,6 (10/14), 76,8 (5), 63,4 (7), 59,2 (8), 40,2 (6), 36,2 (2), 32,2 (4), 21,4 (3), 13,6 (6-Me); unidad B 170,4 (1), 154,0 (7), 131,1 (5), 130,0 (4), 128,5 (9), 122,5 (6), 112,2 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3); unidad C 177,6 (1), 47,0 (3), 43,1 (2), 22,5 (2-Me'), 22,4 (2-Me); unidad D 171,7 (1), 72,0 (2), 39,0 (3), 24,6 (4), 22,8 (4-Me) 21,8 (5).

Ejemplo 6 Síntesis de criptoficina 58

A una solución agitada de criptoficina 57 (5,5 mg, 0,008 mmol) en 3 ml de cloroformo sin etanol a \approx -60ºC se añadió TMSCI (usado como se obtiene de Aldrich, \approx 4,5 mg, \approx 5,2 \mul, \approx 0,04 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 20 minutos, tiempo tras el cual la tlc indicó que no quedaba material de partida. A continuación se eliminaron los componentes volátiles a presión reducida para dar un sólido amorfo. Este material se suspendió en acetonitrilo y se sometió a HPLC (DOS, 10 \mu, 250 x 22,5 mm, MeCN/H_{2}O (3:1), 5 ml min-1) para devolver criptoficina 58 pura (5,4 mg, 93%) como producto principal. [\alpha]_{D} +7,2 (c=2,1, CHCl_{3}): EIEM m/z 706/708/710 (M^{+} 27/23/8), 670/672 (M+ -HCl, 14/13), 583 (54), 581 (53), 485 (23), 483 (21), 447 (34), 294 (21), 282 (39), 246 (57), 195/197 (87/27), 184 (73), 155/157 (45/10), 128 (30), 91(95), 77(30), 69 (100); HREIEM m/z 706.2844 (C_{36}H_{48}N_{2}O_{8}^{35}Cl_{2} \Delta-5,6 mmu), m/z 670.3070 (M+ -HCl, C_{36}H_{47}N_{2}O_{8}^{35}Cl \Delta-4,9 mmu); UV (MeOH) \lambda_{max}(\varepsilon) 204 (331900), 218 (11800), 284 (1800) nm; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta unidad A 7,34-7,42 (10/11/12/13/14-H, ma), 5,01 (5-H, ddd, 9,6, 8,3, 2,5), 4,65 (8-H; d, 9,6), 4,00 (7-H; dd, 9,6, 1,9), 2,42 (6-H. ddc, 8,3, 1,9, 7,0), 2,29 (2-H_{b}; ddd, 14,3, 9,4, 4,5), 2,06 (2-H_{a}, ddd, 14,3, 8,3, 7,5), 1,62-1,82 (3-H_{2}/4-H_{2}, ma), 0,99 (6-CH_{3}, d, 7,0), unidad B 7,20 (5-H; d, 2,1), 7,06 (9-H; dd, 8,3, 2,1), 6,84 (8-H; d, 8,3), 5,62 (2-NH; d, 8,3), 4,61 (2-H; ddd, 8.3, 7,7, 5,4), 3,87 (7-OCH_{3}; s), 3,17 (3-H_{b}; dd, 14,3, 7,7), 3,11 (3-H_{a}; dd, 14,3, 5,4); unidad C 6,97 (3-NH, dd, 6,4, 6,2), 3,43 (3-H_{b}, dd, 13,4/6,2), 3,31 (3-H_{a}; dd, 13,4, 6,4), 1,23 (2-CH_{3}, s), 1,16 (2-CH_{3}'; s); unidad D 4,93 (2-H; dd, 10,0, 4,0), 1,86 (3H_{b}, ddd, 14,0, 10,0, 5,5), 1,58 (3-H_{a}, ddd, 14,0, 8,3, 4,0), 0,97 (4-CH_{3}, d, 6,8), 0,94 (5-H_{3}, d, 6,6); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta unidad A 172,8 (1), 138,7 (9), 129,0 (12), 128,9 (11/13), 128,0 (10/14), 76,5 (5), 73,8 (7), 62,1 (8), 38,1 (6), 35,9 (2), 31,8 (4), 21,4 (3), 8,7 (6-Me); unidad B 170,6 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 130,2 (4), 128,5 (9), 122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (7-OMe), 54,4 (2), 35,0 (3); unidad C 177,2 (1), 47,0 (3), 43,2 (2), 22,5 (2-Me'), 22,4 (2-Me); unidad D 171,8 (1), 72,0 (2), 39,4 (3), 24,9 (4), 22,9 (4-Me) 21,7 (5).

Ejemplo 7 Síntesis de criptoficina 61

A una solución agitada de criptoficina 53 (5 mg, 0,007 mmol) en 0,5 ml de benceno seco se añadió sulfuro de trifenilfosfina (4 mg, 0,014 mmol), seguido por 0,65 \mul de ácido trifluoroacético como solución en benceno seco (100 \mul). La solución se dejó agitar a temperatura ambiente durante 6 horas, se neutralizó con bicarbonato sódico, se filtró y se evaporó. El residuo se repartió entre agua y CH_{2}Cl_{2}. El material soluble en CH2Cl2 se purificó mediante HPLC de fase inversa en C18 usando MeCN/H_{2}O 4:1 para obtener criptoficina 61 pura (1,9 mg, 37%). [\alpha]_{D} +28,4 (c=0,7, CHCl_{3}): EIEM m/z 684/686 (M^{+}, no observado), 652/654 (M^{+}-S, 5/4), 426/428 (90/29), 294 (10), 227 (100), 195/197 (57/20), 184 (20), 155/157 (34/9), 131 (45), 129 (44), 91 (76), 77 (27); HREIEM m/z 652,297 (M^{+}-S, C_{36}H_{45}N_{2}O_{7}^{35}Cl \Delta-5,8 mmu); UV (MeOH) \lambda_{max}(\varepsilon) 204 (26700), 218 (11600), 284 (820) nm; IR (NaCI) \nu_{max}3410, 3271, 2958, 1749, 1724, 1670, 1503, 1463, 1258, 1176, 1066, 758 cm^{-1}; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta unidad A 7,29-7,34 (11/12/13-H, m), 7,25 (10/14-H, da, 6,6), 6,73 (3-H; ddd, 15,2/10,6/4,5), 5,66 (2-H; dd, 15,2/1,7), 5,22 (5-H. ddd, 11,2/4,2/2,0), 3,68 (8-H; d, 5,1), 3,01 (7-H; dd, 8,4/5,1) 2,52 (4-H_{b}, dddd, 14,4/4,5/2,0/1,7), 2,41 (3-H_{a}, ddd, -14,4/11,2/10,6), 1,68-1,74 (6-H, m), 1,14 (6-Me, d, 6,9), unidad B 7,18 (5-H; d, 2,2), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,2), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,45 (NH; d, 7,8), 4,75 (2-H; ddd, 7,8/7,3/5,4), 3,87 (O-Me, s), 3,09 (3-H_{b}; dd, -14,5, 5,4), 3,05 (3-H_{a}; dd, -14,5/ 7,3); unidad C 7,17 (NH, dd, 8,3, 3,9), 3,39 (3-H_{b}, dd, -13,5/8,3), 3,14 (3-H_{a}; dd, -13,5, 3,9), 1,23 (2-Me, s), 1,16 (2-Me'; s); unidad D 4,86 (2-H; dd, 10,2/3,4), 1,77 (3-H_{b}, ddd, -14,0/10,2/4,9), 1,68-1,74 (4-H, m), 1,42 (3-H_{a}, ddd, -14,0/8,7/3,4), 0,92 (4-Me, d, 6,6), 0,88 (5-H_{3}, d, 6,4); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta unidad A 164,9 (1), 141,7 (3), 138,3 (9), 128,8 (11/13), 128,0 (12), 126,7 (10/14), 124,7 (2), 76,6 (5), 45,8 (7), 43,9 (8), 43,9 (6), 36,6 (4), 16,0 (6-Me); unidad B 170,2 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,4 (4), 128,3 (9), 122,8 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,2 (2), 35,3 (3); unidad C 177,9 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,9 (2-Me'), 22,8 (2-Me'); unidad D 170,4 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,7 (4), 22,7 (4-Me) 21,4 (5).

Ejemplo 8 Síntesis de criptoficina 97

A una solución del depsipéptido cíclico, criptoficina 53 (9 mg, 0,013 mmol), disuelta en dimetilsulfóxido (1 ml), se añadió azida sódica (40 mg) y ácido sulfúrico concentrado (4 \mul). Después, la mezcla se dejó agitar a 75-85ºC durante 2 días. Tras este tiempo, la mezcla de reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente, se diluyó con Et2O (15 ml) y la capa orgánica se lavó con salmuera (2 x 20 ml) y H_{2}O (20 ml). Después, el extracto etéreo se secó (MgSO_{4}) y el disolvente se eliminó al vacío para devolver un sólido amorfo incoloro, que era principalmente azido-alcohol, criptoficina 86. La purificación se consiguió mediante cromatografía de fase inversa (DOS 10 \mu, 250 x 10 mm, 25% H_{2}O / MeCN (3:1), 3 ml min^{-1}) para devolver el azido-alcohol puro, criptoficina 86, como un sólido amorfo incoloro (7,4 mg, 77%).

Datos del espectro de criptoficina 86

[\alpha]_{D} -22,0 (c=3,0, CHCl_{3}): EM (EI) m/z 482/484 (ion más alto observado, M^{+} -229, 8/3), 625/627 (14/5), 259 (7), 195/197 (100/34), 184 (14), 155/157 (82/70), 91 (23), 77 (22); HREIEM obsd. m/z 482,1791 C_{23}H_{31}N_{2}O_{7}^{35}Cl (\Delta 2,9 mmu); EM (FAB) m/z (matriz de bala mágica) 712/714 (M^{+} + H, 79/36), 686/688 (31/12), 232 (74), 184 (100); RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta unidad A 7,37-7,42 (10/11/12/13/14-H, ma, W_{1/2}\approx20), 6,77 (3-H; ddd, 15,2, 10,6, 4,4), 5,77 (2-H; dd, 15,2, 1,3), 5,45 (5-H. ddd, 11,0, 4,2, 2,0), 4,55 (8-H; d, 5,7), 3,75 (7-H; dd, 7,3, 5,7) 2,55 (4-H_{b}, dddd, 14,5, 4,4, 2,0, 1,3), 2,43 (4-H_{a}, ddd, 14,5, 11,0, 10,6), 2,34 (7-OH, s), 1,80 (6-H, ddc, 7,3, 4,2, 7,0), 0,99 (6-Me, d, 7,0), unidad B 7,20 (5-H; d, 2,2), 7,06 (9-H; dd, 8,4, 2,2), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,76 (NH; d, 7,7), 4,74 (2-H; ddd, 7,7, 7,5, 5,5), 3,87 (O-CH_{3}, s), 3,10 (3-H_{b}; dd, -14,5, 5,5), 3,06 (3-H_{a}; dd, 14,5, 7,5); unidad C 7,22 (NH, dd, 8,4, 3,7), 3,40 (3-H_{b}, dd, 13,6, 8,4), 3,14 (3-H_{a}; dd, 13,6, 3,7), 1,23 (2-CH_{3}, s), 1,16 (2- CH_{3}'; s); unidad D 4,85 (2-H; dd, 9,5, 5.1), 1,71 (3-H_{b}, ddd, 13,6, 9,5, 5,9), 1,59 (4-H, ma, W_{1/2}\approx25), 1,50 (3-H_{a}, ddd, 13,6, 7,9, 5,1), 0,89 (4- CH_{3}, d, 6,6), 0,85 (5-H_{3}, d, 6,6); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta unidad A 165,3 (1), 143,0 (3), 135,1 (9), 129,1 (12), 128,9 (11/13), 128,6 (10/14), 124.3 (2), 75,1 (7), 74,6 (5), 67,8 (8), 39,3 (6), 34,7 (4), 11,9 (6-Me); unidad B 170,5 (1), 154,1 (7),130,9 (5), 129,7 (4), 128,3 (9), 122,5 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3); unidad C 177,8 (1), 46,5 (3), 42,8 (2), 22,9 (2-Me), 22,7 (2-Me'); unidad D 170,2 (1), 71,4 (2), 39,4 (3), 24,7 (4), 22,6 (4-Me) 21,8 (5).

Criptoficina 97

A una solución del depsipéptido cíclico, criptoficina 86 (5,5 mg, 0,008 mmol), disuelta en Et_{2}O/CH_{2}Cl_{2} (3:1, 0,5 ml) se añadió una solución etérea (0,5 ml) de trifenilfosfina (3 mg, 0,011 mmol). Después, la mezcla se dejó agitar a temperatura ambiente durante tres días. Tras este tiempo, el disolvente se eliminó al vacío y el residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} y se sometió a purificación por HPLC (columna CN, 10 \mu, 250 x 10 mm, 80% EtOAc/CH_{2}Cl_{2}, 3 ml min^{-1}) para devolver criptoficina 97 pura en forma de un sólido amorfo incoloro (4,2 mg, 82%).

UV (MeOH) \lambda_{max}(\varepsilon) 202 (24400), 218 (9400), 284 (2200) nm; EM (EI) m/z 667/669 (M^{+}, 11/3), 639/641 (41/16), 442 (21), 226 (17), 195 (43), 196 (32), 197 (100), 198 (71), 199 (11), 182/184 (25/16), 155/157 (63/22), 146 (30), 91 (40), 77 (29); HREIEM obsrvd. m/z 667,3061, C_{36}H_{46}N_{3}O_{7}^{35}Cl (\Delta-3,6 mmu); RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta unidad A 7,35 (11-H/13-H, m, W_{1/2}\approx15 Hz), 7,28 (12-H, m), 7,16 (10-H/14-H; m, W_{1/2}\approx15 Hz), 6,74 (3-H; ddd, 15,2/9,0/6,1), 5,69 (2-H. d, 15,2), 5,21 (5-H; ddd, 9,2/4,3/4,2), 2,79 (8-H; sa) 2,51 (4-H_{2}, m), 2,11 (7-H, da, 6,5), 1,48 (6-H, m), 1,13 (6-Me, d, 6,9), unidad B 7,18 (5-H; d, 2,1), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,1), 6,83 (8-H; d, 8,4), 5,53 (NH; m), 4,73 (2-H; ddd, 7,6, 5,6, 5,4), 3,87 (O-Me, s), 3,09 (3-H_{b}; dd, 14,7, 5,4), 3,04 (3-H_{a}; dd, 14,7, 7,6); unidad C 7,20 (NH, m), 3,40 (3-H_{b}, dd, 13,5, 8,6), 3,11 (3-H_{a}; dd, 13,5, 3,3), 1,22 (2-Me, s), 1,15 (2-Me'; s); unidad D 4,84 (2-H; dd, 10,1, 3,7), 1,71 (3-H_{b}, m), 1,67 (4-H, ma, W_{1/2}\approx25), 1,35 (3-H_{a}, m), 0,86 (4-Me, d, 6,7), 0,84 (5-H_{3}, d, 6,5); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta unidad A 165,0 (1), 142,1 (3), 139,2 (9), 128,8 (11/13), 127,5 (12), 125,4 (10/14), 124,6 (2), 76,6 (5), 42,5 (6), 42,1 (7), 40,5 (8), 36,6 (4), 14,8 (6-Me); unidad B 170,2 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,2 (9), 122,6 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3); unidad C 177,9 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,8 (2-Me'), 22,8 (2-Me'); unidad D 170,4 (1), 71,3 (2), 39,5 (3), 24,6 (4), 22,7 (4-Me), 21,3 (5).

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Ejemplo comparativo 9

Síntesis de criptoficinas 121-123 y 127

Compuesto AJ

A una solución de BOC-L-monohidrato de leucina (1,245 g, 5 mmol) en 30 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro se añadió EDC sólido (clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida) (0,53 g, 2,75 mmol) en N_{2} con agitación a 0ºC. Tras la agitación a 0ºC durante 1,5 horas, la mezcla se concentró por debajo de 5ºC y el residuo se diluyó con 35 ml de EtOAc frío y se lavó sucesivamente con dos porciones (10 ml) cada una de soluciones heladas de KHSO_{4} ac. al 5%, NaHCO_{3} y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO_{4}) a 5ºC y se evaporó por debajo de 5ºC. El aceite residual se diluyó con THF anhidro helado (5 ml) a una solución de compuesto K (295 mg, 0,5 mmol) en THF anhidro helado (5 ml). A continuación, a la mezcla se añadieron algunos cristales de DMAP y se agitó y dejó alcanzar 25ºC durante la noche, se añadió una solución de NaHCO_{3} ac. al 5% (5 ml) y la mezcla bifásica resultante se agitó enérgicamente a 25ºC durante 2 horas. Se añadió EtOAc (40 ml), la fase acuosa se extrajo con EtOAc adicional (2 x 20 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron (NaSO_{4}), se filtraron y se evaporaron. El residuo se filtró a través de un tapón de gel de sílice con EtOAc al 25% en hexanos para dar el compuesto AJ en forma de un aceite incoloro (385 mg, rendimiento del 96%): [\alpha]_{D} 13,6º (c=0,63 CHCl_{3}): EIEM m/z (intens. relat.) 805/803/801 (M^{+}, 1%), 568/570/572/574 (9/10/6/2), 523/525/527 (5/6/1), 418/420/422/424 (15/15/6/2), 341/343/345/347 (58/70/35/9), 307/309/311 (29/22/10), 224/227/228/229 (10/100/31/14), 208/210/211/212 (20/83/45/54); HREIEM m/z 800,2218 (C35H48^{35}ClN_{2}O_{8} \Delta-5,3 mmu); RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta unidad A 7,21-7,35 (Ph-H_{5}; m), 6,77 (3-H, ddd, 6,7/6,7/15,3), 6,4 (8-H; d, 15,8), 6,05 (7-H; dd, 8,7/15,8), 5,9 (2-H; d, 15,3), 5,0 (5-H; m) 2,6 (6-H, m), 2,55 (4-H_{2}, m), 1,17 (6-Me, d, 6,7), unidad B 7,22 (5-H; s), 7,05 (9-H; d, 8,1), 6,84 (8-H; d, 8,1), 6,55 (NH; d, 7,8), 5,0 (2-H; ddd, 5,5/7,1/7,8), 4,68-4,8 (CH_{2}CCl_{3}; ABc, 11,9), 3,86 (O-Me, s), 3,2 (3-H; dd, 5,5/14,0), 3,06 (3-H'; dd, 7,1/14,0); unidad C \delta 4,8 (NH, d), 4,2 (2-H; m), 1,65 (4-H; m), 1,55 (3-H, m), 1,4 (CMe_{3}; s), 1,37 (3-H'; m), 0,85 (4-Me,d, 6,5), 0,8 (5-H,d, 6,5; RMN ^{13}C unidad A \delta 165,4 (1), 139,3 (3), 137,0 (9), 131,5 (8), 130,5 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (12), 126,2 (10/12), 125,8 (2), 76,2 (5), 40,8 (6), 33,4 (4), 16,8 (6-Me); unidad B \delta 170,0 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 129,0 (9), 122,5 (6), 112,2 (8), 94,4 (CCl_{3}), 74,7 (CH_{2}CCl_{3}), 56,1 (OMe), 53,3 (2), 36,5 (3); unidad D \delta 173,2 (1), 155,7 (BOC-CO), 80,0 (CMe_{3}), 52,4 (2), 41,2 (3), 28,3 (C-Me_{3}); 24,8 (4), 22,8 (4-Me) 21,6 (5).

Compuesto AK

El compuesto AJ (115 mg, 0,134 mmol) se disolvió en TFA (3 ml) y se dejó a 25ºC durante 1 hora. El disolvente se eliminó y el residuo se evaporó de forma repetida e CH_{2}Cl_{2}, después de tolueno, para dar un sólido amorfo. Este sólido se disolvió en THF anhidro (5 ml) y se añadió suficiente dietilisopropilamina para ajustar el pH de la solución a un pH 8-9 cuando se colocó una alícuota de la solución en papel húmedo de pH. La solución se enfrió hasta 0ºC con agitación y se añadió una solución de compuesto AL en THF (3 ml). Para preparar el compuesto AL, el compuesto Z (55 mg, 0,27 mmol) se disolvió en THF (3 ml) y se añadió dietilisopropilamina (0,046 ml, 0,27 mmol). A esta mezcla, tras enfriar hasta 15ºC, se añadió gota a gota pivaloilcloruro (0,033 ml, 0,27 mmol) y la solución se agitó a -15ºC durante 10 minutos y a 0ºC durante 20 minutos. Después, la suspensión resultante se transfirió a la solución de compuesto AJ en THF. La mezcla resultante se agitó a 0ºC y se dejó que alcanzara 25ºC durante la noche. Tras 12 horas a 25ºC, se añadió una solución de NaHCO_{3} ac. al 5% y la mezcla resultante se agitó enérgicamente a 25ºC durante 1,5 horas. Se añadió EtOAc (40 ml) y se separaron las fases. La fase acuosa se extrajo con EtOAc adicional (2 x 10 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con NaHCO_{3} ac. al 5% (20 ml), solución de KHSO_{4} ac. al 5% (20 ml) y salmuera, se secaron (NaSO_{4}) y se evaporaron. El aceite residual se sometió a cromatografía en gel de sílice, eluyendo con EtOAc al 35% en hexanos para dar el compuesto AK en forma de una espuma incolora (98 mg, rendimiento del 83%): [\alpha]_{D} -8,3 (c 0,88 CHCl_{3}): RMN ^{1}H (CDCl_{3}) unidad A \delta 7,28-7,35 (Ph-H_{4}; m), 7,22 (H; 12m) 6,75 (H3, ddd, 6,4/6,4/15,4), 6,04 (H-7; dd, 8,6/15,9), 5,95 (H-2, d, 15,4), 5,0 (H-5; m), 2,6 (H-4; m), 1,1 (6-Me; d, 6,8); unidad B \delta 7,22 (H-5; d, 1,5), 7,15 (NH; d, 7,6), 7,05 (H-9; dd, 1,5/8,2), 6,85 (H-8; d, 8,2), 5,0 (H-2, m), 4,8-4,68 (CH_{2}CCl_{3}; ABc, 12), 3,86 (OMe; s), 3,2 (H-3; m), 3,1 (H-3'; dd, 7,2/14,1); unidad C \delta 5,0 (NH, m), 43,2 (H-2-3; m), 2,55 (H-2; m), 1,1 (2-Me; d, 7,1); unidad D \delta 6,12 (NH, m), 4,4 (H-2; m), 1,65 (H-4; m), 1,55 (H-3; m), 1,4 (H-3'; m), 0,86 (4-Me; d, 6,8), 0,81 (5-H; d, 6,8); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) unidad A \delta 165,8 (1), 138,9 (3), 131,5 (8), 130,4 (7), 128,6 11/13), 127,4 (12), 126,2 (10/14), 125,8 (2), 76,3 (5), 33,6 (4), 16,6 (6-Me); unidad B \delta 170,02(1), 154,1 (7), 136,9 (4), 131,2 (5), 128,6 (9), 122,3 (6), 112,2 (8), 94,4 (CCl_{3}), 74,5 (CH_{2}CCl_{3}), 56,1 (OMe), 53,4 (2), 36,6 (3); unidad C \delta 175,4 (1), 156,3 (BOC-CO), 79,5 (OCMe_{3}), 43,6 (3), 41,3 (2), 15,1 (2-Me); unidad D \delta 172,6 (1), 51,3 (2), 40,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (4-Me) 21,5 (5).

Criptoficina 121

El compuesto AK (73 mg, 0,082 mmol) se disolvió en AcOH (3,5 ml), se añadió polvo de Zn activado (400 mg) y la suspensión resultante se sometió a ultrasonidos durante 45 minutos. Después de agitar a 25ºC durante otras 1,5 horas, la mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (5 ml) y se filtró a través de Celite®. Los sólidos se lavaron con CH_{2}Cl_{2} adicional (10 ml) y el filtrado resultante se evaporó. El residuo, sin más purificación, se disolvió en TFA (3 ml), se guardó a 25ºC durante 1 hora y el disolvente se eliminó al vacío. El residuo se evaporó repetidamente de CH_{2}Cl_{2}, después de tolueno hasta que se obtuvo un sólido incoloro. Este sólido se disolvió en DMF seca (3 ml), se añadió FDPP (43 mg, 0,108 mmol), seguido por una cantidad suficiente de dietilisopropilamina para ajustar el pH de la solución a pH 8-9 cuando se una alícuota salpicó sobre papale húmedo de pH. Después de agitar a 25ºC durante 16 horas, la mezcla se diluyó con éter (40 ml) y se lavó con una solución de KHSO_{4} ac. al 5% (2 x 1 ml), NaHCO_{3} ac. al 5% (15 ml) y salmuera. Después de secar (Na_{2}SO_{4}) y evaporar el residuo se purificó mediante HPLC de fase inversa en sílice C-18 (Econosil® C-18, 22 x 250 mm) eluyendo con CH_{3}CN/agua 65:35 a 6 ml/min. Se recogió y se evaporó la fracción de elución a t_{R} 48 minutos para dar un sólido amorfo (26 mg, rendimiento del 50%): [\alpha]_{D} +46,5º (c 0,81 CHCl_{3})): EIEM m/z 637/639 (M^{+}, 1%), 449/451 (2/1), 420 (5), 411/413 (7/5), 227/228 (9/7), 195 (10), 184 (15), 167/168/169 (40/86/29), 155/157 (100/26), 91 (85), 69 (86); HREIEM m/z 637,2864 (C_{35}H_{44}^{35}ClN_{3}O_{6}, \Delta-5,5 mmu); RMN ^{1}H unidad A \delta 7,21-7,35 (Ph-H_{5}; m), 6,75 (H-3; ddd, 4,2/10,8/16) 6,4 (H-8, d, 16), 6,04 (H-7; dd, 8,8/16), 5,75 (H-2, d, 16), 5,1 (H-5; m), 2,55 (H-4; m; H-6; m), 2,35 (H-4';m); unidad B \delta 7,18 (H-5; d, 2), 7,05 (H-9; dd, 2,0/8,3), 5,7 (NH; d, 7,2), 4,7 (H-2; ddd, 4,9/7,2/7,7), 3,86 (OMe; s), 3,1 (H-3; dd, 4,9/14,4), 3,0 (H-3'; dd, 7,7/14,4); unidad C \delta 7,25 (NH, m), 3,5 (H-3; m), 3,4 (H-3'; m), 2,55 (H-2; m), 1,2 (2-Me; d, 7,2); unidad D \delta 5,8 (NH, d, 7,2), 4,4 (H-2; m), 1,55 (H-4; m), 1,38 (H_{2}-3; dd, 7,2/7,7), 0,76 (4-Me; d, 6,6), 0,74 (H-5; d, 6,6); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) unidad A \delta 165,1 (1), 141,9 (3), 136,8 (9), 131,7 (8), 130,2 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (14), 126,1 (10/12), 125,1 (2), 76,5 (5), 42,3 (6), 36,3 (4), 17,2 (6-Me); unidad B \delta 171,0 (1), 154,1 (7), 130,8 (5), 129,6 (4), 128,4 (9), 122,5 (6), 112,4 (8), 56,2 (OMe), 54,4 (2), 35,4 (3); unidad C \delta 175,8 (1), 41,0 (3), 38,6 (2), 14,8 (2-Me); unidad D \delta 173,2 (1), 51,1 (2), 40,9 (3), 24,7 (4), 23,4 (4-Me) 21,5 (5).

Ejemplo 10 Relaciones entre la estructura y la actividad (REA) y evaluación in vivo

Las citotoxicidades de las criptoficinas 1, 3 y 8 y las nuevas criptoficinas contra las líneas celulares tumorales humanas KB y LoVo se muestran en la tabla 4. La criptoficina 51 y la criptoficina 3 muestran citotoxicidades comparables (CI_{50} 3,5-5,8 nM). Sin embargo, la criptoficina 52 (CI_{50} 43-70 pM) es ligeramente menos citotóxica que la criptoficina 1 (CI_{50} 9-29 pM). Las citotoxicidades CI_{50} para las criptoficinas 117, 122, 125, 127, 128 y 132 son comparables con las de las criptoficinas 1, 8, 52 y 55; sin embargo, en la actualidad los datos no admiten comparaciones más significativas.

La criptoficina 52 es activa in vivo, pero requiere aproximadamente tres veces la dosis total en comparación con la criptoficina 1. La actividad in vivo de la criptoficina 52 frente a cinco tumores sólidos de origen murino y tres tumores sólidos humanos se resume en la tabla 7.

De igual forma, la criptoficina 55 era activa in vivo, aunque también requirió tres veces la dosis total en comparación con la criptoficina 8. La actividad in vivo de la criptoficna 55 contra seis tumores sólidos de origen murino y cuatro tumores sólidos humanos se resume en la tabla 8. Los datos in vivo parecen correlacionar con los datos obtenidos in vitro.

Las criptoficinas 117, 125, 128 y 132 son activas in vivo contra un adenocarcinoma pancreático de origen murino (Panc 03). Parece que las criptoficinas 117 y 128 son más potentes, es decir, requieren dosis totales más pequeñas, que las criptoficinas 1 y 8, respectivamente, mientras que las criptoficinas 125 y 132 son menos potentes, es decir, requieren dosis totales mayores, que las criptoficinas 1 y 8, respectivamente. Los datos se resumen en la tabla 7.

Los valores T/C que son inferiores al 42% se consideran activos según los estándar NCI; los valores T/C inferiores al 10% se considera que poseen una actividad excelente y potencial actividad clínica según los estándar NCI. El log de la muerte aproximado se define como T-C/3,2 Td, donde T es el tiempo medio en días para que los tumores del grupo tratado alcancen 750 mg, C es el tiempo medio en días para que tumores del grupo control alcancen 750 mg, y Td es el tiempo hasta que se dobla el volumen del tumor (T. H. Corbett y col., Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development, pág. 35-87; Kluwer: Norwell, 1992). Los valores log de muerte aproximados > 2,8, 2,0-2,8, 1,3-1,9, 0,7-1,2 y <0,7 con una duración del tratamiento farmacológico de 5-20 días se puntúan ++++, +++, ++, + y - (inactivo), respectivamente. Es necesaria una puntuación de la actividad de +++ a ++++, que es indicativa de actividad clínica para efectuar una regresión parcial o completa de masa de tamaño 100-300 mg de tumores sólidos más transplantados de ratones. La criptomicina 52 muestra valores T/C variables de 0 a 14% para los tumores murinos y de 4,1 a 16 para los tumores humanos y valores log de muerte variables de 1,1 a 2 para los tumores murinos y de 0 a 3,2 para los tumores humanos. La criptoficina 1 muestra valores T/C variables de 0 a 27% y valores log de muerte variables de <1 a 2. La criptoficina 55 muestra valores T/C variables principalmente de 0 a 4,4% y valores log de muerte variables de 2,1 a > 4,6 (curaciones) en todos excepto en un ensayo, el experimento Colon 26 que mostró un valor de log de muerte aproximado de 1,2. La criptoficina 8 muestra valores T/C variables principalmente de 0% y valores log de muerte > 2,8 (varias curaciones) como se muestra en la tabla 10. Parece que las criptoficinas 117 y 125 tiene unos valores T/C y de log de muerte aproximados que son comparables con los de otras criptoficinas de tipo epóxido, las criptoficinas 1 y 52, mientras que las criptoficinas 128 y 132 tienen valores T/C y de log de muerte aproximados que son comparables con los de otras criptoficinas de tipo cloroficina, criptoficinas 8 y 55.

TABLA 1 Actividad in vivo de la criptoficina 1

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TABLA 2 Actividad in vivo de análogos de criptoficina

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TABLA 3 Citotoxicidades de agentes antimitóticos para células SKOV3 Y SKVLB1

Las células se trataron con concentraciones variables de los compuestos que se indican a continuación durante 48 horas. Después se determinó el número de células como se indica en la sección de Procedimientos y se calculó la CI_{50} para cada compuesto. Los valores representan la media \pm EME para tres experimentos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4 Datos de la toxicidad in vitro de las criptoficinas

26

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Resumen de la actividad in vivo de la criptoficina 52

27

Resumen de la actividad in vivo de la criptoficina 55

28

Evaluación de los análogos de criptoficina contra el Panc 03 en su etapa inicial en ratones macho BDF_{1}

29

Tumores implantados el día 0; Los tratamientos con el fármaco comenzaron el día 3.

El día 14 todos los ratones parecen estar en buen estado y ganando peso. No debería haber más muertes por el fármaco.

Actividad in vitro de la criptoficina 8

30

31

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Claims

1. Una criptoficina representada por la estructura:

32

en la que

Ar es metilo o fenilo o uno grupo aromático que tiene 4n + 2 pi electrones en un sistema conjugado monocíclico o bicíclico o un grupo fenilo sustituido con un simple grupo o un grupo heteroaromático;

R_{2} es OH o SH; o

R_{4} y R_{5} son H; o

X e Y son cada uno de forma independiente O, NH o alquilamino.

2. La criptoficina de la reivindicación 1, en la que R_{8} es etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo o isopentilo.

3. La criptoficina de la reivindicación 1, en la que R_{7} es etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo o isopentilo.

4. La criptoficina de la reivindicación 1, en la que R_{3} es etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo o isopentilo.

5. La criptoficina de la reivindicación 1, en la que R_{9} es metilo, etilo, propilo, butilo, isobutilo, pentilo o isopentilo.

6. La criptoficina de la reivindicación 1, en la que R_{10} es metilo, etilo, propilo, butilo, isobutilo, pentilo o isopentilo.

7. El compuesto de la reivindicación 1, en el que al menos uno de los grupos unidos a C_{3}, C_{6}, C_{10}, C_{16}, C_{17} y C_{18} posee una estereoquímica R.

8. El compuesto de la reivindicación 1, en el que al menos uno de los grupos unidos a C_{3}, C_{6}, C_{10}, C_{16}, C_{17} y C_{18} posee una estereoquímica S.

9. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{18} y C_{19}, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14}, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno.

10. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un anillo R,R-epóxido, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14}, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno.

11. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un anillo S,S-epóxido, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14}, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno.

12. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Ar es fenilo, R_{1} es S-cloro, R_{2} es R-hidroxilo, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14}, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno.

13. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un anillo R,R-epóxido, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} son hidrógeno, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno.

14. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Ar es fenilo, R_{1} es S-cloro, R_{2} es R-hidroxilo, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} son hidrógeno, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno.

15. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un anillo R,R-episulfuro, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14}, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno.

16. Un compuesto que tiene la estructura de Fórmula I, en la que Ar es fenilo, R_{1} y R_{2} se toman juntos para formar un anillo R,R-aziridina, R_{3}, R_{7} y R_{8} son metilo, R_{4} y R_{5} se toman juntos para formar un doble enlace entre C_{13} y C_{14}, R_{6} es 3-cloro-4-metoxibencilo, R_{9} es isobutilo, R_{10} es hidrógeno y X e Y son oxígeno.

17. Un procedimiento para producir un compuesto de criptoficina según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, que comprende las siguientes etapas:

seleccionar un E alqueno alílicamente sustituido;

reorganizar el E alqueno alílico a través de una reorganización estereoespecífica de Wittig;

convertir este compuesto en un primer \delta-aminoácido o \delta-hidroxiácido;

acoplar el primer ácido a un segundo \alpha-aminoácido para formar una primera subunidad;

acoplar un tercer \beta-aminoácido a un cuarto \alpha-hidroxiácido o \alpha-aminoácido para formar una segunda subunidad; y

acoplar la primera subunidad a la segunda subunidad para formar una criptoficina.

18. Una composición farmacéutica útil para inhibir la proliferación de una célula de mamífero hiperproloiferativa, que comprende una cantidad eficaz de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, que además comprende al menos un agente antineoplásico adicional.

20. Uso de un compuesto de criptoficina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación de una célula de mamífero.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que el medicamento además comprende al menos un agente antineoplásico adicional.

22. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación de una célula de mamífero hiperproloiferativa que posee un fenotipo de resistencia a múltiples fármacos.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que el medicamento además comprende al menos un agente antineoplásico adicional.

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, que además comprende al menos un agente terapéutico adicional dirigido a la inhibición de dicha proliferación.