ES2228118T3 - Procedimiento para controlar la accion de un farmaco inhibidor de proteasoma. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para controlar la acción del fármaco farmacodinámico de un inhibidor de proteasoma en un mamífero, caracterizado porque comprende la medición de la actividad de la proteasoma en una muestra o muestras biológicas de prueba que han sido obtenidas de un mamífero una o más veces especificadas después de administrar el inhibidor de la proteasoma; la determinación de la cantidad de actividad de la proteasoma en la muestra o muestras biológicas de prueba; y la comparación de la cantidad de actividad de la proteasoma en la muestra biológica con la de una muestra biológica de referencia obtenida de un mamífero al cual no se le ha administrado el inhibidor de la proteasoma.

Description

Procedimiento para controlar la acción de un fármaco inhibidor de proteasoma.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para medir la actividad de proteasoma en muestras biológicas. Más particularmente, la invención se refiere a procedimientos para controlar la acción del fármaco después de la administración in vivo de un inhibidor de proteasoma.

Breve descripción de la técnica relacionada

La proteasoma 26S es la proteasa multicatalítica responsable de la mayoría de los cambios de la proteína intracelular en las células eucarióticas, que incluyen la degradación proteolítica de las proteínas dañadas, oxidadas o mal plegadas, así como también de procesos o degradación de las proteínas reguladoras claves requeridas para diversas funciones celulares (Ciechanover, Cell 79:13-21 (1994); Coux et al., Ann. Rev. Biochem. 65:801-847 (1995); Goldberg et al., Chemistry & Biology 2:503-508 (1995)). Los substratos de proteínas son marcados en primer lugar para la degradación mediante la conjugación covalente con moléculas múltiples de una proteína pequeña, ubiquitina. Se reconoce entonces la proteína poliubiquitinada resultante, y se degrada por la proteasoma 26S.

Constituyendo el centro catalítico de la proteasoma 26S está la proteasoma 20S, un complejo de multi-subunidades de aproximadamente 700 kDa de peso molecular. Coux et al., (Ann. Rev. Biochem. 65:801-847 (1995)) muestra que la proteasoma 20S no degrada por sí misma a las proteínas ubiquitinadas, pero posee actividades de la peptidasa múltiples. Basados en las preferencias del substrato, Coux et al., caracterizan estas actividades como similares a la quimiotripsina, similares a la tripsina, hidrolasa post-glutamino, aminoácido de cadena ramificada preferente, y aminoácido neutro por lo menos preferente. Coux et al., muestran también que una activación dramática de la actividad de la proteasoma 20S puede inducirse en varios tratamientos in vitro, tales como el calentamiento a 55ºC, la incubación con los polipéptidos básicos, sulfato dodecilo de sodio (SDS), HCl de guanidina o ácidos grasos, diálisis contra agua, o por reguladores fisiológicos tales como PA28 ó PA700. McCormarck et al., (Biochemistry 37:7792-7800 (1998)) muestran que una variedad de substratos péptidos, incluyendo Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, Z-Leu-Leu-Arg-AMC, y Z-Leu-Leu-Glu-2NA, en que Suc es N-succinilo, AMC es 7-amino-4-metilcoumarino, y 2NA es 2-naftilamina, son escindidos por la proteasoma 20S.

La trayectoria de la proteasoma-ubiquitina, juega un papel central en un gran número de procesos fisiológicos. Deshaies (Trends in Cell Biol. 5:428-434 (1995)) y Hoyt (Cell 91:149-151 (1997)) muestran que la proteólisis regulada de las proteínas del ciclo celular, incluyendo ciclinas, inhibidores de la cinasa dependiente de la ciclina, y proteínas supresoras de tumores, se requieren para la progresión del ciclo celular controlado y dicha proteólisis de estas proteínas tiene lugar a través de la trayectoria de la proteasoma-ubiquitina. Palombella et al., WO 95/25533 muestra que la activación del factor de transcripción NF-\kappaB, el cual juega asimismo un papel central en la regulación de los genes involucrados en las respuestas inmunes e inflamatorias, es dependiente de la degradación mediada por la proteasoma de una proteína inhibidora, I\kappaB-\alpha. Goldberg y Rock, WO 94/17816 describen que el cambio continuo de las proteínas celulares mediante la trayectoria de la proteasoma-ubiquitina juega un papel esencial en la presentación del
antígeno.

Mientras juegan un papel fisiológico esencial, la trayectoria de la proteasoma-ubiquitina también media la degradación de la proteína inapropiada o acelerada, que tiene lugar como un resultado o causa de las condiciones patológicas tales como el cáncer, enfermedades inflamatorias, o enfermedades autoinmunes, en las que estos procesos celulares normales han llegado a desregularse. Además, Goldberg (patente US nº 5.340.736 (1994)) muestran que la caquexia o desgaste muscular asociado con las condiciones tales como cáncer, enfermedades infecciosas crónicas, fiebres, inactividad muscular (atrofia), daño del nervio, deficiencia renal, y deficiencia hepática resultan de un incremento en la degradación proteolítica por la trayectoria de la proteasoma-ubiquitina. Gonzales et al., (J. Exp. Med. 184:1909 (1996)) muestra que la reorganización citoesquelética que tiene lugar durante la maduración de los parásitos protozoatios depende de la proteasoma.

La inhibición de la actividad de la proteasoma ofrece así un nuevo procedimiento prometedor para la invención terapéutica en estas y otras condiciones directamente o indirectamente mediadas por la función proteolítica de la proteasoma. Goldberg et al., (Chemistry & Biology 2:503-508 (1995)) muestran que los inhibidores de proteasoma bloquean la respuesta inflamatoria in vivo en modelos de animales de tejidos humanos.

En la patente US nº 5.340.736, se describe un procedimiento para inhibir la proteolisis acelerada o mejorada un procedimiento para identificar los inhibidores del proceso, dolencias múltiples y el inhibidor de la proteasoma. El documento WO 96/13266 describe unos procedimientos para utilizar aminoácidos o éter borónico peptídico y compuestos ácidos como inhibidores de la función de la proteasoma. El documento WO 95/24914 se refiere a un procedimiento para reducir la proporción de degradación de la proteína intracelular utilizando ciertos inhibidores de proteasoma. El documento WO 99/66065 se refiere a la modulación y/o regulación de la actividad de la proteasoma, y el documento WO 99/22729 se refiere a unas composiciones que comprende inhibidores de la proteasoma. En el documento WO 99/43346, se describe un procedimiento para detectar enfermedades autoinmunes en un mamífero, que comprende la extracción de una muestra biológica de un mamífero y la detección de la actividad de la proteasoma.

Los presentes inventores están desarrollando inhibidores de la proteasoma para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes y de cáncer. Han descubierto que, cuando se administra un inhibidor de proteasoma a un mamífero, es esencial que el régimen de dosis sea seleccionado cuidadosamente para evitar la inhibición de la proteasoma en exceso. Típicamente, los regímenes de dosis para nuevos fármacos candidatos se determina mediante la medición de la concentración del fármaco en una muestra biológica y la colocación de la cantidad de dosis y frecuencia de dosis para alcanzar así el nivel del fármaco deseado (véase por ejemplo, Ritschel, Handbook of Basic Pharmacokinetics, cuarta edición, Drug Intelligence Publications, Inc., Hamilton, IL, 1992). Los presentes inventores han descubierto que estos procedimientos estándares son inadecuados para los inhibidores de la proteasoma. Existe así, una necesidad en la técnica de procedimientos sensitivos para controlar la accióón del fármaco inhibidor de l proteasoma.

Breve descripción de la invención

La invención proporciona procedimientos sensitivos para controlar la acción del fármaco inhibidor de la proteasoma. Los presentes inventores han descubierto de manera sorprendente que el ensayo ex vivo de la actividad de la proteasoma, preferentemente la concentración del fármaco, en las muestras biológicas, proporciona un procedimiento útil para controlar la acción del fármaco farmacodinámico de los inhibidores de la proteasoma y que este dato proporciona una guía para la selección de una cantidad de dosis futura y una frecuencia de dosis del inhibidor de proteasoma a ser administrado en el futuro.

En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para controlar la acción del fármaco farmacodinámico de un inhibidor de la proteasoma que comprende la medición de la actividad de la proteasoma en una muestra o muestras biológicas de prueba que han sido obtenidas a partir de un mamífero a una o más veces especificadas después de la administración del inhibidor de proteasoma; la determinación de la cantidad de actividad de proteasoma en la muestra o muestras biológicas de prueba; y la comparación de la cantidad de actividad de proteasoma en la muestra biológica de prueba con aquélla en una muestra biológica de referencia obtenida a partir de un mamífero al cual no se ha administrado un inhibidor de la proteasoma.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la determinación de la actividad de proteasoma de línea base, que comprende la medición de la actividad de la proteasoma en una muestra o muestras biológicas obtenidas a partir de un mamífero, en el que dichas muestras son seleccionadas de entre el grupo que consiste en muestras de sangre, de orina, de órganos y de tejidos; la determinación de la cantidad de actividad de proteasoma en la muestra o muestras biológicas y la selección de una cantidad de dosis y frecuencia de dosis de un inhibidor de proteasoma que se ha de administrar a un mamífero que sufre una enfermedad o presenta una condición patológica. En un modo de realización preferido, el mamífero sufre de una enfermedad o condición patológica. En otro modo de realización preferido, al mamífero se le ha administrado un fármaco. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además la determinación de una cantidad de dosis y frecuencia de dosis de un inhibidor de la proteasoma a ser administrado al mamífero.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una representación gráfica de la actividad de la proteasoma 20S en las células blancas de la sangre a partir de 7 voluntarios humanos.

La figura 2 es una representación gráfica de la actividad de la proteasoma 20S diariamente en las células blancas de la sangre a partir de 7 voluntarios humanos.

La figura 3 es una representación gráfica de la actividad de la proteasoma 20S en células blancas de la sangre murina 1,0 horas después de una administración intravenosa de ácido borónico de N-(pirazin)carbonil-L-fenilalanina-L-leucina (1).

La figura 4 es una representación gráfica de la actividad de la proteasoma 20S en células blancas de la sangre murina 24 horas después de una administración intravenosa de 1.

La figura 5 es una representación gráfica de la actividad de la proteasoma 20S en células blancas de la sangre en ratas 1,0 horas después de una administración intravenosa de 1.

La figura 6 es una representación gráfica de la actividad de la proteasoma 20S en células blancas de la sangre en ratas 24 horas después de una administración intravenosa de 1.

La figura 7 es una representación gráfica de la actividad de la proteasoma 20S en células blancas de la sangre en ratas 48 horas después de una administración intravenosa de 1.

La figura 8 es una representación gráfica de la actividad de la proteasoma 20S en células blancas de la sangre en ratas 1,0 horas después de las inyecciones intravenosas dos veces por semana de 1 a dos semanas.

La figura 9 es una representación gráfica de la actividad de la proteasoma 20S en células blancas de la sangre en primates 1,0 horas después de una administración intravenosa de 1.

La figura 10 es una representación gráfica de la actividad de la proteasoma 20S en células blancas de la sangre en primates 72 horas después de una administración intravenosa de 1.

La figura 11 es una representación gráfica de las actividades quimiotrípticas (\Box) y trípticas (\diamondsuit) como una función de la concentración de 1, demostrando que 1 inhibe completamente la actividad quimiotríptica, pero causa una activación de la actividad tríptica.

La figura 12 es un trazo gráfico que compara el porcentaje de inhibición de la proteasoma y la proporción de las actividades quimiotrípticas a trípticas con proteasoma 20S purificada a partir de reticulocitos de conejo.

La figura 13 es un trazo gráfico que compara el porcentaje de la inhibición de la proteasoma y la velocidad de las actividades quimiotrípticas con lisados de células blancas de la sangre en ratas.

Descripción detallada de los modos de realización preferidos

La presente invención se refiere a procedimientos para medir la actividad de la proteasoma en las muestras biológicas. Más particularmente, la invención se refiere a procedimientos para controlar la acción del fármaco después de la administración in vivo de un inhibidor de la proteasoma. Las solicitudes de patente, patentes y referencias de literatura citada aquí, indican el conocimiento en este campo. En el caso de inconsistencias, prevalecerá la presente descripción.

Los presentes inventores han descubierto de manera sorprendente que el ensayo ex vivo de la actividad de la proteasoma, preferentemente la concentración del fármaco en las muestras biológicas, proporciona un procedimiento útil para controlar la acción del fármaco farmacodinámico de los inhibidores de la proteasoma y que este dato proporciona una guía para seleccionar una cantidad de dosis futura y una frecuencia de dosis del inhibidor de la proteasoma a ser administrado en el futuro.

La invención proporciona procedimientos sensitivos para controlar la acción del fármaco inhibidor de la proteasoma. Los inhibidores de la proteasoma son nuevos agentes terapéuticos prometedores para el tratamiento de las condiciones mediadas directamente por la función proteolítica del proteasoma, tal como desgaste muscular, o mediada indirectamente mediante las proteínas, las cuales son procesadas o degradadas por la proteasoma, tales como el factor de transcripción NF-\kappaB y las proteínas reguladoras del ciclo celular. Los presentes inventores han demostrado la eficacia in vivo de los inhibidores de proteasoma en un número de modelos de tumores de animales y modelos de inflamación. Sin embargo, los presentes inventores han encontrado también que la inhibición de proteasoma en exceso muestra efectos tóxicos, incluyendo la mortalidad. Sin querer estar limitados a la teoría, los presentes inventores creen que estos efectos tóxicos están predominantemente basados en mecanismos y células madre a partir de la naturaleza pleotrópica de la función de la proteasoma.

La administración segura de los inhibidores de proteasoma requieren así el control cerrado de los niveles de fármacos y la selección cuidadosa del régimen de dosis para prevenir así una sobredosis. Típicamente en la técnica, los nivveles de fármacos se controla mediante la medición de la cantidad del fármaco principal y/o sus metabolitos en el plasma (véase por ejemplo, Ritschel, Handbook of Basic Pharmacokinetics, cuarta edición, Drug Intelligence Publications, Inc., Hamilton, IL, 1992). La medición de los niveles de fármacos como una función del tiempo proporciona el perfil farmacocinético del fármaco, de entre los cuales los parámetros tales como concentración máxima (C_{max}), vida media (t_{1/2}), área bajo la curva (AUC), y volumen de distribución (V_{d}). Sin embargo, los presentes inventores han descubierto que estos procedimientos estándares no son adecuados para ser utilizados con los inhibidores de la proteasoma. Unos minutos después de la administración intravenosa de una dosis terapéutica de un inhibidor de proteasoma en un animal, el fármaco es virtualmente indetectable en el compartimento del plasma. Sin limitarse a la teoría, los presentes inventores creen que el inhibidor de la proteasoma es rápidamente secuestrado por las proteasomas intracelulares en la vasculatura y en los tejidos. La medición del fármaco de circulación en el plasma, sobrestima excesivamente la cantidad de fármaco bioactivo presente. Los procedimientos alternativos que más exactamente reflejan el perfil farmacodinámico real de los inhibidores de la proteasoma son por tanto necesarios de manera urgente.

Para una mejor comprensión de la presente invención, se usarán las siguientes definiciones:

"Inhibidor de proteasoma" significará cualquier substancia que directamente o indirectamente inhibe la proteasoma 20S ó 26S o la actividad de la misma. Preferentemente, tal inhibición es específica, es decir, el inhibidor de la proteasoma inhibe la actividad de la proteasoma a una concentración que es menor que la concentración del inhibidor requerido para producir otro efecto biológico no relacionado. Preferentemente, la concentración del inhibidor de la proteasoma requerido para la inhibición de la proteasoma es por lo menos, 2 veces más bajo, más preferentemente por lo menos 5 veces más bajo, aún más preferentemente por lo menos 10 veces más bajo, y más preferentemente por lo menos 20 veces más bajo que la concentración requerida para producir un efecto biológico no relacionado. Los ejemplos no limitativos de los inhibidores de la proteasoma para su utilización en la presente invención incluyen péptidos aldehídos (véase por ejemplo Stein et al., WO 95/24914 publicada el 21 de septiembre de 1995; Siman et al., WO 91/13904 publicada el 19 de septiembre de 1991; Iqbat et al., J., Med. Chem. 38:2276-2277 (1995)), sulfonas de vinilo (véase por ejemplo Bogyo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6629 (1997)), \alpha'\beta'-epoxicetonas (véase por ejemplo Spaltenstein et al., Tetrahedron Lett. 37:1343 (1996)); ácidos borónicos de péptidos (véase por ejemplo Adams et al., WO 96/13266 publicado el 9 de mayo de 1996; Siman et al., WO 91/13904 publicado el 19 de septiembre de 1991), y lactacistina y análogos de lactacistina (véase por ejemplo Fenteany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3358 (1994); Fenteany et al., WO 96/32105 publicada el 19 de Octubre de 1996).

"Muestra biológica" significará cualquier muestra de fluido corporal, órgano o tejido obtenida de un animal. El animal puede estar muerto o vivo mientras se obtiene la muestra. El animal es preferentemente un mamífero, en cuyo término están incluidos los humanos.

"Muestra biológica de prueba" significará una muestra biológica que se obtiene a partir de un animal al cual se le ha administrado un inhibidor de la proteasoma.

"Muestra biológica de referencia" significará una muestra biológica que se obtiene a partir de un animal al cual se le ha administrado un inhibidor de la proteasoma, incluyendo una muestra de referencia histórica o estadística, la cual se ha preparado o preservado en la forma escrita, legible o electrónica. "Forma legible" incluye cualquier forma que se puede entender tiene un significado particular para una máquina o experto.

"Muestra estándar" significará una muestra que comprende una cantidad constante o conocida de actividad de proteasoma 20S ó 26S. La muestra puede comprender proteasomas purificadas o parcialmente purificadas, o puede comprender una muestra biológica que contiene proteasomas.

"La actividad de la proteasoma" significará cualquier actividad proteolítica o peptidasa asociada con la proteasoma 26S ó 20S.

"Péptido" significará una molécula comprendida por una disposición lineal de residuos de aminoácidos conectados a cada uno de los otros en la disposición lineal mediante enlaces peptídicos. Tales péptidos de acuerdo con la invención, pueden incluir aproximadamente desde tres hasta aproximadamente 500 aminoácidos, y puede además, incluir estructuras secundarias, terciarias o cuaternarias, así como también pueden existir asociaciones intermoliculares aunque sin limitación, en enlaces covalentes (por ejemplo, a través de los enlaces disulfuro), o a través de la quelación, interacciones electrostáticas, interacciones hidrofóbicas, enlaces hidrógeno, interacciones ión-dipolo, interacciones dipolo-dipolo, o cualquier combinación de las anteriores.

En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para controlar la acción del fármaco farmacodinámico de un inhibidor de proteasoma, que comprende la medición de la actividad de la proteasoma en una muestra o muestras biológicas de prueba a partir de un mamífero en una o más veces especificadas después de la administración del inhibidor de proteasoma; la determinación de la cantidad de actividad de proteasoma en la muestra o muestras biológicas; y la comparación de la cantidad de actividad de proteasoma en la muestra biológica de prueba con la de una muestra biológica de referencia obtenida a partir de un mamífero al cual no se ha administrado el inhibidor de proteasoma.

Las muestras biológicas que se obtienen a partir del mamífero pueden incluir, sin limitación, muestras de la sangre, orina, órgano y tejidos. Preferentemente, la muestra biológica según este aspecto de la invención es una muestra de sangre, más preferentemente un lisado de células de la sangre. La lisis celular se puede abarcar mediante procedimientos estándares. En algunos modos de realización preferidos, la muestra biológica es un lisado celular de la sangre total. Kahn et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 214:957-962 (1995)) y Tsubuki et al. (FEBS Lett., 344:229-233 (1994)) describen que las células rojas de la sangre contienen inhibidores proteináceos endógenos de la proteasoma. Así, la contaminación de las muestras biológicas con aún cantidades pequeñas de células rojas de la sangre, podría interferir con el ensayo. Sin embargo, los presentes inventores han encontrado que los inhibidores de la proteasoma endógenos se activan en presencia de SDS a una concentración de aproximadamente 0,05%, permitiendo que los lisados de las células rojas de la sangre y los lisados de las células rojas de la sangre total, sean ensayados con seguridad. A esta concentración de SDS, toda la actividad de la proteasoma es debida a la proteasoma 20S. Aunque la proteasoma 20S purificada muestra estabilidad escasa a 0,05% de SDS, la actividad de la proteasoma 20S en los lisados celulares es estable bajo estas condiciones. La capacidad para realizar el ensayo en los lisados de las células rojas de la sangre total, ofrece ventajas significativas en términos de economía y facilidad de la preparación de la muestra.

En otros modos de realización preferidos, la muestra biológica es un lisado de células blancas de la sangre total. Se conocen en la técnica los procedimientos para fraccionar las células de la sangre (Rickwood et al., Anal. Biochem. 123:23-31 (1982); Fotino et al., Ann. Clin. Lab. Sci. 1:131 (1971)) y se describen además en los ejemplos. Los productos comerciales usados para la separación celular incluyen sin limitación, Ficoll-Paque® (Phamacia Biotech) y NycoPrep^{TM} (Nycomed). En algunas situaciones, los lisados de las células blancas de la sangre, proporcionan mejor reproductibilidad de datos que los lisados de las células de la sangre total, y por lo tanto, pueden ser preferidos en tales situaciones.

La variabilidad en la preparación de la muestra se puede corregir mediante la introducción de un paso de normalización en la elaboración de los datos. En algunos modos de realización preferidos, la actividad de la proteasoma en la muestra se puede normalizar con relación al contenido de proteína en la muestra (procedimiento de actividad específica). El contenido de proteína total en la muestra se puede determinar usando procedimientos estándares, incluyendo sin limitación, el ensayo de Bradford, y el procedimiento de Lowry. En otros modos de realización preferidos, la actividad de la proteasoma en la muestra puede normalizarse con relación al recuento celular. Esta modalidad puede ser preferida en conjunto, tales como conjuntos clínicos, en los cuales los contadores celulares automatizados son fácilmente accesibles.

Los inhibidores de la proteasoma presentan a menudo inhibición preferencial de la actividad de la peptidasa de la proteasoma sobre otras actividades de la peptidasa proteasoma. Los presentes inventores han reconocido que la inhibición diferencial proporciona un alcance alternativo para la normalización de procedimientos basados en el contenido de proteína o recuento celular. Así, en algunos modos de realización particularmente preferidos, la inhibición de la proteasoma se determina como una proporción de una actividad de la peptidasa de la proteasoma a otra. La derivación de la ecuación teórica para la determinación de la inhibición de la proteasoma según este modo de realización de la invención se proporciona en los ejemplos. Para que este modo de realización sea operativo, el inhibidor de la proteasoma en estudio debe inhibir la actividad de la peptidasa preferentemente sobre por lo menos otra actividad de la peptidasa. La selección de las actividades de la peptidasa a ser ensayada, y por tanto los substratos peptídicos apropiados a ser usados, dependerán del inhibidor en estudio. Por ejemplo, para el inhibidor de ácido borónico de N-(pirazin)carbonil-L-fenilalanina-L-leucina (1), la inhibición de la proteasoma se determina de manera preferentemente como una proporción de la actividad quimiotríptica a la actividad tríptica. La actividad quimiotríptica no se puede inhibir completamente para 1, mientras la actividad tríptica se activa para 1 sobre el mismo rango de concentración.

El mamífero a partir del cual se obtiene la muestra biológica es preferentemente una rata, ratón, pero, cerdo, conejo, primate no humano o humano. Los primates no humanos incluyen, sin limitación, monos cinomolgus, mono tití, chimpancés y babuinos. Más preferentemente, el mamífero es un humano, más preferentemente un humano sometido a tratamiento médico con un inhibidor de la proteasoma. El tratamiento puede tener lugar en un conjunto hospital o en una base de paciente externo. Preferentemente, el humano es un paciente que sufre de una condición resultante de la trayectoria de proteasoma- ubiquitina que media la degradación de la proteína inapropiada o acelerada. En unos modos de realización preferidos, dicha condición se selecciona de entre el grupo que consiste en infección por VIH, caquexia, enfermedades parasíticas por protozoarios tales como malaria, enfermedades proliferativas celulares tales como cáncer, psoriasis, y restenosis, y enfermedades inflamatorias. Las enfermedades inflamatorias incluyen, sin limitación, osteo artritis y reumatoide, enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, sepsis, rechazo al transplante, asma e isquemia o daño por reperfusión, incluyendo apoplejías e infarto de miocardio. En algunos modos de realización preferidos, el humano es un paciente con cáncer o un paciente que sufre o con riesgo de desarrollar isquemia o daño por reperfusión.

Los inhibidores de la proteasoma del aldehído peptídico para su utilización en la presente invención incluyen preferentemente los descritos por Stein et al., WO 95/24914 publicada el 21 de septiembre de 1995, o Siman et al., WO 91/13904 publicada el 19 de septiembre de 1991.

Los compuestos de ácido borónico o ésteres para su utilización en la presente invención, incluyen preferentemente los descritos en Adams et al., WO 96/13266 publicado el 9 de mayo de 1996 o Siman et al., WO 91/13904 publicado el 19 de septiembre de 1991.

Más preferentemente, el compuesto de ácido borónico para su utilización en la presente invención se selecciona de entre el grupo que consiste en:

ácido borónico de N-acetil-L-leucina-\beta-(1-naftil)-L-alanina-L-leucina;

ácido borónico de N-(8-quinolin)sulfonil-\beta-(1-naftil)-L-alanina-L-leucina;

ácido borónico de N-(pirazin)carbonil-L-fenilalanina-L-leucina;

ácido borónico de \beta-(1-naftil)-L-alanina-L-leucina; y

ácido borónico de N-(4-morfolin)carbonil-[O-(2-piridilmetil)]-L-tirosina-L-leucina.

Los compuestos de lactacistina y análogos de lactacistina para su utilización en la presente invención, preferentemente incluyen los descritos en Fenteany et al., WO 96/32105, publicado el 17 de octubre de 1996. Más preferentemente, el análogo de lactacistina se selecciona de entre lactacistina, \beta-lactona de clasto-lactacistina, \beta-lactona de 7-etil-clasto-lactacistina y \beta-lactona de 7-N-propil-clasto-lactacistina. Más preferentemente, el análogo de lactacistina es la \beta-lactona de 7-N-propil-clasto-lactacistina.

El inhibidor de la proteasoma puede ser administrado al mamífero por cualquier vía, incluyendo intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, intraarticular, oral, intratraqueal, intranasal, intraarterial, intravenosa, tópica o rectal. En algunos modos de realización preferidos, el inhibidor de la proteasoma se puede administrar intratumoralmente. Las administraciones parenterales se pueden proporcionar en un bolo o mediante infusión. La administración por vía intravenosa o intraperitoneal se prefiere actualmente. El inhibidor de proteasoma se puede administrar en una dosis única o en dosis repetidas. Las dosis repetidas se pueden administrar a una frecuencia que varía entre una vez mensualmente y varias veces diariamente. Como se indica posteriormente, los procedimientos de la invención se emplean para determinar la cantidad de dosis y la frecuencia que es apropiada para un inhibidor de la proteasoma particular.

La actividad de la proteasoma en la muestra biológica se mide por cualquier procedimiento de ensayo adecuado para la determinación de la actividad de la proteasoma 20S ó 26S. (Véase por ejemplo, McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998)); Driscoll y Goldberg, J. Biol. Chem. 265:4789 (1990); Orlowski et al., Biochemistry 32:1563 (1993)). Preferentemente, un substrato que tiene una etiqueta detectable se proporciona con la mezcla de reacción y se controla la escisión proteolítica del substrato después de la desaparición del substrato o aparición de un producto escindido. La detección de la etiqueta se puede alcanzar por ejemplo, mediante ensayo fluorométrico, colorimétrico o radiométrico.

Los substratos preferidos para determinar la actividad de la proteasoma 26S incluyen, sin limitación, lisozima, \alpha-lactalbumina, \beta-lactoglobulina, b-cadena de insulina y descarboxilasa de ornitina. Cuando se mide la actividad de la proteasoma 26S, el substrato es preferentemente ubiquitinado o la mezcla de reacción comprende además preferentemente ubiquitina y enzimas de ubiquitinación.

Más preferentemente, el substrato es un péptido de menos de 10 aminoácidos de longitud. En un modo de realización preferido, el substrato peptídico contiene una etiqueta fluorescente escindible y la liberación de la etiqueta se controla mediante ensayo fluorométrico. Los ejemplos no limitativos de los substratos preferidos según este modo de realización incluyen N-(N-carbobenciloxicarbonilleucilleucilarginil)-7-amino-4-metilcoumarino (Z-Leu-Leu-Arg-AMC), N-(N-benciloxivalilglicilarginil)-7-amino-4-metilcoumarin (Bz-Val-Gly-Arg-AMC), N-(N-carbobenciloxicarbonilleucilleucilarginil)-2-naftilamina (Z-Leu-Leu-Glu-2NA), o N-(N-succinilleucilleucilvaliltrirosil)-7-amino-4-metilcoumarin (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC). En algunos modos de realización preferidos, la mezcla de reacción comprende además un activador de la proteasoma 20S. Los activadores preferidos incluyen los mostrados en Coux et al., (Ann. Rev. Biochem. 65:801-847 (1995)), preferentemente PA28 o dodecil sulfato de sodio (SDS).

La variabilidad día a día en el ensayo puede ser el resultado de factores tales como las diferencias en las soluciones amortiguadoras, variabilidad del operador, variabilidad en la resolución del instrumento, y variabilidad de la temperatura. Tal variabilidad se puede minimizar mediante la actividad de la proteasoma estandarizante tanto en la muestra biológica como en la muestra de referencia relativa a una muestra de proteasoma estándar que comprende una cantidad constante o conocida de actividad de proteasoma. En algunos modos de realización preferidos, la muestra estándar comprende proteasoma 20S purificada, más preferentemente proteasoma 20S purificada a partir de un eucariota. La fuente de proteasoma 20S no es crítica, e incluye sin limitación, mamíferos, incluyendo sin limitación conejos. En algunos modos de realización preferidos, la proteasoma 20S es purificada a partir de reticulocitos de conejo. En otros modos de realización preferidos, la muestra estándar es una muestra biológica que incluye sin limitación, una muestra de sangre. Preferentemente, la muestra biológica es un lisado de células de la sangre total, más preferentemente, un lisado de las células de la sangre total, obtenida a partir de un humano, preferentemente un humano que no ha sido expuesto a la administración del inhibidor de proteasoma.

La actividad de la proteasoma medida en la muestra biológica de prueba se compara con la medida en una muestra biológica de referencia obtenida a partir de un mamífero al que no se le ha administrado un inhibidor de la proteasoma. En algunos modos de realización preferidos, la muestra biológica de prueba y la muestra biológica de referencia comprenden cada una de manera separada, una pluralidad de muestras combinadas a partir de un grupo de mamíferos, preferentemente ratones, sometidos a tratamiento. En otros modos de realización preferidos, la muestra biológica de prueba y la muestra biológica de referencia, comprenden cada una, una muestra única obtenida de un individuo mamífero. El ensayo de las muestras individuales es actualmente preferido, excepto cuando no resulta práctico debido al pequeño tamaño del mamífero. En algunos modos de realización preferidos, se obtiene una muestra estadística mediante la combinación de los datos a partir de muestras biológicas de pruebas individuales o a partir de muestras biológicas de referencia individuales.

En algunos modos de realización preferidos, la muestra de referencia se obtiene a partir del mamífero tratado antes del inicio del tratamiento del inhibidor de la proteasoma. Este modo de realización es actualmente preferido para mamíferos superiores para minimizar el impacto de la variabilidad inter-mamíferos. Actualmente el control clínico de la acción del fármaco inhibidor de la proteasoma preferentemente vincula este modo de realización de la invención, con cada paciente que sirve como el control de línea de base propio de él o ella.

Una disminución en la actividad de la proteasoma en la muestra biológica comparada con la muestra de referencia indica un efecto in vivo del inhibidor de la proteasoma mientras se obtiene la muestra biológica. En algunos modos de realización preferidos, las muestras biológicas se obtienen en múltiples puntos de tiempo después de la administración del inhibidor de proteasoma. En estos modos de realización, la medición de la actividad de proteasoma en las muestras biológicas proporciona una indicación de la extensión y duración del efecto in vivo del inhibidor de la proteasoma. En otros modos de realización preferidos, las muestras biológicas múltiples se obtienen a partir de un mamífero único en uno o más puntos de tiempo. En estos modos de realización, la medición de la actividad de la proteasoma en las muestras biológicas, proporciona una indicación de la distribución del inhibidor de proteasoma en el mamífero.

Las fuentes potenciales de variabilidad en las mediciones de la actividad de la proteasoma incluyen, diferencias inter-individuales, fluctuaciones en la actividad de la proteasoma en un individuo único con el tiempo, y las diferencias en la actividad de la proteasoma en las células blancas de la sangre y células rojas de la sangre. Las tres fuentes de variabilidad pueden impactar las determinaciones de la inhibición de proteasoma basadas en la actividad específica. Por el contrario, las determinaciones de la inhibición de la proteasoma basadas en la relación de la actividad peptidasa de la proteasoma a otra, pueden presentar mayor consistencia.

La cantidad de dosis puede determinarse preferentemente en una base en mg/kg o mg/m^{2}. El mamífero al que se administrará la dosis futura, puede ser el mismo mamífero que aquél a partir del cual se obtuvieron la muestra o muestras biológicas, o puede ser un mamífero diferente. En algunos modos de realización, se pueden repetir las etapas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, en un conjunto clínico, la cantidad de dosis y la frecuencia de dosis pueden ser ajustadas repetidamente o continuamente como resultado del control repetido de la actividad de proteasoma en las muestras biológicas obtenidas a partir del paciente.

En algunos modos de realización preferidos, la cantidad de dosis y la frecuencia de dosis del inhibidor de proteasoma se seleccionan para evitar la inhibición de proteasoma excesiva. En algunos modos de realización, la inhibición de proteasoma en exceso resulta en un efecto tóxico, presentando el efecto tóxico, sin limitarse a ello, vómito, diarrea, hipovolemia, hipotensión y mortalidad. Preferentemente, la cantidad de dosis y la frecuencia de dosis del inhibidor de proteasoma se seleccionan de tal manera que la inhibición de proteasoma en cualquier muestra biológica futura no excederá de aproximadamente 95%.

En otros modos de realización preferidos, la cantidad de dosis y la frecuencia de dosis del inhibidor de proteasoma se seleccionan de tal manera que se alcanza la inhibición de la proteasoma terapéuticamente útil. Preferentemente, la inhibición de proteasoma terapéuticamente útil resulta en un efecto antitumoral, antiinflamatorio, antiviral o antiparasítico terapéuticamente benéfico.

Preferentemente, se seleccionan la cantidad de dosis y la frecuencia de dosis del inhibidor de proteasoma, de tal manera que la inhibición de proteasoma se alcanza en una muestra biológica futura, por lo menos aproximadamente 15%, preferentemente aproximadamente 20%, más preferentemente aproximadamente 30%, aún más preferentemente aproximadamente 40%, todavía más preferentemente aproximadamente 50%, y más preferentemente de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 80%, aunque en algunos ejemplos, se puede preferir la inhibición de proteasoma tan alta como 95%.

En ciertos modos de realización preferidos, la muestra biológica se obtiene a partir de una zona de enfermedad. En un modo de realización preferido, la muestra biológica comprende un tumor o células tumorales, preferentemente a partir de un paciente con cáncer. La muestra biológica según este modo de realización se obtiene preferentemente mediante una biopsia de un tumor presente en el paciente. En otro modo de realización preferido, la muestra biológica comprende células de la sangre o precursores de las células de a sangre a partir de un paciente con un trastorno proliferativo de las células de la sangre. En otro modo de realización preferido, la muestra biológica se obtiene mediante biopsia de la piel de un paciente con psoriasis. En otro modo de realización preferido, la muestra biológica se obtiene mediante biopsia del colon de un paciente que sufre de enfermedades inflamatorias del intestino. En otro modo de realización preferido, la muestra biológica comprende fluido sinovial, preferentemente a partir de un paciente con artritis. En todavía otro modo de realización preferido, la muestra biológica comprende células musculares, preferentemente a partir de un paciente caquéxico. En todavía otro modo de realización preferido, la muestra biológica comprende fluido bronquial, preferentemente a partir de un paciente con asma.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la determinación de la actividad de la proteasoma de línea base, que comprende la medición de la actividad de la proteasoma en una muestra o muestras biológicas obtenidas a partir de un mamífero, en el que dichas muestras son seleccionadas de entre el grupo que consiste en muestras de sangre, de orina, de órganos y de tejidos; la determinación de la cantidad de actividad de proteasoma en la muestra o muestras biológicas, y la selección de una cantidad de dosis y frecuencia de dosis de un inhibidor de proteasoma a ser administrado a un mamífero que sufre de una enfermedad o condición patológica.

Los modos de realización preferidos de acuerdo con este aspecto de la invención son tales como los descritos anteriormente para el primer aspecto.

En un modo de realización preferido de acuerdo con este aspecto de la invención, el mamífero sufre de una enfermedad o condición patológica. Los presentes inventores contemplan que la actividad de la proteasoma in vivo, se alterará en ciertos estados de enfermedades. Es importante que las desviaciones a partir de la cantidad normal de actividad de proteasoma se identifiquen antes de la iniciación del tratamiento con un inhibidor de la proteasoma. Cuando la actividad de la proteasoma de línea base es superior que la normal, se puede requerir una dosis normal superior del inhibidor de proteasoma. Por el contrario, cuando la actividad de la proteasoma de línea base es inferior que la normal, se puede requerir una dosis normal inferior de proteasoma.

En ciertos modos de realización preferidos, se combinan los datos de la actividad de la proteasoma para una muestra biológica obtenida a partir de un mamífero que sufre de una enfermedad o condición patológica, con los datos de la actividad de la proteasoma para las muestras biológicas de otros mamíferos, con la misma enfermedad o condición. El dato combinado es entonces comparado con los datos de la actividad de la proteasoma para una muestra biológica de referencia obtenida a partir de un mamífero o mamíferos sin la enfermedad o condición. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención permite una determinación estadística del efecto, si existe, que la enfermedad o condición presentan en la actividad de la proteasoma in vivo. En ciertos modos de realización preferidos, el procedimiento comprende además la determinación de una cantidad de dosis del inhibidor de proteasoma a ser administrado a un mamífero que sufre una enfermedad o condición patológica. El mamífero enfermo al que se administrará el inhibidor de proteasoma puede ser el mismo mamífero que aquél al que se le determinó la actividad de la proteasoma de línea base o puede ser un mamífero diferente con la misma enfermedad o condición.

Los inventores contemplan que los niveles de actividad de la proteasoma se pueden distinguir entre los diferentes estados de enfermedades que dan alcance a síntomas similares. De manera similar, los mamíferos con una enfermedad particular se pueden dividir en subpoblaciones de acuerdo con el nivel de actividad de la proteasoma de línea base. Los inventores contemplan que los procedimientos de la invención serán útiles para correlacionar los niveles de la actividad de la proteasoma de línea base con consecuencia de enfermedades y para la determinación del pronóstico de un mamífero individual basado en los datos correlativos.

En otro modo de realización preferido, al mamífero se le ha administrado un fármaco. Los fármacos administrados por una variedad de propósitos, pueden afectar los niveles de la actividad de la proteasoma ya sea directamente, por ejemplo, inhibiendo la proteasoma, o indirectamente, por ejemplo, afectando las trayectorias metabólicas o afectando la disponibilidad del substrato. La presente invención proporciona procedimientos para controlar estos efectos y para predecir las interacciones fármaco-fármaco. En ciertos modos de realización preferidos, la actividad de la proteasoma se mide en una muestra biológica obtenida a partir de un mamífero tratado con el fármaco antes de la iniciación del tratamiento del mamífero con un inhibidor de proteasoma. El procedimiento comprende además la determinación de una cantidad de dosis y frecuencia de dosis del inhibidor de proteasoma a ser administrado.

En otros modos de realización, los datos de la actividad de proteasoma obtenidos a partir de las muestras biológicas obtenidas de un mamífero tratado con fármaco, se combinan con los datos de la actividad de la proteasoma para las muestras biológicas a partir de otros mamíferos tratados con el mismo fármaco. El dato combinado compara entonces con los datos de la actividad de la proteasoma para una muestra biológica de referencia obtenida a partir de un mamífero o mamíferos, a los que no se les ha administrado el fármaco. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención, permite una determinación estadística del efecto, si existe, que el fármaco presenta en la actividad de la proteasoma in vivo. En ciertos modos de realización preferidos, el procedimiento comprende además la determinación de una cantidad de dosis y frecuencia del inhibidor de proteasoma a ser administrado a un mamífero tratado con el fármaco. El mamífero tratado con el fármaco al que se administrará el inhibidor de proteasoma, puede ser el mismo mamífero que aquél para el cual se determinó la actividad de la proteasoma de línea base o puede ser un mamífero diferente que también ha sido tratado con el mismo fármaco.

Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar además ciertos modos de realización preferidos de la invención y no son limitativos en su naturaleza.

Ejemplos Ejemplo 1 Farmacocinéticos de ácido borónico de N-(pirazin)carbonil-L-fenilalanina-L-leucina (1) en ratas y primates Ratas

Se llevó a cabo en ratas Sprague-Dawley (140 hasta 280 g) un estudio de farmacocinéticos intravenosos de dosis única con ácido borónico de N- (pirazin)carbonil-L-fenilalanina-L-leucina (1). Los animales se asignaron a 3 grupos (6/sexo en los grupos 1 y 2; 9/sexo en el grupo 3). Los animales en los grupos 1, 2 y 3, recibieron 0,03, 0,1 ó 0,3 mg/kg de 1, respectivamente, en el mismo volumen de dosis.

Las muestras de la sangre (aproximadamente 1,0 ml) se extrajeron de la vena yugular de los animales predosificados y a aproximadamente 10 y 30 minutos y 1,3 y 24 horas post-dosis el día 1. Las muestras se ensayaron para 1, usando un procedimiento de espectroscopia de masas/cromatografía (LC/MS/MS). El límite inferior de la cuantificación para el análisis se estableció a 2,5 ng/ml para 1 en el plasma de rata y la sangre total.

Siguiendo las dosis intravenosas únicas, los niveles de la sangre total o el plasma de 1, fueron únicamente medibles al nivel de dosis de 0,3 mg/kg. El C_{max} observado, ocurrió con el primer punto de tiempo; aquí, el tiempo al pico de la concentración (T_{max}) se estimó como \leq 10 min en ambas ratas macho y hembra. Los machos de manera general, presentaron una concentración de pico (C_{max}) y unos valores del área bajo la curva del tiempo de concentración (AUC_{0-t}) ligeramente más superior que las hembras. Los valores C_{max} en el plasma y en la sangre total en machos fue de 51,8 y 22,7 ng/ml, respectivamente, y en las hembras fue de 36,9 y 19,1 ng/ml, respectivamente. Los valores AUC_{0-t} en el plasma y la sangre completa en los machos fueron de 14,0 y 18,6 ng\cdoth/ml, respectivamente y en las hembras fueron de 12,9 y 17,7 ng\cdoth/ml, respectivamente. La estimación de la eliminación de la vida media (t_{1/2}) no fue posible debido a la fluctuación de los niveles 1 durante la fase terminal. Las observaciones sugieren que 1 es rápidamente aclarado de la sangre.

Primates

Se midieron el nivel de 1 en la sangre y el plasma a las 2 horas post-dosis en un estudio de hallazgo de rango en primates. Se administraron dosis intravenosas únicas de 1 a dos monos cinomolgus (1 macho 3,3 kg; 1 hembra 2,3 kg). Cada mono recibió dos dosis únicas (0,1 mg/kg el día 1, y 0,3 mg/kg el día 8) a un volumen de dosis de 1,0 ml/kg. El vehículo fue de ácido ascórbico al 0,1%/etanol al 2%/solución salina al 98% (0,9%). Este trabajo se llevó a cabo por Covance Laboratories Inc., Madison, WI.

Después de la administración intravenosa, se extrajo la sangre a partir de cada animal los días 1 y 8 aproximadamente 2 horas después de la dosificación. Las muestras de sangre y plasma se almacenaron en un congelador dispuesto para mantener -20\pm10ºC hasta ser analizado por el contenido de material de prueba.

Las muestras se ensayaron para 1, usando un procedimiento de cromatografía/espectroscopía de masa (LC/MS/
MS). El límite inferior de la cuantificación para el análisis se estableció a 2,5 ng/ml para 1 en el plasma de mono y la sangre total. Dos horas después de la administración de 0,1 mg/kg de 1, las concentraciones de 1 fueron menores de 2,5 ng/ml (macho y hembra) en el plasma; la concentración de 1 en la sangre completa fue de 3,72 ng/ml en el macho y 3,86 ng/ml en la hembra. Dos horas después de la administración de 0,3 mg/kg de 1, las concentraciones de 1 en el plasma fueron de 4,64 ng/ml (hembra) y 6,44 ng/ml (macho); las concentraciones de 1 en la sangre completa fueron de 10,6 ng/ml (hembra) y 9,01 ng/ml (macho).

Ejemplo 2 Preparación de los lisados de células blancas de la sangre periférica para las mediciones in vitro de la actividad de la proteasoma 20S

Este procedimiento de preparación se aplica a las muestras de sangre extraídas de mamíferos, particularmente ratas, ratones, perros, cerdos, conejos, primates no humanos o sujetos humanos. Las células blancas de la sangre periférica se separaron de las muestras de sangre después de la extracción para el almacenamiento a aproximadamente - 70ºC hasta ser ensayadas. Para evitar la interferencia con el ensayo debida a la presencia de inhibidores de la proteasoma endógenos, es importante que las células rojas de la sangre sean rigurosamente excluidas.

Procedimiento

La cantidad requerida de la sangre se extrajo en un tubo que contiene anticoagulante. Para sujetos humanos y primates, se requieren aproximadamente 5 ml de sangre; para ratas, se necesitan aproximadamente 4 ml de sangre; para ratones, se necesitan aproximadamente 1 ml de sangre a partir de cada uno de los cinco ratones, y las cinco muestras de sangre se combinan para proporcionar aproximadamente 5 ml.

La muestra de la sangre se diluye 1:1 (v/v) con solución salina estéril, y la mezcla de solución salina-sangre se estratifica sobre un medio de separación Nycoprep^{TM} (GIBCO BRL Products) en un tubo de ensayo de poliestireno de 14 x 75 mm en una relación de aproximadamente 2:1 sangre:Nycoprep^{TM}. La muestra se centrifugó a 500 x g durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Se removió la capa superior, dejando \sim2-3 mm de la banda celular entre la parte superior y la parte inferior de las capas. La banda celular restante se transfirió por pipeta a un tubo de centrifugación limpio. La banda celular se lavó con 3 ml de solución salina amortiguada de fosfato fría y se centrifugó a 400 x g durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se vertió y el pellet se resuspendió en \sim1 ml de solución salina amortiguada con fosfato. La suspensión se transfirió a un tubo microfugo o de centrifugación Eppendorf de 1,5 ml. Se sometió a centrifugación a 6600 x g durante aproximadamente 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se aspiró completamente y el pellet celular se almacenó a -70ºC\pm10ºC.

Ejemplo 3 Ensayo para medir la actividad de la proteasoma 20S en el procedimiento de actividad específica de las células blancas de la sangre periférica

El ensayo se basa en la actividad como la quimiotripsina inducible por SDS de las partículas de 20S. Se usa la fluorometría para medir la relación a la que la proteasoma 20S hidroliza un enlace amida en un substrato péptido pequeño. La medición de esta relación en ausencia y en presencia de un inhibidor, permite una determinación de cómo la enzima se enlaza por un inhibidor. Este ensayo se usa para medir la actividad de la proteasoma 20S en las células blancas de la sangre periférica en mamíferos, particularmente en ratas, ratones, perros, cerdos, conejos, primates no humanos o sujetos humanos.

Abreviaciones y definiciones

AMC

7-amino-4-metilcoumarino

DMF

dimetilformamida

BSA

albúmina de suero bovino

DMSO

sulfóxido de dimetilo

DTT

ditiotreitol

EDTA

etilendiaminotetraacetato disódico

HEPES

N-(2-hidroxietil)piperazin-N-(2-ácido etansulfónico); ajustes de pH con NaOH

Hgb

hemoglobina

SDS

dodecilsulfato de sodio de ya sea: SDS-grado: dodecilsulfato de sodio al 99%, o de Laurilo grado: dodecilsulfato de sodio al \sim70% con el resto como sulfatos de tetradecilo y hexadecilo

TMB

3,3',5,5'-tetrametilbencidina

WBC

células blancas de la sangre

Substrato Y

N-(N-succinilleucilleucilvaliltirosil)-7-amino-4-metilcoumarino (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC) (Bachem)

Agua MilliQ

agua purificada por osmosis inversa o intercambio de ión y además tratada con un sistema de purificación de agua Millipore MilliQ Plus UF (o sistema equivalente) que resulta en agua con una resistividad mayor que 16 M\Omega\cdotcm.

Procedimiento

El substrato Ys se disolvió a 6 mM en DMSO. Una solución al 2% (2 g/100 ml) de SDS en agua MilliQ se preparó en una botella de vidrio. El amortiguador del substrato Ys, contiene 20 ml de HPES, 0,5 mM de EDTA, 0,035% de SDS, DMSO al 1%, y se preparan 60 \muM de substrato Ys. El pH final del amortiguador Ys es de 8,0.

La proteasoma 20S estándar purificada a partir de reticulocitos de conejo, preparada de acuerdo con el procedimiento de literatura (McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998)), se diluyó 1:9 (v/v) en 20 mM de HEPES/0,5 mM de EDTA (pH 7,8).

A 5 \mul de una solución base de 20 mM de AMC en DMF, se agregó 2 ml de DMF. La solución resultante se diluyó en 1:25 en DMSO para producir una solución de 2\muM de AMC. El valor cero para el amortiguador del substrato Ys se registró en fluorómetro (\lambdaem = 440 nm; \lambdaex = 380 nm). A 2 ml del amortiguador del substrato Ys, se le agregaron 5 \mul de AMC cada 30 segundos hasta un total de cinco veces, para producir una curva de calibración para 0 hasta 50 pmol de AMC. Después de cada adición, se tomó una lectura del fluorómetro con una amplitud de banda de excitación de 10 nm y una amplitud de banda de emisión de 20 nm. La inclinación es la calibración del fluorómetro.

La proteasoma 20S estándar se diluyó 1:10 en 20 mM de HEPES/0,5 mM de EDTA (pH 7,8) para formar una solución base de 12 \mug/ml y se colocó en hielo. 10 \mul de la solución de proteasoma 20S estándar, se agregaron a una probeta que contiene 2 ml del amortiguador del substrato Ys y la reacción tuvo lugar durante 10 minutos. La inclinación lineal máxima se midió en un fluorómetro y proporcionó una calibración del amortiguador del substrato Ys y las condiciones del ensayo (calibración Ys). Este valor se dividió por la calibración del fluorómetro para proporcionar la actividad estandarizada de la proteasoma 20S estándar.

Se prepararon las células blancas de la sangre, como se describe en el ejemplo 1, se sometieron a lisis por la adición de 200 \mul de 5 mM de EDTA a cada muestra. Las muestras se dejaron permanecer en hielo por lo menos durante 15 minutos.

El ensayo de proteína Bradford (medición del contenido de proteína total) y el ensayo de hemoglobina, se realizaron en la muestra de prueba según los procedimientos estándares usando equipos comercialmente disponibles. La medición exacta de la actividad de la proteasoma 20S de las células blancas de la sangre, no se puede determinar si el contenido de hemoglobina es 10% mayor que el de la proteína total. En esta situación, la muestra deberá tratarse como un lisado de células de la sangre completa.

Se agregaron 10 \mul de una muestra de prueba a una probeta que contiene 2 ml del amortiguador del substrato Ys a 37ºC, y se dejó reaccionar durante 10 minutos. La activación completa de la proteasoma 20S se llevó a cabo en los 10 minutos. Los resultados consistentes se obtuvieron para las lecturas tomadas después de 4 minutos y hasta los 10 minutos. Se midió la inclinación lineal máxima durante por lo menos 1 minuto de datos. Si la relación es menor de 1 pmol AMC/seg., la medición se repite usando 20 \mul de la muestra de prueba.

La cantidad de la actividad de la proteasoma 20S en la muestra de prueba se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:

Actividad 20S = \frac{\text{Relación(FU/min)* calibración del fluorómetro(pmol/FU)}}{\text{0,0001* proteína WBC(mg)* 60 s/min* calibración Ys(pmol/s)}}

Para considerar el ensayo válido, la hemoglobina presente en la muestra podrá ser de menos de 10% de la proteína total, y los valores de la actividad de la proteasoma 20S triplicados podrán presentar una desviación estándar inferior a 3%.

Ejemplo 4 Derivación de la ecuación que se refiere a la relación entre la actividad quimiotríptica:tríptica y el porcentaje de inhibición por un inhibidor de la proteasoma

Los símbolos \kappa_{c} y \kappa_{t} son las constantes de relación aparente para los sitios quimiotrípticos y trípticos respectivamente, bajo las condiciones de ensayo estándares (sin inhibidor):

(1)V_{c} = \kappa_{c}[20S]_{t}

(2)V_{1} = \kappa_{t}[20S]_{t}

en la que [20S]_{t} = la concentración de proteasoma total.

En presencia de un modificador de proteasoma que resulta en la formación de un complejo E\cdotI, la constante de relación para los sitios quimiotrípticos y trípticos se puede alterar por la única molécula del modificador enlazada a un sitio no identificado. Este efecto se puede representar por

\beta_{c}k_{c}

\hskip0.5cm

y

\hskip0.5cm

\beta_{t}k_{t}.

en la que

\beta

= 0 indica la inhibición total por el modificador (es decir, E\cdotI no tiene actividad)

\beta

< 1 indica la inhibición parcial (es decir, el complejo E\cdotI tiene menos actividad que E)

\beta

= 1 indica sin inhibición (es decir, el complejo E\cdotI tiene la misma actividad que E)

\beta

> 1 indica activación (es decir, el complejo E\cdotI tiene más actividad que E)

A una fracción dada de la proteasoma modificada (f):

(3)V_{c} = \kappa_{c}[20S]_{t}(1 - f)+(\beta_{c}k_{c}[20S]_{t}(f)

(3)V_{1} = \kappa_{t}[20S]_{t}(1 - f)+(\beta_{t}k_{t}[20S]_{t}(f)

Después

(5)\frac{V_{c}}{V_{t}} = \frac{K_{c}}{K_{t}}\left(\frac{1-f + \beta_{c}f}{1-f + \beta_{t}f}\right)

\hskip0.5cm

y

(6)f = \frac{\left(\frac{K_{c}}{K_{t}} - \frac{V_{c}}{V_{t}}\right)}{\frac{K_{c}}{K_{t}} - \frac{V_{c}}{V_{t}} + \beta_{c} \frac{V_{c}}{V_{t}} - \beta_{c}\frac{K_{c}}{K_{t}}}

El parámetro \kappa_{c}/\kappa_{t} es una constante experimentalmente determinable, por lo menos dentro de un individuo y posiblemente a través de unas especies. \kappa_{c}/\kappa_{t} es dependiente de las condiciones del ensayo para la medición de las actividades quimiotrípticas y trípticas, pero no es dependiente de la identidad del inhibidor. Los parámetros \beta_{c} y \beta_{t} son constantes para un inhibidor particular. Su dependencia en las condiciones del ensayo se espera mucho menor que \kappa_{c}/\kappa_{t} puesto que la actividad del complejo enzima-inhibidor podría alterarse en la actividad de manera diferente a partir de esta actividad de la enzima libre. Si \beta = 0 ó 1, se espera la no dependencia de \beta en las condiciones de ensayo. Una vez que \kappa_{c}/\kappa_{t}, \beta_{c} y \beta_{t} se conocen bajo una serie particular de condiciones de ensayo e inhibidor, las actividades quimiotrípticas y trípticas de una muestra bruta se pueden usar para calcular la fracción de la proteasoma modificada.

En el caso específico de ácido borónico de N-(pirazin)carbonil-L-fenilalanina-L-leucina, \beta_{c} = 0, así

(8)\frac{V_{c}}{V_{t}} = \frac{K_{c}}{K_{t}}\left(\frac{1-f}{1-f + \beta_{t}f}\right)

Las ecuaciones análogas se pueden derivar para la expresión de la inhibición de la proteasoma como una función de la relación de cualquiera de las dos actividades peptidasas de la proteasoma.

Ejemplo 5 Ensayo para medir la actividad de la proteasoma 20S en proporción entre la actividad quimiotríptica y tríptica en las células blancas de la sangre periférica

El ensayo se basó en las actividades inducibles por SDS como quimiotripsina y como tripsina de partículas de proteasoma 20S libres. Se usó fluorometría para medir la proporción a la cual la proteasoma 20S hidroliza un enlace amida en un substrato peptídico menor. Puesto que algunos inhibidores de la actividad de la proteasoma 20S inhiben completamente la actividad como la quimiotripsina, pero activan la actividad como la tripsina, el porcentaje del enlace de proteasoma 20S por dicho inhibidor se puede determinar directamente en la proporción de las actividades como quimiotripsina y como tripsina.

Abreviaciones y definiciones

Además de las definiciones expuestas en el ejemplo 3, también se aplican las siguientes definiciones:

Substrato Rs

N-(N-benzoilvalilglicilarginil)-7-amino-4-metilcoumarino (Bz-Val-Gly-Arg-AMC) (Bachem).

Procedimiento

El amortiguador del substrato Ys se preparó como se describe en el ejemplo 3.

El substrato Rs se disolvió en 10 mM en DMSO. Se preparó amortiguador del substrato Rs, que contiene 20 mM de HEPES, 0,5 mM de EDTA, 0,6% de DMSO, y 60 \muM del substrato Rs.

La proteasoma 20S estándar purificada a partir de reticulocitos de conejo, preparada según el procedimiento de literatura (McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998)), se diluyó 1:9 (v/v) en 20 mM de HEPES/0,5 mM de EDTA (pH 7,8).

La calibración del fluorómetro se realizó como se describe en el ejemplo 3.

La calibración del amortiguador del substrato Ys se realizó como se describe en el ejemplo 3.

La calibración del amortiguador del substrato Rs se realizó de una forma análoga, substituyendo el amortiguador del substrato Rs por el amortiguador del substrato Ys.

Se agregaron 10 \mul de una muestra de prueba a una probeta que contiene 2 ml del amortiguador del substrato Ys a 37ºC, y la reacción tuvo lugar durante 10 minutos. La activación completa de la proteasoma 20S se llevó a cabo dentro de los 10 minutos. Los resultados consistentes se obtuvieron para las lecturas tomadas después de 4 minutos y hasta los 10 minutos. Se midió la inclinación lineal máxima durante por lo menos 1 minuto de datos. Si la relación es menor de 1 pmol AMC/seg., la medición se repite usando 20 \mul de la muestra de prueba.

Se agregaron 20 \mul de una muestra de prueba a una probeta que contiene 2 ml del amortiguador del substrato Ys a 37ºC, y la reacción tuvo lugar durante 10 minutos. La activación completa de la proteasoma 20S se llevó a cabo dentro de los 10 minutos. Los resultados consistentes se obtuvieron para las lecturas tomadas después de 4 minutos y hasta los 10 minutos. Se midió la inclinación lineal máxima durante por lo menos 1 minuto de datos. Si la relación es menor de 1 pmol AMC/seg., la medición se repite usando 20 \mul de la muestra de prueba en 800 \mul de amortiguador Rs.

El porcentaje de inhibición (%) es entonces calculado según la siguiente ecuación:

(9)%I = \frac{100* \left(\frac{K_{c}}{K_{t}} - \frac{V_{c}}{V_{t}}\right)}{\frac{K_{c}}{K_{t}} - \frac{V_{c}}{V_{t}} + \beta_{t} \frac{V_{c}}{V_{t}}}

en la que

V_{c} = (relación quimiotríptica (FU/s))/(volumen de la muestra ensayada);

V_{t} = (relación tríptica (FU/s))/(volumen de la muestra ensayada);

k_{c}/\kappa_{t} = promedio V_{c}/V_{t} de las muestras de línea base 1-3 tomadas a partir del sujeto antes de la dosificación con el inhibidor de proteasoma;

\beta_{t} = factor de activación determinado después de la titulación del inhibidor de proteasoma. Para el inhibidor de proteasoma 1, \beta_{t} = 1,28 en las muestras

Ejemplo 6 Preparación de los lisados de células de la sangre completa para las mediciones in vitro de la actividad de la proteasoma 20S

La cantidad requerida de la sangre se extrajo de un tubo que contiene anticoagulante. Típicamente, se requieren 1 ml de sangre. La sangre se transfiere a un tubo micrófugo o de centrifugación Eppendorf de 1,5 ml y se somete a microfugación centrifugación a 6600 x g durante aproximadamente 10 minutos a 4ºC. El plasma se aspira completamente y el pellet celular se resuspende 1:1 en un volumen (\sim0,5 ml) de solución salina amortiguada con fosfato fría. La suspensión celular es nuevamente microcentrifugada a 6600 x g durante aproximadamente 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se aspira completamente. Se transfieren 10 \mul del pellet celular a un tubo micrófugo o de centrifugación Eppendorf de 1,5 ml y se agregan 0,5 mL de EDTA 5 mM. El pellet celular restante se congela a -70ºC.

Se utilizan de 10 a 20 \mul de esta muestra en el ensayo (la concentración de proteína típica es de 5 mg/ml).

Ejemplo 7 Ensayo para medir la actividad de la proteasoma 20S en proporción entre la actividad semejante a la quimiotríptica y la actividad semejante a la tríptica en las células de la sangre completa periférica Abreviaciones y definiciones

Se aplican las abreviaciones y definiciones expuestas en los ejemplos 3 y 5.

Procedimiento

El substrato Ys se disolvió a 6 mM en DMSO. Se preparó en una botella de vidrio una solución al 2% (2 g/100 ml) de SDS en agua MilliQ. El amortiguador del substrato Ys contiene 20 mM de HEPES, 0,5 mM de EDTA, 0,05% de SDS, DMSO al 1%, y se prepararon 60 \muM de substrato Ys. El pH final del amortiguador Ys es de 8,0.

El substrato Rs se disolvió en 10 mM en DMSO. Se preparó el amortiguador del substrato Rs que contiene 20 mM de HEPES, 0,5 mM de EDTA, DMSO al 0,6% y 60 \muM del substrato Rs. El pH final del amortiguador Rs es 8,0.

El lisado de la sangre completa estándar se preparó como se describe en el ejemplo 6 y se diluyó 1:9 en 20 mM de HEPES/0,5 EDTA (pH 7,8).

La calibración del fluorómetro se realizó como se describe en el ejemplo 3, usando lisado de la sangre completa estándar, en lugar de la proteasoma 20S estándar.

La calibración del amortiguador del substrato Ys se realizó como se describe en el ejemplo 3, usando lisado de la sangre completa estándar, en lugar de la protesoma 20S estándar.

La calibración del amortiguador del substrato Rs se realizó de una forma análoga, substituyendo el amortiguador del substrato Rs por el amortiguador del substrato Ys.

Una muestra que contiene 60 \mug de la proteína, se agregó a una probeta que contiene 2 ml del amortiguador del substrato Ys a 37ºC, y la reacción tuvo lugar durante 10 minutos. La activación completa de la proteasoma 20S se llevó a cabo en los 10 minutos. Los resultados consistentes se obtuvieron para las lecturas tomadas después de 4 minutos y hasta los 10 minutos. Se midió la inclinación lineal máxima durante por lo menos 1 minuto de datos. Si la relación es menor de 1 pmol AMC/seg., la medición se repite, incrementando la cantidad de la muestra de prueba a 120 \mul de proteína.

Una muestra que contiene 60 \mug de proteína, se agregó a una probeta que contiene 2 ml del amortiguador del substrato Rs a 37ºC, y la reacción tuvo lugar durante 10 minutos. La activación completa de la proteasoma 20S se llevó a cabo en los 10 minutos. Los resultados consistentes se obtuvieron para las lecturas tomadas después de 4 minutos y hasta los 10 minutos. Se midió la inclinación lineal máxima durante por lo menos 1 minuto de datos. Si la relación es menor de 1 pmol AMC/seg., la medición se repite utilizando 120 \mug de la muestra de prueba.

El porcentaje de inhibición (%I) se calcula entonces según la siguiente ecuación:

(9)%I = \frac{100* \left(\frac{K_{c}}{K_{t}} - \frac{V_{c}}{V_{t}}\right)}{\left(\frac{K_{c}}{K_{t}} - \frac{V_{c}}{V_{t}} + \beta_{t}\frac{V_{c}}{V_{t}}\right)}

en la que

V_{c} = (relación quimiotríptica (FU/s))/(volumen de la muestra ensayada);

V_{t} = (relación tríptica (FU/s))/(volumen de la muestra ensayada);

k_{c}/\kappa_{t} = promedio V_{c}/V_{t} de las muestras de línea base 1-3 tomadas a partir del sujeto antes de la dosificación con el inhibidor de proteasoma;

\beta_{t} = factor de activación determinado después de la titulación del inhibidor de proteasoma. Para el inhibidor de proteasoma 1, \beta_{t} = 1,28 en las muestras

Ejemplo 8 Niveles de actividad de la proteasoma en las células blancas de la sangre periférica de voluntarios humanos Procedimientos

Se obtuvieron muestras de sangre (aproximadamente 2 ml cada una) en cinco ocasiones, a partir de siete voluntarios humanos durante un periodo de diez semanas. Después de la extracción, las células blancas de la sangre se aislaron a partir de muestras individuales utilizando Nycoprepr^{TM}. El pellet resultante se almacenó en una serie en el congelador para mantener -60ºC hasta -80ºC hasta el día de la prueba. Las muestras extraídas en cada ocasión se probaron juntas y cada muestra se probó por duplicado.

Se determinó la actividad de la proteasoma 20S mediante la medición de la proporción de la hidrólisis proteolítica de un substrato peptídico termina fluorescente (AMC) mediante la muestra y la normalización de la actividad con la cantidad de proteína presente en el lisado. Se agregaron 5 \mul de la muestra a una probeta que contiene 2 ml del amortiguador de la reacción de ensayo (20mM de HEPES, 0,5 M de EDTA, 0,035% de SDS, 60 \muM de Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC en DMSO al 1,0%) y barra de agitación magnética. La probeta se colocó en un fluorómetro y se mantuvo a 37ºC mientras la cantidad del AMC hidrolizado se midió al controlar el incremento en la fluorescencia detectable durante un periodo de 5 minutos (\lambdaem = 440 nm; \lambdaes = 380 nm). Una regresión lineal fija de las curvas de progreso de reacción de los datos extraídos entre 3 y 5 minutos después de la iniciación de la reacción dieron la proporción de la hidrólisis en las subunidades fluorescentes por segundo (FU/seg.). Se determinaron las concentraciones de hemoglobina y proteína utilizando un ensayo Bradford modificado (Pierce) y un ensayo a base de hemoglobina específica enzimática (Sigma), respectivamente. La cantidad total de la proteína medida en la muestra se corrigió por la sustracción de la cantidad de proteína contribuida por las células rojas de la sangre (estimada a partir de la concentración de hemoglobina). La actividad de la proteasoma 20S en la muestra se determinó a partir de la ecuación:

\text{Actividad de la proteasoma 20S(pmoles AMC/seg./mg de proteína)} = \frac{(FU/seg.)/(5x10^{-6} \ ml)(prote\text{í}na \ \mu g/ml)}{C}

en la que C = factor de conversión de balance o equilibrio de la cantidad de fluorescencia a la concentración del AMC libre (FU/pmol AMC).

Resultados y discusión

Los valores medios de la actividad de la proteasoma 20S encontrados para cada voluntario humano variaron de 15,33 hasta 40,04 pmol AMC/seg./mg de proteína (Tabla 1 y figura 1). Las actividades encontradas a través de cada día de prueba están representadas en la figura 2. La actividad media de la proteasoma 20S encontrada en la población fue de 29,97 \pm 0,80 pmol AMC/seg./mg de proteína.

TABLA 1 Niveles de actividad de la proteasoma 20S en voluntarios humanos

1

Ejemplo 9 Actividad de la proteasoma 20S temporal en células blancas de la sangre completa aisladas y en tejidos después de la administración del ácido borónico de N-(pirazin)carbonil-L-fenilalanina-L-leucina (1) Procedimientos generales

Las formulaciones de dosis de 1 se prepararon diariamente durante el curso del estudio. Las diluciones se prepararon a partir de una solución base. La solución base de 1 se elaboró en solución salina al 98% (0,9%), etanol al 2% con ácido ascórbico al 0,1%. Las diluciones de la solución base se elaboraron en el mismo vehículo.

Ratones hembra CD2-F1 (18 a 20 g), ratones hembra BALB/c (18 hasta 20g), ratas hembra Wistar (150 hasta 200 g) y ratas Sprague-Dawley macho (250 hasta 450 g) se obtuvieron a partir de Taconic Farms (Germantown, NY). Los animales se observaron durante por lo menos una semana, y se examinaron por su salud antes de la iniciación del estudio. Los animales utilizados en estos estudios fueron asintomáticos. Los ratones se alojaron 5 por jaula y las ratas 3 por jaula en jaulas de policarbonato. Se utilizó la cama de paja Corn Cob (AND-1005; Farmers Exchange, Framingham, MA) durante la observación y los periodos de estudio. La luz fluorescente se controló para proporcionar automáticamente luz alterna y ciclos oscuros de aproximadamente 12 horas cada uno. La temperatura y la humedad se controlaron centralmente y se registraron diariamente y las lecturas variaron entre 21 \pm 2ºC y 45 \pm 5% respectivamente. Los pellets de alimentos para roedores estándar (#5001, Purina, St. Louis, MO) estuvieron disponibles ad libitum a través de toda la observación y los periodos de estudio. No se conocen contaminantes del alimento y agua que pudieran interferir con el estudio.

Los fármacos se administraron en el vehículo por vía intravenosa (IV) utilizando un volumen de dosis de 100 \mul por ratón o 1,0 ml/kg en ratas. Los grupos de control se administraron con el vehículo (solución salina al 98% [0,9%], etanol al 2%, ácido ascórbico al 0,1%). Los animales se dosificaron con 2 como un bolo único IV dado ya sea una vez o en múltiples ocasiones. Los animales que presentaron actividad moribunda se eutanizaron con inhalación de CO_{2}.

Después de la dosificación IV con 1, la sangre se retiró en varios puntos de tiempo y se aislaron las células blancas de la sangre.

Actividad de la proteasoma 20S ex vivo determinada en las células blancas de la sangre periférica de ratones después de la administración intravenosa individual de 1

En dos estudios combinados, a ratones hembras CD2-F1 (18 hasta 20 g) y ratones hembra BALB/c (18 hasta 20 g) se les administró una dosis intravenosa individual de 1 (0,1 hasta 3,0 mg/kg en un volumen de dosis de 100 \mul). El vehículo fue de solución salina al 98% [0,9%], etanol al 2%, ácido ascórbico al 0,1%. Las muestras de sangre se extrajeron 1,0 y 24 horas después de la administración. Debido al volumen de sangre requerido para el ensayo de la actividad de la proteasoma 20S, los grupos de cinco ratones se sacrificaron al mismo tiempo y sus sangres se combinaron para generar los puntos de datos individuales.

Hubo un incremento en relación a la dosis significativa (p < 0,05) en la actividad de la proteasoma 20S para todos los grupos 1,0 hora después de la administración intravenosa de 1 (figura 3), la cual inicia para recuperarse a las 24 horas (figura 4). Estos estudios demuestran una dosis dependiente e inhibición reversible de la actividad de la proteasoma 20S en las células blancas de la sangre periférica en ratones después de la administración de una inyección intravenosa individual de 1.

Actividad de la proteasoma 20S ex vivo determinada en las células blancas de la sangre periférica en ratas después de la administración intravenosa individual de 1

En cuatro estudios combinados, a ratas hembras Wistar (150 hasta 200 g) se les administró una dosis intravenosa individual de 1 (0,1 hasta 3,0 mg/kg en un volumen de dosis de 1,0 ml/kg). El vehículo fue ácido ascórbico al 0,1%/etanol al 2%/solución salina al 98% (0,9%). Las muestras de sangre se extrajeron 1,0, 24 y 48 horas después de la administración de 1.

Hubo un incremento en relación a la dosis significativa (p < 0,05) en la actividad de la proteasoma 20S para todos los grupos 1,0 hora después de la administración intravenosa de 1 (figura 5). Veinticuatro horas después de la administración, la disminución relacionada con la dosis en la actividad de la proteasoma 20S fue más baja, pero permaneció significativa (p < 0,05) en los grupos de dosis superiores, (0,2 mg/kg (figura 6)). 48 horas después de la administración, la actividad de la proteasoma 20S no fue disminuida de manera significativa (figura 7).

Estos estudios demuestran una dosis dependiente e inhibición reversible de la actividad de la proteasoma 20S en las células blancas de la sangre periférica en ratas después de la administración de una inyección intravenosa individual de 1. Una relación más lenta de regreso a la línea base para los niveles de actividad de la proteasoma 20S se observó en las ratas, posiblemente indicando el metabolismo más rápido de 1 en ratones.

Actividad de la proteasoma 20S ex vivo determinada en las células blancas de la sangre periférica de ratas después de la administración intravenosa repetida de 1

Cuando se administró diariamente en forma intravenosa 1 durante 7 días, se observó una disminución relacionada con la dosis en la actividad de la proteasoma 20S 24 horas después de la administración de por lo menos una dosis. Se observó la inhibición significativa para las dosis de \geq0,05 mg/kg. La extensión de la inhibición de la proteasoma 20S observada después de 24 horas de administración de 7 dosis intravenosas diariamente no fue mayor que la observada 24 horas después de la administración de una dosis intravenosa individual y probablemente se refleja un efecto acumulativo de la administración diaria de 1 en su objetivo biológico, la proteasoma.

Una disminución relacionada con la dosis significativa en la actividad de la proteasoma 20S se observó 24 horas después de la administración de por lo menos una dosis de administración intravenosa diaria alterna de 1 durante 14 días. La disminución relacionada a la dosis en la actividad de la proteasoma 20S fue significativa (p<0,05) en los grupos de dosis \geq0,2 mg/kg. Una disminución relacionada con la dosis significativa (p<0,05) en la actividad de la proteasoma 20S también se observó 24 horas después de la administración intravenosa de 1, una vez semanalmente durante 8 semanas. La disminución relacionada con la dosis en la actividad de la proteasoma 20S fue significativa (p<0,05) en los grupos de dosis \geq0,1 mg/kg.

En un estudio de dosis repetidas adicional, ratas Sprague-Dawley macho (250 hasta 450 g; n = 6 por grupo) se trataron con dosis intravenosas dos veces diariamente de 1 (0,01 hasta 0,35 mg/kg/día en un volumen de dosis de 1,0 ml/kg) durante dos semanas. El vehículo fue ácido ascórbico al 0,1%/etanol al 2%/solución salina al 98% (0,9%). Las muestras de sangre se extrajeron 1,0 horas después de la última dosis para la evaluación de la actividad de la proteasoma 20S.

Cuando se administró 1 dos veces semanalmente durante 2 semanas (total de 4 dosis), una disminución relacionada con la dosis en la actividad de la proteasoma 20S se observó 1,0 horas después de la última dosis (figura 8). Las disminuciones relacionadas con la dosis en la actividad de la proteasoma 20S fue significativa (p<0,05) para todos los grupos de dosis \geq 0,03 mg/kg.

Los resultados indican que la administración de dosis repetida de 1, estimula una disminución con relación a la dosis en la actividad de la proteasoma 20S en las células blancas de la sangre de ratas. La extensión de la inhibición de la actividad de la proteasoma 20S es mayor que la observada después de una dosis única cuando 1 se da diariamente o cada tercer día. Cuando el intervalo entre las dosis de 1 disminuye para permitir la recuperación (es decir, regímenes de una vez cada semana), el grado de inhibición es equivalente a la administración individual de 1. El perfil farmacodinámico soporta dosificaciones dos veces semanalmente con 1, donde se observa la inhibición temporal.

Actividad de la proteasoma 20S ex vivo determinada en los tejidos de ratas después de la administración intravenosa repetida de 1

En dos estudios combinados, a ratas hembras Wistar (150 hasta 200 g) se les administró una dosis intravenosa individual de 1 (0,03, 0,1 y 0,3 mg/kg en un volumen de dosis de 1,0 ml/kg). El vehículo fue ácido ascórbico al 0,1%/etanol al 2%/solución salina al 98% (0,9%). Las muestras de tejido se extrajeron del hígado y el cerebro a 1,0, 24 y 48 horas después de la administración para la evaluación de la actividad de la proteasoma 20S.

Hubo un incremento en relación a la dosis significativa (p<0,05) en la actividad de la proteasoma 20S en el hígado de las ratas 1,0 horas después de la administración intravenosa de 1. Veinticuatro horas después de la administración, las disminuciones con relación a las dosis en la actividad de la proteasoma 20S fueron más bajas, pero permaneció significativa (p>0,05) en los grupos de dosis superiores, 0,3 mg/kg. 48 horas después de la administración, la actividad de la proteasoma 20S en el hígado de las ratas ha vuelto a la línea base. La extensión de la inhibición de la proteasoma 20S en el hígado, regresó a los niveles de la línea base más rápido que los observados para las células blancas de la sangre periférica. No se observó inhibición de la proteasoma 20S en el tejido del cerebro, reflejando la carencia de penetración de 1 en este tejido.

En un tercer estudio, ratas Sprague-Dawley macho (250 hasta 450 g) se administraron a una dosis intravenosa individual de 1 (0,1 y 0,3 mg/kg en un volumen de dosis de 1,0 ml/kg). El vehículo fue ácido ascórbico al 0,1%/etanol al 2%/solución salina al 98% (0,9%). Las muestras de tejido y de sangre se extrajeron 1,0 horas después de la administración para la evaluación de la actividad de la proteasoma 20S. Los tejidos extraídos fueron el cerebro, colon, hígado músculo (gastrocnemio), próstata y testículos.

Las disminuciones relacionadas con la dosis significativas (p<0,05) en la actividad de la proteasoma 20S se observaron en las células blancas de la sangre periférica, colon, hígado, músculo (gastrocnemio), y próstata a 1,0 horas después de la administración intravenosa de 1. No se apreció inhibición de la proteasoma 20S en el cerebro y el testículo, reflejando la carencia de la penetración de 1 en estos tejidos.

La inhibición de la proteasoma 20S en los tejidos 1,0 horas después de la administración de la dosis intravenosa, excepto para el cerebro y los testículos, fue similar a la observada para las células blancas de la sangre periférica.

Actividad de la proteasoma 20S ex vivo determinada en primates después de la administración intravenosa individual de 1

Monos cinomolgus macho y hembra (2,2 hasta 3,5 kg) se asignaron a cuatro grupos (5/sexo/grupo). Cada grupo recibió 0 (control de vehículo), 0,045, 0,067 ó 0,100 mg/kg/dosis de 1 como una inyección intravenosa individual en un volumen de dosis de 0,3 ml/kg dos veces semanalmente durante 4 semanas (días 1, 5, 8, 12, 15, 19, 22 y 26). El vehículo fue ácido ascórbico al 0,1%/etanol al 2%/solución salina al 98% (0,9%). Tres machos del control, grupos de dosis baja y media, dos machos de dosis altas y tres hembras/grupo, se sacrificaron al final del tratamiento el día 27. Se designaron dos animales/sexo/grupo como animales recuperados y recibieron tratamiento durante 4 semanas seguido por 2 semanas de recuperación; se sacrificaron el día 41.

Se extrajo la sangre para la determinación de la actividad de la proteasoma 20S antes del tratamiento, 1,0 hora después de la dosificación los días 1, 8, 15 y 22 y 1,0 hora antes de la dosificación los días 5, 12, 19 y 26; y en los días 31, 34, 38 y 41 (animales recuperados sacrificados). La sangre también se extrajo para la determinación de la actividad de la proteasoma 20S a partir de los machos de dosis altas antes de ser sacrificados en condición moribunda al día 26 después de recibir 8 dosis.

La determinación de la actividad de la proteasoma 20S en células blancas de la sangre 1,0 hora después de la dosificación, reveló una disminución significativa y relacionada con la dosis en la actividad enzimática que se ha recuperado durante 72 horas, antes de la dosis subsecuente (figuras 9 y 10). El animal moribundo presentó baja actividad de la proteasoma 20S residual en sus células blancas de la sangre en el sacrificio en el día 26.

Estos datos soportan un régimen de tratamiento dos veces por semana para 1, puesto que los niveles de la proteasoma 20S se recuperan entre las dosis.

Ejemplo 10 Efecto de ácido borónico de N-(pirazin)carbonil-L-fenilalanina-L-leucina (1) en las actividades quimiotrípticas y trípticas de la proteasoma 20S purificada a partir de reticulocitos de conejos

La proteasoma 20S se purificó a partir de reticulocitos de conejos según los procedimientos publicados (McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998)). Los ensayos quimiotrípticos y trípticos se realizaron como se describe en los ejemplos 3 y 5 a concentraciones incrementadas del inhibidor de la proteasoma 1. Los datos están representados en la figura 11.

Ejemplo 11 Correlación del porcentaje de inhibición y proporción entre la actividad quimiotríptica y la actividad tríptica en proteasoma 20S purificada a partir de reticulocitos de conejos

La proteasoma 20S purificada a partir de reticulocitos de conejos según los procedimientos publicados (McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998)). Los ensayos quimiotrípticos y trípticos se realizaron como se describe en los ejemplos 3 y 5 a concentraciones incrementadas del inhibidor de la proteasoma 1. Los datos se fijaron a v_{c}/v_{t} = k_{c}/\kappa_{t}*(1-f)/(1-f+\beta_{t}*f), en la que \kappa_{c}/\kappa_{t} = 2,88\pm0,03, \beta_{t} = 1,38\pm0,05, y %I = f*100 (figura 12).

Ejemplo 12 Correlación del porcentaje de inhibición y proporción entre la actividad quimiotríptica y la actividad tríptica en lisados de células blancas de la sangre en ratas

Los ensayos quimiotrípticos y trípticos se realizaron como se describe en los ejemplos 3 y 5 a concentraciones incrementadas del inhibidor de la proteasoma 1. Los datos se fijaron como en el ejemplo 10, para dar \kappa_{c}/\kappa_{t} = 17,6 y \beta_{t} = 1,1\pm0,2 (figura 13).

Claims (35)

1. Procedimiento para controlar la acción del fármaco farmacodinámico de un inhibidor de proteasoma en un mamífero, caracterizado porque comprende la medición de la actividad de la proteasoma en una muestra o muestras biológicas de prueba que han sido obtenidas de un mamífero una o más veces especificadas después de administrar el inhibidor de la proteasoma; la determinación de la cantidad de actividad de la proteasoma en la muestra o muestras biológicas de prueba; y la comparación de la cantidad de actividad de la proteasoma en la muestra biológica con la de una muestra biológica de referencia obtenida de un mamífero al cual no se le ha administrado el inhibidor de la proteasoma.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra se selecciona de entre el grupo que consiste en muestras de sangre, orina, órgano y de tejidos.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra biológica se selecciona de entre el grupo que consiste en biopsias de tumor, biopsias de piel, biopsias de colon, fluido sinovial, fluido bronquial, células musculares, células de la sangre y precursores de las células en la sangre.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la muestra biológica es una muestra de sangre.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la muestra de sangre es un lisado de células blancas de la sangre.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la muestra de sangre es un lisado de células de la sangre completa.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el mamífero se selecciona de entre el grupo que consiste en ratas, ratones, primates no humanos, y humanos.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el mamífero es un humano.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la actividad de la proteasoma se mide mediante el ensayo de la proporción de la proteólisis en presencia de un activador de la proteasoma 20S.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el activador es el SDS.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la muestra biológica es un lisado de células blancas de la sangre, y el SDS está presente en una concentración de aproximadamente 0,035%.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la muestra biológica es un lisado de células blancas de la sangre, y el SDS está presente en una concentración de aproximadamente 0,05%.

13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se ensaya la actividad quimiotríptica.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se ensaya la actividad tríptica.

15. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la actividad de la proteasoma en la muestra biológica y la actividad de la proteasoma en la muestra de referencia son normalizadas separadamente en relación a la concentración de la proteína.

16. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la actividad de la proteasoma en la muestra biológica y la actividad de la proteasoma en la muestra de referencia son normalizadas separadamente con relación al recuento celular.

17. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la actividad de la proteasoma en la muestra biológica y la actividad de la proteasoma en la muestra de referencia son determinadas separadamente como una proporción entre una primera actividad de la peptidasa de la proteasoma y una segunda actividad de la peptidasa de la proteasoma.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la primera actividad de la peptidasa es la actividad quimiotríptica y la segunda actividad de la peptidasa es la actividad tríptica.

19. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de la proteasoma se selecciona de entre el grupo que consiste en aldehídos peptidilos, sulfonas de vinilo, epoxicetonas, ácidos borónicos peptidilos y análogos de lactacistina.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el inhibidor de la proteasoma es un ácido borónico de peptidilo.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el ácido borónico de peptidilo se selecciona de entre el grupo que consiste en:

ácido borónico de N-acetil-L-leucina-\beta-(1-naftil)-L-alanina-L-leucina;

ácido borónico de N-(8-quinolin)sulfonil-\beta-(1-naftil)-L-alanina-L-leucina;

ácido borónico de N-(pirazin)carbonil-L-fenilalanina-L-leucina;

ácido borónico de \beta-(1-naftil)-L-alanina-L-leucina; y

ácido borónico de N-(4-morfolin)carbonil-[O-(2-piridilmetil)]-L-tirosina-L-leucina.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el ácido borónico de peptidilo es el ácido borónico de N-(pirazin)carbonil-L-fenilalanina-L-leucina.

23. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el inhibidor de la proteasoma es un análogo de lactacistina.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que el análogo de lactacistina se selecciona de entre el grupo que consiste en lactacistina, \beta-lactona de clasto-lactacistina, \beta-lactona de 7-etil-clasto-lactacistina y \beta-lactona de 7-n-propil-clasto-lactacistina.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que el análogo de lactacistina es \beta-lactona de 7-n-propil-clasto-lactacistina.

26. Procedimiento para la determinación del régimen de dosis para un inhibidor de la proteasoma, que comprende la medición de la actividad de la proteasoma en la muestra o muestras biológicas de prueba de un mamífero, en el que la muestra o las muestras biológicas se seleccionan a partir del grupo que consiste en muestras de sangre, orina, órgano y tejido; la determinación de la cantidad de actividad de la proteasoma en la muestra o muestras biológicas de prueba; y la selección de una cantidad de dosis y frecuencia de dosis del inhibidor de la proteasoma a ser administrado en el futuro a un mamífero que padece una enfermedad o una condición patológica.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, caracterizado porque el mamífero sufre una enfermedad o condición patológica.

28. Procedimiento según la reivindicación 26, caracterizado porque comprende además la comparación de la cantidad de la actividad de proteasoma en una muestra biológica obtenida a partir del mamífero con la cantidad de actividad de proteasoma en una muestra biológica de referencia obtenida a partir de un mamífero sin la enfermedad o condición patológica.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, caracterizado porque los datos de la actividad de la proteasoma para la muestra biológica obtenida a partir del mamífero que sufre una enfermedad o condición patológica, se combinan con los datos obtenidos para las muestras biológicas obtenidas a partir de otros mamíferos que sufren de la misma condición o enfermedad antes de comparar los datos de la actividad de la proteasoma para la muestra biológica de referencia.

30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, caracterizado porque el mamífero es un humano.

31. Procedimiento según la reivindicación 26, caracterizado porque al mamífero se le ha administrado un fármaco.

32. Procedimiento según la reivindicación 31, caracterizado porque el fármaco no es un inhibidor de la proteasoma.

33. Procedimiento según la reivindicación 31, caracterizado porque los datos de la actividad de la proteasoma para la muestra biológica obtenida del mamífero al que se le ha administrado un fármaco, se combinan con los datos obtenidos para las muestras biológicas obtenidas a partir de otros mamíferos a los que se les ha administrado el fármaco antes de comparar los datos de la actividad de la proteasoma para la muestra biológica de referencia.

34. Procedimiento según la reivindicación 31, caracterizado porque comprende además la determinación de una cantidad de dosis y frecuencia de dosis de un inhibidor de proteasoma a ser administrado a un mamífero al que se le ha administrado el fármaco.

35. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, caracterizado porque el mamífero es un humano.