ES2226801T3 - Colorantes de 4,7-dicloro-rodamina utilies como sondas moleculares. - Google Patents
Colorantes de 4,7-dicloro-rodamina utilies como sondas moleculares.Info
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Abstract
Compuesto que tiene la fórmula: en la que: R7-R10, R12-R16 y R18 considerados por separado se seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno, flúor, cloro, metilo, etilo, alquilo C1-8, alqueno C2-8, alquino C2-8, cicloalquilo, fenilo, arilo, sulfonato, sulfona, amino, amido, nitrilo, alcoxi C1-8, grupo de unión y combinaciones de los mismos y/o R7 y R8 y/o R13 y R14 considerados conjuntamente se seleccionan de entre el grupo que consta de oxígeno, azufre, iminio y alquiliminio; R11 y R17 considerados por separado se seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno, alquilo C1-8, sulfonato de alquilo, carboxilato de alquilo, alqueno C2-8, alquino C2-8, cicloalquilo, fenilo, arilo, grupo de unión y combinaciones de los mismos; y X1-X3 considerados por separado se seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno, cloro, flúor, alquilo C1-8, amina, amida, carboxilato, sulfonato, hidroximetilo y los grupos de unión.
Description
Colorantes de
4,7-dicloro-rodamina útiles como
sondas moleculares.
La presente invención se refiere en general a
compuestos colorantes fluorescentes útiles como sondas moleculares.
Más específicamente, esta invención se refiere a colorantes de
4,7-dicloro-rodamina útiles como
reactivos fluorescentes de marcado.
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La detección no radioactiva de analitos
biológicos es una tecnología importante en la moderna biotecnología
analítica. Al eliminar la necesidad de marcadores radioactivos, se
aumenta la seguridad y se reduce en gran medida el impacto
medioambiental del vertido de reactivos, dando como resultado
menores costes de análisis. Ejemplos de los procedimientos que
utilizan dichos procedimientos de detección no radioactivos
incluyen el secuenciado del ADN, los procedimientos de sonda de
oligonucleótido, la detección de productos de la reacción en cadena
de polimerasa, inmunoanálisis y similares.
En muchas aplicaciones se necesita la detección
independiente de analitos múltiples que se solapan espacialmente en
una mezcla, p. ej., los análisis con sonda de ADN múltiple de un
solo tubo, inmunoanálisis, los procedimientos de secuenciado
multicolor de ADN y similares. En el caso de los análisis
poli-locus con sonda de ADN, al proporcionar
detección multicolor, se puede reducir el número de tubos de
reacción simplificando de este modo los protocolos experimentales y
facilitando la preparación de kits específicos de la aplicación. En
el caso del secuenciado de ADN automatizado, el marcado multicolor
permite el análisis de las cuatro bases en una sola banda aumentando
de este modo el rendimiento sobre los procedimientos de un solo
color y eliminando las incertidumbres asociadas a las variaciones
de movilidad electroforética entre bandas.
La detección múltiple impone numerosas
limitaciones severas en la selección de los colorantes marcadores,
particularmente para análisis que requieren una separación
electroforética y para el tratamiento con enzimas, p. ej., el
secuenciado de ADN. En primer lugar es difícil hallar un conjunto de
colorantes cuyos espectros de emisión se resuelvan espectralmente,
ya que la profundidad media de la banda de emisión típica para los
colorantes fluorescentes orgánicos es aproximadamente de 40 a 80
nanómetros (nm) y la anchura del espectro disponible está limitada
por el foco de luz de excitación. En segundo lugar, incluso si se
encuentran colorantes con espectros de emisión no solapantes, el
conjunto puede que todavía no sea adecuado si las eficacias
fluorescentes respectivas son demasiado bajas. Por ejemplo, en el
caso del secuenciado del ADN, el aumento de la cantidad de muestra
no puede compensarse por las bajas eficacias de fluorescencia
(Pringle). En tercer lugar, cuando se utilizan simultáneamente
varios colorantes fluorescentes, la excitación simultánea se hace
difícil porque las bandas de absorción de los colorantes se separan
ampliamente. En cuarto lugar, la carga, el tamaño molecular y la
conformación de los colorantes puede que no afecte
desfavorablemente a las movilidades electroforéticas de los
fragmentos. Por último, los colorantes fluorescentes pueden ser
compatibles con la química utilizada para crear o manipular los
fragmentos, p. ej., disolventes y reactivos de síntesis de ADN,
tampones, enzimas de polimerasa, enzimas de ligasa y similares.
Debido a estas severas limitaciones, se ha
observado que solamente se pueden utilizar unos pocos conjuntos de
colorantes fluorescentes en aplicaciones multicolores,
particularmente en el área del secuenciado del ADN de cuatro
colores (Smith 1992, 1995; Prober; Connell).
Una clase de colorantes fluorescentes
particularmente útil en las aplicaciones multicolores son los
colorantes de rodamina, p. ej., tetrametil-rodamina
(TAMRA), rodamina X (ROX), rodamina 6G (R6G), rodamina 110 (R110) y
similares (Bergot). Los colorantes de rodamina son particularmente
atractivos en comparación con los colorantes de fluoresceína porque
(1) las rodaminas son normalmente más fotoestables que las
fluoresceínas, (2) los didesoxinucleótidos marcados con rodamina
son mejores sustratos para las enzimas polimerasas termoestables y
(3) los espectros de emisión de los colorantes de rodamina son
significativamente en el rojo (mayor longitud de onda) de las
fluoresceínas.
Sin embargo, un inconveniente importante de los
colorantes de rodamina disponibles actualmente en el contexto de
los procedimientos de detección múltiples es el espectro
relativamente ancho de dichos colorantes. Este espectro de emisión
ancho produce resolución espectral entre los colorantes
espectralmente próximos dificultando de este modo el análisis de
multicomponentes de dichas combinaciones de colorante. Un segundo
inconveniente de los colorantes de rodamina disponibles actualmente
es que su espectro de absorción no es compatible con la longitud de
onda de los láseres de diodo verde de doble frecuencia en estado
sólido disponibles actualmente, p. ej. los láseres YAG de neodimio
en estado sólido, que tienen una línea de emisión a aproximadamente
532 nm. Presenta muchas ventajas la utilización de dichos láseres
debido a su tamaño compacto, vida útil prolongada y utilización
eficaz de la potencia.
La presente invención se refiere al presente
descubrimiento de una clase de colorantes de
4,7-dicloro-rodamina útiles como
sondas moleculares.
Un objetivo de la invención consiste en
proporcionar una clase de colorantes de rodamina que tenga
espectros de emisión que sean sustancialmente más próximos que los
colorantes de rodamina disponibles actualmente.
Otro objetivo de la invención consiste en
proporcionar una clase de colorantes de rodamina que tiene un
espectro de absorción desplazado hacia el rojo en comparación con
los colorantes de rodamina existentes.
En un primer aspecto, los objetivos anteriores y
otros objetivos de la invención se alcanzan mediante un compuesto
que tiene la fórmula:
En un segundo aspecto, la invención incluye un
nucleósido/nucleótido marcado que tiene la fórmula:
En un tercer aspecto, la invención incluye un
polinucleótido marcado que contiene un nucleótido que tiene la
fórmula:
El enlace que une a B y D está conectado a D en
una de las posiciones R_{7}-R_{18} o
X_{1}-X_{3}. Preferentemente, el enlace que une
B y D está conectado a D en una de las posiciones X_{2} o
X_{3}. En una forma de realización particularmente preferida, el
enlace es
--- C\equivC
--- CH_{2} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---
Si B es una purina, el enlace está unido a la
posición 8 de la purina. Si B es 7-deazapurina, el
enlace está conectado a la posición 7 de la
7-deazapurina. Si B es pirimidina, el enlace está
conectado a la posición 5 de la pirimidina.
Estos y otros aspectos, objetivos,
características y ventajas de la presente invención se pondrán más
claramente de manifiesto haciendo referencia a la siguiente
descripción, dibujos y reivindicaciones adjuntas.
A continuación se hará referencia con detalle a
las formas de realización preferidas de la invención. Aunque la
invención se describirá conjuntamente con las formas de realización
preferidas debe entenderse que éstas no pretenden limitar la
invención a sus formas de realización. Por el contrario, la
invención pretende abarcar las alternativas, modificaciones y
equivalentes, que puedan incluirse en la invención tal como se
define en las reivindicaciones adjuntas.
En general, la presente invención comprende una
nueva clase de compuestos de
4,7-dicloro-rodamina útiles como
colorantes fluorescentes y reactivos que empleen dichos colorantes
como marcadores moleculares. Los componentes de la presente
invención encuentran particular aplicación en el área del
secuenciado multicolor fluorescente del ADN y en los análisis de
los fragmentos.
La invención se basa en parte en el
descubrimiento de que las propiedades fluorescentes de los
colorantes de 4,7-dicloro-rodaminas
y relacionados son muy favorables para su utilización como sondas
moleculares. Sus anchuras de banda de emisión son generalmente 20 a
30 por ciento más estrechas que las de los análogos que carecen de
derivados de 4,7-dicloro, y, sus máximos de emisión
y absorción son generalmente a longitudes de onda de
aproximadamente 10 a 30 nm mayores que las de los análogos que
carecen de los derivados de 4,7-dicloro.
A menos que se indique de otro modo, los
siguientes términos y expresiones utilizados en esta memoria están
destinados a tener los siguientes significados:
"Grupo de unión" (L) se refiere a una
funcionalidad capaz de reaccionar con una "funcionalidad
complementaria" unida a un reactivo, formando dicha reacción un
"enlace" que conecta un colorante con un reactivo. El grupo de
unión determinado utilizado depende de la naturaleza de la
funcionalidad complementaria y del tipo de enlace deseado. En
algunos casos, el grupo de unión se puede activar antes de la
reacción con una funcionalidad complementaria, p. ej., la
activación de un grupo de unión carboxilato con
diciclohexilcarbodiimida y N-hidroxisuccinimida
para formar un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS).
Preferentemente, siempre que la funcionalidad complementaria es una
amina, el grupo de unión de la invención es isotiocianato,
isocianato, acil azida, éster de NHS, cloruro de sulfonilo,
aldehído o glioxal, epóxido, carbonato, haluro de arilo,
imidoéster, carbodiimida, anhídrido,
4,6-diclorotriazinilamina u otros carboxilatos
activos. Preferentemente, siempre que la funcionalidad
complementaria es sulfhidrilo, el grupo de unión es haloacetilo,
haluro de alquilo, maleimida, aziridina, acriloílo o agente de
arilación, p. ej., fluorobenceno y similares. Cuando la
funcionalidad complementaria es carboxilato, el grupo de unión es
preferentemente diazoalano, diazoacetilo, carbonildiimidazol y
carbodiimida (Hermanson). En una forma de realización
particularmente preferida, el grupo de unión es un éster de NHS
activado que reacciona con una funcionalidad complementaria de
amina, en la que al formar el éster de NHS activado, un colorante
de la invención incluyendo un grupo de unión de carboxilato se hace
reaccionar con diciclohexilcarbodiimida y
N-hidroxisuccinimida (Khanna; Kasai). La Tabla 1
siguiente presenta un muestreo de grupos de unión representativos
junto con funcionalidades complementarias compatibles y los enlaces
resultantes.
El término "alquil inferior" indica
hidrocarburos de cadena lineal y ramificada que contienen de 1 a 8
átomos de carbono, es decir, metilo, etilo, propilo, isopropilo,
tert-butilo, isobutilo, sec-butilo,
neopentilo, tert-pentilo y similares.
El término "propano" en particular se
refiere al grupo -CH_{2}CH_{2}CH_{2}-.
"Cicloalquilo" se refiere a grupos de
hidrocarburo que forman anillos, p. ej. ciclohexilo y ciclopentilo.
Los átomos de nitrógeno con sustituyentes cicloalquilo pueden
formar aziridinilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo,
anillos mayores y formas sustituidas de los mismos.
"Alquilo inferior sustituido" indica un
alquilo inferior que incluye sustituyentes que ceden electrones,
tales como halo, ciano, nitro, sulfo y similares.
"Haloalquilo inferior" indica un alquilo
inferior sustituido con uno o más sustituyentes con átomo de
halógeno, normalmente flúor, cloro, bromo o yodo.
"Alqueno inferior" indica un alquilo
inferior o un alquilo inferior sustituido en el que uno o más de
los enlaces carbono-carbono es un doble enlace.
"Alquino inferior" indica un alquilo
inferior o un alquilo inferior sustituido en el que uno o más de
los enlaces carbono-carbono es un triple
enlace.
"Alcoxi inferior" se refiere a un grupo que
incluye un alquilo inferior unido por un enlace sencillo a un átomo
de oxígeno.
"Arilo" se refiere a un fenil sencillo o
múltiple o fenil sustituido, p. ej., benceno, naftaleno, antraceno,
bifenilo y similares.
El término "nucleósido" se refiere a un
compuesto constituido por una base de nucleósido de purina,
azapurina o pirimidina, p. ej., adenina, guanina, citosina,
uracilo, timina, deazaadenina, deazaguanosina y similares, unida a
una pentosa en la posición 1', incluyendo las formas
2'-desoxi y 2'-hidroxilo (Stryer).
El término "nucleótido" utilizado en esta memoria se refiere a
un éster de fosfato de un nucleósido, p. ej. ésteres de trifosfato,
en el que el punto más común de esterificación es el grupo
hidroxilo unido a la posición C-5 de la pentosa.
Muchas veces en la presente descripción el término nucleósido estará
destinado a incluir tanto nucleósidos como nucleótidos.
"Análogos" en referencia a los nucleósidos
incluyen los análogos sintéticos que tienen grupos de la base
modificados, grupos del azúcar modificados y/o grupos del éster de
fosfato modificados, p. ej., como se describe en otras partes
(Scheit; Eckstein). El término "nucleósido marcado" se refiere
a los nucleósidos que están unidos por enlaces covalentes a los
colorantes 4,7-dicloro-rodamina de
la invención.
Tal como se utilizan en esta memoria, los
términos "polinucleótido" o "oligonucleótido" se refieren
a polímeros lineales de monómeros de nucleótido naturales o a sus
análogos, incluyendo los desoxirribonucleótidos de una sola cadena,
los ribonucleótidos, las formas \alpha-anoméricas
de los mismos y similares. Normalmente, los monómeros de nucleósido
están unidos por enlaces fosfodiéster, en los que tal como se
utiliza en esta memoria, el término "enlace fosfodiéster" se
refiere a los enlaces fosfodiéster o a los análogos de los mismos
que incluyen fosforotioato, fosforoditionato, fosforoselenoato,
fosforodiselenoato, fosforoanilotionato, fosforanilidato,
fosforamidato y similares, incluyendo los contraiones asociados, p.
ej., H^{+}, NH_{4}^{+}, Na^{+} y similares si dichos
contraiones están presentes. Los polinucleótidos oscilan
normalmente de tamaño desde unas pocas unidades monoméricas, p. ej.
de 8 a 40, hasta varios miles de unidades monoméricas. Siempre que
un polinucleótido está representado por una secuencia de letras, tal
como "ATGCCTG", se entiende que los nucleótidos están en el
orden 5'\rightarrow3' de izquierda a derecha y que "A"
indica desoxiadenosina, "C" indica desoxicitidina, "G"
indica desoxiguanosina y "T" indica desoxitimidina, a menos que
se indique de otra manera.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término
"resolución espectral" referido a un conjunto de colorantes
significa que los espectros de emisión fluorescente de los
colorantes son suficientemente distintos, es decir, suficientemente
no solapantes, de los reactivos a los cuales están unidos los
colorantes respectivos, p. ej., polinucleótidos, se pueden
distinguir basándose en la señal fluorescente generada por los
respectivos colorantes utilizando sistemas de fotodetección
normales, p. ej., empleando un sistema de filtros de paso de banda
y tubos multiplicadores, un dispositivo acoplado con carga
juntamente con un espectrógrafo, o similares, tal como se
ejemplifica con los sistemas descritos en otras partes
(Hunkapiller; Wheeless).
El término "sustituido" tal como se utiliza
en esta memoria se refiere a una molécula en la que uno o más
átomos de hidrógeno están sustituidos con uno o más átomos
distintos del hidrógeno, grupos funcionales o grupos. Por ejemplo,
un nitrógeno no sustituido es -NH_{2}, mientras que un nitrógeno
sustituido es -NHCH_{3}. Ejemplos de sustituyentes incluyen pero
no se limitan a halo, p. ej., flúor y cloro, alquilo inferior,
alqueno inferior, alquino inferior, sulfato, sulfonato, sulfona,
amino, amonio, amido, nitrilo, alcoxi inferior, fenoxi, aromáticos,
fenilo, aromáticos policíclicos, heterociclos y grupos de unión.
En un primer aspecto, la presente invención
comprende una nueva clase de compuestos colorantes de
4,7-dicloro-rodamina que tienen la
estructura general mostrada a continuación como Fórmula VI.
(Obsérvese que todas las estructuras moleculares proporcionadas en
toda la exposición están destinadas a abarcar no sólo la estructura
electrónica exacta, sino también a incluir todas las estructuras
resonantes, enantiómeros, diastereoisómeros y los estados de
protonación de los mismos).
\newpage
Fórmula
VI
En la Fórmula VI,
R_{7}-R_{10}, R_{12}-R_{16}
y R_{18} pueden ser hidrógeno, flúor, cloro, metilo, etilo,
alquilo inferior, alqueno inferior, alquino inferior, cicloalquilo,
fenilo, arilo, sulfonato, sulfona, amino, amido, nitrilo, alcoxi
inferior, grupo de unión o combinaciones de los mismos.
Preferentemente, R_{7}-R_{10} y
R_{13}-R_{16} son hidrógeno, metilo o etilo.
R_{7} y R_{8} y/o R_{13} y R_{14}, considerados
conjuntamente pueden ser oxígeno (=O), azufre (=S), iminio (=NH),
alquiliminio (=NR). R_{11} y R_{17} pueden ser hidrógeno,
alquilo inferior, sulfonato de alquilo, carboxilato de alquilo,
alqueno inferior, alquino inferior, cicloalquilo, fenilo, arilo,
grupo de unión o sus combinaciones. Preferentemente R_{11} y
R_{17} son metilo o fenilo. X_{1}-X_{3}
considerados independientemente son hidrógeno, cloro, flúor,
alquilo inferior, amina, amida, carboxilato, ácido sulfónico
(sulfonato), hidroximetilo (-CH_{2}OH), y grupos de unión.
Preferentemente, X_{1} es carboxilato y X_{2} y X_{3}
considerados independientemente son hidrógeno o un grupo de unión.
Determinadas formas de realización preferidas son cuando R_{7},
R_{8}, R_{10}, R_{13}, R_{14} y R_{16} son hidrógeno o
metilo, R_{9} y R_{15} son hidrógeno, R_{11} y R_{17} son
metilo o fenilo y R_{12} y R_{18} son hidrógeno.
En otro aspecto, la presente invención comprende
reactivos marcados con los compuestos colorantes de
4,7-dicloro-rodamina de Fórmula VI.
Los reactivos de la invención pueden ser todos los que se puedan
unir a los colorantes de la invención. Preferentemente los
colorantes se unen por enlace covalente al reactivo directamente o
mediante un enlace. Los ejemplos de reactivos incluyen proteínas,
polipéptidos, polisacáridos, nucleótidos, nucleósidos,
polinucleótidos, lípidos, soportes sólidos, polímeros orgánicos e
inorgánicos y combinaciones y montajes de los mismos, tales como
cromosomas, núcleos, células vivas, tales como bacterias, otros
microorganismos, células de mamíferos, tejidos, glucoproteínas y
similares.
Una clase preferida de reactivos de la presente
invención comprende nucleótidos y nucleósidos que incorporan los
colorantes de 4,7-dicloro-rodamina
de la invención. Dichos reactivos del lado del nucleótido son
particularmente útiles en el contexto de los polinucleótidos de
marcado formados por la síntesis enzimática, p. ej., los
trifosfatos de nucleótido utilizados en el contexto de la
amplificación por PCR, el secuenciado del polinucleótido de tipo
Sanger y las reacciones de traducción en la hendidura.
Los reactivos de la parte del nucleótido
preferidos de la presente invención se presentan a continuación en
la Fórmula VII
Fórmula
VII
en la
que
B es una base de nucleótido; una base de
nucleótido de 7-deazapurina, purina o pirimidina,
análogos de las mismas y preferentemente uracilo, citosina,
deazaadenina o deazaguanosina. D es el colorante de
4,7-dicloro-rodamina de la
invención. W_{1} y W_{2} considerados por separado son H u OH.
W_{3} es OH, OPO_{3}, OP_{2}O_{6}, OP_{3}O_{9},
incluyendo los análogos de los mismos, p. ej., fosforotioato,
fosforoanilidato, fosforoanilotioato, fosforoamidiato y otros como
análogos de fosfato, incluyendo los contraaniones asociados si
están presentes, p. ej., H^{+}, Na^{+}, NH_{4}^{+} y
similares. En una forma de realización preferida, W_{1} es H,
W_{2} es OH y W_{3} es OP_{3}O_{9}. En una segunda forma de
realización preferida, W_{1} y W_{2} son H y W_{3} es
OP_{3}O_{9}. Cuando B es purina o
7-deazapurina, el grupo azúcar está unido en la
posición N^{9} de la purina o deazapurina y cuando B es
pirimidina, el grupo azúcar está unido en la posición N^{1} de la
pirimidina. El enlace que une B y D está conectado a D en una de
las posiciones R_{7}-R_{18} o
X_{1}-X_{3}.
Preferentemente, el enlace está conectado a uno
de X_{2} o X_{3}. Preferentemente, cuando B es una purina, el
enlace que une B y D está conectado en la posición 8 de la purina,
cuando B es 7-deazapurina, el enlace está conectado
a la posición 7 de la 7-deazapurina y cuando B es
pirimidina, el enlace está conectado a la posición 5 de la
pirimidina.
En una forma de realización particularmente
preferida, los nucleótidos de la presente invención son trifosfatos
de didesoxinucleótido que tienen la estructura mostrada a
continuación en la Fórmula VIII, incluyendo los contraiones
asociados si están presentes.
Fórmula
VIII
Los didesoxinucleótidos marcados tal como los
mostrados en la Fórmula VIII encuentran particular aplicación como
agentes de terminación, o "terminadores", en los
procedimientos de secuenciado del ADN de tipo Sanger (Sanger).
En una segunda forma de realización
particularmente preferida, los nucleótidos de la presente invención
son trifosfato de desoxinucleótido que tienen la estructura
mostrada en la Fórmula IX a continuación, incluyendo los
contraiones asociados si están presentes.
Fórmula
IX
Los desoxinucleótidos marcados tal como los
mostrados en la Fórmula IX hallan particular aplicación como medio
para marcar los productos de ampliación de la polimerasa, p. ej., en
la reacción en cadena de polimerasa (Mullis).
El marcado de la parte del nucleótido se puede
realizar utilizando cualquiera de las numerosas técnicas de marcado
de la tendencia del nucleósido utilizando grupos de unión
conocidos, y funcionalidades complementarias asociadas para formar
enlaces. Véase lo anterior para una exposición de los grupos de
unión preferidos. El enlace que une el colorante y el nucleósido
debería (i) no interferir con la hibridación
oligonucleótido-diana, (ii) ser compatible con
enzimas apropiadas, p. ej., polimerasas, ligasas y similares y (iii)
no extinguir la fluorescencia del colorante.
En una forma de realización preferida, los
colorantes de la invención se unen por enlace covalente al carbono
5 de las bases de pirimidina o al carbono 7 de las bases de
7-deazapurina. Se han descrito varios procedimientos
de marcado de bases adecuados que se pueden utilizar en la
invención. (Gibson; Gebeyehu; Haralambidis; Nelson 1992a; Nelson
1992b; Bergstrom; Fung 1988; Ward; Woo).
Preferentemente, los enlaces son enlaces
amidoacetilénicos o amidoalquénicos, formándose el enlace entre el
colorante y la base de nucleótido al reaccionar un éster de NHS
activado del colorante con una base de un nucleótido derivada de
alquinilamino o de alquenilamino. Más preferentemente, el enlace
resultante es
3-(carboxi)amino-1-propinilo
o
3-amino-1-propin-1-ilo
(Fórmula X.1). A continuación se presentan varios enlaces
preferidos para unir los colorantes de la invención a una base de
nucleósido como Fórmulas X.1-6 (Khan).
Fórmula
X.1
--- C\equivC
--- CH_{2} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---
Fórmula
X.2
--- C\equivC
--- CH_{2} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} ---
(CH_{2})_{5} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---
Fórmula
X.3
--- C=CH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} --- NH ---
(CH_{2})_{5} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---
Fórmula
X.4
--- C\equivC
--- CH_{2}OCH_{2}CH_{2}NH
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---
Fórmula
X.5
--- C\equivC
---
CH_{2}OCH_{2}CH_{2}OCH_{2}CH_{2}NH
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---
Fórmula
X.6
La síntesis de los nucleósidos derivados de
alquinilamino está descrita por Hobbs 1989, 1992. En resumen, los
nucleótidos derivados de alquinilamino se forman colocando el
halodidesoxinucleósido apropiado (normalmente didesoxinucleósidos
de 5-yodopirimidina y de
7-yodo-7-deazapurina)
y Cu(I) en un matraz, arrastrando con argón para eliminar el
aire, añadiendo DMF anhidra, seguido de adición de una
alquinilamina, trietilamina y Pd^{0}. La mezcla de reacción se
agita durante varias horas, o hasta que la cromatografía en capa
fina indique el consumo de halodidesoxinucleósido. Cuando se utiliza
una alquilamina no protegida, se puede aislar el nucleósido de
alquinilamino concentrando la mezcla de reacción y cromatografiando
en gel de sílice utilizando un disolvente de elución que contiene
hidróxido de amonio para neutralizar el hidrohaluro generado en la
reacción de acoplamiento. Cuando se utiliza una alquilamina
protegida, se puede añadir metanol/cloruro de metileno a la mezcla
de reacción, seguido de la forma bicarbonato de una resina de
intercambio iónico fuertemente básica. A continuación se puede
agitar la suspensión durante aproximadamente 45 minutos, se filtra
y se enjuaga la resina con cloruro de metanol/metileno adicional.
Los filtrados combinados se pueden concentrar y purificar por
cromatografía de flash en gel de sílice utilizando un gradiente de
cloruro de metanol/metileno. Los 5'-trifosfatos se
obtienen por técnicas normales.
Otra clase preferida todavía de reactivos de la
presente invención comprende polinucleótidos marcados con los
colorantes de 4,7-dicloro-rodamina
de la invención. Dichos polinucleótidos marcados son útiles en
numerosos contextos importantes que incluyen como cebadores de
secuenciado de ADN, cebadores de PCR, sondas de hibridación de
oligonucleótido y similares.
Los polinucleótidos de la invención incluyen un
nucleósido o nucleótido que tiene la fórmula:
Fórmula
XI
en la que los sustituyentes
variables y enlaces se definen de la forma siguiente. D es un
compuesto colorante de
4,7-dicloro-rodamina de la presente
invención. B es una base de nucleótido de
7-deazapurina, purina o pirimidina, preferentemente
de uracilo, citosina, deazaadenina o deazaguanosina. Z_{1} es H,
OH u OCH_{3}. Z_{2} es H, OH, OPO_{3}, OP_{2}O_{6},
OP_{3}O_{9}, o Nuc, nucleótido próximo, en el que Nuc y el
nucleósido están unidos por un enlace fosfodiéster o un análogo del
mismo, p. ej., fosforotioato, fosforoanilidato, fosforoanilotioato,
fosforoamidiato y otros análogos de fosfato similares, incluyendo
los contraiones asociados si están presentes, p. ej. H^{+},
Na^{+}, NH_{4}^{+}, estando unido el enlace en la posición 5'
de Nuc. Z_{3} es H, OPO_{2}, incluyendo los análogos de
fosfato, o Nuc, en el que Nuc y el nucleósido o nucleótido conectado
a D están unidos por un enlace fosfodiéster o un análogo del mismo,
estando conectado el enlace a la posición 3' de Nuc, en el que Nuc
se refiere a un nucleósido, nucleótido o polinucleótido. Cuando B
es purina o 7-deazapurina, el grupo azúcar está
unido a la posición N^{9} de la purina o deazapurina y cuando B
es pirimidina, el grupo azúcar está unido a la posición N^{1} de
la pirimidina. B está conectado al grupo azúcar y al compuesto
colorante como se describió anteriormente para el reactivo
nucleótido de la invención. Como se definió, el nucleótido marcado
de Fórmula XI puede ser el nucleótido con terminal 5', el
nucleótido con terminal 3' o cualquier nucleótido interno del
polinucleótido.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido de la presente invención incluye colorantes
múltiples, uno de los cuales al menos es un compuesto colorante de
la invención, situado de modo que la transferencia de energía de
fluorescencia tenga lugar entre un colorante donante y un colorante
aceptor. Dichos polinucleótidos multi-colorantes
encuentran aplicación como sondas espectralmente sintonizables o
como cebadores de secuenciado de ADN (Ju; Lee 1993; Lee 1999).
Los polinucleótidos marcados se pueden sintetizar
bien por vía enzimática, p. ej., utilizando una DNA^{-}
polimerasa o ligasa (Stryer) o por síntesis química, p. ej., por el
método de la fosforamidita, el método del
fosfito-triéster y similares (Gait). Los marcadores
se pueden introducir durante la síntesis enzimática utilizando
monómeros marcados de trifosfato de nucleótido como se describió
anteriormente o se pueden introducir después de la síntesis.
En general, si el polinucleótido marcado se
prepara por síntesis enzimática, se puede utilizar el siguiente
procedimiento. Se desnaturaliza una plantilla de ADN y se hibrida
un cebador de oligonucleótido a la plantilla de ADN. Se añade una
mezcla de trifosfatos de desoxinucleótido y/o de trifosfatos de
didesoxinucleótido a la reacción incluyendo dGTP, dATP, dCTP, ddTTP,
ddCTP, ddATP, ddCTP y ddTTP, en los que al menos una fracción de
uno de por lo menos uno de los desoxinucleótidos y/o
didesoxinucleótidos está marcado con un compuesto colorante de la
invención tal como se describió anteriormente. A continuación, se
añade una enzima polimerasa en condiciones en las que su actividad
de polimerasa esté operativa. Durante la síntesis de la cadena de
polimerasa se forma un polinucleótido marcado por la incorporación
de los desoxinucleótidos y/o didesoxinucleótidos marcados. En un
procedimiento de síntesis enzimático alternativo, se utilizan dos
cebadores en lugar de uno, un cebador complementario de la cadena +
(más) y el otro complementario de la cadena - (menos) de la diana,
la polimerasa es una polimerasa termoestable y la temperatura de
reacción se cicla entre una temperatura de desnaturalización y una
temperatura de extensión, sintetizando exponencialmente de este modo
un complemento marcado para la secuencia objetivo por PCR (Mullis;
Innis).
Después de la síntesis, se puede marcar el
polinucleótido en numerosas posiciones incluyendo el terminal 5'
(Eckstein; Orgel; Smith 1985; Smith 1992); el eje central del
fosfodiéster (Eckstein); o el terminal en 3' (Nelson 1992a; Nelson
1992b; Nelson 1995). Para un estudio completo de los procedimientos
de marcado de oligonucleótidos véase (Steiner).
En un procedimiento preferido de marcado químico
después de la síntesis, se marca un oligonucleótido de la forma
siguiente. Se transforma un colorante que incluye un grupo de unión
carboxilato en el éster de NHS haciéndolo reaccionar con
aproximadamente 1 equivalente de
1,3-diciclohexilcarbodiimida y aproximadamente 3
equivalentes de N-hidroxisuccinimida en acetato de
etilo anhidro durante 3 horas a temperatura ambiente. Se lava la
mezcla de reacción con HCl al 5%, se seca sobre sulfato de
magnesio, se filtra y se concentra hasta un sólido que se vuelve a
poner en suspensión en DMSO. Se añade a continuación la solución
madre de colorante en DMSO en exceso (10-20
\times) a un oligonucleótido derivado de aminohexilo en tampón de
bicarbonato-carbonato 0,25 M a pH 9,4 y se deja
reaccionar durante 6 horas (Fung 1988). Se separa el
oligonucleótido marcado con colorante del colorante sin reaccionar
pasándolo a través de una columna de cromatografía por exclusión de
tamaño eluyendo con tampón, p. ej., acetato de trietilamonio 0,1
molar (TEAA). La fracción que contiene el oligonucleótido marcado
en bruto se purifica después por HPLC en fase inversa empleando
gradiente de elución.
Los colorantes y reactivos de la presente
invención son muy aconsejables para los procedimientos que utilizan
la detección fluorescente, en particular para los procedimientos
que requieren la detección simultánea de analitos múltiples
solapantes. Los colorantes y reactivos de la invención son muy
aconsejables en particular para identificar clases de
polinucleótidos que se han sometido a un procedimiento de
separación bioquímica, tal como la electroforesis, en el que una
serie de bandas o manchas de sustancias objetivo que tienen
propiedades fisioquímicas similares, p. ej., el tamaño, la
conformación, la carga, la hidrofobia o similares, están presentes
en una disposición lineal o plana. Tal como se utiliza en esta
memoria, el término "bandas" incluye cualquier agrupamiento o
acumulación espacial de analitos sobre la base de propiedades
fisioquímicas similares idénticas. Normalmente las bandas aumentan
en la separación de los conjugados
colorante-polinucleótido por electroforesis.
Las clases de polinucleótidos pueden aumentar en
varios contextos. En una categoría preferida de procedimientos
denominados en esta memoria procedimientos de "análisis de
fragmentos" o de "análisis genéticos", se generan fragmentos
de polinucleótido marcados mediante la síntesis enzimática dirigida
a la plantilla utilizando cebadores o nucleótidos marcados, p. ej.,
por ligadura o extensión del cebador dirigida por la polimerasa;
los fragmentos se someten a un proceso de separación en función del
tamaño, p. ej., electroforesis o cromatografía; y, los fragmentos
separados se detectan después de la separación, p. ej., por
fluorescencia producida por láser. En una forma de realización
particularmente preferida, se separan simultáneamente múltiples
clases de polinucleótidos y las diferentes clases se distinguen por
etiquetas resolubles por vía espectral.
Dicho método de análisis de fragmentos conocido
como detección del polimorfismo de la longitud del fragmento
amplificado (AmpFLP) se basa en polimorfismos de longitud del
fragmento amplificado, es decir, polimorfismos de la longitud del
fragmento de restricción que están amplificados por PCR (Vos).
Estos fragmentos amplificados de tamaño variable sirven como
marcadores conectados para los siguientes genes mutantes en todas
las familias. Cuanto más próximo está el fragmento amplificado al
gen mutante en el cromosoma, mayor es la correlación con el enlace.
Debido a que no se han identificado los genes de muchos trastornos
genéticos, estos marcadores de enlace sirven para ayudar a evaluar
el riesgo de enfermedad o la paternidad. En la técnica de AmpFLP,
los polinucleótidos pueden estar marcados utilizando un cebador por
PCR de polinucleótido marcado o utilizando trifosfatos de
nucleótido marcados en la PCR.
Otro ejemplo de procedimiento de análisis del
fragmento se basa en el número variable repeticiones en serie o
VNTR (Webber; Caskey). Las VNTR son zonas de ADN de doble cadena
que contienen copias múltiples adyacentes de una secuencia
determinada, siendo variable el número de unidades repetidas.
Ejemplos de locus de VNTR son pYNZ22, pMCT118 y Apo B. Un
subconjunto de procedimientos VNTR son aquellos procedimientos
basados en la detección de repeticiones microsatélite o
repeticiones cortas en serie (STR), es decir, repeticiones de ADN
en serie caracterizadas por una secuencia corta (2 a 4 bases)
repetida. Una de las familias más abundante de ADN entremezclado
repetido en el hombre es la familia de dinucleótido repetido
(dC-dA)n-(dG-dT)n
(denominada también familia (CA)n de dinucleótido repetido).
Se cree que existen tantas como 50.000 a 100.000 (CA)n zonas
repetidas en el genoma humano, normalmente con 15 a 30 repeticiones
por bloque. Muchas de estas zonas repetidas son polimórficas en
longitud y pueden servir, por lo tanto, como marcadores genéticos
útiles. Preferentemente, en los procedimientos VNTR o STR, se
introduce un colorante marcador en los fragmentos de polinucleótido
utilizando un cebador de PCR marcado con colorante.
En un método de análisis del fragmento
particularmente preferido, las clases se definen desde el punto de
vista de los nucleótidos terminales de modo que se establece una
correspondencia entre las cuatro bases terminales posibles y los
elementos de un conjunto de colorantes que se pueden resolver
espectralmente (Fung 1989). Dichos conjuntos se montan fácilmente a
partir de los colorantes de la invención midiendo la emisión y la
anchura de la banda de absorción con espectofotómetros disponibles
en el comercio. Más preferentemente, las clases aumentan en el
contexto de la química o de los procedimientos de terminación de la
cadena del secuenciado de ADN, y más preferentemente las clases
aumentan en el contexto del procedimiento de terminación de la
cadena, es decir, secuenciado de didesoxi ADN, o secuenciado de
Sanger. Este procedimiento implica la síntesis de una cadena de ADN
por una ADN polimerasa in vitro utilizando una plantilla de
ADN de una sola cadena o de dos cadenas cuya secuencia se ha de
determinar. La síntesis se inicia en el único sitio en el que un
cebador del oligonucleótido se hibrida con la plantilla. La
reacción de síntesis se termina por la incorporación de un análogo
de nucleótido que no soportará la elongación continuada de ADN. Los
análogos del nucleótido de terminación de la cadena son normalmente
5'-trifosfatos de
2',3'-didesoxinucleósido (ddNTP) que carecen del
grupo 3'-OH necesario para la elongación de la
cadena de ADN de 3' a 5'. Cuando se utilizan proporciones adecuadas
de dNTP (5'-trifosfatos de
2'-desoxi-nucleósido) y uno de los
cuatro ddNTP, la polimerización catalizada por el enzima se
terminará en una fracción de la población de cadenas en cada sitio
en el que el ddNTP se puede incorporar. Si se utilizan cebadores
marcados o ddNTP marcados para cada reacción, se puede detectar por
fluorescencia la información de la secuencia después de la
separación por electroforesis de alta resolución. En el
procedimiento de terminación de la cadena, los colorantes de la
invención pueden estar unidos a los cebadores de secuenciado o a los
didesoxinucleótidos.
En cada uno de los procedimientos de análisis del
fragmento anteriores los polinucleótidos marcados se separan
preferentemente por procedimientos electroforéticos (Rickwood y
Harnes: Osterman). Preferentemente el tipo de matriz
electroforética es poliacrilamida reticulada o sin reticular con una
concentración (peso a volumen) de entre aproximadamente 2 a 20 por
ciento en peso. Más preferentemente, la concentración de
poliacrilamida está comprendida entre aproximadamente 4 y 8 por
ciento. Preferentemente en el contexto del secuenciado de ADN en
particular, la matriz de la electroforesis incluye una cadena que
separa o desnaturaliza el agente, p. ej., urea, formamida y
similares. Los procedimientos detallados para construir dichas
matrices están dados por (Maniatis 1980; ABI PRISM^{TM} 377 ADN
Sequencer User's Manual). La concentración de polímero, pH,
temperatura, concentración de agente desnaturalizante, etc. óptimos
empleados en una separación determinada depende de muchos factores,
incluyendo la gama de tamaños de los ácidos nucleicos que se han de
separar, las composiciones de sus bases, si son de una sola cadena
o de dos cadenas y de la naturaleza de las clases para las que se
busca información por electroforesis. Por consiguiente, puede ser
necesaria la prueba preliminar estándar para optimizar las
condiciones para determinadas separaciones.
Después de la separación electroforética, se
detectan los conjugados colorante-polinucleótido
midiendo la emisión de fluorescencia procedente de los
polinucleótidos marcados con colorante. Para realizar dicha
detección, los polinucleótidos marcados se iluminan por los medios
habituales, p. ej., lámparas de vapor de mercurio de alta
intensidad, láseres o similares. Preferentemente el medio de
iluminación es un láser que tiene un rayo de iluminación de una
longitud de onda comprendida entre 488 y 550 nm. Más
preferentemente, los polinucleótidos con colorante se iluminan
mediante luz de láser generada por un láser de ión argón,
particularmente las líneas de emisión a 488 y 514 nm de un láser de
ión argón, o la línea de emisión 532 de un láser YAG de neodimio en
estado sólido. En el comercio están disponibles varios láseres de
ión argón que emiten simultáneamente en estas líneas, p. ej., el
modelo 2001 de Cyonics, Ltd. (Sunnyvale, Calif.). Un detector
sensible a la luz detecta a continuación la fluorescencia, p. ej.,
un tubo fotomultiplicador, un dispositivo acoplado cargado o
similares.
La invención se aclarará más mediante una
consideración de los ejemplos siguientes, que se pretende que sean
ejemplos puramente de la invención y de ninguna manera limiten su
alcance. Todos los reactivos se adquirieron en Aldrich Chemical Co.
(Milwaukee, WI) excepto que se indique de otra manera. Se preparó
el anhídrido de 3,6-diclorotrimelítico como describe
(Khanna).
Se añadió gota a gota una solución de cloruro de
O-flúor-benzoílo (1,59 g, 10
mmoles) en 2 ml de diclorometano a
m-N-metilamino fenol (1,23 g, 10 mmoles) en
5 ml de diclorometano y trietilamina (1,01 g, 1 mmol) enfriado en un
baño con hielo. Se dejó calentar la reacción a temperatura ambiente
durante una hora. Se diluyó la mezcla con diclorometano, se extrajo
con agua y NaCl sat., se secó con MgSO_{4}, se filtró y se
evaporó al vacío. Se purificó el producto en bruto por
cromatografía en gel de sílice para dar
N-(m-hidroxifenil)-o-flúor-benzamida
de N-metilo en forma de espuma blanca (1,2 g, 5
mmoles, 50%).
Se añadió hidróxido de sodio (200 mg, dispersión
al 60% en aceite, 5 mmoles) a la amida (1,2 g, 5 mmoles) en 10 ml
de dimetilformamida a temperatura ambiente. Se calentó a
continuación a reflujo la mezcla durante 2 horas y se enfrió a
temperatura ambiente. Se evaporó el disolvente al vacío y se añadió
5 ml de ácido clorhídrico (2 M). Se extrajo dos veces la mezcla con
acetato de etilo. Se lavaron los extractos de acetato de etilo
combinados con agua y NaCl sat., se secaron con MgSO_{4}, se
filtraron y se evaporaron al vacío. Se purificó el producto en
bruto por cromatografía en gel de sílice para dar la amida
tricíclica, ciclada como un sólido blanco (0,56 g, 2,5 mmoles,
50%).
Se añadió gota a gota el complejo sulfuro de
dimetilo/borano (3,75 ml, 7,5 mmoles, 2 M en THF) a la amida
tricíclica (0,56 g, 2,5 mmoles) en 10 ml de tetrahidrofurano
anhidro enfriado en un baño con hielo. Se calentó la mezcla a
reflujo durante una hora, se enfrió en un baño con hielo y se añadió
lentamente 10 ml de metanol. Se evaporó el disolvente al vacío, se
añadió más metanol y se repitió la evaporación a fondo al vacío. Se
purificó el producto en bruto por cromatografía en gel de sílice
para dar la amida tricíclica, como un sólido blanco (400 mg, 1,9
mmoles, 76%).
Se calentó a 180ºC durante 2 h una mezcla de la
amina tricíclica (400 mg, 1,9 mmoles), anhídrido
3,6-diclorotrimelítico (248 mg, 0,95 mmol) y ácido
polifosfórico (1 g). Después de enfriar a temperatura ambiente, se
disolvió el sólido en NaOH acuoso (1M, 75 ml). Se precipitó el
producto con HCl acuoso (2 M, 7,5 ml). Se recogió el sólido por
filtración y se purificó por HPLC en fase inversa para dar el
colorante,(Abs. máx. 638 nm). No se asignó la regioquímica de los
grupos 5 y 6 carboxilo de los isómeros. El isómero 1 (32 mg, 5%) y
el isómero 2 (65 mg, 10%) se pudieron separar por HPLC en fase
inversa.
Se mezclaron una solución de
ddATP-NH_{2} (5 \mul, 20 mM, 0,1 \mumol)
(Hobbs 1989, 1992), dR139-NHS (0,15 \mumol) y
tampón de carbonato/bicarbonato 250 mM, pH 9 (5 \mul). Después de
10 min a temperatura ambiente se sometió la solución a HPLC en una
columna de intercambio aniónico y se eluyó con un gradiente de
acetonitrilo al 40%/bicarbonato de trietilamonio 0,1 M al 60% hasta
acetonitrilo al 40%/bicarbonato de trietilamonio 1,5 M al 60% para
eliminar el colorante libre. La fracción que contiene nucleótido
marcado con colorante y nucleótido no marcado se concentró en una
centrifugadora al vacío y se sometió a una segunda HPLC utilizando
una columna en fase inversa. Se separaron el nucleótido no marcado y
cada colorante isómero del nucleótido marcado con colorante
utilizando un gradiente de elusión de acetonitrilo al 15%/acetato
de trietilamonio 0,1M al 85% hasta acetonitrilo al 35%/acetato de
trietilamonio 0,1 M al 65%. La solución que contiene nucleótido
marcado con colorante se concentró en una centrifugadora al vacío,
se redisolvió en tampón de carbonato/bicarbonato 10 mM, pH 9 y se
analizó cuantitativamente midiendo la absorbancia de la solución en
un espectrofotómetro UV/visible. Los rendimientos fueron
aproximadamente del 1%.
Se combinaron una solución de oligonucleótido
funcionalizado con 5'-aminohexilo, (10 \mul, 1
mM) y dR139-NHS (10 \mul, 12 mM en
metilsulfóxido) y tampón de carbonato/bicarbonato (2 \mul, 1M). Se
preparó el cebador modificado con aminohexilo por síntesis de ADN
en fase sólida automática utilizando Aminolink-2 en
el último ciclo de la síntesis (PE Biosystems). Después de 10 min a
temperatura ambiente se sometió la solución a filtración en gel en
Sephadex G-25 para separar el colorante libre. Se
recogió la fracción que contenía el oligonucleótido marcado con
colorante y el oligonucleótido no marcado y se sometió a
purificación por HPLC en una columna en fase inversa. Se separaron
el oligonucleótido no marcado y cada isómero colorante de
oligonucleótido marcado con colorante utilizando un gradiente de
elución de acetonitrilo al 10%/acetato de trietilamonio 0,1 M al
85% hasta acetonitrilo al 30%/ acetato de trietilamonio 0,1 M al
65%. Las soluciones que contienen el oligonucleótido marcado con
colorante se concentraron en una centrífuga al vacío y se
redisolvieron en un tampón conteniendo Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH
7,0 (TE).
Se llevaron a cabo las reacciones con terminador
colorante con AmpliTaq® ADN-polimerasa, FS
siguiendo los protocolos básicos en el manual del kit ABI
PRISM^{TM} Dye Terminador Cycle Sequencing Core (PE Biosystems).
(La enzima FS es una ADN-polimerasa termoacuática
recombinante que tiene dos puntos de mutaciones, G46D y F667Y).
Todos los reactivos excepto la mezcla dNTP y los colorantes
terminadores eran de un kit ABI PRISM^{TM}Dye Terminator Cycle
Sequencing Core (PE Biosystems). Se preparó una premezcla de los
componentes de reacción, en la que los volúmenes están referidos a
la reacción, de la forma siguiente:
Se colocaron las reacciones en tubos de 0,5 ml
para el ciclador térmico de ADN Perkin-Elmer 480 (PE
Biosystems). Los volúmenes totales de reacción fueron de 20 \mul,
incluyendo 15 \mul de la premezcla de reacción anterior, una
cantidad apropiada del terminador marcado con colorante y agua. Las
reacciones del terminador de colorante se colocaron con 1 pmol de
terminador de colorante para los terminadores A y G, o con 15 pmol
de terminador de colorante para los terminadores C y T, con los
colorantes de la presente invención. En unos pocos casos, los
terminadores colorantes para C o T que estaban en una concentración
demasiado baja, tal como 5 \mul, produjeron menos de 15 pmoles de
colorante terminador. En estos casos, se utilizó 5 \mul del
colorante terminador y no se añadió agua a la reacción. Se añadió 30
\mul de aceite mineral a la parte superior de cada volumen de
reacción para reducir la evaporación durante el termorreciclado. Se
termorreciclaron las reacciones durante 25 ciclos de la forma
siguiente: 96ºC durante 30 s, 50ºC durante 15 s, 60ºC durante 4
min; seguido de un ciclo mantenido a 4ºC.
Se purificaron todas las reacciones por
purificación en columna de rotación en columnas de rotación
Centri-Sep (Princeton Separations, Adelphia, NJ).
El material de gel en la columna se hidrató con 0,8 mL de agua
desionizada durante por lo menos 30 minutos a temperatura ambiente.
Después se hidrataron las columnas y esto puso de manifiesto que
ninguna burbuja estaba ocluida en el material de gel, en la tapa
del extremo superior y a continuación se retiró la tapa del extremo
inferior. Se dejó desaguar la columna por gravedad. Se insertaron a
continuación las columnas en los tubos de lavado provistos en el kit
Centi-Sep y se centrifugó en una microcentrifugadora
de velocidad variable (Eppendorf modelo 5415) a 1300 \times g
durante 2 minutos. Se separaron las columnas de los tubos de lavado
y se insertaron en tubos de recogida de muestras. Se separó con
cuidado la mezcla de reacción de debajo del aceite utilizando una
pipeta de vidrio y se cargó en la parte superior de la columna
Centi-Sep. Se centrifugaron las columnas durante 2
minutos. Se secaron las muestras en una centrifugadora al vacío.
Las muestras secas se volvieron a poner en
suspensión en 25 \mul de Template Supresión Reagent (PE
Biosystems), se agitó, se calentó a 95ºC durante 2 minutos, se
enfrió en hielo, se agitó de nuevo y se centrifugó (13.000 \times
g). Se tomaron alícuotas de 10 \mul de la muestra purificada en
viales de muestra y se adaptaron para su utilización en el
analizador genético PE ABI PRISM^{TM} 310 (PE Biosystems). La
electroforesis en el modelo 310 utilizó un capilar de sílice
fundida sin recubrir de 61 cm de longitud, 50 \mum de diámetro
interior con una longitud en el detector de 50 cm. Se rellenó el
capilar con una solución de un polímero de tamizado (Madabhushi) de
dimetilpoliacrilamida (DMA) lineal, tampón y conteniendo
desnaturalizantes de ácido nucleico (PE Biosystems). Se inyectaron
las muestras electrocinéticamente durante 30 s a 2,5 kV. Se realizó
la electroforesis durante 2 horas a 12,2 kV con la temperatura
capilar mantenida a 42ºC.
Claims (31)
1. Compuesto que tiene la fórmula:
en la
que:
R_{7}-R_{10},
R_{12}-R_{16} y R_{18} considerados por
separado se seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno,
flúor, cloro, metilo, etilo, alquilo C_{1-8},
alqueno C_{2-8}, alquino
C_{2-8}, cicloalquilo, fenilo, arilo, sulfonato,
sulfona, amino, amido, nitrilo, alcoxi C_{1-8},
grupo de unión y combinaciones de los mismos y/o R_{7} y R_{8}
y/o R_{13} y R_{14} considerados conjuntamente se seleccionan
de entre el grupo que consta de oxígeno, azufre, iminio y
alquiliminio;
R_{11} y R_{17} considerados por separado se
seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno, alquilo
C_{1-8}, sulfonato de alquilo, carboxilato de
alquilo, alqueno C_{2-8}, alquino
C_{2-8}, cicloalquilo, fenilo, arilo, grupo de
unión y combinaciones de los mismos; y
X_{1}-X_{3} considerados por
separado se seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno,
cloro, flúor, alquilo C_{1-8}, amina, amida,
carboxilato, sulfonato, hidroximetilo y los grupos de unión.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
X_{1} es carboxilato o sulfonato.
3. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
uno de entre X_{2} y X_{3} es un grupo de unión.
4. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
R_{7}-R_{9}, R_{12}-R_{15}
y R_{18} son hidrógeno.
5. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
R_{7}, R_{8},R_{13} y R_{14} son metilo.
6. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
R_{7} y R_{8} y/o R_{13} y R_{14} considerados
conjuntamente se seleccionan de entre el grupo que consta de
oxígeno, azufre, iminio y alquiliminio.
7. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
R_{11} y R_{17} son metilo o fenilo.
8. Compuesto que tiene la fórmula:
en la
que:
R_{7}-R_{10} y R_{12}
considerados por separado se seleccionan de entre el grupo que
consta de hidrógeno, flúor, cloro, metilo, etilo, alquilo
C_{1-8}, alqueno C_{2-8},
alquino C_{2-8}, cicloalquilo, fenilo, arilo,
sulfonato, sulfona, amino, amido, nitrilo, alcoxi
C_{1-8}, grupo de unión y combinaciones de los
mismos; y
R_{11} se selecciona de entre el grupo que
consta de hidrógeno, alquilo C_{1-8}, alqueno
C_{2-8}, alquino C_{2-8},
cicloalquilo, fenilo, arilo, grupo de unión y combinaciones de los
mismos.
9. Compuesto según la reivindicación 8, en el que
R_{7}-R_{9} y R_{12} son hidrógeno.
10. Compuesto según la reivindicación 8, en el
que R_{7} y R_{8} son metilo.
11. Compuesto según la reivindicación 8, en el
que R_{11} es metilo o fenilo.
12. Reactivo marcado en el que el marcador es un
compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y el
reactivo se selecciona de entre una proteína, un polipéptido, un
polisacárido, un nucleósido, un nucleótido, un polinucleótido, un
lípido y un soporte sólido.
13. Reactivo marcado según la reivindicación 12,
que es un nucleósido o nucleótido marcado que tiene la fórmula:
en la
que:
D es un colorante que es un compuesto según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,
B es una base 7-deazapurina,
purina o pirimidina de nucleótido;
W_{1} y W_{2} considerados por separado se
seleccionan de entre el grupo que consta de H y OH;
W_{3} se selecciona de entre el grupo que
consta de OH, OPO_{3}, OP_{2}O_{6}, OP_{3}O_{9}, y
análogos de los mismos;
en la que cuando B es purina o
7-deazapurina, el grupo azúcar está unido en la
posición N^{9} de la purina o deazapurina y cuando B es
pirimidina, el grupo azúcar está unido en la posición N^{1} de la
pirimidina;
en la que el enlace que une B y D está conectado
a D en una de las posiciones R_{7}-R_{18} ó
X_{1}-X_{3}; y
en la que si B es purina, el enlace está
conectado en la posición 8 de la purina, si B es
7-deazapurina, el enlace está conectado a la
posición 7 de la 7-deazapurina y si B es
pirimidina, el enlace está conectado a la posición 5 de la
pirimidina.
14. Nucleósido o nucleótido marcado según la
reivindicación 13, en los que B se selecciona de entre el grupo que
consta de uracilo, citosina, deazaadenina y deazaguanosina.
15. Nucleósido o nucleótido marcado según la
reivindicación 13, en los que el enlace se selecciona de entre el
grupo que consta de:
--- C\equivC
--- CH_{2} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---,--- C\equivC
--- CH_{2} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} ---
(CH_{2})_{5} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---,--- C=CH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} --- NH ---
(CH_{2})_{5} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---,--- C\equivC
--- CH_{2}OCH_{2}CH_{2}NH
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---,--- C\equivC
---
CH_{2}OCH_{2}CH_{2}OCH_{2}CH_{2}NH
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---,y
16. Nucleótido marcado según la reivindicación
13, en el que tanto W_{1} como W_{2} son H; W_{3} es
OP_{3}O_{9}, o en el que W_{1} es H; W_{2} es OH; y W_{3}
es OP_{3}O_{9}.
17. Nucleósido o nucleótido marcado según la
reivindicación 13, en los que el enlace que une B y D está conectado
a D en una de las posiciones X_{2} ó X_{3}.
18. Reactivo marcado según la reivindicación 12,
que es un polinucleótido marcado que contiene un nucleósido o
nucleótido que tiene la fórmula:
en la
que:
D es un colorante que es un compuesto según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;
B es una base de nucleótido
7-deazapurina, purina o pirimidina;
Z_{1} se selecciona de entre el grupo que
consta de H y OH;
Z_{2} se selecciona de entre el grupo que
consta de H, OH, OPO_{3} y Nuc, en el que Nuc es un nucleósido,
nucleótido o polinucleótido y Nuc y el nucleósido o nucleótido
conectados a D están unidos por un enlace fosfodiéster o un análogo
del mismo, estando conectado el enlace a la posición 5' de Nuc;
Z_{3} se selecciona de entre el grupo que
consta de H, PO_{3}, análogos de fosfato y Nuc, en el que Nuc y
el nucleósido o nucleótido conectado a D están unidos por un enlace
fosfodiéster o un análogo del mismo, estando conectado el enlace a
la posición 3' de Nuc;
en la que B es purina o
7-deazapurina, el grupo azúcar está unido en la
posición N^{9} de la purina o deazapurina y cuando B es
pirimidina, el grupo azúcar está unido en la posición N^{1} de la
pirimidina;
en la que el enlace que une B y D está conectado
a D en una de las posiciones R_{7}-R_{18} o
X_{1}-X_{3}; y
en la que si B es una purina, el enlace está
conectado a la posición 8 de la purina, si B es
7-deazapurina, el enlace está conectado a la
posición 7 de la 7-deazapurina y si B es
pirimidina, el enlace está conectado a la posición 5 de la
pirimidina.
19. Polinucleótido marcado según la
reivindicación 18, en el que B se selecciona de entre el grupo que
consta de uracilo, citisina, desaazadenina y desazaguanosina.
20. Polinucleótido marcado según la
reivindicación 18, en los que el enlace se selecciona de entre el
grupo que consta de:
--- C\equivC
--- CH_{2} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---,--- C\equivC
--- CH_{2} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} ---
(CH_{2})_{5} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---,--- C=CH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} --- NH ---
(CH_{2})_{5} --- NH ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---,--- C\equivC
--- CH_{2}OCH_{2}CH_{2}NH
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---,--- C\equivC
---
CH_{2}OCH_{2}CH_{2}OCH_{2}CH_{2}NH
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---,y
21. Polinucleótido marcado con colorante, que
comprende un polinucleótido unido de forma covalente por un enlace a
un colorante de
4,7-dicloro-rodamina, en el que el
enlace está unido al terminal 5' o al terminal 3' del polinucleótido
y el colorante 4,7-dicloro-rodamina
se selecciona a partir de la estructura:
en la
que:
R_{7}-R_{10},
R_{12}-R_{16} y R_{18} considerados por
separado se seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno,
flúor, cloro, metilo, etilo, alquilo C_{1-8},
alqueno C_{2-8}, alquino
C_{2-8}, cicloalquilo, fenilo, arilo, sulfonato,
sulfona, amino, amido, nitrilo, alcoxi C_{1-8} y
un enlace y R_{7} y R_{8} y/o R_{13} y R_{14}, considerados
conjuntamente se seleccionan de entre el grupo que consta de
oxígeno, azufre, iminio y alquiliminio;
R_{11} y R_{17} considerados por separado se
seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno, alquilo
C_{1-8}, sulfonato de alquilo, carboxilato de
alquilo, alqueno C_{2-8}, alquino
C_{2-8}, cicloalquilo, fenilo, arilo y un enlace;
y
X_{1}-X_{3} considerados por
separado se seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno,
cloro, flúor, alquilo C_{1-8}, amina, amida,
carboxilato, sulfonato, hidroximetilo y un enlace.
22. Polinucleótido marcado con colorante según la
reivindicación 21, en el que X_{1} es carboxilato o sulfonato.
23. Polinucleótido marcado con colorante según la
reivindicación 21, en el que uno de entre X_{2} y X_{3} es un
enlace.
24. Polinucleótido marcado con colorante según la
reivindicación 21, en el que R_{7}-R_{9},
R_{12}-R_{15} y R_{18} son hidrógeno.
25. Polinucleótido marcado con colorante según la
reivindicación 21, en el que R_{7},R_{8}, R_{13} y R_{14}
son metilo.
26. Polinucleótido marcado con colorante según la
reivindicación 21, en el que el enlace está conectado a una posición
seleccionada de entre R_{11} y R_{17}.
27. Polinucleótido marcado con colorante según la
reivindicación 21, que comprende un colorante donante y un colorante
aceptor, en el que al menos uno de entre el colorante donante y el
colorante aceptor es el colorante
4,7-dicloro-rodamina situado de
manera que tenga lugar la transferencia de la energía de
fluorescencia entre el colorante donante y el colorante aceptor.
28. Polinucleótido marcado con colorante según la
reivindicación 21, en el que el enlace es un enlace aminohexilo.
29. Procedimiento para marcar un polinucleótido
que comprende combinar un colorante
4,7-dicloro-rodamina que tiene un
grupo de unión con un polinucleótido que tiene funcionalidad
complementaria en el terminal 5' o en el terminal 3', en el que el
colorante 4,7-dicloro-rodamina se
selecciona a partir de la estructura:
en la
que:
R_{7}-R_{10},
R_{12}-R_{16} y R_{18} considerados por
separado se seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno,
flúor, cloro, metilo, etilo, alquilo C_{1-8},
alqueno C_{2-8}, alquino
C_{2-8}, cicloalquilo, fenilo, arilo, sulfonato,
sulfona, amino, amido, nitrilo, alcoxi C_{1-8},
un grupo de unión y combinaciones de los mismos y/o R_{7} y
R_{8} y/o R_{13} y R_{14}, considerados conjuntamente se
seleccionan de entre el grupo que consta de oxígeno, azufre, iminio
y alquiliminio;
R_{11} y R_{17} considerados por separado se
seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno, alquilo
C_{1-8}, sulfonato de alquilo, carboxilato de
alquilo, alqueno C_{2-8}, alquino
C_{2-8}, cicloalquilo, fenilo, arilo, un grupo de
unión o combinaciones de los mismos; y
X_{1}-X_{3} considerados por
separado se seleccionan de entre el grupo que consta de hidrógeno,
cloro, flúor, alquilo C_{1-8}, amina, amida,
carboxilato, sulfonato, hidroximetilo y un grupo de unión,
con la condición de que el colorante de
4,7-dicloro-rodamina comprenda al
menos un grupo de unión, por lo cual se forma un polinucleótido
marcado en 5' con colorante
4,7-dicloro-rodamina o un
polinucleótido marcado en 3' con colorante
4,7-dicloro-rodamina.
30. Procedimiento según la reivindicación 29, en
el que la funcionalidad complementaria es una amina.
31. Procedimiento según la reivindicación 29, en
el que el grupo de unión es un éster de NSH.
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