ES2226374T3 - Utilizacion de un polipeptido derivado de una albumina pa1b de leguminosa como insecticida. - Google Patents
Utilizacion de un polipeptido derivado de una albumina pa1b de leguminosa como insecticida.Info
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Abstract
Utilización como insecticida de un polipéptido que comprende una secuencia que responde a la fórmula general (I) siguiente: X1CX2CX3CX4CX5CX6CX7 (I) en la que: - C representa un residuo de cisteína, - X1 responde a la secuencia y1y2 en la que y1 e y2 representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, o bien y1 representa un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina e y2 representa ácido glutámico o ácido aspártico; - X2 responde a la secuencia y3y4y5 en la que y3 representa glutamina o asparagina e y4 e y5 representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina, treonina, valina, leucina, isoleucina y metionina; - X3 responde a la secuencia y6y7y8y9y10y11y12 en la que y6 representa un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, y7, y11 e y12 representan cada uno prolina, y8 representa un aminoácido elegido entre fenilalanina, triptófano y tirosina, y9 representa ácido aspártico o ácido glutámico, y10representa un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina y metionina; - X4 responde a la secuencia y13y14y15y16 en la que y13, y14, y15, y16 representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, o bien y14 representa un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, y13 e y15 representan cada uno un aminoácido básico e y16 representa ácido aspártico o ácido glutámico; - X5 representa un aminoácido básico; - X6 responde a la secuencia y17y18y19y20y21y22y23y24y25 en la que y17, y19, y21 e y23 representan cada uno un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina y metionina, y18 representa prolina, y20 e y24 representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, y22 representa un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano y tirosina, e y25 representa un aminoácido elegido entre fenilalanina, triptófano y tirosina; - X7 responde a la secuencia y26y27y28y29y30 en la que y26 representa un aminoácido básico o un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina y metionina, y27 representa asparagina o glutamina o un aminoácido básico, y28 representa prolina e y29 e y30 representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina.
Description
Utilización de un polipéptido derivado de una
albúmina PA1b de leguminosa como insecticida.
La presente invención se refiere a proteínas
insecticidas y a su utilización para la protección de plantas, y
particularmente de cereales, de sus granos y de los productos
derivados de éstas contra los insectos devastadores.
Los insectos devastadores de los granos de
cereales se encuentran en diferentes familias, particularmente
entre los coleópteros, los lepidópteros y los homópteros. En los
coleópteros, se citarán particularmente los gorgojos del grano
(Sitophilus oryzae, Sitophilus zeamais, Sitophilus
granarius) así como Tenebrio spp., Rhyzopertha
dominica, Trogoderma spp., Tribolium confusum. En
los lepidópteros, se citarán particularmente Sitotroga
cerealella y Ephestia kuehniella.
Los devastadores de granos de cereales están
entre los enemigos principales de las cosechas a las que atacan en
los campos (al menos en las regiones cálidas), y sobre todo en los
silos de conservación; igualmente pueden atacar a los productos
transformados derivados de cereales (por ejemplo harinas, sémolas,
etc.). Estos insectos causan daños muy importantes y cada año son
la causa de la destrucción de una parte importante (que puede
aproximarse a un 25%) de la cosecha mundial de cereales recogidos
cada año.
Para luchar contra estos insectos, se han
preconizado diferentes procedimientos. La utilización de
insecticidas (LINDANE®, después MALATHION® y bromuro de etileno) se
ha cuestionado actualmente debido a los problemas planteados por la
presencia de residuos de estos productos en la alimentación.
Además, han aparecido resistencias a estos productos en numerosos
insectos diana, lo que hace su utilización cada vez menos eficaz.
Para reemplazar estos insecticidas o limitar su uso se han propuesto
diferentes procedimientos (para revisión véase, por ejemplo, F.H.
ARTHUR, J. Stored. Prod. Res., 32, pág.
293-302 (1996)]. Los más desarrollados actualmente
son procedimientos físicos tales como el enfriamiento de los silos,
la conservación en atmósfera de CO_{2} o nitrógeno; estos
procedimientos son sin embargo costosos y su realización, que
necesita una alta habilidad técnica, es delicada; por tanto no son
aplicables en todos los casos.
Otro tipo de enfoque, que es el objeto de
numerosas investigaciones, consiste en producir plantas
transgénicas que expresan uno o varios genes que les confieren
resistencia frente al ataque de los insectos. Sin embargo, este
enfoque necesita la disposición de genes apropiados, que deben ser
además aceptables tanto para el entorno como para los
consumidores.
La mayoría de los insectos presentan una
especificidad alimentaria más o menos estricta; así los granos de
cereales son atacados por los gorgojos del grano (Sitophilus
oryzae, Sitophilus zeamais, Sitophilus granarius),
que no atacan a los granos de leguminosas; en cambio, otros
devastadores tales como los gorgojos de leguminosas atacan a las
leguminosas pero no a los cereales.
Los trabajos precedentes del equipo de inventores
[DELOBEL y GRENIER, J. Stored. Prod. Res., 29, pág.
7-14 (1993)] han mostrado que las tres especies de
Stophilus citadas anteriormente podían desarrollarse en
castañas o bellotas, pero en cambio morían rápidamente en guisantes
majados, siendo consecuencia esta mortalidad del consumo de
guisante por estos gorgojos.
Los inventores han abordado la empresa de
investigar la sustancia tóxica responsable de esta mortalidad. Es
conocido por otro lado que las leguminosas contienen diversas
sustancias entomotóxicas, y que existen en diversas especies de
insectos para las que las leguminosas son tóxicas subpoblaciones
naturales más o menos resistentes a la toxicidad de las
leguminosas.
Por ejemplo, en el caso de los gorgojos del
grano, un ensayo efectuado por el equipo de inventores sobre 90
cepas de orígenes geográficos diferentes ha mostrado que 4 cepas
que pertenecen a la especie Sitophilus oryzae comprenden
individuos capaces de sobrevivir en guisantes majados en el estado
adulto; en cambio, no se ha encontrado ninguna cepa que posea esta
facultad en las especies Sitophilus zeamais o Sitophilus
granarius; el estudio del determinismo genético de esta
resistencia ha mostrado que este carácter es monogénico, recesivo y
autosómico [GRENIER et al., Heredity, 79, pág.
15-23 (1997)].
Los inventores han seleccionado una cepa de S.
oryzae homocigótica para este gen de resistencia, y han
utilizado esta cepa para investigar la sustancia tóxica frente a la
que se manifiesta el mecanismo de resistencia codificado por este
gen.
Los inventores han constatado también que esta
toxicidad estaba asociada a las isoformas de una proteína de
secuencia similar a la de albúmina de guisante PA1b descrita por
HIGGINS et al. [J. Biol. Chem., 261(24), pág.
11124-11130, (1986)] y que presenta una fuerte
similitud (65% de identidad) con la leginsulina de soja [WATANABE
et al., Eur. J. Biochem., 15, pág.
224:1-167-72, (1994)]. Hasta ahora,
no se había asociado ninguna propiedad entomotóxica a la proteína
PA1b, a la leginsulina o a otras proteínas homólogas.
La alineación de la secuencia de una de las
isoformas de la proteína purificada por los inventores con las de
la proteína PA1b de guisante publicada por HIGGINS et al. y
la de leginsulina de soja publicada por WATANABE
et al. se representa en la Figura 7. Estas 3 secuencias comprenden particularmente 6 residuos de cisteína que ocupan posiciones conservadas.
et al. se representa en la Figura 7. Estas 3 secuencias comprenden particularmente 6 residuos de cisteína que ocupan posiciones conservadas.
La presente invención tiene como objeto la
utilización como insecticida de un polipéptido que comprende una
secuencia que responde a la fórmula general (I) siguiente
(I)X_{1}CX_{2}CX_{3}CX_{4}CX_{5}CX_{6}CX_{7}
en la que C representa un residuo
de cisteína
y
- -
- X_{1} responde a la secuencia y_{1}y_{2} en la que y_{1} e y_{2} representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, o bien y_{1} representa un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina e y_{2} representa ácido glutámico o ácido aspártico; y/o
- -
- X_{2} responde a la secuencia y_{3}y_{4}y_{5} en la que y_{3} representa glutamina o asparagina e y_{4} e y_{5} representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina, treonina, valina, leucina, isoleucina y metionina; y/o
- -
- X_{3} responde a la secuencia y_{6}y_{7}y_{8}y_{9}y_{10}y_{11}y_{12} en la que y_{6} representa un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, y_{7}, y_{11} e y_{12} representan cada uno prolina, y_{8} representa un aminoácido elegido entre fenilalanina, triptófano y tirosina, y_{9} representa ácido aspártico o ácido glutámico, y_{10} representa un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina y metionina; y/o
- -
- X_{4} responde a la secuencia y_{13}y_{14}y_{15}y_{16} en la que y_{13}, y_{14}, y_{15}, y_{16} representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, o bien y_{14} representa un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, y_{13} e y_{15} representan cada uno un aminoácido básico e y_{16} representa ácido aspártico o ácido glutámico; y/o
- -
- X_{5} representa un aminoácido básico; y/o
- -
- X_{6} responde a la secuencia y_{17}y_{18}y_{19}y_{20}y_{21}y_{22}y_{23}y_{24}y_{25} en la que y_{17}, y_{19}, y_{21} e y_{23} representan cada uno un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina y metionina, y_{18} representa prolina, y_{20} e y_{24} representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, y_{22} representa un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano y tirosina, e y_{25} representa un aminoácido elegido entre fenilalanina, triptófano y tirosina; y/o
- -
- X_{7} responde a la secuencia y_{26}y_{27}y_{28}y_{29}y_{30} en la que y_{26} representa un aminoácido básico o un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina y metionina, y_{27} representa asparagina o glutamina o un aminoácido básico, y_{28} representa prolina e y_{29} e y_{30} representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina.
Según un modo de realización preferido de la
presente invención, el polipéptido utilizado como insecticida
presenta al menos un 40%, preferiblemente al menos un 60%, de
homología con una cualquiera de las isoformas de una albúmina
PA1b.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por "albúmina PA1b" no sólo cualquier isoforma de la
proteína PA1b de guisante, sino igualmente cualquier proteína de la
misma familia presente en otras plantas y que puede purificarse
principalmente a partir de granos de leguminosas, particularmente de
leguminosas de la familia de cesalpináceas, mimosáceas, fabáceas o
meliáceas tales como Khaya senegalensis.
Los polipéptidos utilizables según la invención
pueden ser polipéptidos naturales, por ejemplo las leginsulinas de
leguminosas tal como la leginsulina de soja descrita por WATANABE
et al.; puede tratarse igualmente de polipéptidos
artificiales cuya secuencia deriva de la de una PA1b mediante la
adición, deleción o sustitución de un número pequeño de
aminoácidos. Pueden utilizarse por ejemplo polipéptidos que
comprenden una secuencia que responde a la fórmula general (I), o
una parte de ésta correspondiente a la región implicada en la
actividad insecticida. Este péptido activo puede fusionarse
eventualmente en su extremo N-terminal y/o con su
extremo C-terminal con otra secuencia
peptídica.
peptídica.
Estos polipéptidos pueden obtenerse mediante los
procedimientos clásicos, conocidos por sí mismos, por ejemplo
mediante síntesis peptídica, o mediante ingeniería genética,
expresando en una célula hospedadora apropiada una secuencia que
codifica el polipéptido deseado. Pueden purificarse igualmente, en
el caso de polipéptidos naturales tales como PA1b y leginsulina, a
partir de granos de plantas tales como leguminosas o meliáceas
Según la invención, los polipéptidos que
comprenden una secuencia de fórmula general (I) pueden utilizarse
como principio activo único de un insecticida, o bien asociados a
uno o varios principios activos distintos. Pueden utilizarse
particularmente para luchar contra los insectos devastadores de los
granos de cereal, e igualmente contra insectos fitófagos tales como
los lepidópteros Mamestra brassicae o Ostrinia
nubilalis o los coleópteros Chrysomelidae como
Phaedon cochleariae o Curculionidae como Anthonomus
grandis o contra insectos floemófagos tales como los
pulgones.
Además, los inventores han constatado que la
proteína PA1b conservaba su actividad insecticida durante varios
años en los granos secos, y que esta actividad no estaba afectada
por un calentamiento a 100ºC.
Por otro lado, esta proteína no era tóxica para
el hombre o los animales superiores; está presente en las
leguminosas que forman parte de su alimentación habitual.
Los polipéptidos de secuencia general (I) están
particularmente bien adaptados para la protección, particularmente
durante el almacenamiento, de granos, harinas o productos
transformados derivados de ellos.
Para la realización de la presente invención, la
concentración de polipéptido de secuencia (I) al nivel del producto
a proteger (planta, granos o productos derivados) es generalmente de
10 \mumoles/kg a 100 mmoles/kg (o de 10 \muM a 100 mM), y
ventajosamente de 50 \mumoles/kg a 10 mmoles/kg (o de 50 \muM a
10 mM).
Según un modo de realización preferido de la
presente invención, se trata el producto a proteger con una
preparación que comprende dicho polipéptido. Éste puede estar por
ejemplo en forma de una preparación purificada o de una fracción
enriquecida, que pueden obtenerse principalmente a partir de granos
de plantas que producen naturalmente dicho polipéptido, o bien a
partir de cultivos de células que expresan un gen que codifica este
polipéptido.
Según otro modo de realización preferido de la
presente invención, se produce una planta transgénica, transformada
mediante al menos un gen que codifica dicho polipéptido, y que
expresa este último en al menos uno de sus tejidos u órganos.
La presente invención comprende igualmente las
plantas transgénicas producidas de este modo, ventajosamente dichas
plantas son cereales.
Estas plantas pueden obtenerse mediante las
técnicas habituales de la transgénesis vegetal, que son conocidas
por sí mismas.
Así, es posible obtener en una planta una
expresión ubicua y/o una expresión o una sobreexpresión en ciertos
tejidos u órganos (por ejemplo en granos) de un polipéptido de
secuencia (I), y por ello proteger a la planta, al tejido o al
órgano referido, contra los ataques de insectos para los que este
polipéptido es tóxico. Particularmente, la expresión de un
polipéptido de secuencia (I) en los granos permite protegerlos,
incluso después de la cosecha, así como a las harinas y a los
productos transformados obtenidos a partir de estos granos.
La presente invención se comprenderá mejor con la
ayuda del complemento de descripción siguiente que se refiere a
ejemplos no limitantes, que describen la purificación e ilustran
las propiedades insecticidas de una albúmina PA1b de
leguminosa.
Se ha ensayado la toxicidad de harinas de
diferentes leguminosas sobre los gorgojos (Sitophilus
oryzae). Los experimentos se han efectuado paralelamente en
animales de tipo salvaje (cepa sensible S) y en mutantes
supervivientes a la alimentación con guisante (cepa resistente
R).
Los gorgojos (Sitophilus oryzae) se crían
en entorno regulado a 27,5ºC y 70% de humedad relativa. Se toman
muestras de adultos jóvenes de una semana de los criaderos masivos
para los ensayos. Para cada ensayo, se experimenta con lotes de 30
insectos, y se anota la mortalidad diaria.
Se amasan bolas de harina con agua, se ponen a
secar durante 24 h y se utilizan para la alimentación de los
gorgojos. La harina gris de trigo utilizada se completa con
diferentes proporciones de harina de leguminosa tamizada a 0,2 mm
de abertura de malla.
Se han obtenido las curvas de
dosis-respuesta de mortalidad de los gorgojos
utilizando diferentes dosis de cada harina a ensayar. Los resultados
se tratan mediante el programa "Toxicologie" [FEBAY y RAHBÉ,
"Toxicologie", un programa para el análisis de las curvas de
mortalidad mediante el procedimiento de las unidades de probabilidad
en MacIntosh, Cahiers Techn. INRA, 27, pág.
77-78 (1991)]. Este programa utiliza la
transformación en unidades de probabilidad de las mortalidades
acumuladas y determina la ecuación de la curva de regresión y la
concentración letal al 50%. Estos valores se determinan después de 4
a 7 días de exposición.
Además, para cada concentración de harina de
guisante, se han calculado igualmente los tiempos letales al 50%
(TL50) para la cepa sensible S. La curva de calibrado así
establecida permitirá determinar en los experimentos siguientes,
para cada harina o fracción de harina ensayada, la concentración
equivalente de harina de guisante (en % en peso en el trigo). Esta
curva se representa en la Figura 1.
La Figura 2 representa la mortalidad acumulada
para adultos de la cepa sensible S de Sitophilus oryzae, en
guisante (\lozenge) o trigo (\Box), en función del tiempo de
alimentación en días. Estos resultados muestran que los gorgojos del
cereal mueren rápidamente en guisante; en 8 días mueren entre un 90
y un 100% de los adultos.
La Figura 3 representa la mortalidad en 6 días de
Sitophilus oryzae para bolas de diferentes concentraciones
de harina de guisante; se comparan la cepa resistente (R) y la cepa
sensible (S). La curva dosis-respuesta así
establecida muestra que, para la cepa sensible (S) se observa, desde
un 10% de harina de guisante, un 70% de mortalidad en 6 días (y 100%
en 14 días). En el mismo tiempo, la cepa resistente (R) no está
afectada.
Entre los granos de leguminosas utilizados en la
alimentación humana, se ha ensayado en 10 su acción sobre los
gorgojos sensibles y resistentes.
Se han utilizado bolas que contenían un 80% de
harina de leguminosa y un 20% de harina de trigo. La Figura 4
ilustra la mortalidad acumulada de los gorgojos Sitophilus
oryzae, cepa resistente ( ) o cepa sensible ( ), medida después
de 5 (4 A), 7 (4 B), 14 (4 C) y 20 días (4 D) de alimentación con
fríjol caupí (Vigna unguiculata) variedad blanca (1) y pinta
(2), guisante de tierra (3: Vigna subterranea), lenteja (4:
Lens esculenta), judía (5: Phaseolus vulgaris), judía
mungo (6: Vigna radiata), judía adzuki (7: Vigna
angularis), haba (8: Vicia faba), garbanzo (9: Cicer
arietinum) y altramuz (10: Lupinus albus).
Los resultados muestran que a los 7 días todas
las leguminosas son tóxicas para la cepa sensible, incluso si
Vigna subterranea y Cicer arietinum no han matado
todavía a todos los insectos que viven en ellas; en cambio, la cepa
resistente no presenta mortalidad o muy poca. Puede concluirse por
lo tanto que está presente un mismo mecanismo en el origen de la
toxicidad en todas estas leguminosas; este mecanismo parece en
particular predominante en Vigna subterranea, Vigna
radiata y Cicer arietinum.
Sin embargo, el examen de las mortalidades a 14 y
20 días en ciertas leguminosas hace aparecer una mortalidad más o
menos grande para la cepa resistente, que hay que imputar por tanto
a otros mecanismos; este es particularmente el caso en Phaseolus
vulgaris y Vigna angularis.
Se prepara la fracción enriquecida en albúmina a
escala piloto según el protocolo desarrollado por CREVIEU et
al., Nahrung, 40(5), pág. 237-244
(1996)].
Se mezcla la harina de guisante (10 kg) con
agitación con 140 litros de tampón acetato (pH 4,9), se centrifuga
la mezcla a 7500 rpm, se somete el sobrenadante a una
ultrafiltración mediante membrana M5 a una temperatura que no supera
los 25ºC. Se somete el retenido a una diafiltración mediante la
misma membrana, se centrifuga el nuevo retenido a 6000 rpm durante
20 min y se liofiliza el sobrenadante. El polvo obtenido (SRA1), que
representa de media un 1% de la masa utilizada al inicio, se utiliza
para las purificaciones posteriores.
En cada etapa de la purificación se determina la
toxicidad de las diferentes fracciones según el protocolo descrito
en el ejemplo 1 anterior.
Se ponen en suspensión 10 g de SRA1 en 100 ml de
una solución de metanol al 60% y se agita durante 1 hora a 4ºC.
Después de la centrifugación (30 min, 9000 g, 4ºC), se recupera el
sobrenadante y después se elimina el metanol presente en rotavapor.
Se reajusta después el volumen a 100 ml con agua y un tampón
Tris-HCl 1 M (pH 8,8) de manera que se obtiene una
concentración final de 50 mM en Tris-HCl. Las
proteínas solubles se fraccionan mediante cromatografía de
intercambio iónico en una columna (120 x 50 mm) de DEAE SEPHAROSE
FAST FLOW. Se eluyen las proteínas adsorbidas con una concentración
de 50% de tampón B (Tris-HCl 50 mM, pH 8,8, NaCl 500
mM) en tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 8,8). El caudal
de elución es de 20 ml/min y las fracciones recogidas tienen un
volumen de 80 ml. Las proteínas se detectan mediante absorción a 280
nm.
El cromatograma se representa en la Figura 5. La
concentración de tampón B se indica por la línea discontinua. Las
fracciones de 80 ml correspondientes a los picos se reúnen en dos
fracciones principales, DEAE NA y DEAE 1, indicadas en el
cromatograma mediante líneas horizontales. La fracción no adsorbida
(DEAE NA) contiene toda la toxicidad.
Esta fracción se dializa 72 horas frente a agua y
después se liofiliza. Se obtienen así aproximadamente 450 mg de la
fracción DEAE NA.
Se fracciona la fracción DEAE NA obtenida después
de cromatografía de intercambio iónico mediante cromatografía HPLC
en fase inversa (HPLC-FI) en una columna HYPERSIL
(250 x 10,5 mm) rellena con NUCLEOSIL 5 \mum 300 \ring{A}
injertada con una cadena alifática C18. Para cada cromatografía, se
depositan 15 mg de proteínas en la columna. El caudal de elución es
de 3 ml/min, y las proteínas se detectan mediante absorción a 220
nm. Se eluyen las proteínas mediante un gradiente de tampón B (0,04%
de ácido trifluoroacético en acetonitrilo) en la mezcla A (0,04% de
ácido trifluoroacético en agua) según la secuencia siguiente: t= 0
min, 40% de B; t= 5 min, 40% de B; t= 17 min, 48% de B; t= 18 min,
80% de B y t= 23 min, 80% de B.
El cromatograma se ilustra mediante la Figura 6.
Se representa el gradiente de acetonitrilo por la línea
discontinua. La toxicidad se localiza únicamente a la altura de los
picos F1 y PT; las fracciones correspondientes a estos picos que se
han recogido se representan en el cromatograma mediante trazos
horizontales.
Se efectúan treinta cromatografías sucesivas
correspondientes a una cantidad inyectada de 450 mg de DEAE NA. Se
reúnen las fracciones y después se liofilizan tras la evaporación
del acetonitrilo y el ácido trifluoroacético en SPEED VAC. Se
obtienen así 4 mg de la fracción PT y 5 mg de F1. Estas fracciones
se analizan a continuación mediante cromatografía HPLC en fase
inversa (HPLC-FI).
Se efectúa el control de la pureza de las
proteínas de las fracciones F1 y PT mediante cromatografía HPLC en
fase inversa en una columna INTERCHROM (250 x 4,6 mm) rellena con
NUCLEOSIL 5 \mum 100 \ring{A} injertado con una cadena
alifática C18. El caudal de elución es de 1 ml/min y las proteínas
se detectan mediante absorción a 220
nm.
nm.
Se eluyen las proteínas en 45 minutos mediante un
gradiente lineal de 0 a 50% de mezcla B (0,04% de ácido
trifluoroacético en acetonitrilo) en la mezcla A (0,04% de ácido
trifluoroacético en agua).
Este análisis muestra que la fracción PT sólo
contiene la proteína tóxica PT. LA fracción F1 es más compleja y
contiene dos polipéptidos mayoritarios.
Las determinaciones de las masas se han realizado
mediante espectrometría de masas con electropulverización
(EM-EP). Las masas medias calculadas a partir de dos
estimaciones son de 3.741,1 Da en el caso de PT, y de 3.736 y 3.941
para los polipéptidos de la fracción FT.
El número de cisteínas libres e implicadas en los
puentes disulfuro se ha determinado mediante la alquilación de la
proteína mediante yodoacetamida, antes y después de la reducción, y
la comparación de los tiempos de retención en
HPLC-FI y de las masas en EM-EP de
las proteínas alquiladas con la proteína nativa.
La proteína no reducida alquilada presenta un
tiempo de retención y una masa idénticos a los de la proteína
nativa. En cambio, la proteína reducida y después alquilada presenta
un tiempo de retención claramente diferente del observado para la
proteína nativa (30 min en lugar de 42 min) y una masa de 4.089,9
Da.
Parece por tanto que esta proteína contiene 6
cisteínas que están todas implicadas en 3 puentes disulfuro.
Se ha establecido la secuencia completa de la
proteína PT. La masa calculada a partir de los 37 residuos de la
proteína es de 3.741,4 Da, que es idéntica dentro del error de
medida a la determinada mediante espectrometría de masas (3.741,1
Da) para la proteína nativa. El valor calculado para la proteína
alquilada mediante yodoacetamida (4.090 Da) es igualmente
equivalente al obtenido experimentalmente (4.089,9 Da). Estos
resultados demuestran la ausencia de modificaciones
postraduccionales (glicosilaciones, fosforilaciones) de la
proteína.
La secuencia de la proteína PT presenta una
homología muy grande con la de la albúmina de guisante PA1b [HIGGINS
et al., J. Biol. Chem. 261 (24), pág.
11124-11130 (1986)]. Las dos secuencias difieren
sólo por el reemplazo del residuo de valina en posición 29 en la
proteína PT por una isoleucina en la PA1b. Se observa igualmente
una gran homología (62% de identidad, 89% de homología, determinadas
con ayuda del software MAC MOLLY utilizando la matriz BLOSUM62)
entre la proteína PT y la leginsulina de soja [WATANABE, et
al., Eur. J. Biochem., 15, pág.
224:1-167-72 (1994)].
Particularmente, los 6 residuos de cisteína, que desempeñan un
papel esencial en la estructura de las proteínas, ocupan posiciones
conservadas.
La comparación de estas 3 secuencias se ilustra
mediante la Figura 7.
Estos resultados permiten concluir que la
proteína responsable de la resistencia del guisante a los gorgojos
del cereal es similar a la proteína PA1b descrita por HIGGINS. Esta
proteína se sintetiza en forma de una preproteína de 130 residuos
(PA1) que experimenta una maduración postraduccional que libera la
proteína PA1b así como una proteína de 53 residuos denominada PA1a
[HIGGINS et al., J. Biol. Chem., 261 (24), pág.
11124-11130 (1986)).
Se ha realizado igualmente la secuenciación de
los 10 primeros residuos N-terminales de cada uno de
los polipéptidos tóxicos de la fracción F1. Las secuencias obtenidas
son idénticas a las del extremo N-terminal de la
proteína PT. Como las masas de estos polipéptidos determinadas
mediante EM-EP son por otro lado muy cercanas a la
de la PT, parece que estos polipéptidos representan isoformas de la
PT.
Se ha determinado la actividad entomotóxica de
los polipéptidos de la fracción PT o de la fracción F1 como se
describe en el ejemplo 1 anterior: a la concentración de un 1% en la
harina de trigo (3 mmol/kg), estos polipéptidos tienen una toxicidad
para los gorgojos equivalente a la de la harina de guisante pura.
Una concentración de 60 \mumol/kg es suficiente para impedir
cualquier infestación por los gorgojos.
Los polipéptidos de la fracción PT o de la
fracción F1, extraídos a partir de granos secos almacenados durante
varios años, conservan su actividad entomotóxica. Además, esta
actividad no está afectada por un calentamiento a 100ºC.
Se ha ensayado igualmente la toxicidad de la
proteína PT para la polilla de la harina Ephestia
kuehniellea (lepidópteros) y para el pulgón Acyrthosiphon
pisum (homópteros).
Los ensayos con polilla de la harina se han
efectuado sobre larvas de primera y segunda etapa de Ephestia
kuehniellea alimentadas con bolas de harina de trigo que
contenían diferentes concentraciones de la proteína PT (en mmoles
por kg de harina de trigo). Se ilustran los resultados mediante la
Figura 8.
(\circ= supervivencia a 0 días;
\blacktriangle = supervivencia a 4 días;
\Box = supervivencia a 10 días).
Estos resultados muestran que esta proteína es
muy tóxica desde una concentración de 0,25 mmol/kg.
El pulgón Acyrthosiphon pisum (homópteros)
se ha alimentado con medio artificial que contenía diferentes
concentraciones de la proteína PT.
(\Box= 3,3 \muM;
\blacktriangle = 17 \muM;
\blacklozenge= 46 \muM;
\circ= 84 \muM;
\sqbw= 100 \muM).
Los resultados, que se ilustran mediante la
Figura 9, muestran que aparece una importante mortalidad a partir de
la concentración 46 \mumol, mortalidad que es total a 100
\mumolar.
Claims (10)
1. Utilización como insecticida de un polipéptido
que comprende una secuencia que responde a la fórmula general (I)
siguiente:
(I)X_{1}CX_{2}CX_{3}CX_{4}CX_{5}CX_{6}CX_{7}
en la
que:
- -
- C representa un residuo de cisteína,
- -
- X_{1} responde a la secuencia y_{1}y_{2} en la que y_{1} e y_{2} representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, o bien y_{1} representa un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina e y_{2} representa ácido glutámico o ácido aspártico;
- -
- X_{2} responde a la secuencia y_{3}y_{4}y_{5} en la que y_{3} representa glutamina o asparagina e y_{4} e y_{5} representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina, treonina, valina, leucina, isoleucina y metionina;
- -
- X_{3} responde a la secuencia y_{6}y_{7}y_{8}y_{9}y_{10}y_{11}y_{12} en la que y_{6} representa un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, y_{7}, y_{11} e y_{12} representan cada uno prolina, y_{8} representa un aminoácido elegido entre fenilalanina, triptófano y tirosina, y_{9} representa ácido aspártico o ácido glutámico, y_{10} representa un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina y metionina;
- -
- X_{4} responde a la secuencia y_{13}y_{14}y_{15}y_{16} en la que y_{13}, y_{14}, y_{15}, y_{16} representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, o bien y_{14} representa un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, y_{13} e y_{15} representan cada uno un aminoácido básico e y_{16} representa ácido aspártico o ácido glutámico;
- -
- X_{5} representa un aminoácido básico;
- -
- X_{6} responde a la secuencia y_{17}y_{18}y_{19}y_{20}y_{21}y_{22}y_{23}y_{24}y_{25} en la que y_{17}, y_{19}, y_{21} e y_{23} representan cada uno un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina y metionina, y_{18} representa prolina, y_{20} e y_{24} representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina, y_{22} representa un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano y tirosina, e y_{25} representa un aminoácido elegido entre fenilalanina, triptófano y tirosina;
- -
- X_{7} responde a la secuencia y_{26}y_{27}y_{28}y_{29}y_{30} en la que y_{26} representa un aminoácido básico o un aminoácido elegido entre valina, leucina, isoleucina y metionina, y_{27} representa asparagina o glutamina o un aminoácido básico, y_{28} representa prolina e y_{29} e y_{30} representan cada uno un aminoácido elegido entre alanina, serina, glicina y treonina.
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho polipéptido presenta al menos un
60% de identidad con la albúmina PA1b de guisante.
3. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho polipéptido comprende una
secuencia de fórmula (I) definida anteriormente, en la que:
- -
- y_{1} representa alanina, y_{3} representa asparagina, y_{4} representa glicina, y_{6} representa serina, y_{7}, y_{11} e y_{12} representan cada uno prolina, y_{8} representa fenilalanina, y_{9} representa ácido glutámico, X_{5} representa arginina, y_{18} representa prolina, y_{20} representa glicina, y_{21} representa leucina, y_{24} representa glicina, y_{25} representa tirosina, y_{28} representa prolina, y_{30} representa glicina,
y:
- -
- y_{2} representa serina, y_{5} representa valina, y_{10} representa metionina, y_{13} representa glicina, y_{14} representa treonina, y_{15} representa serina, y_{16} representa alanina, y_{17} representa isoleucina, y_{19} representa valina, y_{22} representa valina, y_{23} representa isoleucina o valina, y_{26} representa arginina, y_{27} representa asparagina, y_{29} representa serina,
o bien:
- -
- y_{2} representa ácido aspártico, y_{5} representa alanina, y_{10} representa valina, y_{13} representa arginina, y_{14} representa serina, y_{15} representa arginina, y_{16} representa ácido aspártico, y_{17} representa valina, y_{19} representa isoleucina, y_{22} representa fenilalanina, y_{23} representa valina, y_{26} representa isoleucina, y_{27} representa histidina, y_{28} representa prolina e y_{29} representa treonina.
\newpage
4. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho polipéptido se elige del grupo
constituido por las albúminas PA1b y leginsulinas.
5. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicho
polipéptido se utiliza para proteger a los granos de cereal o
productos derivados de estos contra insectos devastadores.
6. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicho
polipéptido se utiliza para proteger a las plantas contra los
insectos devastadores de los granos de cereal.
7. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque dicho
polipéptido se utiliza a una concentración de 10 \mumol/kg a 100
mmol/kg.
8. Utilización según la reivindicación 7,
caracterizada porque dicho polipéptido se utiliza a una
concentración de 50 \mumol/kg a 10 mmol/kg.
9. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque comprende el
tratamiento del producto a proteger con una preparación que
comprende dicho polipéptido.
10. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende la
producción de una planta transgénica, transformada mediante al menos
un gen que codifica dicho polipéptido, y que expresa este último en
al menos uno de sus tejidos u órganos.
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