ES2226118T3 - Deteccion de agentes que dañan el adn. - Google Patents
Deteccion de agentes que dañan el adn.Info
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Abstract
Moléculas de ADN recombinante que comprenden un elemento de regulación que activa la expresión génica en respuesta al daño del ADN ligado operativamente a una secuencia de ADN que codifica una proteína indicadora emisora de luz, vectores recombinantes que contienen dichas moléculas de ADN y células que contienen las moléculas de ADN o los vectores recombinantes. Se describe también un procedimiento de detección de la presencia de un agente que causa o potencia el daño al ADN, que implica someter las células anteriormente descritos a un supuesto agente que daña al ADN y controlar la expresión de la proteína indicadora emisora de luz de las células.
Description
Detección de agentes que dañan el ADN.
La presente invención se refiere a métodos para
detectar agentes que causan o potencian daño al ADN (ADN = ácido
desoxirribonucleico), y a moléculas y células transformadas que
pueden ser empleadas con utilidad en tales métodos.
El daño al ADN es inducido por los de una
variedad de agentes tales como la luz ultravioleta, los rayos X,
los radicales libres, los agentes metilantes y otros compuestos
mutagénicos. Estos agentes pueden ocasionar daño al ADN que
comprende el código genético de un organismo y ocasionar mutaciones
en genes. En los microorganismos, tales mutaciones pueden conducir
al desarrollo de nuevas cepas indeseables del microorganismo. Por
ejemplo, pueden surgir bacterias resistentes a los antibióticos o a
los herbicidas. En los animales, estas mutaciones pueden conducir a
carcinogénesis, o pueden dañar los gametos para dar lugar a
defectos congénitos en la descendencia.
Estos agentes que dañan el ADN pueden modificar
químicamente los nucleótidos que comprenden ADN, y pueden también
romper los enlaces fosfodiéster que ligan los nucleótidos, o
desbaratar la asociación entre bases (T-A o
C-G). Para contrarrestar el efecto de estos agentes
que dañan el ADN, las células han desarrollado una serie de
mecanismos. Por ejemplo, la respuesta SOS en E. coli es una
respuesta celular perfectamente caracterizada que es inducida por
el daño al ADN y en la cual son expresadas las de una serie de
proteínas, entre las que se incluyen enzimas reparadoras del ADN,
que reparan el ADN dañado.
Hay numerosas circunstancias en las que es
importante identificar qué agentes pueden causar o potenciar el
daño al ADN. Es particularmente importante detectar los agentes que
ocasionan daño al ADN cuando se valora si no es peligroso exponer a
una persona a estos agentes. Por ejemplo, un método de detección de
estos agentes puede ser usado como análisis de mutagénesis para
seleccionar compuestos que son candidatos a ser usados como aditivos
alimentarios, medicamentos o cosméticos para valorar si el
compuesto de interés induce daño al ADN o no lo hace. Como
alternativa, pueden usarse métodos de detección de agentes que
dañan el ADN para supervisar la contaminación de los abastecimientos
de agua con contaminantes que contengan compuestos
mutagénicos.
Son conocidos varios métodos tales como la Prueba
de Ames para determinar la toxicidad de un agente. Desarrollos más
recientes están descritos en el documento WO 95/00834, que se
refiere al uso de un organismo emisor de luz (en particular de la
bacteria Photobacterium phosphoreum) para medir la toxicidad
de los efluentes industriales. El documento WO 95/07463 describe un
constructo génico formado a partir de ADN que codifica para Proteína
Fluorescente Verde y ADN que codifica para un elemento regulador
(tal como un promotor inducido por metales pesados), pudiendo ser
dicho constructo génico usado para detectar contaminación. El
documento WO 94/17208 describe el uso de promotores de estrés,
incluyendo el estrés o daño al ADN, con un gen informador para
determinar la toxicidad de un compuesto para una célula
eucariótica.
Según un primer aspecto de la presente invención,
se aporta una molécula de ADN recombinante que comprende un
elemento regulador que comprende el promotor y las secuencias
reguladoras del lado 5' del gen reparador RAD54 y está ligado
operativamente a una secuencia de ADN que codifica una proteína
fluorescente verde y derivados emisores de luz de la misma.
Según un segundo aspecto de la invención, se
aporta un vector recombinante que comprende una molécula de ADN
según el primer aspecto de la presente invención y un vector de
ADN.
Según un tercer aspecto de la invención, se
aporta una célula que contiene una molécula de ADN según el primer
aspecto de la invención o un vector recombinante según el segundo
aspecto de la presente invención.
Según un cuarto aspecto de la presente invención,
se aporta un método para detectar la presencia de un agente que
ocasiona o potencia daño al ADN, comprendiendo dicho método los
pasos de:
(a) someter a una levadura transformada con una
molécula de ADN recombinante según el primer aspecto de la
invención a un agente; y
(b) supervisar la expresión de la proteína
informadora emisora de luz en la célula.
Entendemos por "elemento regulador" una
secuencia de ADN que regula la transcripción de un gen con el cual
la misma está asociada.
Entendemos por "ligado operativamente" que
el elemento regulador es capaz de inducir la expresión de la
proteína informadora.
Entendemos por "proteína informadora" una
proteína que al ser expresada en respuesta al elemento regulador de
la molécula de ADN de la invención es detectable por medio de un
adecuado procedimiento de análisis.
El método del cuarto aspecto de la invención es
adecuado para valorar si un agente puede ocasionar daño al ADN o no
puede hacerlo. Dicho método es particularmente útil para detectar
los agentes que ocasionan daño al ADN al valorar si no reviste
peligro exponer a una persona a agentes que dañan el ADN. Por
ejemplo, el método puede ser usado como análisis de mutagénesis para
determinar si agentes conocidos tales como sustancias que son
candidatas a ser usadas como comestibles, medicamentos o cosméticos
inducen daño al ADN o no lo hacen. Como alternativa, el método de
la invención puede ser usado para supervisar la contaminación de
abastecimientos de agua con contaminantes que contengan agentes que
dañen el ADN.
El método del cuarto aspecto de la invención
puede ser igualmente usado para valorar si un agente puede
potenciar el daño al ADN. Por ejemplo, determinados agentes pueden
ocasionar daño al ADN a base de inhibir la reparación del ADN (por
ejemplo impidiendo la expresión de una proteína reparadora) sin
infligir directamente daño al ADN. Estos agentes son a menudo
conocidos como coagentes mutagénicos, e incluyen agentes tales como
el plomo.
El elemento regulador de la molécula de ADN del
primer aspecto de la invención activa la expresión de la proteína
informadora cuando se produce daño al ADN. Tales elementos
reguladores comprenden idealmente una secuencia promotora que
induce a la RNA polimerasa a fijarse a la molécula de ADN y a
empezar a transcribir el ADN que codifica para la proteína
informadora. El elemento regulador puede también comprender otras
secuencias de ADN funcionales tales como secuencias de iniciación
de la traducción para unión al ribosoma o secuencias de ADN que
unen factores de transcripción que promueven la expresión génica a
continuación de un daño al ADN. Los elementos reguladores pueden
incluso codificar para proteínas que actúan desalojando del gen
regulado inhibidores de la transcripción, incrementando con ello la
transcripción de ese gen.
El promotor y las secuencias reguladoras del lado
5' del gen reparador RAD54 pueden sacarse de levadura, y en
particular de Saccharomyces cerevisiae. Lo más preferido es
que el elemento regulador comprenda el promotor y las secuencias
reguladoras del lado 5' del gen reparador RAD54 que corresponden a
la secuencia de ADN identificada como SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 1
o a un fragmento o análogo funcional del mismo.
La Proteína Fluorescente Verde (GFP) es de la
medusa Aquorea victoria y es capaz de absorber luz azul y
reemite una luz verde fácilmente detectable, y es por consiguiente
adecuada como proteína informadora. La GFP puede ser ventajosamente
usada como proteína informadora porque su medición es sencilla y no
requiere reactivos, y la proteína es atóxica.
Los derivados de la Proteína Fluorescente Verde
incluyen secuencias de ADN que codifican para análogos
polipeptídicos o fragmentos polipeptídicos de GFP que son capaces
de emitir luz. Muchos de estos derivados absorben y reemiten luz a
longitudes de onda distintas de las de la GFP que se encuentra
endógenamente en la medusa Aquorea victoria. Por ejemplo,
las moléculas de ADN preferidas según el primer aspecto de la
invención tienen una secuencia de ADN que codifica el derivado S65T
de GFP (en el cual la serina 65 de la GFP está sustituida por una
teronina). La GFP S65T tiene la ventaja de que es más luminosa que
la GFP de tipo salvaje (al ser excitada al nivel de su pico de la
longitud de onda más larga) y tan sólo presenta un lento
fotoblanqueo. Además, la GFP S65T produce una buena producción
cuántica de fluorescencia y casa con la salida de los láseres de
iones de argón que son usados en los clasificadores de células
activados por fluorescencia. Las células según el tercer aspecto de
la invención que contienen moléculas de ADN que codifican GFP S65T
pueden ser usadas según el método del cuarto aspecto de la
invención y son particularmente útiles cuando se mide la emisión de
luz de extractos celulares (véase lo expuesto más adelante).
Otra secuencia de ADN preferida codifica para una
GFP mejorada para levadura (YEGFP) tal como el derivado de GFP
descrito por Cormack et al. (1997) (en Microbiology 143 pp.
303 - 311). Tal YEGFP tiene una secuencia de aminoácidos que está
predispuesta al uso en levadura. Así, la YEGFP es particularmente
adecuada para transformar células según el tercer aspecto de la
invención que sean levadura. Además, hemos descubierto que la luz
emitida por la YEGFP en tal levadura es incluso mayor que la
emitida por los derivados S65T. Por ejemplo, la producción de luz
de la cepa de levadura FF18984 (también conocida como Y486)
transformada con una molécula de ADN que codifica YEGFP era el
doble de la producción de la FF18984 transformada con una molécula
de ADN que codifica GFP S65T. Hemos descubierto que la YEGFP es
particularmente adecuada para ser usada en métodos según el cuarto
aspecto de la invención que suponen la supervisión de la emisión de
luz de células intactas según el tercer aspecto de la invención
(que se expone más detalladamente más adelante).
Las moléculas de ADN que codifican YEGFP son
también útiles porque la YEGFP es menos sensible al calor que la
GFP naciente.
Las moléculas de ADN según el primer aspecto de
la invención comprenden un elemento regulador de RAD54 ligado
operativamente a una secuencia de ADN que codifica una GFP o un
derivado emisor de luz de la misma.
La molécula de ADN puede estar contenida dentro
de un adecuado vector de ADN para formar un vector recombinante
según el segundo aspecto de la presente invención. El vector puede
ser, por ejemplo, un plásmido, un cósmido o un fago. Tales vectores
recombinantes son de gran utilidad al replicar la molécula de ADN
del primer aspecto de la invención. Además, los vectores
recombinantes son muy útiles para transformar células con la
molécula de ADN, y pueden también promover la expresión de la
proteína informadora.
Los vectores recombinantes incluirán
frecuentemente uno o varios marcadores seleccionables para permitir
la selección de las células transfectadas con el vector de ADN, y
preferiblemente para permitir la selección de células que alberguen
los vectores recombinantes que incorporan la molécula de ADN del
primer aspecto de la invención. Los ejemplos de tales marcadores
seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a la
canamicina (o G148) y a la ampicilina. Los marcadores
seleccionables pueden incluir aquéllos que restablecen la
prototrofia, como por ejemplo el gen URA3 de levadura.
Los vectores recombinantes pueden ser diseñados
de forma tal que el vector se replique autónomamente en el citosol
de la célula. En este caso pueden ser necesarios en el vector
recombinante elementos que induzcan la replicación de ADN. Un
elemento adecuado se saca del plásmido 2 \mu. Tales vectores
replicantes pueden dar lugar a múltiples copias de la molécula de
ADN en un transformante, y son por consiguiente útiles cuando se
requiere sobreexpresión (y con la misma una incrementada emisión de
luz) de la proteína informadora.
Como alternativa, el vector recombinante puede
ser diseñado de forma tal que el vector y la molécula de ADN del
primer aspecto de la invención se integren en el genoma de una
célula. Tal integración tiene la ventaja de la mejorada estabilidad
en comparación con los plásmidos replicativos. En este caso son
deseables las secuencias de ADN que favorecen la integración
perseguida (p. ej. por recombinación homóloga). Por ejemplo, la
incorporación en el vector recombinante de fragmentos del gen HO
del cromosoma IV de Saccharomyces cerevisiae favorece la
perseguida integración en Saccharomyces cerevisiae o en
líneas celulares derivadas de la misma. Se prefiere que el fragmento
del gen HO tenga la secuencia identificada como SECUENCIA
IDENTIFICADORA Nº 5 o sea un derivado de la misma. Es también
posible insertar en el genoma múltiples copias de vectores
recombinantes integradores. Esto permitirá habilitar una mayor
expresión e incrementar adicionalmente la salida de señal. Por
ejemplo, los vectores pueden ser destinados a cromosoma XII usando
secuencias del conjunto de ADN ribosomal.
Preferiblemente, los vectores recombinantes
pueden ser formados a partir de vectores PFA o derivados de los
mismos que son conocidos en la técnica (véase Wach et al.
(1994) Yeast 10 pp. 1793-1808).
Las moléculas de ADN preferidas según el primer
aspecto de la invención tienen una secuencia de ADN que codifica
para una GFP o un derivado emisor de luz de la misma que se obtiene
de estos vectores PFA.
Son vectores recombinantes preferidos los PFA
KANMX3GFP-RAD54, pWDH443 y pWDH444, que se describen
en detalle en el Ejemplo. Las preferidas moléculas de ADN del
primer aspecto de la presente invención que comprenden un elemento
regulador de RAD54 ligado operativamente a una secuencia de ADN que
codifica para una GFP o un derivado emisor de luz de la misma
pueden ser obtenidas de estos vectores recombinantes PFA
KANMX3GFP-RAD54, pWDH443 o pWDH444 que son los más
preferidos.
El vector recombinante PFA
KANMX3GFP-RAD54 comprende el vector que tiene la
secuencia de la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 4 del listado de
secuencias con el elemento regulador que tiene la secuencia de la
SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 1 del listado de secuencias o un
fragmento o análogo funcional del mismo insertado entre los sitios
para las enzimas de restricción Pac1 y BamH1 del vector que tiene
la secuencia de la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 4 del listado de
secuencias.
El vector recombinante pWDH443 preferido
comprende el PFA KANMX3GFP-RAD54 con un fragmento
del gen HO correspondiente a la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 5
insertado en el sitio singular para BamH1 del
KANMX3GFP-RAD54. El pWDH443 comprende ADN que
codifica para GFP S65T y es capaz de integrarse en el genoma de la
levadura.
El vector recombinante pWDH444 preferido
comprende un fragmento del plásmido 2 \mu ligado con el fragmento
grande generado por la digestión de pWDH443 con BamH1 y Pme1. El
fragmento del plásmido 2 \mu puede corresponder precisamente al
gran fragmento de HindIII/BamH1 liberado del plásmido pRDK249, como
se describe en la publicación Journal Biological Chemistry, Volumen
266, p. 14049, Figura 1 (1991) en el artículo de Johnson, A. W. y
Kolodner, R.D. El ADN del plásmido 2 \mu en pWDH444 permite a
este vector recombinante replicarse autónomamente en el citosol de
una célula huésped, y permite con ello que el vector recombinante
esté presente en grandes números de copias (lo cual puede ser
ventajoso cuando se desea una sobreexpresión de GFP y una
incrementada capacidad de emisión de luz).
Otros vectores recombinantes preferidos son el
yEGFP-443 y el yEGFP-444 (véanse
las Figs. 11 y 12).
El yEGFP-443 es sacado de pWDH443
y comprende el fragmento grande de pWDH443 generado mediante
digestión con Pac1 y Asc1 con el producto de digestión con Pac1 y
Asc1 de la SECUENCIA IDENTIFICADORA
Nº 6 (que codifica una YEGFP) ligado en dicho fragmento grande. El yEGFP-443 comprende ADN que codifica para YEGFP y es capaz de integrarse en el genoma de la levadura.
Nº 6 (que codifica una YEGFP) ligado en dicho fragmento grande. El yEGFP-443 comprende ADN que codifica para YEGFP y es capaz de integrarse en el genoma de la levadura.
El yEGFP-444 es sacado de pWDH444
y comprende el fragmento grande de pWDH444 generado mediante
digestión con Pac1 y Asc1 con el producto de digestión con Pac1 y
Asc1 de la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 6 (que codifica una YEGFP)
ligado en dicho fragmento grande. El ADN del plásmido 2 \mu en
yEGFP-444 permite a este vector recombinante
replicarse autónomamente en el citosol de una célula huésped, y
permite con ello que el vector recombinante esté presente en
grandes números de copias (lo cual puede ser ventajoso cuando se
desea sobreexpresión de GFP y una incrementada capacidad de emisión
de luz).
Según el tercer aspecto de la invención, la
molécula de ADN es incorporada al interior de una célula. Tales
células huésped pueden ser procarióticas o eucarióticas. Las
células huésped adecuadas incluyen bacterias, células vegetales,
levaduras y células de insectos y mamíferos. Las células huésped
preferidas son células de levadura tales como Saccharomyces
cerevisiae. Las levaduras son preferidas porque las mismas
pueden ser fácilmente manipuladas como las bacterias pero son
eucarióticas y por consiguiente tienen sistemas de reparación del
ADN que son más estrechamente afines a los humanos que los de las
bacterias. Así, el uso de tal levadura en el método de la invención
representa un método mejorado para detectar el daño al ADN en
comparación con la prueba de Ames. La prueba de Ames usa bacterias
(cepas de Salmonella typhimurium) que al ser expuestas a un
putativo agente dañador del ADN pueden redundar en un resultado de
genotoxicidad (positivo o negativo) que, debido a las diferencias
existentes entre los procariotas y los eucariotas, no necesariamente
sería representativo de los efectos de tales agentes en eucariotas
tales como los humanos.
Otra ventaja de usar células de levadura como
huésped es la de que los sistemas reparadores del ADN son
inducibles en la levadura a diferencia de lo que sucede en los
humanos, en los que los sistemas reparadores son constitutivos en
gran medida.
Las células de levadura preferidas incluyen las
siguientes:
| (I) | Y485 en forma haploide; |
| (II) | Y486 (también conocida como FF18984) en forma haploide; |
| (III) | Y485/486 en forma diploide; |
| (IV) | FY73; |
| (V) | YLR030w\alpha; y |
| (VI) | Y300. |
Estas cepas pueden encontrarse todas ellas en las
colecciones de cepas de levadura nacionales.
El tipo de cepa de levadura que se use puede
influenciar la respuesta al daño al ADN, y hemos descubierto que la
emisión de luz puede variar en gran medida en dependencia de la
cepa de levadura que se use. A este respecto hemos descubierto que
las cepas (I), (II) y (III) anteriormente enumeradas son cepas que
son particularmente útiles para ser usadas según el método de la
invención.
Las células huésped que son usadas para la
expresión de la proteína que es codificada por la molécula de ADN de
la invención son idealmente transformadas de manera estable, si
bien no se excluye el uso de células transformadas de manera
inestable (transitorias).
Las células transformadas según el tercer aspecto
de la invención pueden ser formadas según los procedimientos que se
indican a continuación. Los vectores PFA pueden ser usados como
adecuado material de partida a partir del cual pueden formarse las
moléculas de ADN del primer aspecto de la invención y los vectores
recombinantes del segundo aspecto de la invención. Los vectores PFA
conocidos contienen o pueden ser manipulados para contener ADN que
codifica para GFP y derivados de la misma. Tales vectores pueden
ser manipulados, mediante conocidas técnicas de biología molecular,
para insertar un adecuado elemento regulador junto a la secuencia
codificante de GFP, formando así una molécula de ADN del primer
aspecto de la invención que está contenida dentro de un vector
recombinante según el segundo aspecto de la invención. Por ejemplo,
los vectores pWDH443, pWDH444, yEGFP-443 e
yEGFP-444 pueden sacarse de tales vectores PFA. La
molécula de ADN puede ser escindida del vector recombinante, o más
preferiblemente la molécula de ADN contenida dentro del vector
recombinante puede ser usada para transformar una célula y para con
ello formar una célula según el tercer aspecto de la invención. La
célula es idealmente una célula de levadura (por ejemplo una de las
cepas anteriormente descritas). Tales células transformadas pueden
ser usadas según el método del cuarto aspecto de la invención para
valorar si determinados agentes inducen o potencian daño al ADN o
no lo hacen. La expresión de GFP es inducida en respuesta al daño al
ADN, y la luz que es emitida por la GFP puede ser medida fácilmente
usando un fluorímetro como índice del daño ocasionado al ADN. Por
ejemplo, la luz emitida por la GFP a 511 nm (tras excitación a una
longitud de onda de entre 475 y 495 nm, y p. ej. a 488 nm) en
respuesta al daño infligido al ADN puede ser evaluada en una
suspensión de un número definido de células enteras o bien en una
cantidad definida de material liberado por células a continuación
de la rotura de las mismas.
Muchos métodos conocidos para detectar el daño
infligido al ADN (incluyendo la Prueba de Ames y métodos afines)
analizan el daño perdurable al ADN, como punto final, ya sea en
forma de ADN mal reparado (mutaciones y recombinaciones) o bien
como daño no reparado en forma de ADN fragmentado. Sin embargo, el
daño al ADN es en su mayor parte reparado antes de que pueda ser
medido tal punto final, y el daño perdurable al ADN se produce tan
sólo si las condiciones son tan severas que los mecanismos de
reparación han llegado a quedar saturados. Los métodos preferidos
del cuarto aspecto de la presente invención son mucho más sensibles
que estos métodos conocidos porque detectan la actividad reparadora
(que hemos descubierto que es detectable cuando el daño infligido
de hecho al ADN es indetectable), lo cual impide que sea alcanzado
el punto final anteriormente mencionado. Por consiguiente, el
método del cuarto aspecto de la invención puede ser usado para
detectar la presencia de agentes que dañan el ADN o de agentes que
potencian el daño al ADN a concentraciones inferiores al umbral
para el cual puede ser detectado el daño infligido de hecho al
ADN.
El método del cuarto aspecto de la invención es
particularmente útil para detectar los agentes que inducen daño al
ADN a bajas concentraciones. Los métodos pueden ser usados para
seleccionar compuestos, tales como los que son candidatos a ser
usados como medicamentos, aditivos alimentarios o cosméticos, para
valorar si no reviste peligro exponer a un organismo viviente, y en
particular a personas, a tales compuestos.
Como alternativa, los métodos del cuarto aspecto
de la invención pueden ser empleados para detectar si
abastecimientos de agua están o no están contaminados por agentes
que dañan el ADN o por agentes que potencian el daño al ADN. Por
ejemplo, los métodos pueden ser usados para supervisar efluentes
industriales para determinar la presencia de contaminantes que
puedan conducir a un incrementado daño al ADN en personas o en
otros organismos expuestos a la contaminación.
Cuando los métodos son usados para detectar si
abastecimientos de agua están o no están contaminados, las células
según el tercer aspecto de la invención son idealmente organismos
unicelulares tales como bacterias, algas, protozoos y en particular
levadura.
La expresión de proteína informadora emisora de
luz puede ser supervisada según el método de la invención en
extractos celulares (en cuyo caso pueden usarse células
transformadas con cualesquiera de las moléculas de ADN recombinante
y/o los vectores recombinantes anteriormente descritos) o bien en
muestras que contengan células enteras intactas (en cuyo caso se
usan preferiblemente células de levadura transformadas con
yEGFP-443 e yEGFP-444).
Hay varias ventajas que van asociadas al uso de
células enteras. Puesto que no hay necesidad de abrir las células
rompiéndolas, se ve reducido el número de pasos de tratamiento. La
producción de extractos requiere que sean efectuadas las
operaciones de recolección de las células, lavado, rotura con perlas
de vidrio y centrifugación para purificar el extracto. La reducción
del número de pasos de tratamiento reduce también el riesgo de que
sean cometidos errores de los que surgen en la manipulación, y hace
que el método sea mucho más rápido. Además, pueden lograrse
simultáneamente la densidad de células y la emisión de luz, lo cual
proporciona mayor sensibilidad. Por consiguiente, el método de la
invención es preferiblemente ejecutado a base de realizar las
operaciones de cultivar células transformadas con un vector
recombinante según el segundo aspecto de la invención (tal como
yEGFP-443 o yEGFP-444), incubar las
células con el agente que putativamente ocasiona daño al ADN por
espacio de un periodo de tiempo predeterminado, y supervisar la
expresión de la proteína informadora emisora de luz directamente en
una muestra de las células.
Cuando se usan células enteras, las mismas están
preferiblemente contenidas en medio de cultivo de baja
fluorescencia. Esto puede obviar la necesidad de lavar las células
antes de que sean efectuadas mediciones, y por consiguiente reduce
aún más el número de pasos que deben ser llevados a cabo en el
método. Por ejemplo, la levadura preferida según el tercer aspecto
de la invención puede ser cultivada en medio F1 (descrito en
Walmsley et al. (1983) Mol. Gen. Genet. 192 pp.
361-365).
Según una realización preferida del método de la
invención, pueden ser transformadas con yEGFP-444 y
cultivadas en medio F1 células FF18984. Entonces puede ser añadido
al medio F1 que contiene las células un putativo agente dañador del
ADN (como p. ej. un aditivo alimentario o un medicamento potencial o
un agente contenido en una muestra de agua o una muestra de
efluente). Se dejan entonces las células en cultivo por espacio de
un definido periodo de tiempo, después de lo cual se retira una
muestra de las células y se mide en la misma la fluorescencia. Esta
medición puede ser efectuada a base de valorar la concentración de
células y la fluorescencia en la muestra usando nefelometría
(dispersión de la luz). Por ejemplo, las células pueden ser
iluminadas a 600 nm, y la luz dispersada (a 600 nm) puede ser
valorada a 90 grados con respecto al haz incidente. La luz emitida
por la GFP puede ser medida mediante excitación a 495 nm y midiendo
la luz fluorescente emitida a 518 nm a 90 grados con respecto al
haz incidente. Ambas mediciones pueden ser efectuadas en una sola
cubeta. Una emisión de luz de GFP normalizada es calculada
dividiendo el valor de fluorescencia de la GFP por el valor de
dispersión de la luz por parte de las células enteras (a 600 nm).
Esta realización de la invención tiene la ventaja de que puede ser
ejecutada fácilmente con un mínimo de pasos (es decir, con un
periodo de incubación seguido por una medición directa de la
fluorescencia).
El método de la invención debería idealmente
emplear fluorímetros sensibles y reducir la dispersión de la luz
para que pueda ser medida con precisión la emisión de luz de la
proteína informadora. Hemos descubierto que la sensibilidad puede
ser mejorada usando un filtro de 495 nm que es introducido entre la
cámara de la muestra y el detector de emisión del fluorímetro. Un
filtro de este tipo reduce adicionalmente la influencia de la
dispersión de la luz y mejora la sensibilidad del método cuando se
usan muestras que contienen células enteras.
Se describe a continuación a modo de ejemplos la
presente invención haciendo referencia a los dibujos acompañantes,
en los cuales:
La Figura 1 es una representación esquemática de
ADN que codifica para el promotor de RAD54 en la que se muestra
dónde los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa que
se usan en el Ejemplo 1 se unen al ADN;
la Figura 2 es una representación esquemática de
ADN que codifica para el promotor de RAD54 y es preparado mediante
amplificación por reacción en cadena de la polimerasa como se
describe en el punto 1.1 del Ejemplo 1;
la Figura 3 es una representación esquemática del
constructo PFA KANMX3GFP usado en el Ejemplo 1 en la preparación de
moléculas de ADN de la invención;
la Figura 4 es una representación esquemática del
vector recombinante PFA KANMX3GFP-RAD54 del Ejemplo
1 que incorpora una molécula de ADN de la invención;
la Figura 5 es una representación esquemática del
vector recombinante pWDH443 del Ejemplo 1 que incorpora una
molécula de ADN de la invención;
la Figura 6 es una representación esquemática del
vector recombinante pWDH444 del Ejemplo 1 que incorpora una
molécula de ADN de la invención;
la Figura 7 es un gráfico que ilustra el
incremento de la fluorescencia que se produce en células según el
tercer aspecto de la invención cuando las células son expuestas a
un agente que daña el ADN;
la Figura 8 es un gráfico que ilustra la
evolución a lo largo del tiempo de la inducción de luminosidad por
parte de un agente que daña al ADN para una célula transformada con
pWDH444;
la Figura 9 es un gráfico que ilustra la
evolución a lo largo del tiempo de la inducción de luminosidad por
parte de un agente que daña al ADN para una célula transformada con
pWDH443;
la Figura 10 es un gráfico que ilustra el efecto
de distintas concentraciones de un agente dañador del ADN en la
luminosidad del extracto celular producida por un agente dañador
del ADN para extractos de una célula transformada con pWDH444;
la Figura 11 es una representación esquemática
del vector recombinante yEGFP-443 del Ejemplo 3 que
incorpora una molécula de ADN de la invención;
la Figura 12 es una representación esquemática
del vector recombinante yEGFP-444 del Ejemplo 2 que
incorpora una molécula de ADN de la invención; y
la Figura 13 es un gráfico que ilustra los
espectros de emisión de células de levadura no transformadas y de
células transformadas con yEGFP-444 -/+ 0,01% MMS
(MMS = sulfonato de metilmetano).
Fue preparado un fragmento de ADN que contenía la
región promotora del gen RAD54 y está representado esquemáticamente
la Fig. 2.
El gen RAD54 está en el Cromosoma VII de la
levadura Saccharomyces cerevisiae. La secuencia de todo el
genoma de Saccharomyces cerevisiae está disponible en bases
de datos públicas. Por ejemplo, en Internet se puede acceder en
muchas direcciones tales como la
http://genome-www-stanford.edu/
a la base de datos que contiene el genoma de Saccharomyces
cerevisiae. La región relevante del Cromosoma VII que contiene
el gen RAD54 y el elemento regulador de interés abarca las bases
193710-198141.
El fragmento de ADN que contiene la región
promotora del gen RAD54 fue preparado mediante amplificación por
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de la región no
codificante del lado de cabeza de RAD54 entre el codón de
iniciación de RAD54 (ATG) y el gen siguiente (SUT1). Esta región
abarca 1729 pares de bases y contiene todas las secuencias de las
que se sabe que intervienen en la regulación de RAD54 (es decir, el
elemento regulador). Esta región es codificada por la SECUENCIA
IDENTIFICADORA Nº 1.
La amplificación por reacción en cadena de la
polimerasa fue efectuada usando dos cebadores de la reacción en
cadena de la polimerasa llamados BAM54 y 54PAC, que están
identificados como las secuencias que corresponden a la SECUENCIA
IDENTIFICADORA Nº 2 y a la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 3 del listado
de secuencias, respectivamente.
El cebador BAM54 comprende las 31 bases
siguientes:
5'
cctccggatcc gacatacgatgacctcaatg
3'
El cebador BAM54 fue diseñado para contener las
bases ggatcc para asegurar que el producto de la reacción en
cadena de la polimerasa contuviese un sitio de restricción para
BamH1 y las bases gacatacgatgacctcaatg que corresponden a
las primeras 20 bases después del gen SUT1 a fin de que el BAM54
pueda unirse al deseado fragmento de ADN. Las bases cctcc del lado
5' fueron añadidas para asegurar que BamH1 pudiese efectuar el
corte en el sitio introducido.
El cebador 54PAC comprende las 44 bases
siguientes:
5'
cctccgttaattaa cat cagttataaggaaatatatatggtacc
3'
El cebador 54PAC fue diseñado para contener las
bases ttaattaa para asegurar que el producto de la reacción
en cadena de la polimerasa contuviese un sitio de restricción para
Pac1, y las bases cagttataaggaaatatatatggtacc corresponden a
las primeras 27 bases del lado de cabeza del gen RAD54 a fin de que
el cebador 54PAC pueda unirse al deseado fragmento de ADN, y las
bases cctccg del lado 5' fueron añadidas para asegurar que Pac1
pudiese efectuar el corte en el sitio introducido. El cebador 54PAC
forma la hebra antisentido del fragmento amplificado, y por
consiguiente las bases en 54PAC que en última instancia codifican
para una proteína informadora de una molécula de ADN según el primer
aspecto de la invención son "codones antisentido" de tal manera
que las bases cat fueron introducidas para añadir el
aminoácido metionina que actúa como un codón de iniciación en un
vector recombinante del segundo aspecto de la invención, y las
bases cctccgttaattaa cat son también una secuencia
codificante "antisentido".
La Figura 1 muestra una representación
esquemática de las partes del lado 5' y del lado 3' del fragmento
de ADN (1) que fue amplificado por reacción en cadena de la
polimerasa e ilustra dónde los cebadores BAM54 (2) y 54PAC (3) se
unen al fragmento. La Fig. 1 muestra además el sitio de restricción
para BamH1 (4) y el sitio para Pac1 (5) que fueron introducidos en
el fragmento amplificado por reacción en cadena de la polimerasa
(1). Se muestran también el inicio de la transcripción, los codones
para los primeros 5 aminoácidos de una proteína expresada desde el
promotor de RAD54 y la dirección de transcripción.
A continuación de la amplificación por reacción
cadena de la polimerasa, el ADN que codifica para el promotor de
RAD54 fue insertado en un vector PFA para formar un vector
recombinante de la invención (véase 1.3).
Se usó un vector PFA en la construcción de
vectores recombinantes según la invención. La serie de plásmidos PFA
ha sido publicada anteriormente (Wach et al. (1994) Yeast 10
pp. 1793-1808).
Se sacó del plásmido conocido PFA KANMX3
(ilustrado en la Figura 1B, página 1797 de Wach et al.) un
plásmido PFA KANMX3GFP. En el plásmido usado por los inventores,
las secuencias de lacz de PFA KANMX3 fueron sustituidas por
secuencias de GFP para formar PFA KANMX3GFP. Se adjunta la secuencia
de PFA KANMX3GFP como la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 4 (véase la
Fig. 3).
El PFA KANMX3GFP contiene una secuencia de ADN
que codifica para el derivado S65T de GFP que tiene un sitio para
Pac1 justo después del codón de iniciación de la transcripción del
gen de GFP. El derivado S65T fue insertado en el vector como un
fragmento de Pac1/Asc1. El PFA KANMX3GFP contiene también ADN (2689
pares de bases) que codifica para un gen que es capaz de conferir
resistencia a la canamicina.
El ADN que codifica para el promotor de RAD54
(véase 1.1) y el PFA KANMX3GFP (véase 1.2) fueron tratados con las
enzimas de restricción BamH1 y Pac 1. Entonces se hizo el
constructo KANMX3GFP-RAD54 a base de ligar
singularmente el ADN que codifica para el promotor de RAD54 (con
extremos adhesivos cortados por BamH1 y Pac1) en el PFA KANMX3GFP
linealizado entre el sitio singular para BamH1 y Pac1 junto a la
secuencia codificante de S65T. Para facilitar la clonación, el PFA
KANMX3GFP fue también tratado con Sma1. El sitio para Sma1 en PFA
KANMX3GFP está situado entre los sitios para BamH1 y Pac1, y por
consiguiente el tratamiento con Sma1 impidió la recircularización
del vector. El sitio para Pac1 está "en marco", de tal manera
que puede ser transcrito el gen de S65T.
El constructo KANMX3GFP-RAD54 fue
cortado en el sitio singular para BamH1, y a continuación fue
tratado con ADN polimerasa (pol1) y fosfatasa intestinal de ternero
para producir extremos romos y no autoligables. Un fragmento de Dra1
(véase la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 5) del gen HO fue entonces
ligado entre los extremos romos del constructo
KANMX31-RAD54 tratado para formar el constructo
pWDH443.
El gen HO se encuentra en el Cromosoma IV del
cromosoma de levadura, y las secuencias están contenidas en la base
de datos del genoma de Saccharomyces cerevisiae, que es del
dominio público. En Internet puede accederse a la base de datos en
muchas direcciones, como por ejemplo la
http://genome-www.stanford.edu/.
El fragmento de Dra1 del gen HO contiene un sitio
para BamH1 en las bases 711 - 716 de la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº
5 y fue empleado para promover la integración del constructo en el
genoma de levadura mediante la conocida técnica de integración
homóloga.
El constructo pWDH443 puede ser cortado con BamH1
y usado para transformar levadura (Y485/486) con selección con G418
(un derivado de canamicina). La transformación fue efectuada usando
el conocido procedimiento que utiliza acetato de litio (véase
http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/human_{-}genetics/gietz/Trafo.html).
El constructo pWDH443 se integra en el genoma de
levadura en el locus de HO. El pWDH443 es un vector recombinante
preferido según el segundo aspecto de la invención, y las células
transformadas con pWDH443 son células preferidas según el tercer
aspecto de la invención.
Entonces fue desarrollado el constructo pWDH444
(mediante manipulación de pWDH443) de forma tal que el constructo
era capaz de experimentar replicación dentro de un huésped de
levadura para estar presente en forma de copias múltiples. Para
hacer esto fueron ligados en pWDH443 cortado con BamH1 y Pme1 un
fragmento de ADN (romo en un extremo y cortado con BamH1 en el otro)
que contenía secuencias que codifican para factores de replicación
con acción cis del plásmido 2 \mu de levadura que se da de manera
natural, el gen URA3 de levadura (prototrofia de uracilo) y las
secuencias del plásmido bacteriano pBR322 que confieren la
capacidad replicativa (ORI) y resistencia a la ampicilina (AMPr) al
constructo (al mantenerse en E. coli). Este corte retiró un
fragmento de pWDH443 que contenía un sitio para Not1. La
construcción mixta de ligación fue cortada con Not1 antes de la
transformación para impedir la recircularización de pWDH443. El
sitio para BamH1 dentro del fragmento de HO (véase los indicado
anteriormente) y el fragmento de HO está por consiguiente truncado
en el pWDH444.
Se encuentran en forma de un fragmento contiguo
en varios plásmidos las secuencias contenidas en el fragmento del
plásmido 2 y correspondientes al origen de 2 \mu de levadura, al
gen URA3 y a la resistencia a la Ampicilina y a la secuencia ORI de
pBR322. (Por ejemplo el vector lanzadera llamado Yep420). El
fragmento del plásmido 2 \mu usado por los inventores corresponde
exactamente al gran fragmento hecho con HindIII/BamH1 y liberado
así del plásmido pRDK249, descrito en el Journal Biological
Chemistry, Volumen 266, p. 14049, Figura 1 (1991) en el artículo de
Johnson, A. W. y Kolodner, R.D. Específicamente, el plásmido fue en
primer lugar cortado con HindIII, y fue a continuación tratado con
ADN polimerasa 1 para producir un extremo romo. El plásmido fue
entonces tratado con BamH1, siendo así producido un fragmento que
era romo en un extremo y tenía un extremo de BamH1 en el otro. El
fragmento fue purificado mediante electroforesis en gel.
El constructo pWDH444 fue usado para transformar
levadura (como se ha descrito para pWDH443) seleccionando para
prototrofia de uracilo (URA3) o resistencia (a la canamicina) G418,
y era capaz de experimentar replicación autónoma con la levadura.
El pWDH444 es un vector recombinante preferido según el segundo
aspecto de la invención, y las células transformadas con pWDH444 son
células preferidas según el tercer aspecto de la invención.
La luz emitida por GFP a 511 nm (tras excitación
a 488 nm) de células de levadura transformadas con pWDH443 y
pWDH444 y que expresan GFP fue medida en un fluorímetro en ausencia
(controles) o en presencia de compuestos de los que se sabe que
inducen daño al ADN, tales como Sulfonato de Metilmetano (MMS). Las
muestras fueron analizadas en forma de células enteras o bien de
extractos celulares.
Se usaron en este Ejemplo (véase lo indicado
anteriormente) cepas de levadura Y485 e Y486 en forma haploide o
Y485/486 en forma diploide.
Los medios YP más un 2% de glucosa (YPD) y los
medios sintéticos más un 2% de glucosa (SD) fueron preparados como
se describe en Kaiser et al. (1994) (Methods in Yeast
Genetics Cold Spring Harbor Laboratory Coruse Manual, NY: Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, NY).
Fue usado como fuente de inoculo un cultivo en
fase estacionaria de células cultivadas en medio SD. Partes
alícuotas (30 \mul) de células fueron inoculadas en 3 ml de SD en
tubos de ensayo de 15 ml. Los de la mitad de los tubos fueron
entonces suplementados con un 0,01% de MMS (dejándose como
controles los tubos restantes). Los tubos fueron incubados a 25ºC
por espacio de 16 h en un sacudidor orbital a 120 rpm, y fueron a
continuación transferidos a una nevera mientras se mantenía la
agitación. Las células fueron entonces transferidas a tubos
eppendorf de 1,5 ml, recolectadas mediante centrifugación (10
seg.), lavadas 2 veces en agua destilada estéril, y puestas
nuevamente en suspensión en 250 \mul de tampón de extracción.
Para las mediciones de fluorescencia en las
células enteras, las células lavadas fueron transferidas
directamente a cubetas que contenían 2,75 ml de agua destilada
estéril.
Para los estudios en extractos celulares, 100
\mul de perlas de vidrio de 400-600 nm de
diámetro fueron añadidos a los tubos de células, que fueron
entonces puestos en una máquina BIO 101 Fastprep FP120 para romper
mecánicamente las células. A continuación de una centrifugación por
espacio de 30 seg., el supernatante fue transferido a un tubo
limpio. La galleta de perlas fue lavada en otros 250 \mul de
tampón de extracción, y esto fue añadido al supernatante de la
extracción anterior. Fueron entonces transferidos a una cubeta 200
\mul del extracto reunido en 300 \mul de agua.
Las mediciones de fluorescencia fueron llevadas a
cabo con un Espectrómetro de Fluorescencia Perkin Elmer LS50. Las
longitudes de onda de excitación y emisión fueron ajustadas a 488
nm y 511 nm respectivamente, con una anchura de rendija de 10 nm.
Para efectuar las correcciones en correspondencia con las
variaciones del número de células/del rendimiento de extracción de
proteína, la absorción de luz fue registrada para cada cubeta a 600
nm (para células enteras) o a 280 nm (para los extractos). Los
valores de fluorescencia obtenidos del fluorómetro fueron entonces
divididos por las lecturas de absorción para obtener el "valor de
luminosidad", que es una unidad arbitraria que es independiente
de la concentración de la muestra. Se trata acerca de otros
detalles del tratamiento de datos ya sea en el texto o bien en
los
Como se muestra en la Fig. 7, la levadura
transformada con pWDH443 (Y485, Y486 y Diploid [Y485/486])
presentaba también un incremento de la luminosidad en presencia del
agente dañador del ADN MMS (Y485i, Y486i y Diploidi) en relación
con las células no transformadas también expuestas a MMS (Y485, Y486
y Diploid).
La fluorescencia empezó a incrementarse una hora
después de la inducción con un 0,05% de MMS. La Fig. 8 y la Fig. 9
muestran las evoluciones a lo largo del tiempo de la inducción de
luminosidad por parte de MMS en la cepa de levadura haploide Y486
transformada con pWDH444 (Y486p + mms) o pWDH443 (Y486i + mms)
respectivamente. Se muestra también el efecto del MMS en las
células no transformadas (Y486 + mms) y la luminosidad en las
células no tratadas (Y486, Y486p e Y486i).
La Fig. 10 ilustra que un 0,02% y un 0,05% de MMS
ocasiona un incremento de la fluorescencia en la cepa de levadura
haploide Y486 que ha sido transfectada con pWDH444 (Y86p) pero
carece de efecto significativo en las células no transformadas
(Y486). Fue incluido SDS (dodecilsulfato sódico) como control para
abolir la fluorescencia de la GFP.
Extractos proteínicos de células de levadura no
transformadas y células de levadura transformadas tanto con pWDH443
como con pWDH444 fueron usados en un análisis Western blot usando
anticuerpo anti-GFP. En las células no
transformadas no fue detectada GFP, y la misma fue detectada tan
sólo a bajos niveles en las células transformadas no inducidas. Sin
embargo, cuando las células de levadura transformadas con pWDH443 o
con pWDH444 fueron inducidas con MMS, hubo un considerable
incremento de la fijación del anticuerpo para la GFP. Este
incremento era proporcional a la fluorescencia medida, y confirmaba
por consiguiente que el incremento de la fluorescencia era debido
al daño al ADN, que inducía el promotor de RAD54 y ocasionaba a
continuación expresión de GFP.
Estos datos ilustran que las células de levadura
transformadas con pWDH443 y pWDH444 emiten una fluorescencia
incrementada (a 511 nm) en presencia de un agente dañador del ADN.
En consecuencia, el pWDH443 y el pWDH444 son vectores recombinantes
muy preferidos según el segundo aspecto de la presente invención, y
las células de levadura transformadas con pWDH443 y pWDH444 son
células muy preferidas según el tercer aspecto de la invención.
Estas células de levadura transformadas son altamente adecuadas
para ser usadas según el método del cuarto aspecto de la invención,
si bien se comprenderá que pueden ser construidos según el segundo
aspecto de la presente invención vectores recombinantes
alternativos, y que las células transformadas con tales vectores
recombinantes alternativos quedarán dentro del alcance de la
presente invención.
Las células transformadas con pWDH443 y pWDH444
pueden ser usadas en un método según el cuarto aspecto de la
presente invención como medio para seleccionar compuestos tales
como aquéllos que sean candidatos a ser usados como medicamentos,
aditivos alimentarios o cosméticos, para valorar si no reviste
peligro exponer a tales compuestos a un organismo viviente, y en
particular a personas, o bien las células pueden ser usadas para
detectar si abastecimientos de agua están contaminados por agentes
que dañan el ADN o por agentes que potencian el daño al ADN.
El vector recombinante yEGFP-444
fue formado y usado para transformar células de levadura que
expresaban YEGFP en respuesta a un agente dañador del ADN
(MMS).
Cepa de levadura usada en este Ejemplo:
- (I)
- FF18984 (MAT\alpha leu2-3, 112 ura3-52 lys2-I his 7-I)
- (II)
- YLR030w\alpha (MAT\alpha his3\Delta200 ura3-52)
Los medios usados fueron los mismos que se
describen en el punto 1.2.1.
El diseño modular de pWDH444 (véase el Ejemplo 1)
permitió la simple sustitución del derivado S65T de GFP por el gen
de YEGFP (Cormack et al., 1997 supra) para formar el
vector recombinante preferido yEGFP-444 (véase la
Fig. 12).
La YEGFP fue amplificada mediante reacción en
cadena de la polimerasa usando cebadores que añadían sitios
flanqueantes para las enzimas de restricción Pac1 y Asc1 para así
producir el producto de reacción en cadena de la polimerasa que
tiene la secuencia correspondiente a la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº
6. Este producto de reacción en cadena de la polimerasa fue
entonces cortado con Pac1 y Asc1.
El gen de la GFP S65T fue liberado del pWDH444
mediante corte con Pac1 y con Asc1, y se usó electroforesis en gel
para purificar el fragmento restante del vector (es decir, el
fragmento grande).
El fragmento más grande del producto de reacción
en cadena de la polimerasa cortado con Pac1 y con Asc1 fue entonces
ligado en el fragmento grande de pWDH444 para formar
yEGFP-444.
La valoración de la fluorescencia de GFP en las
células enteras fue llevada a cabo esencialmente como se ha
descrito en el (anterior) punto 1.2.
La producción de luz de las células transformadas
con el plásmido yEGFP-444 era incluso mayor que la
de las células transformadas con pWDH443 o pWDH444. De hecho, la
Tabla 1 ilustra que la producción de luz era de más del doble en el
caso de las células FF18984 transformadas con
yEGFP-444 en comparación con la de las células
FF18984 transformadas con pWDH444.
Hemos comprobado que el pWDH443 y el pWDH444 es
adecuado para ser usado según el método de la invención, cuando se
mide la producción de luz (en respuesta al daño al ADN) de
extractos celulares sacados de células según el cuarto aspecto de
la invención (a fin de lograr una buena relación de señal a ruido).
El pWDH443 y el pWDH444 son limitadamente adecuados para ser usados
para mediciones en células enteras en parte como consecuencia de la
dispersión de la luz. Hay tan sólo una estrecha diferencia entre
las longitudes de onda de excitación (475 - 495 nm) y de emisión
(aproximadamente 512 nm) que son usadas en la valoración con GFP.
Usando yEGFP-444 junto con un espectrofotómetro
sensible, fue posible ver la señal de la GFP como un punto de
inflexión correctamente posicionado en el registro de
fluorescencia.
La Figura 13 ilustra los espectros de emisión
(excitación a 488 nm) de 0,2 unidades OD600 de células FF18984 no
transformadas y de células transformadas con
yEGFP-444 -/+ 0,01% de MMS. Las células fueron
lavadas dos veces en agua estéril antes de su nueva puesta en
suspensión en 1 x TE (TE = Tris-EDTA) (EDTA = ácido
etilendiaminotetraacético) y adicional dilución. El espectro más
inferior representa la fluorescencia medida en las células no
transformadas con una exposición a MMS y el siguiente corresponde a
las mismas células sin exposición a MMS. El espectro del centro
representa células FF18984 transformadas con el constructo
yEGFP-444 sin exposición a MMS, mientras que el
espectro superior muestra el resultado de un insulto con MMS en las
mismas células transformadas.
Fueron llevados a cabo otros experimentos para
perfeccionar el análisis. Para reducir adicionalmente la influencia
de la dispersión de la luz, fue introducido un filtro de 495 nm
entre la cámara de la muestra y el detector de emisión. Esto
aumentó en gran medida la sensibilidad del aparato, de forma tal
que la diferencia entre las células no inducidas e inducidas era
igual como la obtenida con los extractos celulares. Además, cuando
las células fueron cultivadas en medio F1 (supra), no fue
necesario lavar las muestras de células antes de transferirlas al
espectrofotómetro.
También llevamos a cabo experimentos para
demostrar que la producción de luz de las células según el tercer
aspecto de la invención era específica del daño al ADN y no de un
fenotipo del ciclo celular. Estos experimentos suponían exponer las
células transformadas a hidroxiurea y nocodazol, que pueden retrasar
la mitosis de distintas maneras. La hidroxiurea interfiere en la
síntesis de ADN a dos niveles: inhibe la ribonucleótido reductasa,
limitando así el suministro de precursores para la síntesis de ADN,
e inhibe la ADN ligasa, que es una enzima que es responsable de
reparar las mellas (roturas de una sola hebra) en la cadena
principal de ADN. En contraste con ello, el nocodazol inhibe la
formación de microtúbulos, y por consiguiente detiene primariamente
el crecimiento celular impidiendo la segregación normal de
cromosomas durante la mitosis. A concentraciones de estas dos
sustancias químicas que inhibían el crecimiento celular en grado
similar al correspondiente a nuestro régimen de tratamiento con
MMS, no hubo inducción detectable del gen informador de la GFP, lo
cual demuestra que la emisión de luz no estaba relacionada con el
ciclo celular y era inducida por el daño al ADN que inducía la
activación del promotor de RAD54.
El diseño modular de pWDH443 (véase el Ejemplo 1)
puede ser también explotado para permitir la simple sustitución del
derivado S65T de GFP por el gen de YEGFP para formar el vector
recombinante preferido pWDH443 (véase la Fig. 11).
Puede seguirse el método descrito en el Ejemplo 2
para producir yEGFP-443, con la excepción de que en
lugar de pWDH444 se usó pWDH443.
Son también útiles para ser usadas según el
método de la invención células transformadas con
yEGFP-443.
Las células transformadas con
yEGFP-444 y pWDH444 son particularmente útiles para
detectar el daño al ADN sin necesidad de romper las células para
formar un extracto para el análisis. La combinación de los elementos
consistentes en el gen de YEGFP, una cepa huésped sensible (como p.
ej. la FF18984), un medio de baja fluorescencia (como p. ej. el F1)
y óptimamente la limitación de la dispersión de la luz en el
dispositivo de detección (p. ej. usando un filtro de 495 nm)
permite pasar del lento y complejo análisis de extractos celulares
a las mediciones directas de muestras que contienen células
enteras.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: University of Manchester Institute of Science And Technology
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: P.O. Box 88
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Manchester
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Greater Manchester
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): M60 1QD
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: DETECCIÓN DEL DAÑO AL ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO INFORMÁTICO: PatenIn Lanzamiento Nº1.0,
\vskip0.500000\baselineskip
- Versión Nº1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº:
1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1729 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC DE ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORIENTACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCCGGATC CGACATACGA TGACCTCAAT G
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA IDENTIFICADORA
Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORIENTACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCCGTTAA TTAACATCAG TTATAAGGAA ATATATATGG TACC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA IDENTIFICADORA
Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5902 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORIENTACIÓN: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA IDENTIFICADORA
Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 909 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORIENTACIÓN: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA IDENTIFICADORA
Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 756 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORIENTACIÓN: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (33)
1. Molécula de ADN recombinante que comprende un
elemento regulador que comprende el promotor y las secuencias
reguladoras del lado 5' del gen reparador RAD54 y está ligado
operativamente a una secuencia de ADN que codifica una Proteína
Fluorescente Verde y derivados emisores de luz de la misma.
2. Molécula de ADN recombinante según la
reivindicación 1, en la que el elemento regulador comprende la
secuencia de ADN identificada como la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 1
o un fragmento o análogo funcional de la misma.
3. Molécula de ADN recombinante según cualquier
reivindicación precedente, en la que la secuencia de ADN codifica
el derivado S65T de Proteína Fluorescente Verde.
4. Molécula de ADN recombinante según cualquier
reivindicación precedente, en la que la secuencia de ADN que
codifica una proteína informadora emisora de luz codifica el
derivado de Proteína Fluorescente Verde Mejorado para Levadura.
5. Vector recombinante que comprende una molécula
de ADN según cualquier reivindicación precedente y un vector de
ADN.
6. Vector recombinante según la reivindicación 5,
en el que el vector está diseñado para replicarse autónomamente en
el citosol de una célula.
7. Vector recombinante según la reivindicación 6,
en el que el vector contiene ADN sacado del plásmido 2 \mu.
8. Vector recombinante según la reivindicación 7,
en el que el vector está diseñado para integrarse en el genoma de
una célula.
9. Vector recombinante según la reivindicación 8,
en el que el vector contiene ADN que codifica para parte del gen HO
del cromosoma IV de levadura.
10. Vector recombinante según cualquiera de las
reivindicaciones 5 - 9, en el que el vector está sacado de vectores
PFA y derivados de los mismos.
11. Vector recombinante PFA
KANMX3GFP-RAD54 que comprende el vector que tiene la
secuencia correspondiente a la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 4 del
listado de secuencias y el elemento regulador que tiene la
secuencia que corresponde a la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 1 del
listado de secuencias insertado entre los sitios para las enzimas de
restricción Pac1 y BamH1 del vector que tiene la secuencia que
corresponde a la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 4 del listado de
secuencias.
12. Vector recombinante pWDH443 que comprende el
vector recombinante según la reivindicación 11 con un fragmento del
gen HO correspondiente a la secuencia de la SECUENCIA
IDENTIFICADORA Nº 5 insertado en el sitio para BamH1 del vector.
13. Vector recombinante yEGFP-443
que comprende el fragmento grande del vector recombinante según la
reivindicación 12 generado mediante digestión con Pac1 y Asc1 ligado
al fragmento grande de la YEGFP que tiene la secuencia que
corresponde a la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 6 generado mediante
digestión con Pac1 y Asc1.
14. Vector recombinante que comprende un
fragmento del plásmido 2 \mu ligado con el fragmento grande
generado mediante la digestión con BamH1 y Pme1 del vector
recombinante según la reivindicación 12.
15. Vector recombinante pWDH444 que comprende el
fragmento grande hecho con HindIII/BamH1 y liberado del plásmido
pRDK249 ligado con el fragmento grande generado mediante la
digestión con BamH1 y Pme1 del vector recombinante según la
reivindicación 12.
16. Vector recombinante yEGFP-444
que comprende el fragmento grande del vector recombinante según la
reivindicación 15 generado mediante digestión con Pac1 y Asc1 ligado
al fragmento grande de la YEGFP de la SECUENCIA IDENTIFICADORA Nº 6
generado mediante digestión con Pac1 y Asc1.
17. Célula que contiene una molécula de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4.
18. Célula que contiene un vector recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones 5 - 16.
19. Célula según la reivindicación 17 o 18, la
cual es una levadura.
20. Levadura según la reivindicación 19, en la
que la levadura es una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
21. Levadura según la reivindicación 19, que es
Y485 en forma haploide.
22. Levadura según la reivindicación 19, llamada
FF18984 o Y486 en forma haploide.
23. Levadura según la reivindicación 19, que es
Y485/486 en forma diploide.
24. Método para detectar la presencia de un
agente que ocasiona o potencia daño al ADN, comprendiendo dicho
método los pasos de:
(a) someter a un agente a una levadura
transformada con una molécula de ADN recombinante que comprende un
elemento regulador que comprende el promotor y las secuencias
reguladoras del lado 5' del gen reparador RAD54 y está ligado
operativamente a una secuencia de ADN que codifica una Proteína
Fluorescente Verde y derivados emisores de luz de la misma; y
(b) supervisar la expresión de la proteína
informadora emisora de luz en la célula.
25. Método según la reivindicación 24, en el que
son sometidos a selección agentes para valorar si no reviste
peligro exponer a un organismo viviente a tales compuestos.
26. Método según la reivindicación 24 ó 25, en el
que los agentes son candidatos a ser usados como medicamentos,
aditivos alimentarios o cosméticos.
27. Método según la reivindicación 24 ó 25, en el
que el agente es un contaminante de abastecimientos de agua.
28. Método según la reivindicación 24 ó 25, en el
que el agente es un contaminante de efluentes industriales.
29. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 24 - 28, en el que la expresión de luz es medida
en células enteras.
30. Método según la reivindicación 29, que
comprende los pasos de cultivar células transformadas con un vector
recombinante según la reivindicación 13 ó 16, incubar las células
con el agente por espacio de un periodo de tiempo predeterminado, y
supervisar la expresión de la proteína informadora emisora de luz
directamente en una muestra de las células.
31. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 24 - 30, en el que las células son cultivadas en
medio de cultivo de baja fluorescencia.
32. Método según la reivindicación 31, en el que
las células son cultivadas en medio F1.
33. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 24 - 28, en el que la expresión de luz es medida
en un extracto de las células.
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|---|---|---|---|---|
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| US20080187927A1 (en) * | 2006-11-12 | 2008-08-07 | Palecek Sean P | Using hug1 promoter and a reporter gene to detect genotoxicity and genoprotection |
| GB0921712D0 (en) | 2009-12-11 | 2010-01-27 | Ge Healthcare Uk Ltd | Methods of detecting DNA damage |
| EP4069731A4 (en) | 2019-12-03 | 2024-05-29 | Alamar Biosciences, Inc. | Nucleic acid linked immune-sandwich assay (nulisa) |
| CN115575369B (zh) * | 2022-10-14 | 2025-10-28 | 中国药科大学 | 一种用于消化道内亚硝胺类化合物监测的金属有机配位凝胶保护的全细胞生物传感器 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL75210A0 (en) | 1984-05-22 | 1985-09-29 | Bioteknika International | Yeast vector |
| JP3509100B2 (ja) * | 1993-01-21 | 2004-03-22 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 哺乳動物のストレスプロモーターを利用する化合物の毒性測定方法および診断用キット |
| JP3810791B2 (ja) * | 1993-09-10 | 2006-08-16 | ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク | 緑色蛍光タンパク質の使用 |
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