ES2225838T3 - Estructuras de receptor bacteriano. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN NUEVAS PROTEINAS QUE SE OBTIENEN MEDIANTE MUTAGENESIS DE AMINOACIDOS DE SUPERFICIE EXPUESTA DE DOMINIOS DE RECEPTORES BACTERIANOS NATURALES, LAS PROTEINAS SE OBTIENEN SIN PERDIDA SUBSTANCIAL DE LA ESTRUCTURA BASICA Y DE LA ESTABILIDAD DE LOS RECEPTORES BACTERIANOS NATURALES; TAMBIEN SE PRESENTAN LAS PROTEINAS QUE HAN SIDO SELECCIONADAS ENTRE UNA LIBRERIA DE PROTEINAS QUE CONFORMA UN REPERTORIO DE LAS NUEVAS PROTEINAS; ASI COMO METODOS PARA LA MANUFACTURA DE ESTRUCTURAS RECEPTORAS BACTERIANAS ARTIFICIALES.

Description

Estructura de receptor bacteriano.

La presente invención se refiere a nuevas estructuras de receptor bacteriano que proceden de estructuras de receptor bacteriano naturales que han sido modificadas con respecto a los residuos aminoácidos implicados en la función de interacción original, en que dicha función de interacción adicional ha sido sustancialmente inhibida y reemplazada por una función de interacción modificada dirigida a un participante en la interacción deseado.

Varias bacterias que se sabe invaden a mamíferos han desarrollado proteínas de la superficie capaces de unirse a una diversidad de sustancias, incluidos hidratos de carbono y proteínas específicos del huésped. Varios receptores de este tipo procedentes de agentes patógenos bacterianos Gram-positivos han sido aislados y caracterizados en detalle según se mostrará a continuación. Los mejor caracterizados son los receptores Fc, nombrados por la capacidad de unirse a la parte Fc constante de IgG. Basado en experimentos de unión a IgG procedente de diversas fuentes de mamíferos, y subclases de las mismas, los receptores Fc se han dividido en seis tipos I-VI. El receptor procedente de la proteina A de S. aureus [SPA], que define al receptor de tipo I, ha sido el objeto de inmensos estudios.

SPA se une a IgG procedente de la mayoría de las especies de mamíferos, incluido el hombre. De las cuatro subclases de IgG humana, SPA se une a IgG1 e IgG4, pero muestra una interacción muy débil o ninguna interacción con IgG3 [Eliasson, M. et al, 1989 J. Biol. Chem. 9:4323-4327]. Esta reacción pseudoinmune ha sido utilizada durante más de 20 años para la purificación y detección de anticuerpos en aplicaciones de diagnóstico, investigación y terapéuticas. La clonación, secuenciación y expresión en Escherichia coli de fragmentos definidos del gen SPA revelaron una organización muy repetitiva, con cinco dominios de unión a IgG [E-D-A-B-C], una región que abarca la pared celular y una secuencia de anclaje a la membrana [XM] [Uhlén, M. et al, 1984 J. Biol. Chem. 259:1695-1702; Moks, T. et al, 1986 Eur. J. Biochem. 156: 637-643]. Se ha construido un gran número de vectores de plásmido, permitiendo fusiones del gen a diferentes fragmentos del gen con el fin de la producción de proteínas de fusión en diferentes huéspedes [Nilsson B. y Abrahmsén, L. 1990 Meth. Enz. 185: 144-161] (fig. 2A).

La estructura para un complejo entre Fc humano [IgG1] y un dominio sencillo [B] de SPA ha sido determinado por cristalografía de rayos X a una resolución de 2,8 \ring{A} [Deisenhofer, J. et al 1981 Biochemistry 20: 2361-2370]. Basada en esta estructura y en la información adicional procedente de experimentos de RMN, el dominio B puede considerarse como una estructura compacta que consiste en tres hélices \alpha anti-paralelas conectadas con bucles. En la unión de Fc, que es de naturaleza tanto electrostática como hidrófoba, únicamente están implicadas las cadenas laterales de residuos procedentes de las hélices 1 y 2, mientras que la tercera hélice no participa en la unión. En base a este dominio B, se ha construido un dominio de unión a IgG sintético [Z] [Nilsson, B. et al 1987 Prot. Eng. 1: 107-113], adecuado como participante en la fusión para la producción de proteínas recombinantes, que permite la purificación mediante cromatografía de afinidad de IgG. La elevada solubilidad y la estructura estable del dominio Z han sido utilizadas para la producción, purificación y renaturalización de un gran número de proteínas recombinantes. [Josephsson, S. y Bishop, R. Trends Biotechnol. 6: 218-224; Samuelsson, E. et al 1991 Bio. Technol. 9: 363-366].

Las cepas de estreptococos de los grupos C y G serológicos exhiben un repertorio de unión para IgGs de mamíferos, incluida IgG3 humana, que es incluso más amplio que para el receptor de tipo I. El nombre proteína G fue sugerido para este receptor de tipo III procedente de estreptococos del grupo G. En 1986 Olsson y colaboradores informaron sobre la clonación y secuenciación del gen procedente de los estreptococos del grupo G serológico [G148] [Guss, B. et al, 1987 EMBO J. 5:1567-1575; Olsson, A. et al, 1987 Eur. J. Biochem. 168: 319-324]. En analogía con SPA, SPG es una molécula dispuesta repetitivamente, que comprende una región de unión a IgG de tres dominios homólogos [C1, C2, C3], separados por regiones D más pequeñas (fig. 2A). En comparación con SPA, SPG exhibe espectros de unión diferentes para inmunoglobulinas procedentes de diferentes especies y subclases de las mismas. Los dominios de unión a IgG de la proteína G se utilizan ahora ampliamente como una herramienta inmunológica, es decir en la purificación por afinidad de anticuerpos monoclonales. La producción de subfragmentos construidos mediante tecnología de ADN ha demostrado que una región C individual es suficiente para la unión completa a IgG. Recientemente, se determinó por cristalografía de rayos X (fig. 2B) la estructura para un complejo entre el dominio C1 procedente de SPG y Fc humano. Esto demuestra que SPG se une a la interfaz CH2-CH3, pero en un sitio diferente en comparación con SPA. La unión es principalmente de naturaleza electrostática, lo que está en contraposición con la amplia contribución de fuerzas hidrófobas observadas para interacciones SPA-Fc. Además, la estructura tridimensional de C1 difiere de la estructura X debido a que está constituida por dos láminas \beta conectadas por una hélice \alpha [\beta\beta-\alpha-\beta\beta]. Los residuos de C1 que de acuerdo con la estructura están implicados en la unión corresponden a la hélice \alpha, el bucle y la siguiente lámina \beta.

Una actividad adicional de SPG es la capacidad de unir albúmina de suero. La resistencia de la unión depende de la especie y, entre las muestras sometidas a ensayo, SPG se une lo más intensamente a la albúmina de suero procedente de rata, hombre y ratón. Estudios de producción y de unión de subfragmentos de SPG demuestran que las dos actividades de unión están estructuralmente separadas y que la función de unión a la albúmina de suero está localizada en la región A-B repetitiva [Nygren et al 1990 Eur. J. Biochem. 193:143-148]. Esta región ha sido utilizada para varios fines biotecnológicos. Proteínas recombinantes se han producido como fusiones a la región que permite la purificación por cromatografía de afinidad, en que la albúmina de suero humano se ha utilizado, de la manera más frecuente, como ligando inmovilizado. Proteínas que se encuentran que son proteolíticamente sensibles han sido producidas como "fusiones de afinidad doble" en el sentido de que están flanqueadas por dos colas de afinidad diferente derivadas de SPA y SPG, respectivamente. Así, son posibles esquemas de purificación que empleen tanto el extremo N como el C, lo que asegura la recuperación de una proteína diana intacta [Hammarberg et al 1989 Proc. Nat. Acad. Sciences USA 86: 4367-4371]. La unión fuerte y específica a la albúmina de suero ha sido también utilizada para la estabilización in vivo de proteínas terapéuticas.

A través de la formación del complejo con la albúmina de suero de muy larga vida, el receptor es transportado en la circulación (monos macacos) con una semivida que está próxima a la semivida para la propia albúmina de suero. Estudios en ratones con el receptor CD4 de células T interesante para la terapia de VIH/SIDA, pero rápidamente clarificado, demostraron que este receptor estaba sustancialmente estabilizado cuando se fusionaba con la región de unión a albúmina de suero, cuando se compara con una proteína control no fusionada [Nygren et al 1991 Vaccines 91 Cold Spring Harbor Press 363-368]. La lenta clarificación puede ser explicada probablemente por la formación del complejo con la albúmina de suero que evita la eliminación por parte del hígado y la excreción en el riñón.

Con el fin de determinar la extensión mínima requerida para una unión mantenida a la albúmina de suero, se han producido y analizado varios fragmentos menores de la región A-B. El fragmento más pequeño hasta la fecha con la actividad de unión a albúmina de suero es un fragmento de 46 residuos ["B2A3"] que comprende la región A3 flanqueada por los residuos 13 y 9, respectivamente, procedentes de las regiones B2 y S.

Basado en la homología y en estudios de unión de otros fragmentos parciales, SPG se considera que es trivalente con respecto a la unión a albúmina de suero. De manera similar a los dominios Z y C1 de unión a IgG monovalentes, B2A3 es relativamente pequeño y muestra una alta solubilidad y estabilidad y, por lo tanto, es un candidato adecuado para la modificación.

Sumario de la invención

La presente invención tiene por fin principal proporcionar nuevas estructuras de receptor bacteriano al modificar receptores bacterianos naturales con relación a sus funciones de interacción originales, para dar como resultado nuevas estructuras con funciones de interacción modificadas.

Otro objeto de la invención es proporcionar estructuras de receptor bacteriano artificiales que sean estables y más resistentes a diversas condiciones, tales como temperaturas incrementadas.

Todavía otro objeto de la invención es proporcionar estructuras de receptor bacteriano artificiales, cuyas funciones de interacción han sido modificadas para dirigir las mismas a otros participantes deseados en la interacción.

Con estos y otros objetos que resultarán evidentes teniendo en mente la siguiente descripción, la invención proporciona nuevas proteínas que se pueden obtener por mutagénesis de aminoácidos expuestos en la superficie de dominios de receptores bacterianos naturales, obteniéndose dichas proteínas sin una pérdida sustancial de estructura básica y estabilidad de dichos receptores bacterianos naturales. Dichas proteínas han sido seleccionadas preferiblemente a partir de un banco de proteínas que constituye un repertorio de dichas nuevas proteínas. En estructuras de receptor bacteriano nuevas de este tipo, al menos un residuo aminoácido implicado en la función de interacción del receptor bacteriano original ha sido objeto de sustitución por otro residuo aminoácido, con el fin de dar como resultado una pérdida sustancial de la capacidad de interacción original, creándose una capacidad de interacción modificada, realizándose dicha sustitución sin una pérdida sustancial de la estructura básica y la estabilidad del receptor bacteriano original.

El receptor bacteriano a utilizar como material de partida para la modificación de las estructuras de receptor bacteriano de la función de interacción procede de la proteína A de estafilococos.

Con el fin de mantener una estabilidad y las propiedades de la estructura de receptor bacteriano original, se prefiere, de acuerdo con la presente invención, que la sustitución que implica los residuos aminoácidos que participan en la función de interacción del receptor bacteriano original no implique a más de aproximadamente el 50% de los residuos aminoácidos del receptor bacteriano original. Se prefiere particularmente que no más de aproximadamente 25% de los residuos aminoácidos del receptor bacteriano original sean objeto de sustitución.

En relación con las estructuras del receptor bacteriano original seleccionadas para la modificación de sus funciones de interacción, se prefiere particularmente utilizar receptores que procedan del dominio Z de unión a IgG.

Con el fin de mantener lo más posible la estabilidad y las propiedades de la estructura del receptor original objeto de modificación de acuerdo con la presente invención, se prefiere que su sustitución implique no más de esencialmente todos los residuos aminoácidos que participen en la función de interacción del receptor bacteriano original.

Con el fin de obtener propiedades favorables que conciernen a la estabilidad y resistencia a diversas condiciones, se prefiere que el receptor bacteriano de acuerdo con la presente invención esté constituido por no más de aproximadamente 100 residuos aminoácidos. Se conoce a partir de informes científicos que las proteínas de un tamaño relativamente pequeño son bastante resistentes a temperaturas incrementadas y también a un pH bajo y a determinados productos químicos. Para detalles concernientes a la resistencia a la temperatura, véase el artículo de Alexander et al. en Biochemistry 1992, 31, págs. 3597-3603.

Con respecto a la modificación de la estructura de receptor bacteriano natural, se prefiere realizar la sustitución del mismo recurriendo a la ingeniería genética tal como una mutagénesis dirigida al lugar.

Con respecto al participante en la interacción del receptor bacteriano natural modificado, se puede concebir una multitud de sustancias tales como proteínas, lípidos, hidratos de carbono y sustancias inorgánicas. Entre los ejemplos de hidratos de carbono se encuentran los determinantes del grupo sanguíneo y oligosacáridos específicos de patógenos.

En relación con las proteínas, participantes en la interacción concebibles son IGF-I, IGF-II, hGH, factor VIII, insulina y apolipoproteína y sus respectivos receptores en calidad de participantes en la interacción. Además, al seleccionar nuevas variantes de receptores con una especificidad para diferentes formas de plegamiento de proteínas, se pueden producir resinas de afinidad o herramientas analíticas para facilitar el aislamiento de moléculas correctamente plegadas. Ejemplos adicionales son proteínas de revestimiento vírico, antígenos bacterianos, biotina y marcadores de células tales como CD34 y CD4.

A pesar de que la presente invención es aplicable a una diversidad de receptores bacterianos naturales, la siguiente ilustración de la invención más en detalle se dirigirá al uso del dominio Z de unión a IgG. El concepto de la presente invención, que reside en el uso de receptores bacterianos artificiales basados en las estructuras naturales de receptores bacterianos que se producen de un modo natural, está asociado con varias ventajas. Así, la invención hace posible utilizar receptores robustos y estables, muy solubles y competentes para la selección. Esto está en contraposición con las técnicas previas basadas en el uso de componentes policlonales y monoclonales tales como para fines diagnósticos, que no son muy estables en relación con el almacenamiento, condiciones variables, tales como temperaturas variables, etc. Además, la invención hace posible modificar receptores bacterianos naturales para obtener capacidades de interacción deseadas para fines específicos.

Para la selección variantes funcionales de este tipo en un amplio repertorio, debe emplearse un potente sistema de selección. Desarrollos recientes en este campo ofrecen métodos alternativos. Una de las herramientas más importantes para la ingeniería de las proteínas que ha surgido durante los últimos años es la exhibición del fago de proteínas. Mediante técnicas de ADN recombinante se pueden preparar partículas de fagos sencillas que portan sobre su superficie una proteína fusionada a una proteína revestida con un fago. Al encuadrar una gran agrupación de fagos que portan diferentes proteínas, o variantes de una proteína específica, se pueden clasificar clones de fago específicos que exhiben una determinada característica de unión [documento WO 92/20791 expedido a Winter et al]. Dado que la partícula de fago contiene ADN empaquetado que codifica los componentes de la proteína del fago, se obtiene un acoplamiento entre la variante específica de la proteína exhibida y la correspondiente información genética. Al utilizar esta técnica, típicamente, 10^{9} clones de fagos se pueden generar simultáneamente y someter a un encuadramiento en cuanto al rastreo de características deseadas. La técnica de exhibición del fago se puede utilizar para la selección tanto de péptidos pequeños, así como de proteínas más complicadas tales como anticuerpos, receptores y hormonas. Para la selección de proteínas que no se pueden segregar, lo que es un requisito previo para la exhibición del fago, se han desarrollado sistemas intracelulares en los que el banco de proteínas se fusiona a una proteína represora con afinidad por una región de operador portada por el plásmido específica que resulta en un acoplamiento entre la variante de proteína específica y el plásmido que lo codifica. Una alternativa a fagos como portadores de bancos de proteínas sería utilizar células bacterianas. Recientemente, se demostró la exhibición de proteínas recombinantes sobre la superficie de Staphylococcus xylosus basada en fusiones al dominio de anclaje de la pared celular, lo que abre la posibilidad de exhibir también repertorios de proteínas para la selección de afinidad de variantes específicas [Hansson, M. et al 1992, J. Bacteriology 174:4239-4245]. Además, mediante la modelación de la estructura utilizando simulaciones gráficas por ordenador, se pueden realizar en teoría predicciones de la unión y función de variantes alteradas de una proteína antes de la construcción del gen que codifica la proteína.

Como se ha indicado anteriormente, la presente invención describe la construcción de nuevas proteínas basada en la mutagénesis de aminoácidos expuestos en la superficie de dominios derivados de receptores bacterianos. Estos receptores bacterianos artificiales se pueden seleccionar en cuanto a diferentes aplicaciones utilizando un sistema de exhibición del fago. Los beneficios de utilizar receptores bacterianos como armazones estructurales son varios. Han evolucionado para expresar una función de unión sin perturbar la estructura global. Por naturaleza son muy solubles, robustos a estados no fisiológicos tales como el pH y el calor, eficaces para el plegamiento y, además, son competentes en la secreción.

La invención encuentra uso en varias áreas diferentes.

La parte de introducción de la memoria descriptiva de la patente WO92/20791 antes identificada da una excelente perspectiva sobre anticuerpos y su estructura. Se hace particular referencia a su página 1.

El receptor bacteriano SPA ha sido ampliamente utilizado en la tecnología de anticuerpos para la detección y purificación de anticuerpos procedentes, por ejemplo, de sobrenadantes de hibridoma y fluidos ascites. Sin embargo, no todos los anticuerpos son reconocidos por estos receptores, dependiendo de la especie y de la subclase. Para subfragmentos más pequeños de anticuerpos (fig. 4), SPA y SPG muestran una unión limitada y no están presentes herramientas eficaces para esquemas generales de purificación. Sin embargo, a partir de un repertorio de receptores de mutantes, incluido SPA, se pueden seleccionar en potencia formas que exhiban una mayor afinidad para anticuerpos y subfragmentos de los mismos.

La organización estructural compleja de anticuerpos tiene un cierto número de consecuencias en cuanto a su uso en diferentes aplicaciones, así como para la producción de derivados recombinantes. Para uso en inmunosorbentes, la disposición de subunidades conectadas por enlaces disulfuro puede conducir a una pérdida de las cadenas pesadas y ligeras liberadas a partir de las columnas. El requisito de un bloqueo con éxito de las dos subunidades que contribuyen al sitio de unión al antígeno hace difícil la producción en bacterias de pequeños subfragmentos con una baja asociación. El plegamiento del anticuerpo depende de la formación de enlaces disulfuro intra- e inter-cadena que no son capaces de formarse en el entorno intracelular de las células bacterianas. Sistemas de expresión intracelular de alto nivel para anticuerpos recombinantes conduce a la formación de cuerpos de inclusión que han de ser renaturalizados para obtener una actividad biológica. Estas limitaciones hacen merecedora la investigación de alternativas para uso como dominios de proteínas capaces de unión específica, de reemplazar anticuerpos en un amplio número de aplicaciones.

Las regiones CDR que forman la parte de unión al antígeno de un anticuerpo forman una superficie total disponible para el antígeno de aproximadamente 800 A^{2}, estando implicados en la unión típicamente 10-20 residuos procedentes del anticuerpo. Al utilizar la estructura del complejo determinado por cristalografía de rayos X entre un dominio B individual de SPA y fc[IgGI] humano como punto de partida, se pueden determinar o postular aproximadamente 15 aminoácidos de dicho dominio implicados en esta unión. La superficie de unión de aproximadamente 600 A^{2}, es del mismo orden de magnitud que entre un anticuerpo y su antígeno. Mediante mutagénesis in vitro arbitraria de estas posiciones simultáneamente se obtiene un gran banco de variantes Z con propiedades funcionales modificadas. A la vista del hecho de que las regiones del dominio Z que constituyen el denominado haz de tres hélices muy estable se mantienen en su forma nativa, se generan espectros de proteínas que podrían considerarse como "anticuerpos artificiales" y que tienen la esperada elevada solubilidad y excelentes propiedades de plegamiento capaces de unirse a un gran número de nuevos ligandos. Fusiones de estos receptores artificiales a regiones constantes se pueden construir para reclutar funciones de efector tales como la unión al complemento o el disparo de CCDA (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos).

Hay varias ventajas potenciales de utilizar la estructura de SPA [Z] como punto de partida para "anticuerpos artificiales" o receptores bacterianos artificiales de este tipo. Durante un período de aproximadamente 10 años se ha producido un gran número de proteínas como fusiones a SPA, en que se han utilizado las propiedades únicas del participante en la fusión en la expresión, replegamiento y purificación. En estas aplicaciones, se ha encontrado que el dominio Z es extremadamente soluble, estable frente a proteasas, fácil de producir en grandes cantidades y plegable para formar una estructura correcta, también de modo intracelular en Escherichia coli (sin cisternas). Las inmunoglobulinas (Ig:s) son esencialmente tetrámeros constituidos a partir de las denominadas estructuras de láminas \beta que estabilizan la orientación de los bucles de unión al antígeno que, a su vez, consisten en secuencias peptídicas continuas. Esto se ha de comparar con el dominio Z monómero constituido a partir del denominado haz de tres hélices que consiste en tres estructuras de hélice \alpha estrechamente empaquetadas, en que los aminoácidos de unión a Fc se encuentran discontinuamente en la secuencia, pero en la proteína plegada están situados en la misma superficie de unión. Esta diferencia con respecto a los elementos estructurales que contribuye a la formación de la superficie de unión permite nuevas posibles conformaciones que no pueden obtenerse en anticuerpos naturales. La capacidad de Z de plegarse a la estructura nativa, también bajo condiciones que prevalecen en el sitio del citoplasma, abre la posibilidad de utilizar también clínicamente derivados del mismo. Genes que codifican anticuerpos artificiales, por ejemplo con capacidad neutralizante de virus, se pueden distribuir a células a través de la denominada terapia génica, que resulta en interrumpir la infección en una fase temprana.

Cuando se producen proteínas recombinantes, la purificación del producto es frecuentemente un gran problema. Al expresar la proteína diana como una fusión a una denominada cola de afinidad, el producto híbrido puede recuperarse de manera eficaz y selectiva a partir del lisado de la célula o, en determinados casos, a partir del medio de cultivo mediante el paso a través de una columna que contiene un ligando inmovilizado. Se han descrito varios sistemas de fusión de genes de este tipo que se basan en la interacción de una determinada proteína con un ligando. Para aplicaciones industriales es a menudo deseable limpiar eficazmente las columnas entre las operaciones para satisfacer los requisitos de pureza de parte de las autoridades. En función de la naturaleza de las proteínas, normalmente no se pueden utilizar las condiciones relativamente estrictas (NaOH, ácidos, calor), utilizadas a menudo para matrices orgánicas o físicas, por ejemplo en la cromatografía de intercambio de iones y en la filtración en gel. En este caso, es de gran importancia el uso de nuevos ligandos basados en estructuras estables que proceden de receptores bacterianos. A este respecto, el dominio Z procedente de SPA es un excelente ejemplo, ya que dicho dominio puede ser sometido a condiciones difíciles de este tipo tales como a un pH de 1 o a calentamiento hasta 80ºC sin una desnaturalización no reversible (véase el Ejemplo 2 más abajo). A partir del banco, por ejemplo de variantes Z, se pueden seleccionar para su uso interesantes productos proteínicos inmovilizados sobre una fase sólida para la cromatografía de afinidad. Estos ligandos de proteínas son resistentes a condiciones de purificación eficaces y, por lo tanto, son útiles repetitivamente a gran escala. En la cromatografía de inmunoafinidad tradicional en la que se utilizan anticuerpos monoclonales inmovilizados para la purificación selectiva de un determinado producto, existen problemas con la fuga de la columna de subunidades (cadenas pesada y ligera) del anticuerpo, ya que éste consiste en cuatro cadenas polipeptídicas enlazadas por puentes cisteína. Dado que los receptores bacterianos artificiales consisten sólo en una cadena polipeptídica, este problema se evita. Un área de interés particular es la selección de la unión a hidratos de carbono. Se ha encontrado que lectinas, ligantes por naturaleza a este gran e importante grupo de biomoléculas, son difíciles de purificar y tienen una estabilidad limitada. Dado que se ha encontrado que la generación de anticuerpos contra hidratos de carbono es bastante complicada, será de gran importancia una selección de nuevas lectinas artificiales para la investigación, el diagnóstico y la terapia.

En la producción de proteínas recombinantes en huéspedes bacterianos se forman frecuentemente precipitados del producto génico, los denominados cuerpos de inclusión. Con el fin de obtener una estructura nativa de la proteína, ésta se ha de someter a un replegamiento in vitro. Una limitación en un proceso de este tipo con la que a menudo uno se confronta es el hecho de que una gran parte del material precipita en el proceso, lo que resulta en bajos rendimientos. Al producir la proteína con una extensión en la forma de un péptido hidrófilo corto o de un dominio completo fácilmente soluble [Samuelsson, E. et al 1991 Bio/Technol. 9:363-366], se obtendrán concentraciones esencialmente mayores de la proteína, sin que tenga lugar una precipitación durante la renaturalización. Por ejemplo, la elevada solubilidad de dicho dominio permite el uso de una solubilidad incrementada de proteínas en el replegamiento a partir de cuerpos de inclusión o en la llamada redistribución de puentes disulfuro. A partir de bancos de receptores artificiales se pueden seleccionar nuevas formas con propiedades mejoradas para facilitar e incluso hacer posible el replegamiento de proteínas recombinantes (chaperones cis-actuantes).

Recientemente, se ha descrito una nueva operación para la purificación de proteínas recombinantes basada en la cromatografía de intercambio de iones en el denominado lecho expandido [Hansson, M. et al 1994 Bio/Technol. en prensa]. A este respecto, se utiliza una diferencia en el punto isoeléctrico entre la proteína diana y las proteínas de la célula huésped para el enriquecimiento selectivo en una matriz de intercambio de iones positivamente cargada. Mediante la fusión al dominio Z ácido (pI 4,7), la etapa de intercambio de iones puede tener lugar a un pH al que la mayoría de los contaminantes eran de carga opuesta en comparación con la proteína de fusión. Al construir bancos de receptores bacterianos en los que se ha reemplazado una selección de aminoácidos por los aminoácidos aspartato y glutamato, también se pueden producir dominios muy ácidos y de solubilidad creciente para uso como participantes en la fusión en la producción de proteínas recombinantes.

Como se ha descrito previamente, sistemas de afinidad basados en ligandos de proteínas son totalmente adecuados para fines industriales a la vista de las rígidas condiciones requeridas en la limpieza de las columnas. Por lo tanto, existe la necesidad de participantes en la fusión con una afinidad específica hacia ligandos orgánicos simples y baratos. El encuadramiento de bancos de presentación del fago de diferentes receptores bacterianos frente a tales ligandos proporciona nuevas colas de afinidad, adecuadas para uso como participantes en la fusión para la producción/purificación de proteínas recombinantes.

La presente invención proporciona medios para producir y seleccionar proteínas con nuevas funciones. De acuerdo con la invención, esto se consigue mediante una amplia mutación de residuos definidos de dominios estables de receptores bacterianos. Debido a las nuevas funciones de los receptores bacterianos artificiales, éstos se pueden utilizar como ligantes específicos para el sector terapéutico, el diagnóstico, la biotecnología o en la investigación.

La presente invención se describirá ahora con mayor detalle mediante ejemplos específicos con referencia a los dibujos adjuntos. En los dibujos:

Figura 1. A. Representación esquemática de proteína A de estafilococos que a los dibujos muestra el péptido señal (S), cinco regiones de unión a IgG [E- D-A-B-C], seguido por una región de anclaje a la pared celular [X-M].

B. Representación gráfica por ordenador del complejo entre el dominio B de SPA y FcI humano determinada por cristalografía de rayos X. Obsérvese que en esta figura no se ve la tercera hélice de SPA.

Figura 2. A. Representación esquemática de la proteína G de estreptococos procedente de la cepa G148 que muestra el péptido señal (Ss), la región E (E), la región A-B repetitiva de unión a la albúmina de suero, la región de espaciador (S), seguida de los dominios C1 a C3 de unión a IgG, separada por las regiones D y, finalmente, la región W de anclaje a la pared celular.

B. Representación gráfica por ordenador del complejo entre el dominio C1 de SPG y FcI humano determinada por cristalografía de rayos X.

Figura 3. Representación esquemática de la estructura de haz de tres hélices del análogo Z de SPA de 58 residuos. Se indican algunas de las cadenas laterales que se proponen están implicadas en la unión a Fc, con la excepción de F30, que estabiliza el empaquetamiento de hélice-hélice.

Figura 4. Estructura de anticuerpo IgG, que muestra los diferentes subfragmentos Fab, Fd, Fc y scFv compuesto por el VH y VL conectados por un enlazador corto (aprox. 15 aa).

Figura 5: A. Concepto general para la estrategia de ensamblaje del gen utilizada para la generación de bancos del gen Z. Para la construcción del banco de derivados Z ácidos, únicamente se alteraron los residuos 9, 11, 14, 27 y 35 utilizando los oligonucleótidos ACID-1, ACID-2 degenerados. Los cebadores de PCR utilizados para la amplificación del banco ensamblado eran ZLIB-3 (cebador 5' de PCR) y ZLIB-5 (cebador 3' de PCR).

B. Los productos de PCR procedentes de la amplificación del banco ensamblado que codifica 46 de los 58 residuos del dominio Z pueden clonarse en ADN fagémido que alberga la parte C-terminal de Z restante. Este gen se fusiona en el marco con el gen para la proteína III de la familia M13 de bacteriófagos de E. coli. Esto permite la exhibición en la superficie del fago del repertorio de variantes Z ácidas.

Figura 6. Oligonucleótidos utilizados para la construcción de bancos Z. Para el banco de variantes Z ácidas descritas en el Ejemplo 2, únicamente se utilizaron los oligonucleótidos ZLIB-1, 2, 3, 4, 5, LONGBRIDGE, ACID-1 y ACID-2.

Figura 7. Secuencias de ADN de clones derivados del banco de proteínas Z ácidas. Las cifras en negrita indican las posiciones de aminoácido en el dominio Z. Para claridad, se muestran las posiciones de los sitios de restricción Acc I y Nhe I.

Figura 8. Resultado del análisis de la estabilidad a la temperatura del dominio Z individual a pH 2,9. El contenido de helicidad \alpha en la muestra se vigiló midiendo la elipticidad a s222 nm durante un barrido de temperaturas.

Figura 9. Vector fagémido pKN1. Los productos de PCR del banco que codifican las hélices 1 y 2 variegadas (tanto el banco ácido como el banco extensivo) se subclonaron en el vector fagémido, pKN1, que contenía el gen para los residuos 44-58 del dominio Z de tipo salvaje (esencialmente hélice 3), seguido del gen para una región (PAA) de unión a albúmina de suero de 46 residuos derivada de la proteína G de estreptococos enlazada en marco con una versión truncada del gen de la proteína 3 del revestimiento del fago M13. El fagémido contiene el origen de la replicación derivado del plásmido pBR322, así como la región intergénica (fl ori) requerida para el empaquetamiento en las partículas de fago.

Figura 10. SDS-PAGE. Proteínas purificadas por afinidad HSA procedentes del periplasma de células de Escherichia coli que producen el dominio Z de tipo salvaje y dos variantes Z ácidas diferentes como proteínas de fusión PAA codificadas a partir de sus respectivos vectores fagémidos se analizaron mediante SDS/PAGE. M, marcador del peso molecular; pista 1, dominio Z de tipo salvaje; pista 2, clon 10; pista 3, clon 12.

Figura 11. Datos de DC. Gráfica de superposición de espectros de DC obtenidos para el dominio Z de tipo salvaje y dos variantes del banco de proteínas Z. Las señales de las proteínas se obtuvieron después de restar la contribución de la señal de DC a la cola de PAA, presente durante el análisis.

Figura 12. Cromatografía de intercambio de iones. Las dos proteínas nº 10 y nº 12 de variantes Z ácidas junto con el dominio Z de tipo salvaje (producidas como proteínas de fusión PAA) se sometió cada una de ellas a análisis a pH 5,5, empleando una columna de cromatografía de intercambio de aniones. La elución de las proteínas a partir de la columna se obtuvo mediante un gradiente de NaCl. Parte superior: variante Z ácida nº 12; central, variante Z ácida nº 10; inferior, Z (tipo salvaje). Obsérvese que la proteína Z de tipo salvaje no se retardó en la columna a este pH.

Figura 13. Estructura del dominio Z. Una representación traza de la cadena principal del modelo de la estructura del dominio Z nativo. La estructura de las hélices una y dos son de la co-estructura cristalina entre el dominio B de SPA y Fc (Deisenhofer (1981) Biochemistry, 20, 2361-2370). La tercera hélice se constituyó en base a las asignaciones estructurales secundarias a partir de espectroscopia de RMN (Gouda et al., (1992) Biochemistry, 31, 9665-9672). Los átomos de no hidrógeno de las cadenas laterales de residuos que se mutaron en la construcción del banco combinatorio se exhiben en forma de modelos de bola y palo. La exhibición se generó mediante el programa MOLSCRIPT (Kraulis (1991) J. Appl. Cryst., 24, 946-950).

Figura 14. Secuencia de aminoácidos. Resultado de la secuenciación de ADN de 31 variantes Z elegidas al azar del banco. Los residuos sometidos a la mutagénesis están enmarcados. Las líneas horizontales indican identidad de nucleótidos, con la secuencia Z de tipo salvaje listada en la parte superior. Se indican los clones que se expresaron y se caracterizaron como proteínas de fusión a la cola de PAA.

Figura 15. Distribución de aminoácidos. Resultado del análisis estadístico de los aminoácidos deducidos en las posiciones mutadas. En total, en el cálculo se incluyeron 13 residuos procedentes de 31 clones (403 codones). Las relaciones entre las frecuencias observadas y esperadas se muestran para la totalidad de los 20 aminoácidos, así como para la única señal de terminación (TAG) incluida en el perfil de degeneración NNG/T.

Figura 16. Análisis por SDS-PAGE. Proteínas purificadas por afinidad de HSA a partir del periplasma de células de E. coli que producen el dominio Z de tipo salvaje y cuatro variantes Z diferentes en forma de proteínas de fusión PAA codificadas a partir de sus respectivos vectores fagémidos se analizaron mediante SDS/PAGE. Pistas 1-5: condiciones reducidas. Pistas 6 y 7: condiciones no reducidas. Pista 1, dominio Z de tipo salvaje; pista 2, clon 16; pista 3, clon 21; pista 4, clon 22; pista 5, clon 24; M, marcador del peso molecular; pista 6, clon 16 y pista 7, clon 22.

Figura 17. Datos de DC. Gráfica superpuesta de espectros de DC obtenidos para el dominio Z de tipo salvaje y cuatro variantes del banco de la superficie de la proteína \alpha-helicolidal. Las señales de las variantes se obtuvieron después de restar la contribución de la señal de DC de la cola de PAA presente durante el análisis.

Figura 18. Análisis del biosensor. Una gráfica superpuesta de sensogramas, obtenida a partir del análisis BIA-core® del dominio Z de tipo salvaje de cuatro variantes diferentes (nºs 16, 21, 22, 24; figura 4) condensadas a la cola de PAA. Las actividades de unión a IgG de las diferentes proteínas se analizaron utilizando un chip sensor revestido con aproximadamente 5000 UR de IgG policlonal humana e inyecciones de 45 \mul a impulsos a 2 \mul/min de soluciones 1500 nM de las diferentes proteínas. Obsérvese que las diferencias de los valores de la meseta de las señales durante las inyecciones de las variantes nºs 16, 21, 22 y 24 se debe a las diluciones divergentes en el tampón de accionamiento.

Todos los reactivos y construcciones de ADN están disponibles en el Departamento de Bioquímica y Biotecnología, Royal Institute of Technology, Estocolmo, Suecia.

Material

Los oligonucleótidos (fig. 6) se adquirieron de Scandinavian Gene Synthesis (Suecia) y se fosforilaron en los casos indicados de acuerdo con [Maniatis et al (1988) Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press]. ZLIB-1 se biotiniló en el extremo 5', permitiendo la inmovilización en perlas paramagnéticas de estreptavidina M-280 adquiribles de Dynal A/S (Noruega). El tampón de lavado/unión era NaCl 1 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 1 mM. El tampón de reasociación/ligación era Tris-HCl 30 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, ATP 0,2 mM, 1,4-ditiotreitol (DDT) 1 mM. La ADN ligasa era de Boehringer Mannheim, Alemania. El tampón 10 x PCR contenía MgCl_{2} 20 mM, dNTPs 2 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, Tween 20 al 1%. ADN polimerasa de Taq procedía de Cetus Inc., EE.UU. El ciclador térmico era un Perkin-Elmer 9600. Para el rastreo de la temperatura/estabilidad se utilizó un espectropolarímetro J-720 (JASCO, Japón). La cepa RR1\DeltaM15 de Escherichia coli [Rüther, U. (1982) Nucl. Acids Res. 10:5765-5772] preparada para competencia [Maniatis et al (1988) Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press] se utilizó como huésped para la transformación. Las placas de agar contenían 100 \mug/ml de ampicilina.

Ejemplo 1 Construcción de un banco Z ácido

El análogo Z de SPA de 58 residuos sintético [Nilsson et al. Prot. Eng] se sometió a un proceso de mutagénesis para construir nuevas variantes con un pI alterado, con el fin de producir participantes en la fusión para las proteínas recombinantes a purificar mediante cromatografía de intercambio de iones. En base a la estructura cristalina del complejo entre el dominio B de SPA y FcI humano [Deisenhofer, J. et al 1981, Biochemistry 20:2361-2370], se eligieron como dianas para la mutagénesis cinco residuos procedentes del dominio B que participan en la unión. Estos cinco codones, correspondientes a los residuos Z nºs 9, 11, 14, 27 y 35 situados en las hélices 1 y 2 se alteraron simultáneamente utilizando oligonucleótidos degenerados con la secuencia de tripletes G(C/A)(C/A) en estas posiciones, dando como resultado los codones para los aminoácidos alanina (50%), ácido aspártico (25%) y ácido glutámico (25%), respectivamente. Al utilizar una estrategia de ensamblaje de genes en fase sólida [Stähl et al, Biotechniques 14:424-434] se creó un banco de genes que codifica 3^{5}(243) variantes de carácter ácido del dominio Z de unión a IgG sintético (fig. 5). Veinte microlitros (200 \mug) de perlas revestidas con estreptavidina paramagnéticas se lavaron con tampón de lavado/unión y se incubaron con 15 pmol de oligonucleótidos ZLIB-1 (biotinilado) y ZLIB-2 prehibridados durante 15 min a TA a un volumen final de tampón de lavado/unión de 40 \mul. Después de la ligación y el lavado, se añadieron de una manera repetitiva aproximadamente 15 pmol de cada uno de los oligonucleótidos ACID-1 (degenerado), LONGBRIDGE y ACID-2 (degenerado) y el par de enlazador ZLIB-4/ZLIB-5 pre-reasociado, interviniendo etapas de lavado de acuerdo con Stähl et al [Biotechniques 14:424-434]. Después de haberse completado el ensamblaje, los diferentes fragmentos se ligaron durante 15 min a 37ºC. Para amplificar la cantidad de ADN que codifica el banco Z (Acid), todavía inmovilizado sobre las perlas, se retiró una fracción y se sometió a PCR. La mezcla de PCR (50 \mul) contenía un pmol de cada uno de los cebadores y ZLIB-3 y ZLIB-5 de PCR, 5 \mul de cada una de las mezclas de ligación, tampón 10 x PCR y 10 x CHASE, 1 unidad de polimerasa de Taq y agua estéril hasta 50 \mul. El programa de ciclo de temperaturas era: 96ºC, 1 min, 60ºC, 1 min y 72ºC, 2 min, repetido durante 35 ciclos. El análisis mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% mostró una banda del tamaño esperado de 179 pb, mostrando la capacidad del concepto de ensamblaje. La banda de 179 pb procedente de la PCR del banco Z (Acid) se cortó del gel y se purificó (Geneclean®, Bio 101, Inc. EE.UU.) antes de la inserción en un vector plásmido (kit TA-cloning®, Invitrogen, Inc. EE.UU.) adecuado para la secuenciación de ADN en fase sólida [Hultman et al, 1988]. Después de la transformación y de distribución en placas de agar con contenido en ampicilina, se eligieron dos colonias para el análisis de las secuencias obtenidas. Los resultados (fig.6) muestran que la degeneración esperada se encontró en las posiciones deseadas.

Ejemplo 2 Medición de la estabilidad a la temperatura de la conformación Z

La estabilidad a la temperatura de la conformación Z se determinó siguiendo la elipticidad a 222 nm mediante espectroscopia por dicroismo circular (DC) a través de un barrido de temperaturas. Esta longitud de onda se utiliza para vigilar la presencia de la helicidad \alpha de Z [Cedergren et al. 1993 Prot. Eng. 6:441-448]. El experimento se realizó a un pH más bien bajo (aproximadamente 2,9), con el fin de desestabilizar la molécula, ya que el punto medio de la temperatura de desnaturalización (Tm) ^{\sim} 95ºC a pH neutro (datos no mostrados), que está fuera del intervalo que puede determinarse mediante un barrido completo a través de la transición bajo presión atmosférica normal. El experimento muestra (fig. 4) que la Tm (según se define por el punto de inflexión del barrido de temperaturas) del dominio Z es tan elevado como 71ºC a pH 2,9. Esto demuestra la estabilidad a la temperatura extrema de las hélices á en la molécula Z.

El experimento se llevó a cabo en un espectropolarímetro J-720 (JASCO, Japón), y la temperatura se controló haciendo circular agua a través del soporte de la cubeta procedente de un baño de agua NESLAB. La temperatura se vigiló en la cubeta a través de un dispositivo microsensor (JASCO, Japón). El tampón era ácido acético 50 mM, pH 2,9. La proteína era dominio Z [Cedergren et al 1993 Prot. Eng. 6:441-448] a una concentración de proteínas de 50 \mug/ml y la longitud del recorrido de las células en la cubeta era de 1 cm. La velocidad de barrido de la temperatura en el experimento era 50ºC/h.

Ejemplo 3 Caracterización de proteínas derivadas del banco Z ácido

Dos variantes de proteínas derivadas del banco Z ácido se expresaron en Escherichia coli, se purificaron y caracterizaron utilizando SDS-PAGE, dicroismo circular y cromatografía de intercambio de iones. Los productos de PCR procedentes de un conjunto de genes en fase sólida (véase el Ejemplo 1) se restringieron con 45 U de Esp 3I (Labassco AB, Suecia) y 50 U de Nhe I (Pharmacia, Suecia) en 200 \mul de tampón (Tris-acetato 33 mM, pH 7,9, acetato de Mg 10 mM, acetato de potasio 66 mM, DTT 0,5 mM y 0,1 mg/ml de BSA). La mezcla se recubrió con aceite mineral y se incubó a 37ºC durante una noche. Los fragmentos restringidos (aproximadamente 5 \mug) se purificaron mediante extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, seguido de un lavado adicional con cloroformo y luego se precipitaron con etanol antes de la ligación a 15ºC durante una noche al vector pKN1 escindido con Mlu I-Nhe I (1 \mug) (véase más abajo) utilizando 13,5 unidades de Weiss de T4 ADN ligasa. La mezcla de ligación se trató térmicamente a 70ºC durante 20 min, se extrajo con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, seguido del lavado con cloroformo, se precipitó con etanol y se redisolvió en 20 \mul de agua estéril.

El vector pKN1 fagémido (figura 9) se construyó en varias etapas como sigue. Un enlazador de doble cadena que codifica los residuos 44-58 invariables del dominio Z se formó a partir de los oligonucleótidos ZLIB-6 y ZLIB-7 y se clonó en forma de un fragmento Mlu I-Xho I en el fagémido pKP986 (una amable donación del Dr. Lars Abrahmsén. Pharmacia BioScience Center, Suecia), dando como resultado pKN. El plásmido pKP986 codifica el péptido conductor Omp A de E. coli, seguido de los residuos 249-406 de la proteína 3 de revestimiento del fago filamentoso fd (Lowman et al (1991) Biochemistry, 30, 10832-10844) bajo el control de un promotor lac. Un fragmento de gen que codifica una región de unión a albúmina de suero monovalente derivada de la proteína G de estreptococos se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pB2T (Eliasson et al., Molecular Immunol., 28, 1055-1061), utilizando los cebadores ABP-1 y ABP-2 (que contienen los sitios de reconocimiento Xho I y Sal I, respectivamente) y se clonó en el plásmido pKN restringido con Xho I, proporcionando pKN1. Este vector fagémido codifica así el péptido señal Omp A, la tercera hélice del dominio Z de tipo salvaje, seguido de una proteína de unión a albúmina (PAA) de 46 residuos enlazada a los residuos 249-406 de la proteína III del fago fd y está destinada para la inserción de productos de PCR digeridos con Esp 3I/Nhe I que codifican hélices variegadas una y dos del dominio Z.

Células RR1\DeltaM15 de E. coli competentes congeladas (supE44 lacY1 lacZ ara-14 galK2 xyl-5 mtl-1 leuB6 proA2 \Delta(mrcC-mrr) recA^{+} rpsL20 thi-1 lambda^{-} F[lcc19 lacZ\DeltaM15]) (Rüther, (1982), Nucleic Acids Research, 10, 5765-5772) se transformaron con la mezcla de ligación de acuerdo con Maniatis y colaboradores (Maniatis et al. (1982) Molecular clonig: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y se extendieron en placas de agar que contenían 100 \mug/ml de ampicilina (Sigma. EE.UU.) y glucosa al 1%. Pequeñas cantidades de células procedentes de colonias tomadas al azar se sometieron separadamente a amplificaciones por PCR en dos etapas (30 ciclos: 96ºC, 15 s; 72ºC, 2 min) en un sistema de PCR GeneAmp 9600 (Perkin Elmer, EE.UU.) utilizando 5 pmol de cebadores RJT-27 y NOKA-2 (biotinilado) en TAPS 20 mM (pH 9,3), MgCl_{2} 2 mM, KCl 50 mM, Tween 20 al 0,1%, desoxirribonucleósido trifosfatos (dNTPs) 0,2 mM y 1,0 U de ADN polimerasa de Taq (Perkin-Elmer). La secuenciación de ADN en fase sólida de los productos de PCR se efectuó empleando los cebadores NOKA-3 (para la cadena inmovilizada) y ABP-2 (para la cadena eluída) de secuenciación marcados con FITC en una estación de trabajo robótica (Biomek® 1000, Beckman Instruments, Fullerton, CA) y un Automated Laser Fluorescent (A.L.F.) DNA Sequencer® (Pharmacia Biotech, Suecia) según se describe por Hultman y colaboradores (Hultman et al., (1989) Nucleic Acids Research, 17, 4937-4946.

Para el análisis ulterior se seleccionaron dos clones con las sustituciones de aminoácidos ácidas diferentemente codificadas (en negrillas) en las posiciones 9, 11, 14, 27 y 35 en el dominio Z de acuerdo con la tabla 1. El dominio Z de tipo salvaje y las dos proteínas de variante Z ácidas diferentes (clones nºs 10 y 12) se expresaron a partir de sus respectivos vectores fagémidos como fusiones a la cola de unión a albúmina (PAA) del suero y se purificaron mediante cromatografía de afinidad en albúmina de suero humana.

TABLA 1 Sustituciones de aminoácidos para clones seleccionados en el banco Z ácido^{a}

	Clon nº	Aminoácido codificado en la posición nº
		9	11	14	27	35
	t.s.	Gln	Asn	Tyr	Arg	Lys
	10	Glu	Asp	Asp	Ala	Glu
	12	Glu	Asp	Asp	Ala	Ala
a. letras en negrillas indican aminoácidos

Colonias de células RR1\DeltaM15 de E. coli que albergan los correspondientes vectores fagémidos se utilizaron para inocular 100 ml de caldo de soja tríptico (Difco) suplementado con ampicilina (100 \mug/ml). Los cultivos se desarrollaron a 37ºC hasta una DO_{\text{600 nm}}= 1, seguido de inducción con una concentración final de 1 mM de IPTG e incubación a 30ºC durante la noche. Las células se recolectaron mediante centrifugación a aproximadamente 5000 g durante 10 min y las proteínas periplásmicas se liberaron mediante choque osmótico. El contenido periplásmico procedente de células se sometió a cromatografía de afinidad en HSA-Sepharose, según se describe por Nygren y colaboradores (Nygren et al., (1988) J. Mol. Recognit., 1, 69-74) y se analizaron mediante SDS/PAGE en un gel auxiliar homogéneo al 12% (BioRad Inc., EE.UU.) que se tiñó con azul brillante Coomassie R-250. Para todas las proteínas se pudieron recuperar aproximadamente 1,5-2,5 mg/l de cultivo, indicando eficacias de producción y secreción similares para las variantes y el dominio de tipo salvaje. Además, los resultados del análisis SDS-PAGE (figura 10) de proteínas purificadas sugiere que las variantes Z ácidas analizadas se expresan de modo estable en E. coli.

Para investigar si el contenido en estructura secundaria de los derivados se conservaba después de la mutagénesis en superficie, se realizó un análisis por dicroismo circular sustractivo. Proteínas Z purificadas por cromatografía de afinidad de IgG o HSA, Z-PAA, los derivados de ácidos nºs 10 y 12 condensados a la cola de PAA, así como la propia cola de PAA se sometieron a un análisis de dicroismo circular a 250 hasta 184 nm (más allá del UV) a la temperatura ambiente utilizando un instrumento espectropolarímetro J-720 (JASCO, Japón). La velocidad de rastreo era de 10 nm/min. La longitud del recorrido de las células era 1 mm. Se prepararon soluciones (aproximadamente 0,1 mg/ml) de las diferentes proteínas en tampón fosfato 20 mM, pH 6,5, suplementado con Tween 20 al 0,05% (Kebo AB, Suecia). Se determinaron concentraciones precisas de proteína determinadas mediante el análisis de aminoácidos en un analizador de aminoácidos Beckmann 6300 equipado con un sistema de tratamiento de datos System Gold. Las señales de DC para los derivados se obtuvieron sustrayendo la señal obtenida para la cola de PAA después de ajustes para las diferencias en las concentraciones de proteínas, seguido de normalización para los contenidos en aminoácidos.

Una comparación de las señales obtenidas desde 250 hasta 184 nm para el dominio Z de tipo salvaje y las variantes ácidas condensadas a la cola de PAA se efectuó después de sustraer la contribución procedente de la propia cola de PAA. El resultado demuestra que para los dos derivados Z ácidos, se obtuvieron espectros similares al dominio Z de tipo salvaje con un mínimo característico a 208 nm y un punto de inflexión a 222 nm (Johnson, 1990) (figura 11). Esto sugiere que el marco de haz de tres hélices está conservado en estos mutantes.

Las dos variantes Z, nºs 10 y 12, contienen cuatro y tres aminoácidos ácidos introducidos, respectivamente, en comparación con el dominio Z nativo. Con el fin de investigar si la acidez introducida se reflejaba como diferencias en sus puntos isoeléctricos, se sometieron a una elución de gradiente a partir de una columna de intercambio de aniones. Las proteínas Z (tipo salvaje) y las variantes ácidas nº 10 y nº 12 (todas producidas en forma de proteínas de fusión PAA) se disolvieron cada una (5 \mug) en 300 \mul de tampón piperazina 20 mM (pH 5,5) y se aplicaron por separado a razón de 100 \mul/min en una columna MonoQ.PC 1.6/5 (Pharmacia, Suecia). La elución de las proteínas se realizó aplicando un gradiente de NaCl en tampón piperazina (pH 5,5) (Sigma, EE.UU.) que oscilaba desde 0-50% de NaCl en 20 min. Los resultados procedentes del análisis (figura 12) muestran que las dos proteínas de variante Z ácidas eluyeron a diferentes concentraciones de NaCl, sugiriendo claras diferencias en los puntos isoeléctricos. En contraposición, al pH elegido durante los experimentos, el dominio Z de tipo salvaje no interactuaba con la resina y, por lo tanto, se observa en el flujo.

Así, la serie de experimentos llevados a cabo en las dos variantes Z ácidas muestra que el comportamiento de expresión, la estabilidad proteolítica y el contenido en estructura secundaria de las variantes se mantenían inalterados cuando se comparan con el dominio Z nativo. Además, se introdujeron en las dos variantes Z dos nuevas funciones mediante la sustitución de las posiciones situadas en la superficie con aminoácidos. Las dos variantes ácidas se pueden utilizar, por ejemplo, como participantes en la fusión para facilitar la purificación de proteínas recombinantes mediante cromatografía de intercambio de iones a bajo pH. Así, se demuestra que entre los miembros del banco Z ácido, se pueden aislar variantes con funciones nuevas.

Ejemplo 4 Construcción y caracterización de un banco combinatorio de variantes Z

Un banco de variantes Z se ensambló utilizando una estrategia de ensamblaje de gen en fase sólida (véase el Ejemplo 1). Se encontró que la mayoría de los residuos aminoácidos que sugerían que tomaban parte en la unión a Fc (Deisenhofer, (1981) Biochemistry, 20, 2361-2370) estaban en la superficie de la molécula (Q9, Q10, N11, F13, Y14, L17, N28, Q32 y K35) y, por lo tanto, estaban incluidos en la mutagénesis. Además, en base a su localización superficial, también se decidió que estaban incluidos otros residuos (H18, E24, E25 y R27). En total, 13 residuos en el andamio de Z se eligieron de esta forma para la mutagénesis simultánea y al azar. Un conjunto de oligonucleótidos (figura 6) se sintetizó para la construcción del banco de mutantes de superficie del dominio de unión a IgG monovalente de 58 residuos, denominado Z. En este banco, los codones para Q9, Q10, N11, F13, Y14, L17 y H18 situados en la primera hélice \alpha, y E24, E25, R27, N28, Q32 y K35 en la segunda hélice \alpha del dominio Z (figura 13) se sustituyeron por codones NNK (K= G o T) degenerados utilizando una estrategia en fase sólida que utiliza los oligonucleótidos degenerados de cadena sencilla para el ensamblaje. La degeneración de NNK elegida incluye 32 codones que cubren los 20 aminoácidos, incluida la señal de terminación TAG (ámbar).

El oligonucleótido ZLIB-1 se sintetizó con un grupo biotina 5' para permitir un anclaje firme sobre perlas paramagnéticas revestidas con estreptavidina utilizadas como soporte sólido durante el ensamblaje del gen. Este oligonucleótido ZLIB-1, junto con su secuencia complementaria (ZLIB-2), codifica los residuos 1-8 del dominio Z, precedido por los primeros seis residuos de la región E de la proteína A que se incluían para facilitar la secreción en E. coli de las variantes Z (Abrahmsén et al., (1986) EMBO J., 4, 3901-3906). Los oligonucleótidos DEGEN-1 y DEGEN-2 (Tabla I) codifican las dos hélices mutadas del dominio Z, respectivamente, implicadas normalmente en la unión a Fc. En teoría, una degeneración completa y simultánea de NNK en las 13 posiciones seleccionadas proporcionaría un banco combinatorio de aproximadamente 8\cdot10^{16} variantes de proteínas codificadas por 3,7\cdot10^{19} secuencias de ADN diferentes. Sin embargo, en este caso, el ensamblaje del banco se inició mediante la inmovilización de aproximadamente 15 pmol de oligonucleótidos ZLIB-1 y ZLIB-2 prehibridados (figura 6), lo que limita el tamaño teórico del banco Z a aproximadamente 0,9\cdot10^{13} secuencias de ADN diferentes que codifican aproximadamente 2\cdot10^{10} variantes Z. El ensamblaje se continuó mediante la adición y ligación de una construcción preconformada, obtenida después de la ligación de cantidades equimolares de los oligonucleótidos DEGEN-1 y DEGEN-2, facilitado por el oligonucleótido de puenteo BRIDGE (figura 6).

Para completar el ensamblaje, un fragmento que consiste en los oligonucleótidos ZLIB-4 y ZLIB-5 prehibridados se añadió a las perlas para la ligación. Este fragmento codifica el segundo bucle y los primeros seis residuos de la tercera hélice inalterada del dominio Z. Después de completado el ensamblaje, los oligonucleótidos ZLIB-3 y ZLIB-5, que contenían las secuencias de reconocimiento para las endonucleasas Esp3I y NheI, respectivamente, se utilizaron como cebadores para la amplificación por PCR de las construcciones ensambladas utilizando un décimo del ADNss inmovilizado con perlas en forma de plantilla (correspondiente teóricamente a 2\cdot10^{9} variantes de proteínas). Para evitar una interferencia indeseada durante la amplificación, los oligonucleótidos ZLIB-2, BRIDGE y ZLIB-5 se eluyeron primeramente con álcali. El producto de PCR resultante se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa y se encontró homogéneo y del tamaño esperado de 179 pb.

El producto de PCR se subclonó en el vector fagémido pKN1 que contenía el gen para los residuos 44-58 del dominio Z de tipo salvaje en el marco con una versión truncada del gen proteína 3 revestida con fago fd para la exhibición en superficie en las partículas de fago tras la superinfección con fago helper de células de E. coli transformadas con fagémido (Lowman et al., (1991) Biochemistry, 30, 10832-10844) (figura 9). Además, el vector fagémido contiene una casete en marco interespaciada que codifica una región de unión a albúmina de suero de 5 kDa (46 aa) (denominada PAA) derivada de la proteína G de estreptococos (Nygren et al., (1988) J. Mol. Recognit., 1, 69-74; Nilsson et al., (1994) Eur. J. Biochem., 224, 103-108), permitiendo una purificación por afinidad eficaz de variantes Z producidas desprovistas de su actividad de unión a Fc activa. Además, la actividad de unión a albúmina de suero se puede utilizar en potencia para la pre-selección de partículas de fago que portan moléculas recombinantes antes del encuadramiento para variantes Z con nuevas funciones de unión, para disminuir el fondo que procede de partículas de fago no recombinantes unidas de manera inespecífica.

Después de la transformación, el rastreo por PCR (utilizando los oligonucleótidos RJT-27 y NOKA-2) de 25 clones mostró que más del 95% (24/25) de los clones contenía una inserción de la longitud esperada, sugiriendo que el proceso de ensamblaje del gen se llevó a cabo con una elevada eficacia. Cuarenta y cinco transformantes se seleccionaron al azar y se sometieron a secuenciación de ADN en fase sólida directa (véase el Ejemplo 3) con el fin de analizar adicionalmente la calidad y heterogeneidad del banco. Aproximadamente el 69% de los clones era correcto, conteniendo codones de tipo salvaje y degenerados en las posiciones esperadas. Los clones restantes tenían discrepancias esporádicas que, en parte, pueden atribuirse a la síntesis de oligonucleótidos o errores introducidos durante la PCR. Los clones correctos (31 clones) (figura 14) se analizaron adicionalmente para la representación de codones en las 13 posiciones degeneradas. La distribución de los 403 aminoácidos deducidos resultantes totales entre los 32 codones incluidos en el perfil de degeneración NNK muestra una estrecha correlación con las frecuencias esperadas para estos clones todavía no seleccionados (figura 15). Para investigar la expresión y estabilidad de las variantes Z, cuatro clones (nºs 16, 21, 22, 24; (figura 14) con diferentes grados de sustitución, así como el dominio Z de tipo salvaje se produjeron en forma de fusiones de PAA codificadas a partir de sus respectivos vectores fagémidos. Proteínas solubles procedentes del periplasma de cultivos inducidos por IPTG se sometieron a cromatografía de afinidad HSA empleando la cola de PAA para una recuperación general y eficaz (Nygren et al., (1988). J. Mol. Recognit., 1, 69-74). Para todas las proteínas, se pudieron recuperar aproximadamente 1,5-2,5 mg/l de cultivo, indicando eficacias de producción y secreción similares para las variantes y el dominio de tipo salvaje. Los resultados procedentes de un análisis por SDS-PAGE (figura 16) de proteínas purificadas sugiere que las cuatro variantes Z analizadas se expresan de modo estable en E. coli. La banda más pequeña con actividad de unión de HSA, observada con diferentes intensidades, corresponde lo más probablemente a la propia cola de PAA (5 kDa), resultante de la escisión proteolítica entre la variante Z y la cola de PAA. De modo interesante, las dos variantes Z (nºs 16 y 22) con residuos cisteína introducidos formaban dímeros que podían ser observados en condiciones no reductoras durante la SDS-PAGE (figura 13; pistas 6 y 7).

Para investigar si el contenido en estructura secundaria de los derivados se conservaba después de la mutagénesis en superficie extensiva, se llevó a cabo un análisis de dicroismo circular sustractivo (véase el Ejemplo 3). Una comparación de señales obtenidas desde 250 a 184 nm para el dominio Z de tipo salvaje y las cuatro variantes condensadas a la cola de PAA se llevó a cabo después de la sustracción de la contribución procedente de la propia cola de PAA. El resultado demuestra que para tres de los cuatro derivados se obtuvieron espectros similares al dominio Z de tipo salvaje, con un mínimo característico a 208 nm y un punto de inflexión a 222 nm (Johnson, (1990) Proc. Struct. Funct., Genet., 7, 205-224) (figura 17). Esto sugiere que la estructura de marco de tres hélices se conserva probablemente en estos mutantes. Sin embargo, para el cuarto derivado (nº 24) se obtuvo un espectro que se asemeja a espectros observados para espirales aleatorias, indicando un bajo contenido en elementos de estructura secundaria (Johnson, 1990). Este derivado contiene una sustitución de glutamina por prolina en la posición 32 en la hélice 2, sugiriendo una desestabilización que conduce a un colapso del marco de haz de la hélice.

Con el fin de investigar adicionalmente las cuatro variantes Z, la interacción con IgG humana (hIgG) policlonal (Pharmacia AB) para Z de tipo salvaje y cuatro clones diferentes de variante Z (nºs 16, 21, 22, 24; figura 14) condensados a la cola de PAA se comparó utilizando una tecnología de biosensor (BIAcore®, Pharmacia Biosensor AB, Suecia). La capa de dextrano carboxilada de un chip sensor CM-5 se activó utilizando la química de N-hidroxisuccinimida (NHS) y N-etil-N'-[3-dietilaminopropil]-carbodiimida (EDC) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para la inmovilización de hIgG, 20 \mul de una solución de hIgG 500 mM en acetato 50 mM, pH 4, se inyectó a un caudal de 5 \mul/min sobre la superficie activada, dando como resultado la inmovilización de aproximadamente 5000 unidades de resonancia (UR). Muestras de 45 microlitros de las cinco proteínas de fusión, disueltas a concentraciones aproximadas de 1500 nM en NaCl/Hepes (Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, tensioactivo P-20 al 0,5%) se inyectaron en experimentos separados a un caudal de 2 \mul/min. Después de cada inyección de muestra, la superficie de hIgG se regeneró con HCl 20 mM. Como se esperaba, sólo el dominio Z de tipo salvaje mostró una actividad de unión a Fc detectable (figura 18).

En conclusión, los resultados demuestran que se puede construir un banco de variantes SPA con una superficie constituida a partir de 13 residuos situados en las hélices \alpha. El alto grado de conservación del marco general del dominio Z nativo sugiere que derivados con nuevas funciones injertadas sobre un andamiaje estable y soluble podrían aislarse para uso como anticuerpos artificiales en bioquímica, inmunología y biotecnología.

Claims (15)

1. Un método para la identificación y/o fabricación de una estructura receptora bacteriana artificial, que comprende las etapas:

a) proporcionar un repertorio de proteínas diferentes, siendo el repertorio un conjunto de estructuras de receptor bacteriano artificial diferentes, en cada una de las cuales la secuencia de aminoácidos de la estructura receptora bacteriana artificial corresponde a la de un receptor bacteriano natural con al menos un residuo aminoácido expuesto en la superficie sustituido con otro residuo aminoácido, siendo el receptor bacteriano natural el dominio Z derivado de la proteína A de Staphylococcus aureus;

b) someter dicho repertorio a un proceso de selección basado en una función de interacción deseada, para la selección de estructuras de receptor bacteriano artificial en las que las sustituciones son tal que no se pierde la estructura básica ni la estabilidad del receptor bacteriano natural, en que la estructura del receptor bacteriano artificial carece de una capacidad de interacción del receptor bacteriano natural, y en que la estructura del receptor bacteriano artificial se une a un participante en la interacción al que no se une el receptor bacteriano natural; y

c) aislar la estructura del receptor seleccionada.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la estructura del receptor bacteriano artificial tiene al menos una sustitución en la posición de aminoácido seleccionada de las posiciones 9, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 24, 25, 27, 28, 32 y 35 de la secuencia del dominio Z.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la estructura del receptor bacteriano artificial tiene sustituciones en las posiciones de aminoácidos 9, 11, 14, 27 y 35 de la secuencia del dominio Z.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la estructura del receptor bacteriano artificial tiene sustituciones también en las posiciones de aminoácidos 10, 13, 17, 18, 24, 25, 28 y 32 de la secuencia del dominio Z.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la estructura del receptor bacteriano artificial se condensa a una proteína revestida con fago.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha sustitución se ha obtenido mediante mutagénesis dirigida al lugar.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho participante en la interacción al que no se une el receptor bacteriano natural se selecciona del grupo que consiste en proteínas, lípidos, hidratos de carbono y sustancias inorgánicas.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho participante en la interacción es un hidrato de carbono tal como un determinante del grupo sanguíneo o un oligosacárido específico de patógenos.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho participante en la interacción se selecciona del grupo que consiste en IGF-I, IGF-II, hGH, factor VIII, insulina, apolipoproteína y sus receptores respectivos.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho participante en la interacción se selecciona del grupo que consiste en una proteína de revestimiento viral, un antígeno bacteriano, biotina y un marcador de células, tal como CD34 o CD4.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho participante en la interacción es un fragmento de anticuerpo tal como Fv, scFv, Fab o Fc.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho participante en la interacción es un ligando orgánico.

13. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende las etapas:

a1) preparar, mediante técnicas de ADN recombinante, partículas de fago que portan en sus respectivas superficies proteínas procedentes de dicho repertorio condensado de proteínas de revestimiento de fago;

a2) encuadrar a partir de una agrupación de partículas de fago que resultan de la etapa a1) para seleccionar clones de fago específicos que exhiban características de unión deseadas; y

b) aislar dichos clones de fago específicos utilizando interacciones asociadas con dichas características de unión.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-12, que comprende las etapas:

a) preparar, mediante técnicas de ADN recombinante, proteínas de fusión en que las proteínas de dicho repertorio se condensan a una proteína represora con afinidad por una región específica de operador portada por plásmido que resulta en la interacción entre una variante de proteína específica y un plásmido que codifica el mismo; y

b) aislar las proteínas seleccionadas utilizando dicha interacción.

15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-12, que comprende las etapas:

a1) preparar, mediante técnicas de ADN recombinante, células bacterianas que portan en sus respectivas superficies proteínas procedentes de dicho repertorio condensadas a dominios de anclaje célula-pared funcionales en dichas células bacterianas;

a2) encuadrar a partir de una agrupación de partículas de fago que resultan de la etapa a1) para seleccionar clones de fago específicos que exhiban características de unión deseadas; y

b) aislar dichos clones específicos utilizando interacciones asociadas con dichas características de unión.