ES2225494T3

ES2225494T3 - Procedimiento de determinacion espectroscopica esr de modificaciones de las propiedades de transporte de la albumina en una prueba con contenido de albumina.

Info

Publication number: ES2225494T3
Application number: ES01911706T
Authority: ES
Inventors: Vladimir A. Muravsky; Alexander Milutin; Gert A. Matthes; Gunter Seibt
Original assignee: E W Handels- und Consulting GmbH
Current assignee: E W Handels- und Consulting GmbH
Priority date: 2000-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2021-02-28
Also published as: WO2001065270A3; DE10011163A1; ATE268914T1; EP1269213A2; JP2003525456A; RU2275648C2; TR200402253T4; IL151516A; CA2401486C; CA2401486A1; US20030170912A1; IL151516A0; AU4066201A; DE50102536D1; PT1269213E; AU2001240662B2; CN1418314A; DK1269213T3; US7166474B2; RU2002123351A

Abstract

Procedimiento para el examen espectroscópico de ESR de una prueba con contenido de albúmina bajo el uso de una sonda de espín, caracterizado por el hecho de que se determinan las variaciones de transporte de la albúmina en una prueba con contenido de albúmina, de manera que en la prueba a examinar se inducen cambios intencionados de la conformación de la molécula de albúmina, agregando a las partes alícuotas de la prueba por lo menos tres concentraciones diferentes de una sonda de espín que se une a la albúmina y adicionalmente por lo menos tres concentraciones diferentes de un reactivo polar, por medio de los espectros ESR de las partes alícuotas proporcionadas con la sonda de espín y el reactivo polar se determina el grado de la variación de los parámetros de enlace de la sonda de espín en puntos de enlace específicos de la albúmina dependiendo de la concentración de la sonda de espín y la concentración en reactivo polar mediante simulación por ordenador de los espectros ESR, y se calculan las variaciones de transporte de la albúmina a partir de las variaciones de los valores de los parámetros de enlace de la sonda de espín para las condiciones de conformación de la albúmina inducidas por las diversas concentraciones en la sonda de espín y el reactivo polar, por lo cual las concentraciones en la sonda de espín a añadir se seleccionan de tal manera que el valor medio de la relación de la concentración de la sonda de espín con la concentración de la albúmina es de 2, 5 ñ 0, 5 y, partiendo de este valor medio se seleccionan por lo menos dos concentraciones adicionales, cuya desviación de este valor medio no es inferior a 1, 0 y las concentraciones en reactivo polar se seleccionan entonces de tal manera que el valor medio de la concentración final del reactivo polar es de (0, 6 ñ 0, 25) X cp, con lo cual Cp representa la concentración crítica del reactivo polar, cuyo excedente da lugar a la desnaturalización de la albúmina y, partiendo de este valor medio, se seleccionan por lomenos dos concentraciones adicionales en reactivo polar, cuya desviación de este valor medio supone por lo menos el 15%, con lo cual las concentraciones en sonda de espín y reactivo polar se añaden a las respectivas partes alícuotas de la prueba, dentro de los alcances de concentración arriba definidos de tal manera que por lo menos en una parte alícuota está presente una concentración reducida de sondas y una concentración reducida en reactivo polar, en por lo menos una parte alícuota una concentración media en reactivo polar y una concentración media en sonda de espín y en por lo menos una parte alícuota una concentración alta en sondas y una concentración alta en reactivo polar.

Description

Procedimiento de determinación espectroscópica ESR de modificaciones de las propiedades de transporte de la albúmina en una prueba con contenido de albúmina.

La invención se refiere a un procedimiento práctico médico, biológico, biotecnológico y veterinario para la determinación espectroscópica (ESR) de la resonancia paramagnética electrónica de variaciones de las características de transporte de la albúmina en una prueba que contiene albúmina, que puede emplearse para el diagnóstico y/o el control de variaciones fisiológicas o patológicas en el cuerpo humano o animal o para el control de la calidad de preparados que contienen albúmina, particularmente productos de sangre. El objeto de la invención es también la utilización de un espectrómetro ESR para la realización del procedimiento conforme a la invención.

Para el diagnóstico de enfermedades es conocido emplear los parámetros hematológicos o parámetros que conciernen antígenos, hormonas, enzimas y otras sustancias biológicas activas, lo cual tiene una amplia aplicación en la diagnosis rutinaria clínico-química.

También la espectroscopia NMR y ESR pueden emplearse en la diagnosis patológica para la captación de características estructurales y funcionales de componentes de proteínas y lípidos en el suero sanguíneo. Aunque la aplicación de la espectroscopia ESR, empleando el marcador de espín para el examen de procedimientos de movimiento en macromoléculas, representa el estado de la técnica conocida, la amplia introducción de este método de prueba en la diagnosis rutinaria clínica ha fracasado hasta ahora por los elevados costes del equipamiento y el complicado o no fiable análisis de las señales.

El documento SU 1319705 A1 describe un procedimiento para la diagnosis de enfermedades malignas, midiendo la facultad del plasma sanguíneo o suero sanguíneo mediante ESR para ligar una sonda de espín introducida. Se determina el coeficiente de enlace \alpha, que representa la relación del pico A con la amplitud del pico B. Siendo \alpha > 1 se trata de una enfermedad cancerígena. Con \alpha < 1 el sujeto examinado está sano.

El procedimiento descrito tiene la desventaja de que no trabaja de modo suficientemente sensitivo y por tanto no puede proveer ningún diagnóstico fiable. Los exámenes relativos a este método han mostrado que las declaraciones positivas erróneas y negativas erróneas en el estado precoz de la enfermedad son del \geq 30%.

La EP 0 973 043 A1 describe un procedimiento espectroscópico ESR para la diagnosis de neoplasmas malignos en el suero sanguíneo, en el que se determinan parámetros físico-químicos de la movilidad de una sonda de espín, que representa un ácido graso marcado con espín, en los tres puntos de enlace de la albúmina.

La albúmina es el componente principal en el sistema de transporte de la sangre, que facilita el transporte de ácidos grasos, triptófano, bilirrubina, calcio, hormonas esteroides y otros agentes activos funcionales importantes en la célula de meta, participando al mismo tiempo en el enlace y en la distribución de un gran número de toxinas (entre las mismas también las de origen endógeno). La albúmina es un polipéptido (peso molecular 68.000) con una capacidad de enlace grande para sustancias exógenas (productos farmacéuticos) y endógenas. Se compone de 585 aminoácidos, que están dispuestos en una estructura de lazos por puentes di-sulfúricos. En la literatura se distinguen diversos puntos de enlace en la albúmina de suero. Para ácidos grasos existen los llamados puntos de enlace 1, 2 y 3 en la molécula de
albúmina.

En el procedimiento diagnóstico según la EP 0 973 043 A1 se determina la enfermedad de cáncer por desviación de los parámetros del enlace de sondas de espín que presentan sujetos a examinar sanos.

Con el procedimiento ESR según la EP 0 973 043 A1 se determina entonces el estado concreto de conformación de la albúmina en la sangre, que al presentar un resultado del examen cancerígeno está modificado con respecto a un sujeto sano a examinar. Se ha demostrado que este procedimiento provee declaraciones positivas falsas o negativas falsas, cuando haya influencias adicionales de la sangre sobre la albúmina, p. ej. valores elevados de grasa en la sangre, toma de medicamentos o influencias de diluyentes de la sonda de espín o por conservación de la prueba de sangre al aire.

El objetivo de la presente invención es preparar un procedimiento económico y rápido para la determinación espectroscópica ESR de pruebas con contenido de albúmina, particularmente pruebas de sangre, que permite hacer declaraciones correctas y reproducibles para la conformación de la albúmina tomada en consideración y que es aplicable en la práctica clínico-química del laboratorio. El procedimiento debe ser apropiado para la diagnosis precoz y/o control de cambios fisiológicos o patológicos en el cuerpo humano o animal, para el control de la calidad de materias que contienen albúmina, particularmente de conservas de sangre, y para el dictamen de la capacidad de desintoxicación de moléculas de albúmina.

El objetivo de la invención se resuelve determinando las variaciones de las características de transporte de la albúmina en la prueba a examinar mediante espectroscopia ESR, donde se inducen en la prueba a examinar cambios de conformación intencionados de la molécula de albúmina mediante un reactivo polar bajo la adición de una sonda de espín. Se ha demostrado que los parámetros del enlace de una sonda de espín determinables mediante ESR en puntos de enlace específicos conocidos de la albúmina se correlacionan con parámetros biofísicos de la conformación de la albúmina y los últimos permiten presentar declaraciones fiables sobre cambios fisiológicos o patológicos en el cuerpo humano o animal o también en preparados médicos de transfusión o de transplante.

Conforme a la invención se agregan a partes alícuotas de la prueba por lo menos tres, preferiblemente hasta ocho concentraciones diferentes de una sonda de espín ligada con la albúmina y adicionalmente por lo menos tres, preferiblemente hasta ocho concentraciones diferentes de un reactivo polar, con ayuda de los espectros ESR de las partes alícuotas provistas con sonda de espín y reactivo polar se determina el grado de variación del parámetro de enlace de la sonda de espín en puntos de enlace específicos de la albúmina en dependencia de la concentración de la sonda de espín y de la concentración en reactivo polar mediante simulación por ordenador de los espectros ESR y se calcula la variación de las características de transporte de la albúmina a partir de las variaciones de los valores de los parámetros de enlace de la sonda de espín para los estados de conformación de la albúmina inducidos por las diferentes concentraciones en sonda de espín y reactivo polar, por lo cual las concentraciones en la sonda de espín a agregar son seleccionadas de tal manera que el promedio de la relación de la concentración de la sonda de espín con la concentración de la albúmina es de 2,5 \pm 0,5 y, partiendo de este valor medio, se seleccionan por lo menos dos concentraciones adicionales, cuya diferencia de este valor medio no es inferior a 1,0. Las concentraciones en reactivo polar a añadir son seleccionadas de tal modo que el valor medio de la concentración final del reactivo polar en los alícuotas es de (0,6 \pm 0,25) x Cp, con lo cual Cp representa la concentración crítica del reactivo polar, cuyo excedente da lugar a la desnaturalización de la albúmina, y partiendo de este valor medio, se seleccionan por lo menos dos concentraciones adicionales en reactivo polar, cuya diferencia de este valor medio es de por lo menos el 15%.

Al mismo tiempo deben seleccionarse las concentraciones en sonda de espín y reactivo polar que se agregan a las respectivas partes alícuotas de la prueba, dentro del alcance de las concentraciones indicadas, de tal manera que por lo menos en una parte alícuota son presentes una concentración reducida de sondas y una concentración reducida en reactivo polar, en por lo menos una parte alícuota una concentración elevada de sondas y una concentración elevada en reactivo polar y en por lo menos una parte alícuota una concentración media en reactivo polar y una concentración media en sonda (análisis por detección de enfermedades de 3 espectros). Preferiblemente pueden seleccionarse además otras concentraciones de tal modo que en por lo menos una parte alícuota está presente una alta concentración de sondas y una baja concentración en reactivo polar y especialmente preferido adicionalmente en por lo menos una parte alícuota una baja concentración de sondas y una alta concentración en reactivo polar.

Reactivo presente (análisis de 8 espectros). A través de esta combinación de concentraciones se garantiza que las características de transporte de la albúmina se capten en las diferentes etapas, es decir el estado fisiológico al ligar compuestos químicos hidrófobos como p. ej. ácidos grasos (concentración reducida de sondas y concentración reducida en reactivo polar), el estado fisiológico durante el transporte de compuestos químicos hidrófobos por el sistema vascular (alta concentración de sondas y reducida concentración en reactivo polar) y el estado fisiológico durante la emisión (descarga) de compuestos químicos hidrófobos a las células de meta (alta concentración de sondas y alta concentración en reactivo polar).

Mientras que según el documento SU 1319705 simplemente es posible la determinación del coeficiente de enlace del plasma sanguíneo o del suero sanguíneo en el estado nativo y se determina según la EP 0 973 043 A1 el estado nativo concreto de la albúmina en la prueba de sangre a examinar, el procedimiento según la invención capta las variaciones de la conformación de albúmina (movilidad de conformación) en su desarrollo temporal bajo la influencia de un reactivo polar y, por ello, la funcionalidad de la albúmina y la variación del parámetro de enlace de los substratos a la albúmina. Puesto que dichas variaciones se producen ya muy temprano, por ejemplo por procesos patológicos como por ejemplo principio de cáncer, es posible, según la invención, hacer claras declaraciones diagnósticas ya en estado precoz de las variaciones de la funcionalidad de albúmina, con un tratamiento médico, por abuso de drogas o también durante los pasos de fraccionamiento de componentes del plasma sanguíneo y por almacenamiento incorrecto de derivados de plasma. Dependiendo de la característica físico-química del medio para el análisis ESR, en los análisis de sangre varían la formación de albúmina y por tanto también las características de enlace de una serie de substratos en la albúmina.

El procedimiento según la invención se caracteriza por el hecho de que mediante la espectroscopia ESR se determinan las variaciones de las características de transporte de la albúmina (la funcionalidad de albúmina) p. ej. en la sangre, provocando cambios de conformación intencionados de la molécula de albúmina por diferentes concentraciones en reactivo polar 4 en presencia de diferentes concentraciones en la sonda de espín. Los espectros ESR registrados por las partes alícuotas son simulados electrónicamente mediante un modelo matemático, que preferiblemente está basado en una función Hamilton con anisotropía axial, comparando los espectros experimentales y simulados y se determinan electrónicamente los parámetros del enlace de sondas de espín en puntos de enlace específicos de las sondas de espín de la albúmina, preferiblemente por minimización de los cuadrados de las diferencias de los valores de espectros de los espectros ESR modelados y medidos experimentalmente, que corresponden a estos puntos de enlace, con lo cual los parámetros del enlace de sondas de espín averiguados se correlacionan con parámetros biofísicos de la conformación de albúmina y según la variación fisiológica o patológica a diagnosticar se seleccionan a partir de los parámetros averiguados los parámetros específicos y a partir de estos parámetros se calculan electrónicamente los valores "cut-off" como criterio de decisión mediante una función de discriminación para la modificación específica de la conformación de albúmina como se presenta en variaciones patológicas o fisiológicas especiales.

Según la invención se emplea como sonda de espín un compuesto que puede iniciar un enlace específico con la albúmina, particularmente ácidos grasos, hormonas esteroides o hidrocarburos heterocíclicos, que deben ser marcados por espín. También compuestos químicos hidrófobos, que están marcados con radicales de nitróxilo como sondas de espín conocidas, pueden tener aplicación en el procedimiento conforme a la invención. En una forma de realización especialmente preferida de la invención se emplean ácidos grasos marcados por espín como sondas de espín, preferiblemente los ácidos doxil-esteáricos. Con especial preferencia tiene aplicación el ácido doxil-esteárico 16, 5, 7 o 12. Empleando ácidos grasos marcados por espín como sondas de espín, se pueden determinar de esta manera los parámetros de enlace de sondas de espín en los puntos de enlace 1, 2 y 3 de la albúmina.

Como reactivo polar entra en consideración alcohol o DMSO (dimetilsulfóxido), con lo cual preferiblemente se utiliza un alcohol C_{1}-C_{6}, preferiblemente especialmente alcohol etílico.

Como prueba con contenido de albúmina se entiende en el sentido de la presente invención por ejemplo una prueba de sangre o una prueba de productos farmacéuticos o de productos con contenido de albúmina.

Según la invención son registrados los espectros ESR con por lo menos tres, preferiblemente también hasta ocho concentraciones de sondas de espín. Por ejemplo se pasan tres partes alícuotas de una prueba de suero con un volumen de cada vez 50 \muL con ácido doxil-esteárico 16 en tres concentraciones diferentes y con un reactivo polar en tres volúmenes diferentes, de manera que la concentración final de la sonda de espín en las partes alícuotas a examinar es de 8,33*10^{-4} mol/I, 1,55*10^{-3} mol/I y 2,41*10^{-3} mol/I y la concentración del reactivo polar 2,90 mol/l, 3,37 mol/I y 3,80 mol/I (véase Tabla 1).

La incubación tarda de 7 a 15 minutos, preferiblemente 10 minutos. Durante la incubación se debería agitar. Los espectros ESR se registran por regla general a 37º C y con el valor pH fisiológico de la sangre. Para el aumento de la precisión pueden registrarse los espectros con dos o varios valores de temperatura diferentes de las pruebas entre 15 y 45ºC y/o con dos o varios valores pH diferentes de las pruebas de suero de 7,5 a 3,5.

El análisis de los espectros ESR medidos se realiza electrónicamente con ayuda de un software de ordenador especial desarrollado para el análisis de la estructura de movilidad de moléculas (MMS). Los espectros ESR registrados sobre la base de por lo menos tres, preferiblemente ocho alícuotas de una prueba con contenido de albúmina, preferiblemente de una prueba de suero o de plasma se pasan al software de ordenador para calcular los parámetros del enlace de sondas de espín en los diferentes tipos de los puntos de enlace. Los parámetros de los enlaces de sondas de espín se analizan sobre la base de una simulación de espectros ESR. Un modelo de espectros ESR, preferiblemente a base de una función Hamilton con anisotropía axial, se usa para la simulación de los espectros ESR obtenidos en experimentos. Los parámetros de enlace de sondas de espín en la albúmina describen la simulación por la minimización de los cuadrados de diferencias de espectros ESR simulados y obtenidos en experimentos, como se muestran por ejemplo en la EP 0 973 043 A1

El cálculo de los parámetros se realiza por separado para los diferentes tipos de los puntos de enlace. Los parámetros que caracterizan los enlaces de la sonda de espín en los puntos de enlace de la molécula de albúmina, se calculan mediante la simulación de espectros ESR. Un modelo espín basado preferiblemente en la función Hamilton con anisotropía axial se emplea para el cálculo de cada componente del espectro. El cálculo se realiza según viene descrito arriba en la EP 0 973 043 A1, página 4 a 7.

Para la elaboración matemática del espectro ESR de la sonda de espín se aplica el programa de ordenador arriba indicado, que realiza el algoritmo de cálculo descrito.

El tiempo para la elaboración de un espectro ESR es inferior a 15 segundos.

Como resultado del cálculo de simulación de cada espectro ESR se obtiene un volumen de valores de 48 parámetros de sondas de espín para los tres puntos de enlace de albúmina. Cualquiera de estos parámetros tiene una variación específica, que corresponde a los estados de las moléculas de sondas de espín ligadas a las moléculas de albúmina que reflejan el estado de conformación de las moléculas de albúmina. En total se seleccionan los 17 parámetros de la Tabla 2 del volumen de valores, que caracterizan específicamente el estado de la albúmina, para el caso en que el ácido doxil-esteárico 16 sirve por ejemplo como sonda de espín.

El conjunto de 17 parámetros según la Tabla 2 describe el estado de las moléculas de sondas de espín ligadas en los puntos de enlace de la albúmina 4, que bajo la influencia de las características de enlace de los puntos de enlace reflejan el estado actual de conformación de la molécula de albúmina en forma de parámetros biofísicos.

A partir del conjunto de 17 parámetros averiguados se calculan los parámetros de distribución de sondas de espín y los parámetros de movilidad de las sondas de espín para los alícuotas individuales según la Tabla 3, con lo cual a partir de los parámetros de la concentración relativa de las sondas de espín del pocillo de sondas de espín C_{1} a C_{3} se calculan las características de distribución del número relativo de las moléculas de sondas de espín N, a N3 ligadas en los puntos de enlace por multiplicación de C1 a C3 con la relación de las concentraciones de ácido graso (FS) con albúmina de suero (SA).

Las características de movilidad de las moléculas de sondas de espín inmovilizadas en los puntos de enlace de albúmina se calculan según las fórmulas de la Tabla 3, con lo cual los factores de polaridad del micro-ambiente de los puntos de enlace 1 y 2 a partir de las constantes isotrópicas de la estructura de AF, A_{1}, o A_{2}. Los factores de alineación S_{1} y S_{2} se calculan a partir de las constantes isotrópicas de la estructura de AF, \deltaA_{1} o \deltaA_{2}, y de la respectiva anisotropía de la estructura de AF, A_{1} o A_{2}. Los tiempos de correlación T'2 y T''2 se calculan a partir de las amplitudes de las líneas de espectros W_{L}, W_{M} y W_{H}.

Al mismo tiempo se determinan los parámetros de enlace de la albúmina preferiblemente mediante el método matemático de la regresión de la relación del parámetro de enlace de las sondas de espín en las partes alícuotas en dependencia de la variación de las concentraciones de la sonda de espín y de las concentraciones del reactivo polar. Como características de enlace de la albúmina se calcula un conjunto de parámetros de enlace de las partes alícuotas consistentes en

\bullet K_{B} = constante de enlace,

\bullet N_{1}^{0} = capacidad del punto de enlace de ácido graso 1 y

\bullet C_{p} = concentración crítica del reactivo polar mediante regresión de la relación entre el número relativo de las moléculas de sondas de espín (N_{1}, N_{2}, N_{3}) ligadas en los puntos de enlace de ácido graso, para la concentración del reactivo polar (C) según la fórmula 1:

(I)N_{3}=\frac{I}{K_{B}}\cdot\frac{C_{P}\cdot N_{1}}{(C_{P}-C)\cdot(N_{1}^{0}-N_{1})}

Como otros parámetros de enlace de la albúmina se averiguan para las partes alícuotas individuales los parámetros

\bullet: R_{2} = Relación de las capacidades de los puntos de enlace de ácido graso 2 con 1 en el estado nativo de la albúmina,

\bullet: K_{2} = Coeficiente de flexibilidad del punto de enlace de ácido graso 2,

\bullet: L_{2} = Límite de estabilidad de conformación de la albúmina mediante regresión de la relación entre el número relativo de las moléculas de sondas de espín (N_{1}, N_{2}, N_{3}) ligadas en los puntos de enlace de ácido graso, para la concentración del reactivo polar (C) según la fórmula II:

(II)N_{2} = R_{2}\cdot N_{1}\cdot(1 + K_{2} \cdot C \cdot(L_{2} - N_{1}))

Las fórmulas (I) y (II) describen un modelo de flexibilidad de conformación del sistema de los puntos de enlace de ácido graso de la molécula de albúmina, que según la invención se elaboró sobre la base de amplios estudios experimentales.

Las variaciones de las características de transporte de la albúmina se calculan a partir del conjunto de parámetros de enlace calculados de la albúmina para los alícuotas en dependencia de las condiciones de prueba adoptadas para establecer los alícuotas según la Tabla 4. Las condiciones de prueba a adoptar permiten preferiblemente el cálculo de las características que determinan la carga de la albúmina con ácidos grasos (K_{L}, N_{L}^{0} - condición de prueba: C = 0, cociente ácido graso/albúmina = 0,5), el transporte de ácidos grasos (N_{T}^{0}, K_{T} - condiciones de prueba: C = 0, cociente ácido graso/albúmina = 1,5) y la descarga de los ácidos grasos (D_{u}, N_{u}^{0}-condiciones de prueba: C = 3,37 M, cociente ácido graso/albúmina = 1,5). El cálculo de estas características se realiza según las fórmulas siguientes:

Constante de enlace integral = K_{L} = K_{B}^{*} (N_{1}^{0} + N_{2}^{0})

Capacidad de carga efectiva = N_{L} = (N_{1}^{0} + N_{2}^{0})

Capacidad de transporte efectiva = N_{T}^{0} = (N_{1}^{0} + N_{2}^{0}),

Constante de enlace de transporte integral K_{T} = K_{B}^{*} (N_{1}^{0} + N_{2}^{0}),

Constante de disociación = D_{U} = 1/K_{B},

Capacidad de descarga efectiva = N_{U}^{0} = (N_{1}^{0} + N_{2}^{0})

Según la invención se puede adoptar el procedimiento ESR descrito para el diagnóstico y/o el control de variaciones fisiológicas o patológicas en el cuerpo humano o animal, p. ej. para la diagnosis precoz de enfermedades de cáncer. Para la diagnosis de enfermedades o variaciones fisiológicas entran en una función de discriminación para el análisis de detección de enfermedades por ESR sobre la base de la evaluación de por lo menos 3 partes alícuotas con diversas concentraciones de la sonda de espín y del reactivo polar en cada caso los determinados parámetros de enlace de la Tabla 2 en 5, para determinar los valores diagnósticos del "cut-off' para la respectiva enfermedad o variación patológica y compararlos con los valores del "cut-off' de las pruebas de referencia.

Así por ejemplo los parámetros D_{i} se averiguan según la Tabla 5 para la diagnosis de enfermedades de cáncer. Entonces es suficiente ya uno de los parámetros D_{1}-D_{6} para adoptar una diagnosis fiable. Para el aumento ulterior de la fiabilidad de las declaraciones puede ser ventajoso el determinar otros parámetros, particularmente D_{2}, D_{3}, D_{5} o D_{6}, o todos los seis parámetros D_{i}. Siendo uno de los parámetros D_{i} > 1, es perturbada la conformación de albúmina y se trata por ejemplo de una enfermedad oncológica. Siendo D_{i} < 1 el sujeto a examinar no padece ninguna enfermedad oncológica.

La precisión diagnóstica del método diagnóstico conforme a la invención se comprobó en 212 pacientes con enfermedades de cáncer y en 87 pacientes sin enfermedades de cáncer (véase Tabla 6).

La Tabla 6 justifica la alta precisión diagnóstica del procedimiento ESR conforme a la invención de más del 90%. Se pueden diagnosticar también enfermedades de cáncer en un estado muy precoz de la enfermedad. Así se logra incluso una precisión diagnóstica más alta en cada caso de aprox. el 95% con el cálculo de cada caso D_{2}, D_{3}, D_{5} o D_{6}.

El análisis ESR de pruebas de sangre permite por consiguiente la diagnosis de cáncer y otras enfermedades o variaciones fisiológicas en estados muy precoces de la enfermedad. La modificación de la función de transporte de la albúmina se basa en un bloqueo de los puntos de enlace de ácido graso específicos de la albúmina, que ya se presenta al principio de una enfermedad. La secuencia de este bloqueo del enlace son funciones de albúmina globales perturbadas y características de enlace para los objetivos de transporte normales, pero no para la alimentación de neoplasmas y por ello una de las condiciones para su crecimiento. El bloqueo en los puntos de enlace de ácido graso da lugar a una alimentación defectuosa considerable de células normales y también a alteraciones del sistema inmunológico. Los parámetros que se pueden determinar con métodos actuales de la diagnosis rutinaria clínico-química no registran estas variaciones; las primeras reacciones sobre el desarrollo de tumores sólo se pueden justificar mediante el método ESR según la invención.

El procedimiento según la invención se puede adoptar tanto como parámetro de control en proceso durante la producción de productos farmacéuticos que contienen albúmina como también para la determinación y el control de calidad de preparados que contienen albúmina, preferiblemente preparados de sangre o de plasma, poniendo en relación las variaciones de las características de transporte de la albúmina determinadas según la invención con las características de transporte del material inicial y/o de la albúmina de suero nativa de sujetos sanos a examinar. La aplicación del procedimiento conforme a la invención incluye también aplicaciones para la determinación de la efectividad de diferentes procedimientos para la limpieza de la albúmina de ligaduras ligadas a la molécula y el procedimiento como p. ej. hemosorción y hemodiálisis para la eliminación de endotoxinas, que en cada caso influyen en las características de enlace y las características de transporte de la albúmina, mediante la comparación del material básico y del material que contiene albúmina.

El método según la invención es eficiente con respecto a los costes y el tiempo. Éste permite una determinación automatizada de diferentes espectros ESR. El resultado de cada prueba de detección de enfermedades para 3 alícuotas se presenta en menos de 10 minutos, para el análisis ESR complicado de 8 - alícuotas se precisan 24 minutos.

También es objeto de la invención un equipo de prueba para la realización del procedimiento conforme a la invención, que incluye una placa de microtitulación con las diversas concentraciones necesarias en la sonda de espín y reactivo polar fijadas, estabilizadas y exactamente dosificadas. El equipo de prueba puede comprender también solamente las cantidades exactamente dosificadas en sonda de espín y reactivo polar, p. ej. probetas selladas, de manera que las cantidades previamente dosificadas sólo deben ser añadidas en el laboratorio a las partes alícuotas de la prueba a examinar.

El espectrómetro ESR utilizado para la realización del procedimiento conforme a la invención como analizador ESR automatizado cumple los requisitos de manejo fácil y fiable en el laboratorio clínico moderno, integrando el control automático de aparatos, el registro de señales y la evaluación de señales en la cooperación con un programa del ordenador para el análisis diagnóstico de los datos de medición.

El espectrómetro ESR 1 para la realización del procedimiento según la invención consiste correspondientemente a la representación en la Fig. 1 a partir de un electroimán compacto apantallado con sistema de estabilización según el método de Hall 2, un resonador de medición 3, que está acoplado con una unidad homodina UHF, una unidad de control de aparatos y una unidad de registro de señales 9 y un sistema de regulación termostática 7 de las pruebas de análisis.

La unidad de control de aparatos y de registro de señales 9 consiste en dos ordenadores de chip único (no representados), de los cuales uno sirve como controlador del sistema 10 para el diapasón automatizado y la estabilización, mientras que el segundo, como procesador de señales ESR 11, genera el algoritmo del escáner de los espectros y acumula, filtra digitalmente y registra los datos de señales.

Para el registro de los espectros ESR se introduce la prueba de análisis en el compartimento de medición del resonador 3, en el que se emiten las ondas UHF del oscilador principal de la unidad UHF 5. La señal ESR se mide mediante una unidad guía-ondas homodina como fuente de la radiación UHF, que se refleja a través del resonador de medición.

El campo magnético que se precisa para estimular la señal ESR puede producirse a través del electroimán 2. La fuente de tensión 6 del electroimán 2 se regula a través de un procesador de señales ESR 11.

La unidad de UHF 5 se regula por medio de la unidad de control de aparatos 10, que garantiza la sintonización precisa de la frecuencia del resonador de medición 3 con el oscilador principal de la unidad de UHF 5 y que controla la regulación termostática 7 de la prueba de análisis y acopla el espectrómetro ESR 1 con el ordenador personal 8 del operador, que se utiliza para el mando del espectrómetro y el análisis de datos.

A diferencia de espectrómetros ESR conocidos, que sólo incluyen un elemento de diapasón sea para la sintonización de la frecuencia del generador o para la sintonización de la frecuencia de resonancia, de modo que la sintonización se permite sólo dentro de una amplia gama de frecuencias 1 mediante diapasón del generador, mientras que la sintonización del resonador sólo regula una pequeña gama de frecuencias, garantizando para ello sin embargo una frecuencia estable durante la medición de diferentes pruebas en la medición, el espectrómetro está equipado con dos aparatos de mando acoplados, el primero para el mando de la frecuencia del generador así como el segundo para la frecuencia de resonancia. Esto es necesario para permitir por una parte una amplitud grande de la aplicación para el análisis de diferentes y varias pruebas y para facilitar simultáneamente la congruencia obligatoriamente necesaria y la posibilidad de reproducción de las características de los espectros ESR durante el análisis de pruebas alícuotas según el procedimiento inventivo.

Uno de los aparatos de mando está instalado sobre el oscilador principal de la unidad UHF 5 para la sintonización de frecuencia en el margen de 200-400, preferiblemente 300 MHz de la frecuencia central de 9,45 \pm 0,5 GHz. El segundo aparato de mando está instalado sobre el resonador de medición 3 para la sintonización de la frecuencia de resonancia dentro del margen de 10-50, preferiblemente 30 MHz mediante una variación del volumen de la cavidad del resonador con ayuda de un tirante accionado por motor.

El ajuste óptimo del oscilador principal de la unidad UHF 5 después del intercambio de las pruebas de análisis se realiza sólo cuando el alcance de la sintonización de frecuencia de resonancia es insuficiente. Esto ocurre en el caso de un cambio del tipo de las pruebas de análisis o en el caso de una modificación esencial del procedimiento de preparación de las pruebas.

Cuando entonces se examina un conjunto de pruebas del mismo tipo se registran sus espectros prácticamente con una frecuencia UHF. En este caso la línea espectral básica (de la actividad) es idéntica para todos los espectros registrados, lo cual es muy importante para la precisión del cálculo sucesivo de las características de los objetos examinados.

El sistema de regulación termostática 7 sirve para la estabilización de la temperatura de pruebas en el margen de 30ºC a 45ºC con alta precisión.

A diferencia de espectrómetros ESR conocidos, este sistema 7 incluye un subsistema adicional en forma de un lazo de regulación suplementario no representado. El lazo de regulación general del sistema de regulación termostática 7 consiste en una corriente de aire termorregulada, que según la necesidad sopla el aire precalentado o prerrefrigerado al compartimento de resonador para la regulación de la temperatura de la ampolla de pruebas.

El lazo de regulación adicional del sistema de regulación termostática 7 sirve para el aumento de precisión de la estabilización de temperatura de las pruebas por la minimización de los gradientes dentro del compartimento de resonador. Para este fin se mide el cuerpo del resonador 3 mediante auto-calentamiento del imán a través de su radiación térmica a la temperatura de pruebas concreta. La temperatura del cuerpo de resonador 3 se mide para este fin mediante un sensor de temperatura 4. Durante las interrupciones de los registros de los espectros se conecta la fuente de tensión 6 del electroimán 2 para valores elevados o reducidos.

La estructura y las medidas grandes de los electroimanes compactos 2 apantallados asegura adicionalmente el aislamiento térmico del resonador 3 contra influencias ambientales.

Para el análisis de los espectros ESR mediante simulación de espectros ESR según el procedimiento inventivo era necesario, contrariamente a los espectrómetros conocidos, desarrollar un procedimiento especial de la filtración digital para garantizar el registro de una forma exacta de espectros para el cálculo de los parámetros de espectros mediante simulación, puesto que a diferencia de procedimientos conocidos se tuvo que minimizar la correlación en la señal medida que aparece durante la filtración de ruidos por la señal y por las alteraciones de impulso o por supresión de ruidos, para garantizar la aplicación del espectrómetro para el procedimiento inventivo por la garantía de la alta precisión necesaria del registro de los espectros ESR, de la estabilidad y de la sensitividad delespectró-
metro.

Por ello el procesador de señales ESR genera un algoritmo de la detección de espectros mediante regulación de la fuente de tensión.

Las lecturas de la señal ESR de la unidad de UHF 5 se transforman mediante un convertidor análogo-digital con una frecuencia de 10 KHz y se acumulan en la memoria del procesador de señal 11.

Dado que el tiempo típico de escanear espectros es más de un minuto y el número de los puntos de espectros es inferior a 10.000, cada punto de espectros se desarrolla a partir de 60 o más lecturas de señales.

No obstante una determinada parte de las lecturas de espectros acumuladas generalmente es falsa, puesto que el espectrómetro ESR es un instrumento ultra-sensitivo que puede reaccionar a las perturbaciones electromagnéticas o vibraciones mecánicas.

Una alta sensitividad y estabilidad del espectrómetro ESR se logra, a diferencia de espectrómetros ESR conocidos, aplicando un algoritmo especial de cálculo de cada punto de los espectros, en el que se suman los N registros de la señal ESR S_{i}, acumulados para cada punto espectral, con los factores de ponderación especiales k_{i}. Estos factores se comportan de manera inversa proporcionalmente a los cuadrados del error de medición de los registros correspondientes.

El error \Delta_{i} de la lectura de señal i se calcula como la diferencia entre esta lectura S_{i} y la media aritmética de las otras lecturas (N - 1):

\Delta_{i}=\frac{1}{N-1}\left(\sum\limits^{N}_{p=1}S_{p}-S_{i}\right)-S_{i}

\kappa_{i}=\frac{1}{(\Delta_{i})^{2}}=(N-1)^{2}/\left(\sum\limits^{N}_{p=1}S_{p}-S_{i} . N\right)^{2}

La expresión resultante para el cálculo del punto de la señal es:

S=\left(\sum\limits^{N}_{i=1}\kappa_{i} . S_{i}\right)/\left(\sum\limits^{N}_{i=1}\kappa_{i}\right)

Cuando la lectura S_{i} contiene un ruido de impulso, el valor de error \Delta_{i} aumenta (p. ej. en el décuplo) y los factores de ponderación correspondientes \kappa_{i} se reducen muchas veces más (p. ej. cien veces). Por ello se excluyen las lecturas con ruidos de impulso del registro de informaciones sobre espectros del registro de informaciones en el espectrómetro ESR, a diferencia de los espectrómetros ESR conocidos. Este algoritmo se adopta para la acumulación de cada uno de los puntos medidos del espectro.

En el resultado se garantiza una alta sensitividad y estabilidad del espectro ESR registrado. Simultáneamente se impide el establecimiento de una correlación suplementaria entre puntos de espectros adyacentes, que en el procedimiento conocido de la filtración de señales ESR representa una de las causas principales de la reducción de la precisión de la determinación de los parámetros de espectros mediante simulación de espectros.

Los espectros ESR obtenidos se analizan con ayuda de un software ESR especial (MMS), de modo que el programa para el análisis de detección de enfermedades ESR genera un algoritmo de medición para la medición de 3 partes alícuotas, y realiza los resultados según la norma para la evaluación por medio de las funciones de discriminación según la Tabla 5.

Para la realización del análisis ESR complicado el programa genera un algoritmo de medición para hasta preferiblemente 8 partes alícuotas, cuyos resultados realiza con ayuda de la norma la determinación de las características de transporte de la albúmina aplicando el método matemático de regresión. El programa garantiza una realización automatizada sencilla de la medición de pruebas y la evaluación sin precisar ninguna formación particular o calificación del personal de medición.

A continuación se describe la invención en más detalle con ejemplos de formas de realización:

Ejemplo 1 Reconocimiento de pacientes con enfermedades oncológicas v de pacientes sanos mediante un análisis de detección de enfermedades ESR (análisis de 3 espectros)

El suero sanguíneo se obtiene mediante centrifugado de la sangre total y se dividen las pruebas del suero en tres partes alícuotas. Estas pruebas de suero de cada vez 50 \muL se proporcionan con 10, 12 y 14 \muL de una solución alcohólica de sondas de espín (concentración final de sondas de espín 8,33*10^{-4} mol/L, 1,55*10^{-3} mol/L y 2,41*10^{-3} mol/L). Las mezclas preparadas se incuban durante 10 min. a 37ºC bajo agitación continua.

Tras la incubación de las pruebas preparadas, éstas se transmiten en tres capilares. Los espectros ESR se registran para cada capilar en el resonador del espectrómetro ESR bajo una temperatura constante de 37 \pm 0,2ºC.

Cada espectro ESR registrado es una superposición del espectro específico de las moléculas de sondas de espín que se inmovilizan en diversos puntos de enlace, lo cual es específico para ácidos grasos de cadenas largas. Estos puntos de enlace se localizan en la albúmina del suero sanguíneo examinado.

Los tres espectros ESR registrados se cargan en un ordenador para calcular los parámetros del enlace de sondas de espín. Este análisis se efectúa por separado para cada punto de enlace con ayuda del método arriba descrito de la simulación de espectros ESR.

La Tabla 7 y la Fig. 2 incluyen ejemplos para la determinación de los parámetros de las sondas de espín (16-DS) en la albúmina de suero de algunos pacientes con y sin enfermedades de carcinoma:

I. Pacientes con enfermedades oncológicas

1. Paciente, código de estudio 506.

Diagnóstico clínico: carcinoma de esófago.

2. Paciente, código de estudio 507.

Diagnóstico clínico: carcinoma de estómago.

3. Paciente, código de estudio 528.

Diagnóstico clínico: carcinoma de mama.

4. Paciente, código de estudio 529.

Diagnóstico clínico: carcinoma pulmonar.

II. Pacientes sin enfermedades oncológicas

1. Paciente, código de estudio 110, 42 años.

Diagnóstico clínico: Mastopatía difundida. Ningún certificado histológico para cáncer.

2. Paciente, código de estudio 111, 23 años.

Diagnóstico clínico: Estado general sano.

3. Paciente, código de estudio 112, 22 años.

Diagnóstico clínico: Estado general sano.

4. Paciente, código de estudio 113, 40 años.

Diagnóstico clínico: Enfermedad cardíaca reumática.

La Tabla 7 y la Fig. 2 certifican que se distinguen los parámetros de enlace medidos de las sondas de espín para pacientes que padecen cáncer y pacientes sin índices de cáncer solo en caso de concentraciones más elevadas de alcohol del reactivo polar (pruebas de suero B y C). Estas diferencias muestran una modificación específica de la movilidad de la conformación de las moléculas de suero en los análisis de sangre de pacientes con enfermedades oncológicas.

Ejemplo 2 Análisis de espectros ESR complejo (análisis de 3 y 8 espectros) de la función de transporte de la albúmina en el suero nativo de una población sana (mujeres y hombres)

Las pruebas de suero se mezclaron con un respectivo volumen de 50 \muL con 3 o 8 concentraciones diferentes de una sonda de espín de ácido doxil-esteárico 16 (diluido en alcohol etílico), de manera que resultaron las concentraciones finales de sondas de espín de 0,83*10^{-3} mol/L hasta y 2,34*10^{-3} mol/L y concentraciones finales de alcohol etílico de 1,86 mol/L hasta y 3,8 mol/L. El valor pH de las pruebas de suero después de la mezcla con las sondas de espín era de 7,4 \pm 0,05. Las mezclas preparadas se incubaron durante 10 min. a 37ºC bajo agitación continua y tras la incubación se transmitieron en capilares de vidrio para el registro y análisis de espectros ESR. El registro de espectros se realizó en el espectrómetro ESR. Los espectros ESR fueron registrados para cada capilar en el resonador del espectrómetro ESR a una temperatura constante de 37 \pm 0,2ºC. Para todos los espectros ESR registrados (3 y 8 espectros) de cada prueba se calculan en el analizador integrado ESR los parámetros de enlace de sondas de espín con ayuda de un software de ordenador. Para la simulación de los espectros ESR obtenidos en experimentos de diversas sondas de espín se utiliza un modelo de espectro ESR (función según el método de Hamilton con anisotropía axial). Los parámetros de enlace de sondas de espín 5 en la albúmina de suero describen la simulación por la minimización de los cuadrados de las diferencias de espectros ESR simulados y obtenidos en experimentos. El análisis se realiza por separado para cada punto de enlace y se establecen los parámetros ESR mediante el programa del ordenador referente a la característica de la funcionalidad y conformación de la albúmina.

Los parámetros de la función de transporte de albúmina en el suero nativo de donantes sanos de sangre y de plasma vienen en la Tabla 8 como un ejemplo para funciones de transporte de albúmina intactas. Con ayuda del análisis complejo de espectros ESR no pudieron constatarse anomalías en las pruebas de suero de estos donantes sanos.

Ejemplo 3 Amplio análisis de espectros ESR (3 espectros y análisis 3-D) de la función de transporte de la albúmina en el suero nativo de pacientes con enfermedades del sistema hematológico (hemoblastosas de la leucosis linfática (CML), plasmocitoma

El suero sanguíneo se obtiene mediante centrifugado de la sangre total y las pruebas de suero se dividen en tres partes alícuotas. Estas respectivas pruebas de suero de 50 \muL se proporcionan con 10, 12 y 14 \muL de una solución alcohólica de sondas de espín (concentración final de sondas de espín 0,83*10^{-3} mol/L, 1,61*10^{-3} mol/L y 2,34*10^{-3} mol/L). Las mezclas preparadas se incuban durante 10 min. a 37º C bajo agitación continua.

Tras la incubación de las pruebas preparadas éstas se transmiten en tres capilares. Los espectros ESR se registran para cada capilar en el resonador del espectrómetro ESR bajo una temperatura constante de 37 \pm 0,2ºC 25. Los tres espectros ESR registrados se cargan en un ordenador, para calcular los parámetros de enlace de sondas de espín. Este análisis se efectúa por separado para cada punto de enlace con ayuda del método arriba descrito de la simulación de espectros ESR mediante el software del ordenador.

Enfermedades malignas del sistema hematológico se pueden captar mediante la detección de enfermedades ESR. En la Tabla 9 se representan los parámetros de discriminación de las pruebas de suero de 5 pacientes con CML y 3 pacientes con plasmocitoma. Las funciones de discriminación D1-D5 resultan una imagen típica para la presencia de una enfermedad de carcinoma, que también viene expresada en el análisis 3-D de los puntos de enlace de ácido graso.

Ejemplo 4 Amplio análisis de espectros ESR (análisis de 3 espectros y 3-D) de la función de transporte de la albúmina de pruebas de productos farmacéuticos que contienen albúmina para el control de la calidad

Las pruebas de los productos farmacéuticos que contienen albúmina (soluciones de albúmina, plasma fresco congelado) fueron mezcladas con un respectivo volumen de 50 \muL con 3 o 8 concentraciones diferentes de sonda de espín de ácido doxil-esteárico 16 (diluido en alcohol etílico), de manera que resultaron concentraciones finales de sondas de espín de 0,83*10^{-3} mol/L hasta y 2,34*10^{-3} mol/L y concentraciones finales de alcohol etílico de 1,86 mol/L hasta 3,8 mol/L. El valor del pH de las pruebas de suero tras la mezcla con las sondas de espín fue 7,4 + 0,05. La mezclas preparadas se incubaron durante 10 min. a 37ºC bajo agitación continua y tras la incubación se pasaron en capilares de vidrio al registro y análisis de espectros ESR. El registro de los espectros se realizó en el espectrómetro ESR. Los espectros ESR se registraron para cada capilar en el resonador del espectrómetro ESR a una temperatura constante de 37 + 0,2º C. Para todos los espectros ESR registrados (3 y 8 espectros) de cada parte alícuota se calculan en el analizador integrado ESR los parámetros del enlace de sondas de espín con ayuda del software de ordenador. Para la simulación de los espectros ESR de sondas de diferentes sondas de espín obtenidos en experimentos se usa un modelo de espectros ESR (función según el método de Hamilton con anisotropía axial). Los parámetros del enlace de sondas de espín en la albúmina de suero describen la simulación a través de la minimización de los cuadrados de las diferencias de espectros ESR simulados y obtenidos en experimentos. El análisis se realiza por separado para cada lugar de enlace y mediante el programa del ordenador se establecen los parámetros ESR referentes a la característica de la funcionalidad y conformación de la albúmina.

Durante la fabricación de productos farmacéuticos con contenidos de albúmina es apropiado el análisis de espectros ESR extendido (análisis de 3 espectros y análisis de 3-D) de la función de transporte de albúmina para el control de la calidad y el control durante el proceso. Las Tablas 10 y 11 muestran la aplicación de la tecnología ESR en seguimiento del proceso durante el análisis de 3 y 8 espectros para productos de plasma (Tabla 10) diversos obtenidos (plasma sanguíneo y plasma de aféresis) y productos de plasma tratados (filtrados = depletados de leucocitos) , así como para albúmina intacta y desnaturalizada (Tabla 11). Es evidente que se puede evaluar la capacidad de la función de transporte de la albúmina del producto acabado (p.ej. soluciones de albúmina, plasma fresco congelado para la transfusión de sangre), pero también se pueden analizar fases individuales del proceso de fabricación en cuanto a su influencia sobre las características de transporte de la albúmina cualitativa.

TABLA 1

1

La matriz de la distribución de concentraciones de las partes alícuotas (ejemplo rel. número de moléculas de sondas de espín en BS-2) está representada en la Fig. 3.

TABLA 2 16-DS - parámetros de sondas de espín que han sido detectados por espectros ESR y su correlación con una característica de la conformación y funcionalidad de la albúmina

2

TABLA 3

3

4

TABLA 5

5

* Los parámetros C1, C2 y C3 son los valores de la concentración relativa en sondas de espín, cada vez en los puntos de enlace 1, 2 y 3. El factor de polaridad P_{2} se calcula P_{2} = 1,47333 / A_{2} (mT, con lo cual A2 representa la constante HFS isotrópica del punto de enlace de los ácidos grasos 2. Los símbolos A, B y C caracterizan los números de las pruebas cada vez de una serie de las pruebas de suero medidas de una prueba de sangre como sigue:

A: - Prueba de suero con una concentración final en sondas de espín de 4,3*10^{-4} mol/l

B: - Prueba de suero con una concentración final en sondas de espín de 1,61 *10^{-3} mol/l

C: - Prueba de suero con una concentración final en sondas de espín de 2,34*10^{-3} mol/l

Los coeficientes de K_{1} a K_{6} dependen de las concentraciones concretas del reactivo utilizado y del resultado de la ampliación y la precisión de los datos con respecto a los parámetros de la albúmina de suero de un número a ser posible grande de pacientes de cáncer y sanos.

Los coeficientes de K_{1} a K_{6} pueden adoptar por ejemplo los valores K_{1} = 7,843 K_{2} = -1,517 K_{3} = 6,3 K_{4} = 1,881 K_{5} = 3,009 K_{6} = 1,002

TABLA 6

6

TABLA 7

7

* Para cada uno de los pacientes examinados se determinaron los parámetros representados mediante un análisis ESR de tres pruebas de suero, denominados con A, B, C. Las pruebas A, B o C, cada una, se mezclaron con 10 \mul, 12 \mul y 14 \mul de solución alcohólica de la sonda de espín (concentración final de las sondas de espín 8,33*10^{-4} mol/l 1,55*10^{-3} mol/I o 2,41*10^{-3} mol/l.

Los parámetros representados denominan:

C1 - Concentración relativa de sondas de espín en el punto de enlace 1;

C2 - Concentración relativa de sondas de espín en el punto de enlace 2;

C3 - Concentración relativa de sondas de espín en el punto de enlace 3.

TABLA 8

8

TABLA 9

9

10

TABLA 11

Parámetros ESR de soluciones de albúmina intacta o desnaturalizada
Parámetros de detección de enfermedades de la funcionalidad de la albúmina

11

En la Fig. 1 significan:

1 Espectrómetro ESR

2 Electroimán

3 Resonador de medición

4 Sensor de temperatura

5 Unidad UHF

6 Fuente de tensión

7 Sistema de regulación termostática

8 Ordenador personal

9 Unidad de control de aparatos y de registro de señales

10 Unidad de control de aparatos

11 Procesador de señales

La Fig. 2 muestra la modificación inducida de los parámetros de enlace de pruebas de espín en albúmina de suero de pacientes con y sin enfermedad oncológica como un resultado de la influencia del alcohol sobre la conformación de la molécula de albúmina. Las curvas representadas muestran la dependencia de los parámetros de pruebas de espín de la concentración de alcohol en la prueba de suero.

A) La prueba de suero contiene 50 \muL de suero, 10 \muL de la solución alcohólica de pruebas de espín con una concentración de 0,5*10^{-2} mol/L, concentración final de pruebas de espín 8,33*10^{-4} mol/L.

B) La prueba de suero contiene 50 \muL de suero, 12 \muL de la solución alcohólica de pruebas de espín con una concentración de 0,8*10^{-2} mol/L, concentración final de pruebas de espín 1,55*10^{-3} mol/L.

C) La prueba de suero contiene 50 \muL suero, 14 \muL de la solución alcohólica de pruebas de espín con una concentración de 1,1*10^{-2} mol/L, concentración final de pruebas de espín 2,41*10^{-3} mol/L [110] ... [529]: códigos de estudio de los pacientes.

La Fig. 3 muestra concentraciones preferidas de la sonda de espín (16 ácido doxil-esteárico) y del reactivo polar (alcohol etílico).

Claims

1. Procedimiento para el examen espectroscópico de ESR de una prueba con contenido de albúmina bajo el uso de una sonda de espín, caracterizado por el hecho de que se determinan las variaciones de transporte de la albúmina en una prueba con contenido de albúmina, de manera que en la prueba a examinar se inducen cambios intencionados de la conformación de la molécula de albúmina, agregando a las partes alícuotas de la prueba por lo menos tres concentraciones diferentes de una sonda de espín que se une a la albúmina y adicionalmente por lo menos tres concentraciones diferentes de un reactivo polar, por medio de los espectros ESR de las partes alícuotas proporcionadas con la sonda de espín y el reactivo polar se determina el grado de la variación de los parámetros de enlace de la sonda de espín en puntos de enlace específicos de la albúmina dependiendo de la concentración de la sonda de espín y la concentración en reactivo polar mediante simulación por ordenador de los espectros ESR, y se calculan las variaciones de transporte de la albúmina a partir de las variaciones de los valores de los parámetros de enlace de la sonda de espín para las condiciones de conformación de la albúmina inducidas por las diversas concentraciones en la sonda de espín y el reactivo polar, por lo cual las concentraciones en la sonda de espín a añadir se seleccionan de tal manera que el valor medio de la relación de la concentración de la sonda de espín con la concentración de la albúmina es de 2,5 \pm 0,5 y, partiendo de este valor medio se seleccionan por lo menos dos concentraciones adicionales, cuya desviación de este valor medio no es inferior a 1,0 y las concentraciones en reactivo polar se seleccionan entonces de tal manera que el valor medio de la concentración final del reactivo polar es de (0,6 \pm 0,25) X cp, con lo cual Cp representa la concentración crítica del reactivo polar, cuyo excedente da lugar a la desnaturalización de la albúmina y, partiendo de este valor medio, se seleccionan por lo menos dos concentraciones adicionales en reactivo polar, cuya desviación de este valor medio supone por lo menos el 15%, con lo cual las concentraciones en sonda de espín y reactivo polar se añaden a las respectivas partes alícuotas de la prueba, dentro de los alcances de concentración arriba definidos de tal manera que por lo menos en una parte alícuota está presente una concentración reducida de sondas y una concentración reducida en reactivo polar, en por lo menos una parte alícuota una concentración media en reactivo polar y una concentración media en sonda de espín y en por lo menos una parte alícuota una concentración alta en sondas y una concentración alta en reactivo polar.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que adicionalmente se seleccionan aún otras combinaciones de concentración en sonda de espín y reactivo polar, de tal manera que en por lo menos una parte alícuota está presente una concentración alta en sondas y una concentración reducida en reactivo polar.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que adicionalmente se seleccionan aún otras combinaciones de concentración en sonda de espín y reactivo polar, de tal manera que en por lo menos una parte alícuota está presente una concentración reducida en sondas y una concentración alta en reactivo polar.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que como prueba con contenido de albúmina se utiliza una prueba de sangre o una prueba de productos farmacéuticos.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que como ácidos grasos marcados con espín, en función de sonda de espín, se utilizan especialmente preferiblemente ácidos doxil-esteáricos.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que en función de reactivo polar se utiliza alcohol o DMSO (dimetilsulfuróxido), preferiblemente alcohol etílico.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que los parámetros de enlace de sondas de espín se determinan por las partes alícuotas de un análisis de sangre bajo temperaturas diferentes de 15 a 45ºC y/o con valores diferentes de pH de 7,5 a 3,5.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que los parámetros de enlace de la albúmina se determinan mediante el método matemático de la regresión de la relación de los parámetros de enlace de las sondas de espín en las partes alícuotas dependiendo de la variación de las concentraciones de la sonda de espín y las concentraciones del reactivo polar y a partir de estos parámetros de enlace se calcula la variación del transporte de albúmina.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que está adaptado para el diagnóstico y/o control de variaciones fisiológicas o patológicas en el cuerpo humano o animal, determinando parámetros específicos a partir de los parámetrosde enlace de la albúmina averiguados según la modificación fisiológica o patológica a diagnosticar, preferiblemente las relaciones de las concentraciones relativas en sondas de espín C1, C2, C3 en los puntos de enlace de ácidos grasos entre las partes alícuotas, y comparando las mismas con los valores de cut-off de pruebas de referencia averiguados mediante la función de discriminación.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que está adaptado para el diagnóstico y/o control de enfermedades oncológicas.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que se captan uno o varios parámetros D_{i} según la Tabla 5, que son objeto de esta reivindicación, con lo cual está presente una enfermedad oncológica cuando uno de los parámetros es D_{i} > 1.

12. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que está adaptado para la determinación y el control de la calidad de preparados con contenidos de albúmina, preferiblemente preparados de sangre o de plasma, poniendo las variaciones determinadas según la reivindicación 1 de las características de transporte de la albúmina en relación con las características de transporte del material inicial y/o de la albúmina de suero nativa de sujetos a examinar sanos.

13. Equipo de prueba que es apropiado para la forma de realización del procedimiento según las reivindicaciones 1 a 12 y comprende en contenedores de pruebas las concentraciones exactamente dosificadas en sonda de espín y reactivo polar, por lo cual por lo menos tres contenedores de pruebas, cada uno con diferentes concentraciones entre sí en sondas de espín y adicionalmente con diferentes concentraciones entre sí en reactivo polar, son componentes de los equipos de prueba, y con lo cual las concentraciones en sonda de espín y reactivo polar que se agregan a las respectivas partes alícuotas de la prueba se han seleccionado de tal manera que por lo menos para una parte alícuota existe una reducida concentración de sondas y una reducida concentración en reactivo polar, por lo menos para una parte alícuota una concentración media en reactivo polar y una concentración media en sonda de espín y para por lo menos una parte alícuota una concentración alta en sondas y una concentración alta en reactivo polar.

14. Equipo de prueba según la reivindicación 13, caracterizado por el hecho de que comprende una placa de microtitulación, que en por lo menos tres cavidades comprende diferentes concentraciones en sonda de espín y reactivo polar fijadas, estabilizadas y exactamente dosificadas.

15. Procedimiento para el examen espectroscópico de ESR según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que para la forma de realización del procedimiento se utiliza un espectrómetro ESR consistente en un electroimán compacto apantallado con sistema de estabilización según el método de Hall (2), un resonador de medición (3) que está acoplado con una unidad UHF (5) con oscilador principal regulado para la sintonización de frecuencia dentro de un primer margen de 200 a 400 MHz de la frecuencia central de 9,45 \pm 0,50 Hz, una unidad de mando de aparatos y una unidad de registro de señales (9) y un sistema para la regulación del termostato (7) de las pruebas de análisis, con lo cual para la regulación del resonador de medición (3) con respecto a la compensación de la diferencia de la frecuencia en el registro de espectros de las partes alícuotas de una prueba de análisis el resonador de medición (3) está acoplado con otro aparato de control para la sintonización de la frecuencia de resonancia dentro de un segundo margen de 10 a 50 MHz mediante una variación del volumen de la cavidad del resonador.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que el sistema de regulación termostática (7) del espectrómetro ESR empleado contiene un lazo de regulación adicional para el aumento de la precisión de la estabilización de la temperatura de pruebas por la minimización de los gradientes dentro del compartimento del resonador mediante auto-calentamiento electromagnético, que a través de la regulación de la alimentación de corriente al electroimán controla su auto-calentamiento durante las interrupciones de la exploración de espectros, cuya radiación de calor calienta el resonador.

17. Procedimiento según las reivindicaciones 15 y 16, caracterizado por el hecho de que en el espectrómetro ESR empleado está unido el cuerpo del resonador (3) con un sensor de temperatura (4) para la regulación del auto-calentamiento del electroimán, que realiza el calentamiento del resonador hasta alcanzar la temperatura de pruebas.