ES2223478T3 - Sp-a recombinante para el tratamiento o la prevencion de infecciones e inflamaciones pulmonares. - Google Patents

Abstract

Uso de un componente activo farmacéuticamente aceptable, que es sustancialmente igual a una proteína A recombinante de agentes tensioactivos (rSP-A), para la producción de un medicamento exento de lípidos, que comprende un vehículo apropiado, destinado a prevenir o tratar una infección o inflamación pulmonar.

Description

SP-A recombinante para el tratamiento o la prevención de infecciones e inflamaciones pulmonares.

Campo técnico

El presente invento se refiere al nuevo uso de una proteína A recombinante de agentes tensioactivos para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de infecciones e inflamaciones pulmonares.

Técnica anterior

Un agente tensioactivo pulmonar desempeña un cometido importante en el mantenimiento de la integridad estructural de los alvéolos por reducción de la tensión superficial. El agente tensioactivo consta, en la mayor parte de los casos, de una compleja mezcla de fosfolípidos y de proteínas genéticamente distintas, a las que se hace referencia como proteínas A, B, C y D de agentes tensioactivos (también designadas como SP-A, SP-B, SP-C y SP-D). Este agente es sintetizado por neumocitos alveolares del tipo 11 y es segregado en forma de cuerpos laminares apretadamente empaquetados dentro de los alvéolos (King, R. J.: Pulmonary Surfactant, J. Appl. Physiol. 1982, 51, 1-8).

Se ha establecido la hipótesis de que una SP-A desempeña un cierto cometido en la protección de los pulmones con respecto de infecciones bacterianas, víricas y fúngicas (Thiel, S., y Reid K.: Structures and functions associated with the group of mammalian lectins containing collagen-like sequences [Estructuras y funciones asociadas con el grupo de lectinas de mamíferos, que contienen secuencias similares a las del colágeno], FEBS Lett. 1989, 250, 78). Además, se ha mostrado in vitro que la SP-A se fija a diversos microorganismos, actúa como una opsonina, intensifica la aniquilación de los microorganismos por macrófagos, regula en sentido decreciente a las citocinas pro-inflamatorias, tales como el TNF-\alpha inducido por los LPS (lipopolisacáridos) o patógenos microbianos (recopilado en: Molecular Basis of Disease, Pulmonary surfactant, [Base molecular de una enfermedad, agente tensioactivo pulmonar], Coordinador de edición: L.M.G. van Golde, Biochimica et Biophysica Acta, 1998, 1408, 77-364).

Recientemente, se mostró que los ratones que carecen de SP-A son susceptibles a una infección causada por estreptococos del grupo B (LeVine, A. M. y colaboradores: Surfactant protein A-deficient mice are susceptible to group B streptococcal infection [Los ratones deficientes en cuanto a proteína A de agentes tensioactivos son susceptibles a una infección causada por estreptococos del grupo B]; The Journal of Immunology 1997, 4336-4340) y que una SP-A exógena de proteinosis intensificaba el aclaramiento de bacterias en ratones deficientes en cuanto a SP-A (LeVine A. M. y colaboradores: Surfactant protein-A (SP-A) binds Group B Streptococcus (GBS), enhancing phagocytosis and clearance from lungs of SP-A deficient mice [Una proteína A de agentes tensioactivos (SP-A) fija a estreptococos del grupo B (GBS), intensificando la fagocitosis y el aclaramiento a partir de los pulmones de ratones deficientes en cuanto a SP-A; Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, volumen 157, A 865). Además, se mostró que babuinos con una displasia broncopulmonar (BPD) y una infección superpuesta tienen presentes unos niveles disminuidos de SP-A en los pulmones (King, R. J. y colaboradores: Surfactant protein-A deficiency in a primate model of pulmonary dysplasia [Deficiencia en cuanto a proteína A de agentes tensioactivos en un modelo de primates con displasia pulmonar], Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1995, 151(6), 1989-97 y Coalson, J. J.: Pathophysiologic, morphometric, and biochemical studies of the premature baboon with bronchopulmonary dysplasia [Estudios patofisiológicos, morfométricos y bioquímicos de un babuino prematuro con displasia broncopulmonar], Am. Rev. Respir. Dis. 1992, 145, 872-81). Además, se mostró que una SP-A es disminuida en un cierto número de enfermedades tales como neumonía, asma, bronquiolitis, trasplantes de pulmones, fibrosis cística, ARDS, fumadores, etc., tal como se recopila en la cita de M. Griese, Pulmonary surfactant in health and human lung diseases: state of the art [Un agente tensioactivo pulmonar en seres humanos sanos y enfermedades pulmonares humanos, estado de la técnica]. Eur. Respir. J. 1999, 13, 1455-1476. Se mostró también que una SP-A inhibe la liberación de histamina inducida por alergenos, así como la proliferación de linfocitos en células aisladas a partir de enfermos asmáticos expuestos a alergenos. (Wang, J. Y. y colaboradores, Inhibitory effect of pulmonary surfactant proteins A and D on allergen-induced lymphocite proliferation and histamine release in children with asthma [El efecto inhibidor de las proteínas A y D de agentes tensioactivos pulmonares sobre la proliferación de linfocitos y la liberación de histamina, que se han inducido por alergenos en niños con asma]. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1998, 158, 510-518: Mandan, T. y colaboradores, Lung surfactant proteins A and D can inhibit specific IgE binding to the allergenes of Aspergillus fumigatus and block allergen-induced histamine release from human basophils [Las proteínas A y D de agentes tensioactivos pulmonares pueden inhibir la fijación específica de IgE a los alergenos de Aspergillus fumigatus, y bloquear la liberación de histamina inducida por alergenos a partir de basófilos humanos]. Clin. Exp. Immunol., 1997, 110, 241-349).

El documento de patente de los EE.UU. US-A-5.840.527 enseña el uso de una proteína A recombinante de agentes tensioactivos en combinación con lípidos para el tratamiento del síndrome de angustia respiratoria y de enfermedades respiratorias relacionadas con él, tales como neumonía y bronquitis.

J. Clin. Invest. 94, 311-319 (1994) describe una protección in vitro contra los virus de influenza A mediante una proteína D de agentes tensioactivos (SP-D) a solas o en conjunción con una proteína A de agentes tensioactivos, ambas de las cuales se habían preparado a partir de fuentes naturales.

Sumario del invento

El invento en cuestión tiene varios aspectos distintos. Un aspecto lo constituye el uso de un componente que es al menos sustancialmente igual a una proteína A recombinante de agentes tensioactivos (rSP-A) para tratar o prevenir una infección o inflamación pulmonar. Otro aspecto es una composición medicamentosa exenta de lípidos destinada a tratar o prevenir una infección o inflamación pulmonar; y que comprende un componente activo que es por lo menos sustancialmente igual a una proteína A recombinante de agentes tensioactivos. Un aspecto adicional lo constituye un método para formular dicha composición medicamentosa. Todavía otro aspecto adicional comprende el uso concurrente de una proteína D de agentes tensioactivos (SP-D) con un componente activo, que es por lo menos sustancialmente igual a una proteína A recombinante de agentes tensioactivos, en el tratamiento o la prevención de infecciones e inflamaciones pulmonares, en la formulación de una composición medicamentosa y en la resultante composición medicamentosa propiamente dicha. Un aspecto adicional del invento es un artículo de manufactura, que comprende un material para envasar y una composición exenta de lípidos que comprende una rSP-A o un compuesto que es sustancialmente igual a la rSP-A (en un recipiente) dentro del material para envasar, y el material para envasar incluye una etiqueta o instrucciones que indican la utilidad para el tratamiento o la prevención de una inflamación o una infección microbiana.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra gráficamente que el aclaramiento de los GBS en un ratón (-/-) en SP-A se había aumentado significativamente a las 6 y 24 horas cuando se administraban los GBS conjuntamente con 150 \mug de una rSP-A.

La Figura 2 ilustra gráficamente que el aclaramiento de los GBS por ratones (-/-) en SP-A es dependiente de la dosis y es aumentado por una cantidad aumentada de una rSP-A.

La Figura 3 ilustra gráficamente que el aclaramiento de GBS en ratones de tipo salvaje es aumentado significativamente a las 6 y 24 horas cuando los GBS se administran conjuntamente con 150 \mug de una rSP-A.

La Figura 4 ilustra gráficamente que ciertos animales de tipo salvaje, infectados con GBS y tratados con una rSP-A por vía intratraqueal 6 horas después de la infección, tienen un aclaramiento aumentado de los GBS a las 24 horas.

La Figura 5 ilustra gráficamente que una rSP-A exógena reduce el contenido de TNF-\alpha en materiales homogeneizados pulmonares procedentes de ratones (-/-) en SP-A, estimulados con GBS hasta cerca del nivel observado en ratones (+/+) en SP-A.

Detalles

Sorprendentemente, se ha encontrado que una proteína A recombinante asociada con agentes tensioactivos (rSP-A) se puede usar en el tratamiento o la prevención de infecciones e inflamaciones pulmonares y es equivalente o superior al uso de una proteína A asociada con agentes tensioactivos (SP-A), obtenida a partir de fuentes naturales, por ejemplo la que se aísla a partir de un fluido de lavado procedente de individuos sanos o de pacientes de proteinosis. Esto se debe considerar como particularmente sorprendente, puesto que una SP-A, aislada a partir de un lavatorio de pulmones humanos, consta de una población homogénea de una estructura hexamérica similar a un ramo de flores, de la que cada unidad consta de tres cadenas polipeptídicas de SP-A (\alpha1), análogas a la que se han descrito para el factor de complemento C1q. Se cree que la estructura hexamérica plenamente ensamblada es esencial para una molécula funcional con respecto a la estimulación de mecanismos de defensa antimicrobianos o de una actividad anti-inflamatoria. En contraste con la SP-A obtenida por medios naturales, una proteína A asociada con agentes tensioactivos, producida por técnicas recombinantes, consta de una diversidad de diferentes estructuras oligoméricas que fluctúan desde una única cadena polipeptídica (\alpha1) hasta la forma octadecamérica plenamente ensamblada (\gamma6) (Voss, T., y colaboradores: Macromolecular organization of natural and recombinant lung surfactant protein SP 28-36 [Organización macromolecular de proteínas SP 28-36 naturales y recombinantes de agentes tensioactivos pulmonares]; J. Mol. Biol. 1988, 201, 219-227; Voss y colaboradores: Structural comparison of recombinant pulmonary surfactant protein SP-A derived from two human coding sequences: Implications for the chain composition of natural human SP-A [Comparación estructural de una proteína recombinante de agente tensioactivo pulmonar SP-A, derivada de dos secuencias codificadoras humanas: Implicaciones para la composición de cadenas de una SP-A humana natural], Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1991, 4, 88-94).

Adicionalmente, se mostró que una SP-A, obtenida de modo natural, está glicosilada. Sin embargo, aunque una SP-A producida por vía recombinante, dependiendo del sistema usado para la expresión (células de mamíferos, insectos o levaduras), muestra diferentes modelos de glicosilación, y muestra efectos anti-microbianos o anti-inflamatorios superiores o equivalentes a los de la SP-A natural.

Como se usa en el presente contexto, el término microbios se refiere a bacterias, virus u hongos.

Como se usa en el presente contexto, la expresión proteína A recombinante asociada con agentes tensioactivos (en lo sucesivo también citada como rSP-A) se refiere a una proteína A asociada con agentes tensioactivos de vertebrados, preferiblemente de mamíferos, que se ha producido por técnicas recombinantes. Secuencias de aminoácidos y secuencias de ADN que codifican una proteína A asociada con agentes tensioactivos de mamíferos, se describen, por ejemplo, en los documentos de solicitudes de patentes internacionales WO 86/03408, WO 88/05820 y en el documento de patente de los EE.UU. USP 4.882.422. La expresión proteína A recombinante asociada con agentes tensioactivos se refiere además a derivados de una proteína A asociada con agentes tensioactivos de un vertebrado, preferiblemente de un mamífero, producida por técnicas recombinantes, que difiere de una proteína A natural, asociada con agentes tensioactivos de un mamífero o de otro vertebrado, por una adición, supresión o sustitución de aminoácidos, siempre y cuando que las proteínas retengan una actividad de aclaramiento de microbios o una actividad anti-inflamatoria. Dicha actividad de una proteína A recombinante asociada con agentes tensioactivos se puede determinar, por ejemplo, en un ensayo de acuerdo con el que se describe seguidamente para bacterias estreptococos del grupo B. En una realización preferida, el término rSP-A se refiere a una proteína A recombinante asociada con agentes tensioactivos humanos, producida por métodos recombinantes, y que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN que está contenida en clones de ADNc (ADN cromosomal), pHS10-5, pHS10-4, PSAP-1A, PSAP-6A, y un clon genómico pHS-15 o una variante alélica del mismo. Se han identificado en el genoma humano dos genes (designados como A1 y A2) que codifican una SP-A (White, R. T. y colaboradores; Nature 1985, 317, 361-363; Katyal, S. L. y colaboradores: Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1992, 6:446-452). El clon genómico pHS-15, que codifica una SP-A humana, ha sido descrito en el documento WO 86/03408, y ciertos clones, que contienen secuencias de ADNc que codifican una SP-A, han sido descritos en el documento WO 88/05820 para pHS10-5 y pHS10-4, y por Floros y colaboradores, The Journal of Biological Chemistry, 1986, 261, 9029-33, así como en el documento USP 4.882.422 para PSAP-1A y PSAP-6A). Una SP-A recombinante se puede obtener de acuerdo con procedimientos conocidos en la especialidad. Ciertos métodos para clonar y producir una rSP-A se describen por ejemplo en los documentos WO 86/03408, WO 88/05820, USP 4.659.805, USP 4.912.038, Voss, T., y colaboradores: Macromolecular organization of natural and recombinant lung surfactant protein SP 28-36 [Organización macromolecular de proteínas naturales y recombinantes de agentes tensioactivos pulmonares SP 28-36]; J. Mol. Biol. 1988, 201, 219-227, y Voss y colaboradores: Structural comparison of recombinant pulmonary surfactant protein SP-A derived from two human coding sequences: Implications for the chain composition of natural human SP-A [Comparación estructural de una proteína recombinante de agentes tensioactivos pulmonares SP-A derivada de dos secuencias codificadoras humanas: implicaciones para la composición de la cadena de una SP-A humana natural], Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1991, 4, 88-94).

En el texto y en los dibujos, n se refiere al número de animales (ratones) y wt se refiere a "wild-type" [es decir a un "tipo salvaje"]. Como se usa en las reivindicaciones, la expresión "sustancialmente igual a" incluye: a) derivados de la proteína A asociada con agentes tensioactivos, producida por técnicas recombinantes, pero que difiere de una proteína A natural asociada con agentes tensioactivos, por una adición, supresión o sustitución de uno o más aminoácidos, b) modificaciones de una SP-A que difieren en el tipo y/o en el grado de glicosilación, y c) proteínas de fusión recombinantes que constan de la SP-A completa o de porciones de la SP-A, fusionada(s) con apropiadas proteínas o partes de las mismas, que tienen actividades anti-infecciosas o anti-inflamatorias, siempre y cuando que las proteínas A asociadas con agentes tensioactivos retengan una actividad de aclaramiento de microbios o una actividad anti-inflamatoria, tal como se determina por medio de un ensayo.

Ejemplos que se pueden mencionar en conexión con formas suprimidas, truncadas o mutadas de una rSP-A, son la variante SP-A-glob, en la que se habían suprimido los aminoácidos del dominio colagenoso (aa 17-80), u otras formas, tal como se describieron en la cita de Spissinger y colaboradores, Assembly of the surfactant protein SP-A [Ensamble de la proteína de agentes tensioactivos SP-A]. Eur. J. Biochem. 1991, 199, 65-71.

Proteínas ilustrativas que tienen actividades anti-infecciosas o anti- inflamatorias, que se pueden mencionar en conexión con proteínas de fusión recombinantes, son proteínas tales como defensinas, lisozimas, citocinas, quimiocinas e inmunoglobulinas. Estas proteínas se pueden fusionar con el extremo terminal ya sea de C o de N de una SP-A.

En una realización del invento, una SP-A recombinante, obtenible por expresión de una secuencia de ADN que codifica una SP-A en un sistema de expresión eucariótico apropiado, se usa para la producción de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de infecciones e inflamaciones pulmonares. Apropiados sistemas de expresión son, por ejemplo, células de CHO (ovario de hámster chino) que usan apropiados vectores de expresión. Vectores de expresión apropiados son, por ejemplo: el pMT (E) Apo que contiene el intensificador de SV40 y el promotor de metalotioneína humano inducible (Fritz y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 4114-4118), pRc/CMV para la expresión constitutiva del gen que interesa (Invitrogen, Leek, Holanda), o cualquier otro vector de expresión que sea útil para células de mamífero, y que contenga secuencias de intrones homólogos (es decir, secuencias genómicas auténticas procedentes del gen que interesa) o secuencias de intrones heterólogos. En este caso, se prefiere además usar una secuencia genómica parcial o completa que codifica una SP-A, por ejemplo una secuencia genómica como la que se describe en el documento WO 86/03408 para el gen A1, que proporciona una mayor tasa de expresión y subsiguientemente a estructuras de mayor orden de SP-A (Voss y colaboradores: Structural comparison of recombinant pulmonary surfactant protein SP-A derived from two human coding sequences: Implications for the chain composition of natural human SP-A [Comparación estructural de una proteína recombinante de agentes tensioactivos pulmonares SP-A, derivada de dos secuencias codificadoras humanas: Implicaciones para la composición de cadenas de una SP-A humana natural], Am. J. Respir.
Cell. Mol. Biol., 1991, 4, 88-94). Este enfoque se podría aplicar también al gen A2 descrito por Katyal, S. L. y colaboradores (Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1992, 6: 446-452). De manera preferente, la expresión de las secuencias genómicas, que codifican una SP-A en un apropiado sistema de expresión, se lleva a cabo tal como se ha descrito por Voss y colaboradores (Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1991, 4, 88-94).

Además, para expresar las secuencias de ADNc que codifican una SP-A (A1/A2) se prefiere usar o bien células de insectos usando el sistema de expresión en Baculovirus (Mc-Cormack, F. y colaboradores, J. Biol. Chem. 1994, 269: 5833-5841) o una levadura, tal como Pichia pastoris, en ambos casos con o sin expresión concomitante de la prolil 4-hidroxilasa humana, que estabiliza a las hélices de un colágeno por hidroxilación de residuos de prolina en el dominio colagenoso como se demuestra para la expresión de colágeno (Lamberg, Arja y colaboradores, J. Biol. Chem. 1996, 271: 11988-11995: Vuorela, A. y colaboradores, EMBO J., 1997, 16: 6702-6712). Por ejemplo, una rSP-A se puede producir por clonación de los respectivos ADNc's dentro del sitio para EcoRI del vector de expresión en Baculovirus pVL1392, por subsiguiente generación de virus recombinantes y por expresión en células SF21 usando los procedimientos clásicos. Una rSP-A se puede producir también en una levadura (por ejemplo Pichia pastoris) después de una clonación de los respectivos ADNc's en vectores de expresión en levaduras, tales como pPlCZ A (Invitrogen, Leek, Holanda) para la expresión en Pichia pastoris.

En otra realización del invento, una SP-A recombinante, obtenible por expresión de una secuencia de ADN que codifica una SP-A en un sistema de expresión procariótico apropiado, se usa para la producción de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de infecciones e inflamaciones pulmonares.

En una realización adicional del invento, una rSP-A no glicosilada se usa para la producción de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de infecciones e inflamaciones pulmonares.

Todavía otra realización adicional del invento es un artículo de manufactura que comprende un material para envasar y un agente farmacéutico exento de lípidos dispuesto dentro del material para envasar, en que el agente farmacéutico es por lo menos sustancialmente igual a un rSP-A, y en que el material para envasar comprende una etiqueta o un folleto dentro del envase, que indica que el agente farmacéutico es útil para prevenir o tratar una infección microbiana pulmonar o una inflamación pulmonar. El material para envasar, la etiqueta y el folleto dentro del envase son por lo demás paralelos, o se asemejan, a lo que se considera generalmente como un material clásico para envasar, etiquetas y folletos dentro de los envases para productos farmacéuticos que tienen utilidades relacionadas afines.

Farmacología Métodos Administración de animales

El locus del gen de SP-A murino fue establecido como diana por recombinación homóloga, tal como se ha descrito con anterioridad (Korfhagen, T.R. y colaboradores: "Altered surfactant function and structure in SP-A gene targeted mice" [Función y estructura de agentes tensioactivos alterados en ratones dirigidos hacia el gen de SP-A]: PNAS, 1996, 93, 9594-9599). Los pulmones de ratones (-/-) en SP-A no contienen ningún ARNm (mensajero) ni ninguna proteína de SP-A detectable. Para limitar la variabilidad relacionada con diferencias entre cepas, se estudiaron ratones (+/+) de tipo salvaje 129 J y ratones (-/-) en SP-A de la misma raza. Los animales fueron alojados y estudiados bajo protocolos aprobados por el IACUC en la instalación de cría de animales de la "Children's Hospital Research Foundation" [Fundación de Investigación del Hospital Infantil] de Cincinati. Se usaron ratones machos y hembras con un peso de aproximadamente 20 a 25 gramos (con una edad de 35 a 42 días). (LeVine, A.M. y colaboradores: Surfactant protein A-deficient mice are susceptible to group B streptococcal infection [Los ratones deficientes en cuanto a proteína A de agentes tensioactivos son susceptibles a una infección por estreptococos del grupo B]; The Journal of Immunology, 1997, 158, 4336-4340).

SP-A recombinante

Se produjo una SP-A recombinante tal como se describió por Voss y colaboradores (Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1991, 4, 88-94).

Preparación de las bacterias

Un cultivo progenitor original de estreptococos del grupo B (GBS) se obtuvo a partir de un material aislado clínico procedente de un recién nacido con una infección sistémica. Las bacterias fueron suspendidas en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril, que contenía un 20% de glicerol y que se había congelado en partes alícuotas a -70ºC. Las bacterias procedentes de la misma pasada se usaron para reducir al mínimo las variaciones en virulencia, relacionadas con las condiciones de cultivo. Antes de cada experimento, una parte alícuota se descongeló y sembró sobre una placa de agar de sangre de cordero desfibrinada con soja tríptica al 5% y luego se inoculó dentro de 4 ml de un caldo de Todd-Hewitt (Difco Laboratories, Detroit, MI) y se hizo crecer durante 14 a 16 horas a 37ºC con agitación continua. El caldo se centrifugó, y las bacterias se lavaron en PBS a un pH de 7,2 y se volvieron a suspender en 4 ml del tampón. Con el fin de facilitar los estudios, se generó una curva de crecimiento, de tal manera que la concentración de bacterias se pudiera determinar espectrofotométricamente, lo cual fue confirmado por un cultivo cuantitativo del inóculo intratraqueal.

Inoculación intratraqueal

La administración de GBS dentro el tracto respiratorio de los ratones se realizó por inoculación intratraqueal de 10^{4} ó 10^{6} cfu (unidades de formación de colonias) diluidas en una solución salina normal estéril (con NaCl al 0,9%). Para suministrar GBS en la presencia de una rSP-A, los GBS se diluyeron en NaCl al 0,9% con 1 mM de Ca^{2+} y cantidades apropiadas de la rSP-A en un baño de agua a 37ºC durante 30 minutos. Las bacterias se suministraron por inoculación intratraqueal, tal como se ha descrito precedentemente (LeVine, A.M. y colaboradores: Surfactant protein A-deficient mice are susceptible to group B streptococcal infection [Los ratones deficientes en cuanto a proteína A de agentes tensioactivos son susceptibles a una infección por estreptococos del grupo B]; The Journal of Immunology, 1997, 4336-4340).

Aclaramiento de bacterias

Cultivos cuantitativos de materiales homogeneizados de pulmones se realizaron a las 6 y 24 horas después de una inoculación de los animales con bacterias, o con bacterias junto con una SP-A, tal como se ha descrito con anterioridad (LeVine, A.M. y colaboradores: Surfactant protein A-deficient mice are susceptible to group B streptococcal infection [Los ratones deficientes en cuanto a proteína A de agentes tensioactivos son susceptibles a una infección por estreptococos del grupo B]; The Journal of Immunology, 1997, 4336-4340). El aclaramiento de bacterias a partir de los pulmones de ratones (-/-) en SP-A se determinó después de una inoculación intratraqueal con GBS conjuntamente con dosis variables de la rSP-A, que fluctúan desde 25 \mug, 50 \mug, 75 \mug, 100 \mug hasta 150 \mug. Animales de tipo salvaje se infectaron con GBS (10^{6} cfu) y se trataron con la rSP-A (150 \mug) en el momento de una infección o 6 horas después de una infección.

Producción de citocinas

Materiales homogeneizados de pulmones se centrifugaron a 1.200 x g y los materiales sobrenadantes se almacenaron a -20ºC. Los niveles del factor \alpha de necrosis de tumores (TNF-\alpha) se midieron con ELISA's usando un anticuerpo anti-murino de cabra (R&D Systems) dirigido contra el TNF-\alpha. Todas las placas se leyeron en un lector de microplacas (Molecular Devices, Menlo Park, CA) y se analizaron con el uso de un programa de análisis asistido por ordenador (Softmax, Molecular Devices).

Métodos estadísticos

Puesto que la distribución de la variable cfu / gramo de pulmón no se había efectuado normalmente, se usó una transformación a logaritmos naturales para todos los análisis. Se realizaron análisis de la varianza (ANOVA) para comprobar las diferencias entre los grupos. Las calificaciones individuales para cada momento (punto de tiempo) se compararon usando las calificaciones medianas de un ensayo no paramétrico. Los hallazgos se consideraron estadísticamente significativos con unos niveles de probabilidad de < 0,05.

Resultados Una SP-A recombinante aumentaba el aclaramiento de bacterias en ratones (-/-) en SP-A

El aclaramiento de los GBS en un ratón (-/-) en SP-A se intensificó de manera significativa a las 6 y 24 horas cuando los GBS se administraron conjuntamente con 150 \mug de una rSP-A (Figura 1). Los efectos de una rSP-A eran comparables a los observados con una SP-A aislada a partir de pacientes de proteinosis. El aclaramiento de los GBS por ratones (-/-) en SP-A era dependiente de las dosis y se había aumentado por 50 \mug, 75 \mug, 100 \mug y 150 \mug de la rSP-A (Figura 2).

Una SP-A recombinante aumenta el aclaramiento de bacterias en ratones de tipo salvaje

El aclaramiento de los GBS en ratones de tipo salvaje se intensificó de manera significativa a las 6 y 24 horas cuando los GBS se administraron conjuntamente con 150 \mug de una rSP-A (Figura 3). Animales de tipo salvaje, infectados con los GBS y tratados a las 6 horas después de una infección con una rSP-A intratraqueal (150 \mug), tenían un aclaramiento aumentado de los GBS a las 24 horas (Figura 4).

El aclaramiento pulmonar de GBS administrados por vía intratraqueal se redujo en ratones (-/-) en SP-A en comparación con ratones de tipo salvaje. La administración conjunta de una SP-A recombinante exógena con las bacterias mejoró de una manera significativa el aclaramiento de las bacterias, demostrando un defecto reversible inmediato en un ratón (-/-) en SP-A. El aclaramiento pulmonar intensificado de los GBS con un tratamiento por una rSP-A era dependiente de la dosis. Ratones de tipo salvaje se trataron de una manera efectiva con una rSP-A, con un aclaramiento aumentado de los GBS a partir de los pulmones.

Además, se podría mostrar que una rSP-A exógena reduce el contenido de TNF-\alpha en materiales homogeneizados de pulmones a partir de ratones (-/-) en SP-A, estimulados con los GBS hasta cerca del nivel observado en ratones (+/+) en SP-A (Figura 5).

Utilidad

Teniendo en cuenta sus propiedades de aclaramiento de microbios y anti-inflamatorias, una rSP-A es útil para la producción de medicamentos destinados a la prevención o al tratamiento de infecciones y inflamaciones pulmonares. Tal como se usa en el presente contexto, una infección pulmonar se refiere a neumonías microbianas causadas, por ejemplo, por virus tales como el Virus Sincitial Respiratorio, Adenovirus, los del Herpes simple, de la Influenza A y otros, o por bacterias tales como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Estreptococos del grupo B, Enterobacter o Streptococcus pneumoniae y otras, así como por hongos tales como Aspergillus fumigatus, Pneumocystis carinil, Candida albicans y otros.

Además, el término de infección pulmonar se refiere también a casos de inmunidad reducida, por ejemplo a la fase de inmunoparálisis que se produce durante una sepsis, y a síndromes de inmunodeficiencia ya sea congénita, adquirida espontáneamente o iatrogénica. Éstos se caracterizan por una desusada susceptibilidad a una infección y, de una manera no infrecuente, a una enfermedad autoinmunitaria y a malignidades linforreticulares. Los pacientes con defectos en inmunidad humoral tienen una infección sinopulmonar recurrente o crónica, meningitis y bacteremia, causadas más corrientemente por bacterias piogénicas, tales como Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Estafilococos. Estos y otros organismos piogénicos provocan también frecuentes infecciones en individuos que tienen o bien una neutropenia o una deficiencia del tercer componente fundamental del complemento (C3).

En conexión con el presente invento, el término inflamación pulmonar se refiere, p.ej., a una displasia broncopulmonar (BPD), y por lo tanto una rSP-A es útil también en la producción de medicamentos destinados a la prevención o al tratamiento de una displasia broncopulmonar (BPD) u otros trastornos de deficiencia en cuanto a SP-A. En particular, se puede mencionar en conexión con el presente invento una BPD causada por una ventilación artificial de niños pequeños prematuros. Adicionalmente, el término inflamación se refiere también a una inflamación pulmonar causada por una ventilación artificial o por casos de liberación de citocinas dentro de los pulmones, que no se deben principalmente a bacterias, virus u hongos. El término inflamación incluye también enfermedades tales como asma, CF (fibrosis cística) y COPD (enfermedad pulmonar obstructiva crónica). Éste incluye también una lesión pulmonar aguda en las etapas peores conocidas como ARDS (síndrome de angustia respiratoria de adultos). Además, una inflamación se refiere también a una inflamación inducida por alergenos.

El presente invento es también apropiado para el tratamiento de infecciones pulmonares bacterianas con una rSP-A o formas apropiadas de la misma, en combinación con, o además de, antibióticos de una manera en que se cure una inflamación inducida por una infección.

El invento se puede usar además para el tratamiento de mamíferos, inclusive seres humanos, que están padeciendo de una de las enfermedades antes mencionadas. El tratamiento está caracterizado porque una cantidad de una rSP-A terapéuticamente activa y farmacológicamente tolerable se ha de administrar al mamífero que necesita de ella.

La conexión con el nuevo uso de una rSP-A, de acuerdo con el invento se preparan medicamentos con procedimientos que resultan familiares para los expertos en la especialidad. Para hacer esto, una rSP-A se emplea o bien tal como está o, de manera preferible, en combinación con agentes auxiliares farmacéuticos apropiados, p.ej. como suspensiones, soluciones o en forma de polvos, estando situado el contenido de rSP-A ventajosamente entre 0,1 y 90% (p/p = peso / peso), preferiblemente entre 0,1 y 15% (p/p). La rSP-A se puede administrar o bien a solas o con agentes auxiliares. Los agentes auxiliares que son apropiados para las deseadas formulaciones farmacéuticas resultan familiares para una persona experta en la especialidad, teniendo en cuenta sus conocimientos expertos. Formulaciones farmacéuticas que contienen una rSP-A en combinación con lípidos sintéticos o naturales, se describen, por ejemplo, en el documento US-A 4.659.805. Sorprendentemente, y en contraste con las formulaciones farmacéuticas que comprenden una rSP-A, descritas en el estado de la técnica, las formulaciones exentas de lípidos, que comprenden una rSP-A como ingrediente activo, se pueden usar también para el tratamiento de infecciones e inflamaciones pulmonares. El invento se refiere, por lo tanto, a medicamentos exentos de lípidos que comprenden una rSP-A.

En particular, dichos medicamentos exentos de lípidos, que comprenden una rSP-A, contienen como sustancia auxiliar de 0,01 a 0,1% de una sal de calcio, preferiblemente cloruro de calcio. Un medicamento líquido exento de lípidos, ilustrativo, se puede producir disolviendo de 100 a 1.000 mg de una rSP-A y 11,1 mg de cloruro de calcio en 100 ml de una solución acuosa al 0,9%, estéril, de cloruro de sodio.

En una realización preferida, los medicamentos son puestos a disposición en una forma líquida para una administración intratraqueal o intrabronquial por instilación o nebulización, o en forma de polvo para su administración por inhalación.

En conexión con el nuevo uso de una rSP-A de acuerdo con el invento los medicamentos se administran, por ejemplo, de 2 a 3 veces por día durante 1 a 7 días. Por ejemplo, unos medicamentos que comprenden de 100 \mug/kg a 10 mg/kg (de peso corporal) de una rSP-A se administran por inhalación o por vía intratraqueal o intrabronquial.

En un aspecto adicional del invento, una rSP-A se ha de administrar en combinación con proteínas de agentes tensioactivos, SP-B, SP-C y/o SP-D, o sus derivados modificados, para el tratamiento o la prevención de infecciones e inflamaciones pulmonares. En particular, se prefiere en conexión con el invento la administración concomitante de una rSP-A con una SP-D. Se conocen las secuencias de aminoácidos de dichas proteínas de agentes tensioactivos, su aislamiento o su preparación por ingeniería genética (p.ej. a partir de los documentos WO 86/03408, EP-A-0.251.449, WO 89/04326, WO 87/06943, WO 88/03170, EP-A-0.368.823, EP-A-0.348.697, WO 91/18015, WO 95/32992, EP-A-0.593.094, WO 92/22315, y de la cita de Crouch y colaboradores: Recombinant Pulmonary Surfactant Protein D [Proteína D recombinante de agentes tensioactivos pulmonares], The Journal of Histological Chemistry, 1994, 269, 15808-15813 y las referencias allí citadas).

Descripción de las figuras

Figura 1: Aclaramiento aumentado de los GBS a partir de los pulmones en ratones (-/-) en SP-A. Se inocularon 10^{4} cfu de GBS con o sin 150 \mug de una rSP-A, y los recuentos de colonias se realizaron después de 6 y 24 horas, como se ha descrito con anterioridad. Ratones (-/-) en SP-A sin rSP-A (barras rellenas) y con rSP-A (barras rayadas). Los datos son valores medios \pm ETM (error típico de la media).

Figura 2: El aclaramiento aumentado de los GBS por una rSP-A exógena es dependiente de la dosis. Ratones (-/-) en SP-A se inocularon con 10^{4} cfu de GBS en la presencia o bien de 0 (N.T. = no tratado), 25, 50, 75, 100 ó 150 \mug de una rSP-A y los recuentos de colonias se realizaron a las 6 horas después de una instilación intratraqueal, como anteriormente se ha descrito. Los datos son valores medios \pm ETM.

Figura 3: Aclaramiento aumentado de los GBS a partir de los pulmones en ratones (wt) (+/+) en SP-A. 10^{6} cfu de GBS se inocularon con o sin 150 \mug de una rSP-A, y los recuentos de colonias se realizaron a las 6 y a las 24 horas después de una instilación intratraqueal como se ha descrito con anterioridad. Ratones (+/+) en SP-A sin rSP-A (barras rayadas) y con rSP-A (barras rellenas). Los datos son valores medios \pm ETM.

Figura 4: Rescate de una infección causada por GBS en ratones (wt) SP-A. Los ratones (+/+) en SP-A se inocularon por vía intratraqueal con 10^{6} cfu de GBS en la ausencia de una rSP-A exógena. 6 horas después de la infección, se administraron por vía intratraqueal 150 \mug de rSP-A. A las 24 horas después de la administración de una rSP-A, se realizaron recuentos de colonias en los pulmones. Los cómputos de colonias se redujeron espectacularmente en pulmones procedentes de animales tratados con una rSP-A (barras rellenas) en comparación con animales sin tratar (barras rayadas). Los datos son valores medios \pm ETM.

Figura 5: Una rSP-A reduce el contenido de TNF-
\alpha en materiales homogeneizados de pulmones procedentes de ratones (-/-) en SP-A estimulados con GBS. Los ratones (-/-) en SP-A y (+/+) en SP-A
se inocularon por vía intratraqueal con 10^{4} cfu de GBS, en ausencia o presencia de 150 \mug de una rSP-
A exógena. A las 6 horas después de la infección, los pulmones se extrajeron, se homogeneizaron, y el nivel de TNF-\alpha se midió como se ha
descrito con anterioridad. Ratones (-/-) en SP-A sin tratar (barra rellena), (-/-) en SP-A tratados (barra con rayas cruzadas), ratones (+/+) en SP-A sin tratar (barra punteada) . Los datos se expresan en pg/ml y representan valores medios \pm ETM con n = 6 ratones por grupo.

El invento y sus ventajas se entienden con facilidad a partir de la precedente descripción. Se pueden hacer diversos cambios en los procesos y en las composiciones, sin apartarse del alcance del invento ni sacrificar sus ventajas materiales, siendo los procesos y los productos descritos con anterioridad por lo tanto meramente ilustrativos de realizaciones preferidas del invento.

Claims (16)

1. Uso de un componente activo farmacéuticamente aceptable, que es sustancialmente igual a una proteína A recombinante de agentes tensioactivos (rSP-A), para la producción de un medicamento exento de lípidos, que comprende un vehículo apropiado, destinado a prevenir o tratar una infección o inflamación pulmonar.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que rSP-A es una SP-A recombinante que es igual a la obtenible por expresión de una secuencia genómica que codifica una SP-A en un apropiado sistema de expresión.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que la rSP-A es una SP-A recombinante que es igual a la obtenible por expresión de un ADNc que codifica una SP-A en un apropiado sistema de expresión.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que la composición medicamentosa comprende además una proteína D de agentes tensioactivos (SP-D).

5. Una composición medicamentosa exenta de lípidos, que es útil para tratar o prevenir una infección o inflamación pulmonar y que comprende una cantidad efectiva de un componente activo farmacéuticamente aceptable y un vehículo apropiado para el mismo, en que el componente activo es por lo menos sustancialmente igual a una rSP-A.

6. Una composición medicamentosa de la reivindicación 5, para tratar o prevenir una infección pulmonar.

7. Una composición medicamentosa de la reivindicación 6, en la que la infección pulmonar es una neumonía bacteriana, vírica o fúngica.

8. Una composición medicamentosa de la reivindicación 5, para tratar o prevenir una inflamación pulmonar.

9. Una composición medicamentosa de la reivindicación 8, en la que la inflamación pulmonar es una displasia broncopulmonar.

10. Una composición medicamentosa de la reivindicación 5, en la que la rSP-A es al menos sustancialmente igual a una SP-A recombinante obtenida por expresión de una secuencia genómica que codifica una SP-A en un apropiado sistema de expresión.

11. Una composición medicamentosa de la reivindicación 5, en la que la rSP-A es por menos sustancialmente igual a una SP-A recombinante obtenida por expresión de un ADNc que codifica una SP-A en un apropiado sistema de expresión.

12. Una composición medicamentosa de la reivindicación 5, en la que el componente activo comprende además una proteína D de agentes tensioactivos (SP-D).

13. Uso de una proteína A recombinante (rSP-A) para la producción de un medicamento exento de lípidos, destinado al tratamiento o a la prevención de una infección o inflamación pulmonar.

14. Uso de la reivindicación 13 en que el medicamento comprende además una proteína D de agentes tensioactivos (SP-D).

15. Un artículo de manufactura que comprende un material para envasar y una composición farmacéutica exenta de lípidos, contenida dentro del material para envasar, en el que la composición farmacéutica comprende un agente activo que es por lo menos sustancialmente igual a la proteína A recombinante de agentes tensioactivos, y en que el material para envasar comprende una etiqueta o un folleto dentro del envase, que indica que el agente activo es útil para prevenir o tratar una infección o inflamación microbiana pulmonar.

16. Un artículo de manufactura de la reivindicación 15, en que el agente activo es una rSP-A.