ES2218827T3 - Inhibidores de la serina proteasa. - Google Patents
Inhibidores de la serina proteasa.Info
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Abstract
La invención se refiere a un compuesto con la fórmula (I): R{sup,1}{sub,}SO{sub,2}-B-X-Z-C(O)-Y, B es un enlace, un aminoácido de fórmula -NH-CH[(CH{sub,2}){sub,p}C(O)OH]-C(O)- o un derivado de éster del mismo, en la que p es 1,2 o3, Gly, D-1-Piq, D-3-Piq, D-1-Tiq, D-3-Tiq, D-Atc, Aic, o un L- o D-aminoácido con una cadena lateral hidrófoba, básica o neutral; X es un aminoácido con una cadena lateral hidrófoba, glutamina, serina, treonina, un aminoácido cíclico que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre N, O o S, y opcionalmente sustituido con alquilo C(1-6), alcoxi C(1-6), benciloxi u oxo, o X es un ácido 2-amino-isobutírico, -NR{sup,2}{sub,}-CH{sub,2}-C(O)- o un fragmento (I) o (II), en el que n es 2,3 ó 4, W es CH o N y R{sup,3}{sub,} es H, alquilo C(1-6) o fenilo, pudiendo estar opcionalmente sustituidos estos grupos con hidroxi, alcoxi C(1-6), COOH, COO-alquilo C(1-6), CONH{sub,2} o halógeno; Z es lisina o 4-aminociclohexilglicina. Los compuestos de la invención tienen actividad anticoagulante y pueden usarse para tratar o prevenir enfermedades relacionadas con la trombina. Las variables R{sup,1}{sub,} e Y se definen en la reivindicación 1.
Description
Inhibidores de la serina proteasa.
Esta invención se refiere a nuevos inhibidores de
la serina proteasa, a composiciones farmacéuticas que contienen los
mismos, así como al uso de dichos inhibidores para la fabricación de
un medicamento para tratar y evitar las enfermedades relacionadas
con la trombina.
Las serina proteasas son enzimas que, entre otras
cosas, juegan un papel importante en la cascada de la coagulación
sanguínea. Miembros de este grupo de proteasas son, por ejemplo,
trombina, tripsina, factores VIIa, IXa, Xa, XIa, XIIa y proteína
C.
La trombina es la serina proteasa que regula la
última etapa en la cascada de la coagulación. La función fundamental
de la trombina es la escisión del fibrinógeno para generar monómeros
de fibrina, que forman un gel insoluble por reticulación. Además, la
trombina regula su propia producción activando los factores V y VIII
anteriores en la cascada. También ejerce acciones importantes a
nivel celular, en el que actúa sobre receptores específicos para
provocar la agregación plaquetaria, la activación de las células
endoteliales y la proliferación del fibroblasto. Así, la trombina
tiene un papel regulador central en la hemóstasis y la formación de
trombos. Debido a que los inhibidores de la trombina pueden tener un
amplio rango de aplicaciones terapéuticas, se ha realizado una
amplia investigación en este área.
En el desarrollo de inhibidores sintéticos de las
serina proteasas, y más específicamente de la trombina, ha aumentado
el interés en pequeños péptidos sintéticos que son reconocidos por
las enzimas proteolíticas de una manera parecida a la de los
sustratos naturales. Como resultado, se han preparado nuevos
inhibidores similares a péptidos, tales como los inhibidores del
estado de transición de la trombina.
La búsqueda de inhibidores de la trombina más
efectivos y más selectivos continua sin disminuir con el fin de
obtener inhibidores de la trombina que se puedan administrar en
dosis más bajas y que tengan menos efectos secundarios y menos
graves. Además, se pone atención especial a la biodisponibilidad
oral. Los potentes inhibidores intravenosos de la trombina son
clínicamente efectivos en cuadros de asistencia agudos que requieren
el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la
trombina. Sin embargo, particularmente la prevención de
enfermedades relacionadas con la trombina tales como el infarto de
miocardio, trombosis y apoplejía requieren terapia a largo plazo,
preferiblemente dosificando oralmente un anticoagulante.
Muchos de los inhibidores de serina proteasas
similares a péptidos, en particular inhibidores de la trombina,
descritos en publicaciones anteriores se basan en la secuencia
-D-Phe-Pro-Arg-,
véase, por ejemplo, los compuestos descritos por Brady et al.
[Bioorganic & Medical Chemistry, 3(1995),
1063-78] y en la patente de EE.UU. 5.597.804. Los
inhibidores de la trombina también pueden contener cadenas laterales
de lisina en lugar de arginina, tal como otros inhibidores descritos
por Brady et al., y Lewis et al. [Thrombosis and
Haemostasis, 74(4) (1995), 1107-12], y
adicionalmente por Jones et al. [J. Enzyme Inhibition,
9 (1995), 43-60]. En la última publicación se
informó que los compuestos tripéptidos que contienen funciones
\alpha-ceto-metil-éster son
compuestos lábiles y, por lo tanto, desfavorables para el desarrollo
posterior como inhibidores de la trombina. También se conocen
inhibidores de la trombina que tienen un resto aminociclohexil en
lugar de la cadena lateral de lisina o arginina [WO 94/25051]. De
estas y de otras referencias [por ejemplo, la patente de EE.UU.
5.523.308] se conocen diversas variaciones en el carbono terminal de
estos inhibidores de la trombina similares a péptidos. Los
desarrollos en este campo ya han mejorado la comprensión de como
modular las propiedades biológicas de este tipo de inhibidores de la
trombina. Sin embargo, aunque se está realizando un gran esfuerzo en
encontrar inhibidores selectivos de la trombina que tengan buena
biodisponibilidad oral, todavía hay pocos inhibidores del estado de
transición de la trombina conocidos en la técnica que cumplan estos
requisitos.
Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que los
compuestos de fórmula:
(I)R^{1}SO_{2}-B-X-Z-C(O)-Y
en los que R^{1} es
R^{2}OOC-(CHR^{2})_{m}- o
R^{2}NH-CO-(CHR^{2})_{m}- o se
selecciona entre alquilo (C1-12),
alquenilo(C2-12), cuyos grupos pueden estar
opcionalmente sustituidos con
cicloalquilo(C3-12),
alcoxilo(C1-6), OH, COOR^{2}, CF_{3} o
halógeno, y entre arilo(C6-14),
aralquilo(C7-15) y
aralquenilo(C8-16), cuyos grupos arilo pueden
estar opcionalmente sustituido con
alquilo(C1-6),
cicloalquilo(C3-8), alcoxilo
(C1-6), OH, COOH, CF_{3} o
halógeno;
m es 1, 2 ó 3;
cada grupo R^{2} es independientemente H,
alquilo(C1-12),
cicloalquilo(C3-8),
arilo(C6-14) o
aralquilo(C7-15), cuyos grupos arilo pueden
estar sustituidos con alquilo(C1-6),
alcoxilo(C1-6) o halógeno;
B es un enlace, un amino-ácido de fórmula
-NH-CH[(CH_{2})_{p}C(O)OH]-C(O)-
o un éster derivado de él en el que p es 1, 2 ó 3, Gly,
D-1-Piq,
D-3-Piq,
D-1-Tiq,
D-3-Tiq, D-Atc, Aic,
o un L- o D-aminoácido que tiene una cadena lateral
hidrófoba básica o neutra;
X es un aminoácido con una cadena lateral
hidrófoba, glutamina, serina, treonina, un aminoácido cíclico que
contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre
N, O o S, y sustituido opcionalmente con
alquilo(C1-6),
alcoxi(C1-C6), benciloxi u oxo, o X es ácido
2-amino-isobutírico,
-NR^{2}-CH_{2}-C(O)- o el
fragmento
en el que n es 2, 3 ó 4, W es CH o N y R^{3} es
H, alquilo(C1-6) o fenilo cuyos grupos pueden
estar opcionalmente sustituidos con hidroxi,
alcoxi(C1-6), COOH,
COO-alquilo (C1-6), CONH_{2}, o
halógeno;
Z es lisina o
4-aminociclohexilglicina;
Y es
-NH-alquileno(C1-6)-C_{6}H_{5},
cuyo grupo fenilo puede estar sustituido con
alquilo(C1-6),
alcoxilo(C1-6) o halógeno, o Y es -OR^{4} o
-NR^{5}R^{6}, en el que R^{4} es H,
alquilo(C2-6) o bencilo, y R^{5} y R^{6}
son independientemente H, alcoxi(C1-6), o
alquilo(C1-6) sustituido opcionalmente con
halógeno, o R^{5} y R^{6} juntos son
alquileno(C3-6), o R^{5} y R^{6} junto
con el átomo de nitrógeno al cual están unidos
son 2 , en el que V es O, S o
SO_{2};
o un profármaco de ellos o una sal
farmacéuticamente aceptable de ellos,
son inhibidores potentes y selectivos de la
serina proteasa. Específicamente, los compuestos de la presente
invención son inhibidores de la trombina, del factor tisular/VIIa y
del factor Xa. Los compuestos de la invención muestran propiedades
farmacocinéticas mejoradas y en particular buena biodisponibilidad
tras la administración oral. Los compuestos
\alpha-(C2-C5)ceto-éster que forman parte
de la presente invención no muestran las desventajas de los
compuestos lábiles
\alpha-ceto-metil-éster indicados
previamente.
Los compuestos de la presente invención son
útiles para tratar y evitar las enfermedades mediadas por la
trombina y asociadas a la trombina. Esto incluye varios estados
trombóticos y protrombóticos en los que se activa la cascada de la
coagulación que incluyen, pero no se limitan a, trombosis venosa
profunda, embolia pulmonar, tromboflebitis, oclusión arterial por
trombosis o embolia, reoclusión arterial durante o después de
angioplastia o trombólisis, restenosis resultante de lesión arterial
o procedimientos cardiológicos invasivos, trombosis o embolia venosa
postoperatoria, arteriosclerosis aguda o crónica, apoplejía, infarto
de miocardio, cáncer y metástasis, y enfermedades
neuro-degenerativas. Los compuestos de la invención
también se pueden usar como anticoagulantes en circuitos sanguíneos
extracorporales, como los necesarios en diálisis y cirugía.
Los compuestos de la invención también se pueden
usar como anticoagulantes in vitro.
Los inhibidores de la serina proteasa preferidos
según esta invención son los compuestos en los que Z es lisina. Más
preferidos son los compuestos en los que X en un aminoácido cíclico,
un aminoácido con una cadena lateral hidrófoba, glutamina, serina,
treonina,
-NR^{2}-CH_{2}-C(O)-, o
el fragmento
en el que R^{3} es H,
alquilo(C1-6) o
fenilo.
Son particularmente preferidos los compuestos en
los que X es prolina, leucina, glutamina, treonina, fenilalanina,
NR^{2}-CH_{2}-C(O)- en el
que R^{2} es metilo, ciclopentilo o ciclohexilo, o el
fragmento
en el que R^{3} es H o
metilo.
Otros compuestos preferidos son aquellos en los
que B es un enlace o un D-aminoácido que tiene una
cadena lateral hidrófoba o neutra. Los compuestos de la invención
más preferidos son aquellos en los que R^{1} es
alquilo(C1-6) o bencilo. Preferiblemente
R^{4} en la definición de Y es
alquilo(C2-6) o bencilo. En particular, se
prefieren los compuestos en los que Y es
-OCH(CH_{3})_{2}. También son compuestos
preferidos los que Y es NH_{2}.
La expresión
alquilo(C1-12) quiere decir un grupo alquilo
ramificado o no ramificado que tiene de 1 a 12 átomos de carbono,
tal como metilo, etilo, t-butilo, isopentilo,
heptilo, dodecilo, y similares. Los grupos alquilo preferidos son
grupos alquilo(C1-6), que tienen
1-6 átomos de carbono.
Un grupo alquenilo(C2-12)
es un grupo hidrocarburo insaturado ramificado o no ramificado que
tiene de 2 a 12 átomos de carbono. Los grupos alquenilo preferidos
son C2-6. Son ejemplos etenilo, propenilo, alilo, y
similares.
La expresión
alquileno(C1-6) quiere decir un grupo
alquileno ramificado o no ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de
carbono, tal como -(CH_{2})_{s}- y s es de 1 a 6,
-CH(CH_{3})-, -CH(CH_{3})-(CH_{2})-, etc. Los
grupos alquileno preferidos en la definición de Y son etileno y
metileno.
La expresión alcoxi(C1-6)
quiere decir un grupo alcoxi que tiene 1-6 átomos de
carbono, cuyo resto alquilo tiene el significado descrito
previamente.
La expresión
cicloalquilo(C3-12) quiere decir un grupo
mono- o bi-cicloalquilo que tiene
3-12 átomos de carbono, cuyo grupo cicloalquilo
puede estar opcionalmente sustituido con un grupo oxo. Se prefieren
cicloalquilos(C3-8), tales como ciclopropilo,
ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo,
etc. Los grupos cicloalquilos aun más preferidos son ciclopentilo y
ciclohexilo. Un grupo alquilo sustituido con cicloalquilo preferido
en la definición de R^{1} es el grupo canfor.
Un grupo arilo(C6-14) es
un resto aromático de 6 a 14 átomos de carbono. El grupo arilo puede
contener adicionalmente uno o más heteroátomos, tales como N, S, u
O. Ejemplos de grupos arilo son fenilo, naftilo,
(iso)quinolilo, indanilo, y similares.
Los grupos
aralquilo(C7-15) y
aralquenilo(C8-16) son grupos alquilo y
alquenilo respectivamente, sustituidos por uno o más grupos arilo,
siendo el número total de átomos de carbono de 7 a 15 y de 8 a 16
respectivamente.
El término halógeno quiere decir flúor, cloro,
bromo o yodo.
La expresión derivado de éster quiere decir
cualquier derivado de éster apropiado, preferiblemente ésteres de
alquilo(C1-4), tales como ésteres metílicos,
etílicos o t-butílicos.
El término Atc quiere decir ácido
2-aminotetralin-2-carboxílico
y Aic significa ácido
amino-indano-carboxílico. Los
términos 1- y 3-Tiq quieren decir ácido
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-1- y
-3-carboxílico respectivamente; 1- y
3-Piq son ácido
perhidroisoquinolina-1- y
-3-carboxílico, respectivamente.
La expresión aminoácido que tiene una cadena
lateral hidrófoba quiere decir un aminoácido que tiene una cadena
lateral que es cicloalquilo(C3-8),
arilo(C6-14) o
alquilo(C1-6), cuyo grupo alquilo puede estar
opcionalmente sustituido con uno o más grupos
cicloalquilo(C3-8) o grupos
arilo(C6-14). La cadena lateral hidrófoba
puede estar opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes,
tales como hidroxi, halógeno, trifluormetilo, -OSO_{2}CF_{3},
alquilo(C1-4) (por ejemplo, metilo o etilo),
alcoxi(C1-4) (por ejemplo, metoxi), feniloxi,
benciloxi, y similares. Los aminoácidos preferidos con una cadena
lateral hidrófoba son leucina, valina, ciclohexilalanina,
4-metoxi-ciclohexilalanina,
ciclo-octilalanina, fenilalanina,
D-naftilalanina, tirosina,
o-metil-tirosina (o:
p-metoxi-fenilalanina),
3,3-difenilalanina, norleucina y leucina.
Aminoácidos que tienen una cadena lateral básica
son por ejemplo, pero no se limitan a, arginina y lisina,
preferiblemente arginina.
La expresión aminoácidos que tienen una cadena
lateral neutra se refiere a aminoácidos tales como glutamina (Gln),
metionina sulfona, aspargina (Asn) y similares. Se prefieren Gln y
Asn.
Aminoácidos cíclicos son, por ejemplo, ácido
2-acetidin-carboxílico, prolina,
ácido pipecólico,
1-amino-1-carboxi-cicloalcano(C3-8)
(preferiblemente C4, C5 o C6), ácido
4-piperidin-carboxílico, ácido
4-tiazolidin-carboxílico,
3,4-dehidro-prolina, azaprolina,
ácido 2-octahidroindol-carboxílico,
y similares. Se prefieren ácido
2-acetidin-carboxílico, prolina,
ácido pipecólico, ácido
4-tiazolidin-carboxílico,
3,4-dehidro-prolina y ácido
2-octahidroindol-carboxílico.
En las definiciones, el término sustituido quiere
decir: sustituido por uno o más sustituyentes.
La invención también incluye profármacos de los
compuestos de fórmula I, que después de la administración se
metabolizan en el compuesto activo. Profármacos adecuados son, por
ejemplo, derivados protegidos N-alcoxicarbonil
(preferiblemente N-etoxicarbonil) de los compuestos
de fórmula I.
La invención incluye adicionalmente un
procedimiento para preparar un compuesto de fórmula I, que comprende
la copulación de aminoácidos o de análogos de aminoácidos
adecuadamente protegidos, seguida de la eliminación de los grupos
protectores.
Los compuestos según la fórmula I se pueden
preparar de una manera convencional para tales compuestos. Con ese
fin, se activan derivados de aminoácidos o péptidos adecuadamente
protegidos en el N\alpha (y protegidos en las cadenas laterales si
hay presentes cadenas laterales reactivas) y se copulan con
derivados de aminoácidos o péptidos adecuadamente protegidos en el
carboxilo ya sea en disolución o sobre un soporte sólido. La
protección de las funciones \alpha-amino
generalmente tiene lugar mediante funciones uretano tales como grupo
tert-butiloxicarbonil (Boc) lábil en medio ácido,
grupo benciloxicarbonil (Cbz) y análogos sustituidos o el grupo
9-fluorenil-metiloxicarbonil (Fmoc)
lábil en medio básico. El grupo Chz también se puede eliminar por
hidrogenación catalítica. Otros grupos protectores amino adecuados
incluyen Nps, Bpoc, Msc, etc. Se da una buena revisión global de los
grupos protectores amino en The Peptides, Analysis, Synthesis,
Biology, Vol. 3, E. Gross and Meienhofer, Eds., (Academic Press, New
York, 1981). La protección de los grupos carboxilo puede tener
lugar por formación de éster, por ejemplo, ésteres lábiles en medio
básico como ésteres metílicos o etílicos, ésteres lábiles en medio
ácido como ésteres tert-butílicos, o ésteres lábiles
hidrogenolíticamente como los ésteres bencílicos. La protección de
la función de la cadena lateral de lisina o
4-aminociclohexilglicina se puede realizar usando
los grupos mencionados anteriormente. La activación del grupo
carboxílico de los aminoácidos o péptidos adecuadamente protegidos
puede tener lugar por el método de la azida, del anhídrido mezclado,
del éster activo, o de la carbodiimida, especialmente con la adición
de compuestos catalíticos y supresores de la racemización como
1-hidroxibenzotriazole,
N-hidroxisuccinimida,
3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazina,
N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida.
Véase, por ejemplo, The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology
(véase anteriormente) y Pure and Applied Chem. 59(3),
331-344
(1987).
(1987).
Los compuestos de la invención, que pueden estar
en forma de una base libre, se pueden aislar de la mezcla de
reacción en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales
farmacéuticamente aceptables también se pueden obtener tratando la
base libre de formula I con un ácido orgánico o inorgánico tal como
cloruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno, yoduro de hidrógeno,
ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido propiónico,
ácido glicólico, ácido maleico, ácido malónico, ácido
metanosulfónico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido tartárico,
ácido cítrico, ácido benzoico, y ácido ascórbico.
Los compuestos de esta invención poseen uno o más
átomos de carbono quirales, y por lo tanto pueden obtenerse como un
enantiómero puro, o como una mezcla de enantiómeros, o como una
mezcla que contiene diasteroisómeros. Los métodos para obtener los
enantiómeros puros son bien conocidos en la técnica, por ejemplo,
cristalización de sales que se obtienen a partir de ácidos
ópticamente activos y de la mezcla racémica, o cromatografía usando
columnas quirales. Para los diasteroisómeros se pueden usar columnas
de fase normal o de fase reversa.
Los compuestos de la invención se pueden
administrar enteral o parenteralmente, y para los humanos
preferiblemente en una dosis diaria de 0,001-100 mg
por kg de peso corporal, preferiblemente 0,01-10 mg
por kg de peso corporal. Mezclado con agentes auxiliares
farmacéuticamente adecuados, por ejemplo, como los descritos en la
referencia estándar, Gennaro et al., Remington's
Pharmaceutical Sciences, (18th ed., Mack Publishing Company, 1990,
véase especialmente Part 8: Pharmaceutical Preparations and Their
Manufacture) los compuestos se pueden comprimir en unidades sólidas
de dosificación, tales como píldoras, comprimidos o procesarse en
cápsulas o supositorios. Por medio de líquidos farmacéuticamente
adecuados, los compuestos también se pueden aplicar en forma de una
disolución, suspensión, emulsión, por ejemplo, para usar como una
preparación inyectable, o como un pulverizador, por ejemplo, para
usar como un pulverizador nasal.
Para fabricar las unidades de dosis, por ejemplo
comprimidos, se contempla el uso de aditivos convencionales tales
como agentes de carga, colorantes, agentes ligantes polímeros y
similares. En general, se puede usar cualquier aditivo
farmacéuticamente aceptable que no interfiera con la función de los
compuestos activos.
Los vehículos adecuados con los que se pueden
administrar las composiciones incluyen lactosa, almidón, derivados
de la celulosa y similares, o sus mezclas, usados en cantidades
adecuadas.
La invención se explica adicionalmente por
referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos.
| Et | = | etilo | Bzl | = | bencilo |
| Boc | = | tert-butiloxicarbonilo | Cbz | = | benciloxicarbonilo |
| Cha | = | ciclohexilalanina | Pro | = | prolilo |
| Lys | = | lisilo | Acg | = | 4-aminociclohexil-glicilo |
| TFA | = | ácido trifluor-acético | Pac | = | fenilacetilo |
| Nps | = | nitrofenilsulfonilo | Bpoc | = | 2-p-bifenilisopropiloxicarbonilo |
| Asp | = | aspartilo | Glu | = | glutamilo |
| Dpa | = | difenilalanilo | H-Aad-OH = ácido amino-adípico | ||
| Tyr(Me) = (o-metil)-tirosilo | Phe | = | fenilalanilo | ||
| Nal | = | naftilen-2-il-alanilo | |||
| H-3-Tiq-OH = ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico | |||||
| Msc | = | metilsulfoniletiloxicarbonilo | |||
| Teoc | = | 2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo | |||
| norLeu(cyclo)-Gly-OH = ácido (S)-3-amino-2-oxo-hexahidro-1-azepino-acético | |||||
| norVal(cyclo)-Gly-OH = ácido (S)-3-amino-2-oxo-1-piperidin-acético |
Los sistemas de disolventes usados en HPLC
son:
A: tampón fosfato 0,5 M de pH 2,1; B: agua; C:
acetonitrilo/agua 3/2 v/v.
A no ser que se exponga lo contrario, los tiempos
de retención (Rt(LC)) se determinaron en una columna
analítica de HPLC Supelcosil
LC-18-DB (tamaño de partículas 5
\mum; 250 x 2,1 mm), que se eluyó usando un gradiente (como se
especifica) de sistemas disolventes A, B y C a un caudal de 0,25
ml/min a 35ºC.
A una disolución de
Cbz-Lys(Boc)-OH (28 g) en
diclorometano/metanol (9/1 v/v; 500 ml) se añadió tetrafluorborato
de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(23,6 g) y la disolución se ajustó a pH 8 por adición de
trietilamina. La mezcla de reacción se agitó durante dos horas a
temperatura ambiente. La mezcla se lavó sucesivamente con ácido
clorhídrico frío 1N, agua, hidrogenocarbonato sódico al 5%, y agua y
se secó sobre sulfato sódico. El filtrado se evaporó y el residuo se
cromatografió sobre gel de sílice usando acetato de etilo/heptano
(1/4 v/v) como eluyente. Las fracciones que contenían
Cbz-Lys(Boc)-OMe se reunieron
y se evaporaron. Rendimiento
29,1 g.
29,1 g.
TLC: Rf= 0,85, acetato de etilo/heptano= 3/1 v/v
sobre sílice.
A una disolución fría (-78ºC) de
Cbz-Lys(Boc)-OMe (29,1 g) en
diclorometano seco (800 ml) se añadió gota a gota hidruro de
diisobutilaluminio (222 ml de disolución 1M en hexano) manteniendo
la temperatura de la reacción por debajo de -70ºC. La disolución
resultante se agitó a -78ºC durante 1 hora y se añadió a la mezcla
de reacción una disolución acuosa de ácido cítrico al 5% (600 ml).
Se agitó la mezcla de las dos capas a temperatura ambiente durante
10 minutos, se separaron las capas y la capa acuosa se extrajo dos
veces con diclorometano. Las capas de diclorometano combinadas se
lavaron con agua, se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El
filtrado se agito en atmósfera de nitrógeno y se enfrió en un baño
de agua helada. Se añadió una disolución de cianuro sódico (36,3 g)
y cloruro de benciltrietil-amonio (4,2 g) en agua
(600 ml). Se añadió con agitación enérgica anhídrido acético porción
a porción (2 x 9 ml) durante un periodo de 30 minutos. La capa
orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo dos veces con
diclorometano. Las capas de diclorometano combinadas se lavaron con
agua, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se evaporaron
a vacío. El residuo se purificó por cromatografía sobre sílice
(eluyente: heptano/acetato de etilo= 1/1 v/v) para producir
Cbz-Lys(Boc)\Psi[cianoacetato]
(26,3 g).
TLC: Rf= 0,60, diclorometano/acetato de etilo=
7/3 v/v sobre sílice.
Una disolución de
Cbz-Lys(Boc)\Psi[cianoacetato]
(26,3 g) en dietiléter/metanol= 3/1 v/v (600 ml) se enfrió a -20ºC
en atmósfera de nitrógeno, y se introdujeron 66 g de cloruro de
hidrógeno gaseoso manteniendo la temperatura por debajo de -5ºC. La
mezcla de reacción se mantuvo a 4ºC toda la noche. Se añadió agua
(100 ml) gota a gota a la mezcla de reacción manteniendo la
temperatura por debajo de 5ºC. Después de agitar durante 16 h a
temperatura ambiente, la capa orgánica se separó y se lavó con agua.
La capa acuosa se saturó con cloruro sódico y se extrajo con
sec-butanol/diclorometano= 3/2 v/v. La fase orgánica
se lavó con salmuera, se seco sobre sulfato sódico, se filtró y se
evaporó a vacío para dar 25,4 g de la amina bruta. El residuo se
extrajo en N,N-dimetilformamida (400 ml), se añadió
dicarbonato de di-tert-butilo (16 g)
y se ajustó a pH 8 usando trietilamina. La mezcla de reacción se
agitó a temperatura ambiente toda la noche. El disolvente se eliminó
por evaporación a presión reducida. El residuo se disolvió en
acetato de etilo, se lavó con agua y salmuera sucesivamente, se secó
sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó a vacío. El residuo se
purificó por cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de
etilo/heptano= 4/6 v/v) para producir
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe
(15,8 g).
TLC: Rf= 0,75, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 63/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
Una disolución en agitación de
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe
(2,0 g) en dioxano/agua= 7/3 v/v (50 ml) a temperatura ambiente se
trató porción a porción con una disolución de hidróxido sódico 2M
(2,36 ml). Después de 1 hora, la mezcla de reacción se diluyó con
agua (100 ml), se añadió ácido clorhídrico 2M hasta pH 2 y se
extrajo con diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se lavaron
con agua, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se
concentraron a vacío para producir
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
(1,85 g).
TLC: Rf= 0,65, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 63/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
A una disolución en agitación de
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
(0,90 g) en N,N-dimetilformamida (10 ml) se
añadieron 1-hidroxibenzotriazole (HOBt, 444 mg),
N-metilmorfolina (0,5 ml), bencilamina (282 mg) e
hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(EDCI, 462 mg). Después de agitar durante 16 horas a temperatura
ambiente, la mezcla de reacción se vertió en agua y esta mezcla
acuosa se extrajo con acetato de etilo. El extracto de acetato de
etilo se lavó con ácido clorhídrico 1N, agua, hidrogenocarbonato
sódico acuoso al 5% y agua, se secó sobre sulfato sódico, se filtró
y se concentró a vacío para producir
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NHBzl
(1,0 g).
TLC: Rf= 0,81, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 163/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
A una disolución de
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NHBzlOH
(1,0 g) en metanol (25 ml) se añadió paladio al 10% en carbón activo
(100 mg) y ácido clorhídrico 2M (1 ml) y esta suspensión se
hidrogenó a presión atmosférica durante 1 hora a temperatura
ambiente. Se eliminó el catalizador de paladio por filtración y el
filtrado se concentró a vacío para producir
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NHBzl.HCl
(0,87 g).
TLC: Rf= 0,15, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 163/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
A una disolución en agitación de
L-\alpha-Amino-\varepsilon-caprolactama
(10 g) en dioxano/agua (2/1 v/v) (30 ml) se añadió disolución de
hidróxido sódico 1N (7,8 ml) seguido de dicarbonato de
di-t-butilo (18,8 g). La mezcla se
agitó durante 16 horas a temperatura ambiente y se concentró a
vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con agua
y salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó a
vacío. El material bruto se trituró con hexano, se filtró y se secó
a vacío para producir
N-Boc-L-\alpha-Amino-\varepsilon-caprolactama
(16 g).
TLC: Rf= 0,85, acetato de etilo/heptano 1/1 v/v
sobre sílice.
Se disolvió
N-Boc-L-\alpha-Amino-\varepsilon-caprolactama
(10 g) en diclorometano (100 ml). Se añadió lentamente a -20ºC una
disolución 1M de litio bis(trimetilsilil)amida en
tetrahidrofurano/ciclohexano 1/1 v/v (1 equivalente) y la mezcla se
agitó durante 30 minutos. Posteriormente, se añadió bromoacetato de
metilo (4 ml) y la mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura
ambiente. Se añadió litio bis(trimetilsilil)amida
adicional en tetrahidrofurano/ciclohexano 1/1 v/v para forzar que la
reacción se completase. La mezcla se diluyó con diclorometano y se
lavó con ácido clorhídrico 0,1N, agua, disolución acuosa de
hidrogenocarbonato sódico al 5% y salmuera, se secó sobre sulfato
sódico, se filtró y se evaporó a vacío. El residuo se purificó por
cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: heptano/acetato de
etilo 6/4 v/v) para producir 12 g de
Boc-norLeu(cyclo)-Gly-OMe.
TLC: Rf= 0,55, acetato de etilo/heptano 6/4 v/v
sobre sílice.
Se disolvió
Boc-norLeu(cyclo)-Gly-OMe
(3g) en TFA/diclorometano 1/1 v/v (30 ml) y se agitó durante una
hora a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a
vacío. El residuo se disolvió en diclorometano (25 ml) y se añadió
lentamente a 0ºC una disolución de bencilsulfonilcloruro (2,25 g) en
diclorometano (10 ml). Se añadió trietilamina para mantener el pH en
8 durante la reacción. La mezcla se agitó durante 1hora a
temperatura ambiente después de lo cual la muestra se concentró a
vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con
disolución de hidrogenocarbonato sódico al 5%, agua y salmuera, se
secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó a vacío. El
residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyente:
diclorometano/acetato de etilo 95/5 v/v) para producir
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-OMe
(3,9 g).
TLC: Rf= 0,40, diclorometano/acetato de etilo 9/1
v/v sobre sílice.
Una disolución de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-OMe
(3,9 g) en dioxano/agua 9/1 (100 ml) se trató a temperatura ambiente
con suficiente hidróxido sódico 1N para mantener el pH en 13 durante
2 horas. Después de acidificarla, la mezcla se vertió en agua y se
extrajo con diclorometano. La capa orgánica se lavó con agua y se
secó sobre sulfato sódico. El filtrado se concentró para producir
3,6 g del compuesto del título.
TLC: Rf= 0,60, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
A una disolución fría (0ºC) de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-OH
(340 mg) en N,N-dimetilformamida (10 ml) se
añadieron sucesivamente 1-hidroxibenzotriazol (HOBt,
203 mg) y diciclohexilcarbodiimida (DCC, 217 mg). Después de agitar
durante 30 minutos a 0ºC se añadieron
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NHBzl.HCl
(402 mg), preparado como se describió en (f), y trietilamina (0,15
ml). La mezcla se agitó a 0ºC durante una hora y después se mantuvo
a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla se enfrió a -20ºC y
se eliminó la diciclohexilurea por filtración. El filtrado se
evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se
lavó sucesivamente con ácido clorhídrico 1M, agua,
hidrogenocarbonato sódico acuoso al 5%, agua y salmuera, se secó
sobre sulfato sódico y se concentró a vacío para dar
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NHBzl
(690 mg).
TLC: Rf= 0,75, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 163/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
A una disolución de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NHBzl
(680 mg) en diclorometano seco (20 ml) se añadieron 424 mg de
periodinano (reactivo de Dess-Martin). Después de
agitación a temperatura ambiente durante una hora, se añadió
disolución acuosa de tiosulfato sódico al 2% (20ml) y disolución
acuosa de hidrogenocarbonato sódico al 5% y la mezcla se agitó
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se separó la capa
orgánica, se lavó con agua, se secó sobre sulfato sódico, se filtró
y se evaporó a vacío para dar
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[COCO]-NHBzl
bruto (561 mg).
TLC: Rf= 0,85, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 163/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
Se trató
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[COCO]-NHBzl
(560 g, bruto) con ácido trifluoracético (10 ml) y se agitó durante
una hora a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró
a vacío y el residuo se disolvió en agua y se cargó directamente en
una columna preparativa de HPLC DeltaPack
RP-C_{18}, la cual posteriormente se eluyó usando
un sistema de elución de gradiente de 20% de A / 80% de B a 20% de
A / 45% de B / 35% de C durante 45 minutos a un caudal de 80 ml/min.
Rendimiento: 287 mg de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys\Psi[COCO]-OH.
Rt(LC): 23,8 min; 20% de A / 60% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min.
A una disolución de
Boc-D-Cha-OH.H_{2}O
(21,5 g) en N,N-dimetilformamida (143 ml) a 0ºC se
añadió hidroxibenzotriazol (HOBt) (13,7 g) y
diciclohexilcarbodiimida (DCC) (15,7 g) y se agitó a 0ºC durante 30
minutos. Se disolvió H-Pro-Opac.TFA
(20 g) en 50 ml de N,N-dimetilformamida, el pH se
ajustó a 8 con trietilamina y se añadió esta disolución a la mezcla
de reacción. Ésta se dejo continuar 16 horas durante las cuales la
temperatura aumentó hasta temperatura ambiente. La mezcla se filtró,
se concentró a vacío, se disolvió en acetato de etilo, se lavó con
ácido clorhídrico 1N, agua, disolución de hidrogenocarbonato sódico
al 5% y salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se
evaporo a vacío. Rendimiento 28 g.
TLC: Rf= 0,5, diclorometano/metanol 95/5 v/v
sobre sílice.
Se disolvió
Boc-D-Cha-Pro-OPac
(3,8 g) en TFA/diclorometano 1/1 v/v (25 ml) y se agitó durante 30
minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó a
vacío. La amina bruta se disolvió en diclorometano (50 ml) y se
añadió cloruro de etano-sulfonilo (0,8 ml) a -78ºC.
Se añadió trietilamina para mantener el pH en 8 durante la reacción.
La mezcla se agitó durante 3 horas a 0ºC, después de lo cual se
añadió agua (25 ml). Después de 30 minutos de agitación adicional a
temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró a vacío. El
residuo se disolvió en éter dietílico y se lavó con ácido
clorhídrico 1N, agua, disolución de hidrogenocarbonato sódico al 5%
y salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó a
vacío. La trituración del material bruto con metanol produjo
etilSO_{2}-D-Cha-Pro-OPac
(3,0 g).
TLC: Rf= 0,6, diclorometano/metanol 95/5 v/v
sobre sílice.
A una disolución de
etilSO_{2}-D-Cha-Pro-OPac
(10 g) en tetrahidrofurano (250 ml) se añadió disolución 1M de
fluoruro de tetrabutilamonio en tetrahidrofurano (84 ml). La mezcla
de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y se
vertió en agua (1 l). La disolución acuosa se extrajo con acetato de
etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron sucesivamente con
ácido clorhídrico 1N y agua, se secaron sobre sulfato sódico y se
concentraron a vacío. El residuo se purificó por cristalización en
acetato de etilo/éter diisopropílico para producir
EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH
(6,0 g).
TLC: Rf= 0,2, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua 163/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
La copulación DCC/HOBt entre
EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH
y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe.HCl,
saponificación, oxidación de Dess-Martin,
desprotección y purificación se hicieron según los procedimientos
descritos en el ejemplo 1. Rendimiento: 163 mg del compuesto del
título.
Rt(LC): 36,35 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
Se disolvió
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe
(751) mg en 25 ml de disolución 3N de HCl/etanol y se agitó durante
4,5 horas a temperatura ambiente. La disolución de reacción se
evaporó a sequedad y se coevaporó tres veces con etanol para
producir 691 mg de
Cbz-Lys\Psi[CHOHCO]-OEt.
Este producto se disolvió en 10 ml de diclorometano seco y se añadió
dicarbonato de di-tert-butilo (425 mg). El pH de la
disolución se ajustó y se mantuvo en 8 con trietilamina y la
reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. Se añadió
agua y la capa orgánica se lavó y se secó para producir 782 mg del
producto deseado. Después de la purificación sobre sílice usando
heptano/acetato de etilo 2/3 el rendimiento final fue 696 mg.
TLC: Rf= 0,95, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua 232/31/18/7 v/v/v/v sobre sílice.
A una disolución de
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OEt
(696 mg) en etanol (25 ml) se añadió paladio al 10% en carbón activo
(100 mg) y ácido clorhídrico 2N (0,8 ml) y esta suspensión se
hidrogenó a presión atmosférica durante 50 minutos a temperatura
ambiente. El catalizador de paladio se eliminó por filtración y el
filtrado se concentró a vacío para producir
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OEt.HCl
(525 mg).
TLC: Rf= 0,17, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 232/31/18/7 v/v/v/v sobre sílice.
La copulación con
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-OH,
oxidación, desprotección y purificación se hicieron según los
procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Rendimiento: 186 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 32,46 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación entre
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-OH
y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NH_{2}.HCl
y la posterior oxidación, desprotección y purificación se hicieron
según los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 para producir 103
mg del compuesto del título.
Rt(LC): 27,50 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación DCC/HOBt entre
EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH
(270 mg) y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OEt.HCl
(268 mg), oxidación de Dess-Martín, desprotección
usando ácido trifluoracético y purificación se hicieron según los
procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Rendimiento: 41 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 40,7 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min y manteniendo esta mezcla
de eluyentes durante 10 min adicionales.
La copulación DCC/HOBt entre
EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH
(250 mg) y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NHBzl.HCl
(611 mg), oxidación de Dess-Martin, desprotección
usando ácido trifluoracético y purificación se hicieron según los
procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Rendimiento: 208 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 28,7 min. 20% de A / 60% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min.
Se usaron los procedimientos descritos en el
Ejemplo 1 para preparar el compuesto del título. Se preparó
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NH_{2}.HCl
(0,84 g) a partir de
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
(0,95 g) como se describió para
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NHBzl.HCl.
Después, la copulación DCC/HOBt entre
EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH
(189 mg) y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NH_{2}.HCl
(179 mg), oxidación de Dess-Martin, desprotección
usando ácido trifluoracético y purificación produjeron 126 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 36,3 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
Se disolvió
Cbz-Ornitina-OH.HCl (25 g) en 2 l de
N,N-dimetilformamida y se añadieron 12 ml de
trietilamina a un pH de 8,5. Se añadió gota a gota tetrafluorborato
de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(TBTU, 26,5 g) en 250 ml de N,N-dimetilformamida con
agitación enérgica. La mezcla de dejó reaccionar durante 16 horas a
temperatura ambiente mientras se ajustaba continuamente el pH a 8,5
con trietilamina. La mezcla de reacción se concentró a sequedad, se
disolvió en acetato de etilo y se lavó con ácido clorhídrico 1N,
agua, hidrogenocarbonato sódico al 5%, agua y salmuera, se secó
sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó a sequedad para
producir 11,7 g del compuesto del título.
TLC: Rf= 0,80, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 63/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
Se disolvió
(S)-3-((benciloxicarbonil)amino)-2-oxo-piperidina
(5g) en diclorometano (50 ml). Se añadió lentamente a -20ºC una
disolución 1M de
litio-bis(trimetilsilil)amida en
tetrahidrofurano/ciclohexano 1/1 v/v (20 ml, 1 equivalente) y la
mezcla se agitó durante 30 min. Se añadió posteriormente
bromoacetato de metilo (1,9 ml) y la mezcla se agitó durante 30
minutos a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con acetato de
etilo y se neutralizó con una disolución acuosa saturada de cloruro
amónico. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre
sulfato sódico, se filtró y se evaporó a vacío. El residuo se
purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyente:
diclorometano/metanol 95/5 v/v) para producir 4,7 g de
Cbz-norVal(cyclo)-Gly-OMe.
TLC: Rf= 0,38, acetato de etilo/heptano 3/1 v/v
sobre sílice.
Se disolvió
Cbz-norVal(cyclo)-Gly-OMe
(4,7 g) en 40 ml de metanol, se añadieron 500 mg de paladio al 10%
en carbón, se añadieron 7,4 ml de ácido clorhídrico 2N y se
hidrogenó a presión atmosférica durante una hora a temperatura
ambiente. La mezcla de reacción se filtró, se evaporó a vacío y se
usó inmediatamente en la siguiente etapa como
H-norVal(cyclo)-Gly-OMe.HCl.
La amina bruta se disolvió en diclorometano (50
ml) y se añadió cloruro de bencilsulfonilo (2,82 g) lentamente a
0ºC. Se añadió trietilamina para mantener el pH en 8 durante la
reacción. La mezcla se agitó durante una hora a temperatura
ambiente, después de lo cual la mezcla se lavó con agua y salmuera,
se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó a vacío. El
residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyente:
diclorometano/metanol 95/5 v/v) para producir
BzlSO_{2}-norVal(cyclo)-Gly-OMe
(2 g).
TLC: Rf= 0,87, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 63/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
La saponificación de
BzlSO_{2}-norVal(cyclo)-Gly-OMe
(2 g) se hizo según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
Rendimiento: 1,8 g.
TLC: Rf= 0,40, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 63/20/6/11 sobre sílice.
La copulación entre
BzlSO_{2}-norVal(cyclo)-Gly-OH
y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe.HCl,
saponificación, oxidación, desprotección y purificación se hicieron
según los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Rendimiento: 107
mg del compuesto del título.
Rt(LC): 24,45 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
Se preparó
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-O-i-Propil.HCl
(0,32 g) usando el procedimiento descrito para
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OEt.HCl
en el Ejemplo 3 partiendo de
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe
(0,49 g) y 2-propanol. La copulación DCC/HOBt entre
EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH
(239 mg) y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-O-i-Propil.HCl
(316 mg), oxidación de Dess-Martin, desprotección
usando ácido trifluoracético y purificación se hicieron según los
procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Rendimiento: 123 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 43,0 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min y mantener esta mezcla de
eluyentes durante 10 min adicionales.
Se usaron los procedimientos descritos en el
Ejemplo 1 para preparar el compuesto del título. Se preparó
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-Acetidina
(2,26 g) a partir de
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
(2,7 g) como se describió para
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-NHBzl.
La hidrogenación de
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-Acetidina
(269 mg) produjo
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-Acetidina.HCl
(214 mg). Después, la copulación DCC/HOBt entre
BzlSO_{2}-norVal(cyclo)-Gly-OH
(175 mg) y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-Acetidina.HCl
(214 mg), oxidación de Dess-Martin, desprotección
usando ácido trifluoracético y purificación produjeron 84 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 27,8 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-Acetidina
se preparó según los procedimientos descritos en el Ejemplo 10. La
hidrogenación, copulación de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-OH,
oxidación, desprotección y purificación también se hicieron según
los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Rendimiento: 100 mg
del compuesto del título.
Rt(LC): 33,61 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
Se disolvió
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-Acetidina
(preparado según los procedimientos descritos en el Ejemplo 10) (220
mg) en 10 ml de diclorometano/ácido trifluoracético 1/1 v/v y se
agitó durante dos horas a temperatura ambiente. Se eliminaron los
disolventes por evaporación y el residuo se trituró con dietil-éter.
Rendimiento: 267 mg.
TLC: Rf= 0,57, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 63/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
Se disolvió
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys\Psi[CHOHCO]-Acetidina.TFA
(267 mg) en 10 ml de N,N-dimetilformamida y se
añadieron 46 \mul de cloroformiato de etilo, después de lo cual el
pH se ajustó a 8,5 con trietilamina. Después de agitar durante 16
horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con
acetato de etilo, se lavó con agua, hidrogenocarbonato sódico al 5%,
ácido cítrico al 2% y salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se
filtró y se evaporó a sequedad para producir 150 mg del compuesto
del título.
TLC: Rf= 0,53, diclorometano/metanol 9/1 v/v
sobre sílice.
La oxidación y purificación de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Etoxicarbonil)\Psi[CHOHCO]-Acetidina
(150 mg) se hicieron según los procedimientos descritos en el
Ejemplo 1. Rendimiento 25 mg.
Rt(LC): 26,42 min. 20% de A / 60% de B /
20% de C a 100% de C en 40 min.
La copulación entre
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-OH
(descrito en el Ejemplo 1) y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil.HCl
(descrito en el Ejemplo 9), oxidación, desprotección y purificación
se hicieron según los procedimientos descritos en el Ejemplo 1.
Rendimiento: 400 mg del compuesto del título.
Rt(LC): 40 min. 20% de A / 80% de B a 20%
de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación DCC/HOBt entre 1,96 g de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-OH
y 2,20 g de
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe.HCl
y saponificación del producto se llevaron a cabo según los
procedimientos descritos en el ejemplo 1. Rendimiento: 3,1 g del
compuesto bruto del título.
TLC: Rf= 0,4, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 66/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
La copulación EDCI/HOBt entre 0,4 mmol de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
y 0,105 ml de isopropilamina, oxidación de Dess Martin (tiempo de
reacción 19 h) y desprotección se hicieron según los procedimientos
descritos en el ejemplo 1. Rendimiento: 150 mg del compuesto del
título.
Rt(LC): 34,01 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación EDCI/HOBt entre 0,4 mmol de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
y 0,101 ml de propilamina, oxidación de Dess Martin (tiempo de
reacción: 24 h) y desprotección se hicieron según los procedimientos
descritos en el ejemplo 1. Rendimiento: 144 mg del compuesto del
título.
Rt(LC): 34,22 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación EDCI/HOBt entre 0,4 mmol de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
y metilamina (0,4 ml de una disolución 3M en
N,N-dimetilformamida), oxidación de Dess Martin
(tiempo de reacción: 20 h) y desprotección se hicieron según los
procedimientos descritos en el ejemplo 1. Rendimiento: 127 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 28,36 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A/ 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación EDCI/HOBt entre 0,4 mmol de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
y 0,102 ml de pirrolidina, oxidación de Dess Martin (tiempo de
reacción: 14 días) y desprotección se hicieron según los
procedimientos descritos en el ejemplo 1. Rendimiento: 125 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 36,87 y 37,38 min. 20% de A / 80%
de B a 20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación EDCI/HOBt entre 0,4 mmol de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
y etilamina (1,78 ml de una disolución 0,7M en
N,N-dimetilformamida), oxidación de Dess Martin
(tiempo de reacción: 20 h) y desprotección se hicieron según los
procedimientos descritos en el ejemplo 1. Rendimiento: 115 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 31,30 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación EDCI/HOBt entre 0,4 mmol de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
y 0,107 ml de morfolina, oxidación de Dess Martin (tiempo de
reacción: 6,5 días) y desprotección se hicieron según los
procedimientos descritos en el ejemplo 1. Rendimiento: 148 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 33,73 y 34,17 min. 20% de A / 80%
de B a 20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
A una disolución de 2,47 g de tiomorfolina en 25
ml de metanol se añadieron 5,75 g de dicarbonato de
di-tert-butilo y 4 ml de
trietilamina. Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 h,
se añadieron 50 ml de acetato de etilo y esta disolución se lavó con
agua ajustada a pH 3 con ácido clorhídrico, agua, hidrogenocarbonato
sódico acuoso al 5% y salmuera, se secó sobre sulfato magnésico y se
concentró para dar 4,73 g de
N-tert-butiloxicarbonil
tiomorfolina. Este residuo (4,73 g) se disolvió en 50 ml de
diclorometano y se añadieron 50 ml de agua. A esta mezcla en
agitación se añadieron 11 g de ácido
3-cloroperoxibenzoico (pureza
80-90%) en pequeñas porciones, manteniendo la mezcla
de reacción a pH 7. Después de agitar a temperatura ambiente durante
16 h, se separó la capa acuosa, la capa orgánica se lavó con
tiosulfato sódico acuoso al 5%, hidrogenocarbonato sódico acuoso al
5% (tres veces) y salmuera, se secó sobre sulfato magnésico y se
concentró. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de
sílice (eluyente: acetato de etilo/heptanos 2/3 v/v) para dar 5,7 g
de N-tert-butiloxicarbonil
tiomorfolina 1,1-dióxido. Esta sulfona (0,625 g) se
disolvió en 50 ml de una disolución de cloruro de hidrógeno 3 M en
dioxano y después de agitar durante 4 h a temperatura ambiente la
mezcla de reacción se concentró para dar 0,579 de hidrocloruro de
tiomorfolina 1,1-dióxido.
La copulación EDCI/HOBt entre 0,4 mmol de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
y 0,21 g de hidrocloruro de tiomorfolina
1,1-dióxido, oxidación de Dess Martin (tiempo de
reacción: 3 días) y desprotección se hicieron según los
procedimientos descritos en el ejemplo 1. Rendimiento: 180 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 33,64 min: 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación EDCI/HOBt entre 0,4 mmol de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
y 0,12 g de N,O-dimetilhidroxilamina, oxidación de
Dess Martin (tiempo de reacción: 3,5 días) y desprotección se
hicieron según los procedimientos descritos en el ejemplo 1.
Rendimiento: 136 mg del compuesto del título.
Rt(LC): 33.80 y 34,53 min. 20% de A / 80%
de B a 20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación DCC/HOBt entre 1,13 g de ácido
N-tert-butiloxicarbonil-L-acetidina-2-carboxílico
y 1,38 g de cloruro amónico se llevó a cabo como se describió en el
ejemplo 1 para dar 0,468 g de
N-tert-butiloxicarbonil-L-acetidina-2-carboxamida.
Esta amida (0,224 g) se disolvió en 5 ml de disolución 3M de
cloruro de hidrógeno en dioxano. Después de agitar durante 3 horas a
temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró para dar
0,17 g de hidrocloruro de
acetidina-2-carboxamida.
La copulación EDCI/HOBt entre 0,4 mmol de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OH
y 0,17 g de hidrocloruro de
acetidina-2-carboxamida, oxidación
de Dess Martin (tiempo de reacción: 20 h) y desprotección se
hicieron según los procedimientos descritos en el ejemplo 1.
Rendimiento: 58 mg del compuesto del título.
Rt(LC): 26,43 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
A una disolución en agitación de 11,64 g de
Boc-D-Cha-OH en 100
ml de diclorometano a 0ºC se añadieron 6,36 g de HOBt y 9,72 g de
DCC. Después de 20 minutos, se añadió una disolución de 10,35 g de
H-Pro-OBzl.HCl en 40 ml de
diclorometano ajustada a pH 8 con
N,N-diisopropil-etilamina. Después
de 16 h, se filtró la mezcla de reacción y el filtrado se lavó
sucesivamente con agua, ácido clorhídrico 0,1 N, agua,
hidrogenocarbonato sódico acuoso al 5% y salmuera. Todo los lavados
acuosos se extrajeron dos veces con acetato de etilo, se combinaron
todos los extractos orgánicos, se secaron sobre sulfato sódico y se
concentraron. Se añadió al residuo una mezcla de acetato de
etilo/heptanos= 1/1 (v/v), se filtró la suspensión resultante y el
filtrado se purifico por cromatografía sobre gel de sílice
(eluyente: acetato de etilo/heptanos= 1/1 v/v) para producir 19,34 g
de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl.
TLC: Rf= 0,8, diclorometano/metanol= 9/1 v/v
sobre sílice.
Boc-D-Cha-Pro-OBzl
(1,01 g) se disolvió en 42 ml de una disolución de cloruro de
hidrógeno 3M en dioxano. Después de agitar durante 2 horas a
temperatura ambiente, se concentró la mezcla de reacción. El residuo
se disolvió en 35 ml de diclorometano y se enfrió a 0ºC. A esta
disolución en agitación se añadieron 0,22 ml de cloruro de
1-propanosulfonilo y se ajustó el pH a 8,5. Después de agitar durante 24 h a temperatura ambiente, se concentró la mezcla de reacción. El residuo se disolvió en acetato de etilo, se lavó sucesivamente con hidrogenocarbonato sódico acuoso al 5%, agua, ácido cítrico acuoso al 5% y salmuera, se secó sobre sulfato magnésico y se concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: acetato de etilo/heptanos= 1/1 v/v) para producir 0,85 g
de nPropilSO_{2}-D-Cha-Pro-OBzl.
1-propanosulfonilo y se ajustó el pH a 8,5. Después de agitar durante 24 h a temperatura ambiente, se concentró la mezcla de reacción. El residuo se disolvió en acetato de etilo, se lavó sucesivamente con hidrogenocarbonato sódico acuoso al 5%, agua, ácido cítrico acuoso al 5% y salmuera, se secó sobre sulfato magnésico y se concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: acetato de etilo/heptanos= 1/1 v/v) para producir 0,85 g
de nPropilSO_{2}-D-Cha-Pro-OBzl.
TLC: Rf= 0,6, acetato de etilo/heptanos= 1/1 v/v
sobre sílice.
nPropilSO_{2}-D-Cha-Pro-OBzl
(0,85 g) se hidrogenó usando el procedimiento descrito en el ejemplo
1 para dar 0,54 g de
nPropilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH.
La copulación DCC/HOBt de 225 mg de
nPropilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH
y de
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil.HCl
y la oxidación de Dess Martin se llevaron a cabo según los
procedimientos descritos en el ejemplo 9. El grupo Boc se eliminó
usando una disolución 3M de cloruro de hidrógeno en dioxano como se
describió anteriormente y el producto bruto se purificó usando el
método de HPLC preparativo descrito en el ejemplo 1. Rendimiento: 47
mg del compuesto del título.
Rt(LC): 27,6 min. 20% de A / 60% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min, después a 100% de C en 10
min.
El compuesto del título se preparó a partir de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl
y cloruro de (-)-10-canforsulfonilo
usando los procedimientos descritos en el ejemplo 23. Rendimiento:
12% a partir de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl.
Rt(LC): 33,6 min. 20% de A / 60% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min, después a 100% de C en 10
min.
El compuesto del título se preparó a partir de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl
y cloruro de bencen-sulfonilo usando los
procedimientos descritos en el ejemplo 23. Rendimiento: 9% a partir
de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl.
Rt(LC): 29,3 min. 20% de A / 60% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min, después a 100% de C en 10
min.
El compuesto del título se preparó a partir de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl
y cloruro de metano-sulfonilo usando los
procedimientos descritos en el ejemplo 23. Rendimiento: 18% a partir
de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl.
Rt(LC): 24,3 min. 20% de A / 60% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min, después a 100% de C en 10
min.
El compuesto del título se preparó a partir de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl
y cloruro de isopropil-sulfonilo usando los
procedimientos descritos en el ejemplo 23. Rendimiento: 2% a partir
de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl.
Rt(LC): 26,8 min. 20% de A / 60% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min, después a 100% de C en 10
min.
El compuesto del título se preparó a partir de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl
y cloruro de
\alpha-toluen-sulfonilo usando los
procedimientos descritos en el ejemplo 23. Rendimiento: 11% a partir
de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl.
Rt(LC): 30,4 min. 20% de A / 60% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min, después a 100% de C en 10
min.
El compuesto del título se preparó a partir de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl
y cloruro de 1-butano-sulfonilo
usando los procedimientos descritos en el ejemplo 23. Rendimiento:
29% a partir de
Boc-D-Cha-Pro-OBzl.
Rt(LC): 29,3 min. 20% de A / 60% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min, después a 100% de C en 10
min.
La copulación DCC/HOBt de 151 mg de ácido
[3-(bencilsulfonilamino)-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridinil]-acético
(WO 97/01338) y 205 mg de
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil.HCl,
oxidación de Dess Martin, desprotección y purificación se llevaron a
cabo según los procedimientos descritos en el ejemplo 9 para dar 91
mg del compuesto del título.
Rt(LC): 34,7 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación DCC/HOBt de 178 mg de ácido
[3-(bencilsulfonilamino)-2-oxo-1,2-dihidropiridinil]-acético
(WO 97/46207) y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil.HCl
y la oxidación de Dess Martin se llevaron a cabo según los
procedimientos descritos en el ejemplo 9. La desprotección usando
cloruro de hidrógeno en dioxano y la purificación se llevaron a cabo
según los procedimientos descritos en el ejemplo 23 para dar 116 mg
del compuesto del título.
Rt(LC): 32,4 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación DCC/HOBt de 286 mg de ácido
[3-(bencilsulfonilamino)-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridinil]-acético
(WO 97/01338) y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe.HCl,
según los procedimientos descritos en el ejemplo 1 produjo 0,51 g de
[3-(bencilsulfonilamino)-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridinil]-acetil-Lys\Psi[CHOHCO]
-OMe. La saponificación de este éster metílico, la copulación
EDCI/HOBt con cloruro amónico, la oxidación de Dess Martin, la
desprotección y purificación se llevaron a cabo según los
procedimientos descritos en el ejemplo 14 para dar 76 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 26,9 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
A una disolución en agitación de 0,5 g de
H-Aad(OtBu)-OH en 4,4 ml de
hidróxido sódico acuoso 1N se añadieron 0,42 g de cloruro de
bencil-sulfonilo en 2 ml de dioxano. Después de 16
horas a temperatura ambiente, se añadieron 1,4 ml de hidróxido
sódico acuoso 2N, 0,5 ml de dioxano y 0,09 g de cloruro de
bencil-sulfonilo adicionales, y la mezcla de
reacción se agitó durante un día adicional. Se eliminó el dioxano,
se añadió agua, la mezcla se hizo ácida (pH 3) usando ácido
clorhídrico y se extrajo dos veces con éter dietílico. Las capas
éter combinadas se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron
para dar 235 mg de
BzlSO_{2}-Aad(OtBu)-OH.
TLC: Rf= 0,7, diclorometano/metanol/agua= 14/6/1
v/v/v sobre sílice.
La copulación DCC/HOBt de 235 mg de
BzlSO_{2}-Aad(OtBu)-OH y
168 mg de H-Pro-OBzl.HCl seguida por
hidrogenación como se describió en el ejemplo 23 produjo 193 mg del
compuesto del título.
TLC: Rf= 0,6, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 163/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
La copulación DCC/HOBt de 193 mg de
BzlSO_{2}-Aad(OtBu)-Pro-OH
y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe.HCl,
saponificación, oxidación de Dess Martin, desprotección y
purificación se llevaron a cabo según los procedimientos descritos
en el ejemplo 32 para dar 85 mg del compuesto del título.
Rt(LC): 26,1 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
Partiendo de
H-Glu(OtBu)-OH según la ruta
descrita en el ejemplo 33 dio el compuesto del título. Rendimiento:
3% a partir de
H-Glu(OtBu)-OH.
Rt(LC): 22,6 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
Partiendo de
H-Asp(OtBu)-OH según la ruta
descrita en el ejemplo 33 dio el compuesto del título. Rendimiento:
18% a partir de
H-Asp(OtBu)-OH.
Rt(LC): 21,9 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación DCC/HOBt de 2,22 g de
Boc-D-Tyr(Me)-OH
y 2,0 g de H-Pro-OBzl.HCl,
eliminación del grupo protector Boc, sulfonilación usando cloruro de
etano-sulfonilo e hidrogenación del éster bencílico
usando los procedimientos descritos en el ejemplo 23 produjo 1,0 g
del compuesto del título.
TLC: Rf= 0,23, diclorometano/metanol= 95/5 v/v
sobre sílice
La copulación DCC/HOBt de 254 mg de
EtSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-OH
y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe.HCl,
saponificación, copulación EDCI/HOBt con cloruro amónico, oxidación
de Dess Martin, desprotección y purificación se llevaron a cabo
según los procedimientos descritos en el ejemplo 32 para dar 83 mg
del compuesto del título.
Rt(LC): 28,0 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación DCC/HOBt de 0,51 g de
EtSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-OH
y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil.HCl,
oxidación de Dess Martin, desprotección y purificación se llevaron a
cabo según los procedimientos descritos en el ejemplo 9 para dar 223
mg del compuesto del título.
Rt(LC): 36,5 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
La copulación DCC/HOBt de 307 mg de
EtSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-OH
y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-Acetidina.HCl,
oxidación de Dess Martin, desprotección y purificación se llevaron a
cabo según los procedimientos descritos en el ejemplo 10 para dar 83
mg del compuesto del título.
Rt(LC): 36,4 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
El compuesto del título (43 mg) se obtuvo como
producto secundario en la purificación del ejemplo 38.
Rt(LC): 38,1 min. 20% de A / 80% de B a
20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
Eliminación del grupo Boc de 1,5 g de
Boc-D-Dpa-Pro-OBzl
(WO 97/31937), reacción con cloruro de
bencil-sulfonilo y eliminación del éster bencílico
según los procedimientos descritos en el ejemplo 23 para producir
1,0 g del compuesto del título.
TLC: Rf= 0,63, acetato de etilo/piridina/ácido
acético/agua= 163/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice
La copulación DCC/HOBt de 0,31 g de
BzlSO_{2}-D-Dpa-Pro-OH
y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil.HCl,
oxidación de Dess Martin, desprotección y purificación se llevaron a
cabo según los procedimientos descritos en el ejemplo 9 para dar 50
mg del compuesto del título.
Rt(LC): 32,2 min. 20% de A / 80% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min, después a 100% de C en 10
min.
Una disolución en agitación de 3,0 g de
H-Leu-OMe.HCl en 30 ml de
diclorometano se ajustó a pH 8 usando trietilamina y se enfrió a
0ºC. Después se añadieron 3,2 ml de cloruro de
etano-sulfonilo y 2,3 ml de trietilamina. Después de
agitar durante 16 h a temperatura ambiente la mezcla de reacción se
lavó sucesivamente con ácido clorhídrico 0,5 N,
agua e hidrogenocarbonato sódico acuoso al 5% y se concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol= 9/1 v/v) para producir 3,3 g de EtSO_{2}-Leu-OMe.
agua e hidrogenocarbonato sódico acuoso al 5% y se concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol= 9/1 v/v) para producir 3,3 g de EtSO_{2}-Leu-OMe.
TLC: Rf= 0,69, diclorometano/acetato de etilo=
9/1 v/v sobre sílice.
EtSO_{2}-Leu-OMe
(3,3 g) se saponificó (procedimiento del ejemplo 1), se copuló con
H-Pro-OBzl (procedimiento del
ejemplo 23) y el dipéptido resultante se hidrogenó (procedimiento
del ejemplo 23) usando los procedimientos indicados para dar 3,4 g
del compuesto del título.
TLC: Rf= 0,11, diclorometano/acetato de etilo=
9/1 v/v sobre sílice
La copulación DCC/HOBt de 145 mg de
EtSO_{2}-Leu-Pro-OH
y
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil.HCl,
oxidación de Dess Martin, desprotección y purificación se llevaron
a cabo según los procedimientos descritos en el ejemplo 23 para dar
120 mg del compuesto del título.
Rt(LC): 16,6 min. 20% de A / 60% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min.
A una disolución del éster metílico del ácido
3-[4-(1,1-dimetiletoxicarbonilamino)ciclohexil]-2-hidroxi-3-nitropropiónico
(Lyle et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 7,
67-72(1997)) (294 mg) en metanol (100 ml) se
añadió ácido clorhídrico 2N (0,425 ml) y paladio al 10% en polvo de
carbón activo (0,45 g) y esta suspensión se hidrogenó a presión
atmosférica a temperatura ambiente durante 16 horas. El catalizador
de paladio se eliminó por filtración y el disolvente se eliminó por
evaporación a presión reducida produciendo
H-Acg(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe.HCl
(289 mg) como una mezcla de diasteroisómeros.
TLC: Rf= 0,26, gel de sílice, acetato de
etilo/piridina/ácido acético/agua= 232/31/18/7 v/v/v/v.
La copulación DCC/HOBt entre 0,27 g de
BzlSO_{2}-norLeu(cyclo)-Gly-OH
y 0,25 g de
H-Acg(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe.HCl,
saponificación, copulación EDCI/HOBt con hidrocloruro de acetidina,
oxidación de Dess Martin y desprotección se hicieron según los
procedimientos descritos en el ejemplo 1. Rendimiento: 82 mg del
compuesto del título.
Rt(LC): 34,8 y 35,4 min. 20% de A / 80% de
B a 20% de A / 20% de B / 60% de C en 40 min.
Una disolución en agitación de 0,34 g de
H-Acg(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe.HCl
en 10 ml de acetonitrilo y 10 ml de
N,N-dimetilformamida se ajusta a pH 8 usando
N,N-diisopropiletilamina. A esta disolución se
añadieron 0,24 g de
N-benciloxicarboniloxisuccinimida. Después de
agitación a temperatura ambiente durante una hora se concentró la
mezcla de reacción. El residuo se disolvió en acetato de etilo, se
lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato sódico y se
concentró. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de
sílice (eluyente: acetato de etilo/heptanos 2/3 v/v) para dar 0,287
mg de
Cbz-Acg(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe.
TLC: Rf= 0,25, acetato de etilo/heptanos= 1/1 v/v
sobre sílice
A una mezcla en agitación de 5 ml de
tetrahidrofurano y 1 ml de 2-propanol en atmósfera
de nitrógeno se añadieron lentamente 2,5 ml de disolución 1,6 N de
n-butil-litio en hexanos. Después de
20 minutos, se añadió una disolución de 0,28 g de
Cbz-Acg(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe
en 5 ml de 2-propanol y se agitó durante 2 h a
temperatura ambiente. Después se añadieron 0,5 ml de ácido acético y
se concentró la mezcla de reacción. El residuo se disolvió en
acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato sódico y
se concentró. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de
sílice (eluyente: acetato de etilo/heptanos 2/3 v/v) para dar 0,223
mg de
Cbz-Acg(Boc)\Psi[CHOHCO]-OiPropil.
TLC: Rf= 0,25, acetato de etilo/heptanos= 1/2 v/v
sobre sílice
A una disolución de 0,22 g de
Cbz-Acg(Boc)\Psi[CHOHCO]-OiPropil
en N,N-dimetilformamida se añadió paladio al 10% en
carbón activo (80 mg) y ácido clorhídrico 2 M (0,23 ml) y esta
suspensión se hidrogenó a presión atmosférica durante 1 hora a
temperatura ambiente. El catalizador de paladio se eliminó por
filtración. Este filtrado se usó en una copulación DCC/HOBt con
0,166 g de
EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH
usando el procedimiento descrito en el ejemplo 1. El producto se
oxidó usando el reactivo de Dess Martin, se eliminó el grupo Boc y
se purificó usando los procedimientos descritos en el ejemplo 1.
Rendimiento: 100 mg del compuesto del título.
Rt(LC): 30,0 min. 20% de A / 60% de B /
20% de C a 20% de A / 80% de C en 30 min.
Cbz-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe
(10 g) se hidrogenó en las condiciones descritas en el ejemplo 1f
para dar
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe con rendimiento cuantitativo. El producto bruto se trató con 2-(trimetilsilil)etoxicarbonil-hidroxi-succinimida (6,7 g) en N,N-dimetilformamida (100 ml) en presencia de N,N-diisopropiletilamina (pH= 8) durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con ácido cítrico acuoso al 2%, agua, hidrogenocarbonato sódico acuoso al 5% y salmuera. El secado sobre sulfato sódico y la evaporación del disolvente dieron, después de cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano= 1/1 v/v), Teoc-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe (9,1 g). La transesterificación posterior se realizó añadiendo gota a gota Teoc-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe (2,8 g) a una mezcla en agitación de alcohol isopropílico (5,4 ml), THF (27,1 ml) y n-butil-litio 1,6 M en hexano (13,6 ml) a temperatura ambiente. Después de 1 hora, la mezcla de reacción se enfrió a 0ºC y se añadió ácido acético glacial (2,5 ml). La mezcla de reacción se concentró a un pequeño volumen y se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua (2x) y se secó sobre sulfato sódico. La filtración y eliminación del disolvente a vacío dio el producto bruto. La cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano= 1/1 v/v) dio el compuesto del título (2,9 g).
H-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe con rendimiento cuantitativo. El producto bruto se trató con 2-(trimetilsilil)etoxicarbonil-hidroxi-succinimida (6,7 g) en N,N-dimetilformamida (100 ml) en presencia de N,N-diisopropiletilamina (pH= 8) durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con ácido cítrico acuoso al 2%, agua, hidrogenocarbonato sódico acuoso al 5% y salmuera. El secado sobre sulfato sódico y la evaporación del disolvente dieron, después de cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano= 1/1 v/v), Teoc-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe (9,1 g). La transesterificación posterior se realizó añadiendo gota a gota Teoc-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-OMe (2,8 g) a una mezcla en agitación de alcohol isopropílico (5,4 ml), THF (27,1 ml) y n-butil-litio 1,6 M en hexano (13,6 ml) a temperatura ambiente. Después de 1 hora, la mezcla de reacción se enfrió a 0ºC y se añadió ácido acético glacial (2,5 ml). La mezcla de reacción se concentró a un pequeño volumen y se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua (2x) y se secó sobre sulfato sódico. La filtración y eliminación del disolvente a vacío dio el producto bruto. La cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano= 1/1 v/v) dio el compuesto del título (2,9 g).
TLC: Rf= 0,53, heptano/acetato de etilo 1/1 v/v
en sílice.
Teoc-Lys(Boc)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil
(2,8 g) se disolvió en éter dietílico (36 ml) y ácido
para-toluen-sulfónico (1,8 g).
Después de 2 horas a 30ºC la mezcla de reacción se evaporó y el
residuo se secó a vacío para dar
Teoc-Lys\Psi[CHOHCO]-O-iPropil.
A una suspensión de 4,2 g de resina
hidroximetílica (Bachem, 1,02 mmol/g) en 50 ml de
acetonitrilo/diclorometano (1/1 v/v) y trietilamina (1,81 ml) se
añadió carbonato de N,N-disuccinimidilo (3,36 g). La
suspensión se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente en un
agitador orbital. La resina se separó por filtración y se lavó con
diclorometano, acetonitrilo y diclorometano (tres veces con cada
uno) y se secó.
Teoc-Lys\Psi[CHOHCO]-O-iPropil
(véase anteriormente) se disolvió en 50 ml de
acetonitrilo/diclorometano (1/1 v/v). El pH de la disolución se
ajustó a 8 usando trietilamina. Esta disolución se añadió a la
resina y la suspensión se agitó durante 16 horas a temperatura
ambiente. El disolvente se eliminó por filtración y la resina se
lavó según los procedimientos descritos anteriormente. Después del
secado a vacío, se obtuvieron 5,43 g de
Teoc-Lys(CO-O-metil-resina)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil.
Se agitó una suspensión de 2,5 g de
Teoc-Lys(CO-O-metil-resina)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil
en ácido trifluoracético/diclorometano (50 ml, 1/9 v/v) durante 45
min a temperatura ambiente. La resina se lavó minuciosamente con
diclorometano y se secó a alto vacío para dar
H-Lys(CO-O-metil-resina)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil
(2,5 g).
H-Lys(CO-O-metil-resina)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil
se dividió en cuatro reactores en porciones de 500 mg. La resina se
lavó con disolución al 1% de
N,N-diisopropiletilamina en
diclorometano/N,N-dimetilformamida (3/2 v/v) y
diclorometano (tres veces con cada uno). A continuación, se
añadieron a la resina 10 ml de
diclorometano/N,N-dimetilformamida (3/2 v/v) seguido
por la unidad Boc-X-OH (139 mg de
Boc-D-Leu-OH, 139 mg
de Boc-Leu-OH, 148 mg de
Boc-Gln-OH o 159 mg de
Boc-Phe-OH), tetrafluorborato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(TBTU, 193 mg) y N,N-diisopropiletilamina (105
\mul). La suspensión se agitó durante 90 min a temperatura
ambiente, después de lo cual se eliminó el disolvente por
filtración. La resina se lavó con
diclorometano/N,N-dimetilformamida (3/2 v/v),
N,N-dimetilformamida y diclorometano (tres veces con
cada uno) y se secó.
El grupo Boc de las cuatro unidades X diferentes
se eliminó en las mismas condiciones que las descritas para la
desprotección del grupo Teoc (véase el ejemplo 44c) para dar cuatro
veces 500 mg de
H-X-Lys(CO-O-metil-resina)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil.
Esta resina (500 mg) se distribuyó en cinco vasos de reacción.
La copulación de la segunda unidad
EtSO_{2}-B-OH (27,0 mg de
EtSO_{2}-Asn-OH, 26,8 mg de
EtSO_{2}-D-Leu-OH,
30,8 mg de
EtSO_{2}-D-Phe-OH,
36,8 mg de EtSO_{2}-Nal-OH y 32,4
mg de
EtSO_{2}-D-3-Tiq-OH,
preparados según los métodos descritos en el ejemplo 41) se llevó a
cabo en las mismas condiciones descritas en el procedimiento (d),
sobre la base de 100 mg de resina. Después de la elaboración, los 20
vasos de reacción (resultantes de cuatro unidades X diferentes y
cinco unidades B diferentes) se secaron a vacío.
EtSO_{2}-B-X-Lys(CO-O-metil-resina)\Psi[CHOHCO]-O-iPropil
(100 mg) se hinchó en una disolución de
1-hidroxi-1,2-benciodoxol-3(1H)-ona-1-óxido
(0,18 M) en dimetilsulfóxido (2 ml) y diclorometano (0,2 ml). La
mezcla de reacción se dejo en agitación toda la noche a temperatura
ambiente, después de lo cual el disolvente se eliminó por
filtración. El lavado posterior con dimetilsulfóxido y diclorometano
(tres veces con cada uno) dio, después de secado,
EtSO_{2}-B-X-Lys(CO-O-metil-resina)\Psi[COCO]-O-iPropil.
Se añadió una disolución de ácido
trifluoracético/tioanisol (2 ml, 10/1 v/v) a
EtSO_{2}-B-X-Lys(CO-O-metil-resina)\Psi[COCO]-O-iPropil
(100 mg) y la mezcla de reacción se agitó durante 4 horas a
temperatura ambiente. La resina se filtró, se lavó con ácido
trifluoracético (tres veces) después de lo cual el filtrado se
evaporó a sequedad a vacío. El residuo se enjuagó con heptano (2 ml)
y se agitó vigorosamente, después de lo cual se decantó la capa de
heptano. Este procedimiento se repitió dos veces. El producto bruto
se secó y se aplicó directamente en una columna preparativa
Supelcosil C18DB (21 x 250 mm) para purificación, usando las
siguientes condiciones: flujo: 20 ml/min; tampones A: ácido
trifluoracético acuoso 0,1 M, B: agua, C: acetonitrilo/agua 6/4 v/v;
gradiente (dependiendo de la polaridad del producto) 3% de A - 67%
de B - 30% de C a 3% de A - 52% de B - 45% de C en 40 min. Detección
UV a 210 nm. Los picos principales, correspondientes a los
productos deseados, se aislaron y liofilizaron para dar los
productos purificados finales como se describe en la tabla 44.
\newpage
Tabla
44
Caracterización (tiempos de retención en HPLC de
fase reversa y pico M+H en espectrometría de masas por
electro-nebulización) de
EtSO_{2}-B-X-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
preparado sobre resina hidoximetílica. Condiciones de HPLC: flujo:
1,0 ml/min; tampones A: agua, B: acetonitrilo/agua (6/4 v/v), C:
tampón fosfato 0,5 M de pH 2,1; gradiente: 0 \rightarrow 45
minutos 65% de A / 15% de B / 20% de C \rightarrow 0% de A / 80%
de B / 20% de C. Detección UV a 210 nm.
Los siguientes compuestos se pueden preparar
usando los métodos de la presente invención:
CF_{3}SO_{2}-D-Cha-Pro-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
MeSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
n-ButilSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
CF_{3}SO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
BzlSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-(p-OEt-Phe)-Pro-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Nle-Pro-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-Azt-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-(N-ciclopentil-Gly)-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-Val-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-Pec-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-(3,4-dehidro-Pro)-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-Pro-Lys\Psi[COCO]-Acetidina
MeSO_{2}-D-Cha-Pro-Lys\Psi[COCO]-Acetidina
n-ButilSO_{2}-D-Cha-Pro-Lys\Psi[COCO]-Acetidina
CF_{3}SO2-D-Cha-Pro-Lys\Psi[COCO]-Acetidina
BzlSO_{2}-D-Cha-Pro-Lys\Psi[COCO]-Acetidina
[3-(BzlSO_{2}amino)-2-oxo-1,2-dihidropiridinil]-acetil-Lys\Psi[COCO]-Acetidina
[3-(BzlSO_{2}amino)-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridinil]-acetil-Lys\Psi[COCO]-Acetidina
MeSO_{2}-D-Cha-Pro-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
n-ButilSO_{2}-D-Cha-Pro-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
CF_{3}SO_{2}-D-Cha-Pro-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
BzlSO_{2}-D-Cha-Pro-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
MeSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
n-ButilSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
CF_{3}SO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
BzlSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Tyr(Et)-Pro-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Nle-Pro-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-Azt-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-(N-ciclopentil-Gly)-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-Val-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-Pec-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-(3,4-dehidro-Pro)-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
EtSO_{2}-D-Cha-Pro-Acg\Psi[COCO]-Acetidina
EtSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-Acg\Psi[COCO]-Acetidina
EtSO_{2}-D-Tyr(Me)-Pro-Acg\Psi[COCO]-NH_{2}
MeSO_{2}-D-Cha-Pro-Acg\Psi[COCO]-Acetidina
n-ButilSO_{2}-D-Cha-Pro-Acg\Psi[COCO]-Acetidina
CF_{3}SO_{2}-D-Cha-Pro-Acg\Psi[COCO]-Acetidina
BzlSO_{2}-D-Cha-Pro-Acg\Psi[COCO]-Acetidina
3-(BzlSO_{2}-amino)-1-carboximetil-piridin-2-ona-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
3-(BzlSO_{2}-amino)-1-carboximetil-piridin-2-ona-Acg\Psi[COCO]-Acetidina
3-(BzlSO_{2}-amino)-1-carboximetil-6-metil-piridin-2-ona-Acg\Psi[COCO]-O-iPropil
3-(BzlSO_{2}-amino)-1-carboximetil-6-metil-piridin-2-ona-Acg\Psi[COCO]-Acetidina
Las actividades biológicas de los compuestos de
la presente invención se determinaron por los siguientes métodos de
ensayo.
La trombina (Factor IIa) es un factor en la
cascada de la coagulación.
La actividad anti-trombina de los
compuestos de la presente invención se calculó midiendo
espectrofotométricamente la velocidad de la hidrólisis ejercida por
la trombina del sustrato cromogénico s-2238. Este
ensayo para la actividad anti-trombina en un sistema
tamponado se usó para calcular el valor IC_{50} del compuesto de
ensayo.
| Medio de ensayo: Tampón trometamina-NaCl-polietilen-glicol 6000 (TNP). | ||
| Compuesto de referencia: I2581 (Kabi). | ||
| Vehículo: | Tampón TNP. | |
| \begin{minipage}[t]{138mm} La solubilización se puede ayudar con dimetilsulfóxido, metanol, etanol, acetonitrilo o alcohol tert-butílico que no tienen efectos adversos en concentraciones hasta 2,5% en la mezcla final de reacción.\end{minipage} | ||
| Técnica | Reactivos* | |
| 1. | Tampón trometamina-NaCl(TN) | |
| Composición del tampón: | ||
| \hskip0,5cm Trometamina (Tris) 6,057 g (50 mmol) | ||
| \hskip0,5cm NaCl \hskip1,9cm 5,844 g (100 mmol) | ||
| \hskip0,5cm Agua hasta \hskip1,1cm 1 \hskip0,5cm l | ||
| El pH de la disolución se ajustó a 7,4 a 37ºC con HCl (10 mmol l^{-1}) | ||
| 2. | Tampón TNP | |
| \begin{minipage}[t]{131mm} Se disuelve polietilenglicol 6000 en el tampón TN para obtener una concentración de 3 g\cdotl^{-1}.\end{minipage} | ||
| 3. | Disolución de S-2238. | |
| \begin{minipage}[t]{131mm} Se disuelve un vial de S-2238 (25 mg; Kabi Diagnostica, Suecia) en 20ml de tampón TN para dar una concentración de 1,25 mg\cdotml^{-1} (2 mmol\cdotl^{-1}).\end{minipage} | ||
| 4. | Disolución de trombina. | |
| \begin{minipage}[t]{131mm} Se disuelve trombina humana (16.000 nKat\cdotvial^{-1}, Centraal Laboratorium voor Bloedtransfusie, Ámsterdam, Países Bajos) en tampón TNP para obtener una disolución de trabajo de 835 nKat\cdotml^{-1}. Inmediatamente antes de usar esta disolución se diluye con tampón TNP para obtener una concentración de 3,34 nKat\cdotml^{-1}.\end{minipage} | ||
| * | - Todos los ingredientes usados son de calidad analítica. | |
| - Para las disoluciones acuosas se usa agua ultrapura (calidad Milli-Q). |
Los compuestos de ensayo y de referencia se
disolvieron en agua Milli-Q para obtener
concentraciones de trabajo de 10^{-2} mol\cdotl^{-1}. Cada
concentración se diluyó paso a paso con el vehículo para obtener
concentraciones de 10^{-3}, 10^{-4} y 10^{-5}
mol\cdotl^{-1}. Las diluciones, incluyendo la disolución de
trabajo, se usaron en el ensayo (concentraciones finales en la
mezcla de reacción: 3\cdot10^{-3}; 10^{-3}; 3\cdot10^{-4};
10^{-4}; 3\cdot 10^{-5}; 10^{-5}; 3\cdot10^{-6} y
10^{-6} mol\cdotl^{-1}, respectivamente).
A temperatura ambiente, se pipetean
alternativamente 0,075 ml y 0,025 ml de las disoluciones del
compuesto de ensayo o del compuesto de referencia o del vehículo en
los pocillos de una placa de microtitulación y estas disoluciones se
diluyen con 0,115 ml y 0,0165 ml de tampón TNP, respectivamente. Se
añade a cada pocillo una alícuota de 0,030 ml de disolución de
S-223 y la placa se pre-calienta y
pre-incuba con agitación en un incubador (Amersham)
durante 10 min a 37ºC. Después de la pre-incubación,
se comienza la hidrólisis de S-2238 por adición de
0,030 ml de disolución de trombina a cada pocillo. La placa se
incuba (con agitación durante 30 s) a 37ºC. Comenzando después de un
minuto de incubación, se mide la absorbancia de cada muestra a 405
nm cada 2 min durante un periodo de 90 min usando un lector cinético
de placas de microtitulación (Twinreader plus, Flow
Laboratories).
Todos los datos se recogen en un ordenador
personal IBM usando LOTUS-MEASURE. Para cada
concentración de compuesto (expresado en mol\cdotl^{-1} en la
mezcla de reacción) y para el blanco se representan gráficamente la
absorbancia frente al tiempo de reacción en min.
Para cada concentración final se calculó la
absorbancia máxima a partir de la representación gráfica del ensayo.
El valor IC_{50} (concentración final, expresada en
\mumol\cdotl^{-1}, que causa 50% de inhibición de la
absorbancia máxima del blanco) se calculó usando análisis de
transformación logit según Hafner et al.
(Arzneim.-Forsch/Drug Res. 1977; 27(II):
1871-3).
Los valores IC_{50} de los compuestos de la
presente invención se dan en la siguiente tabla.
| Ejemplo | IC_{50} (\mumol\cdotl^{-1}) |
| 4 | 0,09 |
| 24 | 0,01 |
| 38 | 0,11 |
| 40 | 0,02 |
El factor X activado (Xa) es un factor en la
cascada de la coagulación. La actividad anti-Xa de
los compuestos de la presente invención se calculó midiendo
espectrofotométricamente la velocidad de hidrólisis del sustrato
cromogénico s-2222 ejercida por Xa. Este ensayo
para la actividad anti-Xa en un sistema tampón se
usó para calcular el valor IC_{50} del compuesto de ensayo.
En general, el procedimiento seguido y las
condiciones de los ensayos fueron análogos a los del ensayo
anti-trombina como se describió anteriormente. Las
diferencias se indican a continuación.
| Compuesto de referencia: benzamidina. | ||
| Vehículo: | Tampón TNP. | |
| \begin{minipage}[t]{135mm} La solubilización se puede ayudar con dimetilsulfóxido, metanol, etanol, acetonitrilo o alcohol tert-butílico que no tienen efectos adversos en concentraciones hasta 1% (para DMSO) y 2,5% (para los otros disolventes) en la mezcla final de reacción.\end{minipage} | ||
| Técnica | Reactivos* | |
| 3. | Disolución de S-2222 | |
| \begin{minipage}[t]{128mm}Se disuelve un vial de S-2222 (15 mg; Kabi Diagnostica, Suecia) en 10 ml de agua para obtener una concentración de 1,5 mg\cdotml^{-1} (2 mmol\cdotl^{-1}).\end{minipage} | ||
| 4. | Disolución de Xa | |
| \begin{minipage}[t]{128mm} Se disuelve Bovine Factor Xa Human (71 nKat\cdotvial^{-1}; Kabi Diagnostica) en 10 ml de tampón TNP y después se diluye adicionalmente con 30 ml de tampón TNP para obtener una concentración de 1,77 nKat\cdotml^{-1}. La dilución tiene que estar recién preparada.\end{minipage} | ||
En lugar de la disolución S-2238
(en el ensayo anti-trombina), en este ensayo se
añade la disolución anterior de S-2222 a cada
pocillo.
| Ejemplo | IC_{50}(\mumol\cdotl^{-1}) |
| 1 | 0,64 |
| 5 | 0,28 |
| 28 | 0,02 |
El daño vascular inicia una serie de reacciones
de generación de enzimas que conduce finalmente a la formación de un
gel de fibrina en el sitio de la lesión. La reacción principal de
generación de encimas es la generación del factor activado VII
(VIIa) a partir del factor proenzima VII. Esta reacción de
activación tiene lugar por un mecanismo desconocido todavía. Una
hipótesis es que pequeñas cantidades del factor Xa presente en el
plasma se unan a la proteína Factor Tisular (TF) unida a la membrana
- una proteína que normalmente no está en contacto con la sangre
pero que se ve expuesta a ella por lesión - y que este complejo de
TF unido a la membrana y el factor Xa activa el factor VII (ref. 1).
El factor VII activado después se une también a TF unido a la
membrana y este complejo activador intrínseco a continuación
convierte el factor X en el factor Xa.
La trombosis se desarrolla cuando hay un control
insuficiente de la reacción de coagulación. Una forma de restablecer
este control es inhibiendo las encimas esenciales de la coagulación
tales como, por ejemplo, el complejo de TF unido a la membrana y el
factor VIIa. Puesto que los inhibidores de VIIa o del complejo
VIIa/TF muy probablemente también inhibirán al complejo activador,
los inhibidores del último complejo también se pueden descubrir
determinando la inhibición de VIIa o VIIa/TF por los compuestos de
ensayo. Se describe un método por el que se puede establecer la
potencia inhibidora de los compuestos hacia el complejo VIIa/TF. Los
compuestos de ensayo se mezclan a varias concentraciones con el
factor VIIa y TF y con un sustrato cromogénico, que se sabe que se
escinde mucho mejor por VIIa unido a TF que por VIIa libre. La
reacción amidolítica que tiene lugar se monitoriza continuamente en
un lector de la placa de microtitulación. La potencia inhibitoria de
los compuestos investigados se expresa por el IC_{50}, definido
como la concentración de los compuestos que produce un 50% de
inhibición de la reacción amidolítica, noventa minutos después del
comienzo de la reacción.
Se preparó un tampón Hepes concentrado diez veces
disolviendo 29,40 g de CaCl_{2}.2H_{2}O, 47,66 g de Hepes, 87,66
g
de NaCl y 30,00 g de polietilenglicol (PEG) peso molecular= 6000 en 1000 ml de agua bidestilada. Después de que la disolución se había calentado a 37ºC, el pH del tampón se puso en 7,40 con ayuda de NaOH 10 molar. La disolución tampón concentrada se almacena a 4ºC y es estable durante al menos dos meses en estas condiciones. Antes de usar el tampón se diluye en agua bidestilada 1 a 8 para obtener una concentración final en los pocillos (véase el procedimiento de ensayo) de CaCl_{2} 20 mM, Hepes 20 mM, NaCl 150 mM y PEG6000 al 0,3%. Si los compuestos se disuelven y se diluyen en agua bidestilada o en otro vehículo debido a una solubilidad insuficiente, el tampón Hepes se puede diluir 1 a 6 para conservar la misma fuerza iónica en el ensayo.
de NaCl y 30,00 g de polietilenglicol (PEG) peso molecular= 6000 en 1000 ml de agua bidestilada. Después de que la disolución se había calentado a 37ºC, el pH del tampón se puso en 7,40 con ayuda de NaOH 10 molar. La disolución tampón concentrada se almacena a 4ºC y es estable durante al menos dos meses en estas condiciones. Antes de usar el tampón se diluye en agua bidestilada 1 a 8 para obtener una concentración final en los pocillos (véase el procedimiento de ensayo) de CaCl_{2} 20 mM, Hepes 20 mM, NaCl 150 mM y PEG6000 al 0,3%. Si los compuestos se disuelven y se diluyen en agua bidestilada o en otro vehículo debido a una solubilidad insuficiente, el tampón Hepes se puede diluir 1 a 6 para conservar la misma fuerza iónica en el ensayo.
El factor humano recombinante VIIa se obtiene de
America Diagnostica Inc. Greenwich, CT. Cada vial contiene 1,2 mg de
factor humano recombinante VIIa, que se liofiliza de 2 ml de tampón
compuesto por glicilglicina 10 mM, NaCl 50 mM, CaCl_{2} 10 mM,
manitol 30 mg/ml, Tween 0,1%, pH 5,5. Los contenidos de cada uno e
estos viales se reconstituyen con 2 ml de agua bidestilada como se
indica por el fabricante. Los 2 ml de disolución de trabajo 1,2 x
10^{-5} M así obtenida se divide en fracciones más pequeñas, que
se almacenan a -30ºC. En estas condiciones, estas muestras de VIIa
son estables durante al menos 6 meses.
El factor tisular humano recombinante se obtiene
de American Diagnostica Inc, Greenwich, CT. Cada vial contiene 25
\mug de factor tisular humano recombinante (sin lípido; peso
molecular 35.000 Dalton), que se liofiliza de 1ml de tampón Tris/HCl
(pH 8,0) compuesto por NaCl 150 mM, manitol 200 mM y CHAPS 10 mM
(derivado esteroideo usado para solubilizar las proteínas de la
membrana; véase Merk Index). Los contenidos de cada vial se
reconstituyeron con 1 ml de agua bidestilada como se indica por el
fabricante. El ml de disolución de trabajo 7,14 x 10^{-7} M así
obtenida se divide en fracciones más pequeñas, que se almacenan a
-30ºC. Así almacenadas, estas muestras de VIIa son estables durante
al menos 67 meses.
Pefachrome VIIa -
CH_{3}SO_{2}-D-Cha-but-Arg-pNa.AcOH
(peso molecular 670,8) - se obtiene de Pentapharm Ltd, Basle, Suiza,
en viales que contienen 10 \mumol de este sustrato cromogénico. El
día del experimento los contenidos de un vial se disuelven en 8,33
ml de agua bidestilada, produciendo una disolución de Pefachrome
VIIa 1,2 mMolar. Lo que queda de esta disolución se almacena a -30ºC
y es estable durante al menos 6 meses en estas condiciones.
El día del experimento se descongela una muestra
profundamente congelada de VIIa recombinante 1,2 x 10^{-5} M y una
muestra profundamente congelada de factor tisular humano
recombinante 7,14 x 10^{-7} M. La disolución descongelada de TF
humano recombinante 7,14 x 10^{-7} M se diluye a 4 x 10^{-7} M y
30 \mul de esta disolución se mezcla con 1 \mul de la disolución
descongelada de VIIa recombinante 1,2 x 10^{-5} M y con 449 \mul
de tampón Hepes, produciendo una disolución tampón Hepes que
contiene VIIa recombinante 25 nM y TF recombinante 25 nM. La
cantidad de 480 \mul
de disolución de TF/VIIa es suficiente para examinar la inhibición de ocho disoluciones de un compuesto de ensayo. Se necesita N veces esta cantidad para establecer el IC_{50} de los N compuestos de ensayo.
de disolución de TF/VIIa es suficiente para examinar la inhibición de ocho disoluciones de un compuesto de ensayo. Se necesita N veces esta cantidad para establecer el IC_{50} de los N compuestos de ensayo.
Los compuestos de ensayo se disuelven en tampón
Hepes para obtener disoluciones de trabajo 5 x 10^{-3} M (A). A
partir de esta disolución se preparan siete disoluciones adicionales
con concentraciones de 1,67 x 10^{-3} M (B), 5,56 x 10^{-4} M
(C), 1,85 x 10^{-4} M (D), 6,17 x 10^{-5} M (E), 2,06 x
10^{-5} M (F), 6,86 x 10^{-6} M (G) y 2,29 x 10^{-6} M (H) por
dilución de cada disolución precedente por un factor tres en tampón
Hepes. Una serie tal de disoluciones se preparan para el compuesto
de referencia Org 34593 y también para cada uno de los
N-1 compuestos de ensayo. Si se considera más
conveniente, se pueden preparar otras baterías de disoluciones con
concentraciones diferentes de compuesto.
Los compuestos se distribuyen columna por columna
sobre la placa de microtitulación y una columna de ocho pocillos se
reserva para una serie de reacciones no inhibidas. Se ponen 100
\mul de tampón Hepes en todos los (N+1)*8 pocillos con una pipeta
de ocho canales. Aquí N es el número de compuestos de ensayo
diferentes, incluyendo el compuesto de referencia Org 34593. A
continuación, se añaden 50 ml de la disolución de pefachrome VIIa
1,2 mM con una pipeta de ocho canales a los 100 \mul de tampón
Hepes en todos los (N+1)*8 pocillos reservados para ensayar los
compuestos y las reacciones del blanco.
Después se mezclan 50 \mul de cada una de las
ocho disoluciones del primero, segundo, tercero hasta el compuesto
enésimo en orden descendente de concentraciones con el contenido del
primero (A) hasta el octavo pocillo (H) de las columnas 1,2,3, hasta
la enésima respectivamente, con el fin de obtener una distribución
de un compuesto por columna con un orden descendente de arriba a
abajo de las concentraciones de los compuestos por columna.
Finalmente se añaden 50 \mul de tampón Hepes a los ocho pocillos
de la columna N+1 reservada para una serie de blancos.
Después de que la totalidad de la placa se ha
preparado, se agita durante un minuto en un agitador/incubador de
placas de microtitulación (Amersham) y las disoluciones se ponen a
37ºC incubando la placa en el mismo instrumento durante 10
minutos.
Las reacciones se inician añadiendo 50 \mul de
la disolución VIIa 25 nM /TF 25 nM, que se precalienta a 37ºC, a
cada uno de los (N+1)*8 pocillos con ayuda de una pipeta de ocho
canales. Después de que la placa se agita durante 30 segundos se
coloca en un lector de placas de microtitulación termostatizada y se
lee la absorbancia a 405 nm en cada pocillo a intervalos de tiempo
de 1 minuto durante 90 minutos. Las absorbancias se recogen en LOTUS
1,2,3, cargado en un PC conectado al lector cinético.
Las absorbancias (finales) medidas a los 90
minutos se corrigen para las absorbancias del blanco al comienzo del
ensayo por sustracción del primer valor de absorbancia
correspondiente medido un minuto después del comienzo de la
reacción. Las absorbancias finales corregidas en presencia
(Abs[I]) y ausencia (Abs[0]) del compuesto de ensayo
se convierten en valores logit calculando
+log((Abs[0]/Abs[I])-1) para cada
concentración [I] del compuesto de ensayo. Estos valores logit se
representan gráficamente frente al -log de las concentraciones de
los compuestos de ensayo. Una representación logit tal normalmente
exhibe una relación lineal entre 20% y 80% de inhibición de la
absorbancia final.
El valor pIC_{50} se define como el
-log(concentración M) del compuesto de ensayo para la cual el
valor logit es igual a cero. Este valor se calcula por regresión
lineal de la relación logit frente a -log[I] preferiblemente
alrededor del valor de logit cero. Cuando el compuesto ensayado es
tan activo frente a VIIa/TF que el pIC_{50} debe ser calculado por
extrapolación en lugar de por interpolación, lo mejor es preparar
una batería adicional de diluciones de este compuesto de ensayo y
llevar a cabo el ensayo de nuevo. Este método de calcular el valor
de pIC_{50} está descrito por Hafner et al. (ref. 2). Los
IC_{50} correspondientes se calculan como 10^{-pI50} y se
expresan en Molar.
Se requiere aproximadamente 1 mg para calcular el
IC_{50} de un compuesto de ensayo.
Se puede usar Org 34593 (PPACK) como compuesto de
referencia. Para este compuesto se ha establecido un IC_{50} de 3
x 10^{-7} M.
(1) The structural biology of expression and
function of Tissue factor: Edgington, T.S., et al. en
Thrombosis and Haemostasis 66(1),
67-79(1991).
(2) Mathematical analysis of concentration
response relationships: Hafner, D. et al. en
Arzneim. Forsch./Drug Research 27,
1871-1873(1977)
En la siguiente tabla se da el porcentaje de
inhibición a una concentración 1 x 10^{-5} M, como una medida de
punto único de la actividad anti-factor VIIa/factor
tisular de los compuestos de la presente invención. Para la
determinación de los porcentajes, se siguieron procedimientos como
los descritos anteriormente.
| Ejemplo | porcentaje de inhibición (%) |
| 44) EtSO_{2}-D-Phe-Leu-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil | 98 |
| 44) EtSO_{2}-Asn-Leu-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil | 56 |
| 44) EtSO_{2}-D-3-Tiq-Phe-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil | 91 |
| 44) EtSO_{2}-D-Leu-Gln-Lys\Psi[COCO]-O-iPropil | 94 |
Claims (10)
1. Un compuesto que tiene la fórmula I
(I)R^{1}SO_{2}-B-X-Z-C(O)-Y
en el
que
R^{1} es R^{2}OOC-(CHR^{2})_{m}- o
R^{2}NH-CO-(CHR^{2})_{m}- o se
selecciona entre alquilo (C1-12),
alquenilo(C2-12), cuyos grupos pueden estar
opcionalmente sustituidos con
cicloalquilo(C3-12),
alcoxilo(C1-6), OH, COOR^{2}, CF_{3} o
halógeno, y entre arilo(C6-14),
aralquilo(C7-15) y
aralquenilo(C8-16), cuyos grupos arilo pueden
estar opcionalmente sustituido con
alquilo(C1-6),
cicloalquilo(C3-8), alcoxilo
(C1-6), OH, COOH, CF_{3} o halógeno;
m es 1, 2 ó 3;
cada grupo R^{2} es independientemente H,
alquilo(C1-12),
cicloalquilo(C3-8),
arilo(C6-14) o
aralquilo(C7-15), cuyos grupos arilo pueden
estar sustituidos con alquilo(C1-6),
alcoxilo(C1-6) o halógeno;
B es un enlace, un amino-ácido de fórmula
-NH-CH[(CH_{2})_{p}C(O)OH]-C(O)-
o un éster derivado de él en el que p es 1, 2 ó 3, Gly,
D-1-Piq,
D-3-Piq,
D-1-Tiq,
D-3-Tiq, D-Atc, Aic,
o un L- o D-aminoácido que tiene una cadena lateral
hidrófoba básica o neutra;
X es un aminoácido con una cadena lateral
hidrófoba, glutamina, serina, treonina, un aminoácido cíclico que
contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre
N, O o S, y sustituido opcionalmente con
alquilo(C1-6),
alcoxi(C1-6), benciloxi u oxo, o X es ácido
2-amino-isobutírico,
-NR^{2}-CH_{2}-C(O)- o el
fragmento
en el que n es 2, 3 ó 4, W es CH o N y R^{3} es
H, alquilo(C1-6) o fenilo cuyos grupos pueden
estar opcionalmente sustituidos con hidroxi,
alcoxi(C1-6), COOH,
COO-alquilo (C1-6), CONH_{2}, o
halógeno;
Z es lisina o
4-aminociclohexilglicina;
Y es
-NH-alquileno(C1-6)-C_{6}H_{5},
cuyo grupo fenilo puede estar sustituido con
alquilo(C1-6),
alcoxilo(C1-6) o halógeno, o Y es -OR^{4} o
-NR^{5}R^{6}, en el que R^{4} es H,
alquilo(C2-6) o bencilo, y R^{5} y R^{6}
son independientemente H, alcoxi(C1-6), o
alquilo(C1-6) sustituido opcionalmente con
halógeno, o R^{5} y R^{6} juntos son
alquileno(C3-6), o R^{5} y R^{6} junto
con el átomo de nitrógeno al cual están unidos
Son 7 , en el que V es O, S o
SO_{2};
o un derivado protegido
N-alcoxicarbonilo de ellos o una sal
farmacéuticamente aceptable de ellos.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que
Z es lisina.
3. El compuesto de la reivindicación 1 ó 2, en el
que X es un aminoácido cíclico. un aminoácido con una cadena lateral
hidrófoba, glutamina, serina, treonina,
NR^{2}-CH_{2}-C(O)-, o el
fragmento
en el que R^{3} es H,
alquilo(C1-6) o
fenilo.
4. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que X es prolina,
leucina, glutamina, treonina, fenilalanina,
NR^{2}-CH_{2}-C(O)- en el
que R^{2} es metilo, ciclopentilo o ciclohexilo, o el
fragmento
en el que R^{3} es H o
metilo.
5. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que B es un enlace, un
D-aminoácido que tiene una cadena lateral hidrófoba
o neutra.
6. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en el que R^{1} es
alquilo(C1-6) o bencilo.
7. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que Y es
-OCH(CH_{3})_{2}.
8. Una composición farmacéutica que comprende el
compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones
1-7 y agentes auxiliares farmacéuticamente
adecuados.
9. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 para usar en terapia.
10. Uso del compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 para la fabricación de un
medicamento para tratar o evitar las enfermedades relacionadas con
la trombina.
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