ES2217574T3

ES2217574T3 - Plasmidos para la transformacion de plantas y metodos para utilizarlos.

Info

Publication number: ES2217574T3
Application number: ES98941295T
Authority: ES
Inventors: Maarten Hendrik Stuiver; Anne Silene Ponstein; Stephan Andreas Ohl; Oscar Johanna Maria Goddijn; Lambertus Henricus Simons; Bernardus Martinus Maria Dekker; Sietske Hoekstra; Hendrik Tigelaar; Nicolas Elzinga
Original assignee: Syngenta Mogen BV
Current assignee: Syngenta Mogen BV
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1998-06-29
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2018-06-29
Also published as: AU8973598A; PT1009842E; WO1999001563A1; US7029908B1; TW575663B; EP1009842B1; HUP0002698A2; HU224411B1; HUP0002698A3; IL133458A0; DE69824015D1; DE69824015T2; IL133458A; CA2294703A1; BR9810368A; CN1192110C; CA2294703C; AU730949B2; ATE267262T1; EP1009842A1

Abstract

Vector para transformación de plantas que comprende un T-DNA con márgenes de T-DNA flanqueándolo, que comprende además una secuencia de ácido nucleico localizada en el exterior de los márgenes del T-DNA, la cual evita el desarrollo de transformantes de plantas que tengan más secuencias de vector que la secuencia de T-DNA, comprendiendo dicho ácido nucleico una secuencia que codifica un compuesto tóxico.

Description

Plásmidos para la transformación de plantas y métodos para utilizarlos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la transformación de plantas en la que interviene Agrobacterium, especialmente a la transformación de plantas con T-DNA, en la que se impide la transferencia accidental de secuencias de vectores distintos de T-DNA.

Antecedentes de la invención

La transformación de plantas usando Agrobacterium y los plásmidos Ti o Ri, presentes en las bacterias Agrobacterium de tipo silvestre se conoce desde 1983 (p.ej. en EP-0116718 y EP-0120516). Este procedimiento de transformación consiste generalmente en la infección de plantas con cepas de Agrobacterium no oncogénicas a las que se ha incorporado un gen heterólogo. Este gen heterólogo está localizado en un plásmido, en un fragmento denominado
T-DNA, que es el DNA localizado entre dos repeticiones directas imperfectas de aproximadamente 24 pares de bases de longitud, los márgenes del T-DNA. La transferencia del gen heterólogo al interior de la planta se produce en un proceso en el que los genes vir, también localizados en el plásmido, se activan a través de compuestos fenólicos mediante incubación de Agrobacterium con células vegetales. Estas proteínas vir (D1 y D2), producen el corte de las repeticiones marginales en un sitio preciso, por medio del cual se corta el T-DNA en los márgenes del mismo a partir del plásmido, y se inserta dentro del genoma de la planta.

La existencia de una región marginal derecha parece ser lo más esencial en la transferencia del T-DNA: plásmidos Ti con la región marginal derecha delecionada son avirulentos (Holsters, M. et al., Plasmid 3, 212-230, 1980). La deleción de la región marginal izquierda no produce efecto en la virulencia (Joos, H. et al., Cell 32, 1057-1067, 1983).

La necesidad de que estén presentes los márgenes del T-DNA permanece cuando la transformación se realiza usando un sistema de vector binario, en el que el T-DNA se localiza sobre un replicón independiente separado, el vector binario.

Tras la transformación, el T-DNA está presente en los genomas de las plantas hospedadoras como unidades únicas, o en copias múltiples, colocadas en tándem. Sin embargo, también se observan frecuentemente regiones de T-DNA truncadas (Deroles S.C. y Gardner, R.C., Plant Mol. Biol. 11, 365-377, 1988). Más recientemente, existe información de que el DNA más allá de los márgenes se integra en el genoma de las plantas hospedadoras. Tal caso se describe en 20 a 30% de las plantas transgénicas (Martineau, B. et al., The Plant Cell 6, 1032-1033, 1994). Sin embargo, muy recientemente un informe en la literatura sugiere que aproximadamente 75% de transformantes de tabaco contenían secuencias de la cadena principal del vector (Kononov, M.E. et al., The Plant J. 11(5), 945-957, 1997).

Otro fenómeno que ocurre algunas veces es que la transferencia del T-DNA empieza en el borde izquierdo, que puede actuar también como un punto de partida (débil). Entonces, la cantidad de DNA que se lee de un extremo al otro puede ser considerable: se encuentra que algunas veces la transferencia, que empieza en el margen izquierdo, se lee hasta el margen derecho y finaliza nuevamente en el margen izquierdo, produciendo la transferencia del vector binario completo (Van der Graaf, E. et al., Plant Mol. Biol. 31, 677-681, 1996).

Debido a que el objetivo del genetista vegetal será transferir sólo el DNA que está presente en el T-DNA, el impedimento de ambos mecanismos de lectura completa sería satisfactorio. Además, las autoridades de registro, que tratan con peticiones para el registro (comercial) de plantas transgénicas y/o alimentos transgénicos, también opinan que la contaminación de plantas transgénicas con DNA de vector se deberían evitar en la medida de lo posible.

Sumario de la invención

La invención comprende un vector para la transformación de plantas que comprende un T-DNA con márgenes de T-DNA flanqueándolo, caracterizado porque el vector comprende además una secuencia de ácido nucleico que evita el desarrollo de trasnformantes vegetales que tengan más secuencias de vector que la secuencia de T-DNA.

Esta secuencia, que evita el desarrollo de transformantes que tengan más secuencias de vector que la secuencia de T-DNA, es un gen que codifica para un compuesto tóxico, seleccionado preferiblemente del grupo de la RNAsa, DNAsa, fitotoxinas, toxina de la difteria, proteasas y genes constitutivos antisentido, como ATP-sintasa, citocromo c, piruvato-quinasa, aminoacil-transferasa o translocadores de fosfato, di-, tricarboxilato y 2-oxo-glutarato.

Otra realización de dicho vector es cuando la secuencia que evita el desarrollo de transformantes con secuencias de vector fuera de la secuencia de T-DNA, comprende una secuencia que se une a proteínas que se asocian al DNA, o que es rica en contenido de G+C.

También forma parte de la invención un método para obtener plantas transgénicas que no contienen secuencias de vector fuera del T-DNA, transformando las plantas con un vector según la invención. Además, los hospedadores que contienen tal vector, como bacterias, preferiblemente un miembro de las Agrobacteriaceae, más preferiblemente Agrobacterium o Rhizobacterium, con la máxima preferencia Agrobacterium tumefaciens, forman también parte de la invención.

Adicionalmente, está comprendido en la invención un método para la transformación de plantas, caracterizado porque se usa un vector según la invención.

Descripción de las figuras

Figura 1. Representación esquemática de las construcciones usadas.

Figura 2: Representación esquemática de la localización de la hibridación de los cebadores que se usaron para supervisar la integración conjunta de secuencias de vector.

Descripción detallada de la invención

Básicamente todos los plásmidos y vectores conocidos que se usan para la transformación de plantas se pueden adaptar a un vector según la invención o a un vector utilizable en un método según la invención. Ejemplos de tales plásmidos son pBin19 (Bevan, M., Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721, 1984), Pmog101 (WO 93/10251), pMOG800 (WO 95/05467), pMON128 (EP-0131623), GV2260 (Deblaere et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13, 4777-4788), etcétera, y todos los plásmidos derivados de ellos.

Las características clave de tales plásmidos son que contienen T-DNA flanqueado por secuencias marginales de
T-DNA. Además, deben de estar adaptados para replicarse en Agrobacterium, por tanto deben contener una secuencia de origen de replicación (ori), adecuada para uso en Agrobacterium. Aunque las cepas de Agrobacterium que se usan más frecuentemente son de A. tumefaciens, tambien A. rhizogenes es adecuada para la transformación de plantas. En ésta, el DNA transformable está localizado en el plásmido Ri, y este DNA se debería de llamar por tanto, ulteriormente, R-DNA. Sin embargo, el término que se usa normalmente es T-DNA, y esto no limita la invención sólo a A. tumefaciens, sino que incluye todos los métodos de transformación en los que se usa una secuencia de DNA localizada entre dos repeticiones directas para la trasformación en plantas.

Para la transformación, junto al T-DNA también son necesarias proteínas de virulencia. Éstas pueden estar codificadas en el mismo plásmido que contiene también el T-DNA, que en este ámbito se denomina generalmente plásmido integrado conjuntamente. También puede darse el caso de que los genes de virulencia estén localizados en un plásmido separado (el sistema se denomina normalmente sistema de vector binario), o incluso en el cromosoma bacteriano.

Además, los plásmidos contendrán también normalmente un gen que codifica para la resistencia a un antibiótico (permitiendo el cultivo bajo una presión seleccionada), y un ori para replicación en E. coli.

Se puede encontrar una introducción general a la transformación de genes en plantas y el papel de Agrobacterium y del plásmido Ti, en el libro "Principles of gene manipulation" (Old, R.W. y Primrose, S.B., Blackwell Scientific Publications, London, 1994, capítulo 14, págs. 268-301).

Una realización de la invención comprende un vector en el que un gen que codifica una toxina bajo el control de un promotor expresable en la planta, está localizado fuera de los márgenes del T-DNA. Es esencial que este gen no sea tóxico para la bacteria o no se exprese en la misma, porque esto deterioraría la bacteria y, con ello, la capacidad del T-DNA para transformar la planta. Existen diversas formas por las que se pueden evitar los efectos tóxicos para la bacteria. Una de ellas es elegir un compuesto tóxico que no sea tóxico para la bacteria. Un ejemplo de tal compuesto tóxico es la toxina de la difteria. De forma similar, también el enfoque antisentido en el que se suprime un gen constitutivo esencial de una planta proporciona oportunidades para evitar el deterioro bacteriano. Para esto, hay que recordar elegir un gen constitutivo que sea activo (y esencial) en plantas, pero que carezca de función o tenga sólo una función secundaria en la bacteria, o no sea suficientemente homólogo para que sea obstaculizado por la expresión antisentido del gen.

Sin embargo, incluso si las toxinas son nocivas para las bacterias, se pueden encontrar maneras para evitar la expresión de dichas toxinas en las bacterias. Una posibilidad para lograr esto es produciendo una construcción genética en la que la toxina esté bajo el control de un promotor de la planta. Aunque no todos los promotores específicos de plantas se pueden usar en tal vector, ya que producen al menos algo de expresión en bacterias, es fácil establecer si un promotor elegido no produce expresión en células bacterianas (por ejemplo, transformando una bacteria con un gen GUS precedido por dicho promotor, se puede ensayar fácilmente la expresión de GUS en la bacteria).

Finalmente, una manera de evitar la expresión en bacterias es introducir una secuencia de intrón en la secuencia codificadora de la toxina (o usar secuencias genómicas que contengan intrones). Debido a que las bacterias son incapaces de escindir los intrones, sólo se producirá una proteína (o parte de ella) no funcional, que no perjudicará a las bacterias.

Las toxinas que se pueden usar comprenden toxinas específicas para ciertas plantas, pero también se pueden usar toxinas disponibles de forma más general, que actúan sobre sistemas de membrana y/o otras estructuras o procesos celulares generales. Ejemplos de tales toxinas son: RIP, magaininas, RNAsas (como barnasa), DNAsas, proteasas, etcétera.

Se pueden aplicar otros procedimientos de diversas formas, y se pueden seleccionar genes para estos procedimientos, del grupo formado por (a) genes que codifican ribozimas frente a un transcrito de RNA endógeno; (b) genes que producen proteínas que son capaces de provocar una reacción de hipersensibilidad; (c) genes que, cuando se transcriben, producen transcritos de RNA que son complementarios, o al menos parcialmente complementarios, a los transcritos de RNA de genes endógenos que son esenciales para la viabilidad celular, método conocido como inhibición antisentido de la expresión genética (descrito en EP-A-240208); y (d) genes que cuando se transcriben producen transcritos de RNA que son idénticos o al menos muy similares a los transcritos de genes endógenos que son esenciales para la viabilidad celular, una forma de inhibición de la expresión genética aún no comprendida totalmente, denominada supresión conjunta (descrita por Napoli C. et al., 1990, The Plant Cell, 2, 279-289).

Es posible provocar una respuesta de hipersensibilidad (HR) cuando una proteína que la provoca, derivada de un patógeno, y una proteína receptora correspondiente, derivada de una planta, se expresan simultáneamente. Se conocen en la técnica parejas de tales genes provocador/receptor correspondientes y su aplicabilidad para provocar una HR en una planta transgénica, p.ej., para los genes avr de Cladosporium fulvum y Cf de Lycopersicum esculentum (WO 91/15585) o para los genes avr de Pseudomonas syringae y los genes RPM1 de Arabidopsis thaliana (Grant, M.R., et al., Science 269, 843-846, 1995). La idea general de la aplicación de estos genes en esta invención es insertar uno de los genes entre los márgenes del T-DNA y el gen complementario fuera de estos márgenes. Por tanto, cuando el DNA exterior a los márgenes se transfiere a la planta, se expresarán ambos genes y se producirá una respuesta de hipersensibilidad, que matará a la célula así transformada.

Debido a que los genes de resistencia derivados de plantas aparecen de forma natural en algunas plantas, es posible que en estas plantas sea suficiente un gen que codifique para el gen de avirulencia correspondiente, situado fuera de los márgenes del T-DNA. Cuando se expresa después de la transformación, encontrará el gen de la planta correspondiente producido endógenamente, y provocará una respuesta HR.

Realizaciones preferidas de las construcciones para este mecanismo HR (en vista de las restricciones reguladoras) son las construcciones en las que el gen derivado de la planta está presente entre los márgenes del T-DNA y el gen derivado del patógeno está presente fuera de los márgenes.

Según otra realización de la invención, se usan genes antisentido para inhibir la expresión de los genes endógenos esenciales para la viabilidad celular, los cuales se expresan en la célula vegetal.

Los genes diana para genes disruptores antisentido se seleccionan de aquellos que codifican para enzimas que son esenciales para la viabilidad celular, también llamadas enzimas constitutivas, y deben de ser codificadas por el núcleo, preferiblemente como genes de copia única, aunque aquellos codificados por una familia de genes pequeña también serán adecuados para el propósito de la invención. Además, el efecto de la expresión antisentido de dichos genes, no debe anularse por difusión o translocación de productos enzimáticos sintetizados normalmente por tales enzimas, desde otras células u organelos. Preferiblemente, se eligen genes que codifican enzimas de translocación de membrana, ya que éstas están implicadas en el establecimiento de gradientes químicos a través de las membranas de los organelos. La inhibición de tales proteínas mediante expresión antisentido no se puede cancelar, por definición, mediante difusión de sustratos a través de la membrana en la que residen estas proteínas. El compuesto translocado no esta limitado a moléculas orgánicas, sino que puede ser de naturaleza inorgánica, p.ej. P, H, OH o electrones.

En la Tabla 1 se proporciona una lista de enzimas diana a modo de ejemplo, pero la invención no está limitada a las enzimas mencionadas en esta tabla. Se pueden reunir listados más detallados de series como Biochemistry of Plants (Editores Stumpf & Conn, 1988-1991, volúmenes 1-16, Academic Press) o Encyclopedia of Plant Physiology (New Series, 1976, Springer-Verlag, Berlin). Aunque sólo en algunos casos, los genes que codifican para estas enzimas se han aislado y, por tanto, el número de copias génicas no se conoce, los criterios que se tienen que cumplir se describen en esta invención.

TABLA 1 Ejemplos de enzimas diana para expresión sentido y antisentido

enzima	vía/organelo
ATP-sintasa	mitocondria
translocador de nucleótido de adenina	mitocondria
translocador de fosfato	mitocondria
translocador de tricarboxilato	mitocondria
translocador de dicarboxilato	mitocondria
translocador de 2-oxo-glutarato	mitocondria
citocromo C	mitocondria

TABLA 1 (continuación)

enzima	vía/organelo
piruvato-quinasa	glicolisis
gliceraldehído-3P-deshidrogenasa	glicolisis

NADPH-citocromo P450-reductasa	metabolismo de lípidos
complejo de ácido graso-sintasa	metabolismo de lípidos
glicerol-3P-aciltransferasa	metabolismo de lípidos

hidroximetil-glutaril CoA-reductasa	vía del ácido mevalónico
aminoacil-transferasa	metabolismo de ácidos nucleicos
factores de transcripción	metabolismo de ácidos nucleicos

factores de alargamiento	metabolismo de ácidos nucleicos

Para maximizar los efectos antisentido en un hospedador vegetal, se prefiere el uso de genes homólogos. Por homólogo se entiende que se puede obtener de la misma especie de planta como planta hospedadora. Heterólogo, para los fines de esta memoria descriptiva debe significar que se puede obtener de una planta diferente o de una especie no vegetal. Heterólogo debe comprender también análogos de genes sintéticos, modificados en su mRNA que codifica una secuencia que se diferencia al menos en un 5% del gen hospedador. Como los genes constitutivos en general se conservan mucho, se pueden usar sondas heterólogas de otras especies (vegetales) para aislar el gen correspondiente de la especie de cosecha que se quiere hacer resistente. Tales aislamientos de genes están fácilmente al alcance de los expertos en la técnica y, a la vista de los presentes conocimientos, no requieren experimentación innecesaria.

Con respecto a la necesidad de una región de terminador transcripcional, se cree generalmente que tal región incrementa la fiabilidad así como la eficiencia de transcripción en células vegetales. El uso de la misma se prefiere por tanto considerablemente, en el contexto de la presente invención.

Otra realización de la presente invención es un vector en el que la lectura completa o el comienzo de la transferencia del DNA a partir del margen izquierdo se inhiben mediante la inserción de una secuencia nucleotídica fuera de los márgenes del T-DNA, que interfiere con el procedimiento de desenrollamiento del DNA requerido de forma natural para la formación de una molécula de DNA destinada a la translocación hacia la planta.

Un ejemplo de tal secuencia es una secuencia rica en GC de aproximadamente 40 nucleótidos (preferiblemente
20-60 pares de bases), para la cual el desenrollamiento del DNA es energéticamente desfavorable y, por tanto, se espera que a través de esta secuencia se dificulte el desenrollamiento del DNA. Sin embargo, también se pueden usar otras secuencias que bloquean la lectura completa o el inicio desde el margen izquierdo. Las personas expertas en la técnica conocen los cálculos referentes a la estabilidad incrementada de tales secuencias dúplex, y se describen en Maniatis, Fritsch y Sambrook: Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor, 1982, pág. 388. Otro ejemplo de una secuencia nucleotídica que dificultará el procedimiento de desenrollamiento del DNA en secuencias fuera del margen del T-DNA es una secuencia que está formada por sitios de unión para proteínas que se asocian al DNA de Agrobacterium. Para el desenrollamiento del DNA se requerirá el desplazamiento de proteínas de unión asociadas al DNA, de forma que la energía requerida para el desplazamiento de la hebra se incrementa considerablemente. Además, la presencia de proteínas asociadas al DNA, próximas al margen izquierdo, puede interferir físicamente con la unión del complejo DNA-proteína, requerida para el desenrollamiento del DNA aguas abajo respecto al margen izquierdo. En general, todas las proteínas asociadas con el DNA dúplex serán capaces de interferir con este procedimiento. Preferiblemente, se usan sitios de unión de proteínas a través de los cuales se puede inducir o reforzar una interacción DNA-proteína, mediante tratamiento de células de Agrobacterium con un estímulo externo. Más preferiblemente, la proteína que se une al DNA es virG, que es también una proteína activadora para todas las proteínas vir implicadas en la movilización y transferencia del T-DNA. Se sabe que virG se une a la secuencia vir, formada por la secuencia 5'TNCAATTGAAAY3' (en la que N es cualquier nucleótido e Y es un nucleótido con base pirimidínica (T o C)). Se cree que la unión de virG a esta secuencia vir se inicia o aumenta tras la activación de Agrobacterium, a través del sistema regulador de dos componentes virA/virG. In vivo, la activación de genes vir depende de la fosforilación de virG, pero el papel real de esta modificación no se conoce aún. Como se esboza en Sheng y Citovsky (The Plant Cell 8, 1699-1710, 1996), una explicación muy posible es que la proteína virG fosforilada tiene una afinidad incrementada por su sitio de unión conocido.

Asimismo, la introducción de sitios de unión para proteínas de unión asociadas, unidas estrechamente a las secuencias del margen izquierdo, puede interferir físicamente mediante impedimento estérico con el ensamblaje de proteínas sobre este margen izquierdo, preciso para el desplazamiento de hebra, reduciendo por tanto de manera efectiva los comienzos en el margen izquierdo.

Aunque algunas de las realizaciones de la invención no se pueden poner en práctica en el presente, p.ej. porque algunas especies de plantas son hasta el momento refractarias a la transformación genética, la puesta en práctica de la invención en tales especies de plantas es meramente una cuestión de tiempo y no una cuestión de principio, porque la sensibilidad a la transformación genética no es relevante para la realización subyacente de la invención.

La transformación de especies de plantas es actualmente una rutina para un número impresionante de especies vegetales, incluyendo tanto las dicotiledóneas, así como las monocotiledóneas. En principio, se puede usar cualquier método de transformación para introducir DNA quimérico según la invención en una célula precursora adecuada. Un método preferido según la invención comprende la transferencia de DNA en la que interviene Agrobacterium. Se prefiere especialmente el uso de la tecnología denominada de vector binario, según se describe en EP-A-120516 y en la patente de EE.UU 4.940.838).

La transformación del tomate se realiza preferiblemente como la describen Van Roekel et al. (Van Roekel, J.S.C., Damm, B., Melchers, L.S., Hoekema, A. (1993), Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycopersicon esculentum), Plant Cell Reports, 12, 644-647). La transformación de la patata se realiza de forma preferible, básicamente como la describen Hoekema et al. (Hoekema, A., Hisman, M.J., Molendijk, L, Van den Elzen, PJ.M. y Cornelissen, B.J.C. (1989), The genetic engineering of two commercial potato cultivars for resistance to potato virus X; Bio/Technology 7, 273-278).

Aunque se consideran algo más refractarias a la transformación genética, las plantas monocotiledóneas son sensibles a la transformación, y se pueden regenerar plantas transgénicas fértiles a partir de células o embriones transformados, u otro material vegetal. Las plantas monocotiledóneas, incluyendo cosechas comercialmente importantes, como el arroz y el maíz, son sensibles a la transferencia de DNA mediante cepas de Agrobacterium (véase WO 94/00977; EP-0159418-B1; Gould J., Michael D., Hasegawa O., Ulian EC, Peterson G, Smith RH, (1991); Plant Physiol. 95, 426-434).

Se sabe que prácticamente todas las plantas se pueden regenerar a partir de células o tejidos cultivados. Los medios de regeneración varían entre especies de plantas, pero generalmente se proporciona inicialmente una suspensión de protoplastos transformados o una placa de Petri que contiene explantes transformados. Se pueden inducir vástagos directa o indirectamente desde el callo, a través de organogénesis o embriogénesis, y luego enraizarlos. Además del marcador seleccionable, los medios de cultivo contendrán generalmente diversos aminoácidos y hormonas, como auxina y citoquininas. También es ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como maíz y alfalfa. La regeneración eficiente dependerá del medio, el genotipo y la historia del cultivo. Si estas tres variables se controlan, la regeneración es normalmente reproducible y repetible. Tras la incorporación estable de las secuencias genéticas transformadas en las plantas transgénicas, los rasgos conferidos por las mismas se pueden transferir a otras plantas mediante cruzamiento sexual. Se puede usar cualquiera de las variadas técnicas de reproducción estándar, dependiendo de la especie a cruzar.

Parte experimental Ejemplo 1 Construcción de una cadena principal de vector binario

Se introdujo un sitio único de endonucleasa de restricción Sal I en pMOG 800, de forma que los elementos destinados a la inhibición de la lectura completa o contraselección de transgénicos que llevan secuencias del vector, se pueden clonar próximos al margen izquierdo. El sitio está localizado 10 pares de bases adyacente al margen izquierdo. Usando una estrategia de mutagénesis simple, basada en PCR , con cebadores de secuencias SEQ ID Nº:1 a SEQ ID Nº:4, se creó un fragmento que abarcaba los sitios únicos DraIII y NruI, que es casi idéntico al fragmento correspondiente en el vector binario Pmog800 (depositado en el Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holanda, bajo CBS 414.93, el 12 de agosto de 1993), con un único sitio SalI adicional, a 10 pares de bases de la repetición del margen izquierdo, fuera del T-DNA. Este fragmento de PCR se digirió con DraIII y NruI, y se clonó en pMOG800, digerido con DraIII y NruI. El plásmido resultante se denomina pNE03.

Ejemplo 2 Inserción del tramo rico en GC

Se creo un tramo de 40 pares de bases rico en GC, hibridando las SEQ ID Nº: 5 y 6 entre sí. La inserción de este fragmento en un sitio SalI dejará un sitio SalI intacto sólo en un extremo. El oligonucleótido sintético dúplex se fosforiló mediante T4 polinucleótido-quinasa y se clonó en el vector pNEO3 digerido con SalI. El plásmido pNEO7 resultante tiene el tramo rico en GC insertado en el sitio SalI, lo que produce la eliminación del sitio SalI en el lado más próximo al margen izquierdo del T-DNA. En la Fig. 1 se presenta una representación esquemática de la orientación.

Ejemplo 3 Inserción de sitios de unión de virG

El fragmento que contiene los sitios de unión de VirG deriva del promotor VirB de la cepa EHA 101 de Agrobacterium. El promotor VirB se demostró previamente que contenía dos secuencias vir, que son reconocidas ambas por VirG (Das y Pazour, 1989, Nucl. Ac. Res. 17, 4541-4150). Se cree que la secuencia Vir por sí sola no es suficiente para la unión de la proteína VirG. Más probablemente, para la unión de la proteína VirG se requieren también secuencias no conservadas específicas de aproximadamente 19 pares de bases, en posición 3' respecto a la secuencia VirG. Se usaron los cebadores SEQ ID Nº: 7 y 8 para la amplificación por PCR de un fragmento promotor de VirB de aproximadamente 90 pares de bases, de la cepa MOG101 de Agrobacterium tumefaciens. El fragmento se digirió con SalI y AvaI, y se introdujo en el único sitio SalI del vector pNEO3. Nuevamente, este fragmento se orienta de forma que los extremos SalI-AvaI se juntan lo más próximos al margen izquierdo. En la Fig. 1 se presenta una representación esquemática de la orientación. Este vector se denomina pNEO9.

Ejemplo 4 Introducción de una casete de expresión de barnasa

Se escindieron el marco de lectura abierto de barnasa y las secuencias terminadoras nos (925 pares de bases), de pMOG 944 (WO 98/22599), usando los sitios NcoI y EcoRI, y se clonaron en pMOG1302, digerido con NcoI y EcoRI. pMOG1302 contiene un fragmento promotor GapC (Shih et al., 1991, Gene 104, 133-138), y tiene una cadena principal de vector pMOG445 (basada en pUC) (pMOG445 se obtuvo a partir de pUC18 (Yannisch-Perron y Messing, 1985, Gene 33, 103-119) mediante inserción de un DNA sintético dúplex, fabricado con cebadores de SEQ ID Nº: 9 y 10, en pUC18 digerido con EcoRI y SstI). El plásmido resultante tiene el marco de lectura abierto de la barnasa, las secuencias no traducidas 3' nos/terminador, acopladas con el promotor GapC y las secuencias no traducidas 5' respecto al sitio NcoI, situado en el codón de inicio. El plásmido resultante se denomina pNEO1. La casete de expresión total de pNEO1 (GapC-barnasa-nos), se clonó posteriormente en pBSK+ (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.), usando los sitios BamHI y XhoI. Este plásmido se denomina pNEO5. Luego, pNEO5 se digirió con BamHI y se introdujo un adaptador (SEQ ID Nº:11), que destruye el sitio BamHI, e introduce un sitio SalI. El plásmido resultante es pNEO8. A continuación, se eliminó la casete de expresión de pNEO8, usando SalI y XhoI, y se clonó en los vectores binarios modificados pNEO3, pNEO7 y pNEO9, todos digeridos con SalI. Esto produce los vectores pNE10 (sólo casete
de barnasa), pNE11 (sitio de fijación de GC + casete de barnasa) y pNE12 (sitios de unión de VirG + casete de barnasa).

Ejemplo 5 Introducción de una casete marcadora GUS

Un fragmento EcoRI-HindIII de pMOG1059 contenía una casete de expresión de GUS que contenía 1) el promotor quimérico Fdro1D y secuencias no traducidas (solicitud de patente Nº 97203912.7, presentada el 12/12/97), 2) un marco de lectura abierto de GUS, que contenía un intrón StLS1 (Vancanneyt et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 220, 245-250), y 3) secuencias no traducidas/terminador del gen II inhibidor de proteinasa (Thornburg et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 744-748). Este fragmento EcoRI-HindIII se insertó en los sitios EcoRI-HindIII de los vectores binarios pNE10, -11 y -12, entre los márgenes. La casete GUS es la más próxima al margen derecho, la casete marcadora de selección nptII se encuentra la más próxima al margen izquierdo (véase Fig. 1). Se usó pMOG1059 como testigo sin modificar, cuyas secuencias de vector son la cadena principal de pMOG800 sin modificar. pMOG1313 es el vector binario que tiene la casete Fdro1D-GUS sobre el T-DNA y contiene el sitio de unión de GC cerca de su margen izquierdo; pMOG1314 es idéntico en el T-DNA, pero contiene los sitios de unión VirG cerca del margen izquierdo; pMOG1315 tiene también las mismas secuencias de T-DNA y contiene la casete de barnasa cerca del margen izquierdo. De la misma forma, pMOG1316 contiene, tanto el sitio de unión de GC, como la casete de barnasa, y pMOG1317 contiene los sitios de unión de VirG, seguidos por la casete de barnasa.

Ejemplo 6 Análisis de la frecuencia de transformación de patata con los nuevos vectores binarios

Se transformaron segmentos de tallo de patata de cv. Kardal con la cepa EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens, en tres experimentos de transformación separados, usando un protocolo de transformación estándar (según se describe en PCT/EP 98/02979). Se usó un mínimo de 150 explantes por construcción. Normalmente esto producirá la regeneración de aproximadamente 90 transformantes por construcción. La frecuencia de transformación se determinó como el número de regenerados capaces de enraizar a presión selectiva, sobre medio de crecimiento que contenga kanamicina, relativo al número de explantes usados. Para la Tabla 1, se normalizó la frecuencia de transformación hasta 1,0 para la construcción testigo pMOG1059.

\newpage

Tabla 1

Frecuencias de transformación relativa media observadas con las construcciones analizadas. Todos los valores se normalizaron por experimento de transformación hasta pMOG1059 (fijado a 1,00). Los valores se promediaron a partir de tres experimentos de transformación independientes.

Construcción	Descripción	Frecuencia de transformación
pMOG1313	sitio de unión de GC	1,35
pMOG1314	sitios de unión de virG	1,24
pMOG1315	casete de barnasa	0,97
pMOG1316	GC + casete de barnasa	0,85
pMOG1317	virG + casete de barnasa	0,90

La inserción de un sitio de unión de GC o de sitios de unión de virG fuera del margen izquierdo, parece incrementar algo la frecuencia de transformación. No se conoce completamente la razón para este efecto. Una explicación es que la interferencia con los inicios del margen izquierdo de la transferencia de DNA, como indicaron algunos investigadores (Kononov, M.E. et al., 1997; Plant J. 11, 945-957; Ramanathan, V. y Veluthambi, K., 1995, Plant Mol. Biol., 28, 1149-1154) incrementará las probabilidades de transferencia de T-DNA, lo cual incrementará el número de células transformadas iniciales con el marcador de selección nptII.

Ejemplo 7 Análisis de integración conjunta de la cadena principal del vector

A continuación, se analizó la presencia de fragmentos de DNA que extendiesen los márgenes del T-DNA izquierdo y derecho mediante PCR, fragmentos indicativos de integración del DNA del vector en transformantes. Se analizaron 75 líneas individuales por construcción para secuencias de los márgenes externos, mediante PCR múltiple. Para la PCR múltiple se usaron seis cebadores, con cebadores npt II como testigo interno. Para la localización de los cebadores sobre los vectores binarios, véase Fig. 2.

Las secuencias de extensión del margen izquierdo de los transformantes, fabricadas con los vectores pMOG1313, pMOG1314 y pMOG1059, se amplificaron usando los cebadores de SEQ ID Nº 12 y 13, que producen un fragmento de aproximadamente 1200 pares de bases. Para los transformantes fabricados con las construcciones pMOG1315, pMOG1316 y pMOG1317, se usaron los cebadores de SEQ ID Nº: 12 y 14, para la amplificación de las secuencias de extensión del borde izquierdo. El cebador externo en este caso hibrida con el gen de barnasa. Este cebador se eligió porque, en caso contrario, el fragmento de PCR sería demasiado largo para permitir la amplificación eficiente. La amplificación PCR con cebadores para el testigo interno, npt II, SEQ ID Nº: 15 y 16, producirá un fragmento de aproximadamente 850 pares de bases. Para las secuencias que abarcaban el margen derecho, se amplificó un fragmento de 500 pares de bases, usando cebadores de SEQ ID Nº: 17 y 18. Las reacciones PCR se realizaron en un ciclador térmico 480 de Perkin-Elmer.

Tras la amplificación, los fragmentos de PCR se sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,8% que contenía bromuro de etidio. Tras realizar las fotografías, se contaron los diferentes fragmentos y se determinó el porcentaje de lectura completa (véase Tabla 2 para recopilación).

TABLA 2 Porcentajes de transformantes individuales con secuencias que extienden los márgenes izquierdo y derecho

Construcción	Sólo LB	Sólo RB	LB + RB, ambos	Suma de líneas con transiciones
			presentes	de márgenes
pMOG1313	2,82%	16,90%	28,17%	47,89%
pMOG1314	4,76%	12,70%	20,63%	38,10%
pMOG1315	4,17%	6,94%	2,78%	13,89%
pMOG1316	4,35%	4,35%	1,45%	10,14%
pMOG1317	5,56%	5,56%	1,39%	12,50%
pMOG1059	2,90%	8,70%	37,68%	49,28%

Como se puede observar en la Tabla 2, el número de líneas que muestran la integración conjunta no deseada de secuencias de vectores es muy alta. Aproximadamente la mitad de las líneas transgénicas fabricadas con la construcción pMOG1059 no modificada presentan integración de al menos parte de la cadena principal del vector. Este valor no se reduce cuando se introduce un tramo rico en GC próximo al margen izquierdo. La introducción de sitios de unión de virG próximos al margen izquierdo parece reducir algo en número de transiciones de margen. Claramente, cuando el tramo rico en GC o los sitios de unión de virG se introducen fuera del margen izquierdo, existe una reducción pronunciada en el número de líneas con transiciones del margen izquierdo (calculado como el porcentaje de líneas que llevan sólo LB o LB y transiciones RB), que se reducen de 40% en pMOG1059 hasta aproximadamente 30% y 25% en las líneas transformadas pMOG1313 y pMOG1314.

La construcción pMOG1315, que lleva sólo la casete de expresión de barnasa fuera del margen izquierdo, tiene un número de transformantes con secuencias del vector reducido muy significativamente. La combinación, bien el tramo GC o de los sitios de unión de virG con la casete de barnasa parece reducir más el número. En los experimentos de la invención, se observa que el número de líneas individuales con transiciones de margen disminuye hasta aproximadamente 10%, lo cual es una mejora muy significativa, en relación con el testigo pMOG1059 sin modificar.

Un examen breve de los transformantes de tomate primarios en nuestra colección indicaba que, aproximadamente 40% de las plantas de tomate transgénicas contenían secuencias de margen externas. Esto indica claramente la necesidad de esta tecnología también en otras especies de plantas.

Ejemplo 8 Uso de genes de avirulencia y resistencia para contraselección de secuencias de vector fuera del T-DNA

La región codificadora inductora de AvrRpm1 derivada de Pseudomonas syringae se clona operativamente detrás de un promotor constitutivo fuerte, y antes de la secuencia terminadora transcripcional del inhibidor II de la proteinasa de patata. Esta casete se introduce en el sitio BglII, aguas abajo del margen del T-DNA izquierdo. Se introduce en el T-DNA un fragmento de DNA genómico que contiene el gen de resistencia de Rpm1 derivado de Arabidopsis thaliana, flanqueado por un promotor constitutivo y secuencias terminadoras, formando así el pMOG1257 (Fig. 2). La transformación de Brassica napus, y plantas de tomate y patata con esta construcción, se realiza usando procedimientos estándar.

Las plantas transgénicas que surgen de este procedimiento de transformación se analizan para la presencia de secuencias de vector fuera del T-DNA, usando una reacción PCR sobre el DNA genómico de cada uno de los transformantes. Los cebadores usados extienden una secuencia de aproximadamente 300 pares de bases fuera del T-DNA, próxima al margen izquierdo.

Ejemplo 9 Determinación del número de copias

Para la determinación del número de copias de las plantas que contienen la construcción pMOG1317 y las plantas testigo que contienen la construcción pMOG1059, se aisló el DNA genómico de hojas de 25 plantas por línea, usando un procedimiento de extracción de CTAB, esencialmente según se describió (Rogers y Bendich, 1985, Plant Mol. Biol. 5, 69-76). Se digirieron aproximadamente 10 \mug de DNA genómico con la enzima de restricción EcoRI en el tampón apropiado, durante 16 horas a 37ºC. Este sitio de restricción se localizó una vez en ambas construcciones, entre la casete de expresión GUS y la casete NPT-II. Las mezclas de digestión se extrajeron con 1 volumen de fenol: cloroformo: isoamilalcohol (25:24:1, v/v, Gibco BRL) y se precipitaron con 0,1 volúmenes de NaAc 3 M (pH = 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 96%. El glóbulo de DNA se lavó con etanol al 70% y se disolvió a continuación en 20 \mul de agua destilada.

Cada muestra se separó sobre un gel de agarosa al 0,7% durante aproximadamente 16 horas a 2V/cm. El DNA se transfirió a una membrana de nailon (Hybond-N+, Amersham Life Science), usando transferencia Southern con NaOH 0,4 M. La transferencia se hibridó ( 16 horas, 65ºC) usando un fragmento GUS de 558 pares de bases (fragmento NcoI-EcoRV de pMOG18; Sijmons et al., Biotechnology vol. 8, marzo 1990, págs. 217-221) marcado con 32P-dCTP como sonda. Luego, la transferencia se lavó con una severidad de 0,2x SSC a 65ºC. Los resultados de la transferencia Southern se enumeran en la Tabla 3.

TABLA 3 Número de insertos de T-DNA observados en diversas líneas individuales con pMOG1059 y pMOG1317

línea pMOG1059	número de copias	línea pMOG1317	número de copias
66	5	1	3
67	5	2	1
68	1	3	1
69	2	5	1
70	3	6	4
71	3	7	4
72	3	8	2
73	5	9	2
74	6	11	1
76	2	12	1
77	9	14	1
78	3	15	3
79	4	16	2
80	2	17	4
81	3	18	3
82	1	19	2
83	3	20	1
85	1	21	3
86	3	22	2
87	4	23	2
88	9	25	3
89	2	26	2
90	1
91	2
Media	3,4	Media	2,2
desv. estándar	2,2	desv. estándar	1,1

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: MOGEN International nv

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Einsteinweg 97

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: LEIDEN

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Holanda

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2333 CB

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 31-(0)71-5258282

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: 31-(0)71-5221471

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos plásmidos para transformación de plantas y método de uso de los mismos.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMAS INFORMÁTICOS: descarga PatentIn nº 1,0, versión nº 1,25 (OEP).

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: EP 97201990.5

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE SOLICITUD: 30-junio-1997

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGGCAAAC GCTAATAAGG G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGCGGGTTT AACCTACTTC C

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTTGTCGA CGGCTGGCTG GTGGCAGGAT ATATTGTGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGCCGTCG ACAACAGCTC CCCGACCGGC AGCTCGGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGACGGGGT GCCTGGGGCG GTGGCGGGGC GGGCCGGGGC GTGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGAGCACGC CCCGGCCCGC CCCGCCACCG CCCCAGGCAC CCCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTCGAGAG GGTCGGTTAC TCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTCGACTC CAAGACGCCG AGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCAGATC TCCATGGATC GATGAGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCGATCCA TGGAGATCTG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCGGTCGA CC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACGCTAAAG GCAAACTTGA TTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAACCTACT TCCTTTGGTT CCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCGGCCCAT TTTAGTAGTAGAC GGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCAATTCGA ACCCCAGAGT CCCGTCCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGATCGTT TCGCATGATT G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAACTTATC AGTGATAAAG AATCCGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGATCAGAT TGTCGTTTCC CGCCTTC

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Claims

1. Vector para transformación de plantas que comprende un T-DNA con márgenes de T-DNA flanqueándolo, que comprende además una secuencia de ácido nucleico localizada en el exterior de los márgenes del T-DNA, la cual evita el desarrollo de transformantes de plantas que tengan más secuencias de vector que la secuencia de T-DNA, comprendiendo dicho ácido nucleico una secuencia que codifica un compuesto tóxico.

2. Vector según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto tóxico se selecciona del grupo de RNAsa, DNAsa, fitotoxinas, toxina de la difteria, proteasas y genes constitutivos antisentido.

3. Vector según la reivindicación 2, caracterizado porque el gen constitutivo se selecciona del grupo formado por ATP-sintasa, citocromo c, piruvato-quinasa, aminoacil-transferasa, y translocadores de fosfato, dicarboxilato, tricarboxilato y 2-oxo-glutarato.

4. Vector para transformación de plantas, que comprende un T-DNA con márgenes de T-DNA flanqueándolo, el cual comprende además una secuencia de ácido nucleico que evita el desarrollo de transformantes que tengan más secuencias de vector que la secuencia de T-DNA, caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico está localizada conectada estrechamente con el margen del T-DNA izquierdo, y se selecciona del grupo formado por una secuencia que comprende uno o más sitios de unión, los cuales reconocen proteínas que se unen al DNA bacteriano, con la condición de que los sitios de unión no formen un origen de replicación, y una secuencia rica en GC de 20-60 pares de bases, que tiene un contenido de GC de más de 80%.

5. Vector según la reivindicación 4, caracterizado porque el sitio de unión que reconoce las proteínas que se unen al DNA bacteriano es una secuencia vir.

6. Vector según la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia vir tiene la secuencia 5'TNCAATTGAAA
Y3' (en la cual N es cualquier nucleótido e Y es un nucleótido con base pirimidínica (T o C)).

7. Vector según la reivindicación 4, caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico es una secuencia rica en GC de aproximadamente 40 pares de bases.

8. Vector según la reivindicación 4 ó 7, caracterizado porque la secuencia tiene un contenido en GC de más de 90%.

9. Método para obtener plantas transgénicas que no contengan secuencias de vector fuera del T-DNA, transformando plantas con un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Hospedador que contiene un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

11. Hospedador de la reivindicación 10, caracterizado porque es una bacteria.

12. Hospedador de la reivindicación 11, caracterizado porque es un miembro de las Agrobacteriaceae, preferiblemente Agrobacterium o Rhizobacterium.

13. Hospedador de la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque es Agrobacterium tumefaciens.

14. Método para la transformación de plantas, caracterizado porque se usa un vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.