ES2217199T3 - Mutantes de quimioquinas en el tratamiento de la esclerosis multiple. - Google Patents
Mutantes de quimioquinas en el tratamiento de la esclerosis multiple.Info
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Abstract
Uso de un mutante de quimioquina CC, que contiene al menos dos mutaciones en el sitio catiónico del bucle en 40, y que respecto a la molécula de tipo salvaje, tiene una actividad de unión a GAG reducida, para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de la esclerosis múltiple y/o otras enfermedades desmielinizantes, en el que la quimioquina CC se selecciona entre RANTES, MIP-1alfa, MIP-1beta, MIP-3, MIP-4, HCC1,
Description
Mutantes de quimioquinas en el tratamiento de la
esclerosis múltiple.
La presente invención se refiere a mutantes de
quimioquinas CC, que contienen al menos dos mutaciones en el bucle
en 40, y que, en relación con la molécula de tipo salvaje, tienen
una actividad de unión a GAG reducida: se ha encontrado que dichas
quimioquinas mutadas son eficaces en el tratamiento de la
esclerosis múltiple y/o otras enfermedades desmielinizantes.
Las quimioquinas constituyen una familia de
citoquinas proinflamatorias pequeñas con propiedades activadoras y
quimiotácticas de leucocitos. Dependiendo de la posición de las
primeras cisteínas conservadas, la familia de quimioquinas se puede
dividir en quimioquinas C-C,
C-X-C y
C-X_{3}-C (Baggiolini M. et
al., Adv. Immunol. 1994, 55:97-179;
Baggiolini M. et al., Annu. Rev. Immunol. 1997,
15:675-705; Taub D. et al., Cytokine
Growth Factor Rev. 1996,
7(4):355-76).
Muchas quimioquinas
C-X-C tales como la
interleuquina-8 (IL-8) son
quimiotácticas para neutrófilos, mientras que las quimioquinas
C-C son activas en una variedad de leucocitos
incluyendo monocitos, linfocitos, eosinófilos, basófilos, células
NK y células dendríticas.
El dominio NH_{2}-terminal de
las quimioquinas está implicado en la unión al receptor y el
procesamiento del NH_{2}-terminal puede activar a
las quimioquinas o hacer a las quimioquinas completamente
inactivas.
Se ha ensayado la actividad de variantes
N-terminales de quimioquinas C-C
sintéticas como inhibidores o antagonistas de las formas naturales.
MCP-1, MCP-3 y RANTES que carecen
de los aminoácidos 8 a 9 NH_{2}-terminales son
inactivos en los monocitos y son útiles como antagonistas de
receptores (Gong JH. et al., J. Exp. Med. 1995,
181(2):631-40 y Gong JH. et al., J.
Bio. Chem. 1996, 271 (18): 10521-7).
La extensión de RANTES con una metionina da como
resultado la inactivación casi completa de la molécula y
Met-RANTES se comporta como un antagonista de la
auténtica (Proudfoot AE. et al., J. Biol.Chem. 1996
Feb 2;271(5): 2599- 603).
El documento WO 99/16877 se refiere a RANTES
truncados en el amino terminal, que carecen de los aminoácidos
NH_{2}-terminales correspondientes a los restos
de aminoácidos 1, 1-2, 1-3 ó
1-4 de RANTES natural, y que tienen actividad
antagonista de quimioquinas, así como a secuencias de ADNc que las
codifican, su uso en terapia y/o en diagnóstico de enfermedades, en
las que se requiere una actividad antagonista de los efectos de las
quimioquinas. RANTES (3-68) es la quimioquina
truncada antagonista preferida.
Aunque la actividad quimioatractora de RANTES y
de quimioquinas CC en general se haya estudiado principalmente en
relación con los receptores de membrana celulares específicos,
RANTES también puede interaccionar con glicosoaminoglicanos (GAG),
grupos de azúcares ramificados altamente variables añadidos
postraduccionalmente a varias proteínas llamadas genéricamente
proteoglicanos (PG). Dichas proteínas están presentes en la membrana
celular, en la matriz extracelular y en el torrente sanguíneo,
donde también puede haber GAG aislados.
La interacción con los GAG es una característica
común de muchas moléculas solubles señalizadoras de células
(interleuquinas, factores de crecimiento). Los PG o GAG aislados
pueden formar un complejo con moléculas solubles probablemente con
el fin de proteger esta molécula de la proteolisis en el entorno
extracelular, también se ha propuesto que los GAG pueden ayudar a la
correcta presentación de moléculas señalizadoras de células a su
receptor específico, y finalmente también a la modulación de la
activación de la célula diana.
En el caso de las quimioquinas, la concentración
en gradientes inmovilizados en el sitio de inflamación, y por
consiguiente, la interacción con receptores celulares y su estado
de activación, parece estar modulada por las diferentes formas de
GAG (Hoogewerf AJ. et al., Biochemistry 1997,
36(44):13570-8). Por lo tanto, se ha sugerido
que la modulación de dichas interacciones puede representar un
enfoque terapéutico en la enfermedad inflamatoria (Schwarz MK and
Wells TN, Curr. Opin. Chem. Biol. 1999,
3(4):407-17) y en la infección por VIH (Bums
JM. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999,
96(25):14499-504).
Los requisitos estructurales y efectos
funcionales de la interacción GAG- RANTES se han estudiado en
diferentes modelos. RANTES se une a los GAG en células endoteliales
de vena umbilical humana (HUVEC) en concentraciones micromolares con
una afinidad y especificidad mayor que otras citoquinas, como
MCP-1, IL-8 o
MIP-1alfa. Dicha interacción parece que no es
simplemente electrostática, sino que también depende de otros
parámetros como la longitud y N- y O-sulfatación de
los GAG (Kuschert GS. et al., Biochemistry 1999,
38(39):12959-68). Las líneas celulares
deficientes en GAG todavía se pueden unir a quimioquinas, pero la
presencia de GAG en la superficie celular potencia mucho su
actividad en los receptores, cuando están en bajas concentraciones
(Ali S. et al., J. Biol. Chem. 2000,
275(16):11721-7). Otros experimentos
mostraron que los GAG, el sulfato de heparina en particular,
facilitan la interacción de RANTES con la superficie celular de
macrófagos y la consiguiente inhibición de la infección por el VIH,
un resultado de acuerdo con la conocida resistencia de estas
células, que expresan poco el sulfato de heparina, a los efectos
antivíricos de RANTES (Oravecz T., et al., J. Immunol.
1997, 159(9):4587-92).
Los GAG solubles compiten con los GAG de la
membrana celular, y pueden actuar como inhibidores específicos de la
activación de superficie inducida por RANTES (Appay V., et
al., Int. Immunol. 2000,
12(8):1173-82), o como supresores de la
infección por el VIH (Bums JM., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 1999, 96(25):14499-504).
Algunos estudios de
estructura-función trataron de identificar el
dominio de RANTES responsable de la interacción con los GAG, puesto
que la secuencia de consenso tradicional (BBXB, donde B es un resto
básico y X puede ser cualquier resto) es demasiado genérica. Se
llevó a cabo un estudio de cartografía de epítopos usando un
anticuerpo monoclonal conseguido contra RANTES humano recombinante,
capaz de bloquear tanto los efectos antivíricos como la
movilización del calcio intracelular mediada por RANTES (Bums JM.
et al., J. Ex. Med. 1998,
188(10):1917-27). Este enfoque permite
definir los restos 55-66 como necesarios tanto para
dichas actividades como para la interacción con GAG, alegando que
la interacción con GAG puede tener una función complementaria o
distinta de la mediada por receptores canónicos, como también se
sugiere en un estudio de variantes de RANTES que tienen propiedades
de agregación alteradas (Appay V et al., J. Biol.
Chem. 1999, 274(39):27505-12).
La región 55-66, que representa
el segmento alfa-helicoidal
C-terminal, es homóloga al dominio de unión de GAG
de otras quimioquinas, tales como IL-8 (Witt DP. y
Lander AD., Curr. Biol. 1994,
4(5):394-400), y contiene un sitio catiónico
que contiene lisina y arginina (KKWVR). Dicha región
de unión es distinta del sitio de unión para receptores celulares,
que se sitúa en el extremo N (Pakianathan DR. et al.,
Biochemistry 1997, 36(32):9642-8), y
contiene algunos restos implicados en la agregación de monómeros de
RANTES, incluso aunque dichas mutaciones de desagregación parece
que no afectan a la interacción con los GAG (Czaplewski LG. et
al., J. Biol. Chem. 1999,
274(23):16077-84; documento WO 98/13495).
RANTES contiene otro sitio catiónico (RKNR) en
los restos 44-47, que se conserva en el dominio de
unión de GAG de otras quimioquinas, tales como MIP- 1\alpha
(Koopmann W. and Krangel MS., J. Biol. Chem. 1997,
272(15):10103- 9) y MIP-1\beta (Koopmann W.
et al., J. Immunol. 1999,
163(4):2120-7).
Las variantes de RANTES humana que contienen una
mutación en estos sitios catiónicos, se han descrito como
antagonistas de RANTES que tienen potenciales aplicaciones
terapéuticas en el tratamiento de la infección por VIH y
enfermedades inflamatorias o alérgicas (WO 99/33989).
También se ha descrito que sólo un triple mutante
de RANTES, en el que tres restos en las posiciones 44, 45, y 47, se
han sustituido por Alanina, ha perdido la capacidad de unión a GAG
(A. Proudfoot et al., Chemokine Gordon Conference,
Session I, July 24^{th} 2000, comunicación personal).
Ahora se ha encontrado que las quimioquinas CC,
que contienen al menos dos mutaciones en el sitio catiónico del
llamado "bucle en 40", son eficaces en el tratamiento de la
esclerosis múltiple y/o otras enfermedades desmielinizantes. Este
sitio representa un patrón de unión de GAG conservado en las
quimioquinas CC (como RANTES, MIP-1alfa y
MIP-1beta, MIP-3,
MIP-4, HCC1, I309, MCP-2). Todos
estos mutantes de quimioquinas tienen una actividad de unión a GAG
reducida, cuando se comparan con las correspondientes moléculas de
tipo salvaje.
La región en la que debe haber al menos dos
mutaciones presentes de acuerdo con la invención, el llamado bucle
en 40, se indica para una serie de quimioquinas CC en la figura 1.
En particular, se ha encontrado que el triple mutante de RANTES, en
el que se han sustituido tres restos básicos en las posiciones 44,
45 y 47 por Alanina, es activo en un modelo de animal para el
tratamiento de la esclerosis múltiple. El triple mutante de RANTES
mostró un efecto relacionado con la dosis en el modelo de EAE
murino y una eficacia comparable con el tratamiento de referencia
con IFN-beta recombinante. Se han encontrado
resultados análogos con un triple mutante de RANTES truncado, en el
que se han sustituido tres restos en las posiciones 44, 45 y 47 por
Alanina y que carece de los dos primeros aminoácidos
N-terminales. Este mutante de RANTES truncado (que
tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2) es nuevo y
representa otro objetivo de la presente invención.
Se han generado pruebas experimentales similares
en relación con los triples mutantes de MIP-1alfa y
MIP-1beta, que ya se conocen y que en la presente
memoria se identifican como triple mutante de
MIP-1\alpha R18A-R46A- R48A
(Koopmann W. and Krangel MS., J. Biol. Chem. 1997,
272(15):10103-9) y triple mutante en 40 de
MIP-1\beta
K45A-R46A-K48A (Laurence JS.,
Biochemistry 2001, 40:4990-4999).
La expresión "una actividad de unión a GAG
reducida" significa que los mutantes de la invención tienen una
menor capacidad para unirse a los GAG, es decir, se une un
porcentaje menor de cada uno de estos mutantes a los GAG (como
sulfato de heparina) con respecto a la molécula de tipo salvaje.
Más preferiblemente son mutantes de RANTES
humano, en los que los tres aminoácidos básicos en las posiciones
44, 45 y 47 de la molécula de tipo salvaje se han sustituido por
otros aminoácidos. Dichos restos se pueden sustituir por restos
alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares, tales como
por ejemplo Ala, Ser, Thr, Pro y Gly. La alanina es el
preferido.
Los mutantes de RANTES que se ha encontrado que
son particularmente eficaces en el tratamiento de la EM son los que
tienen las secuencias de aminoácidos indicadas en el SEQ ID NO:2 y
SEQ ID NO:3, respectivamente.
Otro objetivo de la presente invención es el uso
de mutantes de quimioquinas como se han definido antes, para
producir una composición farmacéutica para tratar la esclerosis
múltiple y/o otras enfermedades desmielinizantes.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad del
SNC lentamente progresiva caracterizada por parches diseminados de
desmielinización en el cerebro y médula espinal, que dan como
resultado múltiples y variados síntomas y señales neurológicos,
normalmente con remisiones y exacerbaciones (véase The Merck
Manual, sixteenth edition).
La causa es desconocida pero se sospecha de una
anomalía inmunológica, con pocos hechos que indiquen actualmente un
mecanismo específico. Entre las causas postuladas se incluyen
infección por un virus lento o latente, y mielinolisis por enzimas.
La IgG normalmente es elevada en el LCR, y valoraciones elevadas se
han asociado con una variedad de virus, incluyendo sarampión. La
importancia de estos descubrimientos y de las asociaciones
descritas con alotipos de HLA y número alterado de células T no
está claro, puesto que las pruebas son algo contradictorias. Una
mayor incidencia familiar sugiere susceptibilidad genética; las
mujeres están afectadas con algo más de frecuencia que los hombres.
Parece que están presentes factores medioambientales. Aunque la
edad de aparición en general es de 20 a 40 años. La EM se ha
asociado con la zona geográfica donde un paciente ha pasado sus
primeros 15 años. La nueva ubicación después de los 15 años no
altera el riesgo.
Hay placas o islas de desmielinización con
destrucción de oligodendroglías e inflamación perivascular
diseminadas por el SNC, principalmente en la sustancia blanca, con
predilección por las columnas lateral y posterior (especialmente en
las regiones cervical y dorsal), los nervios ópticos y zonas
periventriculares. Los tractos en el mesencéfalo, protuberancia y
cerebelo también están afectados, y puede estar afectada la
sustancia gris tanto en el cerebro como en la médula.
Los cuerpos celulares y axones normalmente se
mantienen, especialmente en las lesiones tempranas. Más tarde, se
pueden destruir los axones, especialmente en los tractos largos, y
una gliosis fibrosa da a los tractos su aspecto "esclerótico".
Se pueden encontrar simultáneamente tanto las lesiones tempranas
como las tardías. Se han demostrado cambios químicos en
constituyentes lipídicos y proteínicos de la mielina en y entorno a
las placas.
La enfermedad se caracteriza por diferentes
dolencias y disfunciones del SNC, con remisiones y exacerbaciones
recurrentes que persisten.
La formación de imágenes por resonancia magnética
(MRI) es la técnica de formación de imágenes para diagnóstico más
sensible; puede mostrar muchas placas. Las lesiones también pueden
ser visibles en escaneados de TC potenciados con contraste.
Los avances terapéuticos en la esclerosis
múltiple (EM) han surgido lentamente, en parte debido a la
comprensión incompleta de la patogénesis del trastorno. Para el
tratamiento con base empírica, los obstáculos principales para
avanzar incluyen el curso altamente variable de la EM, la naturaleza
de largo plazo de las medidas resultantes más importantes, y la
falta de marcadores objetivos del efecto del tratamiento,
particularmente a corto plazo.
Aunque la patogénesis de la EM sigue sin
conocerse, se sigue estudiando la historia natural. Se han
desarrollado medidas resultantes objetivas basadas en la formación
de imágenes por resonancia magnética (MRI), y ahora se conocen
muchas de las dificultades de los ensayos clínicos, que han
conducido a mejores métodos de ensayo y mejor interpretación de los
resultados.
Por lo tanto, otro objetivo de la presente
invención, es el método para tratar la EM administrando una
cantidad eficaz de los mutantes de quimioquinas de la invención,
junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Una "cantidad eficaz" se refiere a una
cantidad de los ingredientes activos que es suficiente para afectar
al curso y gravedad de la enfermedad, conduciendo a la reducción o
remisión de dicha patología. La cantidad eficaz dependerá de la vía
de administración y el estado del paciente.
Un objetivo adicional de la presente invención
son las composiciones farmacéuticas que contienen los mutantes de
quimioquinas de la invención, en presencia de uno o más excipientes
farmacéuticamente aceptables, para tratar la EM y/o otras
enfermedades desmielinizantes.
"Farmacéuticamente aceptable" se entiende
que abarca cualquier vehículo, que no interfiera con la eficacia de
la actividad biológica del ingrediente activo, y que no es tóxico
para el hospedante al que se administra. Por ejemplo, para
administración parenteral, los ingredientes activos anteriores se
pueden formular en forma de dosificación unitaria para inyección,
en vehículos tales como solución salina, solución de dextrosa,
albúmina de suero y solución de Ringer.
Además del vehículo farmacéuticamente aceptable,
las composiciones de la invención también pueden comprender
cantidades menores de aditivos, tales como estabilizantes,
excipientes, tampones y conservantes.
La administración de dicho ingrediente activo
puede ser por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Otras
vías de administración, que pueden establecer los niveles deseados
en la sangre de los ingredientes respectivos, están comprendidas en
la presente invención.
La dosis óptima de ingrediente activo se puede
seleccionar adecuadamente de acuerdo con la vía de administración,
estado y características (sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño)
del paciente, grado de los síntomas, tratamientos simultáneos,
frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y
manipulación de los intervalos de dosificación establecidos dependen
de la capacidad de los expertos.
Normalmente, una dosificación diaria del
ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0,01 a 100
miligramos por kilogramo de peso corporal. Normalmente, 1 a 40
miligramos por kilogramo por día dados en dosis divididas o en
forma de liberación sostenida, es eficaz para obtener los resultados
deseados. La segunda o posteriores administraciones se pueden
llevar a cabo con una dosificación que es la misma, menor o mayor
que la dosis inicial o previa administrada al individuo.
La presente invención se ha descrito con
referencia a realizaciones específicas, pero el contenido de la
descripción comprende todas las modificaciones y sustituciones que
un experto en la técnica puede llevar a cabo sin ir más allá del
significado y propósito de las reivindicaciones.
La invención se describirá ahora mediante los
siguientes Ejemplos, que no se deben considerar como limitantes de
la presente invención de ninguna forma. Los Ejemplos se referirán a
las Figuras especificadas a continuación.
Figura 1: representa una alineación de algunas
quimioquinas CC de ejemplo, alineadas al nivel del bucle en 40. Este
segmento de proteína y el sitio catiónico que corresponde al patrón
de unión de GAG están recuadrados.
Figura 2: muestra el mapa del plásmido usado para
hacer RANTES de tipo salvaje, y sus mutantes de acuerdo con los
Ejemplos.
Figura 3: muestra los resultados del Ensayo de
Unión Competitiva de [^{125}I]-RANTES y mutantes
por heparina en el ensayo de perlas de heparina.
Figura 4: describe los Ensayos de Unión de
Equilibrio Competitivo de RANTES y el triple mutante de RANTES en
40.
Figura 5: muestra la inducción de quimiotaxis de
monocitos y células T por RANTES y los triples mutantes de RANTES en
40 y 50.
Figura 6: muestra la inhibición del reclutamiento
celular peritoneal por el triple mutante de RANTES en 40.
Figura 7: muestra la inhibición del reclutamiento
celular peritoneal inducido por RANTES, por el triple mutante de
RANTES (3-68) en 40 truncado producido en Pichia
pastoris.
Figura 8: muestra la inhibición del reclutamiento
celular peritoneal inducido por MIP-1\beta, por
el triple mutante en 40 de MIP-1\beta
(K45AR46AK48A).
Figura 9: muestra la inhibición del reclutamiento
celular peritoneal inducido por MIP-1\alpha, por
el triple mutante de MIP-1\alpha
(R18A-R46A- R48A).
Figura 10: muestra la inhibición del
reclutamiento celular inducido por tioglicolato, por el triple
mutante de RANTES en 40.
Figura 11: muestra la inhibición de la aparición
de la encefalomielitis autoinmune experimental por todos los triples
mutantes de RANTES en 40 de la invención.
La mutagénesis de RANTES se logró por una técnica
de reacción en cadena de la polimerasa inversa. Las mutaciones
puntuales se introdujeron en uno de los dos cebadores usados para
hibridar con la secuencia que codifica RANTES humano (nº de acceso
en Gen Bank NM_002985) en la orientación opuesta. Con el fin de
mejorar la eficacia de la reasociación del cebador (especialmente
cuando se introdujeron mutaciones múltiples en los cebadores), el
ADN se desnaturalizó en medio alcalino. El ADN desnaturalizado se
diluyó a una concentración de aproximadamente 10 pg/reacción para
evitar la incorporación de ADN sin mutar en la reacción de
transformación.
La numeración de los aminoácidos dada en los
Ejemplos y en la Descripción considera la proteína madura, es decir,
empezando con Ser, que es el aminoácido en la posición 24 de
acuerdo con la Lista de Secuencias. Por lo tanto, para tener una
correspondencia perfecta entre los números de aminoácidos en la
Lista de Secuencias y en los Ejemplos, se debe añadir 23 a los
números que aparecen en los Ejemplos o en la Descripción.
Las secuencias de los cebadores mutágenos usados
son las siguientes, y las bases mutadas están
subrayadas:
La amplificación se llevó a cabo en un ciclador
térmico de ADN (Perkin- Elmer-Cetus 480) durante 35
ciclos usando ADN-polimerasa pfuturbo® (Stratagene).
El ADN se ligó y transformó en células E. coli competentes
Top 10 F' (Invitrogen).
La secuencia de los mutantes se verificó por
secuenciación del ADN.
Se obtuvieron fragmentos de ADN por PCR como se
ha explicado antes y se han clonado en el plásmido pET24d (figura
2), generando una serie de vectores. La secuencia que codifica
RANTES TS o natural se clona en 3' hasta el promotor pT7, entre los
sitios KbaI y NheI/XhoI. El plásmido contiene
dos genes marcadores (Km y lacl) y un origen de replicación (Ori
fl).
Los vectores resultantes se usaron para volver a
transformar la cepa de E. coli BL21(DE3), que permite
la expresión intensa de proteína usando el sistema de pT7/ Lacl. La
expresión de proteína se indujo por adición de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) 1 mM al cultivo. Las células se recogieron y se volvieron a
suspender en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,
MgCl_{2} 10 mM, benzamidina/HCl 5 mM, DTT 1 mM, fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 0,1 mM (PMSF), DNasa 20 mg/l). Las células se
rompieron mediante el paso tres veces por la unidad de prensa
French. Después la suspensión se centrifugó a 10.000 x g durante 30
min a 4ºC. El sedimento de los cuerpos de inclusión que contenía
RANTES TS o uno de los mutantes de RANTES se solubilizó en Tris/HCl
0,1 M, pH 8,0, que contenía Guanidina/HCl 6 M, y DTT 1 mM, y se
agitó durante 30 min a 60ºC. La solución se dializó frente a 3
cambios de ácido acético al 1%. El material insoluble se separó por
centrifugación a 10.000 x g durante 30 min. El líquido sobrenadante
que contenía RANTES TS o uno de los mutantes de RANTES se
liofilizó.
El polvo liofilizado se disolvió en Tris/HCl 0,1
M, pH 8,0, que contenía guanidina/HCl 6 M, y DTT 1 mM para obtener
una concentración de aproximadamente 1 mg/ml. Las proteínas se
renaturalizaron por dilución gota a gota en un volumen 10 x el de
la solución de guanidina de Tris/HCl 20 mM, pH 8,0 que contenía
glutatión oxidado 0,01 mM y glutatión reducido 0,1 mM. La solución
se agitó toda la noche a 4ºC. El material insoluble se separó por
centrifugación a 10.000 x g durante 30 min. El pH se ajustó a 4,5
con ácido acético, y la conductividad se ajustó a 20 mS por
dilución con agua. La solución se aplicó a una columna HiLoad S
26/10 previamente equilibrada con acetato sódico 20 mM, pH 4,5, y la
proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl
0-2 M en el mismo tampón. Las fracciones que
contenían RANTES TS o una de las proteínas mutantes de RANTES se
mezclaron, se dializaron frente a 3 cambios de ácido acético y se
liofilizaron.
Las proteínas liofilizadas se disolvieron en
tampón de Tris/HCl 50 mM, pH 8,0. La secuencia líder MKKKWPR
obtenida del procedimiento de clonación se escindió de las
proteínas RANTES TS o una de las proteínas mutantes de RANTES por
incubación con endoproteinasa Arg-C (enzima:sustrato
1:600 peso/peso) toda la noche a 37ºC. Las proteínas escindidas se
separaron de la proteína no dividida por cromatografía de
intercambio catiónico en una columna HiLoad S 26/10 previamente
equilibrada con acetato sódico 20 mM, pH 4,5, que contenía urea 6
M, y las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl
0-2 M en el mismo tampón. Las fracciones divididas
se mezclaron y dializaron frente a dos cambios de ácido acético al
1%, y finalmente frente a ácido trifluoroacético al 0,1%, y después
se liofilizaron (Edgerton MD et al., pg.
33-40, y Proudfoot AE et al., Pg.
75-87 en "Chemokine Protocols", Methods in
Molecular Biology 2000, vol. 138, Humana Press).
La autenticidad de las proteínas mutantes de
RANTES y TS se verificó por espectrometría de masas. Con un
procedimiento análogo se produjo otro mutante que contenía una Met
como extensión del extremo NH_{2}, así como los mutantes
sencillos o triples de RANTES en 40 y los mutantes sencillos o
triples en 50.
El triple mutante de RANTES en 40 maduro
(R44A-K45A-R47A) se creó usando un
megacebador basado en mutagénesis por PCR (Datta AK., Nucleic
Acid Research 1995, 23(21):4530-31). Se
clonó en el vector de expresión de Pichia pastoris, pPIC9K,
en el marco con el pre-pro-péptido
señal Mat alfa de S. cerevisiae.
Después de confirmar la secuencia, el plásmido se
transfirió a la cepa hospedante de Pichia pastoris
GS115(his4) por electroporación. Se cribó la expresión del
mutante de RANTES en los productos acabados con His^{+}. Los
estudios de expresión a pequeña escala se llevaron a cabo usando
procedimientos patrón como se describe en el Kit de expresión de
Pichia de Invitrogen (Life Technologies). Brevemente, el cultivo se
expandió en un medio enriquecido usando glicerol como fuente de
carbono, después de lo cual se sedimentó y se volvió a suspender en
medio que contenía metanol para inducir la expresión de la proteína
mutante de RANTES. La secreción del mutante de RANTES en el medio se
detectó en SDS-PAGE teñido con Azul Coomassie.
Se usó un producto acabado que segregaba altos
niveles de mutante de RANTES (aproximadamente
500-750 mg/l) para aumentar la escala en matraces de
agitación grandes. El caldo fermentado se centrifugó a 5.000 rpm y
el líquido sobrenadante se usó para purificar.
Se purificó la proteína del líquido sobrenadante
por una sola etapa de cromatografía en una columna de
heparina-sepharosa, equilibrada con
Tris-HCl 0,1 M, y eluida con un gradiente lineal de
NaCl 0-2M en el mismo tampón, usando 20 volúmenes de
columna. La autenticidad de la proteína se verificó por
espectrometría de masas y se descubrió que en dicho sistema el
mutante de RANTES (R44A-K45A-R47A)
así producido también está truncado en el extremo N con respecto a
la molécula de tipo salvaje, es decir, carece de los 2 primeros
aminoácidos. Por lo tanto, el mutante así obtenido se ha
identificado como el triple mutante de RANTES
(3-68) en 40 (R44A, K45A, R47A) y su secuencia de
aminoácidos es la del SEQ ID NO: 3.
La cromatografía en
heparina-sepharosa se llevó a cabo usando 50 \mug
de proteínas RANTES TS o mutada, que se cargaron en una columna de
heparina- Sepharosa equilibrada con Tris/HCl 25 mM, pH 8,0 y NaCl 50
mM, y se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl
0-2 M en Tris/HCl 25 mM, pH 8,0.
La cromatografía en
heparina-sepharosa se llevó a cabo usando 50 \mug
de proteínas RANTES TS o mutada que se cargaron en una columna de
intercambio catiónico MonoS equilibrada con acetato sódico 50 mM, pH
4,5. La proteína se eluyó con un gradiente de NaCl
0-2 M.
El ensayo de unión competitivo se llevó a cabo
usando RANTES TS, el triple mutante de RANTES en 50, y el triple
mutante de RANTES en 40 (SEQ ID NO:2 - también identificado en la
presente memoria como
"RANTES-R44A-K45A-R47A")
que se radiomarcó con ^{125}I de Amersham hasta una actividad
específica de 2200 mCi/mol. Las placas con filtro que tenían 96
pocillos se empaparon con tampón de unión (HEPES 50 mM, H 7,2, que
contenía CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 5 mM, NaCl 0,15 mM y BSA al
0,5%). Se llevaron a cabo diluciones seriadas de heparina en el
tampón de unión para cubrir el intervalo de concentraciones de 20
mg/ml a 1 \mug/ml. El ensayo se llevó a cabo en un volumen total
de 100 \mul, por adición de 25 \mul de las diluciones de
heparina, 25 \mul de [^{125}I]- quimioquina 0,4 nM, 25 \mul de
perlas de heparina (0,2 \mug/ml en agua) y 25 \mul de tampón de
unión, a cada pocillo. El ensayo se llevó a cabo por triplicado.
Las placas se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante
4 horas. Las placas con filtro se lavaron 3 veces con 200 \mul de
tampón de lavado usando una bomba de vacío para separar la
quimioquina marcada no unida. Después se añadieron 50 \mul de
líquido de centelleo a cada pocillo y se contó la radiactividad (1
min/pocillo). Los datos se analizaron usando el Software
GraFit.
Los ensayos se llevaron a cabo en membranas de
transfectantes de CHO que expresaban CCR1 o CCR5 usando un ensayo de
proximidad de centelleo (SPA) usando
[^{125}I]-MIP-1\alpha como
trazador. Los competidores se prepararon por diluciones seriadas de
las quimioquinas sin marcar en tampón de unión para cubrir el
intervalo de 10^{-6}-10^{-12} M. El tampón de
unión usado era HEPES 50 mM, pH 7,2, que contenía CaCl_{2} 1 mM,
MgCl_{2} 5 mM, NaCl 0,15 M y BSA al 0,5%. Se solubilizaron perlas
de SPA Wheatgerm (Amersham) en PBS hasta 50 mg/ml, y se diluyeron
en el tampón de unión hasta 10 mg/ml, y la concentración final en
el ensayo era 0,25 mg/pocillo. Se almacenaron las membranas
preparadas a partir de células CHO que expresaban CCR1 o CCR5 a
-80ºC y se diluyeron en el tampón de unión a 80 \mug/ml. Se
mezclaron volúmenes iguales de reservas de membrana y perlas antes
de llevar a cabo el ensayo, para reducir el ruido de fondo. La
concentración final de membrana era 2 \mug/ml y la de
[^{125}I]-MIP-1\alpha era 0,1
nM. Las placas se incubaron a temperatura ambiente con agitación
durante 4 horas. Se midió la radiactividad y los datos se
analizaron como se ha descrito para el ensayo de unión a la
heparina.
La quimiotaxis de monocitos se llevó a cabo
usando un ensayo de microcámara de Boyden. Los monocitos se
purificaron de capas leucocitarias usando el siguiente
procedimiento de aislamiento: se diluyeron 100 ml de capa
leucocitaria con 100 ml de PBS, se pusieron en capas sobre Ficoll y
se centrifugaron a 600 x g durante 20 min a temperatura ambiente.
Se recogieron las células que formaban la interfase, se lavaron dos
veces con PBS, y se volvieron a suspender con una concentración de
40-100 x 10^{6}/ml en medio RPMI 1640 que
contenía suero de ternero fetal (FCS) inactivado al 5%, glutamina 2
mM y HEPES 25 mM, pH 7,2. Después se purificaron más de la fracción
de linfocitos por adición de 10^{6} glóbulos rojos de oveja/ml,
se dejaron colorear de rosa toda la noche a 4ºC, y se separaron por
una segunda centrifugación en gradiente con Ficoll a 900 x g
durante 20 min a temperatura ambiente. Los monocitos se encontraron
en la interfase entre el Ficoll y el tampón, y las células T estaban
en el sedimento. Los monocitos se lavaron en PBS y se volvieron a
suspender con 2,5 x 10^{6}/ml en medio RPMI 1640. La pureza se
midió por dispersión frontal y lateral por análisis de FACS, y se
encontró que era 40-80%, dependiendo del donador.
Las quimioquinas se diluyeron hasta un volumen final de 30 \mul,
cubriendo el intervalo de concentraciones de
10^{-6}-10^{-12} M en medio RPMI, y se pusieron
en los pocillos inferiores. Se puso un filtro de 5 \mum de tamaño
de poros (Neuroprobe) para monocitos y 8 \mum para células T sobre
los pocillos inferiores asegurándose de que no había burbujas de
aires, y el sistema se selló. Se pusieron 50 microlitros de la
suspensión celular (2,5 x 10^{6} células/ml) en medio RPMI en los
pocillos superiores. La cámara se incubó durante 30 minutos para
monocitos y 1,5 horas para células T a 37ºC en atmósfera de O_{2}.
Después se descartaron las células, la superficie superior de la
membrana se limpió por raspado de las células, y después la membrana
se lavó con PBS. La membrana se fijó por inmersión en MeOH durante
1 minuto, se secó al aire y se tiñó con soluciones de campos A y B.
Se contaron las células que habían migrado por selección aleatoria
de campos para cada pocillo con un objetivo 20x en un microscopio
patrón equipado con software de análisis de imágenes IBAS. Los
datos se ajustaron usando el software GraFit.
En un primer ensayo, se indujo el reclutamiento
celular por inyección intraperitoneal de 10 \mug de la quimioquina
diluida en 0,2 ml de solución salina estéril (NaCl sin LPS) en
ratones BALB/c hembras de 8 a 12 semanas de edad. Se administraron
los mutantes de quimioquina (10 \mug de la quimioquina diluida en
0,2 ml de solución salina estéril) 30 min antes de la administración
del agonista. Dieciséis horas después, los ratones se sacrificaron
con CO_{2} aerosolizado. El lavado peritoneal se llevó a cabo con
3 lavados con 5 ml de PBS y los lavados se mezclaron. Las células
se centrifugaron a 600 x g durante 10 min, se volvieron a suspender
en un volumen final de 1 ml, y se contaron los leucocitos totales
inducidos con un hemocitómetro.
En un segundo ensayo, el reclutamiento celular se
indujo por inyección intraperitoneal de 200 \mul de una solución
de tioglicolato al 3% en agua destilada, en ratones BALB/c hembras
de 8 a 12 semanas de edad (Día 1). El mutante de quimioquina (10
\mug de la quimioquina diluidos en 0,2 ml de solución salina
estéril) se administró 30 min antes de la administración de
tioglicolato. Después, el mutante de quimioquina se administró
diariamente durante 3 días (Día 2, 3 y 4). Los ratones se
sacrificaron el día 5 con CO_{2} aerosolizado. El lavado
peritoneal se llevó a cabo con 3 lavados con 5 ml de PBS, y los
lavados se mezclaron. Las células se centrifugaron a 600 x g durante
10 min, se volvieron a suspender en un volumen final de 1 ml, y los
leucocitos totales inducidos se contaron con un hemocitómetro.
Se inmunizaron ratones hembra C57 BL/6NCrIBR de 8
semanas de edad que pesaban 18-22 gramos (día = 0)
por inyección s.c. en la parte posterior del cuello, de 0,1 ml de
una emulsión que contenía 200 \mug de péptido
MOG_{35-55} (Neosystem, Strasbourg, Francia) en
adyuvante completo de Freund (CFA con Mycobacterium, Difco,
Detroit, EE.UU.) que contenía 0,25 mg de Mycobacterium
tuberculosis. Antes de la inyección s.c., recibieron una
inyección i.v. de 200 \mul de 300 ng de toxina pertussis (List
Biological Lab., Campbell, CA, EE.UU.) disuelta en PBS en la vena
de la cola. El día 2 se dio a los animales una segunda inyección
i.p. de 300 ng de toxina pertusis.
Este procedimiento da como resultado, empezando
aproximadamente el día 8-10, la aparición de una
parálisis progresiva que partía de la cola y ascendía
progresivamente hasta las extremidades anteriores.
El estudio implicaba grupos de 10 animales cada
uno. Todos los grupos se inmunizaron con péptido
MOG_{35-55} en CFA y toxina pertussis, de acuerdo
con el protocolo de inmunización.
| Grupo 1 | Grupo testigo positivo con dosificación de vehículo solo (PBS) por vía i.p. |
| Grupo 2 | Grupo testigo positivo con dosificación de vehículo solo (PBS) por vía s.c. |
| Grupo 3 | dosificación de 10 \mug/ratón i.p. de triple mutante de RANTES en 40 |
| Grupo 4 | dosificación de 1 \mug/ratón i.p. de triple mutante de RANTES en 40 |
| Grupo 5 | dosificación de 10 \mug/ratón i.p. de triple mutante de Met-RANTES en 40 |
| Grupo 6 | dosificación de 1 \mug/ratón i.p. de triple mutante de Met-RANTES en 40 |
| Grupo 7 | dosificación de 10.000 U/ratón s.c. de interferón beta recombinante de ratón (m-IFN-\beta) |
| Grupo 8 | dosificación de 20.000 U/ratón s.c. de m-IFN-\beta |
Se usó PBS para diluir todos los triples mutantes
de RANTES en 40, todos los triples mutantes de
Met-RANTES en 40 y
m-IFN-\beta a la concentración
adecuada.
El triple mutante de RANTES en 40, triple mutante
de Met-RANTES en 40 y m-
IFN-\beta, se administraron diariamente por vía
i.p. con un volumen de administración de 200 \mul/ratón. Se
administró una dosificación de 200 \mul/ratón de PBS a los grupos
1, 2.
El tratamiento empezó para cada animal el día de
experimentación 4 (aproximadamente 3-5 días antes de
la aparición habitual de la enfermedad) y después continuó durante
14 días consecutivos (sacrificio de los animales el día de
experimentación 18).
A partir del día 5 se examinó en los animales
individualmente la presencia de parálisis mediante una puntuación
clínica como sigue:
0 = no hay señal de enfermedad
0,5 = parálisis parcial de la cola
1 = parálisis de la cola
1,5 = parálisis de la cola + parálisis parcial
unilateral de extremidades posteriores
2 = parálisis de la cola + debilidad de las
extremidades posteriores o parálisis parcial de las extremidades
posteriores
2,5 = parálisis de la cola + parálisis parcial de
las extremidades posteriores (pelvis inferior)
3 = parálisis de la cola + parálisis completa de
las extremidades posteriores
3,5 = parálisis de la cola + parálisis completa
de las extremidades posteriores + incontinencia
4 = parálisis de la cola + parálisis de las
extremidades posteriores + debilidad o parálisis parcial de las
extremidades anteriores
5 = moribundo o muerte
Se analizaron las proteínas RANTES purificadas
mutadas en una o tres posiciones por cromatografía en heparina, y la
concentración de NaCl necesaria para eluirlas se comparó con el
perfil de elución de RANTES TS. Puesto que la interacción con la
heparina es electrostática, los mutantes también se sometieron a
cromatografía de intercambio catiónico en una columna MonoS. Esto
da como resultado una disminución de la concentración de NaCl
necesaria para eluirlas, puesto que la mutagénesis ha eliminado los
restos básicos. La diferencia de concentración de NaCl obtenida en
la cromatografía de intercambio catiónico se resta de la obtenida
en la cromatografía en heparina. Si este valor es positivo, se
identifica una interacción específica con heparina (Tabla 1).
Se llevó a cabo una medición directa de la unión
a la heparina con los mutantes triples de RANTES en 40 y 50 en un
ensayo de unión competitivo. RANTES TS y los mutantes se yodaron
con Amersham, y todos tenían la misma reactividad específica de
2.200 mCi/mol. Sin embargo, sólo aproximadamente 20% de los triples
mutantes en 40 se unieron a las perlas de heparina, con un número
máximo de cpm de 4.000 comparado con 22.000 cpm para RANTES TS y el
mutante en 50 (figura 3). Esto demuestra que estos restos en el
bucle en 40, que se han mutado, contribuyen a la mayor parte de la
capacidad de unión a la heparina de RANTES. Por otra parte, esto
también demuestra que el patrón de unión de GAG putativo en el
bucle en 50 no es un "verdadero" sitio de unión de GAG.
La capacidad de los mutantes de RANTES triple en
40 y triple en 50 para competir con [^{125}I]
MIP-1\alpha por la unión a CCR1 y CCR5
recombinante en membranas se preparó a partir de transfectantes
estables de CHO. No había diferencia significativa en ninguno de
los mutantes sencillos en ambos receptores (no se muestran los
resultados). Ninguno de los triples mutantes mostró una diferencia
en la unión a CCR5 comparado con la proteína RANTES TS. Sin
embargo, en CCR1, el triple mutante en 40 tenía una reducción de 100
veces en la afinidad, mientras que el triple mutante en 50 sólo
mostró una pequeña pérdida (3 veces) de afinidad (Figura 4).
Los mutantes triple en 40 y triple en 50 podían
inducir todos quimiotaxis de monocitos con actividades comparables
a RANTES TS, con excepción del triple mutante en 40 que sólo podía
inducir quimiotaxis significativa con concentración 1 \muM. Sin
embargo, los mutantes triple en 40 y triple en 50 eran equipotentes
en su capacidad para inducir quimiotaxis de células T (Figura 5).
Los resultados obtenidos en los ensayos de quimiotaxis de monocitos
se corresponden bien con los obtenidos en los ensayos de unión al
receptor.
Los resultados obtenidos en los ensayos de
quimiotaxis de monocitos se corresponden bien con los obtenidos en
los ensayos de unión al receptor. La pérdida de actividad del
triple mutante de RANTES en 40 en la quimiotaxis de monocitos se
corresponde con la pérdida de afinidad para CCR1.
El triple mutante de RANTES en 40 no era capaz de
inducir el reclutamiento celular en el peritoneo con la dosis (10
\mug/ratón) con la que RANTES produce un reclutamiento sustancial
(figura 6).
Además, si se administran 10 \mug del mutante
30 minutos antes de la administración de RANTES, se inhibe el
reclutamiento celular inducido por RANTES. Por lo tanto, la
abrogación de la unión de GAG produjo un inhibidor del
reclutamiento celular inducido por quimioquinas in vivo.
Se muestran resultados análogos en la figura 7
con el triple mutante en 40 de RANTES (3-68)
truncado (producido en Pichia pastoris), en la figura 8 con
el triple mutante en 40 de MIP-1\beta
(K45A-R46A-K48A) y en la figura 9
con el triple mutante en 40 de MIP-1\alpha
(R18A-R46A-R48A). El reclutamiento
celular estimulado por tioglicolato fue inhibido también por el
triple mutante de RANTES en 40, como se muestra en la figura
10.
El triple mutante de RANTES en 40 mostró un
efecto relacionado con la dosis en el modelo de EAE murino. La
proteína, administrada tanto con 1 \mug como 10 \mug/ratón
diario i.p., empezando el día 10 después de la inmunización
principal con MOG, demostró una eficacia comparable con el
tratamiento de referencia, el m- IFN-\beta
recombinante (Figura 11). La aparición de la enfermedad se retrasó
significativamente y la gravedad de la enfermedad (evaluada por el
área bajo la curva) también se redujo significativamente. Además,
la media de la puntuación clínica máxima alcanzada durante el
experimento también disminuyó. El otro mutante (triple mutante de
Met-RANTES en 40) no mostró ningún efecto
beneficioso en el mismo experimento.
Los resultados muestran un apreciado efecto
beneficioso del tratamiento con todos los triples mutantes de
RANTES en 40, que reducen las señales clínicas de EAE crónica en
ratones después de inmunización con MOG. Por lo tanto, el triple
mutante de RANTES en 40 tiene un efecto terapéutico beneficioso, y
se puede usar como tratamiento en enfermedades de desmielinización
crónicas tales como la EM.
La siguiente Tabla 2 aclarará la identidad de las
secuencias descritas en las Listas de Secuencias y a lo largo del
texto.
| SEQ ID NO: | Descripción de la secuencia |
| 1 | RANTES DE TIPO SALVAJE (TS) |
| 2 | TRIPLE MUTANTE DE RANTES(3-68) EN 40 |
| 3 | TRIPLE MUTANTE DE RANTES EN 40 |
| 4 | TRIPLE MUTANTE DE MIP-1-alfa (R18A-R46A-R48A) |
| 5 | TRIPLE MUTANTE DE MIP-1-beta (K45A-R46A-K48A) |
| SEQ ID NO: | Descripción de la secuencia |
| 6 | TRIPLE MUTANTE DE RANTES EN 50 |
| 7 | TRIPLE MUTANTE DE Met-RANTES EN 40 |
| 8 | MUTANTE DE RANTES R44A |
| 9 | MUTANTE DE RANTES K45A |
| 10 | MUTANTE DE RANTES R47A |
| 11 | MUTANTE DE RANTES K55A |
| 12 | MUTANTE DE RANTES K56A |
| 13 | MUTANTE DE RANTES R59A |
| 14 | Cebador P1 |
| 15 | Cebador P2 |
| 16 | Cebador P3 |
| 17 | Cebador P4 |
| 18 | Cebador P5 |
| 19 | Cebador P6 |
| 20 | Cebador P7 |
| 21 | Cebador P8 |
| 22 | Cebador P9 |
| 23 | Cebador P10 |
| 24 | Cebador P11 |
| 25 | Cebador P12 |
| 25 | Cebador P13 |
| 27 | Cebador P14 |
| 28 | Cebador P15 |
| 29 | Cebador P16 |
| 30 | I309 TS |
| 31 | MIP-1-alfa TS |
| 32 | MIP-1-beta TS |
| 33 | MIP-4 TS |
| 34 | MIP-5 TS |
| 35 | HCC1 TS |
| 36 | I36512 TS |
| 37 | MCP-2 TS |
\vskip0.333000\baselineskip
<110> APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING
N.V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<120> MUTANTES DE QUIMIOQUINAS EN EL
TRATAMIENTO DE LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<130> WO465
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 91
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<231> Pichia Pastoris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 91
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Escherichia Coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Escherichia Coli
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 6
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<211> 91
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> SEÑAL
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<222> (1)..(23)
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 92
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<212> PRT
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<213> Escherichia Coli
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 7
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<210> 8
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<211> 91
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> SEÑAL
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<222> (1)..(23)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 91
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> SEÑAL
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<222> (1)..(23)
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 91
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> SEÑAL
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<222> (1)..(23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 10
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<210> 11
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<211> 91
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> SEÑAL
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<222> (1)..(23)
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<212> PRT
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<221> SEÑAL
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<222> (1)..(23)
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<221> SEÑAL
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<222> (1)..(23)
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\hskip-.1em\dddseqskipggcacacact tggcggttct ttcgggt
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<212> ADN
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctgggttg gcacacactt ggcg
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<212> ADN
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<212> ADN
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\vskip0.333000\baselineskip
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<213> Escherichia coli
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<213> Escherichia coli
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<400> 32
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 68
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<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 33
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<210> 34
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\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 34
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
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<213> Escherichia coli
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\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<210> 37
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<211> 76
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 37
Claims (14)
1. Uso de un mutante de quimioquina CC, que
contiene al menos dos mutaciones en el sitio catiónico del bucle en
40, y que respecto a la molécula de tipo salvaje, tiene una
actividad de unión a GAG reducida, para preparar una composición
farmacéutica para el tratamiento de la esclerosis múltiple y/o otras
enfermedades desmielinizantes, en el que la quimioquina CC se
selecciona entre RANTES, MIP-1alfa,
MIP-1beta, MIP- 3, MIP-4, HCC1,
I309, I35612 y MCP-2.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que el
mutante de quimioquina es un mutante de RANTES.
3. El uso de la reivindicación 2, en el que el
mutante de quimioquina es un triple mutante de RANTES, en el que
los tres aminoácidos básicos en el sitio catiónico del bucle en 40
se han sustituido por otros aminoácidos.
4. El uso de la reivindicación 3, en el que los
tres aminoácidos básicos en el sitio catiónico del bucle en 40 se
han sustituido por Alanina, Serina, Treonina, Prolina o
Glicina.
5. El uso de la reivindicación 1, en el que el
mutante de quimioquina es RANTES mutado del SEQ ID NO: 3.
6. El uso de la reivindicación 1, en el que el
mutante de quimioquina es el mutante de RANTES del SEQ ID NO:
2.
7. El uso de la reivindicación 1, en el que el
mutante de quimioquina es el mutante de
MIP-1-alfa del SEQ ID NO: 4.
8. El uso de la reivindicación 1, en el que el
mutante de quimioquina es el mutante de
MIP-1-beta del SEQ ID NO: 5.
9. Composición farmacéutica para tratar la
esclerosis múltiple y/o otras enfermedades desmielinizantes, que
comprende como ingrediente activo el mutante de quimioquina como se
define en las reivindicaciones 1 a 8 junto con un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
10. RANTES humano truncado y mutado, que tiene la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2.
11. Molécula de ADN que comprende la secuencia de
ADN que codifica RANTES truncado y mutado de la reivindicación
10.
12. Un vector de expresión que comprende la
molécula de ADN de la reivindicación 10.
13. Una célula hospedante que comprende el vector
de expresión de la reivindicación 12.
14. Un procedimiento recombinante para preparar
el polipéptido de la reivindicación 1, que comprende cultivar en un
medio de cultivo adecuado las células de la reivindicación 13.
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