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ES2215570T3 - Compuestos para tratar y prevenir complicaciones diabeticas. - Google Patents

Compuestos para tratar y prevenir complicaciones diabeticas.

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Publication number
ES2215570T3
ES2215570T3 ES00302264T ES00302264T ES2215570T3 ES 2215570 T3 ES2215570 T3 ES 2215570T3 ES 00302264 T ES00302264 T ES 00302264T ES 00302264 T ES00302264 T ES 00302264T ES 2215570 T3 ES2215570 T3 ES 2215570T3
Authority
ES
Spain
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formula
compound
compounds
acid
alkyl
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES00302264T
Other languages
English (en)
Inventor
Banavara Lakshman Pfizer Inc. Mylari
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Products Inc
Original Assignee
Pfizer Products Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Products Inc filed Critical Pfizer Products Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2215570T3 publication Critical patent/ES2215570T3/es
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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Abstract

El uso de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, en la que R es N, N-dimetilamino o isopropilo, para la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de complicaciones diabéticas en un mamífero.

Description

Compuestos para tratar y prevenir complicaciones diabéticas.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere al uso de derivados específicos de pirimidina para la preparación de medicamentos para tratar y prevenir complicaciones diabéticas en un mamífero. Los mencionados derivados específicos de pirimidina pueden usarse también en combinación con un inhibidor de aldosa-reductasa o un inhibidor de intercambio iónicos sodio hidrógeno para la preparación de los mencionados medicamentos. Las complicaciones diabéticas mencionadas pueden incluir neuropatía diabética, nefropatía diabética, retinopatía diabética, úlceras en el pie y dolencias cardiovasculares.
S. Ao y otros, en Metabolism, 40, 77-87 (1991) han demostrado que se produce una mejora funcional significativa en los nervios de ratas diabéticas (basada en la velocidad de conducción nerviosa) cuando se bajan farmacológicamente los niveles de fructosa y que tal mejora se correlaciona más íntimamente cuando se rebaja la fructosa en nervios que el sorbitol en nervios. Dieron cuenta de resultados similares N.E. Cameron y M. A. Cotter, Diabetic Medicin, 8, suppl. 1, 35A-36A (1991). En ambos casos, la bajada de fructosa en nervios. se logró usando dosis relativamente altas de inhibidores de aldosa reductasa, que inhiben la formación de sorbitol, un precursor de fructosa, a partir de glucosa mediante la aldosa-reductasa enzimática.
Las patentes U.S. nº. 5.138.058 y nº. 5.215.990, describen compuestos de la fórmula
1
en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} son como se describe en las patentes. Se describe que los mencionados compuestos son útiles para la exploración de inhibidores de aldosa reductasa debido a la actividad acumuladora de sorbitol de los mencionados compuestos.
La patente U.S. nº. 5.728.704 y nº. 5.868.578, cedida de conformidad con lo habitual, describen un método para tratar o prevenir complicaciones diabéticas que se pueden tratar o prevenir inhibiendo la enzima sorbitol-deshidrogenasa. Esa patente describe también compuestos de la fórmula A
2
en la que R^{1} a R^{5} son como se define en la propia memoria.
Además, las patentes U.S. n^{os}, transferidas a Hoechst, describen que tienen utilidad para detectar niveles de sorbitol-deshidrogenasa.
Los autores de la presente invención han encontrado que derivados de pirimidina de las fórmulas I, II, III y IV, que se dan posteriormente, y sus sales farmacéuticamente aceptables, rebajan los niveles de fructosa en los tejidos de mamíferos afectados por diabetes (por ejemplo, tejido nervioso, de riñón y retina) y son útiles en el tratamiento y la prevención de complicaciones diabéticas a las que se ha hecho mención antes. Estos compuestos, o sus metabolitos in vivo, son inhibidores de la enzima sorbitol-deshidrogenasa, que cataliza la oxidación de sorbitol a fructosa.
Sumario de la invención
Esta invención está dirigida al uso de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I
3
o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, fórmula en la que:
R es N,N-dimetilamino o isopropilo, para la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de complicaciones diabéticas en un mamífero.
Esta invención está dirigida también al uso de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, y un inhibidor de aldosa-reductasa (ARI), o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de complicaciones diabéticas en un mamífero.
Esta invención está dirigida también al uso de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, y un inhibidor de intercambio iónico sodio hidrógeno (NHE-1), o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de complicaciones diabéticas en un mamífero.
Un compuesto preferido de fórmula I es el compuesto de la fórmula
4
Otro compuesto preferido de fórmula I es el compuesto de fórmula
5
El término "reducción" incluye la prevención parcial o la prevención que, aunque fuera mayor que aquélla que resultaría de no tomar un compuesto o de tomar un placebo, es inferior a 100% además de la prevención sustancialmente total.
El término "que se trata", "tratar" o "tratamiento", tal como se usa aquí incluye el tratamiento preventivo (esto es, profiláctico) y el paliativo.
Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende que el vehículo, el diluyente, los excipientes y/o la sal deben ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para quien los recibe.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales aniónicas no tóxicas que contienen aniones tales como (aunque no exclusivamente) cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, bisulfato, fosfato, acetato, maleato, fumarato, oxalato, lactato, tartrato, citrato, gluconato, metanosulfonato y 4-toluenosulfonato. Cuando existe más de un resto básico, la expresión incluye sales múltiples (por ejemplo, disal). La expresión se refiere también a sales catiónicas no tóxicas tales como (pero no exclusivamente) de sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio o benzatina protonada (N,N'-dibencildiamina), colina, etanolamina, dietanolamina, etilendiamina, meglamina (N-metil-glucamina), benetamina (N-bencilfenetilamina), piperazina o trometamina (2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol).
Tal como se usa aquí, las expresiones "disolvente inerte a la reacción" y "disolvente inerte" se refieren a un disolvente o una mezcla de disolventes que no reaccionan con los materiales de partida, reactivos, intermedios o productos de manera que se afecte negativamente al rendimiento del producto deseado.
DMF significa N,N-dimetilformamida, DMSO significa dimetilsulfóxido. THF significa tetrahidrofurano.
La presente invención incluye también compuestos marcados isotópicamente, que son idénticos a las indicados de fórmula I, pero en los que uno o más átomos están reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o un numérico másico diferente de la masa atómica o el número másico usualmente encontrado en la naturaleza. Entre los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar a los compuestos de la invención están incluidos isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro, tales como ^{2}H, ^{3}H, ^{13}C, ^{14}C, ^{15}N, ^{18}O, ^{17}O, ^{31}P, ^{32}P, ^{35}S, ^{18}F y ^{36}Cl, respectivamente. Los compuesto de la presente invención, sus prefármacos y las sales farmacéuticamente aceptables de los mencionados compuestos o los mencionados prefármacos que contienen los antes mencionados isótopos y/u otros isótopos de otros átomos están incluidos en el ámbito de la presente invención. Ciertos compuestos isotópicamente marcados de la presente invención, por ejemplo, los compuestos en los que se han incorporado isótopos radiactivos tales como ^{3}H y ^{14}C, son útiles en ensayos de fármacos y/o ensayos de distribución de tejidos sustrato. Son particularmente preferidos los isótopos tritiados, esto es, ^{3}H, y carbono-14, esto es, ^{14}C, a causa de la facilidad de su preparación y su detectabilidad. Además, la sustitución con isótopos más pesados tales como deuterio, esto es, ^{2}H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una estabilidad metabólica mayor, por ejemplo, acrecentada semivida in vivo, o exigencias reducidas de dosis, y, por tanto, se puede preferir tal sustitución en algunas circunstancias. Los compuestos de fórmula I de esta invención, isotópicamente marcados, y sus prefármacos se pueden preparar, por lo general, llevando a la práctica los procedimientos descritos en los siguientes Esquemas y/o los Ejemplos y Preparaciones, sustituyendo un reactivo no marcado isotópicamente con un reactivo isotópicamente marcado fácilmente asequible.
Otras características y ventajas serán evidentes al considerar la memoria y las reivindicaciones que describen la invención.
Descripción detallada de la invención
Generalmente, los compuestos de uso en esta invención se pueden preparar por procedimientos entre los que están incluidos procedimientos conocidos en las tecnologías químicas, en particular a la luz de la descripción que aquí se hace. Ciertos procedimientos para la producción de los compuestos de la esta invención se proporcionan como otros rasgos de la invención y se ilustran mediante los siguientes esquemas de reacción. Otros procedimientos se describen en la sección experimental.
Los compuestos de uso en la presente invención se pueden preparar como se ilustra en el siguiente Esquema 1. Los compuestos de la fórmula 1-10, Esquema I, en la que R^{1} es hidrógeno, alquilo C_{1-6}, COalquilo C_{1-6}, CO-fenilo o bencilo, bencilo o fenilo que opcionalmente están sustituidos en el anillo fenilo con hasta como máximo 2 sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, y R^{4} es N,N-dimetilamino o isopropilo, se pueden preparar de acuerdo con el Esquema I
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Esquema 1
6
Los compuestos de la fórmula 1-3 en la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, y R^{2} es etilo o metilo, se pueden preparar haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-1 en la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, con reactivo de Meerwein en condiciones estándar y usualmente se aislan en forma de sus sales de adición de ácido, por ejemplo, una sal hidrocloruro o tetrafluoroborato.
Los compuestos de fórmula 1-3 en la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, y R^{2} es etilo o metilo, se pueden preparar también haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-2 en la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, con cloruro de hidrógeno gaseoso en presencia de disolventes alcohólicos tales como etanol o metanol. La cantidad de cloruro de hidrógeno gas puede variar de un equivalente hasta la requerida para saturar el disolvente empleado. La reacción se efectúa a presión ambiente y a temperaturas entre -20ºC y 0ºC. El término presión ambiente significa la presión del recinto en que se está realizando la reacción.
Los compuestos de fórmula 1-4 en la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, se pueden preparar haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-3 en la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, con amoniaco en disolventes alcohólicos. El grupo de disolventes orgánicos típicos incluye metanol, etanol, propanoles y butanoles. La reacción se lleva a cabo a temperaturas entre -20ºC y 0ºC.
Los compuestos de fórmula 1-6 en la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, se preparan haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-4 en la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, con compuestos de fórmula 1-5 (que se preparan de acuerdo con el método descrito en la patente U.S. nº. 5.138.058) en la que R^{3} es alquilo C_{1-4}. La reacción puede efectuarse en disolventes acuosos o alcohólicos, a temperaturas entre 25 y 100ºC. El grupo de disolventes alcohólicos típicos incluye metanol, etanol y butanoles.
Los compuestos de fórmula 1-6 de configuración enantiómera R en la que R^{1} es CO-alquilo, CO-fenilo en el que fenilo está opcionalmente sustituido con hasta como máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o COCH_{2}-fenilo en el que el mencionado fenilo opcionalmente está sustituido con alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4} se preparan haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-6 que son racémicos, esto es, una mezcla de enatiómeros R y S, en la que R^{1} es H, con compuestos de fórmula CH_{2}=CH-OR^{1} en la que R^{1} es CO-alquilo C_{1-4}, CO-fenilo en el que fenilo opcionalmente está sustituido con alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, y una enzima lipasa, opcionalmente en presencia de un disolvente. Por lo general, la reacción se realiza en presencia de entre uno y 100 equivalentes de CH_{2}=CH-OR^{1}con o sin un disolvente. Cuando se usa un disolvente, se trata de disolventes orgánicos que incluyen disolventes no polares tales como hidrocarburos alquilo C_{1-7} o disolventes hidrocarburo aromático tales como benceno, tolueno y xilenos, disolventes polares tales como acetonitrilo o dimetilsulfóxido, u otros disolventes tales como alquil C_{1-6} éteres, tetrahidrofurano o dioxano. Los disolventes preferidos son disolventes éter. En la reacción se pueden usar varias lipasas comerciales, incluida Lipasa P30, y la proporción de lipasa puede estar en el intervalo entre cantidades catalíticas y hasta 10 equivalentes. La reacción se efectúa a presión ambiente y a temperaturas de 25ºC a la temperatura de reflujo del CH_{2}=CH-OR^{1} o el disolvente utilizado.
Los compuestos de la fórmula 1-6 con configuración enantiómera R, en la que R^{1} es CO-alquilo, CO-fenilo en el que fenilo está opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o COCH_{2}-fenilo en el que el mencionado fenilo opcionalmente está sustituido con alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo yodo, trifluorometilo alcoxi C_{1-4} se pueden preparar también haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-6 en la que R^{1} es H, con alquilo C_{1-6}-CO-O-CO-alquilo C_{1-6} o alquilo C_{1-6}-COCl en presencia de una base adecuada y disolventes compatibles con la reacción. Entre las bases adecuadas están incluidas bases orgánicas terciarias tales como trietilamina, piridina y dimetilaminopiridina. El grupo de disolventes compatibles con la reacción incluye éter, tetrahidrofurano y disolventes halocarburo tales como cloruro de metileno y cloroformo.
Los compuestos de la fórmula 1-7, en la que Y es Cl, OSO_{2}Me y OSO_{2}CF_{3}, respectivamente, y R^{1} es lo definido antes, se pueden preparar haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-6, respectivamente, con oxicloruro de fósforo, cloruro de metanosulfonilo y cloruro de trifluoro-metanosulfonilo. La reacción se efectúa en disolventes inertes frente a la reacción tales como cloruro de metileno, éter o tetrahidrofurano en presencia de una base amina terciaria tal como trietilamina y piridina. La temperatura de reacción es de entre 0ºC y 30ºC.
Los compuestos de fórmula 1-8 se pueden preparar haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-7, en la que Y es Cl, SOO_{2}Me o OSO_{2}CF_{3}, con piperazina. La reacción se efectúa en disolventes de reacción inertes tales como cloruro de metileno, éter o tetrahidrofurano y en presencia de una base amina terciaria tal como trietilamina, piridina o una cantidad en exceso de piperazina. La temperatura de reacción es de entre 0ºC y 30ºC.
Los compuestos de fórmula 1-10 en la que R^{1} es alquilo C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, CO-alquilo C_{1-6}, arilo C_{1-6}, en el que arilo está opcionalmente sustituido con hasta dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, cloro, bromo, yodo o trifluorometilo se pueden preparar haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-8 con R^{4}SO_{2}Cl, siendo R^{4} N,N-dimetilo o isopropilo. La reacción se efectúa en disolventes inertes a la reacción tales como cloruro de metileno, éter o tetrahidrofurano y en presencia de una base amina terciaria tal como trietilamina, dimetilaminopiridina, piridina o una cantidad en exceso de 1-8. La temperatura de reacción está en el intervalo entre la ambiente y la temperatura de reflujo del disolvente empleado.
Los compuestos de fórmula 1-10 en la que R^{1} es hidrógeno y R^{4} es N,N-dimetilo o isopropilo se pueden preparar haciendo reaccionar compuestos de la fórmula 1-10, en la que R^{1} es CO-alquilo C_{1-6} o CO-arilo C_{1-6}, grupo en el que arilo es fenilo opcionalmente sustituido con hasta como máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4}, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, con una base o un ácido en agua o una mezcla de agua y disolventes miscibles con agua. El grupo de disolventes miscibles con agua incluye metanol, etanol, propanol, DMSO, dioxano y tetrahidrofurano. El grupo de bases incluye hidróxidos de metales alcalinos y alcalinotérreos tales como los hidróxidos de litio, sodio, potasio y calcio. El grupo de ácidos incluye ácidos minerales tales como los ácidos clorhídrico y sulfúrico. La reacción se efectúa a temperaturas entre la temperatura ambiente y 50ºC.
Los compuestos de fórmula 1-10 en la que R^{1} es hidrógeno y R^{4} es N,N-dimetilo o isopropilo se pueden preparar haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-12 en la que R^{4} es N,N-dimetilo o isopropilo con bromuro de metilmagnesio en disolventes estándar inertes frente a la reacción usados en reacciones de Grignard, por ejemplo, éter o tetrahidrofurano. La reacción se efectúa a temperaturas de 0ºC a la temperatura de reflujo del disolvente empleado.
Los compuestos de fórmula 1-12 en la que R^{4} es N,N-dimetilo o isopropilo se pueden preparar oxidando compuestos de fórmula 1-11 (preparados de acuerdo con la patente U.S. nº. 5.138.058) en la que R^{4} es N,N-dimetilo o isopropilo. La oxidación puede llevarse a cabo con dióxido de manganeso activado en disolventes clorados tales como cloruro de metileno o usando las condiciones de oxidación de Swern, bien conocidas.
Los materiales de partida y los reactivos para los compuestos antes descritos son adquiribles fácilmente o los pueden sintetizar fácilmente los expertos en la técnica usando métodos convencionales de síntesis orgánica. Por ejemplo, muchos de los compuestos aquí considerados están relacionados con compuestos naturales (o derivan de ellos) que suscitan un gran interés científico y son comercialmente necesarios, por lo que muchos de tales compuestos son asequibles comercialmente o figuran en la bibliografía, o se preparan fácilmente a partir de otras sustancias comúnmente asequibles por métodos considerados en la bibliografía.
Los compuestos de uso en la presente invención inhiben la formación de sorbitol-deshidrogenasa y, por tanto, son útiles para tratar complicaciones diabéticas, entre las que están incluidas, aunque no exclusivamente, nefropatía diabética, neuropatía diabética y cardiomiopatía diabética. La utilidad de los compuestos de uso en la presente invención como agentes médicos en el tratamiento en mamíferos (por ejemplo, el hombre) de enfermedades tales como las aquí detalladas, por ejemplo, complicaciones diabéticas tales como cardiomiopatía diabética, neuropatía diabética, nefropatía diabética, microangiopatía diabética y macroangiopatía diabética está demostrada por la actividad de los compuestos de fórmula I de esta invención en ensayos convencionales. Tales ensayos proporcionan, también, un medio con el que se pueden comparar las actividades de los compuestos de fórmula I de uso en esta invención con las actividades de otros compuestos conocidos. Los resultados de estas comparaciones son útiles para determinar los niveles de dosificación en mamíferos, incluido el hombre, para el tratamiento de tales enfermedades.
Medida de la actividad de SDH
Para estos experimentos se usan ratas Sprague-Dawley macho (350-400 g). En algunas de las ratas se induce diabetes por inyección en vena de la cola de 85 mg/kg de estreptozoquina. 24 horas más tarde, se administra por vía oral, a 4 grupos de ratas diabéticas, una dosis única de 4-[4-(N,N-dimetilsulfamoil)-piperazino]-2-metilpirimidina (10, 50, 100 ó 300 mg/kg). Los animales se sacrifican 4-6 horas después de haber administrado la dosis y se cosechan sangre y nervios ciáticos. Los tejidos y células se someten a extracción con ácido pelclórico al 6%.
El sorbito en eritrocitos y nervios se mide mediante una modificación del método de R.S. Clements y otros (Science, 168: 1007-8, 1969). Se añaden partes alícuotas de extracto de tejido a un sistema de ensayo que tiene concentraciones finales de los reactivos glicina 0,033 M, pH 9,4, dinucleótido de \beta-nicotina adenina 800 mM, y 4 unidades/ml de sorbitol-deshidrogenasa. Después de incubación durante 30 min a temperatura ambiente, se determina la fluorescencia de la muestra en un espectrofotómetro de fluoresecencia con excitación a 366 nm y emisión a 452 nm. Después de sustraer los blancos apropiados, se determina la cantidad de sorbitol en cada muestra de una regresión lineal de patrones de sorbitol tratados de la misma manera que los extractos de tejido.
La fructosa se determina mediante una modificación del método descrito por M. Ameyama, Methodos in Enzymology, 89: 20-25 (1982). Se usa resazurina en vez de ferricianuro. Se añaden partes alícuotas de extractos de tejidos a un sistema de ensayo cuyas concentraciones finales de reactivos son ácido cítrico 1,2 M, pH 4,5, resazurina 13 mM, 3,3 unidades/ml de fructosa-deshidrogenasa y 0,068% de Triton X-100. Después de incubación a temperatura ambiente durante 60 min, se determina la fluoresecencia de la muestra en un espectrofotómetro de fluoresecencia con excitación a 560 nm y emisión a 580 nm. Después de sustraer los blancos apropiados, se determina la cantidad de fructosa en cada muestra por regresión lineal de patrones de fructosa tratados de la misma manera que los extractos de tejidos.
La actividad de SDH se mide por una modificación del método descrito por U. Gerlach, Methodology of Enzymantic Analyses, editado por H.U. Bergmeyer, 3, 112-117 (1983). Se añaden partes alícuotas de suero u orina al sistema de ensayo, que tiene concentraciones finales de reactivos, tampón de fosfato potásico 0,1 M, pH 7,4, NAD 5 mM, sorbitol 20 mM y 0,7 unidades/ml de sorbitol-deshidrogenasa. Después de incubación a temperatura ambiente durante 10 min, se determina a 340 nm el cambio medio de absorbancia de la muestra. La actividad de SDH se expresó como unidades de miliOD_{340}/min (OD_{340}=densidad óptica a 340 nm).
Se puede usar cualquier inhibidor de aldosa-reductasa como segundo compuesto (agente activo) de esta invención para terapias de combinación. El término inhibidor de aldosa-reductasa se refiere a compuestos que inhiben la bioconversión de glucosa a sorbitol catalizada por la enzima aldosa-reductasa. Tal inhibición la determinan fácilmente los expertos en la técnica de acuerdo con ensayos estándar (J. Malone, Diabetes, 29: 861-864, 1980. Red Cell Sorbitol, an Indicator de Diabetic Control). En lo que sigue se describen y se dan referencias de varios inhibidores de aldosa-reductasa, aunque los expertos en la técnica conocerán otros inhibidores de aldosa-reductasa. Las descripciones de las patentes U.S. que se citan más adelante se incorporan aquí por referencia. También, los nombres químicos comunes USAN o de otra designación figuran entre paréntesis cuando son aplicables, junto con la referencia a la bibliografía de patentes apropiadas que describen el compuesto.
La actividad de un inhibidor de aldosa-reductasa puede determinarse ensayando la cantidad de inhibidor de aldosa-reductasa que se requiere para rebajar el sorbitol de tejido (esto es, por inhibir la producción ulterior de sorbitol debido al bloqueo de aldosa-reductasa y, consecuentemente, la producción de fructosa). Si bien no se quiere condicionamiento alguno por cualquier teoría o mecanismo, se cree que un inhibidor de aldosa-reductasa, al inhibir la aldosa-reductasa, impide o reduce la lesión isquémica que se describe aquí luego posteriormente.
Consecuentemente, los ejemplos de inhibidores de aldosa-reductasa útiles en los métodos de esta invención incluyen:
1. Ácido 3-(4-bromo-2-fluorobencil)-3,4-dihidro-4-oxo-1-ftalazinaacético (ponalrestat, patente U.S. 4.251.528).
2. N[{(5-trifluorometil)-6-metoxi-1-naftalenil]tioxo-metil}-N-metilglicina (tolrestat, patente U.S. 4.600.724).
3. Ácido 5-[(Z,E)-\beta-metilcinamiliden]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinaacético (epalrestat patentes U.S. 4.464.382, U.S. 4.791.126 y U.S. 4.831.045).
4. Ácido 3-(4-bromo-2-fluorobencil)-7-cloro-3,4-dihidro-2,4-dioxo-1(2H)-quinazolinaacético (zenarestat, patentes U.S. 4.734.419 y U.S. 4.883.800).
5. Ácido 2R,4R-6,7-dicloro-4-hidroxi-2-metilcroman-4-acético (patente U.S. 4.883.410).
6. Ácido 2R,4R-6,7-dicloro-6-fluoro-4-hidroxi-2-metil- croman-4-acético (patente U.S. 4.883.410).
7. Ácido 3,4-dihidro-2,8-diisopropil-3-oxo-2H-1,4-benzoxazina-4-acético (patente U.S. 4.771.050).
8. Ácido 3,4-dihidro-3-oxo-4-[(4,5,7-trifluoro-2-benzo-tiazolil)metil]-2H-1,4-benzoxazina-2-acético (SPR-210,
patente U.S. 5.252.572).
9. N-[3,5-dimetil-4-[(nitrometil)sulfonil]fenil-2-metil-bencenoacetamida (ZD5522, patentes U.S. 5.270.342 y U.S. 5.430.060).
10. (S)-6-fluoroespiro[croman-4,4'-imidazolina]-2,5-diona (sorbinil, patente U.S. 4.130.714).
11. d-2-metil-6-fluoro-espiro(croman-4',4'-imidazolina)- 2',5'-diona (patente U.S. 4.540.704).
12. 2-fluoro-espiro(9H-fluoreno-9,4'-imidazolina)2',5'- diona (patente U.S. 4.438.272).
13. 2,7-di-fluoro-espiro(9H-fluoreno-9,4'-imidazolina)- 2',5'-diona (patentes U.S. 4.436.745 y U.S. 4.438.272).
14. 2,7-di-fluoro-5-metoxi-espiro(9H-fluoreno-9,4'-imidazolina)2',5'-diona (patentes U.S. 4.436.745 y U.S.
4.438.272).
15. 7-fluoro-espiro(5H-indenol[1,2-b]piridina-5,3'-pirro lidina)2,5'-diona (patentes U.S. 4.436.745 y U.S.
4.438.272).
16. d-cis-6'-cloro-2,3'-dihidro-2'-metil-espiro(imidazolidina-4,4',4'-H-pirano(2,3-b)piridina)-2,5-diona (patente U.S. 4.980.357).
17. Espiro[imidazolidina-4,5'(6H)-quinolina]2,5-diona-3'-cloro-7',8'-dihidro-7'-metil-(5'-cis) (patente U.S.
5.066.659).
18. (2S,4S)-6-fluoro-2',5'-dioxoespiro(croman-4,4'imidazolidina)-2-carboxamida (patente U.S. 5.447.946) y
19. 2-[(4-bromo-2-fluorofenil)metil]-6-fluoroespiro[isoquinolina-4(1H),3'-pirrolidina]-1,2',3,5'(2H)-tetrona
(ARI-509, patente U.S. 5.037.831).
Entre otros inhibidores de aldosa-reductasa están incluidos compuestos que tienen la fórmula AR
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o una de sus sales farmacéuticamente aceptables,
Z siendo en el compuesto de fórmula ARI: O o S;
R^{1} siendo en el compuesto de fórmula ARI: hidroxi o un grupo capaz de ser eliminado in vivo para producir un compuesto de la fórmula ARI en la que R^{1} es OH, y
X e Y siendo en el compuesto de fórmula ARI: son los mismos o diferentes y se seleccionan entre hidrógeno, trifluorometilo, flúor y cloro.
Un subgrupo preferido dentro del grupo anterior de inhibidores de aldosa-reductasa incluye los compuestos numerados 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10 y 17, y los siguientes compuestos de fórmula ARI:
20. Ácido 3,4-dihidro-3-(5-fluorobenzotiazol-2-il-metil-4-oxoftlalazin-1-il-acético [R^{1}=hidroxi; X=F, Y=H].
21. Ácido 3-(5,7-difluorobenzotiazol-2-ilmetil)-3,4-dihidro-4-oxoftalazin-1-ilacético [R^{1}=hidroxi; X=Y=H].
22. Ácido 3-(5-clorobenzotiazol-2-ilmetil)-3,4-dihidro-4-oxoftalazin-1-ilacético [R^{1}=hidroxi; X=Cl; Y=H].
23. Ácido 3-(5,7-diclorobenzotiazol-2-ilmetil)-3,4-dihidro-4-oxoftalazin-1-ilacético [R^{1}=hidroxi; X=Y=Cl].
24. Ácido 3,4-dihidro-4-oxo-3-(5-trifluorometilbenzoxazol-2-ilmetil)ftalazin-1-ilacético [R^{1}=hidroxi; X=CF_{3};
Y=H].
25. Ácido 3,4-dihidro-3-(5-fluorobenzoxazol-2-il-metil)-4-oxoftalazin-1-ilacético [R^{1}=hidroxi; X=F; Y=H].
26. Ácido 3-(5,7-difluorobenzoxazol-2-ilmetil)-3,4-dihidro-4-oxoftalazin-1-ilacético [R^{1}=hidroxi; X=Y=F].
27. Ácido 3-(5-clorobenzoxazol-2-ilmetil)-3,4-di-hidro-4-oxoftalazin-1-ilacético [R^{1}=hidroxi; X=Cl; Y=H].
28. Ácido 3-(3,5-diclorobenzoxazol-2-ilmetil)-3,4-di-hidro-4-oxoftalazin-1-ilacético [R^{1}=hidroxi; X=Y=Cl] y
29. zopolrestat, ácido 1-ftalazinaacético, 3,4-dihidro-4-oxo-3-[{5-(trifluorometil)-2-benzotiazolil}metil] [R^{1}=
hidroxi; X=trifluorometilo; Y=H].
En los compuestos 20-23 y 29, Z es S. En los compuestos 24-28, Z es O.
Del subgrupo anterior, los más preferidos son los compuestos 20-29, siendo especialmente preferido el compuesto 29.
Un inhibidor de aldosa-reductasa especialmente preferido es ácido 1-ftalazinaacético, 3,4-dihidro-4-oxo-3-[{5-trifluorometil)-2-benzotiazolil}metilo].
Los compuestos inhibidores de aldosa-reductasa de uso en esta invención son fácilmente asequibles o pueden sintetizarlos fácilmente los expertos en la técnica por métodos convencionales en síntesis orgánica, en particular a la vista de las pertinentes descripciones de la memoria de la patente.
Se puede usar una cantidad de inhibidor de aldosa-reductasa que sea efectiva para las actividades de esta invención. Típicamente, una dosis efectiva para los inhibidores de aldosa-reductasa de esta invención está en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg/día a 100 mg/kg/día en unidosis o dosis divididas, preferiblemente de 0,1 mg/kg/día a 20 mg/kg/día en una dosis única o dosis divididas.
Como segundo componente activo (agente activo) se puede usar en esta invención, para medicamentos de combinación, un inhibidor de intercambio iónico sodio hidrógeno (NHE-1). El término inhibidor NEH-1 se refiere a compuestos que inhiben el sistema de transporte de intercambio sodio/protón (Na^{+}/H^{+}) y que, por tanto, son útiles como agente terapéutico o profiláctico para enfermedades causadas o agravadas por aceleración del sistema de transporte por intercambio de sodio/protón (Na^{+}/H^{+}), por ejemplo, enfermedades cardiovasculares [como arterioesclerosis, hipertensión, arritmia (por ejemplo, arritmia isquémica, arritmia debida a infarto de miocardio, bloqueo de miocardio, disfunción miocárdica, arritmia después de PTCA o después de trombolisis, etc.), angina de pecho, hipertrofia cardíaca, infarto de miocardio, fallo cardíaco (por ejemplo, fallo cardíaco congestivo, fallo cardíaco agudo, hipertrofia cardíaca, etc.), restenosis después de PTCA, PTCl, shock (por ejemplo, shock hemorrágico, shock por endotoxinas, etc.)], enfermedades renales (por ejemplo, diabetes mellitus, nefropatía diabética, fallo renal isquémico agudo, etc.), trastornos orgánicos asociados con isquemia o reperfusión isquémica [(por ejemplo, trastornos asociados a reperfusión isquémica de músculos del corazón, fallo renal agudo o trastornos inducidos por tratamientos quirúrgicos tales como cirugía de injerto de bypass en arteria coronaria (CABG), cirugías vasculares, trasplante de órganos, cirugías no cardíacas o angioplastia percutánea transluminal coronaria (PTCA), enfermedades cerebrovasculares (por ejemplo, apoplejía isquémica, apoplejía hemorrágica, etc.), trastornos cerebroisquémicos (por ejemplo, trastornos asociados a infarto cerebral, trastornos causados después de apoplejía cerebral como secuelas, o edema cerebral. Los inhibidores NEH-1 se pueden usar también como agentes para protección miocárdica durante cirugías de injerto de bypass en arteria coronaria (CABG), cirugías vasculares, angioplastia percutánea transluminal coronaria (CABG), PTCl, trasplante de órganos o cirugías no cardíacas. La utilidad de los inhibidores NHE-1 como agentes médicos en el tratamiento de enfermedades tales como las que se detallan aquí en mamíferos (por ejemplo, el hombre), por ejemplo, protección del miocardio durante cirugía o protección del miocardio en pacientes que presentan episodios en curso cardíacos o isquémico cerebrales, o cardioprotección crónica en pacientes con enfermedad cardíaca coronaria diagnosticada, o con riesgo de una enfermedad cardíaca coronaria, disfunción cardíaca o bloqueo miocárdico, se demuestra por la actividad de los compuestos de fórmula I de esta invención en ensayos convencionales preclínicos de cardioprotección [véase el ensayo in vivo, por Klein W y otros, Circulation, 92:260-268 (1995); el ensayo de corazón aislado, por Scholz, W. y otros, Cardiovascular Research 29:260-268 (1995); el ensayo antiarrítmico, por Yasutake M y otros, Am. J. Physiol., 36:H2430:H2440 (1994); el ensayo NMR, por Kolke y otros, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 112: 765-775 (1996) y los ensayos in vivo e in vitro adicionales que se describen más adelante. Tales ensayos proporcionan también un medio con el que se pueden comparar las actividades de los compuestos de fórmula I de uso en esta invención con las actividades de otros compuestos conocidos. Los resultados de estas comparaciones son útiles para determinar niveles de dosificación en mamíferos, incluido el hombre, para el tratamiento de tales enfermedades.
Se describen inhibidores NEH-1 en la patente U.S. nº. 5.698.581, la solicitud de patente europea nº. EP 803.501 A1, la publicación de solicitud de patente internacional nº WO 94/26709 y el documento PCT/JP97/04650. Los inhibidores NHE-1 descritos en ellas tienen utilidad en combinación con esta invención. Los mencionados inhibidores NHE-1 se pueden preparar como se describe en los documentos citados.
Entre los inhibidores NHE-1 preferidos están incluidos compuestos de la fórmula NHE.
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un prefármaco de ellos o una de las sales farmacéuticamente aceptable del mencionado compuesto o el mencionado prefármaco.
Z en el compuesto de la fórmula NHE, está conectado a carbono y es un anillo diaza, diinsaturado, de 5 miembros, que tiene dos nitrógenos contiguos, anillo que, opcionalmente, está monosustituido, disustituido o trisustituido con hasta como máximo tres sustituyentes independientemente seleccionados entre R^{1}, R^{2} y R^{3}; o
Z en el compuesto de la fórmula NHE, está conectado a carbono y es un anillo triaza, diinsaturado, de 5 miembros que tiene dos nitrógenos contiguos, anillo que, opcionalmente, está monosustituido o disustituido con hasta como máximo dos sustituyentes independientemente seleccionados entre R^{4} y R^{5};
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} son, cada uno independientemente, hidrógeno, hidroxialquilo C_{1-4}, alquilo C_{1-4}, alquil C_{1-4} tio, cicloalquilo C_{3-4}, cicloalquilo C_{3-7} alquilo C_{1-4}, alcoxi C_{1-4}, alcoxi C_{1-4} alquilo C_{1-4}, mono-N o di-N,N-alquil C_{1-4}carbamoílo, M o M alquilo C_{1-4}, teniendo, opcionalmente, cualquiera de los anteriores restos alquilo C_{1-4}, de uno a nueve átomos de flúor; estando los mencionados alquilo C_{1-4} o cicloalquilo C_{3-4} opcionalmente mono o di-sustituidos con, independientemente, hidroxi, alcoxi C_{1-4}, alquil C_{1-4} tio, alquil C_{1-4} sulfinilo, alquil C_{1-4} sulfonilo, alquilo C_{1-4}, mono-N- o di-N,N-alquil C_{1-4} carbamoílo o mono-N- o di-N,N- alquil C_{1-4} aminosulfonilo; y teniendo el mencionado cicloalquilo C_{3-4}, opcionalmente, de uno a siete átomos de flúor.
M es un anillo de cinco a ocho miembros, parcialmente saturado, totalmente saturado o totalmente insaturado, que opcionalmente tiene de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre oxígeno, azufre y nitrógeno, o un anillo bicíclico que consta de dos anillos de tres a seis miembros condensados parcialmente saturados, totalmente saturados o totalmente insaturados, que opcionalmente tienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, azufre y oxígeno;
M está opcionalmente sustituido en un anillo si el resto es monocíclico, o en uno o ambos anillos si el resto es bicíclico, sobre carbono o nitrógeno con hasta como máximo tres sustituyentes seleccionados independientemente entre R^{6}, R^{7} y R^{8}, siendo uno de R^{6}, R^{7} y R^{8} un anillo de tres a siete miembros parcialmente saturado, totalmente saturado o totalmente insaturado que opcionalmente tiene uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre oxígeno, azufre y nitrógeno, opcionalmente sustituidos con alquilo C_{1-4} y, adicionalmente, R^{6}, R^{7} y R^{8} son, opcionalmente, hidroxi, nitro, halo, alcoxi C_{1-4}, alcoxi C_{1-4} carbonilo, alquilo C_{1-4}, formilo, alcanoilo C_{1-4}, alcanoil C_{1-4} oxi, alcanoil C_{1-4} amino, alcoxi C_{1-4} carbonilamino, sulfonamido, alquil C_{1-4} sulfonamido, amino, mono-N- o di-N,N-alquil C_{1-4} amino, carbamoílo, mono-N- o di-N,N-alquil C_{1-4} carbamoílo, ciano, tiol, alquil C_{1-4} tio, alquil C_{1-4} sulfinilo, alquil C_{1-4} sulfonilo, mono-N- o di-N,N-alquil C_{1-4} aminosulfonilo, alquenilo C_{2-4}, alquinilo C_{2-4} o cicloalquenilo C_{5-7};
los mencionados sustituyentes alcoxi C_{1-4}, alquilo C_{1-4}, alcanoilo C_{1-4}, alquil C_{1-4} tio, mono-N- o di-N,N-alquil C_{1-4} amino o cicloalquilo C_{3-7}, R^{6}, R^{7} y R^{8} están opcionalmente sustituidos, independientemente, con hidroxi, alcoxi C_{1-4} carbonilo, cicloalquilo C_{3-7}, alcanoilo C_{1-4}, alcanoil C_{1-4} amino, alcanoil C_{1-4} oxi, alcoxi C_{1-4} carbonilamino, sulfonamido, alquil C_{1-4} sulfonamido, amino, mono-N- o di-N,N-alquil C_{1-4} amino, carbamoílo, mono-N- o di-N,N-alquil C_{1-4} carbamoílo, ciano, tiol, nitro, alquil C_{1-4} tio, alquil C_{1-4} sulfinilo, alquil C_{1-4} sulfonilo o mono-N- o di-N,N-alquil C_{1-4} aminosulfonilo u opcionalmente sustituidos con uno a nueve átomos de flúor.
Entre los inhibidores NEH-1 especialmente preferidos están incluidos [1-(8-bromoquinolin-5-il)-5-ciclopropil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(6-cloroquinolin-5-il)-5-ciclopropil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(indazol-7-il)-5-ciclopropil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(benzoimidazol-5-il)-5-ciclopropil-1H-pirazol-4-carbonil]-guanidina; [1-(isoquinolil)-5-ciclopropil-1H-pirazol-4-carbonil] guanidina; [5-ciclopropil-1-(4-quinolil)-1H-pirazol-4-
carbonil]guanidina; [5-ciclopropil-1-(quinolin-5-il)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-ciclopropil-1-(quinolin-8-il)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(indazol-6-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(indazol-5-il)-5-etil-
1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(benzoimidazol-5-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil] guanidina; [1-(1-metilbenzoimidazol-6-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; 1-(5-quinolinil)5-n-propil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; 1-(5-quinolinil)-5-isopropil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-etil-1-(6-quinolinil)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(2-metilbenzoimidazol-5-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(1,4-benzodioxan-6-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(benzotriazol-5-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(3-cloroindazol-5-il)-5-etil-
1H-pirazol-4-carbonil]-guanidina; [1-(5-quinolinil)-5-butil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-propil-1-(6-quinolinil)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-isopropil-1-(6-quinolinil)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina;
o una de sus sales farmacéuticamente aceptable.
Los inhibidores NHE-1 preferidos y especialmente preferidos descritos en los dos párrafos anteriores se pueden preparar de acuerdo con métodos considerados en la solicitud de patente internacional nº. PCT /lB99/00206 o como se indica más adelante, señalándose que las variables de los esquemas y la descripción siguientes se refieren sólo a compuestos NHE-1.
Esquema I
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Esquema II
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Esquema III
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Esquema IV
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Esquema V
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Esquema VI
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Esquema VII
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Esquema VIII
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De acuerdo con el Esquema I, el compuesto de la fórmula I-a, en la que R^{4} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NHE, se disuelve o se pone en suspensión en una solución acuosa de hidróxido de un metal alcalino (por ejemplo, hidróxido sódico) junto con nitrito sódico y la mezcla se añade a una solución acuosa de un ácido (por ejemplo, ácido sulfúrico al 10% v/v) a un pH de aproximadamente 0 a una temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 5ºC durante aproximadamente 30 min a aproximadamente 1 hora. La mezcla resultante se filtra y se obtiene la oxima de fórmula I-b. Alternativamente, el compuesto de fórmula I-a se disuelve en ácido acético/ácido propiónico 1:1 y se añade nitrito sódico sólido a aproximadamente 0ºC. La mezcla de reacción se agita a aproximadamente 0ºC durante aproximadamente 2 horas y luego se vierte en agua-hielo, obteniéndose por filtración la oxima de fórmula I-b.
El compuesto de fórmula I-b se hace reaccionar con un compuesto de la fórmula I-c, en la que R^{5} es lo descrito antes para un compuesto de fórmula NHE, en un disolvente prótico tal como etanol, a una temperatura de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 110ºC durante aproximadamente 1 hora para formar la hidrazona de fórmula I-d.
La hidrazona de fórmula I-d se cicla e hidroliza, obteniéndose el triazol de fórmula I-e en un disolvente alcohólico tal como 2-etoxietanol en condiciones básicas (por ejemplo, hidróxido potásico) a una temperatura de aproximadamente 100ºC a aproximadamente 175ºC durante aproximadamente ½ hora a aproximadamente 2 horas; seguidamente se acidifica, obteniéndose el ácido de triazol de fórmula I-e.
El ácido de fórmula I-e se acopla con guanidina en presencia de un agente de acoplamiento adecuado. Un agente de acoplamiento adecuado es un agente que transforma un ácido carboxílico en una especie reactiva que forma un enlace amida al reaccionar con una amina.
El agente de acoplamiento puede ser un reactivo que efectúa esta condensación en un proceso en una etapa cuando se mezcla con el ácido carboxílico y la guanidina. Son ejemplos de agentes de acoplamiento, hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol (EDC/HBT), diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol (HBT), 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina (EEDQ) y cianuro de dietilfosforilo. El acoplamiento se realiza en un disolvente inerte, preferiblemente un disolvente aprótico a una temperatura de aproximadamente -20ºC a aproximadamente 50ºC durante aproximadamente 1 a aproximadamente 48 horas, en presencia de guanidina en exceso como base. Los ejemplos de disolventes incluyen acetonitrilo, diclorometano, dimetilformamida y cloroformo, o mezclas de ellos.
El agente de acoplamiento puede ser también aquel agente que convierte el ácido carboxílico en un intermedio activado que se aisla y/o forma en una primera etapa y se deja que reaccione con guanidina en una segunda etapa. Son ejemplos de tales agentes de acoplamiento e intermedios activados, cloruro de tionilo o cloruro de oxalilo para formar el cloruro de ácido, fluoruro cianúrico para formar un fluoruro de ácido o un cloroformiato de alquilo tal como cloroformiato de isobutilo o isopropenilo, o anhídrido propanofosfónico (anhídrido del ácido propanofosfónico, PPA) (con una base amina terciaria) para formar un anhídrido mixto del ácido carboxílico, o carbonildiimidazol para formar un acilimidazol. Si el agente de acoplamiento es cloruro de oxalilo, es ventajoso emplear una pequeña cantidad de dimetilformamida como disolvente con otro disolvente (tal como diclorometano) para catalizar la formación del cloruro de ácido. Este derivado de ácido activado puede acoplarse mezclándolo con guanidina en exceso en un disolvente apropiado junto con una base apropiada. Son combinaciones apropiadas de disolvente/base, por ejemplo, diclorometano, dimetilformamida o acetonitrilo, o mezclas de ellos, en presencia de un exceso de guanidina como base. Entre otras combinaciones apropiadas de disolvente/base están incluidos agua o un alcohol C_{1-5} o una mezcla de ambos junto con un codisolvente tal como diclorometano, tetrahidrofurano o dioxano y una base tal como hidróxido sódico, potásico o lítico en cantidad suficiente para consumir el ácido liberado en la reacción. El uso de estos agentes de acoplamiento y la selección apropiada de disolventes y temperaturas son conocidos por los expertos en la técnica o pueden determinarse fácilmente por estudio de la bibliografía. Éstas y otras condiciones ejemplares, útiles para acoplamiento de ácidos carboxílicos, se describen en Houben-Weyl, vol. XV, parte II, E. Wunsch, Ed., G. Theime Verlag, 1974, Stuttgart; M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin, 1984; y The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology (ed. E. Gross y J. Meienhofer), vols. 1-5 (Academic Press, NY 1979-1983).
De acuerdo con el esquema II, la amina primaria de la fórmula II-a, en la que R^{5} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula HHE, se hace reaccionar con un \alpha-diazo-\beta-cetoéster de fórmula II-b, en la que R^{4} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NHE y R es alquilo inferior, en presencia de tetracloruro de titanio de manera análoga al método descrito por Eguchi y otros, Synthesis 1993, 793, para formar el éster del ácido triazolcarboxílico de fórmula II-c. El éster de fórmula II-c se convierte directamente en la acilguanidina de fórmula II-d por reacción con guanidina en un disolvente alcohólico a una temperatura de aproximadamente 60ºC a aproximadamente 110ºC, preferiblemente en metanol a reflujo, durante un período de 8 a 20 horas.
De acuerdo con el Esquema III, el compuesto de la fórmula III-a en la que R^{4} y R^{5} son lo descrito antes para el compuesto de fórmula NEH, se trata con reactivo de Lawesson (esto es, 2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3-ditia-2,4-difosofoetano-2,4 disulfuro) en un disolvente aprótico tal como dimetoxietano a una temperatura de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 120ºC durante aproximadamente una a ocho horas. La tioamida resultante se trata con un agente de alquilación tal como yoduro de metilo en un disolvente inerte polar tal como acetona, convenientemente a temperatura ambiente durante aproximadamente ocho a aproximadamente veinticuatro horas. El compuesto resultante se hace reaccionar con hidrazina anhidra en un disolvente alcohólico a una temperatura de aproximadamente 0ºC a 25ºC durante aproximadamente una a ocho horas, obteniéndose el compuesto de fórmula III-b (análogamente a lo descrito por Doyle y Kurzer, Synthesis 1974., 583).
El compuesto de fórmula III-b se trata con un cloruro de monoalquiloxalilo durante aproximadamente una a ocho horas para obtener el compuesto éster de ácido carboxílico de la fórmula III-c, en la que R es alquilo inferior. El éster de fórmula III-c se acopla directamente en un disolvente alcohólico a una temperatura de aproximadamente 60ºC a aproximadamente 110ºC, preferiblemente en metanol a reflujo, durante un período de ocho a veinte horas para preparar las triazolcarbonil guanidinas de fórmula III-d.
De acuerdo con el Esquema IV, el compuesto de la fórmula IV-a en la que R^{5} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NEH, se trata con yoduro de metilo en un disolvente inerte, convenientemente a temperatura ambiente durante aproximadamente cuatro a veinticuatro horas. El compuesto resultante se hace reaccionar con R^{4}-hidrazina anhidra (en la que R^{4} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NHE) en un disolvente alcohólico a una temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 25ºC, durante aproximadamente una a ocho horas, resultando el compuesto amidrazona de fórmula IV-b (análogamente a lo descrito por Doyle y Kurzer, Synthesis 1974, 583).
El compuesto de fórmula IV-b se trata con un cloruro de monoalquiloxalilo en un disolvente aprótico a una temperatura de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 50ºC durante aproximadamente una a ocho horas, obteniéndose el compuesto éster de ácido carboxílico de la fórmula IV-c en la que R es alquilo inferior. El éster de fórmula IV-c se acopla directamente con guanidina en un disolvente orgánico a una temperatura de aproximadamente 60ºC a aproximadamente 110ºC, preferiblemente en metanol a reflujo, durante un período de ocho a veinte horas, resultando las triazolcarbonil guanidinas de fórmula IV-d.
De acuerdo con el Esquema V, el compuesto de la fórmula V-a en la que R^{1} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NEH, se combina con exceso de (CH_{3}O)_{2}C(R^{3})N(CH_{3})_{2}(N,N-dimetilamidadimetilacetal), fórmula en la que R^{3} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NEH, opcionalmente en presencia de un catalizador ácido tal como ácido p-toluenosulfónico, a una temperatura de aproximadamente 90ºC a aproximadamente 110ºC durante aproximadamente una a aproximadamente dos horas, obteniéndose el compuesto de fórmula V-c.
El compuesto de fórmula V-c se cicla con un compuesto de fórmula V-d, en la que R^{2} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NEH, en un disolvente inerte tal como etanol a una temperatura de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 30ºC, durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente una hora, y seguidamente se calienta la mezcla de reacción a una temperatura de aproximadamente 90ºC a aproximadamente 110ºC durante aproximadamente de dos a cuatro horas, formándose el pirazol de fórmula V-f.
Alternativamente, de acuerdo con el Esquema V, el compuesto de la fórmula V-a en la que R^{1} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NHE,, se combina con un trietilortoéster (esto es, R^{3}C(OEt)_{3}, en el que R^{3} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NEH) y anhídrido acético a una temperatura de aproximadamente 120ºC a 150ºC durante aproximadamente dos a aproximadamente cinco horas, obteniéndose el compuesto de fórmula V-b.
El compuesto de fórmula V-b se cicla con un compuesto de fórmula V-d, en la que R^{2} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NEH, resultando el pirazol de fórmula V-c.
El pirazol de fórmula V-c se hidroliza con una base tal como hidróxido sódico o hidróxido de litio en un disolvente tal como agua y/o metanol y/o THF, convenientemente a temperatura ambiente o a temperatura elevada (por ejemplo, a reflujo) durante aproximadamente una hora a aproximadamente cinco horas, resultando el ácido de fórmula V-f.
El ácido de fórmula V-f se acopla con guanidina en presencia de un agente de acoplamiento adecuado, según se ha descrito para el acoplamiento anterior del ácido de fórmula I-e y guanidina. En una realización, el ácido de fórmula V-f se activa con cloruro de tionilo a una temperatura de aproximadamente 60ºC a aproximadamente 90ºC durante aproximadamente quince min a dos horas. El cloruro de ácido activado resultante se combina con hidrocloruro de guanidina y una base inorgánica (por ejemplo, hidróxido sódico) en tetrahidrofurano anhidro y, opcionalmente, metanol y/o agua. La solución se calienta, es conveniente a reflujo, durante aproximadamente una hora a ocho horas para obtener el compuesto de fórmula V-g.
Alternativamente de acuerdo con el Esquema V, el compuesto de fórmula V-e se puede convertir directamente en el compuesto de fórmula V-g por diversos métodos. Por ejemplo, se puede calentar el compuesto de fórmula V-e en presencia de guanidina en exceso, en un disolvente prótico polar, por ejemplo metanol o isopropanol, a una temperatura adecuada, convenientemente a reflujo durante aproximadamente una hora a aproximadamente setenta y dos horas. Esta transformación se puede realizar también eliminando repetidamente el disolvente, por ejemplo, eliminando etanol o tolueno aproximadamente cuatro veces, de una mezcla del compuesto de fórmula V-e y guanidina en exceso a una presión de aproximadamente un mm de Hg a aproximadamente 100 mm de Hg y a una temperatura de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 95ºC. Esta reacción se puede realizar también en ausencia de disolvente calentando la mezcla del compuesto de fórmula V-e y guanidina en exceso a una temperatura de aproximadamente 100ºC a aproximadamente 180ºC, opcionalmente a una presión de aproximadamente 1 mm de Hg a aproximadamente 100 mm de Hg, durante aproximadamente cinco minutos a aproximadamente ocho horas.
De acuerdo con el Esquema VI, el compuesto de la fórmula VI-a, en la que R^{3} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NHE, se hace reaccionar con el compuesto de la fórmula VI-b, en la que R^{1} y R^{2} son lo descrito antes para el compuesto de fórmula NHE, en un disolvente aprótico a una temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 25ºC durante aproximadamente dos horas a aproximadamente veinticuatro horas en presencia de una base amina apropiada, tal como trietilamina, para formar el compuesto de fórmula VI-c.
El compuesto resultante de fórmula VI-c se hidroliza y acopla con guanidina usando uno de los métodos descritos en anteriores Esquemas, como el método en que se emplea carbonilimidazol, para obtener el compuesto de fórmula VI-d.
De acuerdo con el Esquema VII, la hidrazina de la fórmula VII-a, en la que R^{2} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NHE, se hace reaccionar con el compuesto apropiado de fórmula VII-b para que se forme el éster de pirazol de la fórmula VII-c, en la que R es alquilo inferior, de acuerdo con el método de Bajnati, A y Hubert-Habart, M., Bull. Soc. Chim. France 1988, 540. El éster de pirazol resultante se convierte en la acil guanidina de fórmula VII-d usando los métodos de hidrólisis y acoplamiento descritos antes.
De acuerdo con el Esquema VIII, el compuesto de la fórmula VIII-a en la que R^{2} y R^{1} son los descrito antes para el compuesto de fórmula NHE se transforma en la sal de litio de la fórmula VIII-b en la que R es alquilo inferior de acuerdo con el método descrito en J. Het. Chem. 1989, 26, 1389. La sal de litio de fórmula VIII-b se combina con la hidrazina de la fórmula VIII-c en la que R^{3} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NHE, en un disolvente inerte tal como etanol, en presencia de un ácido mineral, a una temperatura de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 30ºC durante aproximadamente cinco minutos a aproximadamente una hora, y seguidamente la mezcla de reacción se calienta a una temperatura de aproximadamente 70ºC a aproximadamente 110ºC durante dos horas a aproximadamente 4 horas para formar los pirazoles de fórmulas VIII-d y VIII-e. Los pirazoles de las fórmulas VIII-d y VIII-e se convierten en las acilguanidinas de las fórmulas VIII-f y VIII-g, respectivamente, usando los métodos de hidrólisis y acoplamiento descritos antes. Algunos de los métodos útiles para la preparación de los compuestos descritos en esta memoria pueden requerir la protección de una funcionalidad remota (por ejemplo, amina primaria, amina secundaria, carboxilo en los precursores de fórmula I). La necesidad de tal protección variará dependiendo de la naturaleza de la funcionalidad remota y las condiciones de los métodos de preparación. La necesidad de tal protección la determina con facilidad un experto en la técnica. El uso de tales métodos de protección/desprotección compete también al saber de la técnica. Para una descripción general de grupos protectores y su uso, véase T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.
Los compuestos de fórmula I de uso en esta invención, cuando se usan en combinación con inhibidores NHE-1, inhiben el sistema de transporte de intercambio sodio/protón (Na^{+}/H^{+}) y, por tanto, son útiles como agente terapéutico o profiláctico para enfermedades causadas o agravadas por la aceleración del sistema de transporte sodio/potasio (Na^{+}/H^{+}), por ejemplo, enfermedades cardiovasculares [por ejemplo, arterioesclerosis, hipertensión, arritmia (por ejemplo, arritmia isquémica, arritmia debida a infarto de miocardio, bloque miocárdico, disfunción miocárdica, arritmia después de PTCA o después de trombolisis, etc.), angina de pecho, hipertrofia cardíaca, infarto de miocardio, fallo cardíaco (por ejemplo, fallo cardíaco congestivo, fallo cardíaco agudo, hipertrofia cardíaca, etc.), restenosis después de PTCA, PTCl, shock (por ejemplo, shock hemorrágico, shock por endotoxinas, etc.)], enfermedades renales (por ejemplo, diabetes mellitus, nefropatía diabética, fallo renal isquémico agudo, etc.), trastornos orgánicos asociados con isquemia o reperfusión isquémica [(por ejemplo, trastornos asociados a reperfusión isquémica del músculo cardíaco, fallo renal agudo, o trastornos inducidos por tratamientos quirúrgicos tales como cirugías de injerto de bypass en arteria coronaria (CABG), cirugías vasculares, trasplante de órganos, cirugías no cardíacas o angioplastia percutánea transluminal coronaria (PTCA)], enfermedades cerebrovasculares (por ejemplo, apoplejía isquémica, apoplejía hemorrágica, etc.), trastornos cerebrales isquémicos (por ejemplo, trastornos asociados a infarto cerebral, trastornos causados después de apoplejía como secuelas, o edema cerebral.
Medida de la actividad inhibidora de NEH-1 humano
Las metodologías para medir la actividad de NEH-1 humano y la potencia inhibidora se basan en las publicadas por Watson y otros, Am. J. Physiol., 24:G229-G238, 1991), en las que se mide la recuperación mediada por NHE del pH intracelular que sigue a la acidificación intracelular. Así, se cultivan fibroblastos que expresan establemente NHE-1 humano (Counillon, L. y otros, Mol. Pharmacol., 44:1041-1045 (1993) sobre placas de 96 pocillos revestidas con colágeno (50.000/pocillo) y se hacen crecer a confluencia en medio de cultivo (DMEM alto en glucosa, 10% de suero fetal bovino, 50 u/ml de penicilina y estreptomicina). Las placas confluentes se incuban durante 30 minutos a 37ºC con la sonda fluorescente sensible a pH BCECF (5 \muM; Molecular Probes, Eugene, OR). Las células cargadas con BCECF se incuban a 37ºC durante 37 minutos en medio de carga ácida (cloruro de colina 70 mM, NHCl_{4} 50 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, glucosa 5 mM, HEPES 10 mM, pH 7,5) y luego se ponen en un lector de placas Fluorescent Imaging Plate Reader (Molecular Devices, CA). La fluorescencia de BCECF se controla usando longitudes de onda de excitación y emisión de 485 nM y 525 nM, respectivamente. La acidificación intracelular se inicia mediante sustitución por vía rápida del medio de carga ácida con medio de recuperación (NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, glucosa 5 mM, HEPES 10 mM, pH 7,5) \pm combinación del ensayo, y la recuperación mediada por NHE del pH intracelular se controla como posterior aumento dependiente del tiempo de la fluorescencia de BCECF. La potencia de las combinaciones de los compuestos de fórmula I de uso en esta invención con inhibidores NEH-1 se calcula como la concentración que reduce en 50% la recuperación del pH intracelular (IC_{50}). En estas condiciones, los inhibidores NHE de referencia amiloride y HOE-642 tenían valores de IC_{50} para NEH-1 humano de 50 \muM y 0,5 \muM, respectivamente.
Como información de base, se señala que breves períodos de isquemia miocárdica seguida de reperfusión seguida de reperfusión de la arteria coronaria protegen el corazón de una severa isquemia miocárdica posterior (Mutty y otros, Circulation, 74: 1124-1136, 1986).
Los efectos terapéuticos de la combinación de compuestos de fórmula I con inhibidores NHE-1 en cuanto a prevenir la lesión del tejido cardíaco resultante de un ultraje isquémico se pueden demostrar in vitro según las directrices presentadas por Liu y otros (Cardiovasc. Res., 28:1057-1061, 1994), como se describe aquí específicamente. La cardioprotección, puesta de manifiesto como reducción del miocardio infartado, se puede inducir farmacológicamente usando agonistas del receptor de adenosina en corazones aislados, perfundidos retrógradamente como un modelo in vitro de preacondicionamiento isquémico miocárdico (Liu y otros, Cardiovasc. Res., 28:1057-1061, 1994). El ensayo in vitro que se describe más adelante demuestra que un compuesto que se ensaya o, en este caso, una combinación que se ensaya (esto es, una combinación de un compuesto de fórmula I con un antagonista de NHE-1) puede inducir farmacológicamente también cardioprotección, esto es, un tamaño reducido del infarto, cuando se administra a un corazón aislado de conejo. Los efectos de la combinación que se ensaya se comparan con el preacondicionamiento isquémico y el agonista A1/A3 de adenosina, APNEA (N^{6}-[2-(4-aminofenil)etil]adenosina) que ha revelado que induce farmacológicamente cardioprotección en el corazón de conejo aislado (Liu y otros, Cardiovasc. Res., 28:1057-1061, 1994). Seguidamente se describe la metodología exacta.
El protocolo usado para estos experimentos sigue el descrito por Liu y otros, Cardiovasc. Res., 28:1057-1061, 1994. Conejos macho New Zealand White (3-4 kg) se anestesian con pentobarbital sódico (30 mg/kg, i.v.). Lograda anestesia profunda (determinada por la ausencia de reflejo de parpadeo ocular), se intuba el animal y se ventila con O_{2} al 100% usando un ventilador de presión positiva. Se realiza toracotomía izquierda, se expone el corazón y se pone holgadamente un lazo (seda 2-0) en torno a una rama prominente de la arteria coronaria izquierda, aproximadamente a una distancia de 2/3 hacia el ápice del corazón. Se extrae el corazón del pecho y rápidamente (en menos de 30 s) se monta en un aparato Langendorff. El corazón se perfunde retrocediendo de manera no recirculante con una solución de Krebs modificada (NaCl 118,5 mM, KCl 4,7 mM, MgSO_{4} 1,2 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, NaHCO_{3} 24,8 mM, CaCl_{2} 2,5 mM y glucosa 10 mM) a una presión constante de 80 mm de Hg y una temperatura de 37ºC. El pH del perfundido se mantiene a 7,4-7,5 burbujeando 95% de O_{2}/5% de CO_{2}. La temperatura del corazón se controla estrechamente usando depósitos calentados para la solución fisiológica y encamisados en torno al tubo de perfusión y el corazón aislado. El latido del corazón y la presión del ventrículo izquierdo se determinan mediante un balón de látex que está insertado en el ventrículo izquierdo, conectado a un transductor de presión mediante un tubo de acero inoxidable. Se infla el balón intraventricular para tener una presión sistólica de 80-100 mm de Hg y una presión diastólica \leq 10 mm de Hg. También se controla continuamente el flujo coronario usando una sonda de corriente en linea normalizada para el peso del corazón.
Se deja que el corazón se equilibre durante 30 min, tiempo durante el cual el corazón muestra presiones estables en el ventrículo izquierdo dentro de los parámetros indicados en lo que antecede. Si las pulsaciones del corazón caen por debajo de 180 bpm en cualquier momento antes del período de 30 min de isquemia regional, el corazón se pone a un ritmo de aproximadamente 200 bpm para el resto del experimento. El preacondicionamiento isquémico se induce por el cese total de perfusión cardíaca (isquemia global) durante 5 min, seguido de reperfusión durante 10 min. La isquemia regional se logra estrechando el lazo en torno a la rama de la arteria coronaria. Después de 30 min de isquemia regional, se libera el lazo y se reperfunde el corazón durante 120 min más.
La cardioprotección farmacológica se induce por infusión de la combinación de ensayo, esto es, una combinación de un compuesto de fórmula I con un inhibidor NHE-1, a concentraciones predeterminadas, comenzando 30 min antes de la isquemia regional y continuando hasta el final del período de 120 min de reperfusión. Los corazones que reciben la combinación de ensayo no se someten al período de preacondicionamiento isquémico. El compuesto de referencia, APNEA (500 nM), se perfunde a través de los corazones (que no reciben el compuesto de ensayo) durante un período de 5 min que termina 10 min antes de los 30 min de isquemia regional.
Al final de los 120 min del período de reperfusión, se estrecha el lazo de la arteria coronaria y se perfunde una suspensión al 0,5% de partículas fluorescentes de sulfato de zinc-cadmio (1-10 \mum, Duke Scientific Corp., Palo Alto, CA) a través del corazón; esto tiñe la totalidad del miocardio, excepto la zona de riesgo para el desarrollo de infarto (zona de riesgo). Se extrae el corazón del aparato de Langendorff, se transfiere en seco, se envuelve en hoja de aluminio y se almacena durante la noche a -20ºC. Al día siguiente, el corazón se divide en rebanadas de 2 mm de corte transversal desde el ápex a la parte de arriba de los ventrículos. Las rebanadas se tiñen con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) al 1%, durante 20 min a 37ºC, en solución salina tamponada con fosfato. Puesto que el TTC reacciona con tejido vivo (que contiene deshidrogenasas dependientes de NAD), esta tinción diferencia entre tejido vivo (teñido en rojo) y tejido muerto (tejido infartado, no teñido). Se calculan para cada rebanada del ventrículo izquierdo la zona infartada (no teñida) y la zona de riesgo (sin partículas fluorescentes) usando un analizador de imágenes precalibrado. Para normalizar la lesión isquémica por diferencias en la zona de riesgo entre corazones, los datos se expresan como media \pm d.e. y se comparan estadísticamente usando un ensayo no paramétrico de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Se considera significación como p < 0,05.
Los resultados del ensayo in vitro anterior demuestran que una combinación de un compuesto de esta invención con un inhibidor NHE-1 induce una significativa cardioprotección comparativamente con el grupo de control.
Los efectos terapéuticos de una combinación de un compuesto de fórmula I con un inhibidor NHE-1 en la prevención de una lesión de tejido cardíaco que resulta de un ultraje isquémico puede demostrarse también in vivo conforme a las directrices presentadas por Liu y otros (Circulation, vol 84:350-356, 1991) según se describe específicamente en el trabajo). En los ensayos in vivo, se estudia la cardioprotección de la combinación de ensayo, esto es, un compuesto de fórmula I junto con un inhibidor NHE-1, comparativamente con el grupo de control que recibe vehículo salino. La cardioprotección, indicada por una reducción del miocardio infartado, se puede inducir farmacológicamente usando agonistas de receptores de adenosina administrados por vía intravenosa en conejos intactos anestesiados, estudiados como modelo in situ de preacondionamiento miocárdico isquémico (Liu y otros, Circulation 84:350-356, 1991). El ensayo in vivo determina si la presente combinación de un compuesto de fórmula I con un inhibidor NHE-1 puede inducir farmacológicamente protección, esto es un tamaño reducido del infarto miocárdico, cuando se administra parenteralmente a conejos anestesiados. Los efectos de la combinación de un compuesto de fórmula I de esta invención con un inhibidor NHE-11 pueden compararse a un preacondicionamiento isquémico usando el agonista de adenosina A1, N^{6}-1(fenil-2R-isopropil) adenosina (PIA), que se ha demostrado que induce farmacológicamente cardioprotección en conejos intactos anestesiados estudiados in situ (Liu y otros, Circulation 84:350-356. 191). Seguidamente se describe la metodología.
Cirugía
Conejos macho New Zealand White (3-4 kg) se anestesian con pentobarbital sódico (30 mg/kg, i.v.). Se realiza una traqueotomía mediante una incisión cervical ventral en la linea central y los conejos se ventilan con oxígeno al 100% usando un ventilador de presión positiva. Se ponen catéteres en la vena yugular izquierda para administración de fármacos y en la arteria carótida izquierda para medir la presión sanguínea. Los corazones se exponen luego mediante una toracotomía izquierda y se pone un lazo (seda 00) en torno a una rama prominente de la arteria coronaria izquierda. Se induce isquemia estrechando el lazo y afianzándolo. La liberación del lazo permite reperfundir la zona afectada. La isquemia miocárdica se evidencia por cianosis regional; la reperfusión se pone de manifiesto por hiperemia reactiva.
Protocolo
El ensayo empieza una vez que la presión arterial y las pulsaciones cardíacas se han estabilizado durante al menos cinco minutos. El preacondicionamiento isquémico se induce ocluyendo la arteria coronaria durante 5 minutos, a lo que sigue una reperfusión durante 10 minutos. El preacondicionamiento farmacológico se induce por infusión de la combinación de ensayo, esto es, una combinación de un compuesto de fórmula I de esta invención con un inhibidor NHE-1, durante, por ejemplo, 5 minutos y dejando 10 minutos antes de otra intervención o por infusión del agonista de adenosina, PIA (0,25 mg/kg). Después del preacondicionamiento isquémico, preacondicionamiento farmacológico o sin acondicionamiento alguno (no acondicionado, control con vehículo), se ocluye la arteria durante 30 min y luego se perfunde durante dos horas para inducir infarto miocárdico. La combinación de ensayo y el PIA se disuelven en solución salina u otro vehículo adecuado y se suministran a 1 a 5 mg/kg, respectivamente.
Tinción
(Liu y otros, Circulation, 84:350-356, 1991): Al final del período de 2 horas de reperfusión, se extraen rápidamente los corazones, se cuelgan en un aparato de Langendorff y se purgan durante 1 min con solución salina normal calentada a la temperatura del cuerpo (38ºC). La sutura de seda usada como lazo se aprieta estrechamente para reocluir la arteria y se infunde una suspensión al 0,5% de partículas fluorescentes de sulfato de zinc-cadmio (1-10 \mum) con el perfundido para teñir todo el miocardio excepto la zona de riesgo (ventrículo no fluorescente). Se congelan luego rápidamente los corazones y se almacenan durante la noche a -20ºC. Al día siguiente, el corazón se divide en rebanadas de 2 mm de corte transversal y se tiñen con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC). Puesto que el TTC reacciona con tejido vivo, esta tinción diferencia entre tejido vivo (teñido en rojo) y tejido muerto (tejido infartado, no teñido). Se calculan para cada rebanada del ventrículo izquierdo la zona infartada (sin teñir) y la zona de riesgo (sin partículas fluorescentes) usando un analizador de imagen precalibrado. Para normalizar la lesión isquémica por diferencias en la zona de riesgo entre corazones, los datos se expresan como relación de zona infartada a zona de riesgo (% de A/AAR). Todos los datos se expresan como valor medio \pm d.e. y se comparan estadísticamente usando el factor individual ANOVA o el ensayo no paramétrico de Mann Whitney. La significación se considera como p < 0,05.
La combinación de un compuesto de fórmula I con un inhibidor NHE-1 se puede ensayar en cuanto a su utilidad para reducir o prevenir la lesión isquémica en tejidos no cardíacos, por ejemplo, el cerebro o el hígado, utilizando procedimientos de la bibliografía científica. La combinación de un compuesto de fórmula I de esta invención con un inhibidor NHE-1 en tales ensayos se puede administrar por la vía y con el vehículo de administración preferidos y en el momento que se desee, antes, durante o después (período de reperfusión) del episodio isquémico, o durante cualquiera de las etapas experimentales que se mencionan en lo que sigue.
El beneficio de la combinación de inhibidores NHE-1 y compuestos de fórmula I para reducir la lesión isquémica cerebral se puede demostrar, por ejemplo, en mamíferos usando el método de Park y otros (An. Neurol., 1988, 24:543-551). De acuerdo con el procedimiento de Park y otros, se anestesian ratas adultas macho Sprague Dawley inicialmente con halotano al 2% y luego por ventilación mecánica con una mezcla de óxido nitroso/oxígeno (70%/30%) que contiene 0,5-1% de halotano. Se realiza luego una traqueotomía. El volumen del golpe del ventilador se ajusta para mantener la tensión arterial de dióxido de carbono a aproximadamente 35 mm de Hg y una oxigenación arterial adecuada (PaO_{2} > 90 mm de Hg). La temperatura del cuerpo se puede controlar con un termómetro rectal y los animales pueden mantenerse normotérmicos, si es necesario, mediante calentamiento exterior. Los animales se someten seguidamente a craneotomía subtemporal para exponer el tronco principal de la arteria media cerebral izquierda (MCA) bajo un microscopio operativo, y la arteria expuesta se ocluye con coagulación microbipolar para generar lesiones isquémicas grandes en el cortex cerebral y ganglios basales. Después de 3 horas de oclusión de MCA, las ratas se anestesian profundamente con halotano al 2% y se realiza una toracotomía para infundir solución salina heparinizada en el ventrículo izquierdo. El efluente se recoge mediante una incisión del atrio derecho. Al lavado con solución salina sigue el lavado con aproximadamente 200 ml de formaldehído al 40%, ácido acético glacial y solución de metanol absoluto (FAM; 1:1:8, v/v/v), luego se decapitan los animales y la cabeza se almacena en fijativo durante 24 horas. Se extrae luego el cerebro, se disecciona, se embebe en cera de parafina y se secciona (aproximadamente 200 secciones de 0,2 mm por cerebro). Las secciones se tiñen luego con hematoxilina-eosina o con una combinación de violeta de cresilo y azul intenso Luxol y se examinan con microscopio óptico para identificar y cuantificar la lesión isquémica usando un analizador de imagen precalibrado. Los volúmenes y superficies isquémicos se expresan en unidades absolutas (mm^{3} y mm^{2}) y como porcentaje de la región total examinada. El efecto de las composiciones y métodos de esta invención para reducir la lesión isquémica cerebral inducida por oclusión de MCA se observa sobre la base de una reducción de la superficie o volumen de lesión isquémica relativa o absoluta en las secciones de cerebro de ratas del grupo de tratamiento en comparación con secciones de cerebro de ratas del grupo de control tratado con placebo.
Entre otros métodos que se podrían utilizar alternativamente para demostrar los usos de la invención para reducir la lesión isquémica cerebral están incluidos los descritos por Nakayama y otros, Neurology, 1988, 38:1667-1673; Memezawa y otros, en Stroke, 1992, 23:552-559; Folgergrova y otros, en Proc. Natl, Acad. Sci., 1995, 92:5057-5059; y Gotti y otros, en Brain Res., 1990, 522:290-307.
Los usos de esta invención para reducir la lesión isquémica del hígado se pueden demostrar, por ejemplo, en mamíferos usando el método de Yokoyama y otros (Am. J. Physiol. 258:G564-G570). De acuerdo con el método de Yokohama y otros, se anestesian ratas macho adultas Sprague Dawley en ayunas con pentobarbital sódico (40 mg/kg, i.p.) y luego se traqueotomizan los animales y se ventilan mecánicamente con aire ambiente. Se extirpa el hígado y se pone en una cámara ambiental mantenida a temperatura constante (37ºC), luego se perfunde a través de la vena portal a una presión constante de 15 cm de agua con tampón de Krebs-Henseleit modificado, exento de hemoglobina (en mM: NaCl 118, KCl 4,7, NaHCO_{3} 27, CaCl_{2} 2,5, MgSO_{4} 1,2, KH_{2}PO_{4} 1,2, EDTA 0,05 y glucosa 11 mM, más 300 U de heparina). El pH del perfundido se mantiene a 7,4 gaseando el tampón con 95% de O_{2}/5% de CO_{2}. Cada hígado se perfunde a un caudal de 20 ml/min en una sola pasada durante un período de lavado y equilibramiento de 30 min, seguidamente un período de 2 horas de isquemia global y luego un período de 2 horas de reperfusión en condiciones idénticas a las del período preisquémico. Durante el período preisquémico, se recogen partes alícuotas (20 ml) del perfundido, inmediatamente después del período isquémico oclusivo y cada 30 minutos del período de 2 horas de reperfusión. Las muestras perfundidas se examinan en cuanto a la aparición de enzimas hepatocelulares, por ejemplo, aminotransferasa de aspartato, (AST), aminotransferasa de alanina (ALT) y lactato-deshidrogenasa (LDH), que se toman para reflejar cuantitativamente el grado de lesión isquémica de tejido hepático durante el procedimiento. Las actividades de AST, ALT y LDH en el perfundido se pueden determinar por varios métodos, por ejemplo, por el método de reflectometría usando un analizador automático Kodak Ektachem 500 al que hacen referencia Nakano y otros (Hepatology 1995, 22:539-545). Se toma nota del efecto de las composiciones y métodos de esta invención en cuanto a reducir la lesión hepática isquémica inducida por oclusión, sobre la base de una reducción de la liberación de enzimas hepatocelulares inmediatamente después del período oclusivo y/o durante el período de reperfusión postisquémica en los hígados perfundidos de ratas del grupo de tratamiento en comparación con hígados perfundidos de ratas en un grupo de control tratado con placebo.
Entre otros métodos y parámetros que, alternativamente, se podrían utilizar para demostrar el efecto beneficioso de esta invención para reducir la lesión isquémica del hígado están incluidos los descritos por Nakano y otros (Hepatology, 1995, 22:539-545).
En lo que sigue, se denominan colectivamente "composiciones y compuestos activos de uso en esta invención" los compuestos de fórmula I, las sales farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores y composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mencionado compuesto y (a) un inhibidor de aldosa-reductasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mencionado inhibidor de aldosa-reductasa, o (b) un inhibidor NHE-1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mencionado inhibidor NHE-1.
Los compuestos activos y las composiciones de uso en esta invención pueden administrarse a un sujeto que necesita ser tratado, por varias vías convencionales de administración, incluidas las vías oral, parenteral y tópica. Por lo general, los compuesto de fórmula I y sus sales farmacéuticamente aceptables se administrarán oralmente o parenteralmente a dosis entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del sujeto a tratar por día, preferiblemente de aproximadamente 1 a 15 mg/día, en una dosis o en dosis divididas. Generalmente, las composiciones que contienen un compuesto de fórmula I y un inhibidor de aldosa-reductasa se administrarán oral o parenteralmente a dosis entre aproximadamente 1 y 100 mg de cada componente activo (esto es, el compuesto de fórmula I y el inhibidor de aldosa-reductasa) por kg de peso corporal del sujeto a tratar por día, preferiblemente de aproximadamente 1 a 25 mg/kg. Las composiciones que contienen un compuesto de fórmula I y un inhibidor NHE-1 se administrarán, generalmente, oral o parenteralmente a dosis entre aproximadamente 1 y 100 mg del mencionado compuesto de fórmula I por kg de peso corporal del sujeto a tratar por día y a dosis de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg/día del mencionado inhibidor NHE-1. Una dosificación especialmente preferida contiene entre aproximadamente 1 y 50 mg/kg/día del mencionado compuesto de fórmula I y entre aproximadamente 0.01 y 50 mg/kg/día del mencionado inhibidor NHE-1.
Los compuestos activos y las composiciones de uso en esta invención pueden administrarse solos o en combinación con vehículos farmacéuticamente aceptables, en dosis únicas o múltiples. Entre los vehículos farmacéuticos adecuados están incluidos diluyentes sólidos inertes o cargas, soluciones acuosas estériles y varios disolventes orgánicos. Las composiciones farmacéuticas formadas combinando los compuestos activos de fórmula I y los vehículos farmacéuticamente aceptables se pueden administrar luego en una variedad de formas de administración tales como comprimidos, polvos, losanges, jarabes, soluciones inyectables, etc. Si se desea, estas composiciones farmacéuticas pueden contener ingredientes adicionales tales como agentes saboreadores, aglutinantes, excipientes, etc. Así, a fines de administración oral, se pueden utilizar comprimidos que contienen varios excipientes tales como citrato sódico, carbonato cálcico y fosfato cálcico junto con desintegrantes tales como almidón, ácido algínico y ciertos silicatos complejos, a la vez que agentes aglutinantes tales como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y goma arábiga. Además, frecuentemente se usan agentes lubricantes tales como estearato magnésico, laurilsulfato sódico y talco para favorecer la preparación de comprimidos. Las composiciones sólidas de un tipo similar se pueden usar también como cargas en cápsulas de gelatina blanda o dura. Entre los materiales preferidos para esto están incluidos lactosa o azúcar de la leche en polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas o elixires para administración oral, el ingrediente activo esencial puede combinarse con varios agentes edulcorantes o saboreadores, materias coloreadoras o colorantes y, si se desea, agentes emulsivos o suspensivos, junto con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y combinaciones de ellos.
Para administración parenteral, se pueden emplear soluciones de los compuestos activos y composiciones de esta invención en aceite de sésamo o cacahuete, propilenglicol acuoso o en soluciones acuosas estériles. Tales soluciones acuosas deben estar adecuadamente tamponadas si es necesario y, primeramente, el diluyente líquido se hace isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este aspecto, los medios acuosos estériles empleados son preparables fácilmente por técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica.
Los compuestos activos y las composiciones de uso en esta invención pueden emplearse, más en particular, en la preparación de soluciones oftálmicas. Tales composiciones oftálmicas tienen un interés principal para el tratamiento de cataratas diabéticas por administración tópica. Para el tratamiento de cataratas diabéticas, los compuestos activos y las composiciones de uso en esta invención se administran en el ojo en forma de un preparado oftálmico de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional. El preparado oftálmico contendrá un compuesto de la fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto de fórmula I, en una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5%, en una solución, suspensión o ungüento farmacéuticamente aceptable. En preparados oftálmicos que contienen una combinación de un compuesto de fórmula I y un inhibidor de aldosa-reductasa, cada ingrediente activo estará presente en una cantidad de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 1% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,25%, en una solución, suspensión o ungüento farmacéuticamente aceptable.
La administración de los compuestos de fórmula I puede hacerse por cualquier vía que suministre un compuesto de esta invención preferentemente al tejido deseado (por ejemplo, los tejidos pancreático, hepático y/o cardíaco). Entre estas vías están incluidas las vías oral, parenteral, intraduodenal, etc. Por lo general, los compuestos de la presente invención se administran en una dosis única (por ejemplo, una dosis al día) o dosis múltiples, o por infusión constante.
Generalmente, un compuesto de fórmula I se administra oralmente o parenteralmente (por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea o intramedular). También puede estar indicada la administración tópica, por ejemplo, cuando el paciente sufre trastornos gastrointestinales o cuando lo mejor es aplicar la medicación sobre la superficie de un tejido u órgano conforme a lo que determine el médico que atiende al paciente.
La cantidad y la cronología de aplicación de los compuestos que se administran dependerá, obviamente, del sujeto que se está tratando, la severidad de la dolencia, el modo de administración y el criterio del médico que atiende al paciente. Así, a causa de la variabilidad de paciente a paciente, las dosis que se indican más adelante tienen el carácter de directrices y el médico puede recetar dosis del fármaco que considera que son las apropiadas para el paciente. Al tener en cuenta el grado de tratamiento deseado, el médico debe plantear una solución de compromiso entre una variedad de factores tales como la edad del paciente, la presencia de una enfermedad preexistente, así como la presencia de otras enfermedades.
Así por ejemplo, en un modo de administración, los compuestos de fórmula I se pueden administrar antes de cirugía (por ejemplo, veinticuatro horas antes de cirugía cardíaca), durante o después de cirugía (por ejemplo, veinticuatro horas después de cirugía) cuando hay riesgo de isquemia miocárdica. Los compuestos de fórmula I también pueden administrarse diariamente de manera crónica.
Por lo general, los compuestos de la presente inyección se administran en forma de una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de fórmula I de esta invención junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Así, los compuestos de fórmula I se pueden administrar individualmente o combinados en cualquier forma convencional de dosificación oral, parenteral, rectal o transdérmica.
A los fines de administración transdérmica (por ejemplo, tópica), se preparan soluciones diluidas estériles, acuosas o parcialmente acuosas (usualmente de una concentración de aproximadamente 0,1% a 5%) similares, por lo demás, a las soluciones parenterales anteriores.
Los métodos para preparar varias composiciones farmacéuticas con una cierta cantidad de ingrediente activo son conocidos, o podrán establecerlos los expertos en la técnica a la luz de esta descripción. Para ver ejemplos de métodos de preparación de composiciones farmacéuticas, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19ª. edición (1995).
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden contener, por ejemplo, 0,0001%-95% de compuesto(s) de esta invención. En cualquier caso, la composición o formulación a administrar contendrá una cantidad de un(os) compuesto(s) de acuerdo con la invención en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad/dolencia del sujeto que se está tratando.
Los dos compuestos diferentes de esta combinación de esta invención se pueden coadministrar simultáneamente o secuencialmente, o como una única composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I y un inhibidor de aldosa-reductasa como se ha descrito antes, o un inhibidor de glicógeno-fosforilasa como se ha descrito antes, o un agente cardiovascular.
Generalmente, los compuestos de fórmula I de uso en esta invención se administrarán en una formulación conveniente.
En las formulaciones que siguen, "ingrediente activo" significa un(os) compuesto(s) de uso en esta invención.
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Formulación 1
Cápsulas de gelatina
Se preparan cápsulas de gelatina dura usando los ingredientes siguientes:
Ingrediente Cantidad (mg/cápsula)
Ingrediente activo 0,25-100
Almidón, NF 0-650
Polvo de almidón deslizable 0-50
Fluido de silicona de 350 x 10^{-6} m^{2} s^{-1} 0-15
Formulación 2
Comprimidos
Se prepara una formulación en comprimidos usando los ingredientes siguientes:
Ingrediente Cantidad (mg/comprimido)
Ingrediente activo 0,25-100
Celulosa microcristalina 200-650
Dióxido de silicio ahumado 10-650
Ácido esteárico 5-15
Se mezclan los componentes y se comprimen para formar comprimidos.
Alternativamente, se preparan como sigue comprimidos, cada uno con un contenido de 0,25-100 mg de ingrediente activo.
Formulación 3
Comprimidos
Ingrediente Cantidad (mg/comprimido)
Ingrediente activo 0,25-100
Almidón 45
Celulosa microcristalina 35
Polivinilpirrolidona (solución al 10% en agua) 4
Carboximetilcelulosa sódica 4,5
Estearato magnésico 0,5
Talco 1
Se hacen pasar el ingrediente activo, el almidón y la celulosa a través de un tamiz de malla U.S. nº. 45 y se mezclan íntimamente. Se mezcla la solución de polivinilpirrolidona con los polvos resultantes y luego se hace pasar la mezcla a través de un tamiz de malla U.S. nº. 14. Los gránulos así producidos se secan a 50ºC-60ºC y se hacen pasar por un tamiz de malla U.S. nº. 18. Se hacen pasar el carboximetilalmidón sódico, el estearato magnésico y el talco a través de un tamiz de malla U.S. nº. 60 y luego se añaden a los gránulos que, después de mezclar, se comprimen en una máquina para obtener los comprimidos.
Se preparan como sigue suspensiones, cada una con un contenido de 0,25-100 mg de ingrediente activo por dosis de 5 ml.
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Formulación 4
Suspensiones
Ingrediente Cantidad (mg/5 ml)
Ingrediente activo 0,25-100 mg
Carboximetilcelulosa sódica 50 mg
Jarabe 1,25 mg
Solución de ácido benzoico 0,10 ml
Agente saboreador s. a.
Colorante s. a.
Agua purificada hasta 5 ml
Se hace pasar el ingrediente activo a través de un tamiz de malla U.S. nº. 45 y se mezcla con la carboximetilcelulosa sódica y el jarabe para formar una pasta uniforme. Se diluyen con algo de agua la solución de ácido benzoico, el agente saboreador y el colorante y se añaden a la pasta mientras que se agita. Se añade luego suficiente agua para producir el volumen requerido.
Se prepara una solución de aerosol que contiene los ingredientes siguientes.
Formulación 5
Aerosol
Ingrediente Cantidad (% en peso)
Ingrediente activo 0,25
Etanol 25,75
Propulsor 22 (clorodifluorometano) 74,00
El ingrediente activo se mezcla con etanol y la mezcla se añade a una porción del propulsor 22, se enfría a 30ºC y se pasa a un dispositivo de llenado. Se aporta luego la cantidad requerida a un recipiente de acero inoxidable y se disuelve con el resto de propulsor. Se ajustan luego las unidades de válvula al recipiente.
Se preparan supositorios como sigue:
Formulación 6
Supositorios
Ingrediente Cantidad (mg/supositorio)
Ingrediente activo 250
Glicéridos de ácido graso saturado 2.000
Se hace pasar el ingrediente activo a través de un tamiz de malla U.S. nº. 60 y se pone en suspensión en los glicéridos de ácido graso saturado previamente fundidos usando el mínimo calor necesario. La mezcla se vierte luego en un molde para supositorios de una capacidad nominal de 2 g y se deja enfriar.
Se prepara como sigue una formulación intravenosa:
Formulación 7
Solución intravenosa
Ingrediente Cantidad
Ingrediente activo 25 mg-10.000 mg
Solución salina isotónica 1.000 ml
La solución de los ingredientes indicados se administra intravenosamente a un paciente.
El ingrediente anterior también puede ser una combinación de agentes.
Procedimientos experimentales generales
Los puntos de fusión se determinaron con un aparato capilar de puntos de fusión Thomas-Hoover y son sin corregir. Los espectros de RMN ^{1}H se obtuvieron con los espectrómetros Bruker AM-250 (Bruker Co., Billerica, Massachusetts), Bruker AM-300, Varian XL-300 (Varian Co., Palo Alto, California) o Varian Unity 400 a aproximadamente 23ºC a 250, 300 ó 400 MHz para protón. Los desplazamientos químicos se expresan en partes por millón (\Box) en relación a cloroformo residual (7,26 ppm), dimetilsulfóxido (2,49 ppm) o metanol (3,30 ppm) como referencia interna. Las formas de los picos se denotan como sigue: s, singlete; d, doblete; t, triplete; q, cuartete; m, multiplete; c, complejo; anc, ancho. Los espectros de masa de baja resolución se obtuvieron en condiciones de termoproyección (TS^{+}) en un espectrómetro de masas Fisons (ahora Micromass) Trio 1000 Mas Spectrometer (Micromass Inc., Beverly, Massachusetts) en condiciones de ionización química en un espectrómetro Hewlett Packard 5989A Particle Beam Mass Spectrometer (Hewlett Packard Co, Palo Alto, California), o por ionización química a presión atmosférica (APCI) en un Fisons (ahora Micromass) Platform II Spectrometer. Las rotaciones ópticas se obtuvieron en un polarímetro Perkin-Elmer 241 MC (Perkin-Elmer, Norwalk, Connecticut) usando una longitud estándar de paso de 1 dcm a aproximadamente 23ºC a la concentración indicada en el disolvente indicado.
La cromatografía de líquidos en columna se realizó usando corriente forzada (cromatografía rápida) del disolvente indicado en Baker Silica Gel (4 0 \mum, J.T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) o Silica Gel 60 (EM Sciences, Gibbstown, New Jersey) en columnas de vidrio o usando presión baja de nitrógeno o aire en cartuchos Flash 40^{MC} o Flash 12^{MC} (Biotage, Charlottesville, Virginia). La cromatografía radial se realizó usando un aparato Chromatron (Harrison Research, Palo Alto, California). Los términos "concentrado" y "evaporado" se refieren a la eliminación de disolvente usando un evaporador rotatorio a la presión de aspiración de agua o a presiones similares generadas por un aparato Büchi B-171 Vacobox (Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, New York) o Büchi B-177 Vacobox con una temperatura del baño igual o menor que 50ºC. Las reacciones que requerían el uso de hidrógeno gas a presiones superiores a 1 atmósfera se realizaron usando un aparato de hidrógeno de Parr (Parr Instrument Co., Moline, Ilinois). A no ser que se especifique lo contrario, los reactivos se adquirieron de fuentes comerciales. Las abreviaturas "d", "h" y "min" corresponden a "día(s)", hora(s) y "minuto(s)", respectivamente.
Ejemplo 1 Dimetilamida del ácido 4-[2-(1R-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il]-piperazin-1-sulfónico
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Etapa A
(R)-2-metoxi-propionitrilo
Se calienta a 160ºC en un aparato de destilación una mezcla de 2-metoxi-propionamida (preparada de acuerdo con Freudenberg y Market, Chem. Ber., 1927, 60, 2453; 3,0 g, 29,1 mmol), pentóxido de fósforo (4,13 g, 29,1 mmol) y arena seca (3,0 g) y se recoge el destilado (1,01 g, 44%); [\alpha]_{D} + 139,2 (C=1, metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,5 (d, 3H), 3,45 (s, 3H), 4,15 (q, 1H).
Etapa B
Hidrocloruro del éster etílico del ácido (R)-2-metoxi-propionimídico
Se hizo pasar cloruro de hidrógeno gas a una solución enfriada con hielo de (R)-2-metoxi-propionitrilo (preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 1, Etapa A, 9,91 g, 116,5 mmol) en etanol anhidro (100 ml) hasta que la solución se saturó con el gas. La mezcla de reacción se almacenó en una nevera durante la noche. Se eliminó en vacío el exceso de etanol, obteniéndose el compuesto del título del Ejemplo 1, Etapa B, como un sólido delicuescente (19,5 g; rend. de 100%); [\alpha]_{D} + 46,4 (c = 1, metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,4 (d, 3H), 3,4 (s, 1H), 3,7 (q, 2H), 4,8 (q, 1H), 6,2 (b, 1H).
Etapa C
(R)-2-metoxi-propionamida
Una solución del éster etílico del ácido (R)-2-metoxi-propionimídico en etanol se enfrió en baño de hielo y se hizo pasar amoniaco gas a la solución hasta que la mezcla de reacción se saturó con amoniaco. La mezcla de reacción se agitó durante la noche. Se eliminó el exceso de etanol para obtener un líquido similar a un jarabe, que se trituró con dietil éter (100 ml). El sólido resultante se filtró para recoger el compuesto del Ejemplo 1, Etapa C (12,2 g), p.f. 60-75ºC; [\alpha]_{D} + 45,4 (c= 1, metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,4 (d, 3), 3,4 (s, 3H), 3,7 (q, 1H), 5,8 (b, 1H), 6,5 (b, 1H).
Etapa D
(R)-2-metoximetil-4-hidroxi-pirimidina
Se agitó a temperatura ambiente durante 24 h una mezcla de (R)-2-metoxi-propionamidina (preparada de acuerdo con el método del Ejemplo 1, Etapa C, 10,0 g, 72,15 mmol), 2-etoxi-carboniletenolato (preparado de acuerdo con la Preparación Uno, Etapa C, 19,93 g, 144,3 mmol) y agua (50 ml). La mezcla de reacción se neutralizó añadiendo suficiente HCl conc. para ajustar el pH a aproximadamente 7,0 y se sometió a extracción con cloruro de metileno. El extracto se secó sobre sulfato sódico anhidro, se evaporó a sequedad y el residuo se cromatografió sobre gel de sílice. Por elución con una mezcla 95:5 de cloruro de metileno/metanol y evaporación del eluyente, se obtuvo un aceite viscoso espeso (1,7 g); [\alpha]_{D} + 76,4 (c = 1, metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 Mhz) \delta 1,51 (d, 3H), 3,44 (s, 3H), 4,29 (q, 1H), 7,91 (d, 1H), 11,00 (b, 1H).
Etapa E
(R)-2-(1-metoxietil)-pirimidin-4-il-metano-sulfonato
A una solución enfriada con hielo de (R)-2-metoximetil-4-hidroxi-pirimidina (1,69 g, 10,95 mmol) en cloruro de metileno (10 ml) se añadió primeramente trietilamina (1,7 ml, 12,05 mmol) y luego cloruro de mesilo (1,38 g, 12,05 mmol). La mezcla de reacción se agitó a la temperatura del hielo durante 20 min y luego se calentó a temperatura ambiente. Después de 1 hora, se apagó la reacción con solución acuosa saturada de bicarbonato sódico, se recogió la capa orgánica y se lavó con agua (10 ml), se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó el filtrado, obteniéndose un aceite (2,11 g, 83%). [\alpha]_{D} + 69,2 (c = 1, metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,52 (d, 3H), 3,38 (s, 3H), 3,62 (s, 3H), 4,53 (q, 1H), 7,00 (d, 1H), 8,80 (d, 1H).
Etapa F
Dimetilamida del ácido (R)-4-[2-(1-metoxi-etil)-pirimidin-4-il]piperazin-1-sulfónico
A una solución de (R)-2-(1-metoxietil)-pirimidin-4-il-metanosulfonato (preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 1, Etapa E, 2,11 g, 9,1 mmol) en tetrahidrofurano (20 ml) se añadió dimetilsulfamoílpiperazina (preparada de acuerdo con el método descrito en la patente U.S. nº. 2.748.129, 1,94 g, 10 mmol) y seguidamente trietilamina (1,4 ml, 10 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo a reflujo durante 15 h y se evaporó, obteniéndose un residuo oleoso. Éste se sometió a extracción con acetato de etilo (20 ml) y luego se lavó el extracto primeramente con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico y luego con agua (10 ml). El extracto en acetato de etilo se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó el filtrado, obteniéndose un producto en bruto que se cromatografió sobre gel de sílice. Después de eluir con una mezcla 9:1 de acetato de etilo/metanol y evaporar los disolventes, se obtuvo el compuesto del título del Ejemplo 1, Etapa F (1,75 g, 59%); p.f. 65-70ºC, [\alpha]_{D} + 54,4º (c = 1, metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,48 (d, 3H), 2,89 (s, 6H), 3,31 (m, 4H), 3,37 (s, 3H), 3,78 (m, 4H), 4,34 (q, 1H), 6,41 (d, 1H), 8,30 (d, 1H).
Etapa G
Dimetilamida del ácido 4-[2-(1R-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il]-piperazin-1-sulfónico
A una solución enfriada a la temperatura del hielo de dimetilamida del ácido (R)-4-[2-(1-metoxi-etil)-pirimidin-4-il]piperazin-1-sulfónico (preparada de acuerdo con el método del Ejemplo 1, Etapa F, 1,75 g, 5,31 mmol) en cloruro de metileno (53 ml) se añadió tribromuro de boro (10,6 ml, 10,6 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h. Se dejó calentar la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se apagó con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico. La capa de cloruro de metileno se lavó con agua (20 ml), se secó sobre sulfato sódico, se filtró y el filtrado se evaporó para obtener un residuo sólido que se cristalizó de una mezcla de isopropil éter y cloruro de metileno, resultando el compuesto del título como un sólido blanco (642 mg, 38%); p.f. 103-105ºC; [\alpha]_{D} + 16,1º (c = 1, metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,48 (d, 6H), 2,83 (s, 3H), 3,31 (m, 4H), 3,74 (m, 4H), 4,70 (q, 1H), 6,40 (d, 1H), 8,21 (d, 1H); MS (Cl) M^{+1} 316.
Ejemplo 2 Dimetilamida del ácido 4-[2-(1R-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il]-piperazin-1-sulfónico
18
Etapa A
Dimetilamida del ácido 4-(2-formil-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico
19
A una solución de dimetilamida del ácido 4-[2-hidroxi-metil)-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico (preparada de acuerdo con el método descrito en la patente U.S. nº. 5.138.058; 12,12 g, 40,2 mmol) en cloruro de metileno (100 ml) se añadió una solución de cloruro de oxalilo (3,9 ml, 44,2 mmol) y la mezcla de reacción se enfrió a -78ºC. A la mezcla de reacción se añadió a gotas una solución de DMSO (6,27 ml, 88,4 mmol) en cloruro de metileno (20 ml) para mantener la temperatura de la mezcla de reacción a -70ºC o más baja. Después de 2 h, se añadió a gotas trietilamina (28,0 ml, 88,4 mmol) y se dejó que la mezcla de reacción alcanzara la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con agua (200 ml) y la capa orgánica recogida se lavó con solución acuosa saturada de bicarbonato sódico. Se recogió la capa orgánica lavada, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y el filtrado se evaporó para obtener un sólido. El sólido se trituró con éter (20 ml) y se filtró la mezcla, obteniéndose el compuesto del título del Ejemplo 2, Etapa A (10,84 g, 94%); p.f. 124-127ºC.
Etapa B
Dimetilamida del ácido 4-[2-(1RS-hidroxietil)-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico
A una solución enfriada a -5ºC de dimetilamida del ácido 4-(2-formil-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico (preparada de acuerdo con el método del Ejemplo 2, Etapa A, 419 g, 14 mmol) en tetrahidrofurano seco (100 ml) se añadió una solución de bromuro de metilmagnesio en éter (7,6 ml, 23,1 mmol). Después de 20 min, se dejó que la mezcla de reacción se calentara a temperatura ambiente y luego se mantuvo a reflujo durante 30 min. Después de enfriar la mezcla de reacción a temperatura ambiente, se apagó con solución saturada de cloruro amónico y luego se sometió a extracción con acetato de etilo (2 x 50 ml). Se recogió la capa orgánica, se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se evaporó el filtrado, obteniéndose un sólido de color amarillo pálido (4,21 g, 95%); p.f. 115-116ºC.
Etapa C
Acetato de R-1-[4-(4-dimetilsulfamoil-piperazin-1-il)-pirimidin-2-il]etilo
20
A una solución que contiene dimetilamida del ácido 4-[2-(1RS-hidroxietil)-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico (preparada de acuerdo con el método del Ejemplo 2, Etapa B, 0,9 g, 2,86 mmol), dimetoxietano (5,7 ml) y acetato de vinilo (10,5 ml) se añadió lipasa P30 (90 mg, 10%) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 14 días. Se filtró y el filtrado se evaporó, obteniéndose un aceite pardo que se cromatografió sobre gel de sílice. Eluyendo con mezcla 95:5 de ecetato de etilo/metanol y evaporando luego el eluyente, se obtuvo el compuesto del título del Ejemplo 2, Etapa C, como un aceite claro (220 mg, 43%); [\alpha]_{D} + 41,9 (c = 1, metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 Mhz) \delta 1,55 (d, 6H), 2,2 (s, 3H), 2,9 (s, 6H), 3,3 (m, 4H), 3,8 (m, 4H), 6,35 (q, 1H), 6,4 (d, 1H), 8,25 (d, 1H).
Etapa D
Dimetilamida del ácido 4-[2-(1R-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il]-piperazin-1-sulfónico
Se agitó a temperatura ambiente durante 1 h una solución que contenía acetato de R-1-[4-(4-dimetilsulfamoil-piperazin-1-il)- pirimidin-2-il]etilo (preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 2, Etapa C, 200 mg, 0,56 mmol), dioxano (4 ml), metanol (0,5 ml) e hidróxido potásico (4 gotas, solución acuosa al 20%). Se diluyó con agua (10 ml), se sometió a extracción con acetato de etilo (2 x 10 ml), se recogió la capa orgánica, se secó sobre sulfato sódico y el filtrado se evaporó para obtener el compuesto del título del Ejemplo 2 como un sólido blanco que tiene las mismas características de identificación indicadas para el compuesto del Ejemplo 1.
Ejemplo 3 Dimetilamida del ácido 4-[2-(1R-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il]piperazin-1-sulfónico
Etapa A
Butirato de 1(R)-(4-piperazin-1-il-pirimidin-2-il)etilo
Se añadió (R,S)-2-hidroxietil-4-hidroxi-pirimidina (preparada de acuerdo con la Preparación Uno, Etapa D, 21,75 g, 155,2 mmol) a dioxano (650 ml) que contenía butirato de vinilo (17,72 g, 310 mmol) y la mezcla se calentó a 50ºC. A la solución resultante se añadió lipasa P30 (4,35 g) y se continuó calentando durante 24 horas. Se filtró la mezcla de reacción y se evaporó el filtrado, obteniéndose un residuo líquido espeso siruposo. El residuo se repartió entre cloruro de metileno (300 ml) y agua (600 ml) y se recogió la capa de cloruro de metileno, se secó sobre sulfato sódico anhidro y luego se filtró. Se evaporó el filtrado, obteniéndose el compuesto del título del Ejemplo 3, Etapa A, como un líquido incoloro (9,35 g, 86%); [\alpha]_{D} +29,5 (c = 1, metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,95 (t, 3H), 1,65 (m, 5H), 2,4 (m, 2H), 5,65 (q, 1H), 6,45 (d, 1H), 8,0 (d, 1H).
Etapa B
Butirato de (R)-1-(4-piperazin-1-il-pirimidin-2-il)-etilo
Una solución a 0ºC de butirato de (R)-1-(4-hidroxi-pirimidin-2-il)-etilo (10,5 g, 50,0 mmol) y trietilamina (6,06 g, 97,8 mmol) en diclorometano (100 ml) se añadió a gotas cloruro de metanosulfonilo (6,29 g, 55,0 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h. La mezcla se lavó sucesivamente con bicarbonato saturado y agua, se secó sobre sulfato magnésico y se filtró. Se evaporó el filtrado, obteniéndose acetato de (R)-1-(4-metano-sulfoniloxi-pirimidin-2-il)-etilo, 12,6 g (91%), como un aceite. Éste se disolvió en tetrahidrofurano (100 ml), a esta solución se añadió piperazina (7,57 g, 88,0 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 12,0 h. Se filtró la mezcla y el filtrado se concentró y luego se mantuvo a presión reducida durante 3 h, obteniéndose el compuesto del título como un aceite, 10,2 g (73%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,95 (t, 3H), 1,56 (d, 3H), 1,68 (m, 2H), 2,48 (t, 2H), 2,83 (m, 4H), 3,63 (m, 4H), 5,53 (q, 1H), 6,35 (d, 1H), 8,21 (d, 1H). MS (TS) 279(MH^{+}).
Etapa C
Butirato de R-1[4-(4-dimetilsulfamoil-piperazin-1-il)-pirimidin-2-il]-etilo
21
A una solución de butirato de (R)-1-(4-piperazin-1-il-pirimidin-2-il)-etilo (preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 3, Etapa B, 1,49 g, 5,00 mmol), trietilamina (0,61 g, 6,0 mmol) y tetrahidrofurano (20,0 ml) se añadió cloruro de N,N-dimetilsulfamoílo (0,86 g, 6,0 mmol) a temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. La mezcla se diluyó con agua y se sometió dos veces a extracción con acetato de etilo. El extracto en acetato de etilo se lavó una vez con agua (10 ml), se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró el filtrado, obteniéndose el compuesto del título del Ejemplo 3, Etapa B, como un aceite (0,72 g, 87%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,95 (t, 3H), 1,55 (d, 6H), 1,55 (d, 3H), 1,6-1,7-(m, 4H), 2,42 (t, 2H), 3,2 (m, 1H), 3,45 (m, 4H), 3,74 (m, 4H), 5,4 (q, 1H), 6,4 (d, 1H), 8,1 (d, 1H).
Etapa D
Dimetilamida del ácido 4-[2-(1R-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il]-piperazin-1-sulfónico
Se combinó butirato de R-1[4-(4-dimetilsulfamoil-piperazin-1-il)-pirimidin-2- il]-etilo (preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 3, Etapa B, 230 mg, 0,60 mmol) con ácido clorhídrico concentrado (5,0 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 6 h, se diluyó con agua, se ajustó el pH de la solución a 9,9 con hidróxido sódico acuoso 6 N y se sometió dos veces a extracción con acetato de etilo. El extracto se lavó una vez con agua, se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró el filtrado para obtener un aceite que se purificó por cromatografía rápida (9:1, cloruro de metileno: metanol). Después de evaporar el eluyente, se obtuvo un aceite que se cristalizó en isopropil éter, resultando el compuesto del título del Ejemplo 3, que tenía las mismas características de identificación dadas para el compuesto del Ejemplo 1.
Ejemplo 4 (R)-[1-4-[4-(propano-2-sulfonil)-piperazin-1-il-]-pirimidin-2-il-etanol
22
Etapa A
Butirato de (R)-{1-4-[4-propano-2-sulfonil)-piperazin-1-il]-pirimidin-2-il}-etilo
23
A una solución de butirato de (R)-1-(4-piperazin-1-il-pirimidin-2-il)-etilo (preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 3, Etapa B, 2,1 g, 7,5 mmol), trietilamina (0,91 g, 9,0 mmol) en cloruro de metileno (37 ml) se añadió cloruro de isopropilsulfonilo (1,3 g, 9,0 mmol) a temperatura ambiente y se agitó durante 14 h. La mezcla se lavó con agua (2 x 20 ml), se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró el filtrado, obteniéndose butirato de (R)-{1-4-[4-propano-2-sulfonil)-piperazin-1-il]-pirimi-din-2-il}-etilo como un aceite claro (2,05 g, 87%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,95 (t, 3H), 1,42 (d, 6H), 1,55 (d, 3H), 1,6-1,7 (m, 4H), 2,42 (t, 2H), 3,2 (m, 1H), 3,45 (m, 4H), 3,74 (m, 4H), 5,4 (q, 1H), 6,4 (d, 1H), 8,1 (d, 1H). MS(Cl) M^{+1} 385.
Etapa B
(R)-{1-4-[4-(propano-2-sulfonil)-piperazin-1-il]-pirimidin-2-il}-etanol
24
A una solución de butirato de (R)-{1-4-[4-propano-2-sulfonil)-piperazin-1-il]-pirimidin-2-il}-etilo (preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 4, Etapa A, 1,9 g, 4,92 mmol) en metanol (30 ml) se añadió a temperatura ambiente hidróxido potásico acuoso 6,0 N (5,0 ml). Después de agitar durante 3,0 h, la solución se diluyó con cloruro de metileno (50 ml) y se lavó dos veces con agua (10 ml). Se separó la capa orgánica, se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró el filtrado, obteniéndose un aceite viscoso que se purificó por cromatografía rápida usando una mezcla 9:1 de cloruro de metileno/etanol. La evaporación de los disolventes dio un sólido que se cristalizó en ciclohexano, obteniéndose el compuesto del título del Ejemplo 4 como un sólido blanco (1,2 g, 77%). p.f. 65ºC-66ºC. RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,4 (d, 6H), 1,54 (d, 3H), 3,23 (m, 1H), 3,4 (m, 4H), 3,6-3,8 (m, 4H), 4,75 (m, 1H), 6,46 (d, 1H), 8,12 (d, 1H). MS(Cl) M^{+1} 315; [\alpha]_{D} + 14,5 (c = 1,0, MeOH).
Ejemplo comparativo 1
Dimetilamida del ácido 4-[2-(1S-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il]-piperazin-1-sulfónico
25
Etapa A
Butirato del ácido 1(S)-(4-hidroxi-pirimidin-2-il)-piperazin-1-sulfónico
A una solución de 2-(S-1-hidroxietil)-3H-pirimidin-4-ona (preparada de acuerdo con el método de Preparación Cuatro, 1,40 g, 10 mmol), trietilamina (2,22 g, 22 mmol) en cloruro de metileno (20 ml) se añadió N,N-dimetilaminopiridina (0,06 g, 0,5 mmol) y seguidamente anhídrido butírico (1,74 g, 11 mmol) a 0ºC. Después de agitar a temperatura ambiente durante 1,0 h, la mezcla se lavó con agua y la capa de cloruro de metileno se secó sobre sulfato magnésico y se filtró. Se concentró el filtrado, resultando el compuesto del título como un aceite (1,97 g, 94%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,94 (t, 3H), 1,49 (d, 3H), 1,68 (m, 2H), 2,38 (t, 2H), 5,64 (q, 1H), 6,38 (d, 1H), 8,21 (d, 1H). MS (Cl) 211 (MH^{+}); [\alpha]_{D} -44,3 (c = 1,0, MeOH).
Etapa B
Butirato de 1(S)-(4-piperazin-1-il-pirimidin-2-il)-etilo
A una solución enfriada a 0ºC de butirato de 1-(S)-(4-hidroxi-pirimidin-2-il)-etilo (preparado de acuerdo con el Ejemplo 5, Etapa A, 0,42 g, 2,0 mmol) y trietilamina (0,20 g, 2,2 mmol) en cloruro de metileno (10 ml) se añadió a gotas cloruro de mesilo (0,25 g, 2,1 mmol) y se agitó durante 1,5 h. La mezcla se lavó sucesivamente con bicarbonato sódico saturado y agua y la capa orgánica se secó sobre sulfato magnésico anhidro. Se filtró y evaporó, obteniéndose butirato de 1-(S)-(4-metanosulfoniloxi-pirimidin-2-il)-etilo como un aceite. El aceite se disolvió en tetrahidrofurano (10 ml) y a la solución se añadió piperazina 0,69 g, 8,0 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Se filtró la mezcla y se concentró el filtrado obteniéndose un producto en bruto que se purificó por cromatografía rápida (9:1 cloruro de metileno/metanol), obteniéndose el compuesto del título del Ejemplo 5, Etapa B, como un aceite (0,50 g, 90%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,95 (t, 3H), 1,51 (d, 3H), 1,68 (m, 2H), 2,66 (t, 2H), 2,83 (m, 4H), 3,63 (m, 4H), 5,54 (q, 1H), 6,38 (d, 1H), 8,24 (d, 1H). MS(Cl) 251 (MH^{+}).
Etapa C
Dimetilamida del ácido 4-[2-(1S-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il]-piperazin-1-sulfónico
26
A una solución de butirato de 1(S)-(4-piperazin-1-il-pirimidin-2-il)-etilo (preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 5, Etapa B, 0,52 g, 1,8 mmol), trietilamina (0,21 g, 2,0 mmol) y tetrahidrofurano (5,0 ml) se añadió cloruro de N,N-dimetilsulfamoílo (0,29 g, 1,8 mmol) a temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. La mezcla se diluyó con agua y se sometió dos veces a extracción con acetato de etilo. El extracto se lavó una vez con agua (10 ml), se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró el filtrado, obteniéndose un aceite. El aceite se disolvió en ácido clorhídrico concentrado (3,0 ml), se agitó a temperatura ambiente durante 6 h, se diluyó con agua y el pH de la solución se ajustó a 9,0 con hidróxido sódico acuoso 6 N. La mezcla de reacción se sometió a extracción con acetato de etilo (2 x 10 ml) y el extracto se lavó una vez con agua (10 ml), se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró el filtrado, obteniéndose un aceite que se purificó por cromatografía rápida (cloruro de metileno: metanol 95:5), resultando un aceite. La trituración del aceite con ispropil éter dio el compuesto del Ejemplo 5 como un sólido blanco (0,16 g, 27,2%); p.f. 99ºC-100ºC. RMN ^{1}H/CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,48 (d, 6H), 2,83 (s, 3H), 3,32 (m, 4H), 3,74 (m, 4H), 4,69 (q, 1H), 6,41 (d, 1H), 8,21 (d, 1H). MS(Cl) M^{+1} 316. [\alpha]_{D} - 16,9 (c = 1,0, MeOH).
Preparación Uno
2-(1-RS-hidroxi-etil)-3H-pirimidin-4-ona
Etapa A
Hidrocloruro del éster etílico del ácido 2-hidroxipropionimídico
Una solución de (RS)-lactonitrilo (378 g, 5,32 mol) en etil éter (1,46 l) y etanol (0,34 l) se saturó con cloruro de hidrógeno gas a 0ºC-5ºC durante 0,5 h y se mantuvo a 5ºC durante 60 h. Se separó por filtración el sólido y se lavó dos veces con etil éter, obteniéndose hidrocloruro del éster etílico del ácido 2-hidroxipropionimídico como un sólido (815 g, 99%); p.f. 165-168ºC. RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}, 300 MHz) \delta 1,38 (t, 3H), 4,49 (q, 1H), 6,56-7,11 (s anc, 1H).
Etapa B
Hidrocloruro de 2-hidroxi-propionamidina
Se saturó con amoniaco gas durante 1 h, manteniendo la temperatura interna por debajo de 5ºC, una suspensión de hidrocloruro del éster etílico del ácido 2-hidroxi-propionimídico (preparado de acuerdo con el método de la Preparación Uno, Etapa A, 751 g, 4,87 mol) en etanol (75 l) a 0ºC. Se agitó luego a temperatura ambiente durante 18 h. Se separó por filtración el sólido y se secó en vacío a 40ºC para obtener un sólido. El filtrado se concentró a la mitad de volumen y se recogió una segunda cosecha de sólido que se secó en vacío y se combinó con la primera cosecha, obteniéndose hidrocloruro de 2-hidroxi-propionamidina como un sólido amarillo (608 g, 99%); p.f. 134-138ºC. RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}, 300 MHz) \delta 1,33 (t, 3H), 4,42 (q, 1H), 6,25-6,88 (s anc, 1H), 8,72-9,25 (s anc, 3H).
Etapa C
2-etoxicarboniloetenolato
A una suspensión de hidruro sódico (dispersión al 60% en aceite) (269 g, 16,7 mol) el isopropil éter (12 l) se añadió lentamente acetato de etilo (1280 g, 14,2 mol) a la velocidad adecuada para mantener una temperatura interna de 45ºC. Se añadió luego a gotas formiato de etilo (2232 g, 30,13 mol) a 42ºC y se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. Se filtró la mezcla y se lavó con etil éter (2 x 300 ml) y con hexanos (500 ml) y se secó el sólido, obteniéndose 2-etoxi-carboniletenolato sódico como un sólido blanco (1930 g, 99%). RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}, 300 MHz) \delta 1,03 (t, 3H), 3,86 (q, 2H), 4,08 (d, 1H), 8,03 (d, 1H).
Etapa D
2-(1RS-hidroxi-etil)-3H-pirimidin-4-ona
A una solución de 2-etoxicarboniloetenolato sódico (preparado de acuerdo con el método de la Preparación Uno, Etapa C, 1301 g, 9,42 mol) en agua (1,3 l) se añadió una solución acuosa de hidrocloruro de 2-hidroxi-propionamida (preparada de acuerdo con el método de la Preparación Uno, Etapa B, 610 g, 4,9 mol) en agua (1,3 l) a temperatura ambiente y se agitó durante 48 h. Se ajustó con ácido acético el pH de la solución a 7,0 y luego se sometió a extracción continua con cloroformo durante 48 h. El extracto se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El filtrado se concentró para obtener un sólido que se puso en suspensión en etil éter, se filtró y se secó el residuo sólido, obteniéndose el compuesto del título de la Preparación Uno (232 g, 38%). p.f- 121-124ºC. RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}, 300 MHz) \delta 1,45 (d, 1H), 4,42 (q, 1H), 6,25-6,88 (s anc, 1H).
Preparación Dos
Acetato de 1-(R)-4-hidroxi-pirimidin-2-il-etilo
Se añadió (RS 2-hidroxietil)-4-hidroxipirimidina (preparada de acuerdo con el método de la Preparación Uno, Etapa D, 2,1 g, 15,07 mol) a dioxano (63 ml) que contenía acetato de vinilo (4,3 g, 50 mol) y la mezcla se calentó a 50ºC. A la solución resultante se añadió lipasa P30 (0,21 g) y se continuó calentando durante 24 horas. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se evaporó para obtener un residuo líquido espeso siruposo. El residuo se cromatografió sobre gel de sílice y se sometió a elusión rápida con una mezcla 95:5 de cloruro de metileno y metanol. Por evaporación del eluyente recogido se obtuvo el compuesto del título como un líquido incoloro (0,97 g, 92%); [\alpha]_{D} + 39,9º (c = 1, metanol). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,61 (d, 3H), 2,2 (s, 3H), 5,65 (q, 1H), 6,35 (d, J = 6 Hz, 1H), 7,97 (d, 1H), 11,94 (s, 1H).
\newpage
Preparación Tres
Butirato de 1-(S)-(4-piperazin-1-il-pirimidin-2-il)-etilo
A una solución enfriada con hielo de butirato de 1-(S)-(4-hidroxi-pirimidin-2-il)-etilo (0,42 g, 2,0 mmol) y trietilamina (0,20 g, 2,2 mmol) en cloruro de metileno (10 ml) se añadió a gotas cloruro de mesilo (0,25 g, 2,1 mmol) y se agitó durante 1,5 h. La mezcla se lavó sucesivamente con solución saturada de bicarbonato y agua y la fase orgánica se secó sobre sulfato magnésico anhidro. Se filtró y evaporó, obteniéndose 1-(S)-(4-metanosulfoniloxi-pirimidin-2-il)etilo como un aceite. El aceite se disolvió en tetrahidrofurano (10 ml) y a la solución se añadió piperazina (0,69 g, 8,0 mmol), y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Se filtró la mezcla y el filtrado se concentró en vacío para obtener un producto en bruto que se purificó por cromatografía rápida (9:1 de cloruro de metileno/metanol), obteniéndose el compuesto del título como un aceite (0,50 g, 90%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,95 (t, 3H), 1,51 (d, 3H), 1,68 (m, 2H), 2,66 (t, 2H), 2,83 (m, 4H), 3,63 (m, 4H), 5,54 (q, 1H), 6,38 (d, 1H), 8,24 (d, 1H). MS(Cl) 251 (MH^{+}).
Preparación Cuatro
2-(1R-hidroxi-etil)-3H-pirimidin-4-ona y 2-(1S-hidroxi-etil)-3H-pirimidin-4-ona
Se separó 2-(1RS-hidroxietil)-3H-pirimidin-4-ona (30 g) en sus enantiómeros individuales por HPLC preparativa. Se cargaron en una columna chiralpak AS (5 cm x 50 cm) inyecciones múltiples de 4 g y se eluyó con hexano/etanol (85:15) a un caudal de 75 ml/min. Se analizaron las fracciones usando una columna analítica AS de 25 cm eluyendo con heptano: etanol: dietilamina (85:15:0,05). Se juntaron las fracciones que eluían más rápidamente (7,2 min) y se evaporó la combinación, obteniéndose 2-(1S-hidroxi-etil-3H-pirimidin-4-ona como un aceite (9,9 g, recuperación de 66%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,51 (d, 3H), 5,54 (q, 1H), 6,38 (d, 1H), 8,24 (d, 1H). MS(Cl) 251 (MH^{+});
[\alpha]_{D} - 69,8 (c = 1,0, MeOH).
Se juntaron las fracciones que eluían más lentamente (9,1 min) y se evaporó la combinación, obteniéndose 2-(1R-hidroxi-etil-3H-pirimidin-4-ona como un aceite (12,4 g, recuperación de 80%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,51 (d, 3H), 5,54 (q, 1H), 6,38 (d, 1H), 8,24 (d, 1H). MS(Cl) 251 (MH^{+}) ; [\alpha]_{D} + 65,8 (c = 1,0, MeOH).
Ensayo cinético de microtitulación con placa de 96 pocillos para sorbitol-deshidrogenasa
Principio
Reacción 1
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ SDH\+\cr  D-sorbitol + NAD ^{+}  \+
<-----------> \+ D-fructosa +
H ^{+} \cr}
Reacción 2
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ diaforasa\+\cr  NaDH + INT (incoloro) \+ <-----------> \+
INTH (violeta) +
NAD ^{+} \cr}
Reactivos
Reactivo 1
Solución tampón de fosfato potásico 100 mM, pH 7,0. Se disuelven 6,8 g de KH_{2}PO_{4} (Fischer nº. P285-500) y 8,7 g de K_{2}HPO_{4} (Fischer nº. P288-500) en aprox. 990 ml de agua, se ajusta el pH a 7,0 con KOH 5 N y se añade agua a un volumen de 1000 ml.
Reactivo 2
Dinucleótido de \beta-nicotinamida adenina (NAD^{+}). Sigma nº. N-7129.
Reactivo 3
Diaforasa (EC 1.8.1.4 de Clostridium kluyveri) Sigma nº. D-5540.
Reactivo 4
Colorante violeta de yodotetrazolio (INT). Sigma nº. I-8377.
Se prepara una solución 10 mM disolviendo 253 mg de INT en un volumen final de 50 ml de agua destilada. Se requiere un calentamiento a aproximadamente 50ºC durante 30 min, mientras que se agita, para disolución completa.
Reactivo 5
Soluciones de SDH recombinante humana o de rata.
Pan Ver nº. R1820 o R1828, respectivamente, aproximadamente 0,5 mg/ml.
Solución de ensayo
Los compuestos se disuelven en DMSO al 20% (v/v) a una concentración 5 mM. Se realizan diluciones seriales con DMSO al 20% para obtener 10x concentraciones finales deseadas.
Reactivo de trabajo
Se añaden a 25 ml de tampón de fosfato 22,4 mg de NAD^{+}, 14,8 mg de diaforasa y 21 \mul de rSDH humana o 146 \mul de rSDH de rata. Después de mezclar en una mezcladora de rotación, se añaden 2,7 ml de solución de INT.
Procedimiento
Se añaden 25 \mul de DMSO o soluciones de ensayo a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Se añaden 200 \mul de reactivo de trabajo a cada pocillo y se deja incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para iniciar la reacción se añaden 25 \mul de D-sorbitol 20 mM. Se controla durante 10 minutos a temperatura ambiente la absorbancia a 495 nm. Se compara la velocidad de aumento de A_{495} para cada pocillo que contiene compuesto con la de los pocillos que contienen sólo DMSO. Se calcula la inhibición porcentual como:
% de inhibición = \frac{{A_{495} \ no \ inhibido \ - \ A_{495} \ inhibido}}{{A_{495} \ no \ inhibido}} x 100
Concentraciones finales
Fosfato potásico 90 mM, pH 7,0
NAD^{+} 1 mM
INT 1 mM
Sorbitol 2 mM
SDH 2 nM (r SDH humana) o 14 nM (rSDH de rata)
IC_{50}, nM (SDH humana)
27
Dimetilamida del ácido 4-[2-(1R-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico
28
Dimetilamida del ácido 4-[2-(1S-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico

Claims (4)

1. El uso de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I
29
o una de sus sales farmacéuticamente aceptable,
en la que R es N,N-dimetilamino o isopropilo, para la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de complicaciones diabéticas en un mamífero.
2. El uso de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I según se ha definido en la reivindicación 1, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, y un inhibidor de aldosa-reductasa (ARI), o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de complicaciones diabéticas en un mamífero.
3. El uso de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I según se ha definido en la reivindicación 1, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, y un inhibidor del intercambio iónico sodio hidrógeno (NHE-1), o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de complicaciones diabéticas en un mamífero.
4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la mencionada complicación diabética es neuropatía diabética, nefropatía diabética, retinopatía diabética, úlceras del pie o un trastorno cardiovascular.
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