ES2214624T3

ES2214624T3 - Procedimiento de activacion de proteina desnaturalizada.

Info

Publication number: ES2214624T3
Application number: ES97928173T
Authority: ES
Inventors: Adelbert Grossmann
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1996-06-11
Filing date: 1997-06-11
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2017-06-11
Also published as: WO1997047735A1; US6342585B1; TR199802584T2; JP3288720B2; EP0904355B1; BR9709569A; KR100305341B1; KR20000016588A; CA2257122A1; AU714318B2; JPH11511759A; DE59711375D1; ATE260972T1; AU3257197A; CA2257122C; BR9709569B1; EP0904355A1

Abstract

UN PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE DISULFUROS MEZCLADOS A PARTIR DE UNA PROTEINA Y UN COMPUESTO DE DISULFURO, CARACTERIZADO PORQUE LA PROTEINA ESTA EN UNA FORMA INACTIVA Y POCO SOLUBLE E INCUBADA CON UNA SOLUCION DE UN COMPUESTO DESNATURALIZANTE A UNA CONCENTRACION SUFICIENTE PARA DESNATURALIZARLA Y EN PRESENCIA DE UN COMPUESTO DE DISULFURO, DISUELTO Y CONVERTIDO EN UN DERIVADO; ESTE PROCEDIMIENTO ES APROPIADO PARA LA OBTENCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES RENATURALIZADAS A PARTIR DE PROCARIONTES CON UN ELEVADO RENDIMIENTO.

Description

Procedimiento de activación de proteína desnaturalizada.

La presente invención se refiere a un procedimiento simplificado de solubilización y naturalización de proteínas desnaturalizadas, en especial de proteínas desnaturalizadas obtenidas por métodos recombinantes.

Durante la obtención de proteínas en células procarióticas, p.ej. E. coli, se forman a menudo agregados proteínicos inactivos difícilmente solubles (cuerpos de inclusión). Para convertir estas proteínas en su forma activa es necesario solubilizarlas y naturalizarlas. Estos procedimientos son conocidos y se describen por ejemplo en los documentos EP-A-0 361 475, EP-A-0 114 506, EP-A- 0 093 619, EP-A-0 253 823, WO 87/02673, EP-A-0 364 926 y EP-A-0 241 022. Un factor crucial, que limita el rendimiento en proteína naturalizada durante la activación, es la reacción competidora entre la conversión de la proteína naturalizada en el producto intermedio correcto de plegamiento y la agregación de varias moléculas proteínicas. Por este motivo, la concentración de proteínas naturalizadas en la solución de naturalización es un parámetro esencial para el rendimiento del proceso de naturalización. A medida que aumenta la concentración de proteínas naturalizadas se favorece la agregación y disminuye el rendimiento relativo de proteína naturalizada con la conformación de proteína nativa (concentración crítica).

Para la fabricación industrial de proteínas recombinantes, la cantidad de proteína a naturalizar es por lo general mucho mayor que la concentración crítica. En el caso frecuente de poco solubilidad de las proteínas en el tampón utilizado para la activación surgen, por tanto, inconvenientes considerables, como son bajo rendimiento, mucha dedicación de tiempo y grandes volúmenes de tampón.

Por el documento WO 87/02673 se conoce un procedimiento en el que la proteína inactiva soluble se solubiliza con los agentes desnaturalizador y reductor, a continuación se separa el reductor y después de las proteínas solubilizadas se obtienen disulfuros heterólogos mixtos entre las proteínas y por ejemplo la glutationa. Estos disulfuros mixtos son ventajosos para la purificación y renaturalización posteriores, porque después de la modificación de los grupos tiol la proteína queda protegida de la oxidación del aire y, de este modo, es estable en un intervalo más amplio de valores de pH. El cambio de la carga neta facilita también la purificación, ya que con una cromatografía de intercambio iónico se pueden separar las proteínas no modificadas.

Para la formación de disulfuros mixtos se incuba la proteína solubilizada, dializada, reducida y liberada de reductores, con una solución que contiene un agente desnaturalizador y un componente disulfuro para la derivatización (p.ej. GSSG, cistina, cistamina). Una vez separado el componente disulfuro se realiza una naturalización por el método habitual. Este procedimiento es eficaz, pero exige la ejecución de un gran número de etapas individuales, en especial para separar el reductor antes de iniciar la derivatización.

Por el documento WO 93/19084 se conoce un procedimiento de plegamiento y purificación del factor de crecimiento I similar a la insulina. En él se disuelven los cuerpos de inclusión en condiciones reductoras, a continuación se añade un exceso de oxidante, sin separar el reductor. La naturalización se inicia con la dilución posterior (sin diálisis) y la nueva adición de reductor (para formar un sistema redox). En el documento WO 91/08762 se describe la obtención de un factor de crecimiento biológicamente activo, derivado de plaquetas. Para ello se realiza en primer lugar una solubilización a pH 3 sin reductor y después una purificación en condiciones desnaturalizadoras. Solo entonces se añade el oxidante para obtener un derivado. Según el documento EP-A-0 450 386 se obtiene un extracto de cuerpos de inclusión (proteína NGF disuelta en condiciones desnaturalizadoras) por adición de tampón solubilizador y posterior centrifugación. El extracto se trata seguidamente con el reductor, se incuba y sin diálisis previa se oxida por adición del oxidante. A continuación se efectúa la dilución y adición de otros componentes para la naturalización. Es decir, en este procedimiento se efectúa en primer lugar como etapa separada una solubilización, sin añadir sustancias activas en procesos redox. Ninguno de estos procedimientos es idóneo para una renaturalización por pulsos según la patente
US-4 933 434.

Se conocen otros procedimientos que permiten la derivatización durante la misma solubilización. Se conoce desde hace mucho tiempo el método de la sulfitolisis (ver p.ej. Bailey, J.L., Cole, R.D. en J. Biol. Chem. 234, 1733-1739, 1959; Cole, R.D. en Meth. Enzymol. 11, 206-208, 1967; EP-0 114 507). En él se tratan los puentes disulfuro de las proteínas con sales del ácido sulfuroso, con lo cual se forma un producto de reacción que es una mezcla en cada caso del 50% de grupos SH proteicos tiosulfonados (RS-SO_{3}^{-}) y libres (RS^{-}). Los grupos SH libres citados en último lugar se convierten de nuevo en disulfuros por reoxidación (p.ej. con iones cobre, yodosobenzoato o con preferencia con tetrationato), estos disulfuros en el curso de nuevos ciclos del proceso se convierten de forma prácticamente total en el tiosulfonato. Este proceso es relativamente sencillo y puede realizarse en condiciones suaves (p.ej. pH neutro). Como ya se explica en J. Biol. Chem. 234, 1733, el conveniente estriba en que el tiosulfonato formado es químicamente lábil, la finalización de la reacción no puede comprobarse y, sobre todo, en que el reoxidante provoca la destrucción parcial de los restos triptofano. Otro inconveniente consiste en que es muy difícil conseguir la separación completa de los productos secundarios provistos de grupos SH proteínicos y los oxidantes así como el yodosobenzoato citado del producto final y la detección analítica es muy laboriosa. Sin embargo, tal detección es imprescindible en el caso de las proteínas destinadas a fines terapéuticos, con el fin de poder descartar los posibles efectos secundarios de un fármaco que ha sufrido modificaciones químicas y, por lo tanto, distintas de las fisiológicas.

En el documento WO 95/30686 se describe también una sulfitolisis de este tipo para la naturalización de factores neurotróficos del grupo NGF-BDNF. Un procedimiento similar para la naturalización de proinsulina humana se describe por parte de R. Wetzel y col., en Gene 16, 63-71 (1981) y de W.F. Heath y col., en J. Biol. Chem. 267, 419-425 (1992).

Se conoce también un método similar que evita el uso de condiciones de reoxidación que puedan dañar las cadenas laterales (Thannhauser, T.W., Konishi, Y., Scheraga, H.A. en Analyt. Biochem. 138, 181-188, 1984; Thannhauser, T.W., Scheraga, H.A., en Biochemistry 24, 7681-7688, 1985): en este caso en lugar de una reoxidación se realiza la derivatización directa de la cisteína, obtenida por reducción de los puentes disulfuro, por reacción con el 2-nitro-5-(sulfotio)-benzoato; en ella se libera el 2-nitro-5-tiobenzoato que puede determinarse fotométricamente, permitiendo de este modo la cuantificación de los grupos SH reaccionados. El inconveniente de este método estriba en que se introduce una sustancia químicamente compleja que resulta muy laborioso separar del producto final y comprobar que se ha separado. Por otro lado, los autores (Biochemistry 24, 7681) han observado que el tiosulfonato obtenido solamente es estable en caso de ausencia total de grupos tiol. Por otro lado, en este caso se observa también una modificación de las cadenas laterales (desamidación de la asparagina).

El objetivo de la presente invención consiste en simplificar y mejorar estos procedimientos y obtener proteínas derivatizadas en los grupos SH que sean estables al almacenaje y que puedan naturalizarse con gran rendimiento.

Se ha encontrado, de modo sorprendente, que según el procedimiento de la invención pueden realizarse en una sola etapa la solubilización y la derivatización, sin necesidad de realizar la reducción previa. Es sorprendente en especial que la derivatización pueda llevarse a cabo también en condiciones ácidas (pH inferior a 7,0, con preferencia pH entre 3 y 6,5), sobre todo para las neurotrofinas, como el NGF, y ello sin incidencia importante en la cinética y en la realización completa, si se compara con una reacción con componentes tiol en el intervalo habitual de pH, por ejemplo entre 7 y 10. Por lo general se suponía que tales reacciones solamente eran viables en presencia del anión tiolato libre; debido a que los aniones tiolato, en una concentración eficaz, tienen un pH alto, situado en torno a 9, lo dicho no se cumple hasta que el pH es igual o superior a 7.

Es, pues, objeto de la presente invención un procedimiento para la obtención de disulfuros mixtos a partir de una proteína y un componente disulfuro, que está caracterizado porque la proteína en forma inactiva y difícilmente soluble (cuerpos de inclusión) se incuba, se disuelve y se derivatiza con una solución de una agente desnaturalizador en un concentración desnaturalizadora y en presencia de un componente disulfuro (la proporción molar entre proteína y componente disulfuro es de 1:1 a 1:10000, con preferencia hasta 1:1000) y después se elimina eventualmente el componente disulfuro. La eliminación del componente disulfuro puede realizarse de modo conveniente cuando después se realice una naturalización por pulsos, descrita por ejemplo en la patente US-4 933 434. La proteína derivatizada de la presente invención es estable y puede almacenarse antes de los procesos ulteriores. Esto es particularmente ventajoso porque, en aplicación del procedimiento de la presente invención, la obtención de la proteína derivatizada puede tener lugar con independencia de la naturalización. De este modo se dispone de la proteína derivatizada en forma de producto intermedio aislado, que puede someterse a un gran número de procedimientos y/o partidas de naturalización y de purificación.

Como alternativa, la incubación para la derivatización de la proteína se realiza en presencia de un reductor (p.ej. DTT, DTE, GSH, cisteína, cistamina, sales del ácido sulfuroso). Con ello puede mejorarse el rendimiento de la derivatización. La concentración del reductor se elige de modo conveniente de forma que se no se restrinja o se restrinja poco la eficacia del componente disulfuro; han dado buenos resultados las concentraciones de reductor situadas como máximo en el 20% molar, con preferencia como máximo en el 10% molar de la concentración del componente disulfuro.

Para proteger los grupos SH libres se pueden añadir con preferencia otros reactivos que puedan impedir total o parcialmente el bloqueo o la destrucción de estos grupos SH por parte de metales pesados, radicales o especies activas de oxígeno. A este grupo de reactivos protectores pertenecen por ejemplo el EDTA en una concentración de 0,1 a
100 mmoles/l o la manita en una concentración de 1 a 1000 mmoles/l.

Se entienden por componentes disulfuro las sustancias del grupo de los disulfuros, p.ej. GSSG, cistamina o cistina. Los componentes disulfuro son capaces de derivatizarse en grupos SH después de la rotura de un puente disulfuro de las proteínas. El componente disulfuro se utiliza con preferencia en una concentración por lo menos de 1 mmol/l o mayor, con preferencia de 1 - 1000 mmoles/l, con preferencia especial de 10 a 200 mmoles/l.

Como agente desnaturalizador se emplea de modo conveniente un desnaturalizador empleado habitualmente para la solubilización de proteína desnaturalizada en condiciones oxidantes. Se utilizan con preferencia el clorhidrato de guanidinio u otras sales de guanidinio, p.ej. el sulfato, el fosfato o el tiocianato, así como urea o sus derivados. Pueden utilizarse también mezclas de estos desnaturalizadores.

La concentración del desnaturalizador dependerá del tipo del desnaturalizador y el experto en la materia la podrá determinar sin más. La concentración del desnaturalizador será suficiente cuando se puede lograr la solubilización completa de la proteína desnaturalizada difícilmente soluble. Para el clorhidrato de guanidinio, estas concentraciones se sitúan habitualmente entre 3 y 8 moles/l, con preferencia entre 6 y 8 moles/l. Para la urea, las concentraciones se sitúan normalmente entre 6 y 10 moles/l.

Se entiende por "proteína en una forma inactiva difícilmente soluble" aquella proteína que se forma en procariotas después de la obtención recombinante. Tales proteínas se forman habitualmente cuando tiene lugar una sobreexpresión de proteínas eucarióticas en procariotas y la proteína no se expulsa en forma activa al periplasma o al líquido sobrenadante celular. De este modo, la proteína obtenida por método recombinante permanece en forma insoluble o agregada en el citoplasma o periplasma. Tales agregados, su aislamiento y su purificación se describen por ejemplo en Marston F.A.O., Biochem. J. 214, 1-12, 1986. Para obtener cuerpos de inclusión se disgregan las células procariotas después de la fermentación.

La disgregación celular puede efectuarse por los métodos habituales, p.ej. por ultrasonidos, dispersión de alta presión o lisozima. La disgregación se realiza con preferencia en una solución tampón idónea para ajustar el pH a un valor entre neutro y ligeramente ácido, que actúa como medio de suspensión, p.ej. 0,1 moles/l de Tris-HCl. Después de la disgregación celular se separan los componentes insolubles (cuerpos de inclusión) por cualquier método, con preferencia por centrifugación o por filtración después del lavado con agentes que no interfieran con las proteínas, pero a ser posible disuelvan las proteínas celulares, p.ej. agua o tampón fosfato, añadiendo eventualmente detergentes suaves, p.ej. Brij®. A continuación se somete el precipitado (perdigón o pellet) al procedimiento de solubilización y derivatización de la presente invención.

El procedimiento de la invención se lleva a cabo en un intervalo neutro o alcalino del pH, con preferencia a un pH entre 6 y 10, con preferencia especial a un pH entre 7 y 8. Son idóneas como solubles tampón todos los tampones habituales; la adición de tampones no es necesaria en el caso de usar el clorhidrato de guanidinio como desnaturalizador, porque este tiene efecto tampón. Se utilizan con preferencia tampones ya conocidos del experto en la materia, p.ej. Tris o fosfato. De modo sorprendente, el procedimiento de la invención puede llevarse a cabo con ventaja especial en el caso de las neurotrofinas incluso en condiciones ácidas (pH 3-6,5).

El procedimiento de la invención se lleva a cabo con adición de un componente disulfuro. Los componentes disulfuro preferidos son p.ej. GSSG, cistamina y cistina. Dado que la reacción de derivatización constituye una reacción de equilibrio entre por un lado la proteína en la forma tiol y el componente disulfuro o entre el disulfuro mixto de la proteína y del componente disulfuro y por otro lado los componentes tiol, es decir los grupos proteína-tiol restantes, así como los componentes tiol liberados de los componentes disulfuro por reacción con la proteína en forma tiol, la reacción de derivatización deseada tendrá que forzarse con un gran exceso del componente disulfuro. Las condiciones requeridas para ello son muy diferentes de una proteína a otra. Se trabaja con preferencia en un intervalo de concentraciones del componente disulfuro de 10 mmoles/l hasta el límite de saturación (para el GSSG p.ej. en función del pH de la partida: de 200 a 300 mmoles/l; para la cistamina: aprox. 700 mmoles/l), el intervalo de concentraciones se situará con preferencia especial entre el 50 y el 100% de la concentración de saturación del componente disulfuro.

En el procedimiento de la invención es preferida además la adición de un reductor. Son preferidos en especial los reductores del grupo de los mercaptanos, por ejemplo la glutationa reducida (GSH) o el 2-mercaptoetanol, la ditioeritrita (DTE) o la ditiotreita (DTT), en una concentración de 0,01 a 50 mmoles/l, con preferencia de 0,1 a 10 mmoles/l. Son también preferidos los reductores tales como p.ej. las sales del ácido sulfuroso, p.ej. el sulfito sódico. La adición de uno de estos reductores no es un requisito imprescindible para que tenga éxito la ejecución de la reacción, pero en función de la proteína tratada esta adición puede traducirse en un mejor rendimiento en la activación de la proteína.

El procedimiento de la invención se lleva a cabo de modo conveniente a temperatura ambiente, durante un período de 0,1 a 100 horas, con preferencia de 1 a 24 horas, con preferencia especial de 2 a 4 horas. Otras condiciones, p.ej. el calentamiento hasta 60ºC o la ejecución de un enfriamiento hasta 0ºC, pueden ser también apropiadas. Para evitar la oxidación del reductor por acción del oxígeno del aire y para proteger los grupos SH libres es conveniente añadir EDTA con preferencia en una cantidad de 1 a 100 mmoles/l, con preferencia especial de 10 mmoles/l. Igualmente conveniente para reprimir las reacciones secundarias por radicales, que pueden transcurrir por ejemplo en soluciones que contienen tioles sobre todo en valores altos del pH, es ventajoso añadir capturadores de radicales ("extintores"), p.ej. manita, en una concentración de 1 a 1000 mmoles/l, con preferencia en una concentración de 20 a 200 mmoles/l, con preferencia especial en una concentración de 50 mmoles/l, durante la naturalización y/o purificación de las proteínas.

Después de la solubilización/derivatización se dializa con preferencia frente a una solución que contenga un desnaturalizador en una concentración desnaturalizadora, para eliminar el componente disulfuro y el reductor eventualmente utilizado. La solución, frente a la cual se dializa, contiene de modo conveniente el desnaturalizador en la misma concentración que la solución de desnaturalización/derivatización. Es también preferido dializar frente a otros agentes desnaturalizadores de igual concentración molar, contra 1 mmol/l de HCl o de ácido acético diluido. Se constatado además que es conveniente no separar por completo los componentes disulfuro; tal como se ha indicado antes, la reacción de derivatización es una reacción de equilibrio entre los componentes tiol libres y los componentes disulfuro (eventualmente mixtos). Si no se realiza la derivatización completa de todos los grupos tiol de las proteínas, se corre el peligro después de la separación del componente disulfuro de que el componente tiol libre restante tenga un efecto reductor en los disulfuros mixtos presentes y por ello pueda darse un retroceso posterior del rendimiento en derivatización durante el almacenaje de la proteína derivatizada. Con vistas a la protección perseguida con la derivatización de los grupos tiol de las proteínas contra la oxidación y otras reacciones secundarias destructivas, el grado de derivatización de la proteína tratada tendrá que ser por lo tanto lo más alto posible y tendrá que ser estable. Esto puede lograrse interrumpiendo la diálisis en estado prematuro, antes de que la concentración del componente disulfuro se sitúe por debajo de la concentración idónea, o bien dializando frente a un tampón de diálisis que contenga el componente disulfuro precisamente en la concentración requerida. La concentración requerida para mantener el grado de derivatización durante el almacenaje de la proteína derivatizada dependerá de la proteína tratada en cuestión y en especial del contenido en cisteína de la proteína tratada y puede situarse en un intervalo de concentraciones de 0 a 100 mmoles/l. Para el uso ulterior de la proteína derivatizada en la reacción de reactivación habrá que tener en cuenta que con la introducción del componente disulfuro en el proceso de reactivación no se influya o por lo menos no se influya de modo importante en las condiciones aplicadas para la deseada unión oxidante de los puentes disulfuro inter- o intramoleculares. Por este motivo se considera favorable una concentración residual de componente disulfuro de 1 a 10 mmoles/l en la proteína derivatizada.

Otro objeto de la invención es un procedimiento de obtención de una proteína naturalizada a partir de su forma inactiva, difícilmente soluble, que puede obtenerse por un método recombinante en procariotas, caracterizado porque la proteína en su forma inactiva difícilmente soluble se incuba, disuelve y derivatiza en una solución de un agente desnaturalizador en una concentración desnaturalizadora y en presencia de un componente disulfuro (la proporción molar entre proteína y componente disulfuro se sitúa entre 1:1 y 1:10000, con preferencia hasta 1:1000) y la proteína disuelta adopta una configuración biológicamente activa por conversión de la solución intensamente desnaturalizadora en una solución no desnaturalizadora o débilmente desnaturalizadora, para ello por adición de un sistema redox se rompen los enlaces disulfuro con el componente disulfuro y pueden volver a formarse en la proteína a nivel intramolecular de modo que la proteína adopte una conformación, en la que posee su actividad biológica característica.

Estas condiciones desnaturalizadoras débiles pueden ajustarse por ejemplo por dilución o diálisis, con preferencia en presencia de un reductor. A diferencia de las condiciones intensamente desnaturalizadoras, las condiciones desnaturalizadoras débiles son aquellas en las que la proteína es capaz de adoptar su conformación activa y permanecer estable en esta conformación. En condiciones intensamente desnaturalizadoras, la proteína es inestable en esta forma y tiende a desnaturalizarse, es decir a perder su estructura tridimensional estable y su enlace disulfuro más favorable en el sentido energético. Se dan las condiciones intensamente desnaturalizadoras por ejemplo en soluciones de 4-9 moles/l de clorhidrato de guanidina. Se dan las condiciones débilmente desnaturalizadores por ejemplo entre 0,1 y 2 moles/l de clorhidrato de guanidina. Para la naturalización se utiliza de modo conveniente la arginina también en concentraciones de 0,1 a 1 mol/l.

Se entiende por actividad de la proteína una actividad biológica de la misma. En el supuesto de ser una proteína de origen natural o un derivado de una proteína natural, la actividad biológica de la proteína podrá determinarse mediante sus propiedades inmunológicas, de biología celular o catalíticas.

Para la activación (naturalización) es preferido trabajar en una concentración de GSH de 0,1 a 20 mmoles/l, una concentración de GSSG de 0,01 a 10 mmoles/l sin agente desnaturalizador o bien en una concentración no desnaturalizadora del agente desnaturalizador y llevar a cabo la reactivación en un período de tiempo de 1 a 300 horas. La concentración de GSH se sitúa con preferencia especial entre 0,5 y 10 mmoles/l y/o la concentración de GSSG se situará entre 0,1 y 10 mmoles/l.

El procedimiento de la invención es idóneo para la naturalización de un gran número de proteínas desnaturalizadas, en especial las proteínas desnaturalizadas obtenidas por métodos recombinantes. Tales proteínas son por ejemplo las proteasas, los factores de crecimiento, las proteíno-hormonas, las citocinas, los activadores de plasminógeno, el factor Xa y en especial las neurotrofinas. Las neurotrofinas son proteínas que se localizan sobre todo en las células nerviosas y favorecen la diferenciación y la supervivencia de las células nerviosas. Las neurotrofinas (p.ej. el NGF, el "brain derived nerve growth factor" (BDNF), las neurotrofinas 3, 4/5, 6) son, por lo tanto, agentes terapéuticos celulares valiosos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo las polineuropatías, la enfermedad de Alzheimer o las lesiones cerebrales o de la médula espinal.

El factor de crecimiento nervioso (NGF) humano es una proteína que consta de dos subunidades (homodímero). La capacidad de operar el crecimiento de las neuronas sensoras y las neuronas simpáticas se atribuye a la unidad \beta. El NGF maduro consta de 118 aminoácidos, contiene tres puentes disulfuro y no esta glicolizado. El NGF biológicamente activo está en forma de dímero. El DNA y la secuencia de aminoácidos del NGF se describe en el documento
EP-B-0 121 338 (patente US-5 169 762). Sin embargo, la proteína activa no se ha podido obtener según este documento. La obtención del NGF recombinante activo se describe por ejemplo en los documentos EP-A-0 329 175,
EP-A-0 370 171, en Biochem. Biophys. Res. Commun. 171, 116-122 (1990); EP-A-0 414 151; Gene 70, 57-65 (1988); EP-A-0 450 386 y Gene 85, 109-114 (1989).

El "brain derived neurotrophic factor " (BDNF) se ha descrito por Leibrock y col. en Nature 341, 149-152 (1989). El BDNF favorece la supervivencia de las neuronas sensoras del sistema nervioso central y parece tener éxito en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. El BDNF recombinante puede obtenerse por ejemplo según lo descrito en el documento WO 91/03568 en células CHO y según WO 92/22665 en procariotas.

Los siguientes ejemplos, publicaciones y protocolo de secuencia ilustran la invención con mayor detalle, cuyo alcance se define en las reivindicaciones. Los procedimientos descritos se deberán considerar como ejemplos, que incluso después de sufrir modificaciones describen el objeto de la invención.

Ejemplo 1 Expresión de NGF en E. coli a) Plásmido de expresión

Sobre la base de la secuencia publicada por Ullrich y col. (Nature 303, 821, 1983) e introduciendo algunas modificaciones, en especial en la porción situada en 5', se obtuvo por vía sintética el gen NGF (SEQ ID NO: 4), que codifica la parte madura. Para ello se aplicó el método de Beattie y Fowle (Nature 352, 548-549, 1991). Para facilitar la clonación se añadió al extremo 5' un sitio de corte para la enzima de restricción EcoRI y al extremo 3' un sitio de corte para la enzima de restricción HindIII. El ácido nucleico sintetizado se restringió con las enzimas EcoRI y HindIII y se ligó con el vector de expresión pA27fd (descrito en el documento EP-A-0 382 174), digerido previamente con EcoRI y parcialmente con HindIII. El añadido de ligación se transformó junto con el plásmido auxiliar pUBS520 en E. coli (Brinkmann y col., Gene 85, 109-114, 1989).

La selección de los clones se realizó a través de la resistencia a la ampicilina y a la canamicina conferida por los plásmidos. El plásmido obtenido pNGF23fd contiene un fragmento EcoRI/HindIII, de un tamaño de 400 bp, que es menor que el plásmido pA27fd de partida.

b) Expresión en E. coli

Para comprobar la capacidad de expresión se cultivó una cepa de E. coli transformada con los plásmidos pNGF23fd y pUBS520 en el medio LB (Sambrook y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 1989) en presencia de ampicilina y canamicina (en cada caso en una concentración final de 50 \mug/ml) hasta una densidad óptica (OD) de 550 nm. Se inició la expresión por adición de 5 mM de IPTG. El cultivo se incubó durante 4 horas más. A continuación se recogieron las E. coli por centrifugación y se resuspendieron en un tampón (50 mM Tris-HCl de pH 8,50; 50 mM EDTA); por tratamiento con ultrasonidos se provocó la lisis de las E. coli. Con otra centrifugación se recogieron las fracciones insolubles de proteína y se volvieron a suspender en el tampón recién mencionados por tratamiento con ultrasonidos. Se añadió a la suspensión 1/4 de volumen de tampón de extensión (250 mM Tris-HCl, pH 6,8; 0,01 mEDTA, 5% SDS, 5% mercaptoetanol, 50% glicerina y 0,005% azul de bromofenol) y se analizó con SDS al 12,5% en gel de poliacrilamida. Como control se realizó la misma preparación con un cultivo de E. coli (pNGF23fd, pUBS520) al que no se añadió el IPTG y se extendió sobre el gel de poliacrilamida. En la preparación del cultivo inducido con IPTG y después de colorear el gel con un 0,2% de Coomassie-Blue R250 (disuelto en un 30% de metanol y un 10% de ácido acético) se puede observar una banda clara con un peso molecular (comparada con la mezcla de proteínas estándar de Biorad "H+L") de unos 14 kD. Esta banda no aparece en la preparación de las células de E. coli no inducidas.

Ejemplo 2 Preparación de cuerpos de inclusión (inclusion bodies, IB)

Para la preparación de IB que contengan NGF recomb. se fermentó la cepa de expresión de E. coli descrita en el ejemplo 1 en un fermentador de 10 l durante 8 horas. La inducción de la expresión del NGF se llevó a cabo por adición de IPTG en la fase de crecimiento logarítmico aprox. 4 horas después del inicio de la fermentación.

Se recolectaron por centrifugación 690 g de biomasa después de 8 horas de fermentación. Se suspendió la biomasa en 3,5 l de Tris-HCl 0,1 mol/l, pH 7, y después de añadir 0,7 g de lisozima, 7 mg de DNasa y 0,4 mmol/l de MgSO_{4} se incubó a 0ºC durante 20 min. A continuación se realizó la disgregación celular total por dispersión de alta presión a 1000 bar. A la solución de disgregación se le añadieron de nuevo la DNasa hasta 0,1 mg/ml y el MgSO_{2} hasta 2 mmol/l y se incubó la solución a 20ºC durante 30 minutos. Después del tratamiento con la DNasa se diluyó la solución con un volumen mitad de un 6% de Brij 35, 1,5 moles/l de NaCl, 60 mmoles/l de EDTA, pH 7,0, y se incubó en un baño de hielo durante 20 minutos. Seguidamente se separaron por centrifugación los componentes insolubles (IB). Se suspendió el precipitado en un volumen 3 veces mayor de 0,1 mol/l de Tris-HCl, 20 mmoles/l de EDTA, pH 6,5 (tampón TE). Después de una incubación de 30 minutos a 20ºC se recolectaron los IB por nueva centrifugación. La siguiente resuspensión del precipitado se realizó en un volumen 3 veces mayor de tampón TE. Después de una incubación de 30 minutos a 20ºC se obtuvieron los IB por nueva centrifugación del precipitado.

Para determinar la porción de rh-NGF en los IB se completaron 500 mg de IB (peso húmedo) con una solución de 7,5 moles/l de guanidio-HCl (GdmHCl) y 10 mmoles/l de EDTA, pH 6,0, hasta 10 ml y se suspendieron durante 2 horas. Se determinó el contenido de proteína de la solución mediante la determinación del biuret (Boehringer Mannheim, artículo nº 124281). La porción de rh-NGF dentro de las proteínas totales en los IB disueltos se determinó después de separar las proteínas desnaturalizadas con SDS y las proteínas reducidas con DTE mediante electroforesis capilar de SDS por comparación de la superficie de los picos con el NGF patrón (p.ej. Boehringer Mannheim, artículo nº 1457616) o por separación de las proteínas mediante electroforesis a través de gel SDS por determinación densitométrica de las cintas de las muestras. Los IB aislados a partir de 10 l de caldo de fermentación contenían unos 6 g de rh-NGF.

Ejemplo 3 Solubilización y derivatización de los rh-NGF a) Obtención de solubilizado

Se suspenden los cuerpos de inclusión (IB) en una solución de 7,5 moles/l de GdmHCl, 0,1 mol/l de Tris-HCl, 10 mmoles/l de EDTA y 0,1 mol/l de DTT, pH 8,5, hasta una concentración de 20 a 200 g de IB/l y se agita a 20-25ºC durante 2 horas. A continuación se ajusta el pH a 3 añadiendo una solución de HCl del 25% y se enfría a 4ºC. Se diafiltra el solubilizado así obtenido a 4ºC en una máquina de filtración Crossflow a través de una membrana de ultrafiltración con límite de exclusión de 10 kDa frente a 6-10 volúmenes de 7,5 moles/l de GdmHCl, 10 mmoles/l de EDTA, pH 3, o bien se dializa en el tubo flexible de diálisis varias veces frente al mismo tampón.

b) Obtención de derivado del solubilizado (estado de la técnica)

Al solubilizado dializado, libre de DTT, obtenido en el ejemplo 3a, se le añaden 20 mmoles/l de GSSG y se ajusta a pH 7,5 por valoración con una solución de 1 mol/l de Tris. Se incuba la mezcla resultante a 20-25ºC durante 2 horas y después se ajusta el pH a 6 por adición de HCl del 25% y se enfría a 4ºC. Se diafiltra el derivado así obtenido a 4ºC en una máquina de filtración Crossflow a través de una membrana de ultrafiltración con límite de exclusión de 10 kDa frente a 6-10 volúmenes de GdmHCl 7,5 M, 10 mmoles/l de EDTA, pH 6, o bien se dializa en el tubo flexible de diálisis varias veces frente al mismo tampón.

c) Obtención del derivado directamente a partir de los IB (procedimiento de la presente invención)

Se suspenden los IB en una solución de 7,5 moles/l de GdmHCl, 0,1 mol/l de Tris, 10-200 mmoles/l de GSSG, 10 mmoles/l de EDTA, pH 6, hasta una concentración de 20 a 200 g de IB/l y se agita a 20-25ºC durante 3 horas. Se diafiltra el derivado así obtenido a 4ºC en una máquina de filtración Crossflow a través de una membrana de ultrafiltración con límite de exclusión de 10 kDa frente a 6-10 volúmenes de 7,5 moles/l de GdmHCl, 10 mmoles/l de EDTA, pH 6, o bien se dializa en el tubo flexible de diálisis varias veces frente al mismo tampón.

La derivatización directa de los IB se realiza de igual manera en un valor de pH de 3 a 10 para la derivatización y pH 6 para la diafiltración, el valor del pH se ajusta a 6 antes de la diálisis añadiendo NaOH o bien HCl. Para valores de pH inferiores a 6 se aumenta la concentración de GSSG hasta 300 mmoles/l. El GSSG eventualmente sin disolver se elimina por centrifugación antes de iniciar la derivatización.

La comprobación (detección) de la derivatización realizada se realiza mediante electroforesis a través de gel SDS y por espectroscopía de masas (MALDI-EM). Se observa que, con independencia del pH existente durante la derivatización, el grado de derivatización del ejemplo 3c se sitúa en valores claramente superiores a los de la derivatización efectuada con arreglo al estado de la técnica (ejemplo 3b).

Se estudia el comportamiento de naturalización del derivado y del solubilizado con material fresco y con material almacenado a 4ºC (ver detalles en ejemplo 4). Los derivados obtenidos según 3c, con independencia del pH de la obtención, presentan un comportamiento de naturalización invariable al cabo de 4 semanas (rendimiento: aprox. 100% del valor inicial), mientras que el rendimiento de la naturalización del solubilizado (3a) se reduce al 60% y del derivado (3b) obtenido según el estado de la técnica, al 80%. Esto guarda buena relación con los datos MALDI-EM, es decir, la estabilidad del derivado es independiente del grado de derivatización, como era de esperar.

Ejemplo 4 Naturalización del rh-NGF

Para la obtención del rh-NGF biológicamente activo a partir de los solubilizados/derivados obtenidos en el ejemplo 3 se diluyen a 4ºC las soluciones que contienen los rh-NGF en forma inactiva, soluble, de 20 a 500 veces en el tampón de naturalización, que se compone de 1 mol/l de Tris-HCl, 0,5 mol/l de arginina, 1 mmol/l de EDTA, 1 mmol/l de GSH, pH 9,1.

Para detectar los rh-NGF naturalizados se cuantifican las mezclas después de un período de incubación de 24 h mediante cromatografía en fase inversa en una columna POROS R1/H (2,1 x 100 mm, Perseptive Biosystems, Friburgo, Alemania). Como tampón inicial se utiliza un 5% de acetonitrilo en H_{2}O (0,1% de TFA), la elución se realiza con un gradiente de hasta el 80% de acetonitrilo en H_{2}O (0,1% de TFA) durante 20 min y un caudal de
1 ml/min. Se identifica el NGF nativo evaluando las fracciones de líquido eluido en un bioensayo (ver más abajo).

Para determinar las concentraciones de rh-NGF naturalizado, biológicamente activo, de las fracciones de HPLC o directamente de las soluciones de naturalización se emplea la estimulabilidad provocada por el rh-NGF en las neuronas sensoras de ganglios de la raíz dorsal disociada de embriones de pollo (día embrionario: 8) para impulsar la formación de dendritas (= ensayo DRG = dorsal root ganglion assay, Levi-Montalcini, R., Meyer, H. y Hamburger, H, Cancer Res. 14, 49-57, 1954; Varón, S., Nomura, J., Pérez-Polo, J.R. y Shooter, E.M., Meth. in Neurochemistry 3, 203-229, 1972; EP-A-0 335 673, pp. 14-15, ejemplo C).

Se ensayan las fracciones HPLC en una serie de diluciones en concentraciones de c = 100 ng/ml hasta c = 100 pg/ml en etapa de dilución 1:2 en placas de 48 hoyos. Para ello, en placas de cultivo celular de la empresa Falcon se mezclan 300 \mul de medio (medio F14; Coon, M.G. y Wei\beta, M.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 852-859, 1969) y 100 \mul de la suspensión celular más 100 \mul de las diluciones recién indicadas (= concentraciones finales de c = 20 ng/ml hasta c = 20 pg/ml) y se incuban a 37ºC con un 3,5% de CO_{2} durante 48 horas. Como indicativo de la actividad biológica se cuantifica el número de células con dendritas formadas. Como referencia se utiliza una solución de concentración conocida de 2,5 S de NGF de las glándulas submaxilares de ratón (empresa Boehringer Mannheim). De modo similar se investigan las mezclas de naturalización después de centrifugarlas y event. prediluirlas con medio F14.

Ejemplo 5 Clonación de los dominios catalíticos del gen de proteasa FX

(Plásmido: pFX-CD)

Métodos

Técnica de DNA recombinante

Para la manipulación del DNA se emplean métodos estándar, p.ej. los descritos por Sambrook, J. y col. en: Molecular cloning: A laboratory manual, editorial Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989. Los reactivos de biología molecular empleados se utilizan siguiendo las instrucciones del fabricante.

Determinación de las proteínas

Se halla la concentración de proteínas de la variante de proteasa rFX-EGF2-AP-CD por determinación de la densidad óptica (OD) a 280 nm empleando el coeficiente de extinción molar calculado a partir de la secuencia de aminoácidos (\varepsilon = 43490 cm^{2}/mol).

Vector de expresión

El vector para la expresión de las variantes de proteasa de coagulación de la sangre se basa en el vector de expresión pSAM-CORE de "core-estreptavidina". Los detalles de obtención y la descripción del plásmido pSAM-CORE se encontrarán en el documento WO 93/09144 de Kopetzki, E. y col.

El gen "core-estreptavidina" se sustituye por el gen deseado de variante de proteasa en el vector pSAM-CORE.

Clonación

Se amplifica el FX cDNA de la posición Bp 649-1362, que codifica a los dominios de proteasa FX de la posición de aminoácidos 217-454 (la numeración de la secuencia del cDNA y de la secuencia de aminoácidos se da con arreglo a la publicación de Kaul, R.K. y col., en Gene 41, 311-314, 1986) en una "reacción en cadena de polimerasa" (PCR) según el método de Mullis, K.B. y Faloona, F.A. (Methods Enzymol. 155, 350-355, 1987), empleando los cebadores N1 de PCR (SEQ ID NO: 1) y N2 (SEQ ID NO: 2)

EcoRI BspHI

N1: 5'-AAAAAAGAATTCTCATGATCGTGGGAGGCCAGGAATGCAAG-3'

HindIII

N2: 5'-AAAAAAAAGCTTCATTACTTGGCCTTGGGCAAGCCCCTGGT-3'

y un banco de genes cDNA de hígado humano, producto comercial (vector: Lamba ZAP® II) de la empresa Stragagene (La Jolla, CA., EE.UU.) como DNA molde. Mediante los cebadores PCR se introduce en el extremo 5' de la región codificadora un sitio de corte singular BspHI y un codón de inicio ATG y en el extremo 3' de la región codificadora un sitio de corte singular HindIII.

El producto de la PCR tiene una longitud de 740 pares de bases (Bp) y se digiere con las endonucleasas de restricción BspHI e HindIII y el fragmento BspHI/HindIII-FX, que tiene una longitud de 725 Bp, se purifica por electroforesis a través de gel de agarosa y se liga al fragmento del vector NcI/HindIII-pSAM-CORE, que tiene una longitud de 2,55 kBp. El plásmido deseado pFX-CD se identifica por mapeado de restricción y se comprueba la secuencia FX cDNA, aislada por PCR, mediante secuenciación de DNA.

Ejemplo 6 Clonación del gen de proteasa FX con dominios EGF2, péptido de activación y dominios catalíticos (plásmido: pFX-EGF2-AP-CD)

Se amplifica el FX cDNA de la posición Bp 322-1362, que codifica a los dominios de proteasa FX de la posición de aminoácidos 108-454 mediante una PCR empleando los cebadores N3 de PCR (SEQ ID NO: 3) y N2 (SEQ ID NO: 2)

EcoRI

N3: 5'-AAAAAAGAATCCATTAAAGAGGAGAAATTAAAATGCGGAAGCTCTGCAGCCTGGACAAC-3'

y un banco de genes cDNA de hígado humano, producto comercial (vector: Lamba ZAP® II) de la empresa Stragagene (La Jolla, CA., EE.UU.) como DNA molde. Mediante los cebadores PCR se introduce en el extremo 5' de la región codificadora un codón de inicio ATG y un sitio de corte singular EcoRI y en el extremo 3' de la región codificadora un sitio de corte singular HindIII.

El producto de la PCR tiene una longitud de 1,09 kBp y se digiere con las endonucleasas de restricción EcoRI y BstEII y el fragmento EcoRI/BstEII-FX, que tiene una longitud de 1,02 kBp, se purifica por electroforesis a través de gel de agarosa y se liga al fragmento del vector EcoRI/BstEII-pFX-CD, que tiene una longitud de 2,58 kBp (ejemplo 5). El plásmido deseado pFX-EGF2-AP-CD se identifica por mapeado de restricción y se comprueba la secuencia FX cDNA, aislada por PCR, mediante secuenciación de DNA.

Ejemplo 7 a) Expresión gel gen de proteasa en E. coli

Para la expresión del gen de proteasa FX-EGF2-AP-CD se transforma una cepa K12 de E. coli (p.ej. UT5600, Grodberg, J. y Dunn, J.J., en J. Bacteriol. 170, 1245-1253, 1988) con el plásmido de expresión pFX-EGF2-AP-CD (resistencia a la ampicilina) descrito en el ejemplo 6 y el plásmido represor lacl^{q}, el pUBS520 (resistencia a la canamicina, obtención y descripción: Brinkmann, U. y col., Gene 85, 109-114, 1989).

Se cultivan a 37ºC las células transformadas UT5600/ pUBS520/pFX-EGF2-AP-CD en un cultivo agitado en medio DYT (1% (p/v) de extracto de levadura, 1% (p/v) de Bacto Tryptone, Difco, y 0,5% de NaCl) con 50-100 mg/l de ampicilina y 50 mg/l de canamicina hasta alcanzar una densidad óptica a 550 nm (OD_{550}) de 0,6-0,9 y después se inducen con IPTG (concentración final: 1-5 mmoles/l). Después de la fase de inducción de 4-8 horas a 37ºC se recolectan las células por centrifugación (centrífuga Sorvall RC-5B, rotor GS3, 6000 rpm, 15 min), se lavan con 50 mmoles/l de tampón Tris-HCl, pH 7,2, y se almacenan a -20ºC hasta el momento de su procesado ulterior. El rendimiento celular de 1 litro de cultivo agitado es de 4-5 g (peso húmedo).

b) Análisis de expresión

Los perdigones (pellets) celulares obtenidos en cada caso de 1 ml de medio de cultivo separado por centrifugación (células UT5600/pUBS520/pFX-EGF2-AP-CD) se resuspenden en 0,25 ml de 10 mmol/l de Tris-HCl, pH 7,2, y se disgregan las células por ultrasonidos (2 pulsos a 30 s con una intensidad del 50%) mediante un aparato Sonifier® Cell Disruptor B 15 de la empresa Branson (Heusenstamm, RFA). Se sedimentan los componentes celulares insolubles (centrífuga Eppendorf 5415, 14000 rpm, 5 min) y al líquido sobrenadante se le añaden 1/5 de volumen de 5xSDS-tampón de muestra (1xSDS-tampón de muestra: 50 mmol/l de Tris-HCl, pH 6,8, 1% de SDS, 1% de mercaptoetanol, 10% de glicerina, 0,001% de azul de bromofenol). La fracción de restos celulares insolubles (perdigón) se resuspende en 0,3 ml de 1xSDS-tampón de muestra con 6-8 mol/l de urea, se incuban las muestras a 95ºC durante 5 min y se vuelve a centrifugar. A continuación se separan las proteínas por electroforesis a través de gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) (Laemmli, U.U., Nature 227, 680-685, 1970) y se colorean con el colorante azul Coomassie Brilliant Blue R.

La variante de proteasa FX-EGF2-AP-CD sintetizada en E. coli es homogénea y se halla exclusivamente en la fracción de restos celulares insolubles ("cuerpos de inclusión", IB). El grado de expresión se sitúa en el 50%, referido a la proteína total de E. coli.

Ejemplo 8 Lisis celular, solubilización y preparación de los cuerpos de inclusión (IB)

El perdigón celular de 3 litros de cultivo agitado (aprox. 15 g de peso húmedo) se resuspende en 75 ml de 50 mmoles/l de Tris-HCl, pH 7,2. A esta suspensión se le añaden 0,25 mg/ml de lisozima y se incuba a 0ºC durante 30 min. Se añaden 2 mmoles/l de MgCl_{2} y 10 \mug/ml de DNasa (Boeheringer Mannheim GmbH, nº de cat. 104159) y se disgregan las células mecánicamente mediante dispersión de alta presión con una prensa French® de la empresa SLM Amico (Urbana, IL, EE.UU.). Después se digieren los DNA a temperatura ambiente (RT) durante 30 min. A esta mezcla se le añaden 37,5 ml de 50 mmoles/l de Tris-HCl, pH 7,2, 60 mmoles/l de EDTA, 1,5 moles/l de NaCl, 6% de Brij X-100, se incuba a RT durante 30 min más y se centrifuga en una centrífuga Sorvall RC-5B (rotor GSA, 12000 rpm, 15 min). Se desecha el líquido sobrenadante, al perdigón se le añaden 100 ml de 50 mmoles/l de Tris-HCl, pH 7,2, 20 mmoles/l de EDTA, se incuba a 4ºC con agitación durante 30 min y se sedimenta de nuevo. Se repite la última etapa de lavado. Los IB purificados (1,5-2,0 g de peso húmedo, 25-30% de masa seca, 100-150 mg de proteasa) se almacenan a -20ºC hasta el momento de su proceso ulterior.

Ejemplo 9 Solubilización y reducción / derivatización y diálisis de los IB

Se suspenden los IB purificados en una concentración de 100 mg de perdigón de IB (peso húmedo)/ml equivalentes a 5-10 mg/ml de proteína en 6 moles/l de guanidinio-HCl, 100 mmoles/l de Tris-HCl, 20 mmoles/l de EDTA, pH 8,0, y se disuelven partes alícuotas en presencia de 200 mmoles/l de GSSG o de 200 mmoles/l de GSH a RT y con agitación durante 1-3 horas. A continuación se ajusta el pH a 5,0 y los componentes insolubles se separan por centrifugación (centrífuga Sorvall RC-5B, rotor SS34, 16000 rpm, 15 min) y se dializan frente a 6 moles/l de guanidinio-HCl, pH 5,0, a 4ºC durante 24 h. La derivatización se detecta mediante SDS-PAGE.

Ejemplo 10 Naturalización de FX-EGF2-AP-CD en función de la reducción / derivatización

La naturalización de la variante de proteasa FX-EGF2-AP-CD solubilizada en 6 moles/l de guanidinio-HCl y reducida con 100 mmoles/l de DTE, o derivatizada con diversas concentraciones de GSSG/GSH se realiza a 4ºC por la adición única en cada caso de 50 \mul de solubilizado/derivado de IB a 5 ml del tampón de naturalización (50 mmoles/l de Tris-HCl/0,6 moles/l de arginina/10 mmoles/l de CaCl_{2}/2 mmoles/l de EDTA/2 mmoles/l de GSH/0,5 mmoles/l de GSSG, pH 8,5).

Se dializa la proteína naturalizada dos veces en cada caso frente a 100 vol. de 50 mmoles/l de Tris-HCl, 150 mmoles/l de NaCl, 5 mmoles/l de CaCl_{2}, 0,1% de polietilenglicol 8000 (PEG 8000), pH 8,0, a 4ºC durante 8-16 h. Se separa la proteína precipitada por centrifugación (centrífuga Eppendorf 5415, 14000 rpm, 5 min) y se utiliza el líquido sobrenadante transparente para la activación.

Ejemplo 11 Activación de la variante de proteasa rFX-EGF2-AP-CD con RVV-X

En cada caso a 1 ml de las muestras de rFX-EGF2-AP-CD naturalizadas y dializadas se les añaden 10 \mul de una solución de "Russels viper venom" (RVV) (1 mg/ml de liofilizado disuelto en 20 mmoles/l de Tris-HCl, pH 7,6) de la empresa Sigma Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen, RFA) y se incuba a 37ºC durante 1-2 días. El curso temporal de la activación enzimática de la rFX-EGF2-AP-CD se sigue con el sustrato peptídico cromógeno X (ver ejemplo 12) hasta la digestión total (meseta, activación máxima). Para ello se toman de la mezcla reaccionante muestras (20 \mul) a intervalos de 4-6 horas y se determina la actividad de FXa generada.

Ejemplo 12 Ensayo de actividad de FXa

Se determina la actividad de la rFXa-EGF2-AP-CD naturalizada y activada con el sustrato cromógeno Chromozym X de la empresa Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, RFA, nº de cat. 789763). A 20 \mul de muestra se les añaden a RT 180 \mul de 50 mmoles/l de Tris-HCl, 150 mmoles/l de NaCl, 5 mmoles/l de CaCl_{2}, 0,1% de PEG 8000, pH 8,0, y 20 \mul de 4 mmoles/l de Chromozym X en una placa de microvaloración y se determina la velocidad inicial lineal (\DeltaE/min) por medición de la extinción a una longitud de onda de 405 nm con un lector ELISA.

Principio del ensayo:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+
rFXa-EGF2-AP-CD\+\cr
 MOC-D-NleGlyArg-pNa
\+ - - - - - - - - - - - - - - - - - > \+
MOC-D-NleGlyArg + 
pNA\cr}

Señal medida: pNA (p-nitroanilina)

Sustrato FX: MOC-D-NLeGlyArg-pNa (Chromozym X)

: Mezcla del ensayo:

: 180 \mul de tampón

: +20 \mul de sustrato (Chromozym X, 4 mmoles/l)

: +20 \mul de muestra rFXa-EGF2-AP-CD

Ejemplo 13 Determinación de la eficacia de la naturalización

Para calcular la eficacia de la naturalización se emplea la actividad generada de la rFXa-EGF2-AP-CC (valor de meseta). El valor máximo dentro de la serie de valores medidos se toma como magnitud de referencia, que se coloca en el 100%.

La proteína reducida proporciona un rendimiento de naturalización del 60% con respecto a la proteína derivatizada.

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WO 91/03568

WO 91/08762

W0 92/22665

WO 93/09144

WO 93/19084

WO 95/30686

(1) DATOS GENERALES

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: BOEHERINGER MANNHEIM GmbH

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: Sandhofer Str. 116

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(C): CIUDAD: Mannheim

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(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL: D-68305

\vskip0.333000\baselineskip

(G): TELÉFONO: +49 8856-60 3446

\vskip0.333000\baselineskip

(H): TELEFAX: +49 8856-60 3451

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento de activación de proteína desnaturalizada

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv): VERSIÓN COMPUTERIZADA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): SOPORTE DE DATOS: disquete (floppy disk)

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM o compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.30B (EPA)

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE HEBRA: monohebra

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULAR: ácidos nucleicos diversos

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc. = cebador ("primer")

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAAAGAAT TCTCATGATC GTGGGAGGCC AGGAATGCAA G

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE HEBRA: monohebra

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULAR: ácidos nucleicos diversos

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc. = cebador ("primer")

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAAAAAGC TTCATTACTT GGCCTTGGGC AAGCCCCTGG T

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 59 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE HEBRA: monohebra

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULAR: ácidos nucleicos diversos

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc. = cebador ("primer")

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAAAGAAT CCATTAAAGA GGAGAAATTA AAATGCGGAA GCTCTGCAGC CTGGACAAC

\hfill

59

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\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 394 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE HEBRA: doble hebra

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULAR: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:

1

Claims

1. Procedimiento para la obtención de disulfuros mixtos a partir de una proteína y un componente disulfuro, caracterizado porque la proteína se incuba, se disuelve y se derivatiza en forma inactiva, difícilmente soluble, con una solución de un agente desnaturalizador en una concentración desnaturalizadora y en presencia de un componente disulfuro.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque después de la derivatización se separa el componente disulfuro.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la derivatización se realiza en condiciones ácidas.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque los grupos SH libres de la proteína se protegen por adición de EDTA.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque en calidad de componente disulfuro se utiliza el GSSG, la cistamina o la cistina.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el componente disulfuro se utiliza en una concentración por lo menos de 1 mmol/l.

7. Procedimiento de fabricación de una proteína biológicamente activa a partir de su forma inactiva, difícilmente soluble, que puede obtenerse por métodos recombinantes en procariotas, caracterizado porque la proteína en su forma inactiva, difícilmente soluble, se disuelve con una solución de un agente desnaturalizador en una concentración desnaturalizadora y en presencia de un componente disulfuro, la proteína disuelta por modificación debida a la solución intensamente desnaturalizadora en una solución no desnaturalizadora o débilmente desnaturalizadora adopta una conformación biológicamente activa, los enlaces disulfuro se rompen con el componente disulfuro y se vuelven a formar en la proteína a nivel intramolecular de modo que la proteína adopta una formación que le permite desplegar una actividad biológica.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la proteína naturalizada es una proteasa, un factor de crecimiento, una hormona proteica, una neurotrofina o una citocina.