ES2213161T3 - Metodos para inducir el crecimiento del pelo y la coloracion. - Google Patents

Abstract

SE MUESTRAN METODOS PARA CONTROLAR O MANIPULAR LA MUERTE CELULAR DE MELANOCITOS Y QUERATINOCITOS. EN ESPECIAL, METODO PARA PREVENIR LA PERDIDA CELULAR DE MELANOCITOS EPIDERMALES DEBIDO A LESION EN VERTEBRADOS. TAMBIEN SE MUESTRA UN METODO PARA INDUCIR EL CRECIMIENTO DEL CABELLO EN VERTEBRADOS, UN METODO PAR INDUCIR EL COLOR DEL CABELLO EN UN VERTEBRADO, UN METODO PARA INDUCIR EL COLOR DE LA PIEL EN UN VERTEBRADO, UN METODO PARA TRATAR LA CALVICIE EN UN INDIVIDUO, Y UN METODO PARA TRATAR LA ALOPECIA AERATA EN UN INDIVIDUO.

Description

Métodos para inducir el crecimiento del pelo y la coloración.

Antecedentes de la invención

Los folículos pilosos normales recorren un ciclo entre una etapa de crecimiento (anagen), una etapa degenerativa (catagen) y una etapa de reposo (telogen). Los pelos del cuero cabelludo tienen un ciclo de vida relativamente largo: La etapa de anagen varía de dos a cinco años, la etapa de catagen varía de unos pocos días a unas pocas semanas, y la etapa de telogen es de aproximadamente tres meses Fitzpatrick, T.B., et al., eds., DERMATOLOGY IN GENERAL MEDICINE (Vol. I), McGraw-Hill, Inc., 1993, pp. 290-291; Sperling, L.C., J. Amer. Acad. Dematology (v. 25, No. 1, Part 1), pp. 1-17 (1991)). Los pelos más cortos que se encuentran en cualquier otra parte del cuerpo tienen una correspondiente duración más corta de anagen. La morfología del pelo y del folículo piloso cambia drásticamente durante el curso del ciclo de vida del pelo.

Durante la anagen, el folículo piloso es altamente activo metabólicamente (Sperling, L.C., J. Amer. Acad. Dermatology (v. 25, No. 1, Part 1), p. 4 (1991)). El folículo comprende una papila folicular (dérmica) en la base del folículo; las células de la matriz epidérmica que rodean la papila folicular y que forman la base del eje del pelo; y el eje del pelo que se extiende hacia arriba desde la papila a través del canal del pelo (Fitzpatrick, T.B., et al., eds. DERMATOLOGY IN GENERAL MEDICINE (Vol. I), McGraw-Hill, Inc., 1993). Las células de la matriz son la porción del pelo que crece activamente (Sperling, L.C., J. Amer. Acad. Dermatology (v. 25, No. 1, Part 1), p. 6 (1991). En la catagen, las células de la matriz se retiran de la papila, y ocurren otros cambios degenerativos (Sperling, L.C. , J. Amer. Acad. Dermatology (v. 25, No. 1, Part 1), pp. 13-14 (1991)). Una columna de células epiteliales empuja hacia arriba el eje próximo queratinizado (Sperling, L.C., J. Amer. Acad. Dermatology (v. 25, No. 1, Part 1), p. 3 (1991)), y ocurre la muerte celular dentro del folículo (Fitzpatrick, T.B., et al., eds., DERMATOLOGY IN GENERAL MEDICINE (Vol. I), McGraw-Hill, Inc., 1993, p. 291).

Cuando el folículo piloso llega a la etapa de telogen, el pelo existente tiene un extremo próximo en forma de palo de golf, y un pequeño brote (un resto de la columna epitelial que se encuentra en catagen) en la base del folículo (Sperling, L.C., J. Amer. Acad. Dermatology (v. 25, No. 1, Part 1), p. 3 (1991)). Un pelo telogen no crecerá más (Fitzpatrick, T.B., et al., eds., DERMATOLOGY IN GENERAL MEDICINE (Vol I), McGraw-Hill, Inc., 1993, p. 291).

El sistema de pigmentación que colorea el pelo implica a los melanocitos localizados en el área de la matriz del folículo, encima de la papila folicular (Fitzpatrick, T.B., et al., eds., DERMATOLOGY IN GENERAL MEDICINE (Vol. I), McGraw-Hill, Inc., 1993, p. 292). Los pigmentos de melanina producidos por los melanocitos fluyen junto con los procesos dendríticos (Fitzpatrick, T.B., et al., eds., DERMATOLOGY IN GENERAL MEDICINE (Vol. I), McGraw-Hill, Inc., 1993, p. 292). Los procesos dendríticos son fagocitados por las células de la matriz de diferenciación que se convierten en parte del eje del pelo; la degradación del material fagocitado da como resultado el desprendimiento de gránulos de melanina en el citoplasma (Fitzpatrick, T.B., et al., eds., DERMATOLOGY IN GENERAL MEDICINE (Vol. I), McGraw-Hill, Inc., 1993, p. 671), pigmentando de este modo el pelo.

Las alteraciones de la pigmentación normal o del crecimiento del pelo pueden estar causadas por la edad, estados de enfermedad fisiológica, o lesión especialmente, por ejemplo, la exposición a irradiación ultravioleta. El "encanecimiento" del pelo, tanto normal (asociado a la edad) o anormal es conocido como canicie. El encanecimiento es el resultado de una disminución progresiva del pigmento presente en el eje del pelo, causado por la pérdida de melanocitos (Fitzpatrick, T.B., et al., eds., DERMATOLOGY IN GENERAL MEDICINE (Vol. I), McGraw-Hill, Inc., 1993, p. 671; Gilchrest, B.A. SKIN AND AGING PROCESSES, CRC. Press, 1984, p. 19). Una disminución de la densidad de los folículos pilosos está también asociada a la edad avanzada (Gilchrest, B.A., SKIN AND AGING PROCESSES, CRC Press, 1984, p. 20).

Hasta la fecha, no ha sido determinado el mecanismo de la lesión melanocítica y queratinocítica, por ejemplo, por exposición a los rayos ultravioletas o el proceso de envejecimiento. De este modo, se sabe o está disponible poco con respecto a un mecanismo para manipular el proceso de la lesión para prevenir la muerte celular y de este modo prevenir la calvicie o encanecimiento prematuro del pelo o, alternativamente, para promover la muerte celular y de este modo, el crecimiento no deseado del pelo.

Sumario de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de los Solicitantes de que los melanocitos y queratinocitos de la capa basal epidérmica sufren una muerte celular programada característica en respuesta a la lesión. En particular, los Solicitantes han mostrado que los melanocitos y queratinocitos epidérmicos sufren una muerte celular programada o apóptosis, y que la apóptosis en estas células está mediada por el camino receptor del factor de crecimiento nervioso p75/factor de crecimiento nervioso (p75 NGF-R/NGF), dando como resultado el aumento de la producción de proteína Bcl-2. Como resultado del descubrimiento de los Solicitantes, se proporcionan aquí métodos para controlar o manipular la muerte de las células melanocíticas y queratinocíticas alterando los efectos de la apóptosis. Por ejemplo, la apóptosis se puede inhibir usando métodos descritos aquí, dando como resultado el crecimiento y la coloración del pelo. Alternativamente, la apóptosis se puede promover por métodos descritos aquí, dando como resultado la pérdida o la despigmentación del pelo.

Los queratinocitos y melanocitos de la capa basal de la epidermis expresan los receptores NGF de alta afinidad (trk E y trk) y de baja afinidad (p75). El NGF, que se sabe que es producido por los queratinocitos, protege las células de la muerte cuando se une a receptores de NGF. En las células, este efecto del NGF es mediado en parte por inducción de la proteína de protección Bcl-2. Interesantemente, los queratinocitos y melanocitos epidérmicos basales expresan la proteína Bcl-2. Específicamente, tal como se describe aquí, se ha demostrado ahora que los melanocitos que expresan el NGF-R p75 pueden ser rescatados de la muerte celular apoptótica por la ocupación del NGF-R p75 con NGF o una substancia capaz de unirse al NGF-R p75, que inicia la expresión de la proteína Bcl-2.

También como se describe aquí, los Solicitantes han demostrado ahora que los folículos pilosos anagen normales expresan fuertemente el NGF-R p75 y que la expresión del NGF-R p75 está significativamente reducida y limitada a unos pocos queratinocitos basales en folículos pilosos telogen.

Como resultado de estos descubrimientos, ahora hay métodos disponibles para inhibir el proceso de apóptosis, o muerte celular programada, en queratinocitos y melanocitos epidérmicos y foliculares de la capa basal en vertebrados, específicamente en seres humanos. De este modo, como resultado de la inhibición de la apóptosis, la presente invención se refiere a métodos de inducir el crecimiento y coloración del pelo, y retrasar la pérdida del pelo y el encanecimiento, además de métodos de inducir la coloración de la piel en vertebrados. Además, la presente invención se refiere a métodos para tratar la alopecia areata y la calvicie, además de métodos de prevenir el crecimiento de pelo no deseado.

En una realización de la presente invención, la invención se refiere a un método para evitar la pérdida de melanocitos después de la lesión inhibiendo la apóptosis en los melanocitos epidérmicos. Tal como se describe aquí, los Solicitantes han demostrado ahora que la apóptosis mediada por NGF-R p75 es responsable de la pérdida de melanocitos después de la lesión, por ejemplo, debido a la irradiación ultravioleta o al envejecimiento. Específicamente, los Solicitantes han mostrado que un NGF-R p75 sin ocupar (es decir, un NGF-R p75 que no está unido a un ligando tal como NGF) induce la muerte celular apoptótica en melanocitos. De este modo, asegurando que el NGF-R p75 está ocupado por un ligando inhibe el camino apoptótico inducido por el NGF-R p75 de la muerte celular, dando como resultado el crecimiento/proliferación continuo, la producción de pigmento y la transferencia de pigmento al queratinocito por los melanocitos epidérmicos. Alternativamente, la pérdida de células melanocíticas epidérmicas se puede prevenir aumentando la expresión de la proteína Bcl-2 en los melanocitos epidérmicos o disminuyendo la expresión del NGF-R p75 en los melanocitos.

En otra realización de la invención, la invención se refiere a un método para inducir el crecimiento de pelo en un vertebrado aumentando la expresión del NGF-R p75 en los queratinocitos en un vertebrado, tal como seres humanos, introduciendo en los queratinocitos epidérmicos una secuencia de nucleótidos que codifica el NGF-R p75. El producto del gen del NGF-R p75 se expresa sobre la superficie de los queratinocitos y se convierte en disponible para unirse a su ligando natural, NGF, o a otra sustancia que imita la actividad de unión del NGF (es decir, un pseudo-ligando). El NGF-R p75 se une a su ligando, o pseudo-ligando, dando como resultado la expresión de la proteína, Bcl-2, que protege al queratinocito de la apóptosis.

Alternativamente, el aumento de la expresión del NGF-R p75 se puede conseguir introduciendo en el queratinocito una substancia, tal como una proteína de activador de transcripción, que inicia la transcripción del gen del NGF-R p75.

El crecimiento del pelo se puede inducir o prolongar también por el aumento de la expresión del la proteína Bcl-2 en los queratinocitos, por la introducción de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Bcl-2 o por la introducción de una substancia que inicia la transcripción del gen que codifica la proteína Bcl-2.

En otra realización de la presente invención, la invención se refiere a un método para inducir el color del pelo en un vertebrado, tal como un ser humano, inhibiendo la apóptosis mediada por el NGF-R p75 de los melanocitos epidérmicos. Tal como se describe anteriormente, un NGF-R p75 sin ocupar induce apóptosis en los melanocitos epidérmicos. Asegurando que el NGF-R p75 está ocupado por un ligando, aumentando la expresión de la proteína Bcl-2, o disminuyendo la expresión del NGF-R p75 inhibe la apóptosis en los melanocitos epidérmicos.

En otra realización de la presente invención, la invención se refiere a un método para inducir color de la piel en un vertebrado, particularmente un ser humano, inhibiendo la apóptosis mediada por el NGF-R p75 de los melanocitos epidérmicos. Tal como se describe anteriormente, un NGF-R p75 sin ocupar induce apóptosis en los melanocitos epidérmicos. Asegurando que el NGF-R p75 está ocupado por un ligando, aumentando la expresión de proteína Bcl-2, o disminuyendo la expresión de NGF-R p75 inhibe la apóptosis en melanocitos epidérmicos.

Alternativamente, la apóptosis se puede promover en melanocitos y queratinocitos en seres humanos, dando como resultado la muerte celular. Por ejemplo, la muerte celular puede ser deseable para evitar el crecimiento de pelo no deseado (por ejemplo, en las caras y antebrazos de las mujeres). Esto se puede conseguir, por ejemplo, bloqueando el factor de crecimiento nervioso en su unión al NGF-R p75, disminuyendo por ello, o inhibiendo completamente la producción de la proteína Bcl-2. De este modo, se promovería la muerte celular apoptótica.

Otra realización de la presente invención se refiere a un método para identificar una substancia capaz de inhibir la apóptosis en melanocitos o queratinocitos determinando el efecto que tiene la substancia sobre el factor de crecimiento nervioso p75. Alternativamente, el método para identificar una substancia capaz de inhibir la apóptosis en melanocitos o queratinocitos se puede conseguir determinando el efecto que tiene la substancia sobre la expresión de la proteína Bcl-2.

De este modo, como resultado del descubrimiento de los Solicitantes del papel de la apóptosis inducida por el NGF-R p75 en melanocitos epidérmicos, ahora hay disponibles métodos para inhibir la muerte celular apoptótica en melanocitos epidérmicos y foliculares, además de queratinocitos epidérmicos y foliculares, que incluyen métodos para inducir o prolongar el crecimiento del pelo, la coloración del pelo y la coloración de la piel.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1A es una fotomicrografía que representa el efecto de la irradiación UV con 10 mJ/cm^{2} sobre los melanocitos.

La Figura 1B es una fotomicrografía que representa el efecto de la irradiación ficticia sobre los melanocitos.

La Figura 1C es una fotomicrografía que representa el efecto de la irradiación UV con 10 mJ/cm^{2} en células MM4.

La Figura 1D es una fotomicrografía que representa el efecto de la irradiación ficticia en células MM4.

La Figura 1E es una fotografía de un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que representa el efecto de la irradiación UV, de células MM4 en la fragmentación de ADN.

La Figura 1F es una fotomicrografía que representa el efecto de la irradiación UV de melanocitos en la fragmentación de la cromatina nuclear.

La Figura 1G es una fotomicrografía que representa el efecto de la irradiación UV de melanocitos en la homogeneización de la cromatina nuclear.

La Figura 1H es un gráfico de barras que representa el porcentaje de melanocitos positivos con yoduro de propidio después de la irradiación ficticia, irradiación UV con 10 mJ/cm^{2} o irradiación UV con 25 mJ/cm^{2}.

La Figura 2A es un diagrama de barras que representa los rendimientos celulares de melanocitos después de 3 irradiaciones UV diarias de 0, 5, 10 y 25 mJ/cm^{2}.

La Figura 2B es un diagrama de barras que representa los rendimientos celulares de MM4 después de una única irradiación UV de 10 mJ/cm^{2} y enriquecimiento con NGF 50 ng/ml o diluyente solo.

La Figura 2C es un diagrama de barras que representa los rendimientos celulares después de la irradiación ficticia y el enriquecimiento con NGF 50 ng/ml o diluyente solo.

La Figura 2D es un diagrama de barras que representa los rendimientos celulares de MM4 después de una única irradiación UV de 10 mJ/cm^{2} y el enriquecimiento con 50 ng/ml de bFGG o diluyente solo.

La Figura 3E es un diagrama de barras que representa los rendimientos celulares de MM4 después de irradiación ficticia y el enriquecimiento con 50 ng/ml de bFGF o diluyente solo.

La Figura 2F es una fotomicrografía que representa la morfología celular del melanocito después de la irradiación UV diaria durante tres días con 10 mJ/cm^{2} y enriquecido con diluyente sólo.

La Figura 2G es una fotomicrografía que representa la morfología celular de MM4 después de la irradiación UV una vez con 10 mJ/cm^{2} y enriquecido con diluyente solo.

La Figura 2H es una fotomicrografía que representa la morfología celular del melanocito después de la irradiación UV diaria durante tres días con 10 mJ/cm^{2} y enriquecido con NGF 50 ng/ml.

La Figura 2I es una fotomicrografía que representa la morfología celular de MM4 después de la irradiación UV una vez con 10 mJ/cm^{2} y enriquecido con NGF 50 ng/ml.

La Figura 3A es una fotografía de un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que representa el efecto de la irradiación UV de células MM4 enriquecidas con NGF en la fragmentación de ADN.

La Figura 3B es un gráfico de barras que representa el porcentaje de melanocitos positivos con yoduro de propidio después de irradiación ficticia o de irradiación UV con 10 mJ/cm^{2} y a continuación tratamiento con NGF 50 ng/ml o diluyente solo.

La Figura 4A es una representación gráfica que representa el efecto del NGF en la expresión de Bcl-2 en células MM4 irradiadas con UV con 10 mJ/cm^{2}.

La Figura 4B es una representación gráfica que representa el efecto del NGF en la expresión de Bcl-2 en células MM4 ficticiamente irradiadas.

La Figura 4C es una fotografía de unos borrones oeste (Western blot) que representa el efecto del NGF en la expresión de Bcl-2 en células MM4 irradiadas con UV o ficticiamente irradiadas.

Las Figuras 5A y 5B son microfotografías que muestran los altos niveles de expresión del NGF-R p75 en los melanocitos y los queratinocitos bulbares en la vaina externa de la raíz en la porción inferior de pelos anagen.

La Figura 5C es una fotomicrografía que muestra los niveles de NGF-R p75 en melanocitos y queratinocitos en pelos telogen.

Las Figuras 5D y 5E son microfotografías que muestran los niveles de NGF-R p75 en melanocitos y queratinocitos en pelos anagen de pacientes con alopecia areata.

La Figura 6 es una fotomicrografía que muestra el efecto del factor de crecimiento nervioso en la inducción de BCL-2 en células melanocíticas transfectadas con NGF-R p75.

La Figura 7 es un gráfico de barras que representa que la disminución de NGF-R p75 anula el efecto del NGF en la supervivencia del melanocito. Las células fueron transfectadas con oligonucleótidos de NGF-R p75 y la expresión del NGF-R fue documentada por inmunofluorescencia indirecta.

La Figura 8 es un gráfico de barras que representa que la disminución de BCL-2 anula el efecto protector del NGF en células melanocíticas irradiadas con UV.

La Figura 9A es una fotomicrografía que muestra el efecto de la irradiación UV y el enriquecimiento con factor de crecimiento nervioso en la apóptosis de queratinocitos.

La Figura 9B es un gráfico de barras que representa el efecto de la irradiación UV y el enriquecimiento de factor de crecimiento nervioso en la supervivencia de queratinocitos.

La figura 10 es una fotomicrografía que muestra el efecto del empobrecimiento del factor de crecimiento nervioso en el nivel de BCL-2 en queratinocitos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está basada en el hallazgo de los Solicitantes de que los melanocitos y queratinocitos de la capa basal sufren una muerte celular programada, o apóptosis. Específicamente, los Solicitantes han demostrado que los melanocitos y queratinocitos de la capa basal de la epidermis y del folículo piloso sufren apóptosis. La apóptosis es un proceso activo de autodestrucción que ocurre en células de vertebrados. La apóptosis sigue un patrón distinguible de sucesos caracterizado por la formación de ampollas en la membrana plasmática, contracción del volumen celular, picnosis nuclear y degradación del ADN nucleosómico interno seguida de activación de las endonucleasas dependientes de Ca+/Mg+. (Hockenberry, D.M., et al., Cell 75:241-251 (1993); García, I., et al., Science 258:302-304 (1992)). La apóptosis es un mecanismo altamente conservado entre especies. Las células llevan en sus núcleos un programa genético para la apóptosis, que puede ser activado por el activador apropiado, tal como en respuesta a cambios en los niveles de hormonas o factores de crecimiento en el medio celular. (Allsopp, T.E., et al., Cell 295-307 (1993); Barinaga, M. et al., Science 259:762-763 (1992); Barinaga,M., et al., Science 263:754-755 (1994)). Los genes "apoptóticos" codifican proteínas que inducirán la apóptosis. Sin embargo, evidencia reciente sugiere que las células que no sufren apóptosis expresan proteínas protectoras, una de las cuales es la Bcl-2, que interacciona con las proteínas apoptóticas, las secuestra y evita su actividad (Allsopp, T.E., et al., Cell 295-307 (1993)). De este modo parece que existe un mecanismo para proteger las células de la apóptosis.

Para examinar si la muerte de un melanocito inducida por UV es apoptótica, se expusieron cultivos de melanocitos epidérmicos humanos puros o de la línea celular de melanoma humano MM4 (proporcionada por el Dr. U. Stierner, Goteborg, Sweden) a 5, 10 ó 25 mJ/cm^{2} de irradiación UV, dosis completamente dentro del intervalo de UV fisiológico que llega a la capa basal de la epidermis durante la exposición ocasional al sol. (Véase el Ejemplo 1). Los cultivos de control ficticiamente irradiados se manejaron idénticamente pero se colocaron bajo un trapo negro adyacente al haz ultravioleta. Después de 1-3 irradiaciones diarias, muchas células se fueron separando de la superficie de la placa (Véase las Figuras 1A y 1C), mientras que la mayoría de las células en los cultivos de control ficticiamente irradiados parecían sanas (Véase las Figuras 1B y 1D).

El ADN celular total aislado de pares de cultivos irradiados con UV mostró la característica fragmentación del ADN en multímeros inducida por la endonucleasa, la llamada escalera de ADN, mientras que el ADN de los controles ficticiamente irradiados no estaba fragmentado (Figura 1E). Cultivos duplicados irradiados con UV teñidos con yoduro de propidio mostraban la característica compactación, marginación y fragmentación de la cromatina nuclear, además de tinción nuclear homogénea (Figuras 1F y 1G). En los cultivos ficticiamente irradiados, menos del 6% de las células se tiñeron positivamente con yoduro de propidio. En contraste, aproximadamente 30% y 60% de las células irradiadas con 10 y 25 mJ/cm^{2} respectivamente dieron positivo con yoduro de propidio (Figura 1H). Estos datos sugieren fuertemente que la irradiación UV induce la muerte apoptótica en células de origen melanocítico.

Sin embargo, no se sabe que los melanocitos in vivo sufran apóptosis después de la irradiación UV. Tal como se describe aquí, los Solicitantes han demostrado que estas células tienen un mecanismo necesario para protegerlas de la muerte celular apoptótica.

Se había mostrado previamente que tanto los receptores del factor de crecimiento nervioso de alta afinidad como de baja afinidad, NGF-R trk y p75, se expresaron in vitro sobre la superficie de melanocitos humanos apropiadamente estimulados. (Peacocke, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 85:5282-5286 (1998); Yaar, M., et al. Clin. Res. 40:531A (1992)). También se había mostrado que los queratinocitos expresan el factor de crecimiento nervioso. (Yaar, M., et al., J. Cell Biol. 115:821-828 (1991); DiMarco, E., et al., J. Biol. Chem. 266:21718-21772 (1991)).

Los Solicitantes describen ahora aquí, que el factor de crecimiento nervioso mejora la supervivencia de melanocitos humanos después de la lesión, por ejemplo, debido a la exposición a la luz ultravioleta o a la pérdida de factor de crecimiento.

Melanocitos humanos cultivados se expusieron a un simulador solar (5, 10, 25 mJ/cm^{2} de dosis UVB) o se irradiaron ficticiamente como se describe en el Ejemplo 1 y a continuación se mantuvieron en un medio subóptimo libre de suero, y se les proporcionó continuamente 50 ng/ml de factor de crecimiento nervioso o diluyente solo. (Véase el Ejemplo 2). Después de la irradiación UV, la mayoría de los melanocitos y células MM4 no enriquecidos con NGF se fueron separando de la superficie de la placa. (Véase las Figuras 2F y 2G). En contraste, los cultivos enriquecidos con NGF parecían sanos. (Véase las Figuras 2H y 2I).

Los rendimientos celulares de melanocitos (Figura 2A) y células MM4 (Figuras 2B y 2C) irradiadas con 10 mJ/cm^{2} y enriquecidos con NGF 50 ng/ml fueron significativamente más altos que los de las células enriquecidas con diluyente solo (melanocitos: 7 experimentos p<0,0085; células MM4: 4 experimentos p<0,0001, ANOVA). Además, el enriquecimiento con factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), un mitógeno principal para células de origen melanocítico (Halaban, R., et al., In Vitro Cell Devel. Biol. 23:47-52 (1987); Halaban R., et al., J. Cell. Biol. 107:1611-1619 (1988)), no pudo mejorar la supervivencia de las células MM4 después de la irradiación UV a pesar de su efecto mitógeno en células ficticiamente irradiadas (Figuras 2D y 2E).

Para explorar el mecanismo de la sorprendente respuesta de las células irradiadas con UV al NGF, se irradiaron pares de cultivos con luz UVB (5, 10 ó 20 mJ/cm^{2} de dosis UVB), o se irradiaron ficticiamente, y a continuación se incubaron con anticuerpos para el componente de alta actividad del receptor de NGF trk. Los melanocitos en los cultivos tratados con UV mostraban más receptores trk que los controles ficticiamente irradiados. El análisis de borrones norte (northern blot) que comprueba los niveles de mARN del NGF-R p75 mostró niveles de transcripción varias veces más altos en los melanocitos enriquecidos con NGF que en los controles con diluyente.

Para determinar si los melanocitos sufren muerte celular apoptótica mediada por NGF-R p75 después de la irradiación UV, los melanocitos se expusieron a UVB (10 ó 25 mJ/cm^{2}) o se irradiaron ficticiamente, tal como se describe en el Ejemplo 1, a continuación se mantuvieron en un medio subóptimo libre de suero. Tanto la irradiación UVB como las condiciones subóptimas de cultivo, que se mostró previamente que indujeron la expresión del NGF-R p75 en melanocitos, indujeron los patrones de fragmentación del ADN clásicos de la apóptosis.

Para determinar si el NGF puede rescatar los melanocitos dañados de la apóptosis, se irradiaron cultivos por duplicado tal como se describe anteriormente, y se mantuvieron en un medio que contenía NGF 50 ng/ml o diluyente solo. Los cultivos irradiados no enriquecidos con NGF mostraron la característica fragmentación del ADN, mientras que los cultivos enriquecidos con NGF mostraron mucha menos fragmentación (Figura 3A). Tal como se describe en el Ejemplo 3, en veinticuatro horas, en melanocitos tratados con NGF frente al control, 12% frente a 30% de los núcleos mostraron fragmentación (p menor de 0,05, ensayo por duplicado) (Figura 3B). Los rendimientos celulares y el índice de marcado con timidina determinados diariamente durante 19 días fueron más altos en los cultivos tratados con NGF (p menor de 0,001), hasta 6,5 veces y 10 veces, respectivamente.

Para determinar si la apóptosis de melanocitos es mediada por el NGF-R p75, los cultivos se trataron como anteriormente, y a continuación se incuban en presencia de un anticuerpo monoclonal de NGF-R p75 anti-humano bloqueante que se cree que actúa como pseudo-ligando para el NGF-R p75. (Anticuerpo monoclonal para NGF-R p75 anti-humano, cortesía de Moses V. Chao, Cornell University Medical Center, New York, NY; Ross, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6681 (1984)). Como el NGF, el anticuerpo suprimió la apóptosis de melanocitos en cultivos irradiados con UV, mientras que el anticuerpo NGF-R p75 anti-rata que no se unió al NGF-R p75 humano no tuvo efecto.

El análisis de borrones norte del ARN de melanocitos de donantes de diferentes edades mostró que el NGF-R p75 era más alto en donantes de más edad, mientras que en contraste el nivel para otros receptores del factor de crecimiento no cambió o decreció con la edad, lo que sugiere una mayor vulnerabilidad a la apóptosis con el envejecimiento, consistente con la tendencia clínica de las personas de más edad a experimentar la pérdida progresiva de pelo.

De este modo, una realización de la presente invención se refiere a un método para prevenir o inhibir la pérdida de células melanocíticas después de la lesión. Los melanocitos están localizados en la capa basal epidérmica e incluyen melanocitos localizados en la piel y en los folículos pilosos. El tipo de lesión incluye la lesión debida a la exposición a luz ultravioleta, especialmente UVB, por ejemplo, en la piel habitualmente expuesta al sol, y la lesión debida al proceso normal de envejecimiento: Las lesiones pueden incluir también los estados de enfermedad tales como alopecia areata.

Más específicamente, la invención se refiere a métodos para evitar, o inhibir, la apóptosis en melanocitos y queratinocitos. Tal como se describe anteriormente, los Solicitantes han mostrado que la apóptosis en melanocitos está mediada por el receptor de NGF p75. Si el receptor está ocupado, esto es, si el receptor tiene unido un ligando, se inhibe la apóptosis en la célula.

El ligando natural para el NGF-R p75 es el factor de crecimiento nervioso (NGF). El NGF de mamífero es una proteína que consiste en tres subunidades, \alpha, \beta, y \gamma que interaccionan para formar un complejo de aproximadamente 130 kD. (Ulrich, A., et al., Nature 303:821-825 (1983)). Sin embargo, todos los efectos conocidos del NGF son mediados por la subunidad \beta de 26 kD a través de su receptor. Hay dos tipos de receptores del NGF, uno de un bajo peso molecular de aproximadamente 75 kD, y el otro de un peso molecular más alto de aproximadamente 140 kD. Se cree que ambos son necesarios para la unión de alta afinidad del NGF que es necesaria para la respuesta celular. Se encontró recientemente que el receptor de alto peso molecular es el protooncogen, trk, que es un miembro de la familia de la tirosina quinasa. (Yaar, M., et al., J. Cell Biol., 115:821-828 (1991); Chao, M., et al., Science 232:518-521 (1996); Klein, R.S., et al., Cell
65:189-197 (1991)). El NGF ha sido secuenciado y clonado tal como se describe en Ulrich, A., et al., Nature, 303:821-825 (1983), cuyas enseñanzas se incorporan aquí como referencia. De este modo, se puede usar para ocupar el receptor el complejo proteínico de NGF completo, una de sus subunidades activas, tal como la subunidad de 26 kD, o cualquier fragmento biológicamente activo de NGF. La actividad biológica de un fragmento de proteína NGF se puede determinar por un bioensayo in vitro, por ejemplo, tal como se describe en DiMarco, E., et al., J. Biol. Chem., 266:21718-21722 (1991), cuyas enseñanzas se incorporan aquí como referencia.

Otras substancias que imitan al NGF pueden actuar como un pseudo-ligando para el receptor. Por ejemplo, el anticuerpo NGF-R p75 anti-humano descrito en Ross, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6681 (1984) se une al NGF-R p75 y suprime la apóptosis en melanocitos. Estas substancias incluyen otros factores neurotróficos y neurotrofinas tales como NT-3, NT-4 y NT-5, que también son capaces de unirse al NGF-R p75 (DiMarco, E., et al., J. Biol. Chem., 268:24290-24295 (1993); Yaar, M., et al., J. Invest. Derm., 100:554 (1993)). Se pueden producir y evaluar substancias adicionales, proteínas o de naturaleza química, para ver su capacidad de unirse al NGF-R. Por ejemplo, se puede producir una substancia química que imita la composición del NGF. Esta substancia se puede evaluar tal como se describe anteriormente para ver la actividad del NGF.

Alternativamente, un método para prevenir la pérdida de células melanocíticas epidérmicas puede incluir disminuir la expresión del NGF-R p75 en melanocitos epidérmicos. Esto daría como resultado también pocas moléculas de receptor sin ocupar y por lo tanto, suprimiría la apóptosis y evitaría la pérdida de células melanocíticas. La disminución se puede conseguir, por ejemplo, introduciendo en el melanocito una substancia que inhibe o disminuye la transcripción del gen que codifica el NGF-R p75. Por ejemplo, un oligonucleótido antisentido que es complementario del mARN que codifica el NGF-R p75 se puede introducir en el melanocito de tal manera que el oligonucleótido antisentido se hibride con el mARN, previniendo con ello la traducción del mARN a la proteína NGF-R p75.

Alternativamente, los melanocitos epidérmicos se pueden poner en contacto con una substancia que se une al receptor del factor de crecimiento nervioso p75 expresado sobre la superficie de los melanocitos. La substancia, por ejemplo, puede ser un factor de crecimiento nervioso en un vehículo farmacéuticamente aceptable o un anticuerpo capaz de unirse al factor de crecimiento nervioso p75 y actuar como un pseudo-ligando. Los pseudo-ligandos incluyen substancias que imitan el factor de crecimiento nervioso, tales como, por ejemplo, péptidos, moléculas orgánicas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos.

Los anticuerpos pseudo-ligandos que se pueden usar en la presente invención son capaces de unirse al receptor del factor de crecimiento nervioso p75. El término anticuerpo se pretende que incluya tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales. El anticuerpo pseudo-ligando preferido es un anticuerpo monoclonal reactivo con un receptor del factor de crecimiento nervioso p75. El término anticuerpo también se pretende que incluya las mezclas de más de un anticuerpo reactivo con un receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (por ejemplo, un cóctel de diferentes tipos de anticuerpos monoclonales reactivos con un receptor del factor de crecimiento nervioso p75). El término anticuerpo se pretende que incluya adicionalmente anticuerpos enteros, sus fragmentos biológicamente funcionales, y anticuerpos quiméricos que comprenden porciones de más de una especie, anticuerpos bifuncionales, etc.. Los fragmentos de anticuerpo biológicamente funcionales que se pueden usar son aquellos fragmentos suficientes para que ocurra la unión del fragmento de anticuerpo al receptor del factor de crecimiento nervioso p75.

Los anticuerpos quiméricos pueden comprender porciones derivadas de dos diferentes especies (por ejemplo, la región constante humana y la región variable o de unión murina). Las porciones derivadas de dos especies diferentes se pueden unir conjuntamente químicamente por técnicas convencionales o se pueden preparar en forma de proteínas contiguas únicas usando técnicas de ingeniería genética. Las porciones derivadas de dos especies diferentes se pueden producir también por medios recombinantes y se pueden unir a continuación tal como se describe anteriormente. El ADN que codifica las proteínas de las porciones tanto de cadena ligera como de cadena pesada del anticuerpo quimérico se puede expresar en forma de proteínas contiguas o se puede producir por medios recombinantes y se puede unir usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

El resultado final de la unión del NGF-R p75 a su ligando es la expresión de la proteína protectora, Bcl-2. Se ha mostrado que la Bcl-2 previene algunas clases de muerte celular en linfocitos y neuronas (Veis, D.J., et al., Cell 75:229-240 (1993)). Tal como se describe en el Ejemplo 4, los Solicitantes han mostrado ahora la expresión de Bcl-2 por melanocitos dañados después del tratamiento con NGF. La apóptosis puede ser inhibida por la expresión de la proteína protectora, Bcl-2. De este modo, otro método para prevenir la pérdida de células melanocíticas comprende un método para aumentar la expresión de la proteína Bcl-2 en los melanocitos. Esto se puede conseguir, por ejemplo, insertando una secuencia de nucleótidos que codifica la Bcl-2 en un vector de expresión capaz de expresar la Bcl-2 codificada en células de vertebrado. Tal vector de expresión se puede construir, por ejemplo, como se describe en Allsopp, T.E., et al., Cell 73:295-307 (1993), cuyas enseñanzas se incorporan aquí como referencia. Este vector de expresión de Bcl-2 se puede introducir a continuación en melanocitos usando técnicas estándar de laboratorio, tales como, por ejemplo, microinyección, precipitación de fosfato de calcio, o bombardeo con microproyectiles.

La alopecia areata (AA) es una enfermedad común del folículo piloso, que afecta a alrededor del 2% de los nuevos pacientes que van a clínicas dermatológicas en los Estados Unidos y en Gran Bretaña (Price, V.H., J. Invest. Dermatol., 96:685 (1991)). En la alopecia areata, el folículo piloso, en respuesta a alguna señal desconocida o lesión, se precipita de repente a telogen prematuro, y a continuación recorre un ciclo abortado acortado en el que se detiene repetidamente a medio camino de anagen prematuro. El folículo puede permanecer en este estado detenido pero es capaz de completar el crecimiento normal después de meses o años. Se desconocen la naturaleza de la señal o lesión y el blanco anatómico de esta anormalidad.

Histológicamente, la AA se caracteriza por el infiltrado linfocítico peribulbar de células ayudantes T predominantemente (Lever, W.F. and Schaumburg-Lever, G., eds., HISTOPATHOLOGY OF THE SKIN, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA, 1990, pp. 223-224), que sugiere fuertemente la implicación del sistema inmune celular quizás por medio de una pérdida de discriminación de auto- y no auto-antígenos (Goldsmith, L.A., J. Invest. Dermatol., 96:985-1005 (1991)). Alternativamente, una anormalidad intrínseca en el queratinocito folicular podría ser activada bajo la influencia de activadores internos o externos, que finalmente puede conducir a la degeneración celular y al infiltrado inflamatorio peribulbar. Sin embargo, hasta la fecha no se ha identificado antígeno específico para apoyar la teoría autoinmune y no se ha publicado ninguna diferencia intrínseca específica entre queratinocitos bulbares normales y de AA.

Tal como se describe en el Ejemplo 5, se realizaron estudios inmonofluorescentes indirectos en material de biopsia obtenido de sujetos normales y de pacientes de alopecia areata en un esfuerzo para detectar diferencias en el sistema de señalización del NGF durante estados caracterizados por la muerte de queratinocitos y melanocitos. Los resultados muestran altos niveles de NGR-R p75 en melanocitos y queratinocitos bulbares de la vaina externa de la raíz en la parte inferior de pelos anagen (Figuras 5A y 5B), que sugieren un papel para el NGF-R p75 en el crecimiento del pelo. Los niveles de NGF-R p75 se redujeron significativamente o el NGF-R p75 estaba ausente en melanocitos y queratinocitos de pelos telogen (Figura 5C). Además, en melanocitos y queratinocitos en pelos anagen de pacientes de AA, se detectaron también significativamente más bajos niveles de NGF-R p75 (Figuras 5D y 5E), lo que indica que los niveles disminuidos de este receptor pueden estar implicados en la patogénesis de AA precipitando los pelos anagen a un telogen prematuro.

Estos hallazgos sugieren fuertemente que la pérdida del NGF-R p75 puede conducir a apóptosis de queratinocitos bulbares y desplazar el folículo piloso hacia telogen. Los NGF-R p75 disminuidos en pelo anagen de pacientes de AA pueden ser la lesión inicial que activa el flujo de telogen en estos pacientes.

De este modo, en otra realización de la presente invención, la invención se refiere a un método para inducir el crecimiento de pelo en un vertebrado. Esto es especialmente útil para retrasar o prevenir la pérdida de pelo en seres humanos, por ejemplo, en la calvicie de patrón masculino. El crecimiento de pelo se induce manteniendo los pelos en la fase anagen, y evitando del inicio de la fase telogen. Tal como se describe anteriormente, los niveles de NGF-R p75 eran significativamente reducidos o ausentes en pacientes de alopecia aerata. De este modo, es razonable creer que si se incrementa el nivel de expresión de NGF-R sobre la superficie de los queratinocitos del folículo piloso, los pelos se mantienen en la fase anagen dando como resultado el crecimiento del pelo. El aumento de la expresión del NGF-R p75 se puede conseguir insertando una secuencia de nucleótidos que codifica el NGF-R p75 en un vector de expresión capaz de expresar la proteína receptora codificada en una célula de vertebrado e introduciendo el vector del receptor en el queratinocito, dando como resultado la expresión del receptor codificado. Los vectores de expresión de NGF-R p75 se pueden construir tal como se describe por ejemplo, en Rabizadeh, S., et al., Science 261:345-348 (1993); Morgenstern, J.P., et al., Nucleic Acids Res. 18:3587 (1990). Este vector de expresión de NGF-R p75 se puede introducir en queratinocitos usando técnicas de laboratorio estándar, tales como, por ejemplo, microinyección, precipitación de fosfato de calcio, o bombardeo con microproyectiles. Las secuencias de cADN para NGF-R p75 de seres humanos, ratas y pollos son conocidas. (Johnson, D., et al., Cell 47:545-554 (1986); Radeke, M. et al., Nature 325:593-597 (1987) y Large, T.H., et al., Neuron 2:1123-1134 (1989); Huer, J. G., et al., Devl. Biol. 137:287-304 (1990), respectivamente, cuyas enseñanzas se incorporan como referencia).

Alternativamente, se puede introducir una substancia en queratinocitos epidérmicos que aumenta la expresión del NGF-R p75, tal como un factor de transcripción que promueve la transcripción del gen que codifica el NGF-R p75.

Tal como se discutió anteriormente, el NGF-R p75 sin ocupar da como resultado la apóptosis en melanocitos. Basados en los datos presentados aquí, los Solicitantes razonablemente esperan que la apóptosis mediada por NGF-R p75/NGF ocurra también en queratinocitos epidérmicos. De este modo, la unión del NGF-R p75 al ligando en queratinocitos epidérmicos da como resultado la expresión de la proteína anti-apóptotica Bcl-2. Otro método para inducir el crecimiento del pelo incluido en la siguiente invención se refiere a aumentar la expresión de Bcl-2 en los queratinocitos epidérmicos. El aumento de la expresión de Bcl-2 se puede conseguir expresando la proteína Bcl-2 codificada en los queratinocitos de una manera similar a la expresión de la proteína Bcl-2 en los melanocitos como se discute anteriormente.

Tal como se discute anteriormente, en biopsias de pacientes con AA, la expresión de NGF-R p75 en queratinocitos de pelos anagen está significativamente reducida o totalmente ausente. En la AA, el NGF-R p75 se puede encontrar in vivo por medio de un autoanticuerpo patógeno que hace imposible la unión adicional de anticuerpos comerciales. Para seguir la posibilidad de que los niveles reducidos de NGF-R p75 en AA son el resultado de un autoanticuerpo unido, se pueden realizar estudios de inmunofluorescencia directa en cortes transversales de pacientes de AA para determinar si las inmunoglobulinas humanas están unidas en áreas que se sabe que expresan el NGF-R p75.

Otra realización de la presente invención se refiere a métodos para inducir la coloración del pelo en un vertebrado que comprenden inhibir la apóptosis en melanocitos epidérmicos. Los melanocitos epidérmicos producen el pigmento melanina en orgánulos llamados melanosomas y transfieren el pigmento a los queratinocitos que los rodean vía las dendritas extensivas. La pigmentación de melanina es el principal determinante del color del pelo y piel. La inhibición de la apóptosis en los melanocitos da como resultado queratinocitos persistentemente pigmentados, o coloración del pelo, y de este modo, retrasa o previene el encanecimiento del pelo que es debido a la pérdida de melanocitos del bulbo piloso.

Alternativamente, como resultado del descubrimiento de los Solicitantes del mecanismo de la muerte celular apoptótica en melanocitos y queratinocitos, se proporcionan también métodos que promueven la apóptosis en estas células dando como resultado la muerte celular. La promoción de la muerte celular en los queratinocitos puede ser deseable para disminuir, o inhibir completamente el crecimiento del pelo en áreas específicas de un individuo. Por ejemplo, a menudo es deseable la inhibición del crecimiento del pelo facial, crecimiento del pelo en el antebrazo o crecimiento del pelo en las piernas.

Tal inhibición del crecimiento del pelo se puede conseguir, por ejemplo, por el uso de un anticuerpo bloqueante que bloqueará la unión del NGF al NGF-R p75 expresado sobre los queratinocitos. El anticuerpo bloqueante (o un fragmento de anticuerpo o péptido) se unirá al NGF-R p75 y de este modo evitará que el NGF se una al NFG-R. De este modo, se inhibe el camino anti-apoptótico mediado por NGF/NGF-R p75 y se permitirá la muerte celular, o se mejorará después de la lesión a las células. Por ejemplo, el área específica en el que se va a inhibir el crecimiento del pelo se puede irradiar primero con luz UV y a continuación se puede aplicar una composición que comprende el anticuerpo bloqueante (por ejemplo, en una crema o pomada), dando como resultado la apóptosis de queratinocitos dañados y la inhibición del crecimiento del pelo.

En otra realización de la presente invención, la invención se refiere a métodos in vitro para identificar nuevas substancias, capaces de inducir el crecimiento del pelo o la coloración del pelo o inhibir el crecimiento del pelo en un individuo. Estos métodos se pueden basar en el descubrimiento de los Solicitantes del mecanismo apoptótico de la muerte en melanocitos y queratinocitos. Un método in vitro de evaluar la apóptosis mediada por NGF-R p75/NGF puede usar, por ejemplo, muestras de piel de ratones C57BL-6 con folículos pilosos sincronizados en telogen o anagen, como se describe en Paus, R., et la., Br. J. Dermatol. 122:777-784 (1990), cuyas enseñanzas se incorporan aquí como referencia. Estas muestras de piel, siendo mayores que las biopsias obtenidas de gente, y teniendo folículos en porciones definidas del ciclo de crecimiento son útiles para investigar la relación entre NGF/NGF-R p75 y el estado de crecimiento del folículo piloso. Están disponibles las sondas murinas necesarias (cADN y anticuerpos). Por ejemplo, el anticuerpo NGF-R p75 anti-rata está disponible de Accurate Chemical & Scientific Company (New York) y el anticuerpo NGF anti-ratón está disponible de Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN). El cADN de NGF de rata se describe en Maisonpierre, P.C., et al., Science 247:1446-1451 (1990) y el cADN de NGF-R p75 se describe en Radeke, M.J. et al., Nature 325:593-597 (1987). Una substancia que se va a ensayar para ver la actividad antiapoptótica en melanocitos se puede evaluar en este u otro ensayo de cultivo de células melanocíticas (por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo 1). Las muestras de piel o melanocitos se pueden mantener en condiciones apropiadas para su proliferación y a continuación se pueden exponer a irradiación UV. Después de la irradiación, la substancia que se va a ensayar para ver la actividad apoptótica se pueden añadir al sistema de cultivo. Subsecuentemente, las células cultivadas se pueden evaluar para determinar si la muerte celular ha sido inhibida o ha disminuido.

Las substancias identificadas en este método son substancias que alteran específicamente el mecanismo apoptótico en melanocitos y queratinocitos. Por ejemplo, las substancias que imitan el factor de crecimiento nervioso se pueden ensayar en un ensayo tal como se describe anteriormente para evaluar su actividad de inhibir la apóptosis. Adicionalmente, las substancias identificadas y evaluadas por este método pueden ser péptidos, moléculas orgánicas, pequeñas moléculas orgánicas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo.

Las substancias identificadas usando métodos descritos aquí, que se encuentra que se unen al receptor del factor de crecimiento nervioso p75, o afectan de otro modo al receptor del factor de crecimiento nervioso p75, o que se encuentra que inician la expresión de Bcl-2, se pueden usar en métodos para inducir el crecimiento del pelo, el color de pelo o el color de la piel. Estos métodos comprenden poner en contacto células epidérmicas, que incluyen melanocitos de la capa basal o queratinocitos foliculares, de un vertebrado con una cantidad efectiva de una substancia capaz de inducir el crecimiento del pelo, el color del pelo o el color de la piel inhibiendo la apóptosis en melanocitos o queratinocitos. Una cantidad efectiva de tal substancia identificada es una cantidad efectiva para disminuir significativamente o inhibir completamente la muerte celular apoptótica en melanocitos y queratinocitos. La disminución de la inhibición de la apóptosis en melanocitos y queratinocitos se puede evaluar usando los métodos descritos aquí.

Se conocen y se pueden usar varios sistemas de suministro para administrar cantidades efectivas de substancias, tales como ligandos naturales o pseudo-ligandos para que el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 inhiba la apóptosis en melanocitos y queratinocitos. Por ejemplo, se puede usar la encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, la expresión por células recombinantes, la endocitosis mediada por receptor, la construcción de un ácido nucléico que codifica un ligando natural o un pseudo-ligando como parte de un vector retroviral u otro vector. En una realización, se puede usar una preparación de liposoma. La preparación de liposoma puede comprender cualquier liposoma que penetra el stratum corneum y se funde con la membrana celular, dando como resultado el suministro de los contenidos del liposoma en la célula. Por ejemplo, se pueden usar liposomas tales como los descritos en la patente de EE.UU: No. 5.077.211 de Yarosh, patente de EE.UU. NO. 4.621.023 de Redziniak et al..

La administración de las substancias puede ser también, por ejemplo, por aplicación tópica a la epidermis de un vertebrado, tal como un ser humano, en una cantidad suficiente para suprimir la apóptosis y prevenir la pérdida de células melanocíticas o queratinocitos. La substancia se puede mezclar en un vehículo tópico farmacológico tal como un gel, una pomada, una loción, una crema, o un champú e incluirá tales vehículos como agua, glicerol, alcohol, propilenglicol, alcoholes grasos, triglicéridos, ésteres de ácido graso, o aceites minerales. Otros vehículos tópicos posibles incluyen, por ejemplo, petrolato líquido, palmitato de isopropilo, polietilenglicol, etanol (95%), monolaurato de polioxietileno (5%) en agua, laurilsulfato de sodio (5%) en agua. Se pueden añadir otros materiales tales como antioxidantes, humectantes, estabilizantes de la viscosidad y agentes similares según sea necesario.

Además, en ciertos casos, se espera que las substancias se puedan depositar dentro de dispositivos colocados sobre, en o bajo la piel. Tales dispositivos incluyen parches transdérmicos, implantes, e inyecciones que desprenden la substancia de tal manera como para ponerse en contacto con la piel o el folículo piloso por mecanismos de desprendimiento activo o pasivo.

El vehículo de suministro puede contener también perfumes, colorantes, estabilizantes, protectores del sol, u otros ingredientes. La substancia se puede aplicar, por ejemplo, tópicamente a la epidermis a intervalos regulares, tal como una vez o dos diariamente, en un vehículo apropiado y con una concentración efectiva. La aplicación puede ser también en un vehículo que se dirige específicamente a las células apropiadas (es decir, melanocitos epidérmicos o queratinocitos epidérmicos). Por ejemplo, un marcador de membrana específico para melanocitos, tal como una hormona de estimulación de melanocitos (MSH), se puede incorporar en un liposoma que contiene una substancia que inhibe o disminuye la transcripción del gen que codifica el NGF-R p75.

Una cantidad efectiva de una substancia que inhibe, disminuye o promueve la apóptosis se puede administrar a un individuo usando cualquiera de los métodos anteriormente descritos. Las cantidades preferidas de hecho de un ligando que se va a administrar variarán según el ligando específico que se esté utilizando, las particulares composiciones formuladas, el modo de aplicación, y el sitio particular y el vertebrado que se esté tratando. La concentración del ligando efectiva para suprimir la apóptosis y para evitar la pérdida de células melanocíticas epidérmicas o la pérdida de células queratinocíticas epidérmicas, o para promover la apóptosis, en un vertebrado, tal como un ser humano, se puede determinar usando protocolos farmacológicos convencionales conocidos.

Los siguientes ejemplos ilustran más específicamente la invención y no se pretende que sean limitantes de ningún modo.

Ejemplo 1 Efecto de la irradiación UV en la muerte de células melanocíticas

Se depositaron melanocitos o células MM4 en placas de cultivo de tejido de 60 mm de diámetro. Los melanocitos se mantuvieron en Medio 199 enriquecido con suero bovino fetal al 7% (FBS), factor de crecimiento epidérmico 10 ng/ml (Collaborative Research), insulina 10 \mug/ml (Sigma), triyodotironina 10^{-9} M (Collaborative Research), transferrina 10 \mug/ml (Sigma), hidrocortisona 1,4 x 10^{-6} M (Calbiochem), toxina de cólera 10^{-9}M (Calbiochem), y factor de crecimiento fibroblástico básico 10 ng/ml (Collaborative Research) (medio basal de melanocitos). Las células MM4 se mantuvieron en DME al 55,3%, L15 al 27,6%, FBS al 15%, aminoácidos no esenciales al 1% (GIBCO BRL), glutamina 2 mM e insulina 10 \mug/ml. Después de 24 horas, el medio se reemplazó por disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y las células se irradiaron usando un simulador solar de arco de xenón de 1 kW (XMN 1000-21, Optical Radiation Corp., Azuza, CA) con 5, 10, ó 25 mJ/cm^{2} de UV a través de la cubierta de plástico de la placa petri. La irradiancia se ajustó a 4 x 10^{-5} cm^{-2} de UV y se midió con un radiómetro de investigación (modelo IL1700A, International Light, Newburyport, MA) provisto de una sonda de UVB a 285\pm5 nm. Después de la irradiación UV, las células se mantuvieron en su medio respectivo sin FBS durante 2 días (células MM4) o 3 días (melanocitos) y se procesaron como se indica. Los cultivos de control ficticiamente irradiados se manejaron idénticamente pero se colocaron bajo un trapo negro adyacentes al haz UV.

Las células en placas de cultivo de tejido de 100 mm se lavaron con PBS fría y se rompieron en un tampón de lisis de pH 8 (tris 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM, SDS al 1%, proteinasa K 200 \mug/ml). Después de 15 horas de incubación a 37ºC, se extrajeron muestras dos veces con fenol más cloroformo (1:1, V/V) y se precipitaron durante la noche con etanol (2,5 x volumen) y acetato de sodio 3 M (1/10 x volumen). El ADN se digirió a continuación con ribonucleasa libre de ADNasa (10 \mug/ml) durante una hora a 37ºC, se separó en gel de agarosa al 1% y se tiñó con bromuro de etidio. El marcador de tamaño es la escalera de ADN de 100 bp (STD) (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD). La Figura 1E muestra que la fragmentación del ADN ocurre en las células MM4 irradiadas con UV pero no en las ficticiamente irradiadas.

Los melanocitos se cultivaron en placas de cultivo de tejido de 8 cámaras (Nunc Inc., Naperville, IL) y se irradiaron con UV con 10 mJ/cm^{2} como anteriormente. Se añadieron cuatro \muM de yoduro de propidio (PI) a cultivos de melanocitos 24 horas después de la irradiación, durante 5 minutos a 37ºC. Los cultivos se lavaron con PBS y los núcleos se analizaron usando un microscopio láser confocal Leitz (Leica, Deerfield, IL). La Figura 1F muestra la fragmentación de la cromatina nuclear de melanocitos irradiados con UV. La Figura 1G muestra la homogeneización de la cromatina nuclear de melanocitos irradiados con UV.

Los melanocitos se irradiaron ficticiamente o con UV con 10 mJ/cm^{2} y 25 mJ/cm^{2}. Veinticuatro horas después de la irradiación, se añadieron 4 \muM de yoduro de propidio a los cultivos como anteriormente y las células se observaron con microscopio Nikon de contraste de fase fluorescente. Se determinó el número de núcleos fragmentados u homogéneamente teñidos frente a núcleos no teñidos en varios campos representativos y se expresó en forma de porcentaje de células totales. Se contaron un mínimo de 130 células para cada estado. La Figura 1H muestra el porcentaje de células positivas con PI en el cultivo de melanocitos.

Ejemplo 2 El factor de crecimiento nervioso mejora la supervivencia de melanocitos humanos después de la lesión

Se irradiaron con UV melanocitos tres veces en tres días consecutivos con dosis de 0, 5, 10 ó 25 mJ/cm^{2}. Después de cada exposición a UV, las células se colocaron hasta la siguiente irradiación en medio de melanocitos de nueva aportación que contiene NGF 50 ng/ml o diluyente solo. La Figura 2A muestra el rendimiento de melanocitos después de tres irradiaciones UV diarias de 0, 5, 10 y 25 mJ/cm^{2}.

Las Figuras 2B y 2D muestran rendimientos de células MM4 24-27 horas después de una única irradiación UV de 10 mJ/cm^{2}. Las Figuras 2C y 2E muestran rendimientos de células MM4 24-72 horas después de la irradiación ficticia. Las células en las Figuras 2B y 2C se enriquecieron con NGF 50 ng/ml o diluyente solo. Las células en las Figuras 2D y 2E se enriquecieron con bFGF 50 ng/ml o diluyente solo.

La Figura 2F muestra la morfología celular de melanocitos después de la irradiación UV diariamente durante tres días con 10 mJ/cm^{2} y enriquecidos con diluyente solo. La Figura 2G muestra la morfología celular de células MM4 después de la irradiación UV una vez con 10 mJ/cm^{2} y enriquecidas con diluyente solo. La Figura 2H muestra la morfología celular de melanocitos después de la irradiación UV diariamente durante tres días con 10 mJ/cm^{2} y enriquecidos con NGF 50 ng/ml. La Figura 2I muestra la morfología celular de células MM4 después de la irradiación UV una vez con 10 mJ/cm^{2} y enriquecidas con NGF 50 ng/ml.

Ejemplo 3 El factor de crecimiento nervioso rescata melanocitos lesionados que sufren apóptosis.

Se depositaron en placas melanocitos o células MM4 tal como se describe en el Ejemplo 1. Después de la irradiación, los melanocitos se mantuvieron en un medio basal de melanocitos que carecía de FBS e hidrocortisona, con NGF 50 ng/ml o diluyente solo (medio de melanocitos). Las células MM4 se mantuvieron en DME enriquecido con NGF 50 ng/ml o diluyente solo.

Veinticuatro horas después de la irradiación UV, las células enriquecidas con diluyente solo (-) mostraban fragmentación, mientras que el ADN de las células enriquecidas con NGF (+) no estaba fragmentado. El estándar (STD) es la escalera de ADN de 100 bp (Gibco/BRL). (Véase la Figura 3A).

Los melanocitos se irradiaron con 10 mJ/cm^{2} o se irradiaron ficticiamente como en el Ejemplo 1 y a continuación se les proporcionó NGF 50 ng/ml o diluyente solo. Veinticuatro horas después de la irradiación, aproximadamente el 30% de las células tratadas con diluyente pero solo el 12% de los cultivos enriquecidos con NGF mostraron núcleos positivos. Esto es, la tinción con yoduro de propidio fue positiva en aproximadamente el 30% de los núcleos en cultivos no enriquecidos con NGF pero positiva solo en el 12% de los núcleos en cultivos enriquecidos con NGF. (Véase la Figura 3B).

Ejemplo 4 Expresión en melanocitos de la proteína Bcl-2 después de la lesión con UV

Para determinar si el NGF induce la proteína Bcl-2, se irradiaron con UV células MM4 con 10 mJ/cm^{2} o se irradiaron ficticiamente y a continuación se enriquecieron con NGF o diluyente solo, tal como se explica en el Ejemplo 3. Veinticuatro horas después de la irradiación, las células se lavaron con PBS y a continuación se separaron con 0,5 mM de EDTA y se lavaron de nuevo con PBS. Se incubaron 10^{6} células con anticuerpo monoclonal de Bcl-2 anti-humano de ratón 3,25 \mug/ml (DAKO Co., Carpintería, CA) o con la misma concentración de igG de ratón normal (Cappel, Organon Teknika Co., West Chester, PA, USA) en PBS con Saponina al 0,3% (Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 4ºC. Después de tres lavados con PBS, las células se incubaron con IgG anti-ratón de cabra conjugada con fluoresceína (1 hora a 4ºC) (Cappel), se lavaron cuatro veces en PBS, se fijaron con formaldehído al 1% de nueva aportación, y se lavaron tres veces en PBS. Se determinó la intensidad de fluorescencia usando un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson, San Jose, CA).

Los resultados muestran que las células irradiadas con UV (Figura 4A) o irradiadas ficticiamente (Figura 4B), las células enriquecidas con diluyente solo, o las células ficticiamente irradiadas enriquecidas con NGF tenían solo bajos niveles de proteína Bcl-2 en el análisis FACScan. Sin embargo, el nivel de Bcl-2 era sustancialmente más alto en células sometidas a irradiación UV seguido de enriquecimiento con NGF (Figura 4A). (-) control de IgG de ratón; (...) diluyente solo; (...) NGF 50 ng/ml.

Las proteínas de cultivos por duplicado analizadas por borrones oeste confirmaron la inducción de Bcl-2 en células melanocíticas irradiadas con UV enriquecidas con NGF (Figura 4C). Las células MM4 se extrajeron en tampón RIPA (Tris-HCl [pH 8,0] 50 mM, NaCl 0,15 M, desoxicolato de sodio al 0,5%, Triton X-100 al 1%) en presencia de aprotinina 1 \mug/ml y de fluoruro de fenilmetilsulfonilo 75 \mug/ml, se sonicaron durante 1-3 segundos y centrifugado. Se separaron 45 \mug de proteína por línea en SDS/PAGE al 12% y se formaron borrones sobre papel de nitrocelulosa (durante la noche, 40V). Los borrones incubados con anticuerpo de Bcl-2 anti-humano 3,25 \mug/ml (DAKO) revelan una banda en el citado peso molecular de 25 kDa: (+) NGF 50 ng/ml, (-) diluyente solo.

Ejemplo 5 Estudios de inmunofluorescencia

Se pueden obtener biopsias por punción (6 mm de diámetro) de cueros cabelludos de pacientes, por ejemplo, con AA en parches, alopecia total, alopecia universal así como sitios sin implicar de pacientes de AA y controles de la misma edad y se congelan instantáneamente para estudios de inmunofluorescencia. La inmunotinción de tejidos recién congelados se compara con los tejidos fijados con formaldehído para determinar si el nivel de detección de antígeno es mejor en las secciones congeladas. Si los anticuerpos reconocen los antígenos fijados con formaldehído con la misma precisión que el antígeno no desnaturalizado, se pueden usar tejidos fijados con formaldehído para los estudios de inmunofluorescencia.

La inmunofluorescencia se realiza como se describe en Yaar, M., et al., Lab Invest. 58:157-162 (1988). Brevemente, secciones verticales de 4 \muM de grosor de muestras de biopsia se incubaron con el primer anticuerpo durante la noche a 4ºC. El segundo anticuerpo aplicado era el anticuerpo apropiado conjugado con isotiocianato de fluoresceína: IgG anti-ratón o anti-conejo de cabra (Cooper Biomedical). El segundo anticuerpo se incubó durante 30 minutos. La cuantificación se realizó por análisis de la intensidad de fluorescencia en el microscopio confocal Leica tal como se describe en Lu, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3889-3893 (1992). Las Figuras 5A y 5B muestran altos niveles de NGF-R p75 en melanocitos y queratinocitos bulbares de la vaina externa de la raíz en la porción inferior de pelos anagen. La Figura 5C muestra que los niveles de NGF-R p75 estaban significativamente reducidos o ausentes en melanocitos y queratinocitos de pelos telogen. Las Figuras 5D y 5E muestran que los niveles de NGF-R p75 eran significativamente menores o estaban ausentes en melanocitos y queratinocitos en pelos anagen de pacientes de AA.

Ejemplo 6 El aumento de NGF-R p75 en células melanocíticas enriquecidas con NGF aumenta la proteína BCL-2.

Para determinar el papel del NGF-R p75 para mediar en el efecto de supervivencia por NGF en células melanocíticas, se transfectaron células MM4 con 5 \mug de ADN del vector de expresión PCMV5A que lleva el cADN de NGF-R p75, además de, con 1 \mug de SV40 Neo de plásmido que lleva un gen resistente a neomicina. Los cultivos de control se transfectaron con 10 \mug de SV40 Neo de plásmido. Los cultivos se mantuvieron en DME enriquecido con G418 (geneticina) 50-100 ng/ml, sin suero, en presencia de NGF 50 ng/ml. Las proteínas celulares totales se extrajeron en tampón RIPA (Tris-HCl 50 nM [pH 8,0], NaCl 0,15 M, desoxicolato de sodio al 0,5%, Triton X-100 al 1%) en presencia de aprotinina 1 \mug/ml y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 75 \mug/ml, se sonicaron durante 1-3 segundos y se centrifugaron. Los borrones se incubaron con anticuerpo BCL-2 anti-humano (DAKO) 3,25 \mug/ml.

Los resultados mostrados en la Figura 6 demuestran que las células melanocíticas expresan constitutivamente las dos formas conocidas de la proteína BCL-2, BCL-2 alfa y BCL-2 beta. Sin embargo, los niveles de BCL-2 alfa y BCL-2 beta son sustancialmente más altos en células enriquecidas con NGF transfectadas con NGF-R p75 comparadas con las células de control enriquecidas con NGF, que indica que en presencia de NGF, más altos niveles de NGF-R p75 en las células contribuyen a su supervivencia.

Ejemplo 7 La disminución de NGF-R p75 en células melanocíticas enriquecidas con NGF anula el efecto del NGF sobre las células.

Para determinar adicionalmente el papel del NGF-R p75 al mediar el efecto de supervivencia con NGF en células melanocíticas, oligonucleótidos de NGF-R p75 antisentido y sin sentido (mezclados) de 19 mer se sintetizaron y se sulfuraron hasta la forma de fosforotioato. La secuencia antisentido se dirigió contra el extremo 5' de la región de codificación del NGF-R p75 humano (Johnson, D., et al., Cell, 47:545-554 (1986). Se usaron las siguientes secuencias: Antisentido 5'\rightarrow3' GGCACCTGCCCCCATCGCC (SEC. ID NO:1); Sin sentido 5'\rightarrow3' CTCCCACTCGTCATTC
GAC (SEC. ID NO:2) (control negativo).

Los melanocitos se mantuvieron en Medio 199 enriquecido con suero bovino fetal al 5% (FBS), factor de crecimiento epidérmico 10 ng/ml (Collaborative Research), transferrina 10 \mug/ml (Sigma), hidrocortisona 1,4 x 10^{-6} M (Calbiochem), toxina del cólera 10^{-9} M (Calbiochem), factor de crecimiento fibroblástico básico 10 ng/ml (Collaborative Research) (medio de melanocitos basales).

Se irradiaron células casi confluentes usando un simulador solar de arco de xenón de 1 kW (XMN 1000-21, Optical Radiation Corp., Azuza, CA) con 20 mJ/cm^{2} de UV a través de la cubierta de plástico de la placa petri. Se ajustó la irradiancia a 4 x 10^{-5} cm^{-2} de UV y se midió con un medidor de radiación 20 de investigación (modelo IL1700A, International Light, Newburyport, MA) provisto de una sonda de UVB a 285\pm5 nm. Después de la irradiación UV, las células se tripsinizaron e incubaron en suspensión a 37ºC durante 30 minutos con 10 uM de oligonucleótidos de NGF-R p75 antisentido y sin sentido.

Después de los 30 minutos iniciales de incubación las células se depositaron en placas de 35 mm en medio de melanocitos basal sin suero. Las células se enriquecieron con oligonucleótidos de nueva aportación cada 12 horas durante 48 horas. Las células se visualizaron por microscopía de contraste de fase y se obtuvieron fotos de los campos representativos. Se determinaron los rendimientos celulares contando células en varios campos representativos. Los resultados mostrados en la Figura 7 demuestran que en la ausencia de NGF-R p75 (NGF-R antisentido), el NGF no tiene un efecto en la supervivencia de melanocitos comparado con las células que expresan NGF-R p75 (NGF-R homosentido). Este experimento confirma el papel del NGF-R p75 al mediar los nuevos efectos del factor de crecimiento en células melanocíticas.

Ejemplo 8 La disminución de BCL-2 anula el efecto protector del NGF en células melanocíticas irradiadas con UV

Se compraron oligonucleótidos purificados con fosforotioato de Quality Controlled Biochemicals, Inc. (Hopkinton, MA). Se diseñaron oligonucleótidos de 19 mer basados en la publicada secuencia de BCL-2 humana (Tsujimoto, Y. and Croce, C.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5214-5218 (1986)). La secuencia escogida se dirigió contra el extremo 5' de la región de codificación que comienza cuatro bases antes del lugar de inicio de la metionina. Los oligonucleótidos sin sentido se usaron como control. Secuencias usadas (todas escritas 5'\rightarrow3'): Antisentido CC
CAGCGTGCGCCATCCTT (SEC. ID. NO: 3); Sin sentido CTCCCACTCGTCATTCGAC (SEC. ID NO: 4).

Las células MM4 se mantuvieron en placas de cultivo de tejido de 60 mm de diámetro en 55,3% DME, 27,6% L15, 15% FBS, 1% de aminoácidos esenciales (GIBCO BRL), 2 mM de glutamina y 10 \mug de insulina. Se irradiaron células casi confluentes con UV con 10 mJ/cm^{2}. Inmediatamente después de la irradiación las células se incubaron con 10 \muM de oligonucleótidos de BCL-2 antisentido y sin sentido en suspensión a 37ºC durante 30 minutos. A continuación las células se depositaron en placas de cultivo de tejido en presencia o ausencia de NGF (50 ng/ml). Las células se enriquecieron con oligonucleótidos de nueva aportación cada 12 horas. El rendimiento celular y el nivel de BCL-2 se determinaron 48 horas después de la irradiación. El rendimiento celular se determinó contando las células por lo menos en tres campos representativos para cada estado. La Figura 8 muestra los resultados de unos borrones oeste que demuestra que en presencia de oligonucleótidos de BCL-2 antisentido los niveles de BCL-2 son casi indetectables. Los rendimientos celulares de los cultivos irradiados con UV enriquecidos con NGF y oligonucleótidos antisentido (barra blanca) son significativamente más altos comparados con los cultivos enriquecidos con oligonucleótidos sin sentido provistos de diluyente solo (barra con puntos) (p<0,007, ANOVA). Los rendimientos celulares de cultivos enriquecidos con NGF tratados con oligonucleótidos antisentido de BCL-2 (barra negra) son significativamente más bajos que los cultivos enriquecidos con NGF provistos de oligonucleótidos sin sentido (barra blanca) que demuestra la anulación completa del efecto del NGF en las células (p<0,003, ANOVA). En los cultivos enriquecidos con diluyente los rendimientos de células tratadas con oligonucleótidos sin sentido (barra con puntos) fueron significativamente más altos que los de las células tratadas con oligonucleótidos antisentido (barra con trazos) (p<0,004, ANOVA). El aspecto morfológico de las células MM4 confirmó los datos numéricos del rendimiento celular. Este experimento demostró que la proteína BCL-2 es requerida para la supervivencia melanocítica después de la irradiación UV y que el NGF afecta a la supervivencia de células melanocíticas aumentando su nivel de BCL-2.

Ejemplo 9 Efecto de la irradiación UV en la muerte de células queratinocíticas

Se depositaron queratinocitos en placas de cultivo de tejidos de 60 mm de diámetro en MCDB153 enriquecido con factor de crecimiento epidérmico (recombinante humano 0,1 ng/ml), insulina (5 \mug/ml), hidrocortisona (0,5 \mug/ml), calcio (0,15 mM), extracto de pituitaria bovina (BPE) (2 ml por 500 ml de medio), gentamicina (50 \mug/ml) y antotericina B (50 ng/ml) (medio básico de queratinocitos). Se irradiaron células preconfluentes en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) usando un simulador solar de arco de xenón de 1 kW (XMN 1000-21, Optical Radiation Corp., Azuza, CA) con 15 ó 25 mJ/cm^{2} de UV a través de la cubierta de plástico de la placa petri tal como se describe en el Ejemplo 7. Después de la irradiación UV, las células se mantuvieron en su medio básico 3 días y se procesaron como se indica. Los cultivos de control ficticiamente irradiados se manejaron idénticamente pero se colocaron bajo un trapo oscuro adyacente al haz UV.

Las células se lavaron con PBS frío y se rompieron en un tampón de lisis de pH 8 (tris 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM, SDS al 1%, proteinasa K 200 \mug/ml). Después de 15 horas de incubación a 37ºC, las muestras se extrajeron dos veces con fenol más cloroformo (1:1, V/V y se precipitaron durante la noche con etanol (2,5 x volumen) y acetato de sodio 3 M (1/10 x volumen). El ADN se digirió a continuación con ribonucleasa libre de ADNasa (10 \mug/ml) durante una hora a 37ºC, se separó en gel de agarosa al 1% y se tiño con bromuro de etidio. Los datos muestran que la fragmentación del ADN, característica de la muerte celular apoptótica, ocurre en los queratinocitos irradiados con UV pero no en los ficticiamente irradiados.

Ejemplo 10 El factor de crecimiento nervioso mejora la supervivencia de queratinocitos humanos después de la lesión

Los queratinocitos se irradiaron con UV como en el Ejemplo 9. Después de la irradiación las células se colocaron en medio de queratinocitos de nueva aportación que contiene NGF 50 ng/ml o diluyente solo. La fragmentación del ADN se determinó como en el Ejemplo 9. La Figura 9A muestra que los queratinocitos irradiados con UV enriquecidos con diluyente solo (-) muestran la fragmentación de ADN característica, mientras que el ADN de las células irradiadas con UV enriquecidas con NGF (+) no está fragmentado. El estándar (STD) es la escalera de ADN de 100 bp (Gibco/BRL). El rendimiento de queratinocitos determinado diariamente durante 5 días como se muestra en la Figura 9B demuestra que en 24 horas hay una disminución del 50% del rendimiento celular en cultivos provistos de diluyente solo, pero disminuye en un 30% en cultivos provistos de NGF. Se detuvo el crecimiento de los queratinocitos irradiados con UV como se esperaba. Sin embargo, los rendimientos celulares de queratinocitos mantenidos en un medio enriquecido con NGF se incrementaron un 40% en los 5 días del experimento, lo que sugiere que el NGF es un mitógeno para los queratinocitos además de un factor de supervivencia. Este experimento demuestra que, igual que para los melanocitos, el NGF es un factor de supervivencia para los queratinocitos. Además, el experimento sugiere que el NGF puede ser también un mitógeno para los queratinocitos.

Ejemplo 11 Expresión de proteína BCL-2 en queratinocitos después de la pérdida de NGF

Para determinar si el NGF afecta al nivel de la proteína BCL-2 en los queratinocitos, las células se mantuvieron en medio básico de queratinocitos hasta que fueron 60-80% confluentes. A continuación a las células se les proporcionó un medio que carece de BPE para eliminar el NGF exógeno. A los cultivos por duplicado se les proporcionó NGF 50 ng/ml o diluyente solo.

Se extrajeron las proteínas totales de los queratinocitos, y se determinaron los niveles de BCL-2 por análisis de borrones oeste como en el Ejemplo 6. La Figura 10 muestra que 24 horas después del agotamiento del NGF se detectaron niveles de BCL-2 disminuidos en los queratinocitos enriquecidos con diluyente comparado con las células enriquecidas con NGF. Se observaron hallazgos similares a las 48 horas. Este experimento demuestra que el NGF contribuye, por lo menos en parte, al mantenimiento de BCL-2 en los queratinocitos.

La reivindicación adicional se refiere al uso de un material para la fabricación de un medicamento tal como se reivindica.

Claims (11)

1. Un método para prevenir la pérdida de células melanocíticas epidérmicas debido a la lesión melanocítica en un vertebrado, que comprende introducir en los melanocitos epidérmicos un oligonucleótido antisentido que es complementario del mARN celular que codifica el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 de tal modo que el oligonucleótido antisentido se hibrida con el mARN celular, para prevenir la traducción del mARN a la proteína receptora del factor de crecimiento nervioso p75; excluyendo los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o de un animal por medio de terapia.

2. Un método para prevenir la pérdida de células melanocíticas epidérmicas en un vertebrado, que comprende poner en contacto melanocitos epidérmicos no malignos con una substancia que se une al receptor del factor de crecimiento nervioso p75 expresado sobre la superficie de los melanocitos; excluyendo los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o de un animal por medio de terapia, en el que (a) la substancia es un factor de crecimiento nervioso en un vehículo aceptable; o (b) la substancia es un anticuerpo capaz de unirse al receptor del factor de crecimiento nervioso p75.

3. Un método para prevenir la pérdida de células melanocíticas en un vertebrado, que comprende las etapas de:

(a) insertar una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Bcl-2 en un vector de expresión capaz de expresar la proteína Bcl-2 codificada en una célula de vertebrado, para producir una construcción del vector de la proteína Bcl-2; e

(b) introducir la construcción del vector de la proteína Bcl-2 en melanocitos epidérmicos del vertebrado, para expresar la proteína Bcl-2 en los melanocitos epidérmicos y dando por ello como resultado el color del pelo; excluyendo los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o de un animal por medio de terapia

4. Un método para inducir el crecimiento de pelo en vertebrados, que comprende las etapas de:

(a) insertar una secuencia de nucleótidos que codifica el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 en un vector de expresión capaz de expresar la proteína receptora codificada en una célula de vertebrado, para producir una construcción del vector del receptor del factor de crecimiento nervioso p75; e

(b) introducir la construcción del vector del receptor del factor de crecimiento nervioso p75 en queratinocitos epidérmicos del vertebrado para provocar que se exprese el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 en los queratinocitos epidérmicos, y dando como resultado el crecimiento de pelo; excluyendo métodos para el tratamiento del cuerpo humano o de un animal por medio de terapia.

5. Un método para inducir (a) el crecimiento de pelo o (b) el color del pelo o de la piel en un vertebrado, que comprende las etapas de:

(a) insertar una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Bcl-2 en un vector de expresión capaz de expresar la proteína Bcl-2 codificada en una célula de vertebrado, para producir una construcción del vector de la proteína Bcl-2; e

(b) introducir la construcción del vector de la proteína Bcl-2 en queratinocitos epidérmicos o melanocitos epidérmicos respectivamente del vertebrado, para efectuar la expresión de la proteína Bcl-2 en los queratinocitos epidérmicos o en los melanocitos epidérmicos y producir el crecimiento de pelo o el color del pelo o de la piel; excluyendo los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o de un animal por medio de terapia.

6. Un método para inducir el color del pelo o de la piel en un vertebrado, que comprende introducir en los melanocitos epidérmicos un oligonucleótido antisentido que es complementario del mARN celular que codifica el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 de tal modo que el oligonucleótido antisentido se hibrida con el mARN celular, para prevenir la traducción del mARN a la proteína receptora del factor de crecimiento nervioso p75; excluyendo los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o de un animal por medio de terapia.

7. Un método para inducir el color del pelo o de la piel en un vertebrado, que comprende poner en contacto y unir una substancia que se une al receptor del factor de crecimiento nervioso p75 expresado sobre la superficie de los melanocitos con melanocitos epidérmicos no malignos; excluyendo los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o de un animal por medio de terapia, en el que (a) la substancia es el factor de crecimiento nervioso en un vehículo apropiado; o (b) la substancia es un anticuerpo capaz de unirse al receptor del factor de crecimiento nervioso p75.

8. Un método para identificar una substancia candidata para la inducción del crecimiento de pelo, la inducción de la coloración del pelo o la inhibición del crecimiento del pelo en un individuo, que comprende:

(a) poner en contacto melanocitos o queratinocitos con una substancia de interés;

(b) irradiar las células con luz UV; y

(c) determinar el efecto de la substancia en la apóptosis en melanocitos o queratinocitos;

en el que una substancia que afecta a la apóptosis en las células es una substancia candidata para la inducción de la coloración del pelo, la inducción del crecimiento del pelo, o la inhibición del crecimiento del pelo.

9. Un método para identificar una substancia candidata para la inducción del crecimiento del pelo, la inducción de la coloración del pelo o la inducción del crecimiento del pelo en un individuo, que comprende:

(a) poner en contacto melanocitos o queratinocitos con una substancia de interés;

(b) irradiar las células con luz UV; y

(c) determinar el efecto que la substancia tiene respectivamente en el aumento o disminución de la expresión de la proteína Bcl-2, siendo una substancia que aumenta la expresión de la proteína Bcl-2 una substancia candidata para la inducción de la coloración del pelo o la inducción del crecimiento del pelo, siendo una substancia que disminuye dicha expresión una candidata para la inhibición del crecimiento del pelo.

10. Un método para promover la apóptosis en queratinocitos en un vertebrado, comprendiendo poner en contacto los queratinocitos con una substancia tal como un anticuerpo que bloquea la unión del factor de crecimiento nervioso al receptor del factor de crecimiento nervioso p75 expresado sobre la superficie de los queratinocitos; excluyendo los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o de un animal por medio de terapia.

11. El uso de un material que comprende cualquiera de:

(a) un oligonucleótido antisentido complementario del mARN celular que codifica el receptor del factor de crecimiento nervioso p75; o

(b) una substancia que se une al receptor del factor de crecimiento nervioso p75 que se expresa sobre la superficie de los melanocitos o queratinocitos, por ejemplo, el factor de crecimiento nervioso (o uno de sus análogos) o un anticuerpo (monoclonal) del receptor p75 (por ejemplo, en un excipiente farmacéutico); o

(c) la proteína Bcl-2 o una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Bcl-2; o

(d) el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 o una secuencia de nucleótidos que codifica el receptor del factor de crecimiento nervioso p75; o

(e) un vector de expresión que comprende un gen del receptor del factor de crecimiento nervioso p75 o un gen de Bcl-2; y

(f) un anticuerpo que bloquea la unión del factor de crecimiento nervioso al receptor del factor de crecimiento nervioso p75 expresado sobre la superficie de los melanocitos o queratinocitos epidérmicos;

para la fabricación de un medicamento para: (i) el control terapéutico (por ejemplo, inducción o eliminación) del crecimiento de pelo y/o la pigmentación; o (ii) la prevención terapéutica de la pérdida de células melanocíticas epidérmicas debido a la lesión melanocítica; o (iii) el control terapéutico (por ejemplo, inducción o eliminación) de la pigmentación de la piel; o (iv) el tratamiento terapéutico de la alopecia areata o de la calvicie de patrón masculino; o (v) la promoción terapéutica de la apóptosis en queratinocitos.