ES2209391T3 - Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacarido acido sialico n-glicolilado-galactosa-glucosa en los tumores malignos y su composicion. - Google Patents
Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacarido acido sialico n-glicolilado-galactosa-glucosa en los tumores malignos y su composicion.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a la rama de la inmunología y de la medicina humana, en particular a la generación y selección de un anticuerpo monoclonal que recopnoce el oligosacarido ácido sialico N - glicolilo - galactosa - glucosa (N - GcNeu - Gal - Glu) present en tumores malignos. Uno de los objetos de esta invención es obtener un anticuerpo monoclonal de tipo igG1 que tiene la característica de reconocer con una gran especificidad la secuencia de oligosacárido ácido sialico N - glicolilo - galactosa - glucosa presente en tejidos de mamarios maligno así como en melanomas y tumores del hígado, el estómago, el colón, el recto y el riñón. También tiene la capacidad de provocar la histolisis directa en células tumorales que llevan dichas secuencias de oligosacárido y como consecuencia, puede utilizarse para el diagnóstico y el tratamiento de ciertas enfermedades neoplásicas. Otro objeto de la presente invención es conseguir el hibridoma que produce dicho monoclonal, así como la composición farmacéutica que lo contiene, para el tratamiento de enfermedades neoplásicas.
Description
Anticuerpo monoclonal que reconoce el
oligosacárido ácido siálico
N-glicolilado-galactosa-glucosa
en los tumores malignos y su composición.
La presente invención está relacionada con el
campo de la inmunología y la medicina humana, en concreto, con la
generación y selección de un anticuerpo monoclonal (Mab) frente a la
secuencia del oligosacárido ácido siálico
N-glicolilado-galactosa-glucosa
que puede utilizarse para el diagnóstico y tratamiento de ciertas
enfermedades neoplásicas.
Las estructuras de los oligosacáridos pueden
hallarse formando parte de glicoproteínas y glicolípidos. Ambos
están presentes en tejidos normales y patológicos.
La glicosilación aberrante ha sido descrita en
aproximadamente el 100% del neoplasma maligno. Cambios frecuentes
en la glicosilación aberrante son: la expresión de neoantígenos,
variaciones en la composición de las secuencias de oligosacáridos,
incremento o descenso de las moléculas de ácido siálico en los
oligosacáridos e incremento en la densidad de las moléculas de la
superficie de las células, entre otros (Hakomori S. H. et al. Curr.
Opin. in Inmmunol. 1991,(3) 646-653). Además de los
cambios que pueden hallarse en el mecanismo de las
sialiltransferasas, también hay variaciones en las hidroxilasas
dependientes N-acetiladas de ácido siálico.
Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que
contienen ácido siálico en su estructura y se caracterizan por estar
presentes en la mayoría de las células de los vertebrados. Estas
moléculas se encuentran en el tejido normal y puede tener una mayor
expresión en los tumores, con una organización y conformación
diferentes en la superficie de las células malignas (Hakomori, SH.
1985, Cancer Res. 45: 2405-2414; Miraldi, F., 1989,
Seminars in Nuclear Medicine, XIX,
282-294).
La respuesta inmune humoral contra antígenos de
carbohidratos es generalmente del isotipo IgM. Las secuencias de
oligosacáridos ligadas a lípidos son generalmente menos
inmunogénicas que las glicoproteínas. Por ello, el uso de
glicolípidos como inmunogen requiere su enlace con proteínas
transportadoras o su incorporación a liposomas o a bacterias como la
Micobaterium tuberculosis o R595 de Salmonella
minnesota.
La respuesta generada con los Gangliósidos es
independiente del timo. De esto han informado repetidamente
Livingston, et. al. (Livinston, P.O. et al., 1982, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84: 2911-2915; Livingston, P.O.
et al. 1989, Cancer Res. 49: 7045-7050). Las
características principales de los anticuerpos generados contra los
Gangliósidos cuando son estudiados en el suero de diferentes
especies son su baja afinidad, considerable inter reactividad y
corta vida (Livingston, P.O. 1991, inmunology and Allergyc
Clinics of North America, 11: 401-423;
Portoukalian, J. et al., 1991, Int. J Cancer, 49:
893-899).
La expresión de la forma
N-glicolilado en los oligosacáridos es común en
tejidos normales y patológicos de todas las especies de vertebrados,
excepto en pollos y humanos en los que sólo se encuentra en tejido
fetal y tumoral. Los tejidos normales de estas dos últimas especies
poseen sólo la variante N-acetilada (Nishimakit et
al. 1979, J. Immunology, 122: 2314; Higashi H. et al, 1985,
Cancer Res., 45: 3796).
El estudio de la composición de los
oligosacáridos en algunos tumores de humanos demuestra la presencia
de la forma N-glicolilada tanto en glicolípidos
como en glicoproteínas de células tumorales de melanoma
(Hirabayashi, Y, et al. 1987, J. Cancer Res., 78, 614
614-620; Saida T. et al. 1991 Arch. Dermatol.
Res. 282(3): 179-182; Kawashima I. et al.
1993, J. Biochem (Tokio) (2) 186-193;
Kawachi S. et al., 1992, J. Dermatol (11):
827-830), así como en tumores de colon,
especialmente en glicolípidos (Miyoshi, I., et al, 1986, Mol.
lmmunol. 23 (6): 631; Higashi H., et al, 1985, Cancer
Research, 45: 3796-3802). Además, se han
realizado estudios para demostrar la presencia de la forma
N-glicolilada de los Gangliósidos en muestras
tumorales del hígado, teratoma, linfoma, etc. (Kawai T. et al. 1991
Cancer. Res. (51) 1242-1246). Aunque en los
primeros casos, la concentración de la variante
N-glicolilada de los glicolípidos era inferior al
0,05% del ácido siálico total, Marquina y sus colaboradores
hallaron en tumores de mama valores aproximados al 10%de ácido
siálico ligado al lípido (Marquina, G. et al, 1996, Cancer
Res. 56: 5165-).
La generación de anticuerpos monoclonales contra
la variante N-glicolilada de los gangliósidos ha
proporcionado hasta la fecha anticuerpos del isotipo IgM que
generalmente reconocen más de una molécula de gangliósidos, por
ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos 2-39M
y 32-27M (Furukawa K., et at. 1988, J. Biological
Chemistry, 263: 18507) y los anticuerpos murinos GMR8 and GMR3
(Ozawa H. et al, 1992, Biochem. Biophys., 2(294):427).
Otros autores han informado sobre la generación de una especie
específica de anticuerpos antigangliósidos
N-glicolilados, siempre del isotipo IgM, entre los
que se encuentran los anticuerpos monoclonales
Y-2-HD1, contra NGcGM_{2} (Samai
Y. et al., 1988, Bioch Biophys. Act., 958, 368) y
MK2-34 contra la misma molécula (Miyake, M. et al,
1990, Cancer Res. 48, 6154).
No obstante, Watarai (Watarai, S. et al. 1995.
J. Biochem. 117, 1062) generó el anticuerpo monoclonal
SHS-1 contra los gangliósidos
N-glocolilados i-activos y Nakumara
obtuvo el anticuerpo monoclonal YK-3 contra
(NGc-NGc) GD1c (Nakumara et al, 1995, J. of Biolog. Chemist., 8 (270):3876). Recientemente Vázquez, et al., (Vázquez, A. M. et al, 1995, Hybridoma, 14, 6, 551) informó de la generación del anticuerpo monoclonal P3, que reconoce la mayoría de las moléculas Gangliósidas que contienen la forma N-glicolilada del ácido siálico, así como los glicolípidos sulfatados.
(NGc-NGc) GD1c (Nakumara et al, 1995, J. of Biolog. Chemist., 8 (270):3876). Recientemente Vázquez, et al., (Vázquez, A. M. et al, 1995, Hybridoma, 14, 6, 551) informó de la generación del anticuerpo monoclonal P3, que reconoce la mayoría de las moléculas Gangliósidas que contienen la forma N-glicolilada del ácido siálico, así como los glicolípidos sulfatados.
Nagai et al. han generado el anticuerpo
monoclonal HMA1 contra Gangliósidos (Nagai Y. et al. Patente US
4.965.198). Obtuvieron un anticuerpo monoclonal específico contra el
Gangliósido NGcGM2 a partir de ratones portadores de una enfermedad
autoinmune. Si bien informaron de varios de estos anticuerpos que
además reconocían otros Gangliósidos N-glicolilados
designados como PyK, YH02, YH03, YH04, YH05, YH06 y YH07.
Además, Yamasaki, M. et al., en su Patente US
4.942.131, informan de la generación de Mabs YH08, YH09, YH10 e
YHH11 contra el Gangliósido NGcGM3
4-O-Acetil, también en ratones con
enfermedad autoinmune.
También se han obtenido anticuerpos monoclonales
contra Gangliósidos empleando estas moléculas como lactones o a
partir de líneas de células que contenían Glangliósidos (Patentes US
5.308.614, 5.240.833, 5.389.530 y 5.500.215).
Igualmente, se han obtenido diferentes
anticuerpos monoclonales, tanto murinos como humanos, contra
gangliósidos GD3, GD2 y GM2, todos de la forma Nacetilada y la
mayoría de ellos de las subclases IgM e IgG3 (Pukel, C.S. et al.
1982, J. Exp. Med., 115: 1133-1147;
Hirabayashi, Y. et al. 1985, J. Biol. Chem., 260:
13328-13333; Solicitud de patente WO 86/00909;
Miyake, M. et al. 1988, Cancer Res., 48:
6154-6160; Kawashima, I. et al. 1992, Molecular
Immunology, 29, 625-632; Kotani,. M. et al.
1992, Biochimica et Biophysica Acta, 1117:
97-103).
La inmunoterapia pasiva con anticuerpos
monoclonales contra gangliósidos ha sido utilizada en ensayos
clínicos para el tratamiento de algunos tumores como los melanomas
y neuroblastomas. El tratamiento de melanomas ha sido
intra-lesión o sistémico y, aunque los resultados
parecen alentadores, sólo un reducido número de paciente mostró
remisiones totales o parciales (Houghton, A.N. et al., 1985,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1242; Dippold, W.G. et al,
1988, JCancer Clin. Oncol, 24: 865;
Vadhan-Raj, S. et al. 1988, J. Clin. Oncol.,
6: 1636; Saleh M.N. et al. 1992, Cancer Res., 52:
4332-4347).
Estos anticuerpos surtieron efecto en estudios de
citotoxicidad mediados por complementos o células (Ravindramath M.H.
et al. 1991, Inter. Rev. Immunol., 7, 303).
Hasta la fecha, todos los anticuerpos
monoclonales obtenidos contra gangliósidos
N-glicolilados son del isotipo IgM y la toxicidad
que provocan es mediada por complemento.
Los IgM generalmente presentan una baja afinidad
con los antígenos y es difícil utilizarlos para el diagnóstico o
tratamiento de Mabs radio etiquetados. Aunque fijan bien el
complemento y garantizan una buena citotoxicidad, la posibilidad de
purificación a gran escala es mucho más complicada que con el
isotipo IgG.
Además, se ha dicho muy poco sobre los
anticuerpos monoclonales contra las glicoproteínas
N-glicoliladas y la mayoría de ellos ha sido con
fines de diagnóstico.
Devine et al. describieron el anticuerpo
monoclonal 3E1.2 que reconoce una mucina
N-glicolilada (glicoprotéica) expresada en el 90%de
los tumores de mama estudiados por la inmunohistoquímica (Devine,
P.L. et al. 1991, Cancer Res. 51(21):
5826-36).
También se ha publicado un anticuerpo monoclonal
designado JAM3 que reconoce las formas N-acetiladas
y N-glicoliladas de una proteína 250 kD presente en
la superficie de los quistes producidos por el ataque de la
Entamoeba (Avron, B. et al. 1987, Mol Biochem Parasitol. (3):
257-266).
La novedad de la presente invención consiste en
haber obtenido un anticuerpo monoclonal altamente específico para la
secuencia del oligosacárido ácido siálico
N-glicolilado-galactosa-glucosa,
presente tanto en gangliósidos como en glicoproteínas. Además, la
característica de ser una inmunoglobulina del isotipo IgG lo hace
más específico y, por tanto, de mayor afinidad para las moléculas
que reconoce, favoreciendo su actividad biológica. De manera
inesperada, este anticuerpo demostró su capacidad para provocar la
muerte celular directamente en las células portadoras de dicha
secuencia de oligosacáridos.
Para obtener el glangliósido NGcGM3, se empleó
una modificación de la técnica de Hakomori. (Hakomori, S. et al.
1974, Methods in Enzymology, 32:, Parte B, 350), utilizando
fuentes naturales como eritrocitos de caballo. El rendimiento de la
extracción del Gangliósido NGcGM3 fue entre 180 y 300 mg por litro
de eritrocitos de caballo con una pureza superior al 90% corroborado
por la cromatografía de líquidos de alta eficacia de acuerdo con el
método de Gazzotti (Gazzotti, G. et al. 1985, J. of Chromatography,
348: 371-378).
Para obtener el inmunogen, el Gangliósido NGcGM3
es ligado hidrofóbicamente a las lipoproteínas humana de muy baja
densidad (VLDL) obtenidas de acuerdo con Dumontet et al.,
(Dumontet, C. et al.1994.Cancer lmmunol Immunother.
38:311-318).
Para obtener Mabs IgG
anti-gangliósidos, se empleó el siguiente método de
inmunización. Se inmunizaron ratones u otras especies mamíferas con
preparaciones de vacunas que contenían entre 0,03 y 0,5 mg del
Gangliósido NGcGM3 ligado a VLDL por dosis y un adyuvante
seleccionado de entre los siguientes: albúmina, adyuvante de Freund
completo o incompleto o Montanide ISA 51.
Antes y después del período de inmunización, se
extrajeron muestras de sangre de los animales para obtener suero con
el fin de monitorizar los anticuerpos generados en los animales
contra el Gangliósido empleado como antígeno. Con este fin se emplea
cualquiera de los métodos de inmunoensayos conocidos para detectar
la reacción antígeno-anticuerpo
(Ag-Ab).
Los animales son inmunizados con varias dosis,
entre 2 y 8 en intervalos de tiempo que varían entre 7 y 14 días. La
administración se realiza por vía subcutánea o intramuscular con
volúmenes comprendidos entre 0,1 y 0,2 mL. Otras vías posibles de
inmunización son la intravenosa y la intraperitoneal. Los animales
que recibieron esta gama de dosis muestran una respuesta específica
frente al Gangliósido utilizado como inmunogen. Entre el 70 y el
100% de los animales inmunizados tuvo una respuesta IgG específica
al gangliósido NGcGM3.
Para la producción de Mabs específicos contra el
gangliósido NGcGM3, los ratones con títulos de anticuerpos en suero
contra este gangliósido recibieron una nueva inmunización con la
preparación de la vacuna 3 días antes de obtener las células
productoras de anticuerpos. Las células del bazo deberían ser
preferentes, sí bien pueden utilizarse otras células.
Estas células se fusionan con células de mieloma,
que proporcionan las células híbridas o hibridomas con la capacidad
de expandirse indefinidamente "in vivo" e "in
vitro". Para ello, puede emplearse cualquiera de los métodos
de fusión de células conocidos. Para determinar los anticuerpos
producidos por los hibridomas, se emplea preferentemente un ensayo
inmunoenzimático. También pueden emplearse otros métodos de
inmunoensayos. El procedimiento de este ensayo es el reconocimiento
de los gangliósidos por supernatantes de hibridoma y la reacción
antígeno-anticuerpo puede visualizarse empleando un
segundo anticuerpo marcado con una enzima que se une al anticuerpo
producido por el hibridoma en condiciones adecuadas y que es, al
mismo tiempo, detectado.
El hibridoma, una vez seleccionado, es clonado al
menos 2 veces (por ejemplo, limitando la dilución). El Mab obtenido
puede producirse "in vitro" en un medio de cultivo
adecuado, como cualquiera de los descritos en el estado de la
técnica, y después purificado de dicho supernatante del cultivo de
tejido. En este caso, entre el 1 y el 8%de los clones secretores
eran específicos con el Gangliósido GM3
N-glicolil.
Otro método de producción de anticuerpos consiste
en la inyección del hibridoma en animales (por ejemplo, animales
singénicos). El hibridoma provoca la formación de tumores no
sólidos que proporcionan una gran concentración del anticuerpo
deseado en el riego sanguíneo y en el exudado peritoneal del huésped
animal.
La purificación de los anticuerpos monoclonales
se realiza a partir del fluido ascítico obtenido por la inoculación
de 0,2 x 10^{6} células del anticuerpo monoclonal que produce
hibridoma en la cavidad peritoneal de los ratones Balb/C, tratado
previamente con adyuvante de Freund como agente ascitogénico.
El fluido ascítico es diluido hasta la mitad en
una solución tampón de glicina 1,5 M, NaCL, 3M, pH 8,9 y es aplicado
a una matriz de proteína A-Sefarosa a un caudal de
flujo de 60 mL/h. La elución de Mab se efectúa empleando una
solución tampón de citrato 0,14 M, pH 6.
La concentración de Mabs purificados se calcula
por el método de Lowry (Lowry, G.H., 1951, J. Biol.
Chem.,
193: 256) y utilizando el coeficiente de absorción de la murina IgG1 a 280 nm. La especificidad es confirmada con ELISA.
193: 256) y utilizando el coeficiente de absorción de la murina IgG1 a 280 nm. La especificidad es confirmada con ELISA.
Se obtuvieron entre 2 y 5 mg de anticuerpo por mL
de ascitis; con un porcentaje de pureza superior al 95%. Esto fue
corroborado mediante cromatografía de líquidos de baja presión.
Para determinar la especificidad de los
anticuerpos monoclonales obtenidos, se realizan estudios
inmunoenzimáticos de los Mabs producidos en placas ELISA y en
cromatografía en capa fina empleando Gangliósidos
N-acetilados (GM1, GM2, GM3, GM1, GD1a, GD1b, GD3 y
GT1b) y N-glicolilados (GM3, GM2, GM1a, GM1b, GD1c y
GD3).
Para realizar la cromatografía en capa fina de
alta resolución de los glicolípidos, se emplea el sistema disolvente
(Cloroformo:Metanol:KCI 0,25% y 2,5 M HN_{3}) (5:4:1) (v:V). El
revelado químico con Orcinol realiza la visualización de las
bandas.
Las placas van revestidas de plástico con una
solución de poliisobutilmetacrilato y se secan al aire a
temperatura ambiente durante la noche. El bloqueo se realiza
durante aproximadamente 30 minutos con una solución de albúmina de
suero bovino del 1% disuelta en una solución tampón de fosfato
salino (PBS), pH 74. Posteriormente, los anticuerpos monoclonales se
incuban en la solución bloqueadora.
Seguidamente, las placas se lavan con PBS y se
añade la inmunoglobulina anti-ratón conjugada con
peroxidasa durante una hora. Las placas vuelven a lavarse y se
añade la solución del substrato de enzimas hasta que se visualizan
las bandas. Finalmente se comparan los revelados químico e
inmunológico. Como resultado, el IgG reconoció sólo el gangliósido
NGcGM3.
Para determinar sí los anticuerpos generados
producen la muerte de células directamente o por algunas de las
demás formas citotóxicas, se incuban 10^{7} cél/mL del mieloma de
murina P3X63 que contiene MGcGM3 a 4ºC y 37ºC respectivamente con el
anticuerpo monoclonal entre 0,01 y 1 mg/mL durante 30 minutos. Luego
se emplea en método azul Tripan para realizar los estudios de
viabilidad. El número de células muertas como consecuencia del
efecto de los anticuerpos puede contarse utilizando ioduro de
propidio o cualquier otro marcador de viabilidad.
Para estudiar la citotoxicidad mediada por
complemento, se emplearon 10^{7} células por mL; se añaden
anticuerpos monoclonales en concentraciones comprendidas entre 0,01
y 0,5 mg/mL. Se añade suero de conejo, que tiene elevadas
concentraciones de proteínas de complemento, a diluciones de 1/20 a
1/2 y se incuban durante 1 hora a 37ºC. La citotoxidad mediada por
complemento se determinó mediante recuentos de viabilidad tal como
se ha descrito antes o empleando el método de liberación Cr^{51}
en el que las células de mieloma radio etiquetadas P3X63 liberan al
supernatante del cultivo el isótopo cuando mueren.
La citotoxicidad directa se midió empleando
diferentes métodos que revelaron valores comprendidos entre el 50 y
85%de células muertas respecto del número total de células
estudiadas.
Los Mabs generados pueden utilizarse tanto para
diagnóstico como para tratamiento, marcados con un radio isótopo
como el 99mTc, Re 186 y Re 188. Schwarz y Steinstrasser (Schwarz A.
y Steinstrasser, A. 1987, J. Nucl. Med.
28: 721) han descrito el método para marcar anticuerpos monoclonales con radio isótopos que fue modificado por Mather y Ellison (Mather S.J. y Ellison D., 1990, J. Nucl. Med. 31: 692-697). El control de calidad del marcaje se realiza mediante cromatografía en papel Whatman 3MM. El porcentaje de marcaje obtenido fue de 98 y 100%.
28: 721) han descrito el método para marcar anticuerpos monoclonales con radio isótopos que fue modificado por Mather y Ellison (Mather S.J. y Ellison D., 1990, J. Nucl. Med. 31: 692-697). El control de calidad del marcaje se realiza mediante cromatografía en papel Whatman 3MM. El porcentaje de marcaje obtenido fue de 98 y 100%.
Para determinar el posible uso del Mab, se
inocularon 10 ratones con el tumor P3X63 y se emplearon otros 10
ratones como controles normales (no se inoculó ningún tumor). Se
esperó el tiempo necesario para que creciera el tumor y luego el Mab
14F7 marcado 99mTC fue inyectado por vía intravenosa a los 20
ratones.
La monitorización de la biodistribución de la
secuencia de anti-oligosacáridos se realiza en
grupos de 5 animales (5 sanos y 5 con tumor) 4 y 24 horas después
de la inyección. Los animales son sacrificados y se pesan los
principales órganos y tumores y se cuantifica la emisión gamma por
separado al final del estudio.
Los anticuerpos monoclonales se distribuyeron en
los animales sanos principalmente en la sangre, hígado y riñón,
mientras que en los animales con el tumor, el Mab se localizó en los
primeros órganos y, preferentemente, en el tumor a las 24
horas.
Los Mabs radioetiquetados, como se han descrito
en el estado de la técnica, pueden utilizarse para detectar tumores
donde se exprese la secuencia de oligosacáridos.
La radiactividad de todo el cuerpo puede
estudiarse con una Cámara Gamma. La adquisición de imágenes se
realiza a los 5 minutos y 1, 3, 5, 24 y 48 horas después de la
inyección de Mab. El Mab es localizado sólo en el tumor y en los
órganos excretores.
Los Mabs también pueden unirse directa o
indirectamente a otros agentes terapéuticos como fármacos, radio
isótopos, inmunomoduladores, lectinas y toxinas. Entre los
modificadores de respuesta biológica (inmunomoduladores) que, de
algún modo, pueden incrementar la destrucción del tumor por parte
del Mab de la presente invención se incluyen linfocinas como: Factor
de Necrosis Tumoral, Factor Activador de Macrófagos, Factor
Estimulador de Colonias, Interferonas, etc.
Se realizaron estudios inmunohistoquímicos con
fines de diagnóstico. Las secciones de tejido se fijaron en una
solución de formalina tamponada del 10% y deshidratada, clarificada
y embebida en parafina. La histopatología fue estudiada en secciones
de tejido teñidas con Hematoxilina-Eosina.
Las secciones serie de los bloques de parafina
empleados para el estudio histopatológico se inmunotiñeron empleando
el método de complejo
biotina-estreptavidina-peroxidasa,
descrito anteriormente (Hsu, S. M. y Raine, L., 1981, J.
Histochem Cytochem. 29: 1349-1353).
Las secciones desparafinadas y deshidratadas se
trataron con una solución de metanol de peróxido de hidrógeno del 3%
durante 30 minutos para eliminar la actividad de la peroxidasa
endógena. Las secciones de tejido se incubaron con los Mabs
purificados. Seguido por anticuerpos anti-ratón
biotinilados y complejo estreptavidín-peroxidasa
(Dakopans) a temperatura ambiente.
Entre las incubaciones, las secciones se lavaron
con una solución tampón salina Tris-HCI. La reacción
de la peroxidasa se reveló con 30% H_{2}O_{2} y
3-3 diaminobencidina.
Los portaobjetos se lavaron con agua del grifo,
se tiñeron con Hematoxilina de Mayer, se montaron con bálsamo y se
cubrieron con cubre objetos. La reacción con la enzima produce un
color marrón rojizo.
Se estudiaron tejidos humanos de mama, pulmón,
piel y del sistema nervioso así como tejidos fetales y adultos
normales.
Se obtuvieron biopsias limpias de tejidos
patológicos durante la primera hora después de la intervención
quirúrgica. Los fragmentos de las biopsias fueron congelados,
posteriormente se seccionaron y los porta objetos se almacenaron
congelados hasta que se realizó el estudio.
La utilización de tejidos fetales para el estudio
se debe al hecho de que en repetidas ocasiones se ha informado de la
asociación de los Gangliósidos con antígenos oncofetales, así como
la similitud de estas moléculas en humanos fetales y tumorales
(Cahan, L. et al. 1982 Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79:
7629-7633).
Las secciones de tejido fetal se obtuvieron de
fetos de entre 12 y 18 semanas.
Los fragmentos de tejido adulto normal se
obtuvieron de sujetos fallecidos en accidentes y/o de muerte
encefálica durante la primera hora después del exitus
letalis.
Entre los tumores estudiados, los tumores de
pulmón y del sistema nervioso central de diferente etiología
resultaron negativos, así como las secciones de tejidos humanos
normales. Mientras que las secciones de tejido de melanomas y
tumores de mama resultaron todas positivas, así como las secciones
de tejido fetal del sistema digestivo (hígado, estómago, intestino
delgado y grueso) y el sistema renal.
Para demostrar el efecto antitumoral de los
anticuerpos monoclonales contra los Gangliósidos NGcGM3, los
animales inoculados con el tumor portador del Gangliósido objetivo
(mieloma P3X63) fueron tratados con los anticuerpos obtenidos. La
dosis puede variar de 0,01 mg/kg de peso a 200 mg/kg de peso en
administraciones de una o más diarias durante uno o varios días. Los
anticuerpos pueden administrarse por inyección parenteral
(intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea,
intracavitaria o transdérmica).
En un experimento típico, los ratones tratados
con el anticuerpo tienen un índice de supervivencia comprendido
entre el 30 y el 80% comparado con los ratones de grupo de control,
corroborado por el test Log Ram (Cox y Oakes (1984) Analysis of
survival Data edits. Chapman Hall). Se hallaron diferencias
significativas (< 0,05%) entre el grupo tratado con el Mab y el
grupo de control.
Se inyectó vía intramuscular a ratones Balb/C
hembras de 6-8 semanas 0,2 mg de la preparación de
vacuna humana NGcGM3/VLDL, con el adyuvante de Freund completo en la
primera dosis y el adyuvante de Freund incompleto en las siguientes
dosis (producido por SIGMA) mezclado en volúmenes iguales. Cada
animal recibió 6 dosis. Las primeras 4 dosis semanalmente y las 2
dosis restantes cada 14 días. Las extracciones de sangre se
realizaron antes de la primera dosis y cada 2 semanas.
Los niveles de anticuerpo se midieron en el suero
de los animales empleando un ELISA indirecto en placas Polysorp
(marca comercial Nunc), donde se inmovilizaron los Gangliósidos
siguiendo el método descrito a continuación:
Los Gangliósidos NAcGM3 y NGcGM3 se disolvieron
por separado en metanol (4 \mug/ml) y se añadieron
50 \mug/pocillo. La placa se colocó a 37ºC durante una hora y media para evaporar el metanol. Después, se añadieron 100 ml/pocillo de TRIS-HCI 0,05M, solución tampón pH 7,8, que contenía un 2% de albúmina de suero bovino (BSA) y se dejó incubar durante una hora a temperatura ambiente. Luego, se diluyeron 50 \mul del suero en la misma solución tampón y se dejó incubar toda la noche a temperatura ambiente.
50 \mug/pocillo. La placa se colocó a 37ºC durante una hora y media para evaporar el metanol. Después, se añadieron 100 ml/pocillo de TRIS-HCI 0,05M, solución tampón pH 7,8, que contenía un 2% de albúmina de suero bovino (BSA) y se dejó incubar durante una hora a temperatura ambiente. Luego, se diluyeron 50 \mul del suero en la misma solución tampón y se dejó incubar toda la noche a temperatura ambiente.
Los pocillos se lavaron 4 veces con 200 \mul de
una solución tampón salina de fosfato (PBS) y se añadieron 50 \mul
de un antisuero de inmunoglobulinas anti-ratón
conjugado con biotina en una dilución adecuada durante una hora y
media a 37ºC.
Tras un nuevo lavado con PBS, se añadieron 50
\mul de una dilución adecuada de estreptavidin de fosfatasa
alcalina. Finalmente, se realizó el último lavado y se disolvieron
100 \mul de substrato de p-nitrofenilfosfato en
solución tampón de dietanolamina, pH 9.8 (1 mg/ml). La absorbancia
se midió en un lector ELISA a 405 nm.
La Figura 1 muestra los resultados de O.D. a 405
nm del suero de cada animal diluido 1/80 en el día 56 del
experimento. La respuesta contra el NGcGM3 y GM3 fue determinada por
ELISA empleando un conjugado anti IgG de ratón biotinilado y
estreptavidin de fosfatasa alcalina de Jackson.
Más del 70% de los animales inmunizados con la
preparación de la vacuna tenían valores a O.D. 405 nm por encima de
0,5 contra el NGcGM3. Todos los animales inmunizados mostraron
respuesta IgG contra el NGcGM3, sin ninguna respuesta observada al
NAcGM3, a pesar de la mínima diferencia entre estas dos
moléculas.
La Figura 2 muestra la respuesta específica
sostenida de los anticuerpos (isotipo IgG) contra el Gangliósido
NGcGM3, tres meses después de recibir la última dosis de
inmunización, sin respuesta mostrada contra el NAcGM3.
Los anticuerpos fueron generados inmunizando
ratones Balb/C empleando el procedimiento descrito en el Ejemplo
1.
Tres días antes de la fusión, los animales
volvieron a inmunizarse con el inmunogen NGcGM/VLDL, utilizando el
adyuvante completo de Freund. Posteriormente, se obtuvieron los
bazos de los ratones y una suspensión celular preparada pasando el
tejido por un tamiz de acero inoxidable o por perfusión del bazo. La
fusión celular se realizó como describen Köhler y Milstein (Nature,
1975, Nº 256, 495-497) con algunas
modificaciones.
Las células del mieloma de murina Ag8 6.5.3.
P3/X63 no secretor se fusionaron con los esplenocitos de murina en
una proporción de 1:10, en 0,5 mL de medios de fusión que contenían
un 42% de polietilenglicol (3000-3600 Sigma) en
medios RPMI 1640.
Las células se cultivaron en medios selectivos
HAT (hipoxantina/aminopterina/timidina) a 37ºC con una atmósfera
húmeda del 5% de CO_{2}, después de la fusión celular.
Entre 10 y 15 días después de realizar la fusión
celular, se inició el ensayo para detectar la presencia de
anticuerpos en el supernatante de los cultivos de células del
hibridoma empleando la técnica ELISA del ejemplo 1.
Las células del hibridoma del cultivo que
reaccionaron con el gangliósido motivo de estudio fueron
seleccionadas y clonadas dos veces por el método de dilución
limitadora en presencia de células condicionantes.
La especificidad de los anticuerpos producidos
por los hibridomas seleccionados fue determinada empleando la
técnica ELISA indirecta con una batería de glicolípidos.
El número de clones específicos contra el
Gangliósido NGcGM3 fue de 5,5%. Uno de los clones obtenidos fue
denominado 14F7.
Para determinar la subclase de inmunoglobulina
del anticuerpo monoclonal de la presente invención, se empleó un
ELISA indirecto en placas cubiertas de NGcGM3 como se describió en
el ejemplo 1, pero sustituyendo el suero por diluciones del
supernatante del hibridoma o del Mab purificado.
Se añadieron Mabs murinos Anti IgG1, IgG2a, IgG2b
e IgG3 conjugados con biotin producidos en ratas (Pharmigen)
diluidos en solución tampón de incubación. Tras una hora de
incubación a 37ºC, las placas se lavaron y se añadió estreptavidin
conjugado con fosfatasa alcalina diluido en la solución tampón de
incubación. Como controles de cada subclase, se emplearon Mabs
murinos previamente caracterizados.
Finalmente, se añadió la solución de substrato.
Se efectuó la lectura de absorbancia como se ha descrito
anteriormente. La Figura 3 muestra que el Mab 14F7 pertenece ala
subclase IgG1.
Se empleó la cromatografía en capa fina de alta
resolución para separar los glicolípidos. El sistema disolvente
empleado fue Cloroformno: Metanol: KCL 0,25% y 2,5 M de NH3 (5:4:1)
v: v. Las bandas se visualizaron mediante el revelado químico con
Orcinol (Svennerholm L., 1964, J. Lipid. Res., 5, 145). Mientras que
para la inmunotinción se empleó el método de Kawashima Y. Y col.
1993 (J. Biochem, 114, 186).
Las placas donde se realizaron previamente las
cromatografías en capa fina eran de plástico recubiertas por
inmersión durante 75 segundos en una solución de 0,1% de
poliisobutilmetacrilato (PIBM) en N-hexano. Las
placas luego se secaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Luego se aplicó una solución PIBM del 1% en los bordes de las placas
manteniéndolas toda la noche a temperatura ambiente.
El bloqueo de interacciones no específicas se
realizó aplicando durante 30 minutos una solución de albúmina de
suero bovino del 1% disuelta en PBS pH entre 7,2 y 7,4.
Inmediatamente después de que las placas fueran incubadas con el Mab
14F7 a una concentración de entre 0,01 y 0,02 mg/ml en la solución
bloqueadora.
Las placas se lavaron con PBS y se incubaron con
antisuero de inmunoglobulinas anti-ratón conejo
conjugado con peroxidasa de rábano diluido en la solución tampón
bloqueadora.
Tras una hora de incubación removiendo a
temperatura ambiente, las placas se lavaron nuevamente y se añadió
la solución de substrato consistente en 0,4 mg/mL de
ortofenilendiamina (C6H8N2) Sigma en una solución tampón de
citrato-fosfato 80 mM pH 5 con 0,12% de Peróxido de
Hidrógeno (H2O2) (Riedel de Haen). La reacción se detuvo con lavados
repetidos con solución tampón de fosfato.
La reacción mostró especificidad sólo para los
Gangliósidos NGcGM3 y no se observó reacción alguna para el resto de
gangliósidos N-glicolilados evaluados como GM1a,
GM1b, GM2 y N-Acetilado (Figuras 4 y 5).
Las secciones de tejido se fijaron en una
solución de formalina tamponada del 10%y deshidratada, clarificada y
embebida en parafina. La histopatología fue estudiada en secciones
de tejido teñidas con Hematoxilina-Eosina.
Las secciones serie de los bloques de parafina
empleados para el estudio histopatológico se inmunotiñeron
empleando el método de complejo
biotina-estreptavidina-peroxidasa,
descrito anteriormente (Hsu, S. M. y Raine, L., 1981, J.
Histochem Cytochem. 29: 1349-1353).
Las secciones desparafinadas y deshidratadas se
trataron con una solución de metanol de peróxido de hidrógeno del 3%
durante 30 minutos para eliminar la actividad de la peroxidasa
endógena. Las secciones se incubaron con el Mab 14F7 purificado
durante una hora a temperatura ambiente. Seguido por anticuerpos
anti-ratón biotinilados y complejo
estreptavidín-peroxidasa (Dakopans) a temperatura
ambiente.
Entre las incubaciones, la secciones se lavaron
con una solución tamponada salina de Tris-HCl. La
reacción de peroxidasa se reveló con 5 mL de una solución tamponada
de Tris, 0,005 mL de 30% H_{2}O_{2} y 3mg de 3-3
diaminobencidina.
Los portaobjetos se lavaron con agua del grifo,
se tiñeron con Hematoxilina de Mayer, se montaron con bálsamo y se
cubrieron con cubre objetos. La reacción con la enzima produce un
color marrón rojizo.
Los fragmentos de tejido adulto normal se
obtuvieron de sujetos fallecidos en accidentes y/o de muerte
encefálica durante la primera hora después del exitus
letalis. Se obtuvieron biopsias limpias de tejidos patológicos
durante la primera hora después de la intervención quirúrgica. Las
secciones de tejido fetal se obtuvieron de fetos de entre 12 y 18
semanas durante la primera hora después del aborto inducido. Todos
los fragmentos de biopsia se lavaron en solución salina y se
congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a
-80ºC.
Se obtuvieron secciones serie de 5 \mum de los
fragmentos congelados en un criostato Leica a -25ºC. Las secciones
se secaron con aire y se utilizaron inmediatamente o se almacenaron
a -20ºC envueltas en papel de aluminio. En un caso, los porta
objetos se fijaron en el momento de ser usados en paraformaldehído
al 4% durante 20 minutos.
La Figura 6 muestra es estudio inmunohistoquímico
del Mab 14F7 en tejidos humanos normales. No se observa reactividad
del Mab en la membrana ni en la región citoplásmica de los
tejidos.
La Figura 7 muestra el mismo estudio para tejidos
patológicos. Todos los tejidos de mama (33/33) y de melanoma (20/20)
estudiados resultaron positivos. Mientras que 70 tumores de pulmón
de diferente etiología resultaron negativos, así como 33 tumores
diferentes del sistema nervioso central.
La Figura 8 muestra el reconocimiento del Mab
14F7 de los tejidos fetales del sistema digestivo y renal.
Las líneas de células estudiadas fueron el
mieloma murino P3X63 que expresa GM3 y NGcGM3 descrito por J.
Muthing et al. (Muthing, J. et al., 1994, J. Biochem 116:
64-73) y el mieloma B16 que expresa GM3. Las células
se cultivaron en medios RPMI con suero fetal bovino al 8%. Las
células se ajustaron a una concentración de 10^{7} células/mL de
una solución de fosfato salino pH 7.4 que contenía 0,02%de azida de
sodio y 1% de albúmina de suero bovino. En cada tubo se añadió 0,1
mL de la suspensión de células seguido de 0,05 mL de la solución de
Mab 14F7 disuelta en una solución tampón de fosfato salino para
obtener una concentración final de 0,1 mg/mL y se incubó durante 30
minutos a 4ºC. Las células luego se lavaron con la solución que
fueron disueltas.
Luego los cultivos celulares se centrifugaron
durante 5 minutos a poca velocidad para precipitar las células.
Seguidamente se añadió y se lavó el conjugado (Jackson) de biotín
anti-ratón (IgG+IgM) después de 30 minutos de
incubación a 4ºC. Finalmente se añadieron 0,002 mg de estreptavidin
fluresceína (FITC) (Jackson) y se incubó en las misma condiciones
que antes. Se efectuó entonces el último lavado, esta vez con la
solución tampón de fosfato salino.
Se eliminó el supernatante después del último
centrifugado y las células se resuspendieron en 0,6 mL de la última
solución de lavado.
Un 80% de las células de la célula de mieloma
P3X63 se tiñeron positivas con el anticuerpo monoclonal 14F7 (Figura
9).
La línea de células de mieloma murino P3X63 fue
incubada con el Mab 14F7 como se ha descrito en el Ejemplo 6. Tras
el lavado, se añadió a las células 0,01 mL de una solución de ioduro
de propidio en una solución tampón de fosfato salino para determinar
la viabilidad celular empleando la citometría de flujo.
Los resultados revelaron que el 78% de las
células murieron (Figura 10).
Veinte ratones Balb/C hembras con un peso entre
20 y 22 g (10 sanos y 10 con el tumor de Mieloma P3X63 inoculado vía
intraperitoneal) recibieron una inyección intravenosa del Mab 14F7
marcado 99mTc.
La relación de concentración de marcaje fue de
0,03 mg del Mab14F7/60 \muCi de 99mTc.
Los resultados de la cuantificación de
radiactividad en los diferentes órganos se realizaron en 5 animales
de cada grupo, a las 4 y 24 horas después de la inyección. Se
sacrificó a los animales y se midió el peso de cada órgano en una
balanza Sartorius. La radiactividad de todos los tubos se determinó
inmediatamente aproximadamente 25 horas después de comenzar el
experimento, en un contador gamma WALLAC (modelo WIZARD 1470).
El método de marcaje fue descrito previamente por
Schwarz y Steinstrasser (1987) y modificado por Muther y Ellison en
1990.
El Mab marcado 14F7 fue eliminado en los ratones
sanos a través del riñón y el hígado (Figura 11).
En los ratones portadores del tumor de Mieloma
P3X63 se reveló la unión del Mab 14F7 a las 4 horas (12% de
radiactividad total inyectada por gramo de tejido) a y las 24 horas
(35% de radiactividad total inyectada por gramo de tejido). La
eliminación del Mab fue principalmente a través de los riñones
(Figura 12).
Ratones hembra Balb/C con un peso de
20-22 g fueron inyectados vía intravenosa con 6
dosis de anticuerpo monoclonal 14F7 (un grupo con 0,1 y un segundo
grupo con 0,2 mg) cada 2 días, en una solución tampón de fosfato
salino. Tres días antes del experimento, la cavidad peritoneal fue
irritada con adyuvante de Freund incompleto para favorecer el
momento en el que el tumor se hace mensurable. La cantidad de 10.000
células de Mieloma murino P3X63 fue inoculada el día 0 del
experimento vía intraperitonal, al mismo tiempo que comenzaba la
terapia pasiva con anticuerpo monoclonal 14F7, aunque fue inoculado
vía intravenosa. Si bien el control de buena prognosis (mejor
tratamiento) empleado por comparación fue un tercer grupo tratado
vía intravenosa con Ciclofosfamida (Shangai Hua Lian Pharmaceutical
Corp.) a una dosis de 20 mg/kg de peso corporal, consistente en una
dosis semanal durante todo el experimento. Se empleó el tratamiento
intravenoso con solución tamponada de fosfato salino, pH 7,4 como
control del experimento.
La Figura 13 muestra los resultados de
supervivencia en los 4 grupos descritos anteriormente. En los grupos
tratados con 14F7 (0,1 y 0,2 mg) y con 20 mg/kg de peso de
Ciclofosfamida no se apreció ningún tumor mesurable en algunos
animales.
Los resultados de supervivencia favorecieron a
los grupos tratados con Mab 14F7. El día 30 del experimento, aunque
no vivía ninguno de los animales del grupo de control, 6 animales
seguían aún con vida, tanto del primer grupo (0,1 mg del Mab) como
del grupo tratado con Ciclofosfamida y 7 animales del segundo grupo
(0,2 mg del Mab). A los 60 días de tratamiento, 2 animales del
primer grupo y 2 animales del grupo tratado con Ciclofosfamida aún
vivían, mientras que del segundo grupo 5 animales aún seguían con
vida.
Diez ratones atímicos hembra, de los NMRI
nacidos, con un peso entre 20 y 22 gramos fueron inoculados vía
subcutánea con 10^{6} células de la línea tumoral del Mieloma
murino P3X63 el día 0 del experimento. Los animales se dividieron en
dos grupos de 5.
Un grupo comenzó el tratamiento vía
intraperitoneal con el Mab 14F7 purificado, 0,15 mg por dosis (6
dosis) cada 2 días. Mientras que el otro grupo actuó como control y
recibió por la misma vía y el mismo número y frecuencia de dosis de
igual volumen de solución tampón de fosfato salino.
La Figura 14 muestra la inhibición del
crecimiento de los tumores en los ratones tratados con el Mab 14F7
con respecto al grupo de control. Se observaron diferencias
significativas entre los dos grupos.
Figura 1: Muestra los niveles de anticuerpos de
suero obtenidos contra el NGcGM3 y no contra el GM3 en día 56 del
experimento, en ratones inmunizados con la preparación de la vacuna
de adyuvante de Freund completo NGcGM3/VLDL.
Figura 2: Determinación mediante ELISA del
isotipo de la respuesta de anticuerpos contra el Gangliósido NGcGM3
en el suero de los ratones 3 meses después de recibir la cuarta
dosis de 0,2 mg de NGcGM3/VLDL/Freund Completo.
Figura 3: Determinación mediante ELISA de la
subclase (IgG) de inmunoglobulina de anticuerpos monoclonales
14F7.
Figura 4: Reconocimiento mediante inmunotinción
empleando la cromatografía en capa fina de gangliósidos
N-glicolilados y N-acetilados que se
utilizaron durante el estudio de la especificidad del anticuerpo
monoclonal 14F7.
Figura 5: Reconocimiento del Gangliósido NGcGM3
por el anticuerpo monoclonal 14F7 mediante inmunotinción sobre
cromatografía en capa fina.
Figura 6: No reconocimiento de tejidos adultos
normales por el anticuerpo monoclonal 14F7 en estudios
inmunohistoquímicos.
Figura 7: Reconocimiento inmunohistoquímico de
algunos tumores humanos malignos y benignos por el anticuerpo
monoclonal 14F7.
Figura 8: Reconocimiento inmunohistoquímico de
tejido fetal humano normal por el anticuerpo monoclonal 14F7.
Figura 9: Reconocimiento de la línea de células
del Mieloma P3X63 que expresa el Gangliósido MGcGM3 por el Mab 14F7
empleando la Citometría de Flujo.
Figura 10: Efecto citotóxico independiente del
complemento del Mab 14F7 empleando la línea de células del Mieloma
P3X63 mediante la técnica de ioduro de propidio con citometría de
flujo.
Figura 11: Biodistribución del anticuerpo
monoclonal 14F7 marcado 99mTc. Resultados de porcentaje de radiación
gamma con respecto al peso en gramos del órgano estudiado en ratones
Balb/c normales.
Figura 12: Biodistribución del anticuerpo
monoclonal 14F7 marcado 99mTc. Resultados de porcentaje de radiación
gamma con respecto al peso en gramos del órgano estudiado en ratones
Balb/c portadores del tumor de Mieloma P3X63.
Figura 13: Efecto antitumoral de la terapia
pasiva del anticuerpo monoclonal 14F7 en grupos de ratones Balb/c
inoculados con el tumor de Mieloma ascítico murino P3X63, tratados
con 0,1 y 0,2 mg de dicho anticuerpo, comparado con un grupo de
control tratado con 20mg/kg de Ciclofosfamida y un grupo de control
con PBS.
Figura 14: Inhibición del crecimiento tumoral
"in vivo" del tumor de Mieloma sólido murino P3X63 en
ratones atímicos de los NMRI nacidos.
Claims (11)
1. Anticuerpo monoclonal generado contra el
gangliósido NGcGM3 que reconoce específicamente la secuencia de
oligosacárido de ácido siálico
N-glicolilado-galactosa-glucosa
en gangliósidos y glicoproteínas, es de la subclase IgG1 y produce
actividad citolítica de las células tumorales portadoras de dicha
secuencia.
2. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que dicha actividad citolítica de las células
tumorales portadoras de la secuencia de oligosacárido de ácido
siálico
N-glicolilado-galactosa-glucosa
puede ser dirigida o mediada por complemento.
3. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 2 que es denominado 14F7, obtenido a partir del
hibridoma del mismo nombre y depositado bajo el número de acceso
provisional 98101901 en la Colección de Cultivos Celulares Europeos
ECACC, Reino Unido el 19 de octubre de 1998.
4. Hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal
de la reivindicación 3 depositado bajo el número de acceso
provisional 98101901 en la Colección de Cultivos Celulares Europeos
ECACC, Reino Unido, el 19 de octubre de 1998.
5. Una composición farmacéutica que contiene una
cantidad del anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones 1 a 3 y
que, además, contiene un diluente o un excipiente adecuado.
6. Una composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 5 donde dicho anticuerpo puede unirse a agentes
terapéuticos como fármacos, radio isótopos, inmunomoduladores,
lectinas y toxinas.
7. Una composición farmacéutica de acuerdo con
las reivindicaciones 5 y 6 destinada al tratamiento de neoplasmas
malignos.
8. Una composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 7 para el tratamiento del cáncer de mama, renal, del
sistema digestivo y melanoma humano.
9. Un reactivo que contiene el anticuerpo
monoclonal de las reivindicaciones 1 a 3 unido a marcadores como las
enzimas, cromóforos, materiales quimioluminiscentes y
radionucleótidos.
10. Un reactivo de acuerdo con la reivindicación
9 para la detección de células tumorales.
11. Un reactivo de acuerdo con la reivindicación
10 para la detección de células tumorales humanas de melanomas,
mama, riñones y sistema digestivo como el hígado, colon, estómago y
recto.
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