ES2207679T3

ES2207679T3 - Uso de fibroplastos dermicos autologos para la reparacion de los defectos de la piel y de los tejidos blandos.

Info

Publication number: ES2207679T3
Application number: ES96923640T
Authority: ES
Inventors: William K. Boss, Jr.
Original assignee: Isolagen International SA
Current assignee: Isolagen International SA
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1996-07-03
Publication date: 2004-06-01
Anticipated expiration: 2016-07-03
Also published as: IL123077A; JP3962715B2; JPH11510069A; EP0845963A4; AU6451696A; DE69630129D1; AU698440B2; MX9800788A; NO317738B1; BR9610028A; ATE250399T1; CN1198090A; KR19990035989A; EP0845963B1; EP0845963A1; DK0845963T3; US5665372A; US5858390A; US5591444A; CA2228138C

Abstract

LA APLICACION SE REFIERE A UN METODO PARA REPARAR TEJIDO SUBCUTANEO O DERMICO EN UN SUJETO. EL METODO IMPLICA LA PREPARACION DE FIBROBLASTOS DERMICOS CULTIVADOS A PARTIR DE UN ESPECIMEN OBTENIDO DEL SUJETO Y LA INYECCION DE LA PREPARACION DE FIBROBLASTOS, SUSTANCIALMENTE LIBRE DE PROTEINAS INMUNOGENAS, PARA REPARAR EL TEJIDO SUBCUTANEO O DERMICO. EL METODO ES APLICABLE A LA REPARACION DE RITIDES, MARCAS DE ESTIRAMIENTO, CICATRICES CON DEPRESION Y DEPRESIONES CUTANEAS NO TRAUMATICAS ASI COMO AL AUMENTO COSMETICO DE LOS LABIOS.

Description

Uso de fibroplastos dérmicos autólogos para la reparación de los defectos de la piel y de los tejidos blandos.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a la reparación de los defectos de la piel y los tejidos blandos, incluyendo las arrugas, en sujetos humanos. Más particularmente, se refiere a una sustancia nueva para uso en técnicas no quirúrgicas que aumenta el volumen de la dermis o el tejido subcutáneo. Mediante la inyección de una suspensión de células autógenas, la invención proporciona un aumento a largo plazo del tejido subyacente sin las desventajas que acompañan el uso de las sustancias actualmente disponibles.

2. Antecedentes de la invención

La inyección de una sustancia (un "inyectable") dentro del cuerpo y, en particular, en la cara, para obtener un resultado estético data del final del siglo XIX. Por ejemplo, la inyección de parafina para corregir los defectos del contorno facial disfrutó de un breve periodo de aceptación en los años previos a la primera guerra mundial. Sin embargo, las complicaciones y la naturaleza no satisfactoria de los resultados a largo plazo provocaron que la práctica se abandonara. La disponibilidad de silicona inyectable dio lugar a la repetición efectiva de estos sucesos, comenzando en los primeros años 60. Las soluciones de silicona "de calidad médica" especialmente elaboradas, por ejemplo, Dow Corning MDX 4.4011, se han usado con un fundamento experimental, en diversos centros de prueba autorizados en los Estados Unidos. Las complicaciones, tales como las reacciones locales y sistémicas a la silicona, la migración del inyectable y la descomposición del tejido local, ha limitado el uso de las inyecciones de silicona. Aunque los defensores originales de las inyecciones de silicona han continuado con sus programas experimentales con un número limitado de sujetos, parece muy improbable que la técnica se adopte más en general por la comunidad de cirujanos y médicos. Revisado por Matton, G. y col., 1985, Aesthetic Plastic Surgery 9: 133-40; Spira, M. & Rosen, T., 1993, Clin. Plastic Surgery 20: 181-9.

Los pobres resultados obtenidos mediante la inyección de sustancias no biológicas han impulsado los intentos de usar proteínas foráneas como inyectables, particularmente colágeno bovino. Aunque el colágeno bovino no procesado es demasiado inmunógeno para ser inyectado en los seres humanos, la eliminación mediante degradación enzimática de los péptidos C-terminal y N-terminal del colágeno bovino proporciona una sustancia ("atelocolágeno") que puede usarse en cantidades limitadas si los pacientes son preseleccionados para excluir aquellos pacientes que sean inmunoreactivos. Los procedimientos para preparar y usar tales productos se describen en la patente de Estados Unidos 3.949.073, en la patente de Estados Unidos 4.424.208 y en la patente de Estados Unidos 4.488.911. El producto sea vendido como ZYDERM®, marca de atelocolágeno en solución a concentraciones de 35 mg / ml y 65 mg / ml. Aunque de uso muy extendido en el mundo, desde 1987 hay más de 200.000 sujetos en los Estados Unidos, el uso de ZYDERM está asociado con el desarrollo de anticuerpos anti-bovinos en aproximadamente el 90% de los sujetos y con complicaciones inmunológicas evidentes en aproximadamente 1-3% de los sujetos. DeLustro, F. y col., 1987, Plastic and Reconstructive Surgery 79: 581.

Se comprobó que el atelocolágeno en solución es menos que completamente satisfactorio porque la sustancia, dentro de un periodo de semanas a meses, se absorbe por el sujeto a partir del sitio de inyección sin ser reemplazada por sustancia del hospedador. Aunque se han contemplado protocolos que consisten en inyecciones repetidas, tales programas están, en la práctica, limitados por el desarrollo de reacciones inmunitarias contra el atelocolágeno bovino, por el coste y por la resistencia del paciente. Para superar estas limitaciones, el atelocolágeno bovino se ha procesado adicionalmente mediante reticulación con glutaraldehído, seguida de filtración y tundido mediante el paso a través de una malla fina. La producción y uso de esta sustancia se describe en la patente de Estados Unidos 4.582.640 y en la patente de Estados Unidos 4.642.117. Se vende un producto producido de acuerdo con esto como ZYPLAST®, marca de atelocolágeno bovino reticulado. La ventaja de que el reticulado tiene la intención de proporcionar una resistencia aumentada a la degradación en el hospedador es contrarrestada por un aumento de la viscosidad. La viscosidad aumentada y, particularmente, la viscosidad irregular ("apelmazamiento") hace que la sustancia sea más difícil de usar e incluso la hace inutilizable para algunas finalidades. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.366.498.

Además, algunos investigadores informan que no hay o solamente hay una persistencia aumentada marginal del ZYPLAST en comparación con el ZYDERM y que la duración de los efectos de las inyecciones es como máximo aproximadamente 4 a 6 meses. Matti, B.A. & Nicolle, F.V., 1990, Aesthetic Plastic Surgery 14: 227-34; Ozgentas, H.E. y col., 1994, Ann Plastic Surgery 33: 171. En la experiencia de la mayoría de los médicos generales hay una absorción obvia después de aproximadamente 4 a 6 semanas.

Las limitaciones impuestas por la inmunogenia de los productos de colágeno bovino en los seres humanos han provocado que otros consideren la preparación de colágeno humano a partir de placenta, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.002.071 y a partir de especímenes quirúrgicos, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 4.969.912 y la patente de Estados Unidos 5.332.802. Se requiere el procesado adicional del colágeno humano mediante reticulado y otras modificaciones químicas porque el colágeno humano está sometido a los mismos procesos degradativos que el colágeno bovino.

El colágeno humano para inyección derivado enteramente de una muestra de tejido propio de los sujetos está disponible y se vende con el nombre comercial AUTOLOGEN™. No hay evidencia de que las inyecciones de colágeno humano den cómo resultado unos efectos más persistentes que las inyecciones de colágeno bovino. Además, el uso de colágeno autógeno procesado está limitado a los sujetos que han sufrido un procedimiento de estiramiento facial, porque la sustancia de partida para su producción es la piel eliminada durante esta operación. Por tanto, claramente, aunque el colágeno autógeno procesado evita la inmunogenia del colágeno bovino, no proporciona, como el colágeno bovino, beneficios terapéuticos a largo plazo y está limitado a los pacientes que han sufrido una operación.

Otros han inyectado una mezcla de polvo de gelatina, ácido \varepsilon-aminocaproico y plasma del sujeto (“FIBREL™”) como alternativa al atelocolágeno con la finalidad de aumentar la dermis subyacente. Multicenter trial, 1987, J. Am. Acad. Dermatol. 16: 1155-62.

La acción del FIBREL™ parece depender, en parte, de la inducción de una respuesta esclerogénica e inflamatoria para aumentar el tejido blando. Gold, M.H., 1994, J. Dermatologic Surg. Oncol. 20: 586-90. Aunque los informes de los tratamientos con FIBREL™ declaran que benefician a una fracción de los pacientes, véase, por ejemplo, Millikan, L. y col., 1991, J. Dermatologic Surg. Oncol. 17: 223-29, los resultados pueden sufrir apelmazamiento y una falta de persistencia. El uso del FIBREL™ también está limitado por el malestar asociado con las inyecciones y porque los médicos han encontrado que su preparación es tediosa.

En resumen, ninguna de las sustancias inyectables de materia no viva disponibles es totalmente satisfactoria en la finalidad de aumentar la dermis subyacente y los tejidos blandos.

La incapacidad de obtener resultados duraderos con los inyectables de atelocolágeno y los problemas del uso del FIBREL™ han impulsado a algunos a intentar obtener e inyectar (injertar) tejido adiposo vivo para aumentar la dermis subyacente y los tejidos blandos. Se pueden obtener buenos resultados en la corrección de los defectos principales cuando el tejido adiposo se elimina quirúrgicamente y se reimplanta. Véase, por ejemplo, McKinney, P. & Pandya, S., 1994, Aesthetic Plastic Surgery 18: 383-5; Davies, R.E. y col., 1995, Arch of Otolaryngology-Head & Neck Surgery 121: 95-100. Sin embargo, para las reparaciones que requieren colocar el injerto mediante inyección, los resultados son decididamente menos favorables. Ersek, R.A., 1991, Plastic & Reconstructive Surgery 87: 219-27. De este modo, aunque se ha informado de algunos resultados beneficiosos, véase, por ejemplo, Hambley, R.M. & Carruthers, J.A. 1992, J. Derm. Surgery & Oncol. 18: 963-8, los defensores del procedimiento admiten que para la mayoría de los médicos generales la técnica ha producido resultados insatisfactorios. Lewis, C.M., 1993, Aesthetic Plastic Surgery 17: 109-12. Entre los problemas que encuentran comúnmente los médicos y los sujetos están la imprevisibilidad de los resultados y el apelmazamiento, que hacen el procedimiento incompatible con el tratamiento de las arrugas finas, y un periodo de hinchazón extrema post-inyección, que dura entre 4-6 semanas.

3. Resumen de la invención

La presente invención proporciona el uso de fibroblastos dérmicos en la elaboración de un agente para uso en el aumento cosmético de los defectos cosméticos o estéticos de la piel de un sujeto, en el que el agente, fibroblastos dérmicos autógenos expandidos sustancialmente libres de proteínas derivadas del suero del medio de cultivo. El agente puede inyectarse en la forma de una suspensión en la dermis y el tejido subcutáneo subyacente al defecto. Los defectos típicos que pueden corregirse incluyen ritidosis, marcas extensas, cicatrices hundidas, depresiones cutáneas de origen no traumático, cicatrices de la acné común y la hipoplasia de los labios. Las células que se inyectan son células que son histocompatibles con el sujeto y se han expandido mediante el paso a un sistema de cultivo de células. Preferentemente, las células inyectadas son fibroblastos dérmicos derivados de un espécimen de biopsia tomado del sujeto.

Los fibroblastos dérmicos cultivados están sustancialmente libres de proteínas séricas derivadas del medio de cultivo usado para expandir las células, para que puedan usarse para corregir los defectos de la piel. Esto puede realizarse mediante incubación de los fibroblastos expandidos durante un período de tiempo en un medio sin proteínas.

4. Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el reconocimiento de que la sustancia ideal con la que aumentar la dermis y el tejido subcutáneo subyacente a un defecto sería células vivas del tipo tisular que se encuentra normalmente en la dermis. La invención también se basa en el reconocimiento de que un suministro abundante de células autógenas del tipo deseado puede obtenerse mediante el cultivo de un espécimen de biopsia, tomado previamente del sujeto, varias semanas antes de la inyección. La invención se basa adicionalmente en el reconocimiento de que, después de tal expansión en histocultivo, las células autógenas contendrán una cantidad significativa de proteínas antigénicas, pero estas proteínas antigénicas pueden eliminarse antes de la inyección en el sujeto.

4.1. Procedimientos para obtener una suspensión de células inyectable

La invención se puede poner en práctica mediante inyección de cualquier célula mesenquimática no diferenciada que puede expandirse en cultivo. En una realización preferida, se inyectan fibroblastos dérmicos porque pueden obtenerse fácilmente y expandirse y porque son uno de los tipos celulares que aparecen normalmente en la dermis y los tejidos subyacentes.

El cultivo de fibroblastos dérmicos se inicia a partir de un espécimen de biopsia de 2 x 5 mm de espesor total. Debido al fenómeno del rechazo del aloinjerto, que es bien conocido por los cirujanos de trasplantes y los inmunólogos, es esencial que los fibroblastos cultivados sean histocompatibles con el hospedador. La histocompatibilidad puede asegurarse mediante la obtención de una biopsia del sujeto cuyo defecto dérmico será corregido y el cultivo de los fibroblastos a partir de este espécimen.

Antes del inicio del cultivo, la biopsia se lava repetidamente con agentes antibióticos y antifúngicos. Subsecuentemente, se eliminan la epidermis y el tejido que contiene adipocitos subcutáneo, para que el cultivo resultante esté sustancialmente libre de células no fibroblásticas y el espécimen de dermis se divide finamente con el escalpelo o las tijeras. Las piezas del espécimen se colocan individualmente con unas pinzas sobre la superficie seca de un frasco de histocultivo y se permite que se unan entre 5 y 10 minutos antes de añadir despacio una pequeña cantidad de medio, teniendo cuidado de no desplazar los fragmentos de tejido unidos. Después de 24 horas de incubación, el frasco se alimenta con medio adicional. Cuando se usa un frasco T-25 para iniciar el cultivo la cantidad inicial de medio es 1,5-2,0 ml. El establecimiento de una línea celular a partir del espécimen de biopsia lleva, ordinariamente, entre 2 y 3 semanas, tiempo tras el que las células pueden sacarse del recipiente de cultivo inicial para la expansión.

Durante las etapas tempranas del cultivo es deseable que los fragmentos de tejido permanezcan unidos a la base del recipiente de cultivo; los fragmentos que se levanten deben ser reimplantados en recipientes nuevos. Los fibroblastos pueden ser estimulados para crecer mediante una breve exposición del histocultivo a EDTA-tripsina, de acuerdo con las técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. La exposición a la tripsina es demasiado breve para liberar a los fibroblastos de su unión a la base del recipiente de cultivo. Inmediatamente después de que los cultivos se hayan establecido y estén aproximándose a la confluencia, se pueden extraer muestras de fibroblastos para almacenarlos congelados. Se prefiere el almacenamiento por congelación de los fibroblastos de los pasos más bien tempranos que tardíos porque el número de pasos en histocultivo de fibroblastos humanos normales está limitado.

Los fibroblastos pueden congelarse en cualquier medio apropiado de congelación para preservar los fibroblastos. Puede usarse, con buenos resultados, un medio que consiste en medio de crecimiento 70%, suero bovino fetal 20% (vol. / vol.) y dimetilsulfóxido (DMSO) 10% (vol. / vol.). Las células descongeladas pueden usarse para iniciar cultivos secundarios para obtener suspensiones para uso en el mismo sujeto sin el inconveniente de obtener un segundo espécimen.

Se puede usar cualquier técnica de histocultivo que sea apropiada para la propagación de fibroblastos dérmicos a partir de especímenes de biopsia para expandir las células para poner en práctica la invención. Pueden encontrarse técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica en R.I. Freshney, Ed. Animal Cell Culture: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Inglaterra, 1986) y R.I. Freshney, Ed., Culture of Animal Cells: A manual of Basic Techniques, Alan R. Liss & Co., New York, 1987), que se incorporan en el presente documento como referencia.

El medio puede ser cualquier medio adecuado para el crecimiento de cultivos primarios de fibroblastos. En la mayoría de los casos, el medio se complementa con suero en una cantidad entre 0,5% y 20% (vol. / vol.) para promover el crecimiento de los fibroblastos. Las concentraciones mayores de suero promueven un más rápido crecimiento de los fibroblastos. En una realización preferida, el suero es suero bovino fetal, que se añade a una concentración final de 10% en base al medio. Por ejemplo, el medio puede ser DMEM rico en glucosa, complementado con glutamina 2 mM, piruvato sódico 110 mg / l, suero bovino fetal 10% (vol. / vol.) y antibióticos (“medio completo”).

Las células pueden pasarse a frascos nuevos mediante tripsinización. Para la expansión, los frascos individuales se dividen a 1:3. Son adecuados los frascos T-150 de base triple, que tienen un área total de cultivo de 450 cm^{2}, para poner en práctica la invención. Un T-150 de base triple puede alimentarse con aproximadamente 6 x 10^{6} células y tiene la capacidad de producir aproximadamente 1,8 x 10^{7} células. Cuando se alcanza la capacidad del frasco, que requiere típicamente 5-7 días de cultivo, el medio de crecimiento se reemplaza por un medio completo sin suero; subsecuentemente, las células se incuban, es decir, se mantienen entre aproximadamente 30ºC y aproximadamente 40ºC durante al menos 6 horas, preferentemente, durante más de 12 horas y lo más preferentemente de 16 a 18 horas a 37ºC, en el medio sin proteínas. La incubación de las células en el medio sin suero elimina sustancialmente las proteínas de las células derivadas del suero bovino fetal que, si estuvieran presentes, serían inmunógenas para el sujeto y provocarían una reacción alérgica.

Al final de la incubación en medio sin suero, se extraen las células del frasco de histocultivo mediante tripsina / EDTA; se lavan extensamente mediante centrifugación y resuspensión y se suspenden en un volumen igual de solución salina isotónica inyectable para la inyección. Seis frascos T-150 de triple pase, hasta su capacidad, proporcionan aproximadamente 10^{8} células que son suficientes para constituir aproximadamente 1,0 ml de suspensión.

Alternativamente, las células pueden transportarse a 4ºC siempre que se inyecten en 18 horas desde que se hizo la suspensión. Las células pueden suspenderse en un volumen igual de medio completo, con ausencia del indicador de pH rojo fenol, y el reemplazamiento del suero bovino fetal por el suero del sujeto para tal transporte (medio de transporte). Las células pueden aspirarse e inyectarse en el medio de transporte.

El volumen de solución salina o medio de transporte en el que las células se suspenden no es crítico. Dependiendo de factores tales como el número de fibroblastos que el médico general quiere inyectar, el tamaño y número de los defectos a tratar y la urgencia del deseo del sujeto en obtener los resultados de tratamiento, el médico general puede suspender las células en un volumen mayor de medio e inyectar correspondientemente menos células en cada sitio de inyección.

4.2. Procedimiento alternativo para obtener una población de células inyectables en una suspensión viscosa

Cuando la reparación del defecto dérmico requiere un gran volumen de sustancia, la presente invención proporciona un procedimiento alternativo para preparar una suspensión de células inyectable. Los ejemplos de tales defectos incluyen sujetos que necesitan un aumento de los labios, tratamiento de los pliegues nasolabiales y tratamiento de los defectos subcutáneos.

El procedimiento alternativo es idéntico al procedimiento descrito anteriormente hasta que se obtiene una población de aproximadamente 1 x 10^{6} células. Se forma un coágulo plasmático en el fondo de una placa de Petri de 100 mm, se trata para tener una superficie de histocultivo añadiendo 2 ml del plasma del sujeto y 50-100 unidades de trombina autógena (típicamente en 50 \mul) de forma que se forma un coágulo. Los fibroblastos dérmicos cultivados, 1 x 10^{6} células en 3-5 ml, se siembran sobre la superficie del coágulo y se cultivan durante 7 días adicionales en medio completo. Al final de los 7 días, se cambia el medio completo por medio sin suero. Un protocolo en el que el medio se elimina dos veces y se reemplaza con medio sin suero a intervalos de una hora y subsecuentemente las células se cultivan durante 14-18 horas adicionales en un medio sin suero proporciona resultados satisfactorios. Después de que concluya la incubación en medio sin suero, el coágulo puede ser aspirado en una jeringuilla e inyectado según se necesite.

En una realización alternativa de la invención, los fibroblastos no se hacen en suspensión. Más bien, el coágulo se usa intacto o se corta con un escalpelo con la forma deseada y se aplica la superficie del coágulo sembrada con fibroblastos como una venda en la dermis del sujeto después de la excoriación dérmica.

4.3. Administración de las células a los sujetos

Las suspensiones de células de la invención pueden usarse para tratar los defectos dérmicos usando las mismas técnicas que emplean actualmente los expertos en la técnica a la hora de usar ZYDERM® y ZYPLAST®. La suspensión de células puede usarse en lugar de las soluciones de atelocolágeno con las ventajas indicadas anteriormente. Pueden encontrarse enseñanzas representativas que se refieren al uso de sustancias inyectables para aumentar la dermis subyacente y el tejido subcutáneo en la bibliografía quirúrgica. Gonzales, U.M., 1992, Aesthetic Plastic Surgery 16: 231-4; Nicolle, F.V., 1985, Aesthetic Plastic Surgery 9: 159-62; Pieyre, J.M., 1985, Aesthetic Plastic Surgery 9: 153-54; que se incorporan íntegramente en el presente documento como referencia.

El tratamiento de las arrugas faciales finas superficiales, una realización de la invención, puede llevarse a cabo como sigue. El área a ser tratada se prepara con alcohol y se estira para proporcionar una superficie tensa. Se llena una jeringuilla con una suspensión de células y se adapta una aguja de 30 ga. para inyección. Se inserta la aguja en el sitio de la piel tan superficialmente como sea posible; la orientación del bisel no es crítica. Se hace una inyección intradérmica mediante presión suave hasta que se vea un leve blanqueado. Se hacen inyecciones seriadas múltiples.

El inyectable puede ubicarse en la musculatura orbicular para tratar la hipoplasia de los labios o en el tejido subcutáneo para tratar los defectos subcutáneos profundos.

Se pueden tratar extensas áreas de cicatrices de la acné mediante excoriación hasta el nivel de la dermis media o profunda. Seguidamente, se moldea un coágulo que contiene fibroblastos de forma que cubra la superficie excoriada y se aplica para que la cara del coágulo sembrada con fibroblastos quede yuxtapuesta a la superficie dérmica excoriada. Seguidamente, el coágulo aplicado se cubre con una venda quirúrgica tal como Xeroform®, Adaptic® o cualquier venda quirúrgica no oclusiva.

5. Resumen de la experiencia clínica

Seis pacientes han sufrido tratamiento de diversos defectos dérmicos de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Los diagnósticos fueron como sigue: arrugas de la risa (pliegues nasolabiales), 2 pacientes; arrugas perivucales, 2 pacientes; arrugas de la glabela; cicatriz hundida; hipoplasia labial y ritidosis actínica de la mejilla.

Cada paciente recibió una dosis de prueba en el antebrazo de 0,1 ml de la suspensión de células. Dos pacientes desarrollaron un eritema leve pero no hubo ningún otro signo de reacción a las inyecciones. Tres semanas más tarde se hicieron inyecciones terapéuticas que tenían un volumen total de 1,0 ml en el sitio de los defectos dérmicos. Cuatro semanas más tarde, se realizó, en algunos pacientes, una segunda inyección terapéutica de 1,0 ml. Solamente en el paciente que tenía el aumento de labios, la segunda inyección se hizo para reparar el mismo defecto; todo el resto de los pacientes tuvo solamente una inyección en cada área de tratamiento.

Los pacientes tuvieron de un eritema mínimo a ausencia de eritema y no hubo signos de reacciones sistémicas inmediatas o reacciones locales adversas. Cada paciente fue capaz de trabajar inmediatamente después de las inyecciones y en cada paciente la mejora fue patente inmediatamente.

Solamente hubo un malestar mínimo asociado con las inyecciones. Se informó de que el malestar es menor que el asociado con las inyecciones de atelocolágeno bovino. Los pacientes expresaron su satisfacción con el tratamiento y su deseo de someterse a tratamientos adicionales de otros defectos. La corrección de los defectos dérmicos fue patente para los amigos y los colegas de los pacientes que no tenían conocimiento de los tratamientos. No hay secuelas visibles del tratamiento de la piel, aunque puede detectarse alguna evidencia del tratamiento por palpación.

No ha habido reacciones adversas locales o sistémicas retardadas durante un período de prueba post-inyección de seis meses. Ningún paciente desarrolló bultos, irregularidades o desigualdades. Más significativamente, los efectos terapéuticos de las inyecciones no han mostrado disminución durante el período de observación, que se extendió a más de seis meses desde el tiempo de inyección, tiempo durante el que se esperaría que una inyección de atelocolágeno bovino se absorbiera. Más bien, los efectos terapéuticos en algunos pacientes disponibles para un seguimiento a largo plazo, mostraron beneficios que aumentaban con el tiempo. El comienzo tardío de las mejoras a largo plazo indica que los fibroblastos inyectados son activos metabólicamente y producen matriz extracelular adicional en el sitio de la inyección.

La presente invención no está limitada en el alcance por las realizaciones específicas descritas que tienen la intención de servir como ilustraciones singulares de aspectos individuales de la invención y los procedimientos y componentes funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Ciertamente, serán evidentes para los expertos en la técnica, a partir de la descripción anterior, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en el presente documento. Se tiene la intención de que tales modificaciones estén comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones del apéndice.

Claims

1. Uso de fibroblastos dérmicos en la elaboración de un agente para uso en el aumento cosmético de los defectos cosméticos o estéticos en la piel de un sujeto, en el que el agente comprende, fibroblastos dérmicos autólogos expandidos, sustancialmente libres de proteínas derivadas del suero del medio de cultivo.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente está sustancialmente libre de células no fibroblásticas.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el defecto cosmético o estético es una ritidosis, lesiones de rascado, una cicatriz hundida, una depresión cutánea de origen no traumático o un subdesarrollo de los labios.

4. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el agente comprende una suspensión para inyectar en el tejido subyacente al defecto cosmético o estético en un sujeto.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que adicionalmente la suspensión comprende, fibrina humana en una cantidad eficaz para formar un gel inyectable.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el gel inyectable comprende plasma alógeno activado con trombina.

7. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que las proteínas derivadas del suero del medio de cultivo se eliminan de los fibroblastos mediante incubación en medio sin suero.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que los fibroblastos se incuban durante al menos 6 horas en medio sin suero.

9. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que los fibroblastos se obtienen mediante las etapas de

(a): pasar los fibroblastos dérmicos, obtenidos previamente mediante una biopsia dérmica a partir del sujeto, por un medio de cultivo que comprende entre 0,5% y 20% de suero no humano, de forma que se proporcionen fibroblastos dérmicos sustancialmente libres de adipocitos, queratinocitos y matriz extracelular;

(b): incubar los fibroblastos dérmicos cultivados en un medio sin suero durante al menos 6 horas entre aproximadamente 30ºC y aproximadamente 40ºC y

(c): exponer los fibroblastos incubados a una enzima proteolítica para suspender los fibroblastos.

10. Uso de los fibroblastos dérmicos en la elaboración de un agente para uso en un procedimiento quirúrgico para el aumento cosmético a largo plazo del tejido subcutáneo o dérmico en un sujeto humano, en el que el procedimiento:

(a): proporcionar un agente que comprende una suspensión de fibroblastos dérmicos autógenos cultivados, sustancialmente libres de proteínas derivadas del suero del medio de cultivo;

(b): identificar un defecto cosmético susceptible de mejora mediante aumento del tejido subcutáneo o dérmico subyacente y

(c): inyectar un volumen eficaz del agente en el tejido subyacente para que el tejido aumente.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente comprende un coágulo sembrado con fibroblastos que tiene fibroblastos dérmicos derivados del sujeto y siendo el coágulo para aplicar en un sitio, con secuelas de la acné común del sujeto, que ha sido excoriado hasta el nivel de la dermis media o profunda, de forma que los fibroblastos sembrados se yuxtapongan a la dermis.