ES2206951T3

ES2206951T3 - Metodos de formacion de imagen fotoacustica.

Info

Publication number: ES2206951T3
Application number: ES98930870T
Authority: ES
Inventors: Paul Mark Henrichs; Morten Eriksen; Pal Rongved; Wolfgang Hans Heinrich Gunther; Robert Allen Snow; Kenneth Robert Hollister; Gregory Lynn Mcintire
Original assignee: Amersham Health AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1997-06-16
Filing date: 1998-06-16
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2018-06-16
Also published as: GB9712524D0; JP4436461B2; WO1998057667A1; AU8115898A; EP0996469B1; EP0996469A1; ATE247491T1; DE69817360T2; JP2002508760A; DE69817360D1; US6662040B1

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento de generación de una imagen del cuerpo de un animal humano o no humano o parte del mismo. El procedimiento comprende la administración a dicho cuerpo de un agente de contraste fisiológicamente tolerable que comprende un componente que absorbe la radiación y/o un componente generador de presión, exponiendo dicho cuerpo a la radiación, detectando las ondas de presión generadas en dicho cuerpo por dicha radiación y generando un a imagen optoacústica de al menos una parte de dicho cuerpo que contiene el agente de contraste administrado.

Description

Métodos de formación de imágen fotoacústica.

La presente invención se refiere a la utilización de agentes de contraste para conseguir un reforzamiento del contraste en la formación de imagen fotoacústica in vivo en pacientes humanos o animales.

La radiación de energía incidente es absorbida sobre ciertos materiales. Cuando la absorción da lugar a producción de calor se da una elevación local de la temperatura. La temperatura vuelve a la del entorno cuando la irradiación cesa. Si la irradiación incidente es un impulso nítido, el calor se propaga desde el lugar de la absorción en forma de onda térmica, que puede convertirse en un impulso de presión al contacto con un medio que se expande adecuadamente (por ejemplo, un gas en la superficie de la muestra). Cuando la irradiación incidente varía en intensidad a una frecuencia característica, hay calentamiento y enfriamiento periódicos en el lugar de la absorción que se traduce en calentamiento y enfriamiento periódicos en la superficie acompañados por cambios periódicos de presión en la superficie. Estos se pueden detectar como sonido que tiene una frecuencias fundamental igual a la de la variación de intensidad de la radiación incidente.

Por la capacidad de difusión térmica y el espesor de la muestra se determina si la onda térmica alcanza la superficie después de un impulso de luz. La detección de las ondas sonoras generadas entonces en la superficie de la muestra es, por lo tanto, solo adecuada en general para muestras muy delgadas. Sin embargo, si el lugar de absorción se extiende suficientemente después de la absorción de luz, se puede producir también sonido directamente en la interfase entre el lugar de absorción y el medio que le rodea. Cuando la radiación incidente es un impulso nítido, el aumento de presión producido por la expansión del lugar de absorción es temporal, pero no obstante se propaga una perturbación de la presión a la velocidad del sonido desde el lugar de absorción después del impulso. Esto se puede detectar con un transductor a cierta distancia del lugar de absorción como cambio de presión dependiente del tiempo. El tiempo transcurrido entre la irradiación inicial y la llegada de la perturbación de la presión al detector sirve de indicación de la distancia del lugar de absorción desde el transductor. La forma de la perturbación de la presión detectada proporciona información acerca de la forma de impulso incidente y la forma del lugar de absorción. La señal del dominio-tiempo es equivalente a una distribución de ondas sonoras de diferentes frecuencias en el dominio de la frecuencia. La forma de la distribución y las fases de las frecuencias individuales en la distribución se determinan por la longitud del impulso de irradiación, la forma del lugar de absorción, su distancia del punto de detección y las propiedades sónicas del medio.

Cuando la intensidad de la radiación incidente varía periódicamente con una frecuencia característica, hay una elevación y caída correspondientes en la presión impuestas sobre el medio circundante por el lugar de absorción. Los cambios de presión se irradian a través de la muestra en forma de sonido con frecuencias fundamental y armónicos iguales a las de la radiación incidente. La detección en la frecuencia a la que varía la radiación incidente permite la determinación directa de un punto en el dominio de las frecuencias. En principio, se puede encontrar la distribución entera en el dominio de la frecuencia haciendo medidas a muchas frecuencias diferentes.

La generación de ondas sonoras por radiación incidente se conoce como efecto "fotoacústico" u "optoacústico" y existe una revisión hecha por Tam (Reviews of Modern Physics, 1986, 58 (2), páginas 381-431). Los autores de la presente invención utilizan intercambiablemente ambas palabras para referirse a este fenómeno.

La radiación incidente puede ser cualquier tipo de radiación energética, incluyendo radiación electromagnética desde radiofrecuencia a rayos X, electrones, protones, iones u otras partículas. Para simplificar, se citarán aquí todas las anteriores como "radiación". La palabra "luz" se utilizará específicamente para designar radiación electromagnética de cualquier longitud de onda o frecuencia.

La formación de imagen termoacústica de personas y animales que comprende la aplicación de varios tipos de radiación está descrita en la Patente estadounidense número 4.385.634. La Patente WO 97/27801, un documento que entra dentro del Artículo 54(3) EPC, describe un sistema de formación de imagen opto-acústica con láser.

Se ha utilizado espectroscopia fotoacústica como medio sensible para detección de impurezas traza en gases y ha sido desarrollada como una útil herramienta analítica para la detección sensible de especies químicas en líquidos y sólidos, dentro de polvos, o en líquidos con gran turbiedad, donde una dispersión de luz intensa interferiría con los métodos directos de espectroscopia (véase, por ejemplo, Rosencwaig, 1975, Anal. Chem., 47(6), páginas 592 A-60 A; Karabutov y col., 1995, SPIE, 2389, páginas 209-216).

Se pueden utilizar métodos fotoacústicos para la determinación tanto de las propiedades ópticas como de las propiedades físicas de materiales. La eficacia con que la radiación se convierte en calor y presión dentro del material depende de sus propiedades ópticas. La propagación de ondas térmicas, de presión o sonoras depende de las propiedades mecánicas y físicas. Según esto, las señales fotoacústicas llevan la información acerca de la elasticidad, densidad, espesor de regiones de componentes, conductividad térmica y calor específico, así como las propiedades ópticas del material donde se generan. Pueden proporcionar también datos acerca de la cristalinidad de muestras sólidas y semi-sólidas y pueden utilizarse para detectar transiciones de fase y discontinuidades. Cuando el haz de luz se enfoca, se pueden medir localmente algunas de estas propiedades. La localización de las propiedades en un plano lateral, que atraviesa la muestra, es la base de la microscopía fotoacústica.

Se puede realizar un perfilado de la profundidad fotoacústico cuando la onda sonora medida se analiza en términos de tiempo de tránsito desde el lugar de absorción de luz de vuelta al detector. Las señales desde lo profundo dentro de una muestra lleva más tiempo para alcanzar el detector que desde las regiones cercanas a la superficie. Para irradiación impulsada, el tiempo de tránsito más largo se traduce en una mayor separación entre el tiempo de llegada del impulso y el de llegada de la señal al detector. Para irradiación modulada en amplitud, el tiempo de tránsito más largo se traduce en un cambio de fase en la onda sonora detectada. Juntos, la microscopía fotoacústica y el perfilado de profundidad fotoacústico constituyen la formación de imagen fotoacústica.

La utilización de impulsos cortos (luz truncada) en vez de luz aplicada de forma continua es especialmente útil para perfilado fotoacústico de profundidad. En este caso, la absorción de cada impulso de luz y subsiguiente calentamiento de las diversas regiones de la muestra produce una o más ondas de presión positiva o negativa que se propagan radialmente desde el lugar de la absorción después de cada impulso. Para impulsos de luz muy cortos, la forma de los impulsos de presión generados por los impulsos de luz se determina por las propiedades ópticas y térmicas, tamaños y formas de las diferentes regiones de la muestra, así como por la velocidad del sonido dentro de los lugares del medio circundante (véase, por ejemplo, Karabutov y col. 1996, Appl. Phys., 63, páginas 545-563; Hutchins, 1986, Can. J. Phys, 64, páginas 1247-1264).

Por ejemplo, en una muestra absorbente que mide 5 mm, persiste la señal del esfuerzo (onda de presión) en el detector durante varios microsegundos. Matemáticamente, un impulso nítido individual que es de amplitud de varios microsegundos de tiempo puede descomponerse por medio de transformación de Fourier en una distribución continua de ondas sinusoidales múltiples que varían en frecuencia de 0 a megahertzio. Incluso aunque esté ausente sonido en forma de onda de presión dependiente del tiempo, sinusoidal, la detección de los impulsos de presión requiere aún transductores ultrasónicos. El término "fotoacústico" y su sinónimo "optoacústico" son apropiados aún debido a que las señales detectadas son una combinación de ondas sonoras normales.

La espectroscopia fotoacústica ha sido aplicada al análisis clínico y biológico. Por ejemplo, se han detectado células cancerosas en la orina (Huang y col., 1990, J. Biomed. Eng., 12, páginas 425-428). Se ha realizado también el perfilado de profundidad. Por ejemplo, se han realizado estudios de la retina (Boucher y col., 1986, Applied Optics, 25(4), páginas 515-520), de piel (Giese y col., 1986, Can. J. Phys. 64, páginas 1139-1141), de la cresta de un gallo (Oraevsky y col, 1995, SPIE 2389, páginas 198-208), de hojas (Nery y col. 1987, Analyst, 112, páginas 1487.1490; Kirkbright y col., 1984, Analyst, 109, páginas 1443-1447), de líquen (O'Hara y col., 1983, Photochemistry & Photobiology 38(6), páginas 709-715) y sobre equivalentes de tejidos (Kruger & Liu, 1994, Am. Assoc. Phys. Med. 21(7), páginas 1179-1184; Esanaliev y col. 1996, SPIE, 2676, páginas 84-90; Oraevsky y col., 1996, SPIE, 2676, página 22-31). En cada caso, se detectaba la presencia de áreas de la muestra que absorbían radiación de diferentes longitudes de onda o absorbían más eficazmente que el fondo a diferentes niveles dentro de las muestras. En general, estos métodos, sin embargo, han estado limitados solamente a muestras delgadas (del orden de unos pocos centímetros debido a la limitación de la profundidad de la irradiación y al amortiguamiento de las ondas sonoras cuando pasan a través de la muestra al detector.

Según esto, las ondas sonoras producidas dentro de la muestra, por ejemplo, el cuerpo, deben tener suficiente amplitud para ser detectadas en la superficie de la muestra después de pasar a través de cualquier porción de la muestra que no contribuye a la generación de las ondas.

La utilización de espectroscopía fotoacústica para formación de imágenes médicas ha tenido hasta ahora graves limitaciones. No solamente la detección de objetos que absorbían radiaciones solo era posible normalmente en muestras muy delgadas, sino que el método quedaba también restringido a la detección de objetos o materiales dentro de muestras que absorbían radiación y producían las ondas térmicas requeridas para el efecto fotoacústico. Estas regiones absorbentes de radiación tenían que ser necesariamente distinguibles del fondo de manera de manera que la relación señal:ruido fuera lo suficiente alta para la detección.

Se ha encontrado ahora que se pueden utilizar agentes de contraste que resuelven los problemas antes mencionados. Por ejemplo, agentes de contraste permiten la absorción de luz y generación de sonido en regiones en las que no es posible de otra forma. Agentes de contraste pueden mejorar también la relación señal:ruido incrementando la amplitud de la onda sonora. El aumento de la amplitud de la onda sonora permite un incremento de la profundidad máxima posible de detección y por tanto permite la formación de imagen de objetos que están más abajo de la superficie corporal.

La utilización de medio de contraste es crucial en el éxito de la formación de imagen fotoacústica. Este agente de contraste para formación de imagen fotoacústica trabaja tanto para (i) potenciar el efecto fotoacústico pre-existente como para (ii) creación de un efecto fotoacústico donde antes no era posible este camino. Esto se puede conseguir por radiación de absorción selectiva en ciertos órganos o ciertas estructuras corporales sanas o enfermas o partes de los mismos, y/o por conversión eficaz de la radiación en calor, y/o por facilitar o mejorar la conversión calor-presión, y/o por dispersión y difusión de la luz incidente de manera que ilumine más uniformemente los órganos diana.

Los objetos que antes no podían detectarse o se detectaban muy mal se pueden identificar si los agentes de contraste se insertan dirigidamente en las áreas de interés particulares. Esta inserción dirigida permite identificar y diagnosticar formas de enfermedad particulares, por ejemplo, cáncer, o permite la detección o elucidación de estructuras u órganos corporales particulares, por ejemplo el canal alimentario, el sistema sanguíneo periférico.

Según esto, en un aspecto, la presente invención proporciona un método de generación de una imagen del cuerpo, o de una parte del mismo, de ser humano o de un animal al que se le ha administrado previamente un agente de contraste fisiológicamente tolerable que comprende un componente que induce presión, comprendiendo el citado método la exposición del citado cuerpo a radiación, la detección de las ondas de presión generadas en dicho cuerpo por dicha radiación y generación de una imagen optoacústica desde el mismo de al menos una parte del citado cuerpo que contiene el citado agente de contraste.

Según otro aspecto, la invención proporciona la utilización de un agente de contraste fisiológicamente tolerable que comprende un componente de inducción de presión para la manufactura de un medio de contraste para administración a un cuerpo animado de persona o de animal, en un método de tratamiento o diagnóstico del citado cuerpo o a parte del mismo, método que supone la generación de una imagen fotoacústica del citado cuerpo.

Este método representa una técnica de formación de imagen superior a la pura formación de imagen óptica del cuerpo que está fuertemente impedida por dispersión de la luz, incluso cuando se emplea luz de infra-rojo próximo con una longitud de onda entre 600 y 1300 nm para reducir la absorción de luz por aparición natural de sustancias dentro del cuerpo. El efecto fotoacústico proporciona las mismas ventajas para la formación de imagen que proporciona para la espectroscopia: el método es aun sensible a las propiedades ópticas de la muestra, pero el método de detección es insensible a la dispersión de luz. De hecho, la dispersión de luz puede proporcionar el efecto beneficioso de bañar los órganos internos en una iluminación aproximadamente isotrópica.

Selectivamente se puede obtener por inserción dirigida del agente de contraste a un órgano/estructura particular por incorporación de un componente de inserción dirigida o por administración apropiada por elección de la vía de administración.

La administración puede ser parenteral (por ejemplo intravenosa, intraarterial, intramuscular, intersticial, subcutánea, transdérmica, o intraesternal) o de introducción en una cavidad corporal hueca al exterior (por ejemplo tracto gastrointestinal, vejiga, útero, vagina, nariz, orejas o pulmones), en un ser humano o un animal animados (por ejemplo mamífero, reptil o ave).

Los métodos y usos aquí descritos son especialmente útiles para formación de imagen de órganos llenos de líquido o de aire o estructuras que contienen sangre, por ejemplo, tumores, tejidos enfermos, u órganos particulares, por utilización de agentes de contraste con especificidad para esta región/estructura, por ejemplo utilizando agentes de reconocimiento biológico con la especificidad deseada.

"Radiación" tal como aquí se describe puede ser radiación electromagnética de cualquier longitud de onda o frecuencia. Preferiblemente, la radiación electromagnética estará dentro de la región del infra-rojo próximo y tendrá una longitud de onda entre 600 a 1300nm. Más preferiblemente la radiación electromagnética tendrá una longitud de onda entre 625 y 1200 nm. Lo más preferible es que tenga una longitud de onda en el intervalo de 650 a 1000 nm. Alternativamente, la radiación electromagnética puede caer dentro de la región de rayos X o rayos gamma del espectro electromagnético y tener una longitud de onda inferior a 0,1 \mum, o puede caer dentro de la región de microondas y tener una frecuencia entre 0,3 y 30 GHz.

Como se ha mencionado antes, se puede utilizar radiación de onda continua con su amplitud o frecuencia modulada. Cuando se utiliza radiación de onda continua, los efectos fotoacústicos se pueden analizar en el dominio de frecuencias midiendo la amplitud y fase de uno o varios componentes de Fourier. Alternativamente, y preferiblemente, se emplean impulsos cortos de radiación que permiten el confinamiento del esfuerzo. Se prefieren los impulsos con una duración de \leq1 \musegundos, por ejemplo nanosegundo. Cuando se utilizan impulsos, se puede hacer el análisis en el dominio de los tiempos, es decir, sobre la base del tiempo necesario para que la onda sonora alcance el detector, simplificando así el análisis y contribuyendo al perfilado de profundidad.

Tal como aquí se emplea, "un componente que absorbe radiación" es un compuesto químico, un complejo, o una estructura que absorbe radiación de la longitud de onda pertinente y que convierte eficazmente esta radiación en calor.

El componente que absorbe radiación, o una parte del mismo, puede estar formado por compuesto colorante. Un compuesto colorante o composición colorante es una sustancia que absorbe radiación electromagnética con una longitud de onda de 300 a 1300 nm, generalmente con un cambio en las poblaciones de los niveles electrónicos de energía de la sustancia. Un compuesto colorante será especialmente útil cuando la radiación incidente es radiación electromagnética en la región infra-roja cercana con una longitud de onda entre 600 y 1300 nm. Para comprender el requerimiento molecular para el colorante que se usa en este componente se necesita la apreciación de los procesos implicados durante y después de la absorción de radiación.

La mayoría de las moléculas tienen un estado electrónico base de singlete. La absorción de un fotón de radiación eleva primero una molécula a un estado de singlete excitado. Generalmente, este será también un estado vibracional excitado. Para los colorantes en estado sólido puede haber también interacciones intermoleculares desfavorables. Para las moléculas en solución, puede haber una disposición desfavorable de las moléculas del disolvente alrededor del colorante excitado. Una reordenación rápida de la propia molécula del colorante y las moléculas a su alrededor después de absorción de radiación produce una molécula en un estado electrónico excitado y estado base vibracional. Se libera una pequeña cantidad de calor.

La molécula puede seguir entonces uno entre varios caminos. Puede volver al estado base no-radiativamente con producción de una cantidad relativamente grande de calor a través del proceso de conversión interna. Puede volver radiativamente al estado base con la producción de un fotón de radiación a través del proceso de fluorescencia. Por último, se puede convertir a un estado de triplete excitado de larga vida a través del proceso de cruzamiento intersistema. Las transiciones del estado triplete excitado al estado de base están simétricamente prohibidas, y el estado de triplete es de vida mucho más larga que el estado singlete excitado. No obstante, el retorno eventual al estado base con la liberación de un fotón de radiación es posible a través del proceso de fosforescencia.

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La producción eficaz de calor, tal como se requiere generalmente para el efecto fotoacústico hace necesario que los procesos que compiten con la conversión interna se reduzcan al mínimo. Según esto, preferiblemente, un colorante que se va a utilizar en el componente que absorbe radiación tendrá una débil fluorescencia y una débil fosforescencia. Afortunadamente, la fosforescencia y la fluorescencia son inherentemente débiles para muchos colorantes que absorben longitudes de onda de luz en el intervalo 600-1300 nm, el intervalo preferido para el que la absorbancia de las sustancias que aparecen en el cuerpo de forma natural es baja.

Alternativamente, el agente de contraste puede captar rayos X o rayos gamma con generación de calor. Los requerimientos moleculares para este agente son algo diferentes de los del agente que absorbe luz en el infra-rojo cercano. Generalmente, cualquier elemento con un número atómico mayor de 20 es capaz de absorber rayos-X, dependiendo de la fuente de rayos X y de la longitud de onda o borde K del elemento. Incluso gases tales como xenon son conocidos por absorber rayos X y han sido utilizados para formación de imagen de diagnóstico por rayos X por CT del cerebro y otros tejidos dentro del cuerpo. Un fotón de rayos X apropiadamente seleccionado lleva suficiente energía para liberar electrones desde los átomos que forman el agente de contraste. La transferencia de energía desde estos electrones a vibraciones del retículo produce entonces calor. Según esto, un agente de contraste para formación de imagen fotoacústica con rayos-X deberá tener electrones que se ionicen fácilmente por rayos X.

Un aspecto de la invención es la utilización de compuestos aromáticos yodados, tales como los ya utilizados ampliamente para potenciar contraste de imágenes de rayos X, como agentes de contraste para formación de imagen fotoacústica. El número de átomos de yodo por molécula puede variar de 1 a 6 (por ejemplo como en agentes de contraste "dímeros" tales como yodixanol, yodipamida, etc.), con un número mayor de átomos de yodo que proporciona una señal potenciada. Los agentes de contraste poliméricos con muchos átomos de yodo por molécula serían la extensión lógica de tal preparación de agente de contraste. Estos incluirían polímeros convencionales tanto ramificados como lineales así como materiales dendriméricos. Estos mismos materiales serán particularmente adecuados para formación de imagen fotoacústica de rayos X cuando se emplean dosis terapéuticas de los rayos X o rayos gamma, ya que se sabe que con dosis altas de rayos X, estos compuestos liberan electrones (véase R.S. Mello, H. Callisen, J. Winter, R. Kagen y A. Norman, "Radiation dose enhancement in tumors with iodine" Med. Phys. 1983, 10, 75; y K. S. Iwamoto, A. Norman, A.R. Kagan, M. Wollin, A. Olch, Imgram M. Bellotti y R.G. Skillen, "The CT scanner as a therapy machine" Radiother. Oncol. 1990, 19, 337). Dado que la producción de electrones puede conducir potencialmente a lesión celular, la formación de imagen fotoacústica con rayos X puede ser más útil en unión a una terapia de radiación.

Más generalmente, cualquier compuesto que contiene átomos pesados, especialmente yodo, wolframio o bario será útil como agente de contraste para formación de imagen fotoacústica con rayos X. Pueden ser líquidos o sólidos solubles o pueden ser suspensiones de partículas sólidas en un líquido fisiológicamente aceptable. Alternativamente, pueden ser materiales líquidos o sólidos encapsulados en liposomas.

Alternativamente, el agente de contraste puede absorber microondas y generar calor. Cuando las microondas penetran en un sólido, líquido o gas, los campos eléctricos oscilantes de la radiación inducen un movimiento de translación periódico en partículas cargadas e iones y un movimiento de rotación periódico en especies dipolares. Los movimientos de traslación y de rotación tienen la oposición de fuerzas inerciales, elásticas y de fricción, dependientes de la frecuencia, y se forma calor con acompañamiento de disipación del campo eléctrico oscilante. Cuando la sustancia contiene especies con un momento magnético neto, tal como partículas de magnetita, la interacción de estas partículas con el campo magnético oscilante de la radiación conduce también a la generación de calor.

La eficacia con la que una sustancia dada convierte las microondas en calor se mide generalmente por el factor de pérdida dieléctrica a la frecuencia de microondas. Cualquier sustancia con un alto factor de pérdida en la frecuencia de microondas, preferiblemente con un factor de pérdida más alto que el agua, es potencialmente útil como agente de contraste para formación de imagen fotoacústica con microondas.

Otro aspecto de la invención es la utilización de suspensiones de partículas superparamagnéticas como agentes de contraste para formación de imagen fotoacústica. Aún otro aspecto de la invención es la utilización de partículas suspendidas de ciertos materiales cerámicos, especialmente CO_{2}O_{3}, MnO_{2}, NiO y CuO, como agentes de contraste para formación de imagen fotoacústica con microondas.

Los componentes absorbentes de radiación de la invención pueden consistir en partículas sólidas, soluciones líquidas, sólidos que pasan a la solución al ser introducidos en el cuerpo o burbujas de gas, o una combinación de dos o más de las diferentes fases, donde los componentes de las diferentes fases pueden ser iguales o diferentes químicamente. Con propósito aclaratorio, la palabra "partícula" se utiliza para referirse a cualquier material en partículas fisiológicamente aceptable. Estas partículas pueden ser sólidas (por ejemplo material cristalino recubierto o sin recubrir) o fluidas (por ejemplo partículas de líquido en una emulsión) o pueden ser agregados (por ejemplo liposomas que contienen líquido). Cuando se utiliza material en partículas, éste puede dispersar la radiación de manera que se distribuya más uniformemente dentro de los órganos diana y tenga una mayor probabilidad de ser absorbido como resultado del aumento de la longitud media de trayecto seguido por fotones dispersados frecuentemente.

Los términos "gas", "líquido" y "sólido" tal como aquí se utilizan se refieren al estado físico del agente de contraste o al de uno o varios de sus componentes a la temperatura normal del cuerpo del sujeto al que se administra el agente de contraste, por ejemplo a 37ºC para una persona.

Un "componente que induce presión" es un compuesto, complejo o estructura que al calentarlo o al irradiarlo a la longitud de onda pertinente induce en su entorno inmediato una presión que puede detectarse como onda sonora. Preferiblemente, el componente que induce presión es térmicamente expansionable y se expande cuando se calienta por la liberación de calor desde el componente que absorbe radiación (que puede ser de aparición natural), en forma suficiente para producir una onda de presión que sería detectable. Este componente que induce presión puede consistir en sólido, líquido o preferiblemente gas, por ejemplo en la forma de burbujas, o una mezcla de ellos en que las moléculas de sólido, gas o líquido pueden ser iguales o diferentes. El componente inductor de presión puede comprender también gotitas de una emulsión. Incluidos dentro del grupo de tales componentes están los agentes que generan presión a través de la iniciación de reacciones químicas. Así, entre los componentes utilizados en la invención se incluyen precursores, es decir compuestos, complejos o estructuras que al ser irradiados o calentados (como se ha descrito antes) producen un componente que induce presión tal como un componente que se expansiona térmicamente o moléculas que ocupan un mayor volumen. Un ejemplo de un precursor de este tipo es grafito que al ser calentado con agua, o como resultado de la absorción de radiación, produce CO y H_{2}, los dos térmicamente expansionables. Esto da lugar tanto a un incremento de volumen debido a la producción de gases como a una posterior expansión debido al calentamiento de estos gases, resultando así una onda de presión. Otros ejemplos de precursores de gas son aminomalonato, carbonatos y bicarbonatos, compuestos de diazonio fisiológicamente aceptables, ésteres carbonato que contienen agrupaciones del tipo -CO-O-CR^{1}R^{2}-O-CO-OR^{3} y \beta-cetoácidos. Estos pueden reaccionar por varios caminos para generar gas. Asi, por ejemplo, en presencia de reacciones fotoquímicas que generan iones H^{+}, los carbonatos y bicarbonatos pueden generar dióxido de carbono in vivo después de la administración; los compuestos de diazonio pueden generar nitrógeno si en la irradiación se utiliza luz ultravioleta; los ésteres carbonato liberados por reacciones fotoquímicas interactuarán con esterasa no-específica in vivo, conduciendo a eliminación de dióxido de carbono; los \beta-cetoácidos se descarboxilarán. El componente que induce presión puede quedar consumido en el transcurso de la reacción química antes descrita produciendo una onda de presión, o puede simplemente actuar como catalizador.

Hay que señalar que los componentes que absorben radiación que convierten eficazmente la radiación en calor tendrán inherentemente propiedades de inducción de presión (si el entorno local es ya susceptible a un cambio de presión al calentar). Sin embargo puede añadirse un componente que induce presión adicionalmente (o alternativamente) para ayudar o permitir la conversión del calor generado en presión (o convertir directamente la radiación en presión a través de una reacción química). Análogamente, hay que hacer notar que un componente que induce presión puede tener también inherentemente características de absorción de radiación, por ejemplo, gases que absorben radiación de longitud de onda pertinente, o grafito que absorbe radiación y puede producir gas como componente de inducción de presión. Según esto, en algunos casos, la misma entidad física (por ejemplo, un compuesto o complejo) o estado físico (por ejemplo gas) puede tener tanto componente absorbente de la radiación como componente inductor de presión.

Si se utilizan ambos, componente de absorción de radiación y componente inductor de presión, preferiblemente expansionable térmicamente, estos se pueden administrar separadamente, simultáneamente o secuencialmente. Opcionalmente, pueden estar contenidos en el mismo compuesto, complejo o estructura. Por ejemplo, se pueden producir burbujas de gas o micro-globos en los que el gas está rodeado de una membrana que contiene o consiste en un componente absorbente de radiación adecuado de manera que el calor resultante de la absorción de radiación pueda transferirse fácilmente al gas. Un estuche de partes adecuadas para administración separada, simultánea o secuencial de componentes de agente de contraste para ser utilizado en la presente invención constituye otro aspecto de la presente invención.

El agente de contraste que comprende un componente que induce presión y opcionalmente un componente que absorbe radiación (pudiendo estar, ellos mismos, compuestos de diferentes fases y diferentes moléculas dentro de estas fases, donde las moléculas se citan aquí como "elementos" de cada componente) puede, como un todo, consistir en partículas sólidas, gotitas en emulsión, sólidos que pasan a solución al ser introducidos en el organismo, soluciones de líquido o gas o una combinación de dos o más de estas.

Opcionalmente, las longitudes de onda de absorción u otras propiedades ópticas de uno o más elementos del agente de contraste pueden ser sensibles a las propiedades bioquímicas o biofísicas de los órganos en que están o van a estar contenidos o localizados. Por ejemplo, las longitudes de onda de absorción de elementos del componente de absorción de radiación, tal como colorantes, pueden ser sensibles al pH local.

Los agentes de contraste sólidos pueden comprender un colorante que absorbe luz o pueden consistir en un núcleo de material incoloro, por ejemplo un gas, y una cáscara compuesta de un colorante que absorbe luz. Alternativamente pueden consistir en sustancias que absorben rayos X o microondas, o pueden comprender un núcleo de sustancia no-absorbente y una cáscara de una sustancia que absorbe rayos X o microondas. Preferiblemente, el colorante absorberá en el intervalo de longitudes de onda 300-1300 mm, más preferiblemente en el intervalo de longitudes de onda 600-1300 nm.

Generalmente, los agentes de contraste sólidos se formularán como partículas con tamaños de diámetro entre 5 y 10000 nm, preferiblemente entre 10 y 2000 nm suspendidas en solución acuosa. Preferiblemente, para asegurar una absorción óptima de luz (distinta a radiación de microondas) y calentamiento de partículas, las partículas deberán tener diámetros de 100 a 500 nanómetros. Sin embargo, las partículas superparamagnéticas para absorción de microondas tendrán preferiblemente diámetros de 5 a 30 nm, más preferiblemente 5 a 20 nm, lo más preferiblemente 5 a 15 nm. Estas partículas se pueden componer exclusivamente de los componentes absorbentes de radiación y/o el componente de inducción de presión o pueden incluir también otros componentes que pueden estar distribuidos homogénea o no-homogéneamente a través de las partículas tal como en una estructura de compartimentos múltiples, o pueden, por ejemplo, formar un núcleo central o dominio al que se unen componentes del agente de contraste, o viceversa.

Preferiblemente, las partículas sólidas están recubiertas o pueden mezclarse hasta a un 100% de partícula en peso con un agente tensioactivo para impedir la agregación durante la sesión de autoclave y almacenamiento.

En un aspecto, un agente de contraste fisiológicamente aceptable de esta invención comprende al menos un grupo cromóforo unido a una molécula de agente tensioactivo.

En esta invención, una molécula de agente tensioactivo se define como un emulsionante o detergente tal como los enumerados en McCutcheon's Directories, Volumen 1: Emulsifiers and Detergents (1994), y que contiene al menos un grupo funcional químico seleccionado del grupo que consiste en un alcohol (OH), un grupo nitrilo que incluye una amina primaria (NH_{2}) y una amina secundaria (NH), un ácido carboxílico (COOH), un sulfhidrilo (SH), un grupo ácido fosfórico, un grupo ácido fosfónico, un grupo fenólico, un grupo ácido sulfónico, un doble enlace carbono-carbono, y una cetona.

Los grupos funcionales químicos en las moléculas de agente tensioactivo se pueden interconvertir por reacciones químicas muy conocidas para los especialistas. Por ejemplo, un grupo hidroxilo se puede convertir en éster de ácido metanosulfónico que se puede tratar con azida sódica y reducirse para formar un grupo amina. Grupos ácido carboxílico y cetonas se pueden reducir para formar alcoholes, y los alcoholes se pueden oxidar para formar cetonas, aldehidos y grupos ácido carboxílico.

Las moléculas de agente tensioactivo útiles son emulsionantes o detergentes que pueden funcionar como agentes dispersantes, agentes humectantes, adsorbentes, agentes antiapelmazamiento, agentes anti-redepósito de impurezas, antiestáticos, aglutinantes, vehículos, agentes iridescentes, agentes acondicionadores, hidrótropos, desespumantes, emolientes, floculantes, humectantes, lubricantes, opacificantes, plastificantes, conservantes, agentes de desprendimiento, inhibidores de incrustaciones, estabilizantes, agentes de suspensión, espesantes, absorbentes de UV, repelentes de agua, ceras, y pulimentos, y que contienen al menos un grupo químico funcional seleccionado del grupo que consiste en un alcohol (OH), un grupo nitrilo incluyendo amina primaria (NH_{2}) y amina secundaria (NH), un ácido carboxílico (COOH), un sulfhidrilo (SH), un grupo ácido fosfórico, un grupo ácido fosfónico, un grupo fenólico, un grupo ácido sulfónico, un doble enlace carbono-carbono, y una cetona.

Preferiblemente, la molécula de agente tensioactivo comprende una fracción poli óxido de alquileno, que tiene opcionalmente un grupo ramificado tal como aquí se ha definido; más preferiblemente una fracción copolimérica de bloque de poli óxido de alquileno que tiene opcionalmente un grupo ramificado como aquí se ha definido; y lo más preferiblemente una fracción polimérica de bloques de poli óxido de alquileno que tiene opcionalmente un grupo ramificado y que comprende un bloque de poli óxido de propileno y un bloque de poli óxido de etileno. Entre los ejemplos de moléculas de agente tensioactivos útiles se incluyen copolímeros de bloque tales como AL 2070 de ICI Surfactants, copolímeros de bloque Antarox de Rhone-Poulenc, copolímeros de bloque Delonic de DeForest, Inc., copolímeros de bloque Hartopol de Texaco Chemical Canada, copolímeros de bloque Macol de PPG Industries, copolímeros de bloque Marlox de Huls America, copolímeros de bloque Pluronic que incluye Pluronic F, L, P y R, de BASF Corp., copolímeros de bloque Poly-Tergent de Olin Corp., y copolímeros de bloque Tetronic, y Tetronic R de BASF Corp. Actualmente las moléculas de agente tensioactivo preferidas incluyen copolímeros de bloque Tetronic y Pluronic, y hoy día los más preferidos son los copolímeros de bloque Tetronic..

Cuando los agentes se destinan a la administración por inyección en el sistema vascular, se pueden recubrir o mezclar hasta un 100% en peso de partículas con una sustancia que contiene polímero tal como poli(etilen glicol) para hacer más lenta la desaparición desde la corriente sanguínea. Opcionalmente, la solución en la que están suspendidas las partículas sólidas puede contener agentes tampón y otros excipientes para controlar el pH y la osmolalidad.

Cuando se utilizan agentes de contraste que contienen elementos absorbentes de radiación líquidos, estos pueden ser soluciones de colorantes estabilizados o soluciones de colorantes altamente solubles que se formulan de antemano o que se preparan inmediatamente antes de su uso. Preferiblemente, los colorantes se seleccionan para una eficacia óptima en la conversión de radiación absorbida en calor según los principios descritos antes y tendrán un máximo de absorbencia de luz entre las longitudes de onda de 300 y 1300 nm, más preferiblemente entre longitudes de onda de 600 y 1300 nm. Los colorantes se pueden incorporar a un polímero tal como un polímero ramificado o lineal que contiene poli(etilen glicol) y puede tener grupos tales como grupos alquilo que contienen hidroxilo o sulfonato unidos, para potenciar su estabilidad o solubilidad en agua. Materiales adecuados son los descritos en las Publicaciones de Patente Internacional Nos. WO 96/17628 (Schering) y WO 96/23522 (Daiichi).

Generalmente, los agentes de contraste lipófilos se formulan como emulsiones aceite-en-agua con tamaños de gotita de aceite entre 5 y 10000 nm, preferiblemente entre 10 y 2000 nm, suspendidos en una fase acuosa farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, para asegurar la absorción de luz y calentamiento de partícula óptimos, las gotitas habrán de tener diámetros de 50 a 500 nm. Estas gotitas de aceite pueden estar compuestas exclusivamente del (de los) componente(s) que absorbe(n) radiación o puede(n) incluir otras sustancias lipófilas distribuidas a través de la gotita. La propia gotita es el "componente inductor de la presión" del agente de contraste por el que se inicia la onda de presión requerida para detección acústica en la interfase entre las fases aceite y agua. Estas emulsiones contendrán casi siempre excipientes farmacéuticamente aceptables como se conocen en la técnica entre los que se incluyen lecitina, otros fosfolípidos, agentes tensioactivos tales como los Tetronics y Pluronics, aditivos lipófilos tales como aceite de sésamo, y los componentes convencionalmente utilizados para control de la isotonicidad, pH y osmolalidad.

Cuando se utilizan colorantes solubles en soluciones acuosas, las soluciones opcionalmente pueden contener agentes estabilizantes como se señala en la patente WO 94/23646. Las soluciones pueden contener también excipientes para controlar el pH o la osmolalidad.

Los colorantes solubles pueden ir encerrados en micelas o liposomas como se señala en la Patente WO 96/23424. Las formulaciones liposómicas pueden contener opcionalmente sustancias para estabilizar los colorantes frente a la oxidación u otros procesos de degradación.

Alternativamente, los agentes de contraste pueden contener compuestos solubles que comprenden átomos pesados tales como yodo. Las soluciones de los compuestos yodados se pueden formular previamente o se pueden preparar inmediatamente antes de su uso. Preferiblemente se eligen compuestos yodados por su eficacia óptima en la conversión de rayos X y rayos gamma, absorbidos, en calor según los principios descritos antes y tendrán un máximo de absorbencia de rayos X y rayos gamma con una longitud de onda inferior a 1,0 \mum. Los compuestos yodados se pueden incorporar a un polímero tal como un polímero lineal que contiene poli(etilen glicol) y puede tener grupos unidos para potenciar su solubilidad en agua. Cuando se van a utilizar compuestos yodados en soluciones acuosas, las soluciones pueden contener opcionalmente excipientes para control del pH o de la osmolalidad. Los compuestos yodados adecuados pueden estar, opcionalmente, encerrados en micelas o liposomas.

Cuando un gas forma un elemento de un agente de contraste, el agente de contraste está preferiblemente en forma de estructura que contiene el gas, por ejemplo una vesícula (por ejemplo liposoma, micela, microglobo, etc.), o el gas está en uno o más compartimentos de una estructura de compartimentos múltiples. Estas estructuras que contienen gas son preferiblemente de un diámetro de 1000-6000 nm. Estas estructuras que contienen gas pueden ser similares o idénticas a las utilizadas como agentes de contraste para formación de imágenes ultrasónicas. La preparación de las micropartículas o microglobos llenos de gas para su utilización en formación de imagen ultrasónica está descrita en la Patente WO 95/06518.

Preferiblemente, para proporcionar adicionalmente un componente que absorbe radiaciones para formación de imagen foto-acústica, ya sea el mismo gas o al menos un componente de la cáscara de encerramiento deberá absorber fuertemente la radiación, que preferiblemente tendrá una longitud de onda entre 300 y 1300 nm, más preferiblemente entre 600 y 1300 nm. Esto se puede conseguir empleando uno o más colorantes o compuestos que contienen colorante que absorben la radiación a la longitud de onda apropiada, como componente de la cáscara de encerramiento.

Los gases adecuados, o mezclas de ellos, incluyen los gases comunes en la sangre CO_{2}, O_{2}, N_{2}, aunque deberán ser evitados preferiblemente los gases que aparecen en los tejidos biológicos para mejorar la relación señal:ruido. El gas se puede mezclar con un gas noble, como diluyente, tal como argon, helio, neon o xenon que hará máxima la transferencia de energía de traslación del gas absorbente que se diluye ya que estos gases no tienen grado interno de libertad (rotacional ni vibracional) (véase Putterman, feb. 1995, Scientific American, páginas 32-37, concerniente al efecto de los gases nobles sobre el efecto acústico).

Cuando el agente de contraste es una estructura que contiene gas o líquido, la estabilidad de la cáscara que le rodea puede ser suficientemente baja para que el calor, como consecuencia de la irradiación, dé lugar a disrupción de la estructura y quede liberado el contenido. Este puede generar a su vez una onda de presión, produciendo un efecto de señal de identificación para el agente de contraste, y/o puede utilizarse para liberar simultáneamente moléculas requeridas en los entornos locales, por ejemplo compuestos terapéuticamente activos.

Para obtener selectividad, el agente de contraste se puede insertar dirigidamente, pasiva o activamente, a regiones de interés diagnóstico tales como órganos, vasos, puntos de enfermedad, tejidos de tumores, o un organismo específico en un paciente. En la inserción dirigida activa, los agentes de contraste se pueden unir a agentes de reconocimiento biológico para permitirles la acumulación en ellos o para ser retenidos selectivamente o ser lentamente eliminados desde ciertas partes del cuerpo, tales como órganos específicos, partes de órganos, estructuras corporales y estructuras de enfermedades y lesiones. Los agentes de reconocimiento pueden estar unidos a elementos de componentes que absorben radiación e inducen presión o pueden estar unidos a otros componentes de los agentes de contraste, tales como componentes estructurales que se pueden utilizar, por ejemplo, en la producción de partículas o microglobos de agente de contraste. La inserción dirigida activa se define como una modificación de biodistribución utilizando grupos químicos que se asociarán con las especies presentes en el tejido u organismo objetivo para reducir eficazmente la velocidad de pérdida del agente de contraste del tejido u organismo específico.

La inserción dirigida activa de un agente de contraste se puede considerar como la localización a través de modificación de la biodistribución del agente de contraste por medio de un grupo o ligando químico de inserción dirigida que se une o se incorpora al agente de contraste. . El ligando o grupo de inserción dirigida se puede asociar o unir con una o más especies receptoras presentes en el tejido u organismo de interés diagnóstico. La unión reducirá eficazmente la velocidad de pérdida de agente de contraste desde el tejido u organismo específico de interés diagnóstico. En tales casos, el agente de contraste se puede modificar sintéticamente para incorporar el ligando de inserción dirigida o vector de inserción dirigida. Los agentes de contraste insertados dirigidamente se pueden localizar debido a que se unen entre el ligando y el receptor objetivo. Alternativamente, los agentes de contraste se pueden distribuir por biodistribución pasiva, es decir, por inserción dirigida pasiva a tejidos enfermos de interés, tales como tumores. De esta forma, incluso sin manipulación sintética para incorporar un ligando o vector de inserción dirigida que pueda unirse a una sede de receptor, los agentes de contraste isertados dirigidamente de forma pasiva se pueden acumular en un tejido enfermo o en localizaciones específicas en el paciente tales como el hígado. La presente invención comprende la utilización de un agente de contraste que va ligado a un vector de inserción dirigida (citado también como ligando) que tiene afinidad para unirse a un receptor. Preferiblemente, el receptor está situado sobre la superficie de una célula enferma o causante de la enfermedad en un paciente humano o animal.

En un aspecto, el receptor comprende una enzima dihidrofolato reductasa (también citada como receptor DHFR). Los receptores DHFR están presentes en ciertas bacterias causantes de enfermedades y se expresan en número relativamente grande en ciertas células de tumores. Los ligandos adecuados que pueden unirse a estos receptores DHFR incluyen ácido fólico y derivados de ácido fólico incluyendo derivados 7,8-dihidrofolato, fármacos antifolato, antagonistas, agonistas e inhibidores de DHFR, trimetoprim y análogos de trimetoprim que pueden unirse a sedes de DHFR en bacterias, metotrexato y análogos de metotrexato que pueden unirse a sedes de DHFR sobre células de tumor, pirimetamina y tetroxoprim. En la Patente WO 94/13327 se dan descripciones de ligandos adecuados que pueden unirse a receptores DHRF. Los ligandos preferidos en primer lugar comprenden derivados de los fármacos antifolato, metotrexato y trimetoprim.

En un aspecto, agentes de contraste útiles en esta invención son componentes de absorción de radiación y de inducción de presión que comprenden ligandos tales como derivados de trimetoprim y metotrexato que se unen químicamente a cromóforos o colorantes para formar conjugados ligando-colorante insertados dirigidamente. Los colorantes preferidos absorben en la región de 300 a 1300, y más preferiblemente de 600 a 1300 tales como colorantes de cianina. Uno o más ligandos pueden unirse a uno o más colorantes, por ejemplo, por utilización de un péptido como grupo de unión entre el colorante y el ligando. En la Patente WO 94/13327 se describen derivados de trimetoprim y metotrexato útiles que comprenden un grupo amina primaria reactivo. Estos derivados de amina primaria puede reaccionar con colorantes que contienen grupos funcionales reactivos tales como, por ejemplo, grupos isotiocianato (NCS) (y así colorantes de cianina útiles pueden ser los que se citan aquí como DYE-NCS y se describirán después), grupos cianato, grupos cloruro de vinilo, grupos éster activo tales como grupos N-hidroxisuccinimida (NHS), y grupos éster nitrofenílico. Entre los ejemplos representativos no-limitativos de colorantes de cianina que contienen grupos funcionales reactivos útiles se incluyen, por ejemplo, colorantes CY^{TM} comercializados por Amersham Inc., colorantes descritos en la Solicitud de Patente Europea 0670374 A1, y colorantes descritos por N. Narayanan y G. Patonay en Journal of Organic Chemistry (1995), 60. 2391-2395. Ejemplos de la preparación de componentes que absorben radiación e inducen presión útiles en la invención que se pueden insertar dirigidamente en receptores DHFR son los representados en los Esquemas 1 y 2 a continuación. En estos esquemas se utiliza la química de unión a isotiocianato como ejemplo no-limitativo.

Esquema 1

Los derivados de colorante trimetoprim útiles en esta invención pueden prepararse como sigue:

2

200

Esquema 2

Los derivados de colorante metotrexato útiles en esta invención se pueden preparar como sigue:

3

Un ejemplo de colorante reactivo útil (DYE-NCS) en el esquema anterior es

4

Un ejemplo de un colorante reactivo útil que utiliza la química de éster activo (DYE-NHS, donde NHS se refiere a N-hidroxisuccinamida) en lugar de la química de isotiocianato (DYE-NCS) para formar conjugados ligando-colorante insertados dirigidamente a través de un enlace amida (-NH-C(=O)-DYE) en lugar de a través de un enlace tiourea (NH-C(=S)-NH-DYE) en los esquemas 1 y 2 anteriores, es el colorante reactivo Cy5^{TM} de Amnersham Incorporated.

5

El número de colorantes que absorben radiación e inducen presión unidos al ligando que se insertan dirigidamente en receptor DHRF puede variar desde uno a aproximadamente 100, preferiblemente de uno a aproximadamente 10, y más preferiblemente de uno a aproximadamente 3. Se pueden conseguir variaciones en el número de colorantes unidos a los ligandos de DHRF en los Esquemas 1 y 2 se por cambio del número de grupos liisina incorporados sintéticamente a los péptidos mostrados en los esquemas 1 y 2, y tratando después con suficiente colorante reactivo para que reaccione con cada amina lisina.

Los conjugados ligando-colorante insertados dirigidamente así producidos se pueden formular en un medio farmacéuticamente aceptable tal como, por ejemplo, en solución salina estéril tamponada con fosfato, y después administrarse a un paciente, por ejemplo, por inyección intravenosa.

Los ligandos de estos agentes de contraste de conjugado ligando-colorante insertados dirigidamente se unirán a receptores DHFR tales como, por ejemplo, a receptores DHFR de bacterias asociadas con una infección en el paciente en el caso de un derivado de conjugado ligando-colorante insertado dirigidamente trimetoprim, y a receptores DHFR en células cancerosas en el caso de derivado de conjugado ligando-colorante insertado dirigidamente metotrexato. El agente de contraste que no se une a un receptor DHFR será eliminado del paciente a un ritmo más rápido que el agente de contraste unido a receptor a través de mecanismos de eliminación de fármacos de los que se dispone comúnmente tal como a través del hígado o el riñón mientras que el agente de contraste que se une a receptores DHFR en áreas de enfermedad del paciente permanecerá asociado con esas áreas de enfermedad durante un tiempo prolongado con respecto a la cantidad de conjugado colorante-ligando no unido. Cuando el paciente o una parte del paciente se somete entonces a un procedimiento de formación de imagen fotoacústica después de que se ha podido eliminar una cantidad de agente de contraste no unida a receptor desde el paciente, las áreas de intensidad de señal potenciada derivarán de los lugares que contienen receptor DHFR al que está unido el conjugado ligando-colorante que absorbe radiación e induce presión insertado dirigidamente.

Los especialistas en la técnica se darán cuenta fácilmente de otros métodos adecuados de unión de colorantes a ligandos.

La utilización de agentes de reconocimiento biológicos (o "vectores") para insertar dirigidamente agentes de contraste ha sido descrita con detalle en la Solicitud de Patente estadounidense No. de serie 08/848.586 titulada "Método de tratamiento de tumores" registrada el 29 de abril de 1997 en nombre de William Anthony Sanderson y en la Solicitud de Patente internacional No. PCT/GB98/01245. Entre los agentes de reconocimiento biológicos se incluyen amino ácidos, péptidos, antígenos, haptenos, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, biotina, hormonas, neurohormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, linfocinas, lectinas, toxinas, hidratos de carbono, oligosacáridos, polisacáridos, dextranos, oligonucleótidos estabilizados frente a nucleasas, fármacos y ligandos de unión a receptor, anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos. Hay que señalar que la selección apropiada de un agente biológico de reconocimiento dependerá del órgano al que se inserta dirigidamente y de la vía de administración, pero por lo general se apoyará en la unión de una o más superficies de órganos corporales, estructuras u organismos biológicos, especialmente a las células de estas superficies que únicamente pueden ser reconocidos por la presencia de características de superficie únicas, por ejemplo, número o tipo de receptor, o expresión de antígeno.

Los colorantes y moléculas que contienen colorante apropiados tales como derivados de polietilen glicol de colorantes para utilización en agentes de contraste utilizados en la invención, en particular para la preparación de agentes de contraste en que se usan partículas no sólidas que tienen una cáscara que comprende un colorante, cáscara que rodea moléculas de gas, deberán tener un máximo de absorción en el intervalo de 300 a 1300 nm, más preferiblemente 600 a 1300 nm. Los colorantes utilizados en la invención incluyen compuestos que tienen un sistema de electrones deslocalizados extenso, por ejemplo cianinas, merocianinas, ftalocianinas, naftalocianinas, trifenilmetinas, porfirinas, colorantes de pirilio, colorantes de tiapirilio, colorantes de escuarilio, colorantes de croconio, colorantes de azulenio, indoanilinas, colorantes de benzofenoxazinio, colorantes de benzo-tiafenotiazinio, antraquinonas, naftoquinonas, indantrenos, ftaloilacridonas, trifenoquinonas, colorantes azoicos, colorantes de transferencia de carga intramolecular e intermolecular y complejos colorantes, troponas, tetrazinas, complejos, complejos bis(ditioleno), complejos bis(benceno- ditiolato), colorantes de yodoanilina, complejos de bis(S,O-ditioleno), etc. Se pueden encontrar ejemplos de compuestos colorantes orgánicos o con metal, adecuados, en "Topics in Applied Chemistry: infrared absorbing dyes" Ed. M. Matsuoka, Plenum, NY 1990, "Topics in Applied Chemistry: The Chemistry and Application of Dyes" , Waring y col. Plenum, NY, 1990, "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" Haughland, Molecular Probes Inc. 1996, Patente DE-A-4445065, Patente DE-A-4326466, Patente JP-A-3/228046; Narayanan y col. J. Org. Chem. 60: 2391-2395 (1995), Lipowska y col: Heterocyclic Comm. 1: 427-430 (1995), Fabian y col. Chem. Rev. 92: 1197 (1992), WO 96/23525, Strekowska y col. J. Org. Chem., 57:4578-4580 (1992) y WO96/17628.

A menos que se especifique de otra manera, un grupo alquilo, tal como aquí se define, puede ser lineal o ramificado, saturado o sin saturar, puede contener un grupo de oxígeno de éter, y puede tener uno o más anillos de 3 a 6 átomos de carbono tales como ciclopropilo, espirociclopropilo, ciclopropilideno, ciclobutilo, espiro-1,1-ciclobutilo, 1,2-ciclobutilideno, 1,3-ciclobutilideno, ciclopentilo, 1,2-ciclopentilideno, ciclopenten-3-ilo, ciclohexilo, 1,4-ciclohexilideno, 2,3-biciclo[2,2,1] heptilideno, 1-decalina, fenilo, 1,4-fenileno, y similares, y puede estar sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxilo, 1,2-dihidroxietilo, 1,2-dihidroxi-propiloxilo, carboxilo, sulfonato, fosfonato, y poli(alquilen oxidilo) tal como \omega-hidroxipoli(etilen oxidilo) y \omega-metoxipoli(etilen oxidilo) de pesos moleculares que pueden ser de hasta aproximadamente 50.000.

Preferiblemente se pueden utilizar los colorantes de la fórmula I

6

donde

cada Z_{1} se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en:

hidrógeno

un grupo metilo opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, carboxilo, sulfonato, fosfonato, y poli(alquilen oxidilo) tal como \omega-hidroxipoli(etilen oxidilo) y \omega-metoxipoli(etilen oxidilo) cuyos pesos moleculares pueden ser de hasta aproximadamente 50.000,

un grupo etilo opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxilo, carboxilo, sulfonato, fosfonato, y poli(alquilen oxidilo) tal como \omega-hidroxipoli(etilen oxidilo) y \omega-metoxipoli(etilen oxidilo) cuyos pesos moleculares pueden ser de hasta aproximadamente 50.000,

un grupo etileno opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxilo, carboxilo, sulfonato, fosfonato, y poli(alquilen oxidilo) tal como \omega-hidroxipoli(etilen oxidilo) y \omega-metoxipoli(etilen oxidilo) cuyos pesos moleculares pueden ser de hasta aproximadamente 50.000,

un grupo alquilo de C_{3-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo éter alcoxilo de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo éster carboxialquilo de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo éster oxicarbonilalquilo de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo carbonilaminoalquil amida de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo aminocarbonilalquil amida de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo ácido carboxílico que puede ser un grupo carboxilato,

un grupo sulfonato

un grupo hidroxilo,

un grupo fosfato,

un grupo sulfonamidoalquilo de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo aminosulfonilalquilo de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo aminocarbonilaminoalquil urea de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo aminotiocarbonilaminoalquilo tiourea de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes

un grupo fenil-alquilo de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo fenoxi-alquilo de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo feniloxi-alquilo de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo oxifenoxi-alquilo de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes,

un grupo poli(alquilen oxidilo) tal como hidroxipoli(etilen oxidilo) y metoxipoli(etilen oxidilo) con un peso molecular de hasta aproximadamente 50.000,

y un ciclo aromático anillado que comprende un anillo benzo[e]aromático, un anillo benzo[f]aromático, o un anillo benzo[g]aromático, donde e, f y g se definen respecto a la estructura de indol como patrón y cada uno de los anillos puede estar sustituidos por grupos alquilo de C_{1-16}, alcoxilo de C_{1-16}, carboxilo, sulfonato, sulfonamido, fenilo, poli(alquilen oxidilo) o fenoxilo como se han definido antes;

cada R'_{1} se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en grupo metilo y alquilo de C_{2-16} incluyendo un grupo alquilo sustituido donde el alquilo está opcionalmente sustituido como se ha definido antes,

cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en O, N-R'_{1}, S, Se, Te, CH=CH, y (CH_{3})_{2}C; y

Q_{1} se selecciona del grupo que consiste en

(CH=CH)_{n} donde n tiene un valor de 1 a 6,

7

70

700

donde Z_{2} se selecciona del grupo que consiste en H, cloro, O-alquilo, S-alquilo donde el alquilo está opcionalmente sustituido como se ha definido antes, O-poli(alquilen oxidilo), S-poli(alquilen oxidilo), donde el poli(alquilen oxidilo) se define como antes e incluye también grupos poli(óxido de alquileno) al que se une otro colorante en el terminal \omega, O-fenilo, S-fenilo, donde los grupos fenilo pueden estar sustituidos con grupos alquilo como se ha definido antes, grupos O-alquilo como se han definido antes, grupos S-alquilo como se han definido antes, grupos aminotiocarbonilaminoalquilo, y grupos aminotiocarbonil-aminofenilo, y

donde Z_{3} se selecciona del grupo que consiste en H, carboxilato y carboxialquilo donde el alquilo es como se ha definido antes, carbonilaminoalquilo donde el alquilo es tal como se he definido antes, y carbonilaminofenilo donde el fenilo es como se ha definido antes, y

8

y

Z^{-} es un contra-ión fisiológicamente tolerable, preferiblemente I, Br, Cl o OAc.

Más preferiblemente se pueden utilizar los colorantes de fórmula II

9

donde

n es un entero que tiene un valor de 1 a 6;

cada R_{1}, que puede ser el mismo o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo solubilizante, o sustituyentes R_{1} adyacentes junto con los carbonos del anillo al que van unidos pueden formar una estructura cíclica, preferiblemente de 5 ó 6 eslabones, por ejemplo un anillo aromático;

cada R_{2}, que puede ser el mismo o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo lipófilo, por ejemplo, un grupo alquilo de C_{1-24}, opcionalmente insaturado, preferiblemente un grupo de C_{6-18}, especialmente cuando el colorante se utiliza como parte de una partícula no-sólida que contiene gas, alternativamente, cada R_{2} puede ser grupo alquilo de C_{2-8} opcionalmente insaturado que va unido a uno o más grupos solubilizantes;

cada X, que puede ser el mismo o diferente, representa cada uno O, S, -CH=CH- o C(R_{3})_{2} en que cada R_{3} que puede ser el mismo o diferente, representa un átomo de hidrógeno o más preferiblemente un grupo metilo o etilo;

Z es un contra-ión fisiológicamente tolerable, preferiblemente I, Br o Cl.

Entre los ejemplos de grupos solubilizantes adecuados se incluyen grupos sulfato, carboxilato, fosfato, hidroxi, oxiácido y tiol, así como grupos alquilo de C_{1-6} sustituidos con uno o más de tales grupos.

Medios de contraste utilizados en la invención que contienen agente de contraste pueden incluir otros componentes, por ejemplo, auxiliares de formulaciones farmacéuticas convencionales tales como agentes humectantes, agentes tampón, disgregantes, aglutinantes, cargas, agentes aromatizantes, y medios vehículo líquidos tales como agua estéril, agua/etanol, etc. El agente de contraste deberá ser adecuado para administrarlo por inyección o inhalación o introducirlo por catéter, por instilación o transdérmicamente en una de las diversas cavidades corporales que incluyen el canal alimentario, la vagina, el recto, la vejiga, el uréter, la uretra, la boca, etc.

Para administración oral, el pH de la composición está preferiblemente en el intervalo ácido, por ejemplo 2 a 7, y se pueden emplear agentes tampón o agentes de ajuste del pH.

Los medios de contraste se pueden formular en las formas de administración farmacéuticas convencionales, tales como tabletas, cápsulas, polvos, soluciones, dispersión, jarabes, supositorios, etc.

La dosificación preferida de los medios de contraste variará según una serie de factores, tales como la vía de administración, la edad, el peso y clase de sujeto, pero en general contiene del orden de 1 pmol/kg a 1 mmol/kg de peso corporal del agente de contraste.

La formación de imagen del área deseada se realiza por detección y análisis apropiado de las ondas sonoras resultantes de la irradiación. La detección se puede realizar en la misma superficie de muestra que la fuente de radiación incidente (reflexión) o alternativamente en otra superficie tal como la superficie diametralmente opuesta a la luz incidente, es decir, la superficie del revés de la muestra (transmisión). Los métodos adecuados de detección incluyen el uso de micrófono, transductor piezoeléctrico, transductor de capacitancia, métodos de sensor de fibra óptica o alternativamente métodos sin contacto (véase Tam, 1986, citado antes, para una revisión). Se pueden utilizar las técnicas y el equipamiento de la formación de imagen ultrasónica.

La Figura 1a es una gráfica de datos de biodistribución comparativos de agente de contraste NC100448 frente a verde de indocianina como control en ratones hembra inmunodeficientes que tienen tumores HT-29 una hora después de inyección intravenosa de soluciones salinas tamponadas con fosfato de cada uno. El NC100448 se detecta en el tumor, el compuesto de control apenas se detecta.

La figura 1b es una gráfica de los datos de biodistribución comparativos de agente de contraste NC100448 frente a verde de indocianina como control en ratones hembra inmunodeficientes que tienen tumores HT-29 al cabo de tres horas de la inyección intravenosa de soluciones salinas tamponadas con fosfato de cada uno. El NC100448 se detecta en el tumor, el compuesto control apenas se detecta. Respecto a la Figura 1a, la concentración del agente de contraste en el tumor se ha incrementado mientras que la concentración en sangre ha disminuido.

La figura 2 muestra imágenes monodimensionales obtenidas de un ratón desnudo, inmunocompetente, antes y después de la inyección de una solución de NC100448 en la vena caudal (véase Ejemplo 7 después).

La Figura 3 muestra imágenes mono-dimensionales obtenidas de un ratón desnudo, inmunocompetente antes y después de la inyección de una suspensión de liposomas de verde de indocianina en la vena caudal (véase el Ejemplo 18 de después).

Los modos de realización preferidos de la invención se describirán ahora con referencia a los siguientes ejemplos no-limitativos:

Ejemplo 1 Partículas de colorante suspendidas

Se añade el colorante yoduro de 3,3'-dietiltiatricarbocianina (Fisher) que es muy poco soluble a un frasco de vidrio ámbar de 42,45 g (1,5 onzas) que contiene aproximadamente 12 ml de bolas de 1,1 mm de diámetro de sulfato de zirconio en una cantidad suficiente para constituir el 15% (peso/volumen) de la suspensión final. La solución del frasco se hace también al 3% en Pluronic F-68 y 10% en PEG-400 (Shear-water). Se tritura a aproximadamente 150 rpm hasta un total de 9 días, tiempo durante el cual se hace un seguimiento del tamaño de partícula por dispersión luminosa u otros métodos analíticos. El proceso se detiene cuando el tamaño medio de partícula es de 100-400 nm de diámetro. El producto resultante tendrá un máximo de absorción de alrededor de longitud de onda de 772 nm y se puede someter a autoclave sin cambio del tamaño de partícula.

Ejemplo 2 Partículas de grafito suspendidas

Se procesó polvo de grafito siguiendo el método del Ejemplo 1.

Ejemplo 3 Preparación del producto de reacción de 2-[2-[2-(4-isotiociano)fenoxi-3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden]etiliden]-1-ciclo-hexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-1H-benz[e]indolium, sal interna, sal de sodio, con PEG 3400 \alpha,\omega-diamina

Se utilizó el esquema de reacción dado a continuación para producir el compuesto del título:

10

100

101

donde X es NH-CS-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}NH-CS-NH).

Ejemplo 4 Preparación del producto de reacción de 2-[2-[2-(4-isotiociano)fenoxi-3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden]etiliden]-1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-1H-benz[e]indolium, sal interna, sal de sodio, con PEG 3400 \alpha,\omega-diamina

Se produjo el compuesto del título de manera análoga al Ejemplo 3 empleando PEG 10.000 \alpha,\omega-diamina.

Ejemplo 5 Preparación del producto de reacción colorante: polímero 2:1 bis(tioéter) entre 2-[2-[2-(cloro-3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]-indol-2-iliden]etiliden]-5-(etoxicarbonil)-1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-1H-benz[e]indolio, sal interna, sal sódica, y \alpha,\omega-ditiolato-PEG 3.400 disódico (NC 1000448)

11

Una solución de 1,9 g poli(etilenglicol)-\alpha,\omega-ditiol de peso molecular 3.400, de Shearwater Polymers, Inc. ,en 8,5 ml de dimetil formamida seca y con burbujeo de nitrógeno se trató con 0,1 g de hidruro de sodio al 50%, y luego se añadió gota a gota, bajo nitrógeno y a temperatura ambiente a lo largo de 15 minutos, a una solución agitada de 0,89 g de 2-[2-[2-cloro-3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfonilpropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden)etiliden]-5-(etoxicarbonil)-1-ciclohexen-1-il)etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-1H-benz[e]indolio en 9 ml de dimetilformamida anhidra con burbujeo de nitrógeno. Al cabo de dos horas y media, se trató la mezcla de reacción con dióxido de carbono en exceso, se hizo evaporar el disolvente y se aisló el deseado aducto colorante:polímero 2:1 por cromatografía en columna (SiO_{2}: metanol al 15% en cloroformo).

Los resultados de la biodistribución se presentan en las Figuras 1a (una hora después de la dosificación) y 1b (tres horas después de la dosificación).

Ejemplo 6 Burbujas de gas encapsuladas en una cáscara absorbente de luz

Se prepara un colorante de cianina de la estructura general de fórmula II con n=3, X=C(CH_{3})_{2}, R_{1}=H, R_{2}=C_{18}H_{20} y Z=Cl^{-} por métodos conocidos en la especialidad (Southwick y col. Cytometry, 11, páginas 418-430; Mujumdar, S.R. y col. 1996, Bioconjugate Chem. 7, páginas 356-363). A una suspensión espesa de 20 \mug del colorante en 1 ml de una solución al 5% de propilen glicol-glicerina en agua se añaden 5 mg de fosfatidilserina (90-99,9% en moles). Se calienta la dispersión a no más de 80ºC durante 5 minutos, luego se enfría a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se pasa a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se inunda con perfluorobutano. Se sacude el vial en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, luego se coloca la muestra sobre una mesa de rodillos. Después de la centrifugación, se intercambia el infra-nadante con agua y se repite el lavado.

Ejemplo 7 Formación de imagen fotoacústica con radiación infra-roja y NC100448

El agente de contraste (4,6 mg) se disolvió inmediatamente antes del uso en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (agente tampón de Dulbecco). La solución se filtró doblemente a través de un filtro de jeringuilla con un tamaño de poro de 0,45 \mum y luego se almacenó en la oscuridad antes de la inyección.

Los animales de ensayo eran ratones desnudos inmunocompetentes de aproximadamente 23 g de peso, que se anestesiaron i.m. con 5 \mul de xilazina (Rompun) y 10 \mul de cetamina antes de las mediciones.

La luz irradiada se produjo con un láser de alejandrita que operaba a una frecuencia de 750 nm. El haz de luz se atenuó con un filtro de densidad neutra de manera que la energía impartida por cada impulso a la piel del ratón era inferior a 50 milijulios.

Para la formación de imagen, el ratón se colocó en posición de descanso sobre un transductor acústico de niobato de litio. Se detectó la señal fotoacústica después de que pasara al lado opuesto del ratón desde la radiación incidente. La señal se detectó después de atravesado el cuerpo del ratón al lado opuesto desde el punto de irradiación.

Antes de la inyección del agente de contraste, se colocó el primer ratón sobre su espalda sobre el transductor para hacer máxima la señal interna cuando la piel de encima del hígado era irradiada. El haz de luz era mucho más pequeño que el propio hígado, y la señal detectada era probablemente de los vasos sanguíneos del interior del
hígado.

La dosis inyectada era de 100 \mul inyectados intravenosamente en la vena caudal con una aguja de calibre 26. Inmediatamente después de la inyección se colocó de nuevo el ratón para señal máxima. La señal máxima detectada de los vasos sanguíneos del hígado era de 5 a 10 veces mayor que la obtenida antes de la inyección del agente como muestra la Figura 2.

La Figura 2 muestra imágenes mono-dimensionales obtenidas de un ratón desnudo, inmunocompetente, antes y después de la inyección de una solución de NC100448 en la vena caudal. El borde a mano derecha de cada trazado corresponde al punto en el que se irradia la piel. La luz absorbida generaba una onda de presión que pasaba a través del cuerpo del ratón y era detectada con un transductor que generaba una señal eléctrica medida en milivoltios. El eje del fondo muestra el tiempo que sigue al impulso de radiación. Los componentes de la onda de presión que se generaba dentro del cuerpo del ratón fueron los detectados primero y aparecen a la izquierda del trazado. El componente del trazado generado sobre la piel se detectó más tarde y aparece a la derecha. La profundidad dentro del ratón del punto de origen de la onda de presión es proporcional al tiempo de llegada del correspondiente impulso de presión. La escala se muestra en la parte alta de la figura.

Ejemplo 8 Formación de imagen fotoacústica con rayos X y sulfato de bario

Se obtienen rayos X monocromáticos con una energía de fotón de 20 a 30 keV con un doble monocromador de cristal utilizando rayos X blancos de un sincrotón. La intensidad del haz es modulada por un interruptor pulsatorio de plato de plomo rotatorio con una frecuencia de 10 Hz. La cámara de muestras es una célula cilíndrica con un volumen de aproximadamente 0,5 ml en un baño salino que tiene dos ventanas de berilio. El flujo de fotones en la cámara de muestras se mide con una cámara de ionización colocada enfrente.

La amplitud de la señal fotoacústica, normalizada para el flujo de fotones, se mide cuando la cámara de muestras contiene la solución salina y cuando contiene una suspensión de sulfato de bario. Estas suspensiones son fácilmente asequibles como agentes de contraste para formación de imagen del tracto gastrointestinal. También son adecuadas otras suspensiones de partículas que contienen metales pesados. La señal es mayor cuando la cámara contiene el agente de contraste.

Ejemplo 9 Formación de imagen fotoacústica con rayos X y yodixanol

Se obtienen rayos X monocromáticos con una energía de fotón de 20 a 30 keV con un monocromador de doble cristal utilizando rayos X blancos de un sincrotón. La intensidad de haz se modula con un interruptor pulsatorio de plato de plomo rotatorio con una frecuencia de 10 Hz. La cámara de muestras es una célula cilíndrica con un volumen de aproximadamente 0,5 ml en un baño salino que tiene dos ventanas de berilio. El flujo de fotones en la cámara de muestras se mide con una cámara de ionización colocada enfrente.

La amplitud de la señal fotoacústica, normalizada para el flujo de fotones, se mide cuando la cámara de muestras contiene la solución salina y cuando contiene una solución de yodixanol en PBS. El yodixanol es un agente de contraste soluble conocido. Se pueden emplear otros agentes de contraste solubles que contienen yodo. La señal es mayor cuando la cámara contiene agente de contraste.

Ejemplo 10 Formación de imagen fotoacústica con microondas y partículas supermagnéticas suspendidas

La radiación de microondas se genera con un klistrón impulsado que trabaja a 2,45 GHz. El klistrón se acopla a una guía de ondas en una antena de bocina a 30 cm del recipiente de muestras, que está hecho de teflón. El recipiente de muestra es de 1 cm de diámetro y está sumergido en un baño de liposin.

La señal acústica tras cada impulso de radiación se detecta con un ttransductor acústico de niobato de litio colocado en la pared del baño. El tiempo de tránsito de la señal acústica desde la muestra a la pared del baño es proporcional a la distancia de la muestra desde la pared del baño.

La amplitud de la señal obtenida cuando el recipiente de muestras contiene la suspensión líquida de partículas paramagnéticas es mayor de la obtenida cuando el recipiente de muestras contiene agente tampón PBS.

Ejemplo 11 Formulación de verde de indocianina en un liposoma

Se añadió verde de indocianina (ICG) a una suspensión de liposomas formada por 8,2% de lecitina (fosfatidil colina), 0,8% de dimiristalfosfatidilglicerina, y 0,1% de un agente tensioactivo polímero no-iónico, P-79, destinado a impartir al liposoma una residencia de acumulación en sangre prolongada. Se mezclaron los fosfolípidos y el agente tensioactivo con agua utilizando energía ultrasónica desde un sonicador de sonda (Bransonic Sonifier 450, 90% de ciclo de utilización, producción 10). Se prepararon liposomas utilizando un microfluidizador Microfluidics M110S a 14.000 PSI y 4 pases a través de la cámara de interacción de la mezcla de fosfolípido. Los liposomas resultantes eran de un diámetro medio de aproximadamente 100 nm determinado por dispersión luminosa y permanecen del mismo tamaño después de esterilización en autoclave. Además, estos liposomas eran capaces de pasar a través de un filtro estéril (es decir de tamaño de poro de 0,2 micras). La adición de ICG en cantidad suficiente para hacer que la suspensión tuviera aproximadamente 7 mg/ml de ICG no alteraba las características físicas de las suspensiones liposómicas. Después de esterilización bajo atmósfera de nitrógeno, estos liposomas de ICG eran estables durante al menos 6 semanas a temperatura ambiente.

La comprobación de las propiedades de espectro de ICG liposómicaorespecto a ICG disuelto en agua o solución salina demostró el impacto del medio entorno liposómico. Tanto la longitud de onda de excitación máxima como la longitud de onda de emisión se desplazaron a energías más bajas (es decir, longitudes de onda más altas) respecto a las soluciones acuosas homogéneas. Además, medidas cuidadosas del rendimiento cuántico muestran un incremento de al menos el cuádruple en rendimiento cuántico del ICG liposómico respecto a soluciones acuosas de ICG. No obstante, es de esperar que la radiación con luz de máximo de absorbencia de ICG dé por resultado la generación de onda de presión que emana de la interfase entre los liposomas y el medio acuoso en volumen, la cual será detectable por una señal acústica para aplicaciones de formación de imagen.

Ejemplo 12 Suspensión de liposomas de colorante absorbente de rayos X para formación de imagen foto-acústica

Se prepararon liposomas (CTP-10) de fosfatidilcolina y fosfatidil serina en una relación molar de 10 a 1 por extrusión a través de filtros de tamaño de poro de 1 micra apilados, a presión. Estos liposomas se prepararon en una solución que contenía 400 mg/ml de yodixanol, un agente de contraste de rayos X soluble yodado. Según esto, cada liposoma contenía una cantidad significativa de agente de contraste yodado dentro de la acumulación acuosa interna del liposoma. Esta formulación de agente de contraste de rayos X de CT encapsulado en liposoma (es decir yodixanol) se administró a conejos como un bolus individual de 150 mg de yodo/kg, un bolus dividido de 2x75 mg de yodo/kg, y se llevó a cabo una infusión de 10 minutos de 80 mg de I/minuto (dosis total = 800 mg de I o aproximadamente 265 mg de yodo/kg a1 ml/min.). La formación de imagen de rayos X se llevó a cabo sobre un equipo de exploración (scanner) de CT de espiral GE en Palo Alto Veterans Hospital, Palo Alto, California. Ni el bolus individual ni el bolus dividido condujeron a opacificación significativa de la sangre al cabo de 1 minuto después de la administración. La infusión sin embargo proporciona una opacificación útil de la sangre durante la infusión así como potenciamiento del hígado. Incluso a 5 minutos de infusión, el contraste en la aorta es de aproximadamente 125 HU, al menos 50 HU por encima de los niveles de opacificación del fondo.

Con respecto a la formación de imagen fotoacústica, los datos de CT muestran claramente los niveles de agente de contraste presentes dentro de las diversas estructuras (es decir, hígado, sangre). La actual creencia en este campo es que cada 30 HU es igual a aproximadamente 1 mg/g de yodo o, más aproximadamente, 2 mg de agente de contraste /g de tejido. Según esto, en los anteriores regímenes de dosificación se alcanzan niveles de agente de contraste de hasta 8-10 mg/g tejido. Es de esperar, por tanto, que los detectores acústicos localizados sobre o cerca del cuerpo del conejo capten las señales generadas por la expansión del propio liposoma al exponerlo a los rayos X de diagnóstico debido al calor dentro del liposoma por la absorción de rayos X por el agente de contraste de rayos X. Si el haz de rayos X se puede modular electrónicamente o mediante un obturador, la señal fotoacústica podría utilizarse para perfilado de profundidad así como formación de imagen planar.

Ejemplo 13 Preparación de una emulsión estable de Sudan III

El Sudan III (llamdo también Rojo D&C No. 17, Rojo Disolvente 23, Rojo de Cerasina) es muy insoluble en agua, pero soluble en aceite de sésamo, un aceite muy conocido para emulsiones aceite-en-agua parenterales (por ejemplo Intralípido, Liposyn, etc.) y tiene una longitud de onda máxima de absorción de luz de 507 nm. Se preparó una emulsión de Sudan III como sigue: Se preparó una solución saturada de Sudan III en aceite de sésamo haciendo girar suavemente el recipiente durante todo el fin de semana (aproximadamente 72 horas). Se filtró entonces la solución de aceite a través de un filtro de jeringuilla de 5 micras seguido de un filtro de 0,8 micras para eliminar el Sudan III sólido sin disolver. La solución saturada resultante se emulsionó entonces en agua a una relación de 10% de "aceite" a solución de agente tensioactivo acuoso al 90% utilizando energía ultrasónica seguido de microfluidización a aproximadamente 14.000 PSI hasta alcanzar un tamaño de gota constante. El tamaño de gota se midió por dispersión de luz utilizando un dispositivo de dispersión de luz Horiba 910 y un volumen de pesada medio. Las emulsiones resultantes se esterilizaron también por esterilización con vapor tradicional y se midió de nuevo el tamaño de gota con los siguientes resultados:

Formulación	Tamaño medio de gota (nm)
	Antes de autoclave	Tras autoclave
1	1,2% lecitina,0,3% F68	787	909
2	1,2% lecitina.2% P79	141	199
3	0,8% lecitina, 3% P79	122	128

El P79, descrito en el Ejemplo 2k de la Publicación de Patente Internacional WO 96/07434, es un éster doble de PEG de peso molecular de aproximadamente 10.000 y de fórmula: CH_{3}(CH_{2})_{13}COO(CH_{2})_{15}COO((CH_{2})_{2}O)_{n}CH_{3}. El P79 es una agente tensioactivo polimérico que contribuye en gran medida a la capacidad de hacer pequeñas las gotas de la emulsión de aceite de sésamo saturada con Sudán III. La emulsión de color rosa resultante es estable en
depósito.

Es de esperar que, a la irradiación con luz de 507 nm, estas gotitas de aceite se expandan y generen una onda de presión desde su interfase de agua debido al desprendimiento de calor desde el colorante excitado después de la absorción de luz. Así, una fuente de luz modulada proporcionará perfilado en profundidad por detección acústica mientras que la irradiación continua permitirá microscopia fotoacústica.

Ejemplo 14

Se prepararon liposomas como en el Ejemplo 11 anterior con adición de colorante absorbente soluble en agua tal como los descritos en la Solicitud de Patente estadounidense No. de serie 08/848.586 titulada "Método de tratamiento de tumores", registrada el 29 de abril de 1997 a nombre de William Anthony Sanderson, y en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/GB98/01245. De nuevo, los propios liposomas generarán una onda de presión como resultado de la absorción de luz a la longitud de onda apropiada del colorante encapsulado dentro de la acumulación acuosa del liposoma. Esta onda de presión será útil para formación de imagen acústica, completando así el paradigma de la formación de imagen fotoacústica.

Ejemplo 15 Preparación de una suspensión de partículas superparamagnéticas

Se preparó una suspensión de partículas según el método descrito en el Ejemplo 1 de WO 97/25073, siguiendo las etapas del método dadas a continuación:

A. Preparación de solución de almidón

1. Se suspenden 50 gramos de almidón de patata soluble (CAS No. 9005-84-9) en 850 gramos de agua desionizada a ebullición y se mezcla.

2. Se lleva a ebullición y cuando hierve se coloca inmediatamente la solución de almidón en un baño maría a 55ºC.

B. Adición de hierro e hidróxido amónico al almidón

1. Se disuelven 9,0 gramos de FeCl_{3}.6H_{2}O y 3,3 gramos de FeCl_{2}.4H_{2}O (relación molar de FeIII y FeII de 2:1) en un volumen total de 50 ml de agua desionizada.

2. Una vez enfriada la solución de almidón a una temperatura estacionaria de 55ºC, se vierte la solución de hierro en la solución de almidón, se mezcla a fondo y se añaden 50 ml de NH_{4}OH al 30% (conc.)

3. Se calienta la solución resultante para aumentar la temperatura a 89ºC a lo largo de 2 horas y se mantiene a 89ºC durante otros 50 minutos.

4. Al cabo de 170 minutos de calentamiento sobre baño maría, se deja enfriando toda la noche a 4ºC.

C. Procedimiento de lavado

Se lava por bombeo de agua desionizada fría a través de la suspensión sedimentada hasta que el pH es inferior a 8,5.

D. Escisión oxidante con hipoclorito de sodio

Se hace una valoración de la dosis de la cantidad de hipoclorito de sodio (hipo) por gramo de gel sobre un nuevo lote para hacer óptima la producción. La producción de partículas magnéticas se comprueba por espectroscopia de correlación de fotón (PCS) en cuanto a tamaño y dispersabilidad, y por determinación de velocidades de relajación del protón del agua.

a.: Se tratan 1,8 mililitros de hipoclorito al 5% por 12,5 miligramos Fe/5 gramos de suspensión. Se ajusta el volumen de hipoclorito a la concentración de cloro disponible y de miligramos de Fe en 5 gramos de suspensión.

b.: Se pesa la suspensión, se añade hipoclorito y se calienta en baño maría a 70ºC durante 45 minutos.

c.: Se añade urea 8 M (0,8 ml/5 gramos de suspensión) después de calentar. La urea inactiva el exceso de hipoclorito.

d.: Se filtra con diálisis utilizando una membrana (corte de paso de pesos moleculares MW <100 kD) hasta que ha sido separado todo el Fe libre y el CHO.

El resultado fue una suspensión negra en la que se encontró un contenido de aproximadamente un 8% de hierro (determinado por ICP).

Ejemplo 16 Respuesta térmica de una suspensión de partículas superparamagnéticas a radiación de microondas

Se llevó a cabo un experimento para demostrar que una suspensión de partículas superparamagnéticas da una respuesta potenciada a radiación de microondas comparada con agua. Se cargó un matraz Erlenmeyer de 125 ml de capacidad con 100 ml de una suspensión de partículas super-paramagnéticas preparada como se ha descrito en el anterior Ejemplo 15. Se cargó un matraz idéntico con 100 ml de agua destilada. Se colocaron ambos matraces en el plato del carrusel rotatorio del interior de un horno de microondas Sharp Carousel Household Microwave Oven (modelo R-5 A97). Se hizo funcionar entonces el horno de microondas a un nivel de potencia 5 (50% de la potencia máxima) durante intervalos de 20 segundos, durante los cuales se hizo girar el plato del carrusel. Se midió la temperatura de cada muestra entre los intervalos de operación de 20 segundos, sacando rápidamente la muestra, midiendo la temperatura con un termómetro y colocándola otra vez rápidamente en el horno de microondas. Se registraron las temperaturas y se repitió rápidamente el ciclo de operación de 20 segundos. Después de un cierto número de repeticiones de este proceso el experimento estaba terminado. Para confirmar la tendencia observada en los resultados, se repitió el experimento completo con una segunda muestra de la suspensión de partículas superparamagnéticas y una segunda muestra de agua destilada. Los resultados se muestran a continuación:

12

* En cada caso a 180 segundos hubo algo de ebullición de la suspensión de partículas superparamagnéticas.

Ejemplo 17 Preparación de verde de indocianina encapsulado en liposoma

La solución A contenía 435,06 mg/ml de Yohexol, 10,88 mg/ml de P79 y 6,44 mg/ml de ICG en 25 ml de agua NanoPure.

La solución B consistió en 4,1% de Tris-HCl y 0,41% de EDTA en agua NanoPure.

A 23,56 ml de Solución A se añadieron 1,44 gramos de una mezcla 10:1 de fosfatidil colina y fosfatidil seina. La solución resultante se calentó a 80ºC con agitación hasta que los fosfolípidos se transformaban del estado sólido a gel. La mezcla se calentó entonces y se agitó durante 20 minutos. Hubo una considerable formación de espuma. Se reemplazó la pérdida de agua por evaporación. La solución caliente se homogeneizó durante 20 segundos (24.000 rpm) y se extruyó inmediatamente a 80ºC a través de siete membranas de policarbonato de 1 micra apiladas, a presión de 0,07 kg por milímetro cuadrado a 0,10 kg por milímetro cuadrado (100-150 psi). En el filtro quedó algo de color verde. El producto final se produjo por adición de 1 parte de solución B a 40 partes de la mezcla extruida. Se congeló y se almacenó 4 días antes de descongelar durante 4 horas a temperatura ambiente.

Ejemplo 18 Formación de imagen fotoacústica con irradiación infra-roja y verde de indocianina encapsulado en liposomas

El procedimiento de formación de imagen fue el mismo que el descrito en el Ejemplo 7. Después de encontrar las señales máximas del área de los hígados y de los costados, se inyectó a cada dos ratones 100 \mul de verde indocianina liposómico. Se practicó un masaje para trasladar la solución viscosa desde la vena caudal a la vasculatura en conjunto. Se volvieron a registrar las señales máximas de hígado y costados. El potenciamiento de la señal producida por el agente de contraste era de 5 a seis veces, tal como se muestra en la Figura 3.

Claims

1. Un método de generación de una imagen del cuerpo de una persona o de un animal o de parte de ese cuerpo al que se ha administrado previamente un agente de contraste fisiológicamente tolerable que comprende un componente inductor de presión, comprendiendo el citado método exposición de dicho cuerpo a radiación, detección de las ondas de presión generadas en dicho cuerpo por la citada radiación y generación de esta forma de una imagen optoacústica de al menos una parte de dicho cuerpo que contiene el citado agente de contraste.

2. Método según la reivindicación 1 donde el citado agente de contraste comprende adicionalmente un componente que absorbe radiación.

3. Utilización de un agente de contraste que comprende un componente inductor de presión para la manufactura de un medio de contraste para la administración al cuerpo de una persona o de un animal para tratamiento o diagnóstico del citado cuerpo o parte del mismo, que supone la generación de una imagen fotoacústica del citado cuerpo.

4. Utilización según la reivindicación 3 donde el citado agente de contraste comprende adicionalmente un componente de absorción de la radiación.

5. Método o uso tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde se emplea radiación con una longitud de onda de 300 a 1300 nm.

6. Método o uso según la reivindicación 5 donde se emplea radiación con una longitud de onda de 600 a 1300 nm.

7. Método o uso según la reivindicación 5 donde se emplea radiación con una longitud de onda de 625 a 1200 nm.

8. Método o uso según la reivindicación 5 donde se emplea radiación con una longitud de onda de 650 a 1000 nm.

9. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde se utiliza radiación de rayos X o rayos gamma con una longitud de onda de menos de 0,1 \mum.

10. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde se utiliza radiación de microondas con una frecuencia de 0,3 GHz a 30 GHz.

11. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde se emplean cortos impulsos de radiación.

12. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4 a 8 donde el citado componente absorbente de radiación incluye un compuesto colorante.

13. Método o uso según la reivindicación 12 donde el citado compuesto colorante se selecciona del grupo que comprende colorantes de cianina, colorantes de escuarilio, croconio, colorantes de ftalocianina, colorantes de naftalocianina, colorantes de xanteno, colorantes de dibenzoxanteno, colorantes de merocianina, colorantes de trifenilmetano o porfirinas.

14. Método o uso según la reivindicación 12 donde el citado compuesto colorante tiene la fórmula:

14

donde

cada Z_{1} se selecciona independientemente del grupo que consiste en:

hidrógeno,

un grupo etilo opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxilo, carboxilo, sulfonato, fosfonato, y poli(alquilen oxidilo) tal como \omega-hidroxipoli(etilen oxidilo) y \omega-metoxipoli(etilen oxidilo) cuyos pesos moleculares pueden ser de hasta aproximadamente 50.000.

un grupo ácido carboxílico que puede ser un grupo carboxilato,

un grupo sulfonato

un grupo hidroxilo,

un grupo fosfato,

un grupo aminotiocarbonilaminoalquil tiourea de C_{1-16}, cuya porción alquilo está opcionalmente sustituida como se ha definido antes

y un ciclo aromático anillado que comprende un anillo benzo[e]aromático, un anillo benzo[f]aromático, o un anillo benzo[g]aromático, donde e, f y g se definen respecto a la estructura de indol como patrón y cada uno de los anillos puede estar sustituido por grupos alquilo de C_{1-16}, alcoxilo de C_{1-16}, carboxilo, sulfonato, sulfonamido, fenilo, poli(alquilen oxidilo) o fenoxilo como se han definido antes;

cada R'_{1} se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en grupo metilo y alquilo de C_{2-16} incluyendo grupo alquilo sustituido donde el alquilo está opcionalmente sustituido como se ha definido antes,

Q_{1} se selecciona del grupo que consiste en (CH=CH)_{n} donde n tiene un valor de 1 a 6,

15

donde Z_{2} se selecciona del grupo que consiste en H, cloro, O-alquilo, S-alquilo, donde el alquilo está opcionalmente sustituido como se ha definido antes, O-poli(alquilen oxidilo), S-poli(alquilen oxidilo), donde el poli(alquilen oxidilo) se define como antes e incluye también grupos poli(óxido de alquileno) al que se une otro colorante en el terminal \omega, O-fenilo, S-fenilo, donde los grupos fenilo pueden estar sustituidos con grupos alquilo opcionalmente sustituidos como se ha definido antes. Grupos O-alquilo como se han definido antes, grupos S-alquilo como se han definido antes, grupos amino-tiocarbonilaminoalquilo, y grupos aminotiocarbonilaminofenilo, y

16

y

15. Método o uso según la reivindicación 12 donde el citado compuesto colorante tiene la fórmula II:

17

donde

n es un entero que tiene un valor de 1 a 6;

cada R_{1}, que puede ser el mismo o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo solubilizante, o sustituyentes R_{1} adyacentes junto con los carbonos del anillo al que van unidos forman una estructura cíclica, preferiblemente un anillo de 5 ó 6 eslabones;

cada R_{2}, que puede ser el mismo o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo lipófilo, alternativamente cada R_{2} puede ser grupo alquilo de C_{2-8} opcionalmente insaturado que va unido a uno o más grupos solubilizantes;

cada X, que puede ser igual o diferente, representa cada uno O, S, -CH=CH- o C(R_{3})_{2} en que cada R_{3}^{,} que puede ser el mismo o diferente, representa un átomo de hidrógeno o más preferiblemente un grupo metilo o etilo;

Z es un contra-ión fisiológicamente tolerable, preferiblemente I, Br o Cl.

cada grupo solubilizante que puede ser el mismo o diferente es grupo sulfato, carboxilato, fosfato, hidroxi, oxiácido o tiol, o un grupo alquilo de C_{1-6} sustituido con uno o más de tales grupos.

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16. Método o uso según la reivindicación 16 donde el citado componente absorbente de radiación comprende un elemento con número atómico superior a 20.

17. Método o uso según la reivindicación 16 donde el citado componente absorbente de radiación comprende un elemento seleccionado entre bario, wolframio, yodo, bromo, bismuto y elementos lantánidos.

18. Método o uso según la reivindicación 9 donde el citado componente absorbente de radiación incluye un compuesto yodado que contiene al menos un átomo de yodo por molécula, preferiblemente al menos tres átomos de yodo por molécula, más preferiblemente al menos seis átomos de yodo por molécula.

19. Método o uso según la reivindicación 16 donde el citado componente absorbente de radiación incluye un compuesto altamente yodado.

20. Método o uso según la reivindicación 9 donde el componente absorbente de radiación está en forma de suspensión de partículas sólidas en un líquido fisiológicamente aceptable.

21. Método o uso según la reivindicación 9 donde el componente absorbente de radiación está en forma de material sólido, líquido o gaseoso encapsulado en micelas o liposomas.

22. Método o uso según la reivindicación 21 donde el material gaseoso es xenon.

23. Método o uso según la reivindicación 9 donde el agente de contraste está en la forma de una suspensión de partículas sólidas o líquidas en un líquido fisiológicamente aceptable.

24. Método o uso según la reivindicación 20 o la reivindicación 23 donde las partículas tienen diámetros de 100 a 500 nm.

25. Método o uso según la reivindicación 23 donde el agente de contraste está en la forma de un material sólido o líquido encapsulado en micelas o liposomas.

26. Método o uso según la reivindicación 10 donde el agente de contraste está en la forma de una suspensión de partículas superparamagnéticas en un líquido fisiológicamente aceptable.

27. Método o uso según la reivindicación 26 donde las partículas tienen diámetros de 5 a 30 nm.

28. Método o uso según la reivindicación 10 donde el agente de contraste está en forma de una suspensión de partículas de un material cerámico seleccionado entre Co_{2}O_{3}, MnO_{2}, NiO y CuO, en un líquido fisiológicamente aceptable.

29. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde el citado agente de contraste comprende un ligando de inserción dirigida activo.

30. Método o uso según la reivindicación 29 donde el ligando activo de inserción dirigida es capaz de unirse a un receptor de dihidrofolato reductasa.

31. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 donde el citado componente inductor de la presión es un gas.

32. Método o uso según la reivindicación 31 donde el citado gas es xenon o un perfluorohidrocarburo.

33. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 donde el citado componente inductor de presión es un precursor del gas.

34. Método o uso según la reivindicación 33 donde el citado precursor del gas se selecciona entre grafito, aminomalonatos, carbonatos, bicarbonatos, compuestos de diazonio fisiológicamente aceptables, ésteres carbonato que contienen agrupaciones del tipo -CO-O-CR^{1}R^{2}-O-CO-OR^{3}, y \beta-cetoácidos.

35. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 donde el citado componente inductor de presión es una gota de emulsión aceite-en-agua.

36. Método o uso según la reivindicación 35 donde la citada gota de emulsión comprende un colorante lipófilo absorbente de luz.

37. Método o uso según la reivindicación 35 donde la citada gota de emulsión contiene partículas absorbentes de luz.

38. Método o uso según la reivindicación 36 donde las citadas partículas absorbentes de luz comprenden partículas de grafito y/o partículas de pigmento modificado en la superficie.

39. Un estuche de piezas de un método o uso según se reivindica en las reivindicaciones 2 ó 4 que comprende un componente absorbente de radiación según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22 y un componente inductor de presión según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 36, siendo adecuados los citados componentes para administración separada, simultánea o secuencial a una persona o a un animal.

40. Método o uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el citado agente de contraste comprende al menos un grupo cromóforo unido a una molécula de agente tensioactivo.