ES2205914T3

ES2205914T3 - Particulas magneticas para la purificacion de acidos nucleicos.

Info

Publication number: ES2205914T3
Application number: ES99959300T
Authority: ES
Inventors: Herbert Harttig; Michael Riedling; Martin Mennig; Helmut Schmidt
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-11-30
Filing date: 1999-11-23
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2019-11-23
Also published as: PT1144620E; CA2352490A1; US6919444B2; DE59906909D1; EP1144620A1; NO329549B1; DK1144620T3; WO2000032762A1; ATE248911T1; NO20012620D0; US6545143B1; JP2002531084A; JP3561270B2; AU1652800A; US20030125542A1; JP3561235B2; CA2352490C; NO20012620L; AU762188B2; JP2004135678A

Abstract

Preparación que contiene partículas con una superficie vítrea, en donde más del 75% en peso de estas partículas tienen un tamaño de grano entre 0, 5 y 15 m caracterizada porque la superficie vítrea está compuesta de SiO2, B2O3, K2O, CaO, Al2O3 y ZnO.

Description

Partículas magnéticas para la purificación de ácidos nucleicos.

Es objeto de la presente solicitud de patente una preparación de partículas con una superficie vítrea, un procedimiento para la obtención de dicha preparación, así como un procedimiento para la purificación de ácidos nucleicos con ayuda de esta preparación.

Los ácidos nucleicos han estado en los tiempos recientes en el punto de vista del interés del diagnóstico médico. Así por ejemplo, se han elaborado últimamente un gran número de procedimientos de comprobación, en los cuales se evalúa la presencia o ausencia de determinados ácidos nucleicos como indicadores de una enfermedad. A estos pertenecen p. ej., la comprobación de organismos infecciosos, p. ej., de virus o bacterias en líquidos corporales, pero también la comprobación de mutaciones en ácidos nucleicos genómicos, p. ej., en Oncología. Los ácidos nucleicos figuran en el material de las muestras normalmente utilizadas en muy pequeñas concentraciones. Por este motivo se han elaborado diferentes procedimientos para aislar los ácidos nucleicos de los otros componentes de las muestras, como son proteínas u otros componentes celulares, los cuales entorpecen aunque parcialmente los subsiguientes procedimientos de comprobación. Una parte de estos procedimientos utilizan sondas de captura unidas en fase sólida, las cuales pueden hibridar con los ácidos nucleicos que van a separarse y los retienen en la fase sólida, mientras que el resto de componentes de la muestra son eliminados. Dicho procedimiento está descrito por ejemplo en EP-B-O 305 399. Estos procedimientos tienen sin embargo la desventaja de que son válidos solamente para la purificación de ácidos nucleicos que tienen una secuencia de nucleótidos muy especial.

En la patente WO 91/12079 está descrito un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos con ayuda de partículas magnéticas de celulosa y óxido de hierro en las cuales el tamaño de partícula está entre 1 y 10 \mum. Estas partículas no poseen ninguna superficie vítrea y sirven solamente para un aislamiento por precipitación de los ácidos nucleicos. Por agregación quedan encerrados un gran número de componentes de las muestras, los cuales más tarde entorpecen los diferentes pasos del procedimiento.

En la patente EP-B-0389 063 se propone un procedimiento en el que la muestra se mezcla con una mezcla de una sal caótropa de guanidinio y partículas de sílice. Bajo estas condiciones los ácidos nucleicos se unen con relativa independencia de la secuencia a la superficie de la sílice. El resto de componentes de la muestra pueden eliminarse por lavado y a continuación se eluyen los ácidos nucleicos.

En la patente WO 96/41811 se describen partículas magnéticas con una superficie vítrea esencialmente exenta de poros para la purificación independientemente de la secuencia de los ácidos nucleicos. Las partículas empleadas tienen un núcleo de preferencia con magnetita como material magnético y tienen un tamaño de núcleo de preferencia entre 10 y 60 \mum. La magnetita en cristales de tamaño aproximadamente 30 a 50 nm muestra propiedades de magnetismo duro. Mediante un campo magnético externo se induce un magnetismo permanente. Las partículas con dichos núcleos magnéticos duros muestran después del primer efecto de un campo magnético externo las propiedades de un pequeño imán permanente. En suspensión, estas partículas se atraen mutuamente y forman grandes unidades. Estas grandes unidades sedimentan bajo la influencia de un intenso campo externo, más rápidamente que las partículas solas. Esto es desventajoso puesto que es necesaria una incubación, con lo que la duración aumenta.

En la patente 96/41840 se describen pigmentos que presentan una superficie vítrea con un grueso de por lo menos 0,8 \mum. Como componente formador del vidrio se proponen también los compuestos de zinc. Con ello se generan partículas de pigmento con un tamaño de partículas de preferencia 2 a 20 \mum.

Se ha comprobado que en los procedimientos descritos hasta ahora para la obtención de partículas según el procedimiento de sol-gel, en el cual partículas con núcleo de un tamaño predeterminado se recubren con un gel y a continuación tiene lugar un espesamiento hasta obtener una superficie vítrea, se forma una alta proporción de partículas que no contienen ningún núcleo en la partícula. Esto conduce a que, en los procedimientos de comprobación de ácidos nucleicos efectuados con tales preparaciones, se produzcan grandes pérdidas de ácidos nucleicos, o bien que deban separarse los componentes finos, con un alto coste, para aumentar el rendimiento. Ha sido un objetivo de la presente invención, el mejorar el estado actual de la técnica, completa o parcialmente, en particular obtener partículas con una distribución de tamaños de núcleos relativamente estrecha, y aumentar el rendimiento en la purificación de ácidos nucleicos, o/y preparar partículas para la purificación de ácidos nucleicos, de forma que aún después de la acción de un campo magnético externo, muestren una muy pequeña tendencia al agrupamiento y sedimenten tan lentamente en el campo gravitatorio, como aquellas que nunca han sido expuestas a un campo magnético.

Es un objeto de la invención la obtención de una preparación que contenga unas partículas con una superficie vítrea en la cual más del 75% en peso de estas partículas tienen un tamaño de grano entre 0,5 y 15 \mum.

Otros objetos de la invención son un procedimiento para la obtención de una preparación de partículas que contienen un núcleo rodeado con una capa de gel o una capa vítrea y un procedimiento para la purificación de ácidos nucleicos con ayuda de la preparación según la invención.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para la obtención de una preparación de partículas con un núcleo superparamagnético.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para la obtención de una preparación de partículas con un núcleo magnético, de preferencia un núcleo metálico magnético dulce.

Como partículas, el experto abarca los materiales sólidos que tienen un pequeño diámetro. De preferencia estas partículas tienen esencialmente una superficie esférica. Aquí deben incluirse también como partículas las que tienen forma de plaquitas e hilos en las dimensiones más abajo indicadas. Para ser particularmente adecuadas para la purificación de los ácidos nucleicos, es importante que las partículas tengan un núcleo (parte de pigmento), el cual es de preferencia, magnético y el cual está rodeado de una capa vítrea. Estos núcleos contienen de preferencia óxidos metálicos como óxido de aluminio, óxido de hierro, óxido de cromo, óxido de cobre, óxido de manganeso, óxido de plomo. óxido de estaño, óxido de titanio, óxido de zinc y óxido de zirconio, o metales como Fe, Cr, Ni o aleaciones magnéticas. La composición de este núcleo es para la función de las partículas según la invención poco esencial, puesto que el núcleo está rodeado de una superficie vítrea, de manera que el núcleo no entra directamente en contacto con la muestra de la cual se quiere separar el ácido nucleico. Estos núcleos pueden adquirirse comercialmente. Cuando el núcleo contiene Fe_{3}O_{4} (magnetita) o Fe_{2}O_{3} (maghemita) o Fe o Cr o Ni o aleaciones magnéticas, estos núcleos son magnéticos.

Como materiales que se designan como magnéticamente dulces, entran en cuestión metales a base de los elementos puros Fe, Ni, Cr y aleaciones de los mismos, de preferencia a base de Ni. Ejemplos de estas aleaciones son conocidos con la denominación de Permalloy. Están compuestos del 70 al 80% de Ni con adiciones de Cr, Cu y Mo. Las partículas de material magnético dulce no se atraen entre sí en ausencia de un campo magnético externo o sólo deficientemente.

Los polvos de metales finamente divididos son muy reactivos. En presencia de aire, existe el peligro de una autoexplosión, es decir, actúan como piróforos. Por este motivo es muy sorprendente que dichas partículas metálicas finamente divididas puedan recubrirse por el procedimiento de sol-gel con una capa vítrea, sin que varíen esencialmente sus propiedades magnéticas. Con particular preferencia se emplean como polvos de metales, polvos de ferrocarbonilo, de los cuales, los tipos reducidos con H_{2} presentan propiedades magnéticas particularmente preferidas. Propiedades preferidas presentan también los cristales filiformes de ferrocarbonilo.

Los polvos de metales tienen de preferencia un tamaño de grano entre 10 nm y 100 \mum, y con mayor preferencia, entre 200 nm y 8 \mum.

Una superficie vítrea en el sentido de la presente invención, está compuesta de un material amorfo que contiene silicio. El vidrio contiene de preferencia junto al óxido de silicio uno o más componentes siguientes (en % molar):

B_{2}O_{3} (0-30%), Al_{2}O_{3} (0-20%), CaO (0-20%), BaO (0-10%), K_{2}O (0-20%), Na_{2}O (0-20%), MgO (0-18%), Pb_{2}O_{3} (0-15%), ZnO (0-6%).

En una pequeña cantidad total del 0-5% pueden estar contenidos también un gran número de otros óxidos como p. ej., Na_{2}O, Mn_{2}O_{3}, TiO_{2}, As_{2}O_{3}, Fe_{2}O_{3}, CuO, ZrO_{2}, CoO, etc. Particularmente efectivas han demostrado ser las superficies de una composición de SiO_{2}, B_{2}O_{3}, Al_{2}O_{3}, CaO, K_{2}O y ZnO. Bajo el punto de vista del rendimiento en ácidos nucleicos, son particularmente preferidos los vidrios de borosilicato que tienen un contenido en óxido de zinc de 2-6, de preferencia aproximadamente 4 moles%. Particularmente preferida es la capa de vidrio de 68-79 moles% de SiO_{2}, 15-5 moles% de B_{2}O_{3}, 6-2,5 moles% de cantidad total en K_{2}O y Na_{2}O, 4-1 moles% de CaO, 8-2 moles% de Al_{2}O_{3}, 6-2 moles% de ZnO. Particularmente preferido en el sentido de la invención son los vidrios que se forman mediante el llamado procedimiento de gel-sol y subsiguiente secado y espesamiento de la capa formada. Este procedimiento es ya conocido en sus rasgos esenciales y fue p. ej., descrito en C.J. Brinker, G.W. Scherer "Sol Gel Science. The physics and chemistry of Sol Gel Processing" ("La ciencia del sol gel. Física y Química del procedimiento del sol gel"), Academic Press Inc. 1990, y Sol-Gel Optics, Processing and Applications ("Optica del sol-gel, procedimiento y aplicaciones"), Lisa C. Klein Ed. Kluwer Academic Publishers 1994, página 450 ff. así como en DE-A-1941191, DE-A-3719339, DE-A-4117041, y DE-A-4217432. En el procedimiento gel-sol, se incorporan los alcóxidos de componentes formadores de retículos, p. ej., SiO_{2}, B_{2}O_{3}, Al_{2}O_{3}, TiO_{2}, ZrO_{2} y ZnO juntamente con óxidos y sales de otros componentes, p. ej., en solución alcohólica, y se hidrolizan.

Mediante la adición de agua se pone en marcha el proceso de hidrólisis de los componentes de partida. La reacción transcurre con relativa rapidez puesto que los iones de álcali influyen catalíticamente sobre la velocidad de hidrólisis del éster de ácido silícico. Una vez terminada la formación del gel, puede secarse el gel formado y mediante un proceso térmico, concentrarse formando un vidrio.

La relación de cantidades sol/pigmento tiene una elevada influencia sobre el rendimiento en pigmento magnético según la invención. Se dan límites a esta relación, de forma que que la proporción en pigmento sea tan pequeña que la masa formada pueda todavía bombearse y pulverizarse. En el caso de una proporción de pigmento demasiado pequeña, la parte fina p. ej., de material no magnético, puede llegar a ser demasiado grande y convertirse en perjudicial. Teniendo presente el rendimiento en pigmento, se encontró como una relación regular de cantidades, la de 10 a 45 g de pigmento/100 ml de sol.

Se prefiere la preparación de una suspensión para la formación de un polvo, la cual se pulveriza a través de una tobera y el aerosol se seca durante el recorrido de caída. La tobera se calienta de preferencia, para acelerar el secaje de la suspensión. En función de la geometría de la tobera la temperatura de la misma es aproximadamente de 120 a 250ºC. Debe encontrarse un equilibrio entre una velocidad de evaporación suficiente y una pulverización sin impedimentos.

Con respecto al rendimiento debe escogerse una temperatura de espesamiento lo más alta posible. Sin embargo, si es demasiado alta se pegan las partículas unas con otras y se forman aglomerados que deben separarse por tamizado. Una adición de zinc a la capa eleva sorprendentemente el punto de fusión, de forma que es posible una temperatura de espesamiento más alta (entre 710 y 800ºC). El tratamiento final con aire conduce a altas temperaturas, a una pérdida de las propiedades magnéticas, por lo cual deben evitarse temperaturas demasiado altas. También aquí son posibles otras temperaturas mediante la adición de zinc (de preferencia entre 150 y 250ºC).

Se ha demostrado en el marco de la presente invención, que en el procedimiento descrito en la patente WO 96/41811 pueden emplearse como núcleos magnéticos aquellos que esencialmente son más pequeños. En particular se ha demostrado que es posible emplear núcleos del orden de los nanometros, p. ej., los de la magnetita con un tamaño de cristal inferior a 50 nm, de preferencia inferior a 30 nm. El límite inferior del tamaño de los núcleos se desprende de la manejabilidad de los núcleos, particularmente de su tendencia a la formación de agregados. De preferencia los núcleos son mayores de 5 nm, con particular preferencia mayores de 7 nm. El comportamiento magnético de los núcleos del orden de los nanometros recibe el nombre de superparamagnético. Las partículas obtenidas sedimentan rápidamente bajo la acción de un campo magnético exterior. Después de la redispersión, la velocidad de sedimentación en el campo de gravitación no se diferencia de la velocidad de sedimentación en el campo de gravitación antes de la acción del campo magnético externo. Es ventajoso a este respecto, que los tiempos de incubación de la suspensión sean más prolongados para que no se tenga que mezclar de nuevo y resuspender.

Para la obtención de la preparación según la invención se emplea una preparación de partículas de núcleo en las cuales más del 75% en peso de las partículas de núcleo tienen un tamaño de núcleo entre algo menos de 0,5 y algo menos de 15 \mum, en el procedimiento de sol/gel. Las partículas de núcleo deben ser tan pequeñas como las partículas rodeadas de vidrio, como implica el grueso de la capa de vidrio. La capa de vidrio tendrá el grueso, de acuerdo con el procedimiento según la invención, entre 5 nm y 1 \mum, en función de las circunstancias elegidas, como la relación de gel a partículas de núcleo. En cuanto al diámetro, la capa de vidrio debería tener un grueso entre 0,2 y 0,3 \mum.

Particularmente preferida es una preparación que contiene partículas con una superficie vítrea en la que más del 75% en peso de estas partículas tienen un tamaño de grano entre 2 y 15 \mum. Particularmente preferido es que la proporción de partículas con el tamaño de grano determinado sea mayor del 90% en peso.

Con particular preferencia se emplean partículas de núcleo magnéticas. La preparación según la invención tiene la ventaja de que preferentemente más del 95% en peso de partículas con un tamaño de grano entre 0,5 y 15 \mum, de preferencia entre 2 y 15 \mum, son magnéticas. Esto significa que frente al conocido procedimiento la proporción de partículas que no tienen núcleo, está drásticamente disminuida. Esto se puede reconocer en que solamente pocas partículas no magnéticas están contenidas. Esto conduce a que ya no es prácticamente necesario separar las partículas no magnéticas formadas, de las partículas magnéticas, antes de que la preparación se utilice en el procedimiento para la purificación de ácidos nucleicos. Esto significa una simplificación del proceso de obtención.

Además, la preparación según la invención puede caracterizarse porque de preferencia menos del 50% de las partículas tienen un tamaño de grano inferior a 2 \mum. Esto tiene como consecuencia que la proporción fina no magnética, la cual en los pequeños tamaños de grano representa una proporción relativamente grande, se reduce fuertemente. Con particular preferencia menos de un 2% de las partícula tienen un tamaño de grano menor de 0,5 \mum.

De preferencia, no más del 10%, con particular preferencia entre el 10 y el 40%, de las partículas de la preparación tienen un tamaño de grano mayor de 10 \mum.

La preparación según la invención puede contener junto a las partículas según la invención, todavía más componentes que no contienen vidrio, como p. ej., substancias tampón o un agente de suspensión, p. ej., agua o soluciones alcohólicas de agua.

La capa de vidrio de las partículas de la preparación según la invención contiene de preferencia una proporción entre 2 y 6 moles%, con particular preferencia 4 moles% de óxido de zinc. Esto puede lograrse de forma que la proporción de óxido de zinc en la masa sólida del sol comparada con las proporciones del resto de componentes sólidos esté en este margen de orden de tamaños. La proporción de óxido de zinc aumenta con la reducción de la proporción de óxido de boro, en particular con un calentamiento más prolongado, puesto que el óxido de boro ya es volátil bajo las condiciones de la obtención.

Las partículas que tienen una capa de vidrio en la cual la proporción de óxido de zinc está entre 2 y 6 moles%, se han evidenciado como particularmente efectivas para la purificación de los ácidos nucleicos. El rendimiento en ácidos nucleicos puede, en comparación con la misma capa de vidrio sin óxido de zinc, aumentarse parcialmente alrededor de un 50%.

Es igualmente objeto de la invención un procedimiento para la obtención de una preparación de partículas con un núcleo recubierto con una capa de gel que contiene menos del 5% en peso de partículas sin núcleo, el cual procedimiento comprende el paso de la suspensión de las partículas de núcleo en un sol bajo la utilización de una preparación de partículas de núcleo y secado por pulverización de la suspensión con formación de un gel, en donde la preparación de partículas de núcleo se compone de un 75% en peso de partículas con un tamaño de grueso entre 0,5 y 15 \mum, de preferencia entre 2 y 15 \mum.

Para la ejecución del procedimiento de gel/sol, el cual utiliza el procedimiento de obtención según la invención, nos remitimos a la descripción del estado actual de la técnica. La diferencia esencial de la invención respecto a lo descrito anteriormente es el empleo de una determinada preparación de partículas de núcleo mediante las cuales puede obtenerse una preparación con menos del 5% en peso de partículas sin núcleo. Como particularmente preferido se ha evidenciado un procedimiento mediante el cual primeramente se prepara un sol de tetraalqilortosilicatos, alquilboratos, aluminioalcoholatos y alcalialcoholatos en etanol, y esta mezcla se calienta con calcio. A continuación, se hidroliza la mezcla mediante adición de agua. En el sol así formado se añaden las partículas de núcleo en forma sólida y se obtiene una suspensión, de preferencia con ultrasonidos. A continuación, se pulveriza la suspensión con formación de un gel en un procedimiento de secado por pulverización en el cual la tobera se calienta y en la cual aparecen esencialmente partículas en las cuales están contenidas de 1 a solo pocas partículas de núcleo por partícula (de preferencia contienen menos de 1% de partículas más de 10 partículas de núcleo). El producto pulverizado se calienta a continuación, para espesar el gel hasta formar un vidrio. También aquí es ventajosa la adición de óxido de zinc al gel. El espesamiento puede efectuarse a elevadas temperatura como las que se emplean sin adición de zinc, puesto que el punto de reblandecimiento del vidrio que se forma es más alto.

Por esta razón se pueden eliminar fácilmente los componentes orgánicos que sobran de los materiales empleados.

Puesto que de acuerdo con el procedimiento según la invención se obtiene una preparación con una muy pequeña proporción de partículas sin núcleo, no es necesario efectuar en general ningún fraccionamiento subsiguiente de partículas sin núcleo/con núcleo.

Igualmente es objeto de la invención un procedimiento para la purificación de ácidos nucleicos mediante la unión no covalente de los ácidos nucleicos de una muestra a partículas revestidas de una superficie vítrea, eliminación de los componentes de la muestra que no se han unido, y elución de los ácidos nucleicos unidos, de la superficie vítrea, para lo cual se emplea una preparación según la invención. El procedimiento es particularmente sencillo, cuando las partículas son magnéticas.

En la patente WO 96/41811 se describen procedimientos para la purificación de ácidos nucleicos con ayuda de partículas magnéticas con una superficie vítrea. Al contenido de la misma en su totalidad vamos a referirnos. Como muestras para el procedimiento de purificación según la invención entran en consideración en particular muestras clínicas, como sangre, suero, líquido de lavado de la boca, orina, líquido cerebral, esputos, heces, plasma, líquido extraído por punción o muestras de médula ósea. El material de muestra preferido es el suero. Para la purificación de los ácidos nucleicos, la muestra se mezcla, en caso necesario después de la lisis de eventuales estructuras celulares contenidas y la digestión de los componentes de las muestras que estorban, con la preparación según la invención, p. ej., en forma de una cantidad determinada de una suspensión de partículas. Después de un tiempo de incubación, durante el cual los ácidos nucleicos se unen a la superficie vítrea inespecíficamente a la secuencia, se elimina el líquido juntamente con los componentes de la muestra que no se han unido, y las partículas se lavan según el caso, para eliminar los residuos. Los ácidos nucleicos unidos todavía al mismo, se eliminan de la superficie mediante elución con un líquido en el que los ácido nucleicos se disuelven bien. El líquido resultante puede a continuación seguir manipulándose en particular emplearse en procedimientos de amplificación, como p. ej., la reacción PCR, puesto que durante el procedimiento de purificación se han separado la mayoría de inhibidores de las enzimas.

En tanto las partículas son magnéticas, la eliminación del líquido de las partículas con los ácidos nucleicos es particularmente sencillo puesto que las partículas se recogen con ayuda de un imán y pueden mantenerse juntas mientras que el líquido se elimina. Cuando las partículas no son magnéticas pueden separarse del líquido por filtración mediante un filtro adecuado.

La invención anterior se aclara con más detalle mediante los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1 Sol para la obtención de una capa exenta de zinc (74 SiO_{2} x 15 B_{2}O_{3} x 4 K_{2}O x 2 CaO x 5 Al_{2}O_{3})

En un matraz redondo de 5 litros se introducen 1750 ml de ortosilicato de tetraetilo (fabricante: Wacker, Burghausen), y a temperatura ambiente con agitación (500 rpm) se añaden rápidamente:

541 ml de borato de trietilo (fabricante: Aldrich, Steinheim)

250 ml de metanolato de potasio (25% en metanol (fabricante: Fluka, Deisenhofen))

261 g de sec.butilato de aluminio (fabricante: Aldrich, Steinheim)

292 ml de etanol, y

8,49 g de calcio (fabricante: Fluka, Deisenhofen)

La mezcla se calienta a continuación con agitación hasta conseguir un reflujo intenso. Durante 30 minutos se añade gota a gota una mezcla con un total de 583 ml de etanol y 233 de agua. Después de enfriar a < 50ºC el sol se transvasa a un recipiente abierto y se añaden al mismo 1200 g de pigmento IRIODIN 600 Black Mica ("mica negra") (fabricante: Merck, Darmstadt). El sol se agita después de la adición completa del pigmento todavía 1 minuto a 500 rpm y a continuación se trata 5 minutos con ultrasonidos. Después del tratamiento con ultrasonidos se agita la mezcla de sol-pigmento con un agitador Dissol a aproximadamente 500 rpm, hasta que se ha consumido toda la cantidad.

Ejemplo 2 Obtención del pigmento recubierto de vidrio (MGP)

Se pulveriza en una torre de pulverización de la firma Nubilosa, Konstanz, con un diámetro de 0,75 m, una altura de 2,5 m y un rendimiento de evaporación (referido al agua) de 1-3 litros/hora. La temperatura de entrada del aire es de 270ºC, la temperatura de salida, aproximadamente de 130ºC. El caudal del aire es de 7,2 m^{3}/minuto. Para la pulverización se emplea una tobera de dos productos con una presión de pulverización de 2 bars. El rendimiento en transporte de la bomba de membrana de la válvula de bola utilizada es de 60 g de sol/minuto.

El producto pulverizado es capturado por un ciclón, se espesa previamente al aire a 250ºC y a continuación se lleva a una estufa de nitrógeno con una velocidad de calentamiento de 1 K/minuto, a una temperatura de 675ºC, se mantiene allí durante 1 hora y se enfría a 300ºC. A 300ºC se añade oxígeno, se mantiene 1 hora, y a continuación se enfría a temperatura ambiente. Después de enfriar se efectúa un tamizado con un tamiz con un ancho de malla de 50 \mum para eliminar los agregados eventualmente existentes. Con ello se da por terminada la obtención.

Ejemplo 3 Sol para la obtención de una capa conteniendo zinc (70,67 SiO_{2} x 14,33 B_{2}O_{3} x 4 K_{2}O x 2 CaO x 5 Al_{2}O_{3} x 4 ZnO)

De la misma manera que en el ejemplo 1 se prepara un sol que contiene zinc. Al mismo se incorporan los siguientes eductos y se trata análogamente:

1258 ml de ortosilicato de tetraetilo (fabricante: Wacker, Burghausen)

387 ml de borato de trietilo (fabricante: Aldrich, Steinheim)

188 ml de metanolato de potasio 25% en metanol (fabricante: Fluka, Deisenhofen))

196 g de sec.butilato de aluminio (fabricante: Aldrich, Steinheim)

1285 ml de etanol

6,39 g de calcio (fabricante: Fluka, Deisenhofen)

58,5 g de acetato de zinc dihidrato, deshidratado (fabricante: Fluka, Deisenhofen)

Después de hervir a reflujo se añaden gota a gota, 178 ml de H_{2}O juntamente con 444 ml de etanol durante 30 minutos. Después de enfriar se añaden 1200 g de pigmento. Por lo demás, ver el ejemplo 1.

Ejemplo 4 Obtención de un pigmento conteniendo zinc, recubierto de vidrio

El sol conteniendo pigmento del ejemplo 3 se opera análogamente al ejemplo 2. La temperatura de espesamiento es sin embargo de 750ºC.

Ejemplo 5 Obtención de un pigmento conteniendo zinc, recubierto de vidrio, con un tratamiento final modificado (MGP, partículas de vidrio magnéticas)

El sol conteniendo pigmento del ejemplo 3 se opera análogamente al ejemplo 2. La temperatura de espesamiento es sin embargo de 750ºC y la temperatura del tratamiento en oxígeno es de 200ºC.

Ejemplo 6 Determinación del rendimiento del ADN o respectivamente ARN con ^{32}P radioactivo

Para una comprobación directa de ADN o respectivamente ARN unido o respectivamente sin unir, se emplea el HIV-gag ARN Standard marcado con ^{32}P, de 1,4 kb, o respectivamente el amplicón landa marcado con ^{32}P, de 3 kb. Como muestra sirve el plasma negativo (humano) que contiene en los dos casos, 10^{9} copias.

Ejecución de la preparación de las muestras

En un recipiente Eppendorf de 2 ml se introducen 500 \mul de plasma negativo con 10^{9} copias de amplicón landa marcado con ^{32}P. A los mismos se añaden con pipeta, 480 \mul de la solución tampón de unión/proteinasa K (5:1), se agita con el vórtex y se incuba a 70ºC durante 10 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente se añaden con pipeta, 400 \mul de suspensión isopropanólica de MGP con un contenido total de 3 mg de MGP. Inmediatamente después se mezcla con el vórtex. La muestra se incuba a continuación durante 15 minutos en un mezclador, p. ej., el termomezclador 5436 de Eppendorf.

Los MGP se concentran por transvase de la muestra a un separador magnético. Después de 1 minuto el sobrenadante se separa completamente con una pipeta.

Se pipetean 0,5 ml de tampón de lavado a los MGP. Las muestras se agitan con el vórtex y a continuación se pasan al separador magnético. Después de 1 minuto, se separa el sobrenadante con una pipeta. El proceso de lavado se repite 2 veces.

Al MGP se añaden 200 ml de tampón de elución. Se incuban a 80ºC durante 10 minutos en un termomezclador a 1400 rpm. La muestra se pasa a un separador magnético y después de 1 minuto se saca todo el eluato. El eluato se pasa a continuación a un nuevo recipiente y se mide en un contador de centelleo.

De la relación entre la radioactividad del eluato y la radioactividad de la muestra antes del procedimiento de purificación, puede determinarse el rendimiento.

Resultados con MGP de diferentes recubrimientos:

	Rendimiento	Rendimiento
	en ADN	en ARN
MGP según el ejemplo 2 (sin zinc)	44%	44%
MGP según el ejemplo 4 (con zinc)	62%	59%
MGP según el ejemplo 6 (con zinc,	66%	70%
tratamiento final modificado)

Ejemplo 7 Black Mica ("mica negra") (BM) como base del pigmento (ejemplo de referencia)

Se prepara una partida según el ejemplo 1, en el cual el pigmento es mica negra (BM).

Ejemplo 8 Microna Matte Black ("Microna negro mate") (MMB) como base del pigmento

Se prepara una partida según el ejemplo 1, en el cual el pigmento es MMB (microna negra mate) (fabricante Merck, Darmstadt)).

Ejemplo 9 Intensidad de la señal después de la amplificación en la preparación de la muestra con MGP en diferentes bases de pigmento

Se emplea MGP según los ejemplos 7 y 8 en una preparación de la muestra. Como muestra se utiliza plasma humano con 100 copias/ml de virus HCV. El eluato de la preparación de la muestra se somete a una amplificación y el resultado de la amplificación se detecta con un procedimiento electroluminiscente. En otra prueba la muestra fue plasma humano con 600 copias/ml de virus HBV.

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	Cuentas HCV ECL	Cuentas HBV ECL
MGP según el ejemplo 7 (BM)	97000	25000
MGP según el ejemplo 8 (MMB)	127000	43000

Ejemplo 10 Polvo de ferrocarbonilo HQ como pigmento

Se prepara un sol conteniendo zinc análogamente al ejemplo 3, pero solamente 240 g de sol.

Después de enfriar, se añaden 71 g de polvo de ferrocarbonilo HQ (BASF, Ludwigshafen) con una distribución por tamaños de grano de: 10% < 0,5 \mum, 50% < 1,1 \mum, 90% < 2,2 \mum. Se agita durante 1 minuto a 500 rpm y a continuación se trata durante 5 minutos con ultrasonidos. El sol se pulveriza en un secador por pulverización (Büche 190, secador mini spray). La temperatura de las toberas del secador por pulverización fue de 140ºC.

El polvo obtenido se calienta a 150ºC en el aire. La velocidad de calentamiento es de 1 K/minuto, el tiempo de mantenimiento, 1 hora. A continuación, se substituye el aire por N_{2} en el horno, se lava varias veces y con 1K/minuto se calienta a 700ºC, se mantiene durante 1 hora y se enfría a 200ºC con 1K/minuto. A 200ºC se substituye el N por aire y se mantiene durante 1 hora. A continuación, se enfría a temperatura ambiente. Eventualmente, los agregados que aparecen se separan por tamizado con un tamiz de 50 \mum de malla.

El rendimiento es de 62,4 g. Las pérdidas por tamizado son despreciables. No se forman agregados.

Ejemplo 11 Determinación de la unión del ARN

De acuerdo con el ejemplo 6, se une el HIV gag standard marcado con ^{32}P con 1,4 Kb, a las partículas según el ejemplo 10. La medición radioactiva da una unión > 80%.

Ejemplo 12 Comparación de las velocidades de sedimentación

En dos recipientes Eppendorf se agitan 3 mg de partículas según el ejemplo 10, en cada uno de ellos con un volumen de 2 ml y se suspenden cada uno con 1,5 ml de H_{2}O.

Las partículas del recipiente 1 se atraen a la pared del recipiente con un imán y a continuación se resuspenden agitando. Al mismo tiempo se agitan las partículas del recipiente 2.

Se observa visualmente la sedimentación en el campo gravitatorio. No se produce ninguna diferencia.

Claims

1. Preparación que contiene partículas con una superficie vítrea, en donde más del 75% en peso de estas partículas tienen un tamaño de grano entre 0,5 y 15 \mum

caracterizada porque

la superficie vítrea está compuesta de SiO_{2}, B_{2}O_{3}, K_{2}O, CaO, Al_{2}O_{3} y ZnO.

2. Preparación según la reivindicación 1, caracterizada porque más del 95% en peso de las partículas con un tamaño de grano entre 0,5 y 15 \mum son magnéticas.

3. Preparación según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque menos de la mitad de las partículas tienen un tamaño de grano inferior a 2 \mum.

4. Preparación según una de las reivindicaciones 1, 2 y 3, caracterizada porque menos del 2% de las partículas tienen un tamaño de grano inferior a 0,5 \mum.

5. Preparación según la reivindicación 2, caracterizada porque las partículas magnéticas tienen un núcleo magnético el cual está recubierto de vidrio.

6. Preparación según la reivindicación 1, caracterizada porque no más del 10% de estas partículas son partículas con un tamaño de grano mayor de 10 \mum.

7. Preparación según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque las partículas tienen un revestimiento vítreo que contiene una proporción entre 2 y 6% de óxido de zinc.

8. Preparación según una de las reivindicaciones precedentes, que contiene por lo menos un núcleo de un metal magnético.

9. Preparación según la reivindicación 8, caracterizada porque el o los núcleos tienen un tamaño de grano entre 0,01 \mum y 100 \mum, con particular preferencia entre 0,2 \mum y 8 \mum.

10. Procedimiento para la obtención de una preparación de partículas con un núcleo revestido con una capa de gel que contiene menos del 5% en peso de partículas sin núcleo y en donde la capa de gel esta compuesta de SiO_{2}, B_{2}O_{3}, K_{2}O, CaO, Al_{2}O_{3} y ZnO, el cual procedimiento comprende los pasos:

- Suspensión de las partículas de núcleo en un sol con el empleo de una preparación de partículas con núcleo,

- Secado por pulverización de la suspensión con formación de un gel,

caracterizado porque la preparación de partículas con núcleo se compone de un 75% en peso de partículas con un tamaño de grano entre 0,5 y 15 \mum.

11. Procedimiento para la purificación de ácidos nucleicos mediante la unión no covalente de los ácidos nucleicos de una muestra, a partículas con una superficie vítrea que contiene ZnO, eliminación de los componentes de la muestra que no se han unido, y elución de los ácidos nucleicos unidos de la superficie vítrea.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque la muestra se pone en contacto con una preparación según una de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque las partículas son magnéticas, y permanecen retenidas mediante un imán cuando se eliminan los componentes de las muestras.

14. Procedimiento para la obtención de una preparación de partículas con un núcleo revestido con una capa vítrea, que contiene menos de un 5% de partículas sin núcleo y en donde la superficie vítrea está compuesta de SiO_{2}, B_{2}O_{3}, K_{2}O, CaO, Al_{2}O_{3} y ZnO, el cual procedimiento comprende los pasos:

- Suspensión de las partículas con núcleo en un sol con el empleo de una preparación de partículas con núcleo,

- Secado por pulverización de la suspensión con formación de un gel,

- Espesamiento del gel para formar un vidrio,

caracterizado porque la preparación de partículas con núcleo se compone de un 75% en peso de partículas con un tamaño de grano entre 0,15 y 15 \mum.

15. Empleo del óxido de zinc en las capas vítreas formadas según el procedimiento de sol/gel de la reivindicación 14, para aumentar la capacidad de unión de la superficie vítrea con los ácidos nucleicos.