ES2296615T3 - Actividad antiproliferativa de oligonucleotidos ricos en g y procedimiento de uso de los mismos para su union a la nucleolina. - Google Patents

Abstract

Uso de una cantidad eficaz terapéuticamente de un oligonucleótido rico en guanosina capaz de ligar al menos una proteína o nucleolina ligante de oligonucleótidos ricos en G para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la proliferación de células malignas, displásicas, y/o hiperproliferativas en un sujeto.

Description

Actividad antiproliferativa de oligonucleótidos ricos en G y procedimiento de uso de los mismos para su unión a la nucleolina.

Esta investigación fue financiada por la Subvención # DAMD-17-98-1-8583 del Departamento de Defensa
(CDMRP) para la Iniciativa contra el Cáncer de Próstata.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la inhibición de la proliferación celular. Específicamente, la presente invención se refiere a oligonucleótidos específicos que inhiben la proliferación celular, incluyendo aquellas células neoplásicas y/o displásicas, unidas a proteínas específicas asociadas a la proliferación celular.

Antecedentes de la invención

Los oligonucleótidos tienen el potencial de reconocer secuencias únicas de ADN o ARN con un grado extraordinario de especificidad. Por esta razón han sido considerados como candidatos prometedores para realizar terapias específicas de genes para el tratamiento de enfermedades malignas, virales e inflamatorias. Dos estrategias principales de intervención terapéutica mediada por oligonucleótidos han sido desarrolladas, a saber, los enfoques antisentido y antigénicos. La estrategia antisentido pretende regular la expresión de un gen específico por medio de la hibridación del oligonucleótido al ARNm específico, resultando en la inhibición de la traducción. Gewirtz et al. Blood 92 (1998) 712-736; Crooke Antisentido Nucleic Acid Drug Dev. 8 (1998) 115-122; Branch, Trends Biochem. Sci. 23 (1998) 45-50; Agrawal et al. Antisentido Nucleic Acid Drug Dev (1998) 8, 135-139. La estrategia antigénica propone inhibir la transcripción de un gen objetivo por medio de la formación de triple hélice entre los oligonucleótidos y las secuencias específicas en el ADN genómico de doble hebra. Helene et a. (1997) Ciba Found Symp. 209, 94-102. Los ensayos clínicos sobre la base del enfoque antisentido están mostrando ahora que los oligonucleótidos pueden ser administrados de una manera clínicamente relevante y tienen pocos efectos tóxicos secundarios. Gewirtz et al. (1998) Blood 92, 712-736; Agrawal et al. (1998) Antisentido Nucleic Acid Drug Dev 8, 135-139.

Mientras ambas estrategias, tanto la antisentido como la antigénica, han encontrado algunos éxitos, se ha puesto en claro en los últimos años que las interacciones de los oligonucleótidos con los componentes de un organismo viviente van más allá de la hibridación especifica de la secuencia con el ácido nucleico objetivo. Los estudios recientes y la reexaminación temprana de los datos de antisentido han indicado que algunos de los efectos biológicos observados en los oligonucleótidos antisentido no pueden ser atribuibles completamente a la hibridación Watson-Crick con el ARNm objetivo. En algunos casos, el efecto biológico esperado (por ejemplo, la inhibición del crecimiento celular o apoptosis) es conseguida, pero ésta no está acompañada de una regulación descendente de la proteína objetivo y, por tanto, no es evidente que tenga un efecto antisentido verdadero. White et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 227, 118-124; Dryden et al. (1998) J. Endocrinol. 157, 169-175. En muchos casos, se demuestra que otros oligonucleótidos específicos no secuenciados pueden ejercer efectos biológicos que igualan o exceden la secuencia antisentido. Barton et al. (1995) Br. J. Cancer 71, 429-437; Burgess et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 4051-4055; Benimetskaya et al. (1997) Nucleic Acid Res. 25, 2648-2656. Aunque actualmente existe un alto conocimiento entre los investigadores del antisentido de la importancia de los oligonucleótidos de control adecuado y de la necesidad de demostrar la inhibición de la producción de la proteína objetivo (Stein (1998) Antisentido Nucleic Acid Drug Dev 6, 129-132), el mecanismo de los efectos que no sean atribuibles al antisentido ha sido poco comprendido.

En particular, ha sido repetidamente encontrado que oligodeoxinucleótidos de fosfodiésteres y fosforotioatos conteniendo guanosinas contiguas (G) tienen efectos no antisentido sobre el crecimiento celular en cultivos. Burgess et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 4051-4055; Benimetskaya et al. (1997) Nucleic Acid Res 25, 2648-2656; Saijo et al. (1997) Jpn. J Cancer Res. 88, 26-33. Existen evidencias de que esta actividad está asociada a la capacidad de estos oligonucleótidos de formar estructuras estables que involucran cuartetos-G intramoleculares o intermoleculares. Burgess et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92 4051-4055; Benimetskaya et al. (1997) Nucleic Acid Res. 25, 2648-2656. Éstas son arreglos planares cuadrados de cuatro guaninas adheridas por el hidrógeno que se estabilizan por cationes monovalentes. Tales estructuras se piensa que tienen un rol importante in vivo y las secuencias formadoras de cuartetos putativos han sido identificadas en ADN teloméricos (Sundquist et al. (1989) Nature 342, 825-829), en secuencias de regiones intercomunicadoras de inmunoglobulina (Sen et al. (1988) Nature 334, 364-366), VIH1 ARN (Sundquist et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 3393-3397), las secuencias de repetición de X débiles (Fry et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 4950-4954) y el gen de retinoblastomas (Murchie et al. (1992) Nucleic Acid Res. 20, 49-53).

Ha sido sugerido que los efectos no antisentido podrían ser atribuibles al secuestro de proteínas superficiales o intracelulares por el oligonucleótido. Gold et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64, 763-797; Stein (1997) Ciba Found. Symp. 209, 79-89. Para los oligonucleótidos ricos en G que pueden formar estructuras plegadas, los cuartetos que contienen G, se piensa que esta ligadura es mediada no por el reconocimiento de la secuencia principal de los oligonucleótidos, sino más bien por sus formas tridimensionales únicas. Sin embargo, las proteínas objetivo de estos oligonucleótidos no han sido bien caracterizadas.

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Los oligonucleótidos son especies polianiónicas que son interiorizadas en las células, probablemente por endocitosis mediada por receptores. Vlassov et al. (1994) Biochim. Biophys. Act. 1197, 95-108. Éstos probablemente interactúan con muchas biomoléculas dentro de la célula y también en la membrana extracelular, en virtud tanto de su carga como de su forma, así como de interacciones específicas de secuencias. Las proteínas que se ligan a oligonucleótidos y median los efectos no antisentido no han sido identificadas unívocamente todavía.

La presente solicitud identifica una proteína ligante de oligonucleótidos ricos en G (GRO, según sus siglas en inglés) y la capacidad de un oligonucleótido rico en G de ligarse a esta proteína se correlaciona con su propensión de formar cuartetos G y con su capacidad de inhibir el crecimiento de las células tumorales.

Los solicitantes han descrito oligonucleótidos ricos en G (GROs) que tienen potentes efectos inhibitorios del crecimiento que no están relacionados con cualquier actividad antisentido o antigénica esperada. Mientras que el mecanismo de estos efectos todavía no ha sido delineado específicamente, los solicitantes han demostrado que los efectos antiproliferativos de estos oligonucleótidos están relacionados con su capacidad de ligarse a una proteína celular específica. Debido a que la proteína ligante de GRO también es reconocida por anticuerpos anti-nucleolina, los solicitantes han llegado a la conclusión de que esta proteína es la misma nucleolina, o una proteína de un tamaño similar que comparte las semejanzas inmunogénicas con la nucleolina.

Nucleolina es una abundante fosfoproteína multifuncional de 110 kDa que se piensa que está localizada predominantemente en los nucleolos de las células que se proliferan (para revisiones de literatura, véanse Tuteja et al. (1998) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33, 407-436; Ginisty et al. (1999) Cell J. Sci. 112, 761-772). La nucleolina ha sido implicada en muchos aspectos de biogénesis de ribosomas, incluyendo el control de la transcripción de ADNr empaquetamiento preribosoma, organización de cromatina nucleolar. Tuteja et al. (1998) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33, 407-436; Ginisty et al. (1999) J. Sci Cell. 112, 761-772; Ginisty et al. (1998) EMBO J, 171476-1486. Otro rol emergente de la nucleolina es como una proteína lanzadera que transporta proteínas virales y celulares entre el citoplasma y núcleos/nucleolos de la célula. Kibbey et al. (1995) J. Neurosci. Res. 42, 314-322; Lee et al. (1998) J Biol. Chem. 273, 7650-7656; Waggoner et al. (1998) J Virol. 72, 6699-6709. La nucleolina también está implicada, directamente o indirectamente, en otros roles, que incluyen la estructura de la matriz nuclear (Gotzmann et al. (1997) Electrophoresis 18, 2645-2653), citoquinosis y división nuclear (Léger-Silvestre et al. (1997) Chromosoma 105, 542-52), y como una caja helicoidal de ARN y ADN (Tuteja et al. (1995) Gene 160, 143-148). La naturaleza multifuncional de nucleolina se refleja en su estructura multidominio que comprende un terminal N semejante a histona, un dominio central que contiene los sitios de reconocimiento de ARN y un terminal C rico en glicina/arginina. Lapeyre et al. (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. 84, 1472-1476. Se sabe que los niveles de nucleolina se relacionan con la proporción de la proliferación celular (Derenzini et al. (1995) Lab. Invest. 73, 497-502; Roussel et al. (1994) Exp. Cell Res. 214, 465-472), siendo elevados en células que proliferan rápidamente, como en las células malignas, y menor en células que se dividen lentamente. Por esta razón, la nucleolina es un objetivo terapéutico atractivo.

Aunque es considerada una proteína predominantemente nucleolar, el descubrimiento de que la nucleolina está presente en la membrana de plasma es consistente con algunos informes que identifican la nucleolina en la superficie de la célula y sugieren su rol como un receptor superficial de las células. Larrucea et al. (1998) J Biol. Chem. 273, 31718-31725; Callebout et al. (1998) J Biol. Chem. 273, 21988-21997; Semenkovich et al. (1990) Biochemistry 29, 9708; Jordan et al. (1994) Biochemistry 33, 14696-14706.

Previamente fueron propuestos algunos mecanismos para explicar los efectos específicos no secuenciados de oligonucleótidos. Éstos incluían la ligadura de receptores celulares (Rockwell et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 6523-6528; Coulson et al. (1996) Mol. Pharmacol. 50, 314-325), la modulación de citoquinas o actividad del factor de crecimiento (Hartmann et al. (1996) Mol. Med. 2, 429-438; Sonehara et al. (1996) J. Interferon Cytokine Res. 16, 799-803; Fennewald et al. (1995) J Biol. Chem. 270, 21718 interferón -21721; Guvakova et al. (1995) J Biol. Chem. 270, 2620-2627; Scaggiante et al. (1998) Eur. J Biochem. 252, 207-215), la inhibición de la evolución del ciclo de las células (Burgess et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 4051-4055), los cambios en adherencia de las células (Saijo et al. (1997) Jpn. J. Cancer Res. 88, 26-33) y su ligadura a una proteína de 45 kDa no caracterizada (Ramanathan et al. (1994) J Biol. Chem. 269, 24564-24574). También han sido descritas las propiedades inmunoestimuladoras de oligonucleótidos que contienen secuencias de 5'-CG-3' (McCluskie et al. (1998) J Immunol. 161, 4463-4466), pero parece improbable que estén relacionados con los efectos que han observado los solicitantes.

Dempsey et al. (1999) J Biol. Chem. 274 pp1066-1071 describe compuestos que incluyen factores de ligadura (LR1) de ADN dúplex específicos de células B y nucleolina que se liga a oligonucleótidos sintéticos con pares de base G-G. Dempsey et al. discute el efecto de pares G-G sobre la recombinación in vivo, en especial la recombinación del intercomunicador de inmunoglobulina.

Serin et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 pp13109-13116 describe la estructura de nucleolina como que incluye dos dominios de ligadura de ARN que condicionan la especificidad de la ligadura de ARN de la nucleolina. Serin et al. han estudiado mutaciones de estos sitios ligantes para demostrar que estos sitios influyen en la especificidad de la ligadura.

Weidner et al. (1995) 366 pp146-150 describe un oligonucleótido de fosfotiorato que liga la nucleolina de una manera específica no secuencial y, en particular, los motivos de reconocimiento del ARN de nucleolina. Weidner et al. compara las capacidades de ligadura de los oligonucleótidos de fosfotioratos con los de oligonucleótidos de fosfodiésteres (que no se ligan a los motivos de ligadura de ARN de la nucleolina).

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Ishikawa et al. (1993) 13 pp4301-4310 discuten proteínas nucleares que se ligan al ADN y al ARN teloméricos y en especial a las repeticiones TTAGGG.

En la presente solicitud, los solicitantes han identificado una proteína ligante de oligonucleótidos y muestran una correlación entre la ligadura de esta proteína y la actividad antiproliferativa para una serie de oligonucleótidos ricos en G. Estas afirmaciones sugieren fuertemente un rol mecanicista para esta proteína en la inhibición mediada por oligonucleótidos no antisentido del crecimiento celular. La base para el reconocimiento de GROs por nucleolina no es obvia a partir de las secuencias de los oligonucleótidos evaluados, pero puede estar relacionada con su propensión para formar estructuras particulares de cuartetos G.

La relación entre la ligadura de nucleolina y la actividad antiproliferativa para otros oligonucleótidos, no ricos en G, no ha sido valorada completamente todavía. Se encontró que una secuencia de oligonucleótidos mezclados (MIX1) se liga a la nucleolina, aunque no tiene ningún efecto inhibitorio del crecimiento. La nucleolina contiene dominios de ligaduras de ARN que pueden reconocer secuencias específicas de ARN o ADN de simple hebra, Dickinson et al. (1995) Mol. Cell Biol. 15, 456-465; Ghisolfi et al. (1996) J Mol. Biol. 260,34-53. Es posible que este oligonucleótido en especial contenga una secuencia o estructura que se parece al elemento de reconocimiento.

A favor de este hallazgo de los solicitantes de que la nucleolina se liga a oligonucleótidos ricos en G se encuentran recientes reportes que han demostrado que la nucleolina puede ligarse a otras secuencias de cuartetos G tales como regiones intercomunicadoras de la inmunoglobulina y la secuencia del gen ribosomal (Dempsey et al. (1999) J Biol. Chem. 274, 1066-1071 y Hanakai et al. (1999) J Biol. Chem. 274, 15903-15912). Es posible que la nucleolina tenga funciones actualmente indeterminadas in vivo que dependen del reconocimiento de secuencias ricas en G, por ejemplo, las secuencias de regiones intercomunicadoras del ADN ribosomal o telómeros.

La síntesis de nucleolina se correlaciona positivamente con velocidades aumentadas de división celular y los niveles de nucleolina son por tanto más altos en células tumorales en comparación con la mayoría de las células normales. De hecho, la nucleolina es una de las proteínas de regiones organizadoras nucleares (NOR) cuyos niveles, cuando se miden por tintado por plata, son considerados por los patólogos como un marcador de la proliferación celular y un indicador de malignidad. La nucleolina es, por lo tanto, un objetivo selectivo de tumores para intervención terapéutica y las estrategias para reducir los niveles de nucleolina funcional se espera que inhiban el crecimiento celular de tumores.

Las consecuencias de la inhibición por la nucleolina sobre el crecimiento celular no han sido bien estudiadas, pero la inhibición de una proteína cuyas funciones incluyan la producción de ribosoma, transporte nuclear y entrada celular debe tener efectos profundos sobre el crecimiento celular.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método para inhibir la proliferación celular maligna, displásica, y/o hiperproliferativa en un sujeto por administración de una cantidad eficaz terapéuticamente de un oligonucleótido rico en guanosina.

La presente invención también proporciona oligonucleótidos que son capaces de estar específicamente ligados a una proteína celular específica que está implicada en la proliferación celular, específicamente en células malignas displásicas, y/o hiperproliferativas.

Descripción breve de los dibujos

Con el propósito de que las características del tema descrito anteriormente, sus ventajas y objetivos de la invención, así como otras, se pongan en claro, consigan y puedan ser comprendidas en detalle, son detalladas descripciones más particulares de la presente invención, resumida brevemente más arriba, con referencias a ciertas realizaciones que son ilustradas en las figuras que se adicionan. Estas figuras constituyen parte de la presente solicitud. Sin embargo, se hace notar, que los dibujos añadidos ilustran las realizaciones preferidas de la invención y por tanto no se consideran limitantes en su alcance.

Figura 1: presenta el ensayo MTT que muestra el crecimiento de células tumorales tratadas con oligonucleótidos ricos en G o agua como un control con el tiempo, en el (A) - el tipo de célula es DU145, (B) - el tipo de célula es MDA-MB-231, (C) - el tipo de célula es HeLa, y (D) - el tipo de célula es MCF-7 y en el que (\Box) GRO15A, (\lozenge) GRO15B, (\medcirc) GRO29A, (\Delta) GRO26A y (+) agua.

La Figura 2 ilustra los resultados del ensayo MTT que muestra el crecimiento de (A) - células DU145, (B) - células MDA-MB-231, y (C) - células HS27 con GRO29A activo, tratadas con oligonucleótidos (cuadros cerrados), GRO15B (oligonucleótido inactivo, cuadrados llenos a la mitad), o no oligonucleótidos (cuadrados abiertos).

La Figura 3: presenta el ensayo MTT, que muestra la dependencia de la dosis en la inhibición del crecimiento por GRO29A en líneas de células leucémicas, U937 y K563 y una línea de células madres hematopoyéticas no malignas de ratón (ATCC 2037).

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La Figura 4 presenta curvas por U.V. de renaturalización térmica para evaluar la formación de cuartetos G por oligonucleótidos ricos en G, en las que (A) - TEL, (B) - GRO29A, (C) - GRO15A, (D) - GRO15G, y (E) - GRO26A.

La Figura 5 es un cromatograma que ilustra la captación de oligonucleótidos ricos en G por células mamarias de cáncer MDA-MB-231.

Figura 6: (A) - Ensayo de movilidad electroforética (EMSA) muestra la ligadura de oligonucleótidos marcados con ^{32}P a 5 \mug de extractos nucleares de HeLa; y la competición respecto a la de oligonucleótidos competidores sin marcar (en un exceso 100 veces molar respecto al oligonucleótido marcado). Los oligonucleótidos competidores que están abreviados respecto a T (TEL), 29 (GRO29A), 26 (GRO26A) y 15A (GRO15A). (B) - EMSA mostrando complejos que se forman entre los oligonucleótidos TEL marcados con ^{32}P (1 nM) y 5 \mug de extractos nucleares de HeLa y el efecto de los oligonucleótidos competidores ricos en G, sin marcar (10 o 100 nM). (C) - gel de poliacrilamida SDS mostrando los complejos formados por entrecruzamiento por UV de oligonucleótidos marcados y los extractos nucleares de HeLa, incubados en ausencia o presencia del competidor no marcado (en un exceso molar de 100 veces). (D) - El tintado Southwestern blot de extractos nucleares de HeLa sondados con oligonucleótidos ricos en G marcados con ^{32}P (recuentos a 2 x 10^{6} por minuto, aproximadamente 0,75 nmol).

Figura 7: (A) - es un cromatograma que ilustra un ensayo MTT de células MDA-MB-231 tratadas con una única dosis de 10 \muM de oligonucleótidos ricos en G o PBS como un control, el ensayo fue ejecutado el día 9 (los oligonucleótidos fueron adicionados el día 1); (B) - ilustra un EMSA que muestra un complejo formado por la ligadura de 5 \mug de extractos nucleares MDA-MB-231 con el oligonucleótido TEL marcado con ^{32}P y la competición por los oligonucleótidos ricos en G sin marcar (en un exceso molar de 10 veces); (C) - Es un cromatograma que ilustra los resultados de un ensayo MTT de células MDA-MB-231 tratadas con una única dosis de 10 \muM de oligonucleótido rico en C (CRO) protegido en 3' u oligonucleótido de secuencias mezcladas (MIX1), o con 20 unidades/ml de heparina (HEP), en comparación con los oligonucleótidos inactivos (GRO15B) y activos ricos en G (GRO29A) en que el ensayo se llevó a cabo en el día 7; y (D) - es un cromatograma que ilustra los resultados de un ensayo MTT de células MDA-MB-231 tratadas con una única dosis de 10 \muM de oligonucleótidos de secuencias mezcladas no modificados, en comparación con un análogo GRO29A no modificado (29A-OH) y TEL, en el que para tratar las células, el medio de cultivo fue reemplazado por un medio libre de suero conteniendo 10 \muM de oligonucleótido y después de cuatro horas a 37ºC, fue añadido suero fetal bovino para dar 10% v/v y el ensayo se llevó a cabo el día 7.

Figura 8: (superior) Tintado Southwestern blot usando el GRO15A radiomarcado para detectar proteína ligante de GRO en extractos nucleares (N) y citoplasmático (C) de varias líneas de células. (Inferior): sensibilidad de varias líneas de células a los efectos inhibitorios de crecimiento por GRO29A y GRO15A.

Figura 9: (A) - Tintados Southwestern blot (SW) y western blot (W) evaluados respectivamente con oligonucleótido rico en G activo marcado con ^{32}P (GRO15A) o antisuero de nucleolina. El panel izquierdo muestra extractos nucleares MDA-MB-231 (5 \mug/carril); El panel derecho muestra extractos nucleares de HeLa (Promega Inc., 5 \mug/carril). (B) Tintados Southwestern blot y western blot de proteínas captadas de lisados de células MDA-MB-231 que habían sido tratadas sin oligonucleótidos (ninguno), con oligonucleótido activo rico en G (15A), o con oligonucleótido rico en G menos activo (15B) de los lisados. (C) - Tintados Southwestern blot y Western blot que muestran ligaduras de GRO15A y anticuerpo de nucleolina a extractos de proteínas de células MDA-MB-231 (3 \mug/carril): extractos nucleares (NU), extractos citoplasmáticos (CY) y proteínas de membrana (ME).

Figura 10 ilustra los resultados de estudios de inmunofluorescencia que muestran células de MDA-MB-231 teñidas con anti-nucleolina sin tratar (A) y tratadas con GRO29A (B) 72 horas después del tratamiento.

Figura 11: Tintado de células DU145 no permeabilizadas con anticuerpo de nucleolina, mostrando la presencia de nucleolina en la membrana del plasma.

Figura 12: (A) - Cuartetos G, ilustrando la interacción ligante del hidrógeno. (B) - Modelo molecular de GRO29A, mostrando una estructura dimérica propuesta estabilizada por 8 cuartetos G. (C) - Huella del dimetil sulfato de GRO29A, mostrando una metilación preferencial del lazo de la región de guanosina, consistente con el modelo pronosticado.

Figura 13: (A) - Ensayo MTT mostrando la actividad antiproliferativa de los nuevos oligonucleótidos ricos en guanosina sobre células de cáncer mamarias MDA-MB-231. (B) - Secuencias de nuevos oligonucleótidos ricos en guanosina.

Figura 14: Una fotografía que describe los resultados de un ensayo de desplazamiento en la movilidad electroforética para compuestos ligantes de nucleolina en la que:

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Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevos oligonucleótidos ricos en guanina (GROs) y sus métodos de uso de al menos un GRO que impida el crecimiento de células neoplásicas, displásicas, o de otra forma hiperproliferativas en un sujeto

Ejemplos de nuevos oligonucleótidos de la presente invención tienen las siguientes secuencias de nucleótidos y se designan como sigue: GRO14A (5'-GTTGTTTGGGGTGG-3' SEQ ID No. 1), GRO15A (5'-GGTGGT-3'-GTTGTTTGG SEQ ID No: 2), GRO25A (5'-GGTTGGGGTGGGTGGGGTG GGTGGG-3' SEQ ID No: 3), GRO28A (5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG- SEQ ID No: 4), GRO29A (5'-TTTGGTGGTGGTGG TTGTGGT
GGTGGTGG-3' SEQ ID No: 5), GRO29-2 (5'-TTTGGTGG TGGTGGTTTTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 6), GRO29-3 (5'-TTTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 7), GRO29-5 (5'-TTTGGTGGTGGT
GGTTTGGGTGGTGG TGG-3' SEQ ID No: 8), GRO29-13 (5'-TGGTGGTGGTGGT-3' SEQ ID No: 9), GRO11A (5'-GGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 10), GRO14C (5'-GGTGGTTGTGGTGG-3' SEQID No: 11), GRO26B (5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 12), GRO56A (5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTG
GTGGTTGTGGTGGTGGTG GTTGTGGTGGTG GTGG-3' SEQ ID No: 13), GRO32A (5'-GGTGGTTGTGGTGG
TTGTGGTGGTTGT GGTGG-3' SEQ ID No: 14), GRO32B (5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGT GGTGGTGG
TTT-3' SEQ ID No: 15), GRO29-6 (5'-GGTGGTGGTGGTTGT GGTGGTGGTGGTTT-3' SEQ ID No: 16),
GRO28B (5'-TTTGGTGGTGGT GGTGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 17), y GRO13 (5'-TGGTGGTGGT-3' SEQ ID No: 18) Se contemplan también otros oligonucleótidos con la misma actividad.

Ha sido demostrado que los oligonucleótidos GRO29-2, GRO29-3, GRO29-5, GRO29-13, GRO15C, GRO28H y GRO24I inhiben el crecimiento celular de cáncer de mama y compiten por ligarse a la proteína de ligadura de oligonucleótidos ricos en G, como se demuestra por el ensayo de movilidad electroforética (véanse Figuras 6 y 7). La demostración de la actividad y de la ligadura de la proteína a GROs de la presente invención incluye GRO15A, 29A se muestra en las Figura 1 y 6; GRO14A, 25A, 28A se muestran en la Figura 7; GRO11A, 14C, 26B, 32A, 56A se muestran en la Figura 3; GRO29-2, 29-3, 29-5, 29-6, 28B también ha sido demostrado que tienen actividad antiproliferativa y ligadura por proteína.

Por oligonucleótidos ricos en G (GRO) nos referimos a los oligonucleótidos que constan de 4-100 nucleótidos (preferentemente 10-30 nucleótidos) de ADN, ARN, 2'-O-metilo, fosforotioato u otras cadenas principales químicamente similares. Sus secuencias contienen uno o más motivos de GGT. Los oligonucleótidos tienen actividad antiproliferativa contra las células y se ligan a proteínas y/o nucleolina de conexión GRO. Estas propiedades pueden ser demostradas usando el ensayo MTT y la técnica EMSA mostrada en la Figura 6B, u otro ensayo similar.

Los oligonucleótidos de la presente invención son ricos en guanosina y son capaces de formar estructuras de cuartetos G. Específicamente, los oligonucleótidos de la presente invención están primariamente compuestos por timidita y guanosina con al menos una repetición de guanosina contigua en la secuencia de cada oligonucleótido. Los oligonucleótidos ricos en G son estables y pueden mantenerse no degradados en el suero por largos períodos de tiempo y ha sido encontrado que conservan su crecimiento y que inhiben los efectos por períodos de al menos siete días.

Como se usa en la presente solicitud, el concepto "oligonucleótido" se define como una molécula que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. El tamaño exacto depende de un número de factores que incluyen la especificidad y afinidad al ligando del objetivo. Cuando se hace referencia a "bases" o a "nucleótidos", los términos incluyen tanto los ácidos desoxirribonucleicos como los ácidos ribonucleicos.

El nuevo oligonucleótido de la presente invención puede ser usado para inhibir la proliferación celular maligna, displásica y/o hiperproliferativa por ligaduras específicamente a proteínas celulares específicas, asociadas a la proliferación celular que incluyen nucleolina y proteínas análogos a la nucleolina.

El término "análogos a la nucleolina" se emplea para definir una proteína que es la misma nucleolina o una proteína de similar tamaño que comparte semejanzas inmunogénicas y semejanzas funcionales con la nucleolina.

Los oligonucleótidos pueden ser modificados en su extremo 3' para modificar una propiedad específica del oligonucleótido. Por ejemplo, el extremo 3' del oligonucleótido puede ser modificado por adición de un grupo propilamina, que ha sido encontrado que incrementa la estabilidad del oligonucleótido frente a las nucleasas del suero. Otras modificaciones que son bien conocidas en la técnica incluyen las modificaciones 3' y 5', por ejemplo, la ligadura del colesterol, y las modificaciones de la cadena principal, por ejemplo, la sustitución fosforotioato y/o 2'-O-metilo ARN.

El término "inhibición de la proliferación de las células malignas, displásicas, y/o hiperplásicas" incluye cualquier inhibición parcial o total del crecimiento que incluye disminución de la velocidad de la proliferación o del crecimiento de las células.

Como se usa en la presente solicitud, el concepto "neoplásico" incluye un nuevo y anormal crecimiento de tejidos y células, como cáncer o tumor, incluyendo, por ejemplo, cáncer de mama, leucemia o cáncer de próstata. El término "neoplásico" también incluye células malignas que pueden invadir y destruir estructuras adyacentes y/o metástasis.

Como se usa en la presente solicitud, el concepto "displásico" incluye cualquier crecimiento anormal de células, tejidos, o estructuras que incluyen condiciones tales como soriasis.

El término "sujeto" representa a todos los animales, en que se incluyen los seres humanos. Los ejemplos de sujetos incluyen a seres humanos, vacas, perros, gatos, cabras, ovejas, y cerdos.

Los expertos en la técnica pueden fácilmente identificar a pacientes que tienen una condición maligna, displásica, o hiperproliferativa como cáncer o soriasis, respectivamente. Por ejemplo, pacientes que tienen un cáncer como cáncer de mama, cáncer de próstata, carcinomas del cuello del útero y sus análogos.

Una cantidad eficaz terapéuticamente es la cantidad de un oligonucleótido de la presente invención que, cuando se administra al sujeto, mejora un síntoma de la enfermedad, trastorno o condición al impedir o reducir la proliferación de células displásicas, hiperproliferativas o malignas.

Los GROs de la presente invención pueden ser administrados a un paciente o sujeto solas o como parte de una composición farmacéutica. Los GROs pueden ser administrados a pacientes o sujetos tanto de forma oral, rectal, parenteral (por vía intravenosa, intramuscular, o subcutánea), intrasistémica, intravaginal, intraperitoneal, intravesical local (polvos, ungüentos, o gotas) o como un spray nasal o bucal.

Composiciones de GROs de la presente invención adecuadas para inyección parenteral comprenden soluciones acuosas o no acuosas estériles, dispersiones, suspensiones o emulsiones fisiológicamente adecuadas, y polvos estériles para reconstituir en soluciones o dispersiones inyectables estériles fisiológicamente adecuadas. Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos, de diluentes, solventes o vehículos apropiados incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol y sus análogos), mezclas apropiadas de éstos, aceites vegetales (como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables como el oleato de etilo. La fluidez correcta puede ser mantenida, por ejemplo, usando una capa de recubrimiento como lecitina, manteniendo el tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión y usando agentes tensoactivos.

Estas composiciones pueden también contener adyuvantes tales como preservantes, humectantes, emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede ser asegurada por varios agentes bactericidas y fungicidas, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, el ácido sórbico, y sus análogos. Puede ser también deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcar, cloruro de sodio, y sus análogos. La larga absorción de la forma farmacéutica inyectable puede estar causada por el uso de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las dosis en forma sólida para administración oral incluyen cápsulas, pastillas, polvos, y gránulos. En las dosis en forma sólida, el compuesto activo (GRO) es mezclado con al menos un excipiente (o portador) inerte convencional tal como citrato de sodio o fosfato de dicálcico o (a) rellenos o diluyentes, como por ejemplo, almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, (b) aglutinantes, como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatinas, polivinilpirrolidona, sacarosa y acacia, (c) humectantes, como por ejemplo, glicerol, (d) agentes desintegradores, como por ejemplo, agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa ó tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos complejos y carbonato de sodio, (e) soluciones retardadoras, como por ejemplo parafina, (f) aceleradores de absorción, como por ejemplo, compuestos de amonio cuaternarios, (g) agentes humidificadores, como por ejemplo, alcohol cetílico, y monoestearato de glicerol, (h) adsorbentes, como por ejemplo, caolín y bentonita, e (i) lubricantes, como por ejemplo, talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril-sulfato de sodio o mezclas de éstos. En el caso de cápsulas, tabletas y pastillas las formas de dosificación deben también constar de agentes tampones.

Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden ser empleadas como rellenos en cápsulas de gelatina de llenos blandos y duros que usan tales excipientes como lactosa o leche azucarada así como los polietilenglicoles de alto peso molecular y sus análogos.

Las dosis en forma sólida como pastillas, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos pueden ser preparadas provistas de capas y cortezas tales como recubrimientos entéricos y otros bien conocidos en la técnica. Pueden contener agentes opacificantes y también pueden ser de tal composición que éstos liberen de manera sostenida el compuesto o los compuestos activos en cierta parte del tracto intestinal. Ejemplos de compuestos embebidos que pueden ser usados son las sustancias poliméricas y ceras. Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada, si es apropiada, con uno o más de los excipientes antes mencionados.

Las dosis en forma de líquidos para administración oral incluyen emulsiones farmacéuticamente aceptables, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires. Además del compuesto activo, la dosis en forma líquida puede contener diluyentes inertes generalmente usados en la técnica como agua u otro solvente, agentes solubilizantes y emulsionantes, como por ejemplo alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, en particular, aceite de semilla de algodón, aceite de maní, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de ajonjolí, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido grasos de sorbital o mezcla de estas sustancias y sus análogos.

Además de tales diluentes inertes, los compuestos también pueden incluir adyuvantes, como agentes humectantes, agentes emulsionantes y, para suspensiones, edulcorantes, saborizantes y perfumados.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes para suspensiones, como por ejemplo, alcoholes etoxilados de isoestearilo, sorbitol-poli(oxietileno) y ésteres de sorbitol, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y goma de adragante, o mezclas de estas sustancias, y sus análogos.

Los compuestos para administración rectal son preferentemente supositorios que pueden ser preparados mezclando los compuestos de la presente invención con excipientes no irritantes apropiados o portadores como mantequilla de cacao, polietileneglicol o cera para supositorios, que son sólidos a temperaturas corrientes pero líquidos a la temperatura corporal y por tanto se derriten en el recto o la cavidad vaginal y liberan el componente activo.

Las formas de dosificación para administración tópica de un GRO de esta invención incluyen ungüentos, polvos, sprays e inhaladores. El componente activo es mezclado en condiciones estériles con un portador fisiológicamente aceptable y cualquier conservante, tampones o propulsores como pueda ser requerido. Las formulaciones oftalmológicas, ungüentos para ojos, polvos y soluciones también se considera que se encuentran dentro del alcance de esta invención.

Además, los GROs de la presente invención pueden existir en forma tanto solvatada como no solvatada con solventes aceptables farmacéuticamente como agua, etanol, y sus análogos. En general, las formas solvatadas son consideradas equivalentes a las formas no solvatadas para los propósitos de la presente invención.

Los GROs de la presente invención pueden ser administrados a un paciente en niveles de dosificación de unos 1,5 mg a unos 150 mg por día. Para un adulto humano normal que tiene un peso corporal de aproximadamente 70 kg, es preferible una dosis aproximadamente de 0,2 mg hasta aproximadamente 2,0 mg por kg de peso corporal por día. La dosis específica usada, sin embargo, puede variar. Por ejemplo, la dosis puede depender de varios factores incluyendo requisitos del paciente, gravedad de la enfermedad que se trata y actividad farmacológica del compuesto que se está usando. La determinación de las dosis óptimas para un paciente en especial es bien conocida por los expertos. Los GROs de la presente invención pueden ser administrados en dosis individuales o múltiples.

Además, se intenta que la presente invención cubra los GROs que se hacen por cualquier técnica de síntesis orgánica estándar, incluyendo la combinación de métodos biológicos ó químicos, tales como a través del metabolismo.

Los oligonucleótidos ricos en G de la presente invención también pueden ser usados en combinación con otros agentes quimioterapéuticos para proporcionar una eficacia o inhibición sinérgica o potenciada del crecimiento celular de las neoplasias. Por ejemplo, los oligonucleótidos ricos en G de la presente invención pueden ser administrados en combinación con agentes quimioterapéuticos que incluyen, por ejemplo, cis-platino, mitoxantrona, etoposida, camptotecina, 5-fluororacilo, vinblastina, paclitaxol, docetaxol, mitramicina A, dexametasona, cafeína y otros agentes quimioterapéuticos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los experimentos llevados a cabo por los solicitantes mostraron que el GRO29A actuaba sinergísticamente con cis-platino en el crecimiento celular de MDA-MB-231 inhibidor in vitro. Los solicitantes descubrieron que en las condiciones en las que GRO29A tiene un pequeño efecto por sí mismo (inhibición de crecimiento de un 5%), una combinación de cis-platino (0,5 mg/ml) y GRO29A inhiben sinergísticamente el crecimiento celular (inhibición de un 63% cuando se compara a un 29% de la inhibición por cis-platino solamente).

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Los ejemplos presentados a continuación pretenden ilustrar realizaciones particulares de la invención y no intentan de ninguna manera limitar el alcance de la presente solicitud, incluyendo las reivindicaciones.

Ejemplos Procedimientos experimentales

Oligonucleótidos. Los oligonucleótidos 3' modificados fueron comprados a Oligos Etc. (Wilsonville, OR) o sintetizados en la Universidad de Alabama, en Birmingham, usando columnas de CPG 3'-C3-amina de Glen Research (Sterling, VA). Los oligonucleótidos no modificados fueron obtenidos de Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD. Los oligonucleótidos fueron resuspendidos en agua, precipitados en alcohol butílico, lavados con etanol al 70%, secados y resuspendidos en el agua estéril o fosfato salino (PBS). Fueron luego esterilizados por filtración a través de un filtro 0,2 \mum. Cada oligonucleótido fue examinado en busca de su integridad por radiomarcado en 5' seguido por electroforesis en gel de poliacrilamida PAGE. Los resultados presentados en este trabajo fueron reproducibles e independientes de la fuente de oligonucleótidos sintéticos.

Ensayo de crecimiento celular. Células fueron llevadas a placas a baja densidad (de 10^{2} a 10^{3} células por pocillo, dependiendo de la línea celular) en el medio complementado con suero apropiado en placas de 96 pocillos (una placa por punto de tiempo de ensayo MTT) y crecen bajo las condiciones estándares de cultivo de células. Los oligonucleótidos siguientes del día (día 1), o agua como control, fueron añadidos al medio de cultivo para dar una concentración final de 15 \muM. Oligonucleótidos adicionales, equivalentes a la mitad de la dosis inicial, fueron añadidos al medio de cultivo a los días dos, tres y cuatro. Las células fueron ensayadas usando el ensayo MTT (Morgan (1998). Methods. Mol. Biol. 79, 179-183) a los días uno, tres, cinco, siete y nueve después de puesta en placas. El medio de cultivo no fue cambiado durante toda la duración del experimento (que fue el momento requerido para que las células sin tratar crecieran hasta alcanzar confluencia).

Los experimentos fueron realizados por triplicado y las barras representan el error estándar de los datos. Para el experimento que se muestra en la Figura 7A, las células de cáncer de mama MDA-MB-231 (5 x 10^{2} de células por pocillo) fueron llevadas a placa de 96 pocillos. Después de veinticuatro horas, una única dosis de oligonucleótido, o un volumen igual de PBS como control, fue añadido al medio de cultivo para una concentración final de 10 \muM. Las células viables fueron evaluadas siete días después de la puesta en placas usando el ensayo MTT. Para el experimento usando oligonucleótidos 3' no modificados (Figura 7D), el medio suplementado con suero fue reemplazado por medio libre de suero que contenía oligonucleótido (o medio libre de suero solo en los pocillos de control). Después de la incubación a 37ºC por cuatro horas, se añade suero fetal bovino (Life Technologies, Inc.) al medio para dar 10% v/v. La heparina usada en estos experimentos fue sal sódica grado USP obtenida de intestino porcino, comprado en Apothecon (Bristol-Myers Squibb Co.). Las soluciones de trabajo fueron diluidas desde la solución madre (1000 unidades/ml) en PBS estéril.

Detección de Cuartetos G por U.V. Espectroscopia. Los oligonucleótidos fueron resuspendidos en tampón Tm (20 mM de Tris HCl, pH 8,0, 140 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl_{2}) a una concentración tal que A_{260} = 0,6 (concentración molar en el intervalo de 2,0 a 3,9 \muM). Las muestras fueron pretratadas con ebullición durante cinco minutos y se les dejó enfriarse a temperatura ambiente lentamente y se dejaron en incubación durante toda la noche a 4ºC. Los experimentos de desnaturalización/renaturalización térmica fueron realizados usando un instrumento Ultrospec 2000 Amersham Pharmacia Biotech equipado con un portador de cubetas calentado por efecto Peltier y controlador de temperatura (Amersham Pharmacia Biotech). La absorbencia a 295 nm fue controlada en un intervalo de temperatura de 25-95 ó 20-90ºC a una velocidad de calentamiento/enfriamiento de 0,5ºC/min.

Captación de oligonucleótidos. Fueron sembradas células de MDA-MB-231 en placas de veinticuatro pocillos a una densidad de células 5x10^{5}/pocillos. Después de veinticuatro horas, los oligonucleótidos (5 nmol de oligonucleótido no marcado y 5x10^{6} cpm (aproximadamente 1 pmol) de 5' oligonucleótido marcado con ^{32}P) se añadieron directamente al medio de cultivo para dar una concentración final de 10 \muM. Las células fueron incubadas a 37ºC durante diez o veintiséis horas y fueron lavadas luego tres veces con PBS. Las células fueron retiradas de la placa por tripsinización, lavadas, y recogidas en 100 \mul de PBS. Una alícuota de 50 \mul fue analizada por centelleo para contar la radiactividad asociada a la célula. Para asegurar que los procedimientos de lavado fueron suficientes y se eliminó todo el exceso de oligonucleótido, el lavado final de PBS fue analizado y encontrado que está muy bajo comparado con la radiactividad asociada a la célula. Las alícuotas de 50 \mul restantes se sometieron a ebullición durante cinco minutos y fueron colocadas sobre hielo. Se añadió un volumen igual de fenol/cloroformo, y los oligonucleótidos fueron extraídos en la fase acuosa, precipitados con alcohol n-butílico, y analizados por electroforesis en un gel al 15% de poliacrilamida desnaturalizada.

Ensayo de desplazamiento por movilidad electroforética (EMSA). Los oligonucleótidos 5' fueron marcados con ^{32}P usando T4 quinasa. Los oligonucleótidos marcados (concentración final de 1 nM, aproximadamente 50,000 cpm) se preincubaron durante treinta minutos a 37ºC solos o en presencia de un oligonucleótido competidor no marcado. Fueron añadidos los extractos nucleares, y la muestra se incubó por unos treinta minutos adicionales a 37ºC. Tanto la preincubación como las reacciones de ligadura fueron realizadas en tampón A (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4; 140 mM de KCl; 2,5 mM de MgCl_{2}; 1 mM de ditiotreitol; 0,2 mM de fluoruro de fenil-metil-sulfonilo y 8% v/v de glicerol). La electroforesis se llevó a cabo usando geles al 5% de poliacrilamida en tampón de TBE (90 mM de Tris borato, 2 mM de EDTA).

Enlace de entrecruzamiento por U.V. Para los experimentos de entrecruzamiento por UV, las muestras se incubaron como se describió anteriormente (EMSA). Fueron colocadas sobre hielo y luego irradiadas a 5 cm con la fuente usando la función "Enlace de autocruzamiento" de un instrumento Stratagene Stratalinker UV. Luego de la irradiación, las muestras fueron sometidas a electroforesis en condiciones de desnaturalización en un gel al 8% de poliacrilamida-SDS usando un tampón Tris-glicina estándar y visualizado por autoradiografía.

Tintado Southwestern Blotting. Extractos nucleares fueron sometidos a electroforesis en un gel al 8% de poliacrilamida-SDS y transferidos a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) por electrotintado (electroblotting) usando un tampón de Tris glicina/metanol (10% v/v). Las proteínas inmovilizadas fueron desnaturalizadas y renaturalizadas lavando durante treinta minutos a 4ºC con 6M de guanidina. HCl seguido por lavados en diluciones 1:1, 1:2 y 1:4 de 6M de guanidina en tampón ligante de HEPES (25 mM HEPES pH 7,9; 4 mM KCl, 3 mM MgCl_{2}). La membrana fue bloqueada por lavado durante una hora en una solución al 5% de leche deshidratada sin grasas (NDM) en un tampón ligante. La hibridación de oligonucleótidos marcados (1-4 x 10^{6} cpm) tuvo lugar durante dos horas a 4ºC en tampón ligante HEPES suplementado con 0,25% de NDM, 0,05% de Nonidet, 400 \mug/ml de ADN de espermatozoides de salmones y 100 \mug/ml de una no relacionada, secuencia mezclada de 35-méro oligonucleótidos (5'-TCGAGAAAAACTCTCCTCTCCTTCCTTCCTCTCCA-3' SEQ ID No: 19). Las membranas fueron lavadas en tampón ligante y visualizadas por autoradiografía.

Tintado Western Blotting. Fue realizado a temperatura ambiente en un tampón que contenía Tween 20 al 0,1% (para anticuerpo policlonal) ó 0,05% (anticuerpo monoclonal). Membranas PVDF fueron bloqueadas con PBS-Tween 20 que contenía 5% de NDM durante una hora, lavadas e incubadas en PBS-Tween 20 durante una hora a una dilución 1:1000 del antisuero de nucleolina o del anticuerpo monoclonal de nucleolina (MBL Ltd., Japan, concentración final 1 \mug/ml) en PBS-Tween 20. Las membranas fueron lavadas tres veces durante cinco minutos, cada lavado en PBS/Tween 20, y fueron incubadas durante una hora con anticuerpo secundario diluido en PBS/Tween 20 (anticuerpo de conejo IgG-HRP 1:1000 ó 1:2000 anticuerpo de ratón IgG-HRP). Después del lavado, la mancha se visualizó usando reactivo ECL (Amersham Pharmacia Biotech) según las instrucciones del fabricante.

Captación de complejos oligonucleótidos-proteína biotinilados. Células MDA-MB-231 fueron crecidas hasta 50% de confluencia en placas de 90 mm. Se añadieron oligonucleótidos 5'-biotinilados al medio de cultivo a una concentración final de 5 \muM. Después de la incubación durante dos horas a 37ºC, las células fueron lavadas exhaustivamente con PBS y lisadas por adición de 1 ml de tampón para lisis (50 mM Tris.HCl; pH 8,0; 150 mM de NaCl, 0,02% (p/v) de azida de sodio; 0,1 mg/ml de fluoruro de sulfonilo de fenilmetilo 1% (v/v) de Nonidet P40; 0,5% (p/v) de deoxicolato de sodio; 0,5 mM de ditiotreitol, 1 \mug/ml de aprotinina) seguido por incubación a -20ºC durante diez minutos. El ADN genómico fue cargado por inyección repetida del lisado a través de una aguja ancha y fina. El lisado fue añadido a perlas magnéticas cubiertas de estreptavidina (MagneSphere, Promega Inc.) e incubado durante diez minutos a temperatura ambiente. Las perlas fueron capturadas y se retiró la muestra no enlazada. Las perlas fueron lavadas luego dos veces con 1 ml de tampón de lisis y otra vez con 1ml de tampón A. Finalmente, las proteínas fueron eluídas por la adición de 50 ml de tampón de carga (conteniendo 1% de SDS y 5% de 2-mercaptoetanol) e incubación durante quince minutos a 65ºC.

Preparación de extractos de proteína nuclear, de membrana y citoplasmática. Los extractos nucleares de HeLa usados en EMSA fueron comprados a Promega Inc. (grado "desplazamiento de bandas"). Los extractos nucleares y citoplasmáticos de células MDA-MB-231 fueron preparados usando el protocolo descrito en F.M. Ausubel et al. Ausubel et al. (Eds.) (1996) Currents Protocols in Molecular Biology, Wiley, NY, Section 12.1. Las proteínas de membrana de plasma fueron preparadas de las células de MDA-MB-231 usando el método antes descrito. Yao et al. (1996) Biochemical Farmacology 51, 431-436; Naito et al. (1988) J Biol. Chem. 263, 11887-11891.

Tintado con tinta china. La membrana fue incubada durante 15 minutos a temperatura ambiente en PBS-Tween 20 conteniendo tres gotas de tinta china Higgins 4415 y lavada con agua destilada.

Ensayo ligante de nucleolina. Para determinar qué moléculas base no oligonucleótidos o compuestos son capaces de ligarse a nucleolina, fue efectuado un ensayo EMSA como se describe a continuación y los resultados son mostrados en la Figura 14. En este ensayo, se revisa la capacidad ligante de algunas moléculas o compuestos diferentes a la nucleolina. Este tipo de ensayo puede ser utilizado para seleccionar las moléculas o compuestos capaces de ligarse a nucleolina.

Fueron añadidas proteínas nucleares (2,5 \mug; en el caso de células de HeLa) a oligonucleótidos TEL marcados en 5' con ^{32}P (5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG SEQ ID No: 20 a la concentración final de 2 nM). El oligonucleótido o compuesto competidor no marcado fue añadido para dar una concentración final de oligonucleótidos de 50 nM (equivalente a aproximadamente 0,5 \mug/ml de GRO29A) ó 0,5 \mug/ml (carriles 3-12). Las reacciones de ligadura tuvieron lugar durante 30 minutos a 37ºC en un tampón que contenía 20 mM de Tris.HCl; pH 7,4, 140 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl_{2}, 8% (v/v) de glicerol, 1 mM de DTT, 0,2 mM de PMSF). Las muestras fueron analizadas en un gel al 5% de poliacrilamida usando tampón TBE.

Agente quimioterapéutico y protocolo experimental GRO. Fue añadido cis-platino (en solución al 1% de DMSO para dar una concentración final de 0,5 \mug/ml) al medio de células de cáncer de mama MDA-MB-231 en crecimiento en el cultivo. Después de dos horas, es añadido al medio GRO29A (en solución de PBS para dar una concentración final de 8 \muM). Después de seis días, se determina el respectivo número de células viables usando el ensayo MTT. Las células tratadas con GRO29A sólo recibieron un apropiado volumen de 1% de DMSO en lugar de cis-platino. Las células tratadas con cis-platino sólo recibieron un volumen apropiado de PBS en lugar de GRO29A.

Eficacia de GROs contra el cáncer in vivo . El objetivo principal es demostrar que la eficacia de los GROs contra del cáncer de próstata in vivo y el éxito en estos estudios podría conducir a ensayos clínicos de GROs. El segundo objetivo es revisar los niveles de nucleolina y las características en células de próstata. La nucleolina, una proteína nucleolar involucrada en aspectos múltiples del crecimiento de células, ha sido identificada como el objetivo putativo para los efectos de los GRO. La hipótesis de los solicitantes es que los GROs se ligan y desactivan a la nucleolina. Es conocido que los niveles de nucleolina (en el núcleo) se correlacionan positivamente con la velocidad de proliferación celular, y por tanto, las estrategias que inhiben a la nucleolina tienen importante potencial terapéutico. Los solicitantes han mostrado que aparentemente la nucleolina está también presente en las células de cáncer de próstata, y esto podría ser relevante para el mecanismo de los efectos de los GRO. Además, los niveles de nucleolina en la superficie de las células pueden ser elevados en células malignas comparados con células normales. Esto tendría implicaciones en relación con la nucleolina como un indicador de células tumorales. Otro objetivo es analizar las nuevas terapias para el cáncer de próstata, como las terapias de combinación de GRO y agentes de quimioterapia, e inhibidores con pequeñas moléculas de la nucleolina.

Determinar la actividad de los GROs en una serie de líneas celulares derivadas de los tejidos normal y maligno de la próstata: Los niveles de nucleolina en el núcleo, el citoplasma y membrana de plasma de estas células serán revisadas usando un microscopio de inmunofluorescencia y tintado. Para optimizar la entrega de los GROs, pueden ser estudiadas la captación y actividad de los GROs introducidos a las células cultivadas por varios métodos diferentes. También, la captación por tumores de los GROs, entregados por diferentes métodos, será estudiada en modelos del cáncer de próstata en ratones y ratas. Para el estudio de la eficacia in vivo, son usados ratones desnudos con xenografías de tumores implantados vía subcutánea u orto-tópicamente y el modelo de rata Dunning del cáncer de próstata. Los datos preliminares indican que los GROs son sinergísticos con algunos fármacos empleados en quimioterapia. Por tanto, pueden ser examinados los efectos de combinaciones de los GROs con una variedad de otros agentes citotóxicos en células cultivadas, y ensayadas para cualquiera combinación sinergística en modelos de animales. Finalmente, puede ser formulado un modelo de homología de nucleolina basado en las estructuras reportadas de muchas proteínas similares y usado para identificar potenciales inhibidores con moléculas pequeñas de la nucleolina por un método de "Exploración virtual".

Los agentes de quimioterapia convencionales han sido ineficaces en prolongar la supervivencia en ensayos aleatorios en pacientes con cáncer de próstata refractario a hormonas y son requeridos urgentemente nuevos enfoques terapéuticos. Los GROs de la presente invención son potencialmente agentes tumorales específicos que son muy activos contra las células de cáncer de próstata. Éstos tienen un mecanismo nuevo de acción y un potencial terapéutico enorme en la lucha contra el cáncer de próstata. Los solicitantes han identificado la nucleolina también como un nuevo objetivo para la intervención terapéutica en el cáncer de próstata. El desarrollo del conocimiento de esta proteína puede resultar una mejora en las técnicas de diagnóstico o pronóstico para el cáncer de próstata, o una nueva clase de fármacos que inhiban la nucleolina.

Los métodos descritos a continuación describen el ensayo del oligonucleótido GRO29A. Sin embargo, si otro GRO tiene superior actividad y similar estabilidad, podría ser usado en lugar de GRO29A.

Sensibilidad de líneas de células de próstata, malignas y transformadas, y relación entre la sensibilidad y los niveles de proteínas de ligadura de nucleolina/GRO. Es calculado el valor GI_{50} para GRO29A para una variedad de líneas de células que son derivadas de próstatas de seres humanos y de ratas usando el ensayo MTT. Éstos incluirán las dependientes de la hormona (LNCaP) e independientes (DU145, PC-3), no malignas (PZ-HPV-7 y YPEN-1 de rata), y líneas de células resistentes a fármacos múltiples (AT3 B1 de rata y MLLB-2). Las líneas de células pueden ser adquiridas de ATCC. Para determinar los niveles de nucleolina, son preparados extractos de membrana nuclear, citoplasmática y plasma de cada línea de células por métodos estándares. Bates et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (37): 26369-77. Los extractos son sometidos a electroforesis sobre geles al 8% de poliacrilamida-SDS y transferidos a membranas de PVDF. Son examinados por Tintado Southwestern blotting (con GRO radiomarcado) y western blotting (con anticuerpo monoclonal de nucleolina, Santa Cruz) para determinar los niveles de proteína/nucleolina ligada al GRO. Las células también son examinadas por tintado con inmunofluorescencia usando anticuerpos de nucleolina apropiados para tintado de proteínas sea intracelulares o superficiales de las células.

Optimización de la entrega de oligonucleótidos a células de tumor en cultivo e in vivo . Para investigar la captación de las células GRO29A cultivadas, es usado un análogo a GRO29A marcado en 5'-FITC. Células (inicialmente DU145 y PC-3) son tratadas con este oligonucleótido entregado por una variedad de métodos diferentes. Éstos incluirán electroporación, lípidos catiónicos (1 \mug GRO29A: 4 \mug DOTAP-DOPE; [1:1]), sulfato de polimixina B (Sigma) nanopartículas de ácido láctico (una síntesis simple es descrita en Berton et al. (1999) Eur. J Pharm. Biopharm. 47 (2): 119-23) y permeabilización de estreptolisina O (Giles et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26 (7): 1567-75). La captación de oligonucleótidos y localización intracelular es seguida por microscopía de fluorescencia. Los efectos de los diferentes métodos de entrega sobre la actividad antiproliferativa de GRO29A son determinados por el ensayo MTT. Para determinar si las características de captación de GRO29A son significativamente diferentes de los oligonucleótidos no ricos en G, la captación sin ayuda de GRO29A rico en C es comparada con el rico en C y la secuencia mezclada del oligonucleótido marcado por FITC. Si la captación es significativamente diferente, la investigación de la posibilidad de que diferentes receptores sean utilizados se lleva a cabo en experimentos en los que oligonucleótidos FITC marcados se incuban con células en presencia de oligonucleótidos competidores no marcados. Estos experimentos proporcionan información importante respecto a la captación de oligonucleótidos en general, y a la importancia de la interacción de GRO con nucleolina en la superficie de células.

Para revisar la farmacocinética, estabilidad y entrega del tumor son usados métodos in vivo similares a los informados previamente para un oligonucleótido rico en G, para un fosfodiéster que ha sido valorado como agente anti-VIH. Wallace et. Al. (1997) J Farmacol. Exp. Ther. 280 (3): 1480-8. Primero, es sintetizado un análogo a GRO29A, marcado interiormente con ^{32}P. Este procedimiento ha sido descrito antes (Bishop et al. (1996) J Biol. Chem. 271 (10): 5698-703), e involucra la síntesis de dos fragmentos de oligonucleótidos pequeños, marcado en 5'- de un fragmento usando T4 quinasa, seguido por ligazón dirigida por plantilla de los dos fragmentos por T4 ligasa. Los oligonucleótidos marcados se purifican luego por electroforesis en gel de poliacrilamida-PAGE. Ratones desnudo machos (nueve en total) son inoculados subcutáneamente (s.c.) en su flanco oculto con células de cáncer de próstata DU145 con anestesia suave. Cuando los tumores son establecidos (con diámetro aproximado de 0,5 mm), los ratones son tratados con una única dosis de 5 mg/kg de GRO29A (una mezcla de oligonucleótido marcado y no marcado) en un volumen de 25 \mul por inyección intratumoral, intraperitoneal o intravenosa (vena de la cola). Los animales son observados para evidencias de toxicidad aguda y pérdida de peso. En los días dos, cuatro y siete, después de la inyección de GRO, los ratones son sacrificados con inhalación de CO_{2}, el tumor extirpado, y son recogidos la sangre y los órganos. Los niveles de radiactividad son analizados en el tumor, suero, hígado, riñón, bazo y próstata. La estabilidad es determinada en muestras de suero desnaturalizadas por PAGE. También son realizados experimentos similares usando el modelo de Dunning de carcinoma prostático. Isaacs et al. (1978) Cancer Res. 38 (11 Pt 2): 4353-9; Zaccheo et al. (1998) 35 Prostata (4): 237-42. Si alguna de las técnicas de entrega evaluadas en cultivos de células ha dado como resultado una captación significativamente potenciada (y ha resultado apropiada para la entrega in vivo), también se evalúa. Estos experimentos determinan las rutas de administración óptimas en ratas y ratones, y proporcionan una indicación del esquema de dosificación óptima. Todos los experimentos en animales se adhieren estrictamente a las guías institucionales en el cuidado y uso de animales.

Evaluación in vivo de la eficacia de GROs en la inhibición del crecimiento del cáncer de próstata y metástasis. Primero es evaluada la eficacia en los modelos de ratones desnudos. Los ratones son inoculados s.c. con células DU145 con anestesia suave. Después del establecimiento de xenografías palpables, los ratones son tratados (seis ratones por grupo) con GRO29A, oligonucleótido control (5'-GACTGTACCGAGGTGCAAG TACTCTA, con la modificación en amino 3') o PBS usando la ruta de administración óptima descrita anteriormente. Tres grupos de tratamiento reciben dosis dos veces por semana durante dos semanas 0,5, 5 ó 50 mg/kg. Son monitoreados el peso corporal y tamaño del tumor (medido con calibrador). A un tiempo apropiado, los ratones son sacrificados por inhalación de CO_{2} y los tumores extirpados. Las secciones del tumor son revisadas por análisis morfológico e inmunotintado, incluyendo nucleolina, PCNA, análisis de Ki 67 y TUNEL para determinar apoptosis. Experimentos similares usando la dosis óptima (económicamente viable) son realizados para determinar la eficacia de GRO29A en la inhibición de PC-3 y xenografías de LNCaP. Luego son implementados modelos de cáncer de próstata metastático. La implantación quirúrgica ortotópica de tumores PC-3 para las glándulas de próstata de ratones desnudos ha sido reportada recientemente (An et al. (1998) 34 (3): 169-74) Prostata, y resultados en nódulo linfático (13/19 ratones) y metástasis de pulmón (5/19) antes de las doce semanas después de la implantación. El modelo de Dunning para ratas del carcinoma prostático fue desarrollado por Isaacs et al. ((1978) Cancer Res 38 (11 Pt 2): 4353-9) y ha sido ampliamente usado para el estudio del crecimiento del tumor y metástasis. Este incluye la inyección de s.c. de tejido del tumor y da como resultado metástasis en nódulo linfático, pulmón y esqueleto. A los animales (quince por grupo) se les implantan tumores como se describió antes (Isaacs et al. (1978) Cancer Res. 38 (11 Pt 2): 4353-9; Zaccheo et al. (1998) 35 Prostata (4): 237-42) y el tratamiento con GRO29A lo empiezan seis semanas después de la implantación (o a la primera aparición de tumores palpables en el modelo de ratas), y continúan dos veces por semana durante seis semanas adicionales. En este momento (o antes, si los animales aparecen agonizando o angustiados), los animales son sacrificados y sometidos a la autopsia para revisar el tamaño del tumor principal y metástasis. Los tumores y metástasis son revisados histológicamente como se describió anteriormente.

Evaluación de combinaciones farmacoterapias de GRO-citotóxicos para el cáncer de próstata. Se determina la eficacia de los tratamientos combinados de GRO29A con fármacos de quimioterapia y otros agentes que se espera actúen sobre la detención del crecimiento de las células. Éstos incluyen mitoxantrona, etoposida, cis-platino, camptotecina, 5-fluororacil, vinblastina, mitramicina A, dexametasona y cafeína (promociona la evolución a través de la fase S de los puntos de chequeo del ciclo de la célula). Este grupo comprende agentes con mecanismos diversos de acción, por ejemplo, inhibidores de la topoisomerasa I y II, inhibidores de la mitosis y agentes que dañan el ADN. La actividad de éstos es evaluada en células cultivadas que usan el ensayo MTT para determinar la cantidad de células. Las células son tratadas por la adición de fármacos (a la dosis GI_{30}) al medio, seguida veinticuatro horas después por adición de GRO29A (a la dosis GI_{30}) o en la secuencia inversa. Para las combinaciones en las que hay actividad sinergística, las células son revisadas en busca de la perturbación del ciclo celular (por citometría de flujo) y apoptosis (citometría de flujo de células teñidas con anexina V). Las combinaciones sinergísticas también son evaluadas in vivo, como se describió anteriormente.

Desarrollo de modelos de homología de nucleolina y realización de una"exploración virtual"de una biblioteca de moléculas pequeñas para identificar inhibidores potenciales de nucleolina. Los inhibidores con moléculas pequeñas de nucleolina podrían ser las alternativas más prácticas de los oligonucleótidos. La modelación por homología (MSI Modeller and Homology Program) se usa para desarrollar un modelo en 3D de nucleolina partiendo de su alineamiento de secuencia con las estructuras conocidas de proteínas relacionadas (han sido identificada 16). Fueron usadas técnicas estándares de construcción de la cadena principal, modelación del lazo, superposición de estructuras y análisis estadístico de los modelos resultantes. El modelo de homología será mejorado usando dinámica molecular.

La pantalla virtual usa el software MSI Ludi combinado con la base de datos ACD. El Ludi fija moléculas en el sitio activo de la nucleolina combinando con grupos polares e hidrófobos complementarios. Se usa una función empírica de conteo para priorizar los resultados. El Ludi también sugiere las modificaciones que pueden incrementar la afinidad de ligadura entre los oligonucleótidos activos y la nucleolina, y también pueden mejorar el modelo de homología de nucleolina por inferencia de la ligadura de los oligonucleótidos activos. La base estructural de datos ACD contiene 65.800 productos químicos comercial y sintéticamente disponibles que pueden ser adquiridos inmediatamente para un desarrollo adicional. Una selección de los compuestos más prometedores es ensayada para la ligadura de proteínas y la actividad antiproliferativa en células cultivadas in vivo.

Efectos inhibitorios de crecimiento de oligonucleótidos ricos en G. Los efectos de cuatro oligonucleótidos fosfodiésteres ricos en G (GROs) fueron evaluados en el aumento de células tumorales en cultivos. Estos oligonucleótidos constan enteramente de deoxiguanosina y timidina y contienen al menos dos guanosinas contiguas. Para aumentar la estabilidad frente a las nucleasas de sueros, los oligonucleótidos fueron modificados en el extremo 3' con un grupo propilamino. Esta modificación protege a los oligonucleótidos de la degradación en los medios conteniendo sueros durante al menos veinticuatro horas.

La Figura 1A-D muestra los resultados del ensayo MTT para determinar los números relativos de células viables en las líneas celulares tratadas derivadas de carcinomas de próstata (DU145), pecho (MDA-MB-231, MCF-7) o cervical (HeLa).

Dos oligonucleótidos, GRO29A y GRO15A, inhiben consistentemente la proliferación en todas las líneas celulares evaluadas. Para tres de las líneas celulares, GRO29A tiene un efecto inhibitorio mas potente que GRO15A (para células MCF-7, los oligonucleótidos tienen efectos similares). El crecimiento de células tratadas con otros dos oligonucleótidos, GRO15B y GRO26A, fue similar al del control de células tratadas con agua (GRO26A tuvo un efecto inhibitorio débil del crecimiento en las células MDA-MB-231 y HeLa).

Los resultados ilustrados en la Figura 2A-C muestran que GRO29A tiene un menor efecto inhibitorio del crecimiento sobre una línea celular no maligna (HS27) comparado con la mayoría de las líneas celulares malignas, por ejemplo, DU145, MDA-MB-231. También, GRO29A tiene efectos antiproliferativos respecto a las líneas celulares de leucemia, por ejemplo, K562 y U937, como se muestra en la Figura 3. Tiene un efecto inhibitorio menor del crecimiento respecto a una línea celular madre hematopoyética no maligna (ATCC2037).

Formación de Cuartetos G por Oligonucleótidos ricos en G. Para investigar la formación de estructuras de Cuartetos G por los oligonucleótidos ricos en G, se usó una técnica de condensación por U.V. descrita por Mergny et al. (1998) FEBS Lett. 435, 74-78. Este método se basa en el hecho de que la disociación de Cuartetos G da como resultado una disminución de la absorbancia a 295 nm y se señala que da una indicación de la formación intramolecular de Cuartetos G más confiable que la medición a 260 nm. Como un control de la formación de Cuartetos G, usamos un oligonucleótido TEL de sólo una hebra. Este oligonucleótido contiene cuatro repeticiones de la secuencia telomérica humana 5'-TTAGGG y se conoce que forma una estructura de Cuartetos G in vitro, Wang et al. (1993) Structure 1, 263-282. La Figura 4-A muestra la curva de condensación de esta secuencia. La formación de Cuartetos G es demostrada por una transición clara a una temperatura de fusión de 66ºC. La transición fue reversible y una histéresis leve fue observada entre las curvas de enfriamiento y calentamiento (no mostrada) a 0,5ºC/minutos indicando una transición bastante lenta. El oligonucleótido más activo, GRO29A (Figura 4B), mostró un perfil similar, demostrando evidentemente la presencia de Cuartetos G. El oligonucleótido ligeramente menos activo, GRO15A (Figura 4C), mostró una disminución de la absorbancia entre 20 y 50ºC. Esto sugiere la formación de Cuartetos G, pero no se vio una transición clara ya que la temperatura en el proceso de fusión es inferior para el TEL (Figura 4A) o GRO15A (Figura 4C). Las curvas para los dos oligonucleótidos inactivos, GRO15B (Figura 4B) y GRO26A (Figura 4E), no indican ninguna transición características de la formación intramolecular de cuartetos G en estas condiciones.

Captación relativa de oligonucleótidos. Para determinar si la actividad antiproliferativa de oligonucleótidos ricos en G podía ser explicada por su captación diferencial en las células, fue evaluada la captación celular de oligonucleótidos radiomarcados en 5'. Aunque este método puede subestimar la captación celular total de oligonucleótidos debido a la acción de la fosfomonoesterasa en retirar la marca en 5', puede proporcionar una información útil cuando se compara la captación relativa. Scaggiante et al. (1998) Eur. J. Biochem. 252, 207-215; Capaccioli et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Com. 197, 818-825. La Figura 5 indica la captación relativa de oligonucleótidos en células después de diez horas, como se mide por la radiactividad asociada a las células. El orden de captación (i.e. GRO15A > GRO29A \sim CRO > GRO15B > GRO26A > MIX1) fue la misma a las veintiséis horas. La presencia de células de oligonucleótidos intactos en el interior de las células fue verificada por electroforesis de poliacrilamida de célula lisadas.

Aunque la Figura 5 muestra que había diferencias en la extensión de la captación del oligonucleótido dependiendo de la secuencia, éstas no tienen correlación con la actividad antiproliferativa. Por ejemplo, un oligonucleótido inactivo, CRO (véase Figura 6C), fue tratado con eficiencia similar al oligonucleótido más activo, GRO29A. Por lo tanto, las propiedades inhibitorias del crecimiento diferencial de los oligonucleótidos no pueden ser explicadas en relación con las diferencias en la captación celular. Fue notado que la captación relativa parece tener buena correlación con la proporción (pero no con el número) de timidinas en la secuencia, pero la trascendencia de esta observación no está clara actualmente.

Ligadura de oligonucleótidos ricos en G activo para una proteína celular específica. Para investigar además el mecanismo de los efectos inhibitorios del crecimiento, fue examinada la ligadura de los oligonucleótidos a proteínas celulares. Los oligonucleótidos radiomarcados en 5' fueron incubados con extractos nucleares de HeLa, solos o en presencia de un oligonucleótido competidor marcado, y revisado en un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética. El oligonucleótido de secuencia telomérica que forma cuartetos G, TEL, fue incluido como competidor en este experimento. Un oligonucleótidos de sola hebra, TEL, también es incluido como competidor en este experimento. El TEL contiene cuatro repeticiones de la secuencia telomérica humana 5'-TTAGGG-3', y es conocido que forma una estructura de cuartetos G in vitro, Wang et al. (1993) Structure 1, 263-282. La Figura 6A muestra la formación de un complejo estable de proteína-oligonucleótido ("*" marcado). Esta banda fue intensa cuando el oligonucleótido marcado fue uno de los oligonucleótidos inhibitorios de crecimiento, GRO15A o GRO29A (carriles 1 y 5), pero el oligonucleótido inactivo, GRO26A, forma solamente un complejo débil (carril 9). Este experimento también muestra que el complejo puede competir efectivamente por el oligonucleótido antiproliferativo sea no marcado o TEL, pero no por el GRO26A inactivo.

Para confirmar que la misma proteína está ligando al TEL y a los oligonucleótidos inhibitorios de crecimiento, un experimento similar es realizado en el que TEL fue marcado. El TEL marcado formó dos complejos con extractos nucleares en ausencia de oligonucleótidos competidores (bandas A y B, de la Figura 6B). El complejo proteína-TEL que migra más lentamente (banda A) fue competido por los oligonucleótidos inhibitorios del crecimiento más lentos no marcados (GRO15A, GRO29A) pero no por oligonucleótidos inactivos (GRO26A, GRO15B). El complejo migratorio más rápido (banda B) es específico para TEL y no fue competido por oligonucleótidos ricos en G. Por tanto, la ligadura de los GROs competidores fue caracterizada por una disminución de la intensidad de la banda A y un aumento en la intensidad de banda B (debido a la liberación de TEL marcado desde el complejo de la banda A). Este ensayo permite la comparación de la afinidad de ligadura de los GROs nativos (sin fosforilación en 5') y fue usado para la valoración de la ligadura de proteínas en los experimentos siguientes. Asegurar que la competición fue debida a la ligadura de los GRO al componente de proteína A del complejo, y no un resultado de la interacción entre el GRO y el oligonucleótido TEL, un desplazamiento de movilidad fue realizado en un gel al 15% de poliacrilamida. No se observan bandas desplazadas cuando el TEL marcado fue incubado con los GROs en ausencia de proteína (datos no mostrados).

Para determinar el peso molecular aproximado de la proteína involucrada en el complejo A y confirmar que la competición por este complejo es resultado de la ligadura directa de la proteína a los oligonucleótidos, se lleva a cabo un estudio de entrecruzamiento con U.V. Oligonucleótidos marcados en 5' y extractos nucleares de HeLa fueron incubados a solos o en presencia de un oligonucleótido competidor no marcado. Las muestras fueron irradiadas luego con luz U.V. dando como resultado la formación de entrecruzamiento entre residuos de proteínas y las timidinas en el oligonucleótido. La proteína fue de esta manera radiomarcada y podía ser detectada en un gel de poliacrilamida SDS. La Figura 6C muestra los resultados de este experimento. Tanto el TEL como GRO15A se entrecruzan con una proteína (marcada "*") por la que fueron compitiendo con oligonucleótidos antiproliferativos y TEL, pero no por el GRO26A inactivo. El oligonucleótido más activo, GRO29A, también forma este complejo de aproximadamente 100 kDa y otro complejo de peso molecular mayor (no es mostrado). El GRO26A inactivo produce una banda escasamente visible de aproximadamente 100 kDa (no es mostrada).

El peso molecular de la proteína nuclear fue determinado con más exactitud por Tintado Southwestern blotting. Extractos nucleares de HeLa fueron sometidos a electroforesis en un gel al 8% de poliacrilamida-SDS y transferidos a una membrana de PVDF. La membrana fue bloqueada y cortada en tiras. Cada tira fue incubada a 4ºC con un oligonucleótido rico en G marcado con ^{32}P en presencia de ADN relacionado no marcado y de una y doble hebra para el bloqueo de la ligadura no especifica. La Figura 6D muestra los oligonucleótidos activos GRO15A y GRO29A hibridizados a una banda sola de proteína de 106 kDa (la banda estuvo exactamente adyacente al marcador de peso 106 kDa, no mostrado). Los oligonucleótidos inactivos GRO15B y GRO26A sólo hibridizaron débilmente a esta proteína. Los datos presentados en la Figura 6 sugieren una correlación entre la actividad y la ligadura de la proteína, por lo menos para los cuatro oligonucleótidos revisados. Estos experimentos también demuestran que la ligadura de GROs a p106 es muy específica, ya que solamente una banda única de proteína es reconocida con afinidad tan alta (véase Figura 6D). Esto no es simplemente un resultado de hibridación a una proteína abundante, ya que el tintado con tinta China de los extractos nucleares inmovilizados demostró la presencia de muchas otras bandas de proteína que son igual o más intensas que la banda de 106 kDa (datos no mostrados).

Actividad antiproliferativa correlaciona con la ligadura de proteína. Para confirmar adicionalmente la relación entre la actividad y la ligadura de la proteína de 106 kDa, fueron sintetizados cuatro oligonucleótidos ricos en G y sus efectos fueron comparados con los oligonucleótidos activo (GRO29A) e inactivo (GRO15B). Las Figuras 7A y 7B muestran que el efecto inhibitorio del crecimiento de los oligonucleótidos tiene correlación con la capacidad de competir por proteína ligante a TEL. Tres de los nuevos oligonucleótidos (GRO14A, GRO25A, GRO28A) exhibieron una actividad antiproliferativa moderada pero no es tan potente como la GRO29A. El oligonucleótido GRO14B no mostró actividad antiproliferativa. En consecuencia, los oligonucleótidos moderadamente activos eran capaces de competir con TEL para ligar la proteína nuclear, sin embargo no tan eficazmente como GRO29A. El oligonucleótido no inhibitorio, GRO14B, no fue capaz de competir para ligarse a la proteína.

La importancia de la proteína de aproximadamente 106 kDa sobre el efecto sobre el GRO fue demostrada por la correlación entre la sensibilidad de varias líneas celulares a los efectos y niveles antiproliferativos inducidos por el GRO de esta proteína en los extractos nucleares y citoplasmáticos de estas líneas celulares, tal como se muestra en la Figura 8.

Efectos de oligonucleótidos no ricos en G. Para investigar la especificidad de los efectos antiproliferativos, fueron examinados los efectos inhibitorios del crecimiento por oligonucleótidos no ricos en G y heparina, un polisacárido polianiónico.

La Figura 7C muestra que a una concentración de 10 \muM (equivalente aproximadamente a 0,1 mg/ml para
GRO29A), ni un oligonucleótido rico en C modificado en 3' (CRO) ni un oligonucleótido de base mezclado modificado en 3' (MIX1) fueron capaces de inhibir el crecimiento de células de cáncer de mama MDA-MB-231. Este resultado demostró que sólo la actividad inhibitoria del crecimiento de GRO15A y GRO29A no era simplemente efectos no específicos que resultan de la presencia de oligonucleótidos modificados en 3', sino que dependía de alguna característica única de estas secuencias. La heparina tampoco tuvo efecto sobre el crecimiento celular cuando se adicionó al medio de cultivo a una concentración de 20 unidades/ml (aproximadamente 0,12 mg/ml), demostrando que los efectos antiproliferativo de los oligonucleótidos activos no son sólo resultado de su carácter polianiónico. Para examinar las propiedades antiproliferativas del oligonucleótido protegido en 3', fue usado un protocolo de tratamiento ligeramente modificado, en el que los oligonucleótidos se añadieron a células un en medio libre suero (véanse "Procedimientos experimentales"). La Figura 7D muestra que efectos similares podrían también ser vistos con oligonucleótidos no modificados en estas condiciones. Tanto el 29A-OH (un análogo no modificado en 3'de GRO29A), como el TEL impiden el crecimiento celular, mientras que dos oligonucleótidos de secuencias mezcladas no tenían ningún efecto inhibitorio del crecimiento.

Las propiedades ligantes de proteínas de estos oligonucleótidos no ricos en G y la heparina (no mostradas) tampoco fueron comparadas. Como era de esperar, los oligonucleótidos inhibidores del crecimiento no marcados GRO29A, 29A-OH, y TEL compitieron fuertemente por la ligadura de proteínas en el ensayo competitivo de desplazamiento de movilidad electroforética (usando extractos nucleares de oligonucleótidos TEL marcado y MDA-MB-231) a la concentración de 10 nM (aproximadamente 0,1 mg/ml para el GRO29A). De acuerdo con su actividad antiproliferativa menor, el TEL compite ligeramente menos eficazmente que el 29A-OH o GRO29A. Ninguna competición fue observada usando 10 nM de CRO, MIX2, o MIX3 no marcados, o en presencia de 0,02 unidades/ml heparina (aproximadamente 0,12 mg/ml).

Sin embargo, el oligonucleótido de secuencias mezcladas, MIX1, es anómalo. Aunque este oligonucleótido no tiene ningún efecto sobre el crecimiento celular, parecía competir por la ligadura de proteínas en el EMSA competitivo.

Evidencia de que la proteína ligante de oligonucleótidos ricos en G es la nucleolina. Dos artículos previos describen la ligadura de la proteína nucleolar, la nucleolina, a la secuencia telómera rica en G. Ishikawa et al. ((1993) Mol. Cell. Biol. 13, 4301-4310) identifica una proteína de 50 kDa a partir de los extractos de HeLa, los cuales se ligan a 5'-(TTAGGG)_{4}-3'. La determinación de microsecuencia sugiere que ésta era un fragmento proteolítico de la nucleolina. La ligadura de la proteína de nucleolina de longitud completa de 106 kDa y purificada fue demostrada por separado por Dickinson y Kohwi-Shigematsu. Dickinson et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 456-465. Debido a que la proteína en cuestión es de peso molecular correcto y también ligada a 5'-(TTAGGG)_{4}-3' (TEL), fue puesta a prueba la hipótesis de que la proteína ligante de oligonucleótidos ricos en G era la nucleolina. Extractos nucleares de células de HeLa (comprada en Promega) o de células de cáncer de mama, MDA-MB-231 (obtenida en el laboratorio de los solicitantes por procedimientos estándares) fueron sometidos a electroforesis y transferidos a membrana de PVDF. Las proteínas inmovilizadas fueron ensayadas en la ligadura de GRO15A marcado con ^{32}P usando el procedimiento descritode tintado Southwestern y visualizadas por exposición durante la noche expuestas a una película autoradiográfica. La misma membrana fue liberada de oligonucleótidos según los pasos de desnaturalización/renaturalización descritos anteriormente (Procedimientos experimentales, véase "Tintado Southwestern blotting") y western blot usando antisuero de nucleolina como anticuerpo fundamental y un anticuerpo secundario conjugado de conejo de peroxidasa de herradura (HRP). La mancha fue visualizada por incubación con un reactivo de detección de quimioluminescencia, seguida por una exposición de veinte segundos a una película autoradiográfica. Los resultados son mostrados en la Figura 9A. El Tintado Southwestern blotting de los extractos nucleares mostró una banda intensa en la hibridación y GRO15A radiomarcado, en 106 kDa (HeLa) o aproximadamente 116 kDa (MDA-MB-231). El tintado western blotting de las proteínas nucleares de MDA-MB-231 indica una tira intensa en aproximadamente 116 kDa y bandas más débiles en aproximadamente 50 kDa. En los extractos de HeLa el anticuerpo nucleolina reconoce bandas múltiples en aproximadamente 50, 75, 106 y 120 kDa. Lo más importante, en ambas líneas celulares la banda reconocida por GRO15A corresponde exactamente a una banda reconocida cuando la membrana fue liberada y sometida al tintado western blotting con anticuerpo de nucleolina. Nucleolina es una proteína que puede ser fosforilada en células por varias quinasas, y es también susceptible a sufrir auto proteólisis. Zhou et al. (1997) J Biol. Chem. 272, 31130-31137; Schwab et al. (1997) Eur. J Cel. Biol. 73, 287-297; Li et al. (1996) J Biol. Chem. 271, 15662-15668; Peter et al. (1990) Cell 60, 791-801; Belenguer et al. (1990) Mol. Cel Biol 10, 3607-3618; Fang et al. (1993) Exp. Cell Res. 208,48-53; Chen et al., (1991) J Biol. Chem. 266, 7754-7758. Se cree que la diferencia detectada en los pesos moleculares de proteínas en estas manchas podría surgir de los diferentes métodos de preparaciones del extracto nuclear dando como resultado formas fosforiladas o degradadas de manera diferente de nucleolina siendo las especies predominantes. La diferencia en las intensidades de las tiras mostradas en los tintados Southwestern blotting en la Figura 9A podría deberse a la ligadura preferencial de GRO15A a una forma de nucleolina (aparentemente a las especies de 106 kDa) sobre otras.

Para determinar si la ligadura de la proteína específica ocurre dentro del ambiente de célula, fueron usados oligonucleótidos ricos en G biotinilados para tratar células de cáncer de mama, MDA-MB-231. Perlas magnéticas cubiertas con estreptavidina fueron usadas para captar los complejos oligonucleótidos-proteína después del lisado de las células con un tampón para lograr su inmunoprecipitación (véase "Procedimientos experimentales"). Este procedimiento fue realizado para las células que fueron tratadas con un oligonucleótidos activo (5'-Biotin-GRO15A) o con un oligonucleótido inactivo (5'-Biotin-GRO15B), y para células sin tratar como el control. Volúmenes iguales de cada muestra fueron sometidos a electroforesis y transferidos a una membrana de PVDF. Éstos fueron analizados por tintado con tinta china, tintado Southwestern blotting con GRO15A radiomarcado, y tintado western blotting con un anticuerpo monoclonal de nucleolina. El tintado con tinta china de la membrana indicaba una banda de proteínas muy importante aproximadamente a 116 kDa que estaba presente en las células tratadas con GRO15A biotinilado, pero estaban ausente en las células sin tratar y de una intensidad muy inferior en células tratadas con GRO15B biotinilado inactivo (los datos no se muestran). Los tintado Southwestern blotting y western blotting (Figura 9B) confirman que esta proteína captada se liga tanto a ambos, al GRO15A así como al anticuerpo de nucleolina.

Este experimento muestra que una proteína de 116 kDa fue captada específicamente de las células tratadas con GROs biotinilado, que esta proteína fue reconocida también por un anticuerpo de nucleolina, y también, que esa proteína fue captada más por GRO15A activo que lo captado por el GRO15B menos activo. Aunque la posibilidad de que la asociación oligonucleótido-proteína tuviera lugar durante la lisis de la célula o la captación de oligonucleótidos no pueda ser excluida completamente, es improbable que el oligonucleótido existiera en un estado libre, no acomplejado dentro de la célula. Estos resultados suministran pruebas fehacientes a favor de la ligadura del oligonucleótido a la proteína de 116 kDa dentro de la célula (o posiblemente en la superficie de la célula).

Para determinar la ubicación subcelular de proteína ligante de oligonucleótidos ricos en G, fueron realizados tintados experimentales Southwestern y western blotting para comparar los extractos nucleares, los extractos citoplasmáticos y las proteínas derivadas de la membrana celular (5 \mug de extracto por carril). Figura 9C muestra los resultados de estos estudios. El tintado Southwestern blotting muestra que una proteína de 116 kDa es capaz de la ligadura a GRO15A marcado y está presente en los extractos nucleares y, en menor grado, en la fracción citoplasmática. La misma banda estaba presente en los extractos de membranas de plasma e hibridizado fuertemente a GRO15A. El tintado Western blotting de la misma membrana muestra que un anticuerpo monoclonal de nucleolina también reconoce estas bandas a 116 kDa en cada fracción. (Una banda aproximadamente a 70 kDa también se reconoce tanto por el GRO15A como por el anticuerpo de nucleolina y podría ser un extracto proteolítico de nucleolina.) Debido a que tanto la ubicación como la respectiva intensidad de las bandas reconocidas por el GRO15A y el anticuerpo de nucleolina son las mismas, estos resultados proporcionan evidencia adicional de que es nucleolina la proteína que se liga al oligonucleótido antiproliferativo rico en G. La detección de la proteína ligante del GRO en los extractos de plasma de membranas también indica la posibilidad de que la ligadura por la proteína de la superficie de las células podría ser importante en el mecanismo de la acción de los oligonucleótidos ricos en G.

Además, la participación de la proteína ligante de GRO-nucleolina en la actividad antiproliferativa de GRO ya que fue mostrada que la sensibilidad de las líneas celulares a los efectos del GRO se encuentra relacionada con los niveles de GRO ligados a la proteína (detectado por tintado Southwestern blotting en los extractos de células). Por ejemplo, las líneas celulares que son más sensibles a los efectos del GRO (DE145, MDA-MB-231, HeLa) tienen altos niveles de p110, mientras que las líneas celulares menos sensibles (HS27, MCF-7) o las líneas celulares resistentes (un derivado de MCF-7, resistente al metotrexato) tenían niveles bajos o no detectables de p110. Adicionalmente, se encontró que los niveles de nucleolina son alterados significativamente por las células tratadas con GRO, y las células sin tratar crecen en forma exponencial como se muestra en la Figura 9, en la que fue encontrado un aumento total en inmunofluorescencia para las células MDA-MB-231 tratadas (B) versus las no tratadas (A) a las setenta dos horas seguidas al tratamiento con GRO29A usando un tintado con anti-nucleolina y también fue observado un desplazamiento respecto al citoplasma.

El complejo TEL-proteína es superado en su competencia frente a los más eficaces GRO29A y OMR29A (carriles 2 y 13), que son dos potentes oligonucleótidos antiproliferativos. El complejo no es superado en competencia, o es superado en menor grado en su competencia frente a los compuestos sin actividad antiproliferativa (por ejemplo cafeína, polimixina o heparina) o frente a los agentes terapéuticos comúnmente usados cuyos mecanismos es conocido que son resultado de propiedades distintas a la ligadura de la nucleolina (por ejemplo 5-FU, taxol o cis-platino).

Cualquiera de las patentes o publicaciones mencionadas en la presente solicitud son indicativas de los niveles de los expertos en la técnica a los que concierne la invención. Estas patentes y publicaciones son incluidas como referencias en el mismo alcance, tal como si se indicara específica e individualmente para cada publicación individual que se ha incluido como referencia.

El experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para alcanzar los objetos, y obtener sus fines y las ventajas mencionadas, tales como las inherentes a la presente invención. Los métodos actuales, procedimientos, tratamientos, moléculas, y compuestos específicos descritos en la presente solicitud son actualmente representativos de las realizaciones preferentes, son ejemplares, y no están previstos como limitaciones al alcance de la invención. Sus cambios y otros usos que se les ocurran a los expertos en la técnica están abarcados dentro del espíritu de la invención tal como ésta se define por el alcance de las reivindicaciones.

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Referencias citadas en la presente solicitud

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para la conveniencia del lector. No forma parte del Documento Europeo de Patente. Aun cuando se ha tenido un gran cuidado en la compilación de las referencias, los errores o las omisiones no pueden ser excluidas y la EPO desconoce todo adeudo a este respecto.

Documentos de patentes citados en la descripción

EP 00921868 A

US 60128316 B

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<110> Aptamera Inc

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<120> Actividad antiproliferativa de oligonucleotidos ricos en G y el método que es usado para unir a nucleolina

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<130> ANTBH/P32956EP

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<140> 00921868.6

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<151> 8 Abril 1999

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<160> 20

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<170> SeqWin99

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<211> 14

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<212> ADN

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<223> oligonucleótido rico en G

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14

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<223> oligonucleótido rico en G

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GTTGTTTGGG GTGGT

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<210> 14

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<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido rico en G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGGTTGTG GTGGTTGTGG TGGTTGTGGT GG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido rico en G

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGTGGTG GTGGTTGTGG TGGTGGTGGT TT

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido rico en G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGGTGGTG GTTGTGGTGG TGGTGGTTT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido rico en G

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGTGGTG GTGGTGTGGT GGTGGTGG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido rico en G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGTGGTGGT

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido de secuencia mezclada 35-mero

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGAGAAAAA CTCTCCTCTC CTTCCTTCCT CTCCA

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido TEL marcado P

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAGGGTTAG GGTTAGGGTT AGGG

\hfill

24

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Claims (17)

1. Uso de una cantidad eficaz terapéuticamente de un oligonucleótido rico en guanosina capaz de ligar al menos una proteína o nucleolina ligante de oligonucleótidos ricos en G para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la proliferación de células malignas, displásicas, y/o hiperproliferativas en un sujeto.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido rico en guanosina comprende al menos un motivo GGT.

3. El uso según la reivindicación 1, en el que los oligonucleótidos ricos en guanosina son capaces de formar estructuras de cuartetos de guanosina.

4. El uso según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos una repetición contigua de guanosina.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que dicho oligonucleótido tiene un extremo 3' y un extremo 5', estando el extremo 3' modificado para alterar una propiedad del oligonucleótido.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que el extremo 3' comprende un grupo propilamina enlazado a éste.

7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el oligonucleótido comprende una cadena principal de ADN, ARN, 2'-O-metilo o fosforotioato.

8. El uso según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido es seleccionado entre el grupo de secuencias que consta de las secuencias designadas como SEQ ID: No: 1-20.

9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además incluya un agente quimioterapéutico además del oligonucleótido rico en guanosina.

10. El uso según la reivindicación 9, en el que el agente quimioterapéutico se selecciona entre el grupo que comprende mitoxantrona, etoposida, cis-platino, camptotecina, 5-fluororacilo, vinblastina, mitramicina A, paclitaxol, docetaxol, dexametasona y cafeína.

11. Un oligonucleótido ligante de nucleolina, seleccionado entre el grupo que comprende las secuencias designadas como SEQ ID: No: 1-20.

12. El oligonucleótido ligante de nucleolina según la reivindicación 11, en el que dicho oligonucleótido tiene un extremo 3' y un extremo 5', estando dicho extremo 3' modificado.

13. El oligonucleótido ligante de nucleolina según la reivindicación 12, en el que dicho extremo 3' comprende un grupo propilamina ligado a éste.

14. El oligonucleótido ligante de nucleolina según una cualquiera de las reivindicaciones de la 11 a 13, en el que dicho oligonucleótido comprende una cadena principal de ADN, ARN, 2'-O-metilo o fosforotioato.

15. Un oligonucleótido ligante de nucleolina según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que dicho oligonucleótido es capaz de ligarse a TEL-proteína ligante.

16. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido rico en guanina según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 y un portador aceptable farmacéuticamente.

17. La composición farmacéutica según la reivindicación 16 para tratamiento de una enfermedad neoplásica o hiperproliferativa por la función de inhibición de nucleolina.