ES2296335T3 - Utilizacion de uteroglobina humana recombinante en el tratamiento de afecciones fibroticas. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de unión a fibronectina de uteroglobina humana recombinante (rhUG) o un derivado de la misma, con la condición de que el derivado conserve la actividad biológica de la molécula parental, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Description

Utilización de uteroglobina humana recombinante en el tratamiento de afecciones fibróticas.

Campo de la invención

La invención se refiere en general al tratamiento de afecciones inflamatorias y fibróticas utilizando uteroglobina humana (hUG) o uteroglobina humana recombinante (rhUG). Se han identificado papeles fisiológicos y terapias novedosas para la UG (hUG o rhUG). Específicamente, la invención hace referencia al tratamiento de afecciones inflamatorias y fibróticas mediante la administración de hUG o rhUG para inhibir PLA_{2} y/o para prevenir el depósito de fibronectina. La invención proporciona adicionalmente el tratamiento del síndrome de fatiga respiratoria neonatal (RDS) y la displasia broncopulmonar (BPD), una afección crítica del pulmón, y la nefropatía glomerular, una enfermedad del riñón, ambas caracterizadas por afecciones inflamatorias y fibróticas.

Los documentos citados en esta solicitud hacen referencia al estado de la técnica a la cual pertenece esta invención.

Antecedentes de la invención Afecciones Inflamatorias y Fibróticas

La búsqueda de agentes terapéuticos mejorados para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias y fibróticas ha recibido mucha atención en los últimos años. La RDS neonatal, una enfermedad por deficiencia en tensioactivo pulmonar, es una afección de particular interés ya que es una de las causas principales de mortalidad en los neonatos prematuros. Si bien la introducción de la terapia con tensioactivos mejora espectacularmente la supervivencia de los pacientes con RDS, el desarrollo de enfermedades inflamatorias y fibróticas crónicas en un porcentaje significativo de esta población de pacientes es un problema principal. Del mismo modo, la nefropatía glomerular hereditaria por depósito de fibronectina conduce a una insuficiencia renal en la fase final cuando los riñones del paciente se quedan bloqueados y no filtran más la sangre. La nefropatía se caracteriza por depósitos de fibronectina y fibrosis de los riñones que convierten el órgano en no funcional, y a la larga, incapaz de mantener la
vida.

La PLA_{2} (fosfolipasa A_{2}), una clase de enzimas endógenas que hidrolizan el enlace éster de la posición Sn2 de los glicerofosfolípidos, es una de las muchas proteínas implicadas en las afecciones inflamatorias y fibróticas. Asimismo es responsable de la hidrólisis de los fosfolípidos tensioactivos en los pulmones. La uteroglobina (también conocida como CC10, CC16, CC17, proteína-1 de la orina, P-1, proteína de unión a progesterona, proteína de unión a PCB, proteína secretora de células Clara (CCSP), blastoquinina, proteína de unión a retinol, proteína de unión a fosfolípidos, y alfa2 microglobulina) inhibe la actividad de PLA_{2} in vitro.

La uteroglobina es una proteína homodimérica globular pequeña. Tiene un peso molecular de 15,8 kDa, pero migra en geles electroforéticos a un tamaño correspondiente a 10 kDa. La uteroglobina humana es abundante en el pulmón humano adulto, y comprende hasta aproximadamente un 7% de la proteína soluble total. No obstante, su expresión no está totalmente activada en el feto humano en desarrollo hasta el final de la gestación. Por consiguiente, los fluidos extracelulares del pulmón de los lactantes pre-término contienen bastante menos UG que los de los adultos. La UG también es expresada por el páncreas.

Las PLA_{2} juegan papeles críticos en la respuesta inflamatoria debido a que liberan ácido araquidónico (AA) de los reservorios de fosfolípidos celulares. El AA es metabolizado a numerosos mediadores inflamatorios potentes en un proceso referido como cascada de ácido araquidónico.

Varias afecciones clínicas agudas y crónicas están caracterizadas por una elevada actividad de PLA_{2} en suero o local (véase la Tabla 1, más abajo).

TABLA 1 Afecciones Clínicas Asociadas con la Actividad de PLA_{2}

1

No existen inhibidores de PLA_{2} eficaces disponibles en la actualidad para uso clínico. Hasta la fecha, solamente unos pocos inhibidores de PLA_{2} han progresado en las pruebas clínicas, pero ninguno se ha cualificado para su comercialización en el mercado.

La fibronectina (Fn) es una glicoproteína de 200 kDa que existe en varias formas diferentes y es secretada por diferentes tejidos. La Fn es una proteína esencial y la desorganización dirigida del gen de la Fn en ratones demostró que tiene un papel central en la embriogénesis. La Fn también juega un papel clave en la inflamación, la adherencia celular, la reparación de tejidos y la fibrosis, y se deposita en el lugar de la lesión. La fibronectina del plasma (pFn) es secretada por el hígado y circula en el plasma. En el pulmón, la Fn celular (cFn) es secretada tras la inflamación y la lesión. Ambos tipos de Fn son factores quimiotácticos para las células inflamatorias y los fibroblastos. Un gran número de células inflamatorias y fibroblastos se infiltran en el pulmón durante los episodios inflamatorios, que pueden conducir a la fibrosis pulmonar y por último a la muerte. Se han detectado niveles elevados de Fn en condiciones clínicas en seres humanos tales como RDS neonatal y PBD del pulmón, y nefropatía glomerular del riñón.

Papel de la UG

El análisis de aminoácidos de la UG humana purificada revela que es estructuralmente similar pero no idéntica a otras proteínas "de tipo UG", por ejemplo UG de conejo. Treinta y nueve de los 70 aminoácidos son idénticos entre la UG humana y de conejo (véase la Figura 1). Las proteínas "de tipo UG", incluyendo UG/CC10 humana, CC10 de rata, CC10 de ratón, y UG de conejo, muestran diferencias antigénicas específicas de la especie y específicas del tejido, así como diferencias en su distribución en los tejidos y actividades bioquímicas in vitro. Se han descrito proteínas de tipo UG en muchos contextos diferentes con respecto al tejido y la especie de origen, incluyendo pulmón de rata, orina humana, esputo, componentes de la sangre, útero de conejo, próstata de rata y humana, y pulmón humano. En la actualidad no existen papeles fisiológicos conocidos para estas proteínas.

A pesar de años de estudio, los papeles biológicos de estas proteínas in vivo permanecen poco claros. La ausencia de identidad estructural entre las proteínas de tipo UG hace imposible predecir si una proteína poseerá función terapéutica in vivo en seres humanos basándose en la actividad in vitro u otra actividad mostrada por una proteína estructuralmente relacionada. Por ejemplo, la uteroglobina humana se une a menos del 5% de la cantidad de progesterona que la UG de conejo en el mismo análisis. La UG humana tiene un punto isoeléctrico más bajo (4,6) que la UG de conejo (5,4).

Stripp et al. (1.996) han informado sobre estudios con ratones con el gen de la uteroglobina desactivado generados para eliminar la expresión de la uteroglobina. El ratón tiene células Clara que muestran estructuras intracelulares extrañas en lugar de gránulos de secreción de uteroglobina, pero no existe otro fenotipo. Esta observación es muy significativa debido a que se esperaba una función pulmonar acompañada de inflamación y fibrosis pulmonar. Por otra parte, este ratón con el gen desactivado no mostraba evidencia de anomalías renales, pancreáticas, o reproductivas, indicando que la proteína uteroglobina no tenía un papel significativo en el control de la inflamación o la fibrosis
in vivo.

Objetos de la invención

Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar una composición farmacéutica que incluye una fibronectina que se une a una cantidad eficaz de uteroglobina humana recombinante o un fragmento o derivado de la misma, un tensioactivo pulmonar, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Adicionalmente, la invención describe un método para inhibir enzimas PLA_{2} in vivo en un mamífero que necesita semejante tratamiento, donde el método incluye administrar a un mamífero una cantidad eficaz inhibidora de PLA_{2} de uteroglobina humana nativa o recombinante o un fragmento o derivado de la misma.

Aún más, la presente invención describe un método para tratar o prevenir una afección inflamatoria en un paciente que necesita semejante tratamiento, donde el método incluye administrar una cantidad eficaz como anti-inflamatorio de UG nativa o recombinante o un fragmento o derivado de la misma.

Un objeto de la presente invención es proporcionar el uso, para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir una afección fibrótica en un paciente que necesita semejante tratamiento, de una fibronectina que se une a una cantidad eficaz de UG nativa o recombinante o un fragmento o derivado de la misma.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar el uso, para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir una afección inflamatoria o fibrótica caracterizada por una deficiencia en UG endógena, de una cantidad compensatoria de UG nativa o recombinante o un fragmento o derivado de la misma.

Finalmente, un objeto de la presente invención es proporcionar un análisis que cuantifica los complejos de uteroglobina-fibronectina en una muestra clínica.

Compendio de la invención

Se ha encontrado ahora que la uteroglobina juega un papel fisiológico central en la inhibición de PLA_{2} y en la prevención del depósito de fibronectina y la fibrosis in vivo. Una combinación de experimentos realizados en una nueva cepa de ratones transgénicos con el "gen de la uteroglobina desactivado", y en un modelo de mono de síndrome de fatiga respiratoria neonatal (RDS) que implica inflamación y fibrosis pulmonar demuestran estos efectos. Los ratones con el gen de la uteroglobina desactivado de la presente invención (referidos en adelante como "ratones/ratón UG KO") muestran una nefropatía glomerular y una fibrosis parenquimal renal letales, como enfermedades de comienzo temprano y tardío, respectivamente. La administración de Fn exógena a los ratones normales ocasiona el depósito de Fn en los riñones, pero la administración de cantidades equimolares de Fn y rhUG no.

Se ha demostrado la reducción de la actividad de PLA_{2} in vivo en presencia de rhUG. En un primer experimento, el fenotipo de los ratones UG KO reveló que la actividad de PLA_{2} en suero es significativamente elevada en ausencia de UG, en comparación con la actividad de PLA_{2} en camadas que poseen un gen UG funcional. En un segundo experimento, se demostró que la administración de rhUG a monos pre-término que padecían RDS inhibía la actividad de PLA_{2} en los fluidos extracelulares de los pulmones.

Otros experimentos demostraron que la PLA_{2} in vitro puede degradar el tensioactivo artificial (típicamente Survanta) utilizado en el tratamiento de RDS y que la UG puede inhibir su degradación. Estos experimentos demuestran que la UG media la inhibición de PLA_{2} y el depósito de Fn in vivo siguientes a la administración intratraqueal o intravenosa.

Los experimentos en ratón con el gen de la uteroglobina desactivado demuestran que se puede utilizar la rhUG para tratar afecciones en las cuales se ha encontrado que la uteroglobina es deficiente o la propia proteína porta una mutación de pérdida de función. Se ha descubierto ahora que se puede utilizar la rhUG para tratar o prevenir las afecciones inflamatorias o fibróticas en las cuales la uteroglobina endógena funcional es deficiente en la circulación o en el sitio de la inflamación o la fibrosis. Se han encontrado reducciones de los niveles de rhUG en suero y/o fluidos de lavado bronco-alveloar en ciertas afecciones inflamatorias o fibróticas pulmonares, incluyendo lactantes pre-término con riesgo de desarrollar BPD neonatal. Se ha encontrado que se puede utilizar la UG como suplemento de la uteroglobina endógena deficiente o defectuosa para prevenir o tratar tales afecciones inflamatorias y
fibróticas.

Según un aspecto, la invención describe un método de tratamiento de una afección inflamatoria in vivo que comprende administrar a un paciente que necesita semejante tratamiento una cantidad eficaz como anti-inflamatorio de UG.

Según un aspecto adicional, la invención describe un método de inhibición de las enzimas PLA_{2} solubles in vivo, que comprende administrar a un paciente que necesita semejante tratamiento una cantidad eficaz como inhibidor de PLA_{2} de UG.

La invención proporciona el uso, para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir una afección fibrótica, de una cantidad eficaz en la unión a fibronectina de UG.

Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso, para la fabricación de una composición para tratar o prevenir la fibrilogénesis de una cantidad en la unión a fibronectina de UG.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona el uso, para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir una afección fibrótica caracterizada por una deficiencia de UG funcional endógena, de un tensioactivo pulmonar y una cantidad compensatoria de UG.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de rhUG asociada con un tensioactivo pulmonar y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden adoptar la forma de soluciones inyectables, y líquidos o semi-aerosoles para la administración intratraqueal.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la rhUG y un tensioactivo pulmonar (p. ej., Survanta (un extracto de pulmón bovino de Abbott Labs) y Exosurf (un tensioactivo de pulmón químicamente sintético de Glaxo Wellcome)) asociado con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona un análisis para cuantificar los complejos de uteroglobina-fibronectina en una muestra clínica, donde la muestra clínica que se sospecha que contiene un complejo uteroglobina-fibronectina se pone en contacto con un agente de captura de antígenos, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de conejo monoespecífico, inmovilizado sobre un soporte insoluble; un agente de detección de antígenos, por ejemplo un anticuerpo específico para la fibronectina, se añade a la muestra; y se detecta la presencia de cualquier complejo unido al soporte utilizando, por ejemplo, un anticuerpo secundario, p. ej., anticuerpo anti-IgG conjugado con una enzima tal como peroxidasa de rábano picante utilizando una reacción enzimática normalizada donde el sustrato enzimático se convierte en un compuesto cromogénico o fluorogénico que se cuantifica utilizando un aparato espectrofotométrico o fluorométrico normalizado.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describirá a continuación con más detalle, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra un alineamiento de las proteínas de tipo UG;

La Figura 2 muestra el constructo de redireccionamiento pretendido del ratón con el gen UG desactivado transgénico; los sitios de restricción son B - BamIII, E = EcoRI, H = HindIII;

Las Figuras 2B-2D muestran la verificación de los constructos genéticos en la progenie de los embriones transgénicos mediante análisis de PCR y transferencia Southern; (B) análisis de transferencia Southern de los clones de las células ES R1 dirigidos, donde Wt = tipo salvaje; (C) análisis de PCR representativos del ADN genómico de biopsias de la cola de los vástagos; los genotipos y sus correspondientes productos de la PCR son los siguientes: UG^{+/+}, 304 pb; UG^{+/-}, 304 y 667 pb; UG^{-/-}, 667 pb; (D) transferencia Southern de ADN genómico de cola de ratón; la Figura 2E muestra la confirmación de la ausencia de ARNm de UG en tejidos de pulmón de ratones UG^{-/-} mediante análisis de RT-PCR; los análisis de RT-PCR del ARN total extraído de los tejidos de pulmón de camadas con genotipos UG^{+/+}, UG^{+/-}, y UG^{-/-}; era detectable un producto de la RT-PCR de 273 pb en los pulmones de UG^{+/+} y UG^{+/-} pero ausente de los de los ratones UG^{-/-}; La Figura 2F muestra la confirmación de la ausencia de proteína UG en los pulmones de ratones UG^{-/-} mediante análisis Western; las proteínas (30 microgramos cada una) de producto lisado de pulmón fueron resueltas mediante electroforesis utilizando un gradiente 4-20% de SDS-Page en condiciones no reductoras y sometidas a inmunotransferencia utilizando UG anti-ratón de conejo; la Figura 2G muestra la confirmación de la ausencia de UG en secciones de tejido de pulmón de los ratones UG^{-/-} utilizando métodos inmunohistoquímicos en células epiteliales bronquiolares; la tinción oscura sobre las células epiteliales bronquiolares de ratón UG^{+/+} (panel superior) indica inmunorreactividad con UG; obsérvese la ausencia de inmunorreactividad en pulmones de ratón UG^{-/-} (panel inferior).

Las Figuras 3A-3J comparan los análisis histopatológicos de secciones de riñón de ratones normales versus UG^{-/-}, que muestran fibrosis parenquimal anormal y depósito de Fn glomerular en los ratones con el gen desactivado solamente; H & E tinción de secciones de riñón de camadas UG^{+/+} (A) y su camada UG^{-/-} (B); (C) secciones de riñón de un ratón de 10 meses de edad con fibrosis parenquimal grave; (D) una región del mismo riñón de ratón en (C) que muestra hiperplasia tubular renal (aumento 40X, g = glomérulo; f = fibrosis; t = túbulo); (E) microscopía electrónica de transmisión del depósito glomerular de un ratón UG^{-/-} con enfermedad renal grave (aumento 6000X); (F) el recuadro de (E) está aumentado 60.000X, lo que muestra las estructuras fibrilares estriadas largas indicativas de colágeno (col) y las difusas cortas que coinciden con las fibrillas de Fn; (G) inmunofluorescencia de Fn de una sección de riñón de un ratón UG^{+/+} utilizando anticuerpo para Fn de múrido; (H) inmunofluorescencia de Fn de una sección de riñón de un ratón UG^{-/-} con enfermedad renal grave; tinción con tricrómico de Mason de secciones de riñón con ratones UG^{+/+} (I) y UG^{-/-} (J); la tinción azulada sobre los glomérulos de secciones de riñón de ratón UG^{-/-} es colágeno (aumento aproximadamente 40X).

La Figura 4A muestra la presencia de agregados de Fn solamente en los riñones de los ratones UG^{-/-}; inmunoprecipitación y transferencia western de Fn de plasma, riñón, e hígado de ratones UG^{+/+} y UG^{-/-}; se detectaba una banda de Fn multimérica (flecha en negrita) solamente en los productos lisados de riñón de ratones UG^{-/-}.

Las Figuras 4B y 4C muestran la formación de complejos UG-Fn in vitro; (B) se incubaron concentraciones equimolares de UG y Fn, se inmunoprecipitaron y se detectaron mediante transferencia Western con anticuerpo para Fn o UG; los productos inmunoprecipitados contienen tanto Fn (calle 2, panel superior) como UG (calle 2, panel inferior); las calles 1 de ambos paneles representan patrones de Fn y UG; (C) se incubaron concentraciones equimolares de UG-I^{125} y Fn a 4ºC durante 1 hora y el complejo resultante se resolvió mediante electroforesis sobre geles de poliacrilamida no desnaturalizantes al 6%; calle 1, heterómero Fn-UG teñido con azul de coomassie; calle 2, su autorradiograma.

La Figura 4D muestra la presencia de complejos UG-Fn en el plasma de ratones normales pero no UG^{-/-}; inmunoprecipitación de plasma de ratones UG^{+/+} y UG^{-/-} con anticuerpo para Fn y transferencia western con anticuerpos para Fn y UG; Fn (panel superior); UG (panel inferior); std = patrones para UG y Fn.

La Figura 4E muestra la inhibición dependiente de la dosis de la autoagregación de Fn por UG in vitro; el entrecruzamiento por afinidad de Fn-I^{125} con Fn no marcada en ausencia (calle 2) y presencia de cantidades variables de UG (calles 3-5); la intensidad de la banda de Fn radiactiva, de peso molecular muy elevado (calle 2) formada en ausencia de UG se reduce de una manera dependiente de la dosis; calle 1, Fn-I^{125} con Fn no marcada en ausencia de UG y DSS; flecha abierta - Fn multimérica; flecha fina inferior = Fn de 220 kDa.

La Figura 4F muestra la inhibición de la formación del complejo Fn-colágeno por UG; entrecruzamiento de afinidad de colágeno I-I^{125} con Fn no marcada en ausencia (calle 3) y presencia (calle 4) de UG; calle 1, colágeno I teñido con azul de coomassie; cadena alfa_{1}-alfa_{1} de colágeno I y cadena alfa_{2}-alfa_{2} de colágeno I; calle 2, colágeno I-I^{125} y Fn no marcada en ausencia de UG y DSS.

Las Figuras 5A-5F muestran el análisis inmunohistoquímico del depósito de Fn en los riñones de ratones normales y UG^{-/-} solamente en ausencia de UG; (A) sección de riñón de un ratón de tipo salvaje que recibió una mezcla de concentraciones equimolares de Fn y UG intravenosamente; (B) ratón UG^{+/+} que recibió la misma dosis de Fn que en (A) pero sin UG; (C) ratón UG^{-/-}, aparentemente sano que recibe una mezcla de Fn y UG; (D) ratón UG^{-/-} que recibe Fn sola (la misma dosis que en (C)), pero sin UG; (E) fibrilogénesis de Fn por células cultivadas desarrolladas en medio con un suplemento de hFn soluble sola; (F) un cultivo celular idéntico al de (E) que se alimentó con medio que contenía una mezcla de concentraciones equimolares de hFn soluble y UG (aumento 40X, g = glomérulo).

Las Figuras 6A-6B muestran el formato para un análisis de diagnóstico para detectar complejos UG-Fn en muestras clínicas.

La Figura 7 muestra el paso del dímero de UG a través de una membrana de diálisis MWCO de 8,0 kDa pero no de una membrana de diálisis MWCO de 3,5 kDa.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas rhUG

La rhUG de la invención tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la de la proteína UG humana nativa. Una secuencia de aminoácidos que tiene "sustancialmente la misma" secuencia de aminoácidos que la de la proteína humana nativa incluye una rhUG que tiene una identidad de al menos 75% con la proteína humana nativa. En una realización preferida, la rhUG tienen una identidad de al menos 85%, y en una realización muy preferida, la rhUG tiene una identidad de al menos 98% con la UG nativa.

También está incluido en la presente invención el uso de fragmentos o derivados de UG. Un "fragmento" de UG hace referencia a una porción de la secuencia de aminoácidos de hUG nativa que tiene seis o más aminoácidos contiguos de la secuencia de la proteína nativa. El término "derivado" hace referencia a los análogos peptídicos de UG, que incluyen una o más sustituciones de aminoácidos y/o la adición de uno o más radicales químicos; p. ej., agentes acilantes o agentes sulfonantes, con la condición de que el derivado conserva la actividad biológica de la molécula parental.

Adicionalmente, la UG utilizada en la presente invención es sustancialmente pura. El término "sustancialmente pura" hace referencia a una UG que tiene una pureza de aproximadamente 75% a aproximadamente 100%. En una realización preferida, UG tiene una pureza de aproximadamente 90% a aproximadamente 100%, y en la realización más preferida, UG tiene una pureza de al menos 95%.

Usos clínicos de UG

La invención proporciona, en otro aspecto, el tratamiento o la prevención de una afección inflamatoria o fibrótica en un mamífero, que puede ser un animal o ser humano, con una cantidad eficaz de UG.

La siguiente lista no limitante de afecciones son ejemplos representativos de aquellas asociadas con deficiencias de UG, actividad de PLA_{2} excesiva, y deposito de fibronectina.

TABLA 2 Usos Clínicos de la Uteroglobina Recombinante (agrupados por Propiedades de UG)

2

Las relaciones típicas entre la deficiencia de UG, la actividad de PLA_{2} y la agregación y el depósito de fibronectina en las afecciones inflamatorias/fibróticas humanas se resumen más abajo.

Displasia Bronco-Pulmonar Neonatal (BPD Neonatal)

La BPD neonatal está caracterizada por inflamación grave y fibrosis irreversible del tejido pulmonar en niños recién nacidos, normalmente como resultado del síndrome de fatiga respiratoria (RDS). No obstante, esta afección también puede estar causada por el síndrome de aspiración de meconio o infección.

Una deficiencia de hUG ha sido implicada en esta afección debido a que la síntesis de hUG pulmonar puede ser regulada simultáneamente con tensioactivo, que comienza tarde en la gestación. De este modo, los neonatos gravemente prematuros pueden carecer de UG así como de tensioactivo. La deficiencia de hUG puede ocasionar un incremento de la actividad de PLA_{2} y la fibrosis relacionada con Fn, que están asociados con la inflamación y la fibrosis observadas en BPD neonatal. Algunos niños no responden al tensioactivo sintético, lo que puede estar debido al exceso de actividad de PLA_{2}. De este modo, se puede utilizar UG para tratar la BPD neonatal.

La ruta de administración preferida es la instilación directa por vía endotraqueal o las rutas sistémicas.

Fallo Multiorgánico (MOF)

La actividad excesiva de PLA_{2} ha sido implicada en el MOF debido a sepsis bacteriana o trauma. Esta afección se caracteriza por una respuesta inflamatoria sistémica, que implica una lesión del tejido rápida, masiva y la pérdida de función orgánica en los pulmones, el riñón, el páncreas, los intestinos, y la vasculatura. La evidencia reciente apunta al desencadenante de MOF como la elevada actividad de la fosfolipasa A_{2} soluble sistémica, su lisis directa de las membranas celulares de los tejidos, y la hidrólisis de los fosfolípidos esenciales, tales como los tensioactivos pulmonares. Los intentos para inhibir la PLA_{2} directamente en marcos clínicos no han tenido éxito.

En el MOF, la cantidad de UG endógena es insuficiente para la superactivación de PLA_{2}. La UG suministrada exógenamente se puede utilizar para combatir el MOF.

El fallo de órganos remotos (ROF) implica la lesión de órganos distintos del órgano afectado principalmente por el trauma o la infección. A menudo el fallo de órganos remotos implica más de un órgano remoto, dando como resultado el fallo multiorgánico. Por ejemplo, la pancreatitis es una inflamación del páncreas en respuesta a la ingesta de alcohol, a una infección, o a un trauma, que puede dar como resultado un síndrome de fatiga respiratoria en adultos (ARDS), una insuficiencia renal aguda (ARF), y un choque generalizado. Un episodio de enfermedad inflamatoria del intestino o peritonitis puede dar como resultado ROF/MOF. El ROF/MOF está asociado con elevados niveles de PLA_{2} activada, circulante. La aplicación generalizada de hUG podría prevenir el ROF/MOF. La inyección inmediata de UG en pacientes con ROF/MOF, podría reducir la gravedad o eliminar el fallo de órganos y el choque mediados por PLA_{2}.

Pancreatitis

Todas las formas de pancreatitis implican una actividad elevada de PLA_{2} soluble de Tipo I, tanto sistémica como local. La pancreatitis a menudo da como resultado una insuficiencia pulmonar o ARDS, caracterizada por una elevada actividad de PLA_{2} soluble en los pulmones. Por lo tanto, como inhibidor de las PLA_{2} de Tipo I solubles in vivo, la UG es un excelente candidato para el tratamiento de las dos formas de pancreatitis aguda, y es una medida preventiva de la insuficiencia pulmonar en todas las formas agudas de la pancreatitis.

La ruta de administración preferida es por ruta intravenosa.

Enfermedad Inflamatoria del Intestino

La enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), incluyendo la colitis ulcerativa, la diverticulitis, y la enfermedad de Crohn, se caracteriza por una producción local y una actividad de la PLA_{2} soluble de Tipo II elevadas. La actividad de la PLA_{2} soluble circulante también puede ser elevada en IBD. La IBD ocasiona insuficiencia pulmonar o ARDS en casos graves, como resultado de una actividad de PLA_{2} elevada (que es similar a la pancreatitis).

La base lógica de la aplicación de UG exógena en IBD es idéntica a la de la pancreatitis: regular a la baja la respuesta inflamatoria inhibiendo la PLA_{2}, la agregación y/o el depósito de Fn y evitar la implicación de órganos remotos (pulmones y riñones).

La ruta de administración preferida es la ruta intravenosa en pacientes hospitalizados.

Pneumonía Bacteriana

Se demostró que los fluidos BAL de pacientes que han sobrevivido a pneumonía bacteriana tienen niveles 2-3X superiores de UG que aquellos que han fallecido. La infección bacteriana de los pulmones puede sobreactivar la PLA_{2} soluble endógena. La UG se puede administrar para inhibir o controlar este efecto.

La ruta de administración preferida es la ruta intra-traqueal si el paciente está intubado o intravenosa si no.

Complicaciones de la Diálisis

La principal complicación de la diálisis es la trombosis, esto es, coágulos de sangre formados espontáneamente. Estos a menudo taponan el puerto de acceso vascular, deteriorando el tratamiento, así como causando episodios isquémicos, amenazadores para la vida a veces, en el paciente. Un segundo problema con los pacientes de hemodiálisis es la inflamación y/o fibrosis de la vena proximal que devuelve la sangre dializada a la circulación principal del paciente. La fibrosis de la vena proximal se detecta generalmente como un incremento en la resistencia, o presión, frente al retorno de la sangre dializada. Un tercer problema es la fibrosis y el cierre del sitio de acceso vascular, o fístula. Un cuarto problema es la aterosclerosis acelerada y un quinto es la pérdida de función renal residual, muy probablemente debido a depósito de Fn.

La posibilidad de que la UG endógena sea dializada durante el procedimiento proporciona una explicación para estos problemas. La separación selectiva de la UG endógena deja libre la Fn para agregarse, formando los focos para la formación de coágulos de sangre o el depósito sobre los glóbulos rojos, cebándolos para una respuesta de coagulación pegándolos entre sí o al lúmen vascular. Las transglutaminasas (TG) son enzimas responsables de la construcción de redes macromoleculares encontradas en las membranas del basamento, la piel y los coágulos de sangre. En ausencia de UG libre que compite como sustrato por las TG activadas, la Fn y otros componentes de los coágulos de sangre se entrecruzan.

La inflamación y la fibrosis tanto de la vena proximal como del sitio de acceso vascular, así como la aterosclerosis acelerada, se pueden explicar por el depósito de Fn en el lúmen vascular. El depósito de fibronectina sobre el endotelio vascular promueve la adherencia de las plaquetas y los glóbulos blancos, ambos los cuales se pueden agravar en ausencia de inhibición de PLA_{2}. Los depósitos vasculares de Fn también pueden promover los depósitos locales de grasa, colesterol y proteínas encontrados en la placa aterosclerótica. Se sabe que la fibroconexión es un componente principal de la placa aterosclerótica, así como de los depósitos glomerulares renales asociados con la nefropatía y la pérdida de la función renal primaria y residual. Por lo tanto, la administración de UG puede reducir o eliminar estos problemas reduciendo la inflamación y el depósito de fibronectina.

La ruta de administración preferida de UG sería la infusión intravenosa antes, durante o después de la diálisis.

Alternativamente, la pérdida de UG endógena se puede evitar por medio de la adición de UG al tampón de diálisis o recubriendo previamente la membrana de diálisis con UG o ambos.

Trasplante de Órganos

El término "órgano" hace referencia, por ejemplo, a órganos sólidos, tales como riñón, hígado, y corazón, así como médula ósea, córnea y piel.

Existen dos tipos de rechazo de trasplante de órganos; agudo y crónico. El rechazo agudo es un proceso inflamatorio que implica la actividad de PLA_{2} y la infiltración por las células inflamatorias que a menudo destruyen el injerto.

El rechazo crónico implica la fibrosis mediada por Fn del injerto, incluyendo aterosclerosis confinada al injerto. De este modo, se puede utilizar la administración de UG para tratar o prevenir el rechazo de los injertos tanto agudo como crónico.

La ruta de administración preferida es mediante inyección.

Otro aspecto del trasplante de órganos es la isquemia del órgano antes de la retirada del donante, durante el transporte y en el receptor, que contribuye al rechazo agudo. Se sabe que la isquemia produce una actividad de PLA_{2} elevada y la necrosis del tejido. Por tanto, se podría utilizar UG para evitar semejante isquemia. La forma preferida de UG es un líquido de perfusión o un tampón de almacenamiento en el que se conserva el órgano ex vivo.

Prevención de la Diabetes de Tipo I

La diabetes de Tipo 1 surge de la destrucción del tejido pancreático por una respuesta autoinmunitaria. El páncreas secreta normalmente PLA_{2} soluble y hUG a la circulación. Se ha informado sobre lesiones necróticas en el páncreas de ratón con el gen de la uteroglobina desactivado (KO) de la presente invención (referido en adelante como "ratón KO UG").

En ausencia de uteroglobina, el ratón KO UG muestra una destrucción del tejido pancreático similar que podría desencadenar una respuesta autoinmunitaria. De este modo se puede utilizar la UG para prevenir o detener el lento progreso de la diabetes de Tipo I. La ruta de administración preferida es mediante inyección.

Prevención y Tratamiento de la Nefropatía

Los depósitos de Fn y la fibrosis renales en el ratón KO UG son similares a los depósitos de Fn y la fibrosis en las nefropatías humanas. De este modo, la administración de UG podría evitar o ralentizar el progreso de la nefropatía en pacientes con riesgo, tales como la diabetes de Tipo II.

Prevención y Tratamiento de la Inflamación Ocular

La inflamación ocular, incluyendo la uveítis, la retinitis, y la inflamación siguiente a la cirugía, se caracteriza por un aumento de la actividad de PLA_{2}. Por lo tanto, se puede administrar la UG tópicamente, intraocularmente, o sistémicamente para reducir la inflamación ocular.

Arteriosclerosis

La arteriosclerosis es un engrosamiento fibrótico de los vasos sanguíneos por todo el organismo. Se inicia y/o está mediado por el depósito de Fn sobre las paredes de la vasculatura. La aterosclerosis es una forma de arteriosclerosis que implica depósito de colesterol, además de depósito de Fn. Por lo tanto, se puede administrar UG para prevenir o reducir la arteriosclerosis.

Insuficiencia Renal Aguda

La insuficiencia renal aguda (ARF) es típicamente una consecuencia de la inflamación, la infección o el trauma directo de un órgano remoto, que da como resultado la liberación y activación de PLA_{2} soluble a la circulación. La lesión de los riñones durante la ARF puede ser bastante grave, con lesión tisular aguda promovida por la inflamación y se puede resolver en fibrosis en el riñón, que conduce a una reducción de la función del riñón a largo plazo. Las propiedades anti-inflamatorias y anti-fibróticas de la UG son particularmente relevantes en el riñón como se muestra por medio del ratón KO UG.

La ruta de administración preferida es mediante inyección o administración sistémica.

Sobre todo, la siguiente lista no limitante de afecciones incluye aquellas asociadas a la inhibición de PLA_{2} y/o el depósito de fibronectina, cada una de las cuales son candidatos para el tratamiento o la prevención por medio de la presente invención:

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Articulación/Hueso:

artritis reumatoide;

Autoinmunitarias:

artritis reumatoide, esclerosis múltiples, diabetes de Tipo I, uveitis, psoriasis, lupus eritematoso generalizado (SLE), y enfermedad de Crohn;

Páncreas:

pancreatitis;

Peritoneo:

peritonitis, apendicitis;

Vascular/sistémico:

choque séptico; enfermedad vascular por colágeno, arteriosclerosis, aterosclerosis, choque anafiláctico, esquistosomiasis, y choque inducido por trauma;

Renal:

insuficiencia renal aguda, infección bacteriana de los riñones, inflamación debida a tumores renales, prevención de la fibrosis resultante de la quimioterapia o terapia con anticuerpos, prevención de la nefropatía diabética, prevención y/o tratamiento de la nefropatía idiopática;

Hígado:

hepatitis, hepatitis viral, y cirrosis;

Vejiga:

cistitis, inflamación de la uretra, inflamación del uréter, e inflamación de la vejiga tal como cistitis intersticial;

Reproductor/femenino:

vaginitis, cérvix inflamado, enfermedad inflamatoria pélvica, inflamación del ovario (salpingitis), endometriosis, candidiasis vaginal, e inflamación o fibrosis de las trompas de Falopio;

Reproductor/masculino:

inflamación del pene, inflamación de la próstata, inflamación de los túbulos y vesículas seminales, inflamación testicular, e inflamación del vaso deferente, epidídimos y glándula prostática

Ocular:

uveitis, retinitis, trauma, lesión con quemadura por producto químico o humo, inflamación ocular debida a retinitis por CMV, conjuntivitis (infección bacteriana), infección viral, inflamación ocular debida a agente infeccioso, inflamación ocular siguiente a cirugía ocular; incluyendo la eliminación de cataratas, cirugía por láser, trasplante de córnea, eliminación de tumores, inflamación ocular debida a retinoblastoma (tumor), inflamación ocular debida a exposición a radiación, inflamación debida a respuesta alérgica;

Corazón:

Endocarditis

Pulmones:

asma bronquial, ARDS, pneumonía, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis pulmonar resultante de quimioterapia (bleomicina, metotrexato), fibrosis pulmonar resultante de la exposición a productos químicos medioambientales (amianto, líquidos de limpieza, contaminantes, p. ej., dioxina y PCB del escape de los automóviles), inhalación de humo, inflamación pulmonar durante la recuperación del ahogo, y RDS neonatal;

Intestino:

enfermedad inflamatoria del intestino, colitis, enfermedad de Crohn, diverticulitis, enterocolitis necrotizante neonatal, inflamación debida a un agente infeccioso, rotavirus, virus de la polio, VIH, úlceras de estómago, enfermedad de reflujo gastro-esofágico, y tonsilitis;

Hemorroides; Trasplantes:

administración siguiente a la cirugía de trasplante de cualquier órgano o tejido para controlar la inflamación o fibrosis y los rechazos;

Oídos:

Otitis media; y

Piel:

psoriasis, urticaria, alergia y dermatitis, esclerodermia, dermatitis de contacto, dermatitis química (debido a hiedra venenosa, roble venenoso, y exposición a productos químicos como PCB, cloro, amoniaco, (agentes de limpieza, agentes tóxicos).

Por otra parte, se puede administrar UG sola o combinada con otros agentes activos o composiciones utilizados típicamente en el tratamiento o la prevención de los estados de enfermedad identificados antes. Tales agentes activos o composiciones incluyen, pero no están limitados a, anti-inflamatorios no esteroideos (AINE), agentes quimioterapéuticos, analgésicos, agentes inmunoterapéuticos, agentes antivirales, agentes antifúngicos, vacunas, inmunosupresores, factores de crecimiento hematopoyético, hormonas, citocinas, anticuerpos, anti-trombóticos, fármacos cardiovasculares, o fármacos de fertilidad. También están incluidos fármacos de tolerancia, vitaminas y minerales.

Por otra parte, se puede administrar UG como portador para la supresión de la inflamación en el sitio de la inyección o administración de otro agente terapéutico o profiláctico para suprimir la inflamación o la respuesta inmunitaria causada por tal agente. Con respecto a esto, la UG permitiría la administración de una cantidad eficaz del agente activo para la indicación diana.

La UG también se puede administrar como una composición cosmética para su uso en la limitación de la fibrosis, la formación de cicatrices o queloides a partir de la curación de heridas, o durante una respuesta inflamatoria dérmica.

La presente invención hace referencia al uso de UG en la prevención o tratamiento de las afecciones asociadas con la fibronectina. Con respecto a la prevención de un estado de enfermedad, "prevención" hace referencia a la prevención del desarrollo de la enfermedad en una población susceptible o potencialmente susceptible, o a la limitación de su gravedad o progreso, mientras el término "tratamiento" hace referencia al alivio de una enfermedad o estado patológico.

La UG se puede administrar intravenosamente o, en el caso del tratamiento de RDS/BPD neonatal y RDS en adultos, en forma de un líquido o semi-aerosol vía tubo intratraqueal. Otras rutas de administración viables incluyen tópica, ocular, dérmica, transdérmica, anal, sistémica, intramuscular, de liberación lenta, oral, vaginal, intraduodenal, intraperitoneal, e intracolónica. Tales composiciones se pueden administrar a un sujeto o paciente que necesita semejante administración en dosificaciones y mediante técnicas bien conocidas por los expertos en las técnicas médica, nutricional o veterinaria tomando en consideración factores tales como la edad, el sexo, el peso, y el estado del sujeto o paciente concreto, y la ruta de administración. Las composiciones de la presente invención también se pueden administrar en una formulación de liberación controlada. Las composiciones se pueden administrar simultáneamente o administrar sucesivamente con otros agentes activos, de nuevo, tomando en consideración factores tales como la edad, el sexo, el peso, y el estado del sujeto o paciente concreto, y, la ruta de administración.

Los ejemplos de las composiciones de la invención incluyen composiciones comestibles para la administración oral tales como formulaciones sólidas o líquidas, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, píldoras, y preparaciones líquidas similares para los orificios, p. ej., oral, nasal, anal, vaginal etc., formulaciones tales como suspensiones, jarabes o elixires; y, preparaciones para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (p. ej., administración inyectable), tales como suspensiones o emulsiones estériles. No obstante, el ingrediente activo de las composiciones puede formar complejos con proteínas de manera que cuando se administra a la corriente sanguínea, puede producir coagulación debido a la precipitación de las proteínas de la sangre; y, los artesanos expertos deben tener esto en cuenta.

En tales composiciones la UG puede estar mezclada con un portador, diluyente, o excipiente adecuado tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, DMSO, etanol, o similar. La UG se puede proporcionar en forma liofilizada para su reconstitución, por ejemplo, en solución acuosa, salina, glucosa isotónica, o tampón de DMSO. En algunas soluciones salinas, se ha observado cierta precipitación de rhUG; y esta observación se puede emplear como medio para aislar los compuestos de la invención, p. ej., mediante un procedimiento de "precipitación por adición de sal".

Adicionalmente, la invención también comprende un kit donde se proporciona la UG. El kit puede incluir un recipiente separado que contiene un portador, diluyente o excipiente adecuado. El kit puede incluir un agente adicional que reduce o alivia los males de la enfermedad de las afecciones identificadas antes para la administración simultánea o sucesiva. Se pueden proporcionar uno o varios agentes adicionales en recipientes separados o mezclados con UG. Adicionalmente, el kit puede incluir instrucciones para mezclar o combinar ingredientes y/o para su administración.

La invención también contempla el tratamiento o la prevención de una afección fibrótica caracterizada por una deficiencia de UG funcional endógena, que comprende administrar a un paciente que necesita semejante tratamiento una cantidad compensatoria de UG. El término "cantidad compensatoria" representa una cantidad de UG requerida para llevar la concentración pulmonar local o generalizada de UG total (UG funcional endógena y UG exógena) a su intervalo normal. Más específicamente, el intervalo normal para la concentración pulmonar local de UG endógena es de aproximadamente >50 microgramos de UG/miligramo de albúmina o >50 microgramos/litro. El intervalo normal para la concentración de UG en suero es >15 microgramos/litro.

Las composiciones de la invención comprenden hUG nativa y/o recombinante en una cantidad eficaz para alcanzar el propósito pretendido, esto es un incremento de los niveles de UG en plasma o tejido para producir el efecto deseado de inhibición selectiva de PLA_{2} y una reducción de la inflamación y/o unión de fibronectina para mitigar su agregación y/o depósito en condiciones fibróticas. Las composiciones comprenden una cantidad eficaz de UG humana nativa y/o recombinante sustancialmente pura, asociada con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional, las composiciones de la invención comprenden una cantidad eficaz de hUG nativa y/o recombinante y tensioactivo pulmonar, asociada con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. La administración intratraqueal local de UG a los pulmones, suficiente para la inhibición de la actividad de PLA_{2} y/o el depósito de fibronectina, requiere cantidades de UG sustancialmente pura en el intervalo de 0,2 \mug/kg a 500 mg/kg de proteína en una única o en múltiples dosis. La UG se administra normalmente en una cantidad de un único bolo de 20 ng/kg a 500 mg/kg, en una sola o en múltiples dosis, o en forma de una infusión continua de hasta 10 gramos.

La hUG nativa y/o recombinante también se puede administrar junto con tensioactivo pulmonar artificial, tal como Survanta, por ruta intratraqueal. La UG y Survanta (5 ml/kg) se administran simultáneamente y la UG no se une al tensioactivo, evitando que funcione terapéuticamente. El tensioactivo pulmonar está generalmente presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 10-90% en peso, más normalmente aproximadamente 20-80% en peso. El tensioactivo, en virtud de su tensión superficial muy baja se disemina sobre la superficie interna de los pulmones, llevando con él la UG. La administración generalizada de UG mediante inyección intravenosa, suficiente para la inhibición de la actividad de PLA_{2} y/o el depósito de fibronectina, requiere cantidades de UG nativa y/o recombinante sustancialmente pura en el intervalo de 0,5 \mug para una infusión continua de varios gramos de proteína a lo largo de un período de tiempo prolongado (días).

Las formulaciones adecuadas para la inyección y la liberación intratraqueal en semi-aerosol incluyen soluciones acuosas de hUG nativa y/o recombinante opcionalmente con modificadores de la viscosidad y estabilizadores.

El término "cantidad eficaz inhibidora de PLA_{2}" según se utiliza en la presente memoria representa una cantidad de UG que inhibe la actividad de PLA_{2} y que reduce o alivia la inflamación en el tejido u organismo del paciente. El término "cantidad eficaz de unión a fibronectina" representa la cantidad de UG que se une a la fibronectina para reducir la agregación y/o depósito de la misma, y evita o reduce la fibrilogénesis o la fibrosis. El término "cantidad anti-inflamatoria" según se utiliza en la presente memoria representa la cantidad que reduce o alivia la inflamación en el tejido u organismo. Típicamente, la cantidad de UG administrada a adultos para el tratamiento de afecciones inflamatorias y fibróticas será de bolos de 0,2 \mug/kg a 500 mg/kg o hasta varios gramos administrados a lo largo de un período de tiempo prolongado. Para los neonatos, en el tratamiento de la RDS neonatal, el intervalo será típicamente de 50 nanogramos/kg a 100 mg/kg en un único bolo o hasta 10 gramos administrados continuamente a lo largo de un período de tiempo prolongado. Las velocidades de infusión continua eficaces y seguras están entre 50 ng/kg/hora a 500 mg/kg/hora.

Ejemplos

La invención se describirá ahora adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Las partes y porcentajes son en peso a menos que se establezca de otro modo.

Ejemplo 1 Experimentos In Vivo

Se obtuvo UG humana recombinante mediante el método de Mantile et al. (1.993).

Un macho y una hembra de la especie P. cyanocephalus, que pesaban aproximadamente 400 gramos cada uno fueron liberados por la Sección C a los 142 días de gestación. Este es un modelo establecido de RDS (Coalson, J.J., et al. Baboon Model of BPD. II: Pathologic features. Exp. Mol. Pathol. 37:355-350 (1.982)).

Tras la liberación, las crías fueron anestesiadas con cetamina (10 mg/kg) e intubadas con tubo endotraqueal de 2,5 mm de diámetro. Se controlaron los gases y la presión de la sangre por medio de un conducto arterial situado mediante inyección percutánea en la arteria radial. Se colocó un conducto venoso profundo percutáneamente en la vena safena a través del cual se administraron fluidos, antibióticos, y fármacos. Los animales se mantuvieron sobre calentadores de infrarrojos servo-controlados y se ventilaron con un ventilador normalizado regulado por presión, con ciclos de tiempo con humidificadores mantenidos a 36-37ºC. Los ajustes iniciales fueron FiO_{2} 1,0, velocidad 40/minuto, razón I/E 1:1,5, presión positiva al final de la expiración (PHEP) a 4 cm H_{2}O, y presión inspiratoria de pico (PIP) según se requería para una exploración del pecho adecuada. La FiO_{2} se mantuvo a 1,0 y la PIP se reguló para mantener PaCO_{2} a 0,052\pm0,0013 atm. Los gases en sangre, el hematocrito, los electrolitos, el tiempo de protrombina, el tiempo de tromboplastina parcial y Dextrostix se controlaron cada hora. La sangre retirada para los estudios se remplazó volumétricamente por sangre de babuino adulto. Los fluidos intravenosos se administraron con electrolitos a 10 cc/kg/hora y se incrementaron según fue necesario cuando el ritmo cardíaco sobrepasó 180 latidos/minuto. Se administró bicarbonato sódico (2 meq/kg) cuando el déficit de la base sobrepasó -10. Se administraron Ampicilina (50 mg/kg/día en dos dosis divididas) y Gentamicina 5 mg/kg/día en dos dosis divididas) continuamente a lo largo de la duración del experimento.

Un animal recibió tensioactivo más PBS (tratamiento núm. 1), y el segundo animal (tratamiento núm. 2) recibió tensioactivo más dos dosis de 1 mg/kg de rhUG. Tanto el tensioactivo como la rhUG se administraron directamente a los pulmones a través del tubo endotraqueal. El tensioactivo utilizado fue Survanta (Ross Labs), una preparación de tensioactivo derivada de tejido pulmonar bovino, que contenía apoproteínas B y C tensioactivas además de fosfolípidos. La primera dosis de rhUG se administró con el tensioactivo y la segunda se administró cuatro horas después de la primera. Se controlaron los gases de la sangre arterial, los electrolitos y el EKG de los animales. Se sacrificaron 50 horas después del inicio de la terapia con tensioactivo. Los pulmones se lavaron a las 24 y 48 horas con PBS que contenía inhibidores de proteasa (PMSF, 10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de pepstatina y bacitracina). Se congelaron a -80ºC hasta que se analizó la actividad PLA_{2}. Las proteínas totales se determinaron mediante el método de Bradford (BioRad). La actividad PLA_{2} de los lavados pulmonares se midió según Levin et al. (1.986; supra) y se presenta en la siguiente Tabla.

TABLA 3 Resultados del Ensayo In Vivo de UG

3

Los datos dados antes son la media de dos determinaciones. Los resultados muestran que la administración endotraqueal de rhUG inhibe la PLA_{2} in vivo. Los animales que recibieron tensioactivo y rhUG tuvieron una actividad PLA_{2} apreciablemente inferior en su fluido de lavado pulmonar en comparación con los animales que recibieron tensioactivo sin rhUG. Los datos confirman que la administración de rhUG junto con el tensioactivo es beneficiosa al proteger los fosfolípidos tensioactivos.

Ejemplo 2 Inhibición de la Hidrólisis de Tensioactivo Artificial por PLA_{2} Soluble in vitro

La rhUG inhibe la hidrólisis del tensioactivo artificial por la PLA_{2} soluble in vitro. Survanta es un tensioactivo artificial derivado de pulmón bovino y se utiliza para tratar neonatos con RDS y adultos con RDS (ARDS). La hidrólisis de Survanta por una PLA_{2} soluble del Grupo I, esto es, PLA_{2} porcina, pancreática (Boehringer Mannheim) se caracteriza por su capacidad para competir como sustrato con un sustrato de fosfatidilcolina fluorescente (Cayman Chemicals), generando ácido araquidónico como producto.

Survanta es un sustrato para la degradación in vitro por las PLA_{2} solubles del Grupo I. Survanta es rápidamente degradado in vitro por las PLA_{2} encontradas en los fluidos extracelulares de un pulmón humano. La rhUG inhibe la degradación de Survanta in vitro.

Ejemplo 3 Construcción de ratón con el gen UG desactivado

Se creó un ratón KO UG transgénico con el fin de determinar el papel de la uteroglobina en la fisiología de los mamíferos, así como para generar un modelo para la UG como agente terapéutico en numerosas afecciones clínicas inflamatorias. La primera etapa consistió en construir un vector de ADN apropiado con el cual dirigir e interrumpir el gen de la uteroglobina de ratón endógena. El fragmento de ADN BamHI-EcoRI de 3,2 kb que contenía el exón 3 y las secuencias contiguas del gen de la uteroglobina de la cepa de ratón 129/SVJ (Ray, 1.993) fueron subclonados en los sitios correspondientes del vector pPNW como describen Lei et al. (1.996). Se amplificó mediante PCR un fragmento de 0,9 kb que contenía parte del exón 2 y su secuencia aguas arriba (con los cebadores Primer-L (del Intrón 1): 5'-TTC CAA GGC AGA ACA TTT GAG AC-3'; Primer-R (del Exón 2): 5'-TCT GAG CCA GGG TTG AAA GG C-3') con los sitios de restricción NotI y XhoI diseñados en los extremos para la subclonación direccional en el vector de redireccionamiento del gen. En este constructo, se suprimieron 79 pb del Exón 2 que codifica 27 aminoácidos. El fragmento de la PCR se situó aguas arriba del gen que codifica la resistencia a la neomicina en pPNW, generando el vector de redireccionamiento del gen, pPNWUG. El vector se muestra en la Figura 2A, en la que la casete PGK-neo interrumpe el gen de la uteroglobina, desorganizando la secuencia codificadora de la proteína.

El vector de redireccionamiento del gen pPNWUG se linealizó con NotI y se sometió a electroporación en células ES R_{1} según Nagy, A., et al. PNAS 90:8424 (1.993). La selección con Ganciclovir y G-418 de las células sometidas a electroporación produjo 156 clones. El análisis de transferencia Southern (ADN) identificó un fragmento HindIII de 5,1 kb del alelo de la uteroglobina de tipo salvaje y un fragmento HindIII de 8,2 kb adicional resultante de la recombinación homóloga en tres de los 156 clones, mostrados en la Fig. 2B. Estos clones ES R1 se inyectaron en blastocitos C57BL/6 según Capecchi, Science 244: 1288 (1.989). Se generaron dos líneas diferentes de ratones, que descendían de diferentes fundadores quiméricos. Los vástagos heterocigotos (UG^{+/-}) que portaban el locus del gen de la uteroglobina elegido como diana fueron emparejados y se analizaron los genotipos de la progenie mediante la PCR mostrada en la Figura 2C, así como la transferencia Southern, mostrada en la Figura 2D.

Ejemplo 4 Verificación del gen UG desactivado y ausencia de la proteína UG de ratón (mUG)

Con el fin de verificar que los ratones con el gen desactivado homocigotos (UG^{-/-}) no poseían ninguna mUG detectable, se sometieron a ensayo ratones con el gen de la uteroglobina elegido como diana en cuanto a la expresión del ARNm de UG y la proteína de mUG en diversos órganos incluyendo los pulmones. Se aprobó un protocolo experimental por el comité de cuidado y uso institucional de animales. Los ARN totales se aislaron de diferentes órganos de ratones UG^{+/+}, UG^{+/-}, y UG^{-/-}. La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) se utilizó para detectar el ARNm de mUG. Las moléculas diana fueron sometidas a transcripción inversa utilizando un cebador específico de mUG, mPr (5'-ATC TTG CTT ACA CAG AGG ACT TG-3), y el ADNc generado se amplificó utilizando los cebadores de PCR mPr y mPl (5'-ATC GCC ATC ACA ATC ACT GT-3'). El producto de la PCR se hibridó con una sonda oligonucleotídica, mPp (5'-ATC AGA GTC TGG TTA TGT GGC ATC C-3') derivada del exón 2 de la secuencia génica de UG. Los cebadores y la sonda utilizados en la RT-PCR de GAPDH de ratón son los siguientes: mGAPDH-r (5'-GGC ATC GAA GGT GGA AGA GT-3'); mGAPDH-l (5'-ATG GCC TTC CGT GTT CCT AC-3'); mGAPDH-p (5'-GAA GGT GGT GAA GCA GGC ATC TGA GG-3'). La Figura 2E demuestra que el ARNm de mUG se detectaba en pulmones de ratones UG^{+/+} y UG^{+/-}, pero no UG^{-/-}. Datos similares (no mostrados) muestran que el ARNm de mUG no está presente en próstata o útero de ratones UG^{-/-}, pero está presente en los ratones con un gen de uteroglobina intacto.

Los análisis de inmunoprecipitación y transferencia Western de proteína mUG en los pulmones produjeron resultados similares corroborativos, mostrados en la Figura 2F. Los productos lisados de los riñones, el hígado, y los pulmones de los ratones UG^{+/+} y UG^{-/-} fueron preparados mediante homogeneización en un tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, Tritón X-100 al 1%, desoxicolato al 0,2%, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM y aprotinina, leupeptina, y pepstatina A, 20 \mug/ml cada una. Los productos homogeneizados se centrifugaron a 17.500 x g durante 30 minutos a 4ºC y se inmunoprecipitaron como se ha descrito (E. Harlow y D. Lane, Antibodies; a laboratory manual, 1^{a} Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1.998) incubando los productos lisados de los tejidos o las proteínas del plasma (1 mg/ml) con anticuerpo de conejo contra Fn de múrido (dilución 1:100). La inmunoprecipitación simultánea de Fn de múrido purificada (mFn) y rhUG (Mantile, G. et al., J. Biol. Chem. 267:20343 (1.993)) se realizó incubando concentraciones equimolares de mFn con rhUG en presencia de glicerol al 10%, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 250 mM, fosfato de sodio 4,3 mM a 4ºC durante 1 hora, seguido de adición de anticuerpo anti-mFn (dilución 1:100). Se resolvieron cantidades iguales de proteínas extraídas de tejidos (30 \mug) o productos inmunoprecipitados o sobre geles de SDS-poliacrilamida al 4-20% o al 6% en condiciones reductoras, seguido de transferencia Western con anticuerpos de conejo frente a Fn de ratón (dilución 1:2000) o UG (dilución 1:2000). No se detectó mUG en tejidos o fluidos de los ratones UG^{-/-}, mientras los tejidos de ratones UG^{+/+} y UG^{+/-} no contenían la proteína mUG.

Finalmente, los análisis histopatológicos de los pulmones de UG^{-/-}, solamente, carecían de la inmunotinción específica de mUG en células epiteliales bronquiolares. Los tejidos de pulmón de ratones UG^{-/-}, UG^{+/-}, y UG^{+/+} fueron fijados en fluido de Bouin o en fijadores de formalina tamponados neutros al 10%, embebidos en parafina y seccionados a 4-6 micras. Se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E). Los tejidos seleccionados se tiñeron mediante el método tricrómico de Masson para la detección de colágeno, PTAH para la fibrina, o Rojo Congo para la proteína amiloide. Para la detección inmunohistoquímica de mUG y mFn, se utilizó el kit Vectastain Elite ABC de conejo (Vector Laboratories). El anticuerpo de conejo (CytImmune) para mUG se originó utilizando un péptido sintético (Peptide Technologies, Inc.) correspondiente a la secuencia de aminoácidos de mUG (Lys28 a Thr49, específicamente KPFNPGSDLQNAGTQLKRLVDT). El anticuerpo de conejo para mFn (GIBCO BRL) se utilizó como una dilución de 1:1000, y el anticuerpo para mUG se utilizó a 1:500.

Estos tres grupos de resultados confirman que el ratón con el gen de la uteroglobina desactivado homocigoto, UG^{-/-}, carece de proteína mUG, o cualquier porción detectable de la proteína.

Ejemplo 5 Fenotipo de ratón con el gen de la uteroglobina desactivado

De los 179 ratones nacidos de los cruces de ratones UG^{-/-}, 46 (26%) eran del genotipo +/+, 90 (50%) del +/- y 43 (24%) del UG^{-/-}, indicando que el locus mUG desorganizado es heredado de modo Mendeliano y que los ratones UG^{+/+}, UG^{+/-} y UG^{-/-} eran igualmente viables al nacer. No obstante, los ratones UG^{-/-} mostraban un fenotipo novedoso en el cual desarrollaban una enfermedad progresiva caracterizada por caquexia, fuerte proteinuria, e hipocalcemia asociada con una pérdida de peso profunda. La proteinuria es una afección en la que niveles anormalmente elevados de albúmina y otras proteínas del suero se excretan en la orina. Es indicativa de disfunción glomerular e insuficiencia renal. El examen histopatológico de los riñones de los animales afectados (como se ha descrito antes para los pulmones) reveló la enfermedad glomerular renal fulminante mostrada en la Figura 3. En comparación con los glomérulos de los ratones UG^{+/+}, los de los ratones UG^{-/-} eran hipocelulares y tenían depósitos proteináceos eosinofílicos masivos. El desarrollo en el tiempo de la fatal enfermedad renal en los ratones UG^{-/-} era de comienzo temprano (período de 4-5 semanas) o de comienzo tardío (período de 10 meses). Aquellos ratones UG^{-/-} que inicialmente parecían sanos a las 4 semanas de edad tenían depósitos glomerulares focales a los dos meses de edad. Aproximadamente a los 10 meses, estos ratones tenían una caquexia extrema similar a la de los ratones que morían de enfermedad de comienzo temprano. Los heterocigotos tenían una forma más suave de la enfermedad renal observada en los ratones UG^{-/-}. La histopatología de los riñones de los ratones con enfermedad de comienzo tardío mostraba no solamente una glomerulopatía grave como en la enfermedad de comienzo temprano, sino también una marcada fibrosis del parénquima renal e hiperplasia tubular (véase la Figura 3). Aunque la patología predominante en los ratones UG^{-/-} se encontraba en los riñones, los estudios histopatológicos también descubrieron zonas focales ocasionales de necrosis en el páncreas que parecían estar orientadas vascularmente. Por otra parte, también se encontraron zonas focales en el timo y en las estructuras del bazo sugerentes de cuerpos apoptóticos. Interesantemente, el páncreas expresa el gen mUG, y este órgano también es una fuente rica de PLA_{2} extracelular del grupo I, puesto que esta es principalmente una enzima digestiva, su activación puede causar lesión tisular.

Debido a que se ha informado de que las proteínas uteroglobina tienen propiedades inmunomoduladoras y anti-inflamatorias y debido a que se sabe que ocurre una amiloidosis reactiva en respuesta a la inflamación, es probable que los depósitos glomerulares en los ratones sin mUG fueran proteínas amiloides. La amiloidosis reactiva se caracteriza por el depósito de proteína amiloide y complejos autoinmunitarios. La identidad de los depósitos renales en los ratones UG^{-/-} fue establecida mediante inmunohistoquímica de secciones de riñón. Las secciones de riñón de ratones UG^{-/-} y UG^{+/+} se tiñeron con rojo Congo y se examinaron con luz polarizada. Las proteínas amiloides producen una birrefringencia positiva en este ensayo; sin embargo, los glomérulos de los ratones UG^{-/-} eran claramente negativos. Los estudios de inmunofluorescencia para la presencia de inmunocomplejos con IgA, IgG o IgM en los glomérulos de los ratones UG^{-/-} y los análisis inmunohistoquímicos para la presencia de proteínas amiloides principales también fueron negativos. De este modo, los depósitos glomerulares de los ratones UG^{-/-} no contenían proteínas amiloides ni inmunocomplejos, y por lo tanto, no parecían ser el resultado de una respuesta inflamatoria.

Ejemplo 6 Detección de Fn y Colágeno en riñones UG^{-/-}

Los depósitos en los riñones de ratones UG^{-/-} se examinaron mediante microscopía de transmisión de electrones para dilucidar su estructura y morfología. Se fijó un riñón de un ratón UG^{-/-}, con lesión glomerular, en formalina y se embebió en resina epoxídica. Las secciones finas se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo para su examen al microscopio electrónico. Se tomaron microfotografías a 6.000X o a 60.000X. Los depósitos contenían principalmente dos tipos de estructuras fibrilares: un tipo de fibrillas largas y estriadas que son relativamente infrecuentes, las otras cortas y difusas que son más abundantes (Figuras 3E y 3F). Debido a que las proteínas ECM, tales como el colágeno y la fibronectina, producen estructuras fibrilares similares, los depósitos glomerulares en los ratones UG^{-/-} pueden contener estas proteínas.

Los depósitos glomerulares se analizaron a continuación mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpo anti-mFn. Se utilizaron secciones de tejido fijadas con formalina para la inmunoflurescencia utilizando un anti-mFn de conejo e IgG anti-conejo de cabra conjugada con FITC. De un modo similar, también se realizaron estudios de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para mFn, colágeno I y III, vitronectina, laminina y osteopontina. La epifluorescencia se fotografió utilizando un microscopio Zeiss Axiophot. La inmunofluorescencia específica de Fn en los glomérulos renales de los ratones de tipo salvaje era virtualmente indetectable (Figura 3G), la de los glomérulos de las camadas UG^{-/-} era intensa (Figura 3H). Cuando se utilizaba la tinción tricrómica de Masson, los glomérulos de los ratones UG^{+/+} eran negativos (Figura 3I) y los de los ratones UG^{-/-} (Figura 3J) eran positivos, sugiriendo la presencia de colágeno en los depósitos glomerulares. La inmunofluorescencia, utilizando anticuerpos específicos de colágeno I y colágeno III confirmó estos resultados. Debido a que se sabe que Fn interacciona con otras proteínas de la matriz extracelular (ECM), los autores también sometieron a ensayo la presencia de laminina, vitronectina y osteopontina en los glomérulos de ratones UG^{+/+} y UG^{-/-} mediante inmunohistoquímica, cuyos resultados fueron negativos.

Ejemplo 7 Los riñones de ratones UG^{-/-} no producen en exceso Fn

Con el fin de determinar si la producción excesiva de Fn puede justificar su depósito en los glomérulos renales, los autores de la invención evaluaron la cantidad relativa de ARNm de Fn en los riñones, los pulmones, y el hígado de ratones UG^{-/-} y UG^{+/+} mediante RT-PCR y densitometría. Los resultados indican que las cantidades relativas de ARNm de Fn eran esencialmente idénticas en animales tanto UG^{+/+} como UG^{-/-}. De este modo, la producción en exceso de ARNm de Fn no era una causa probable de depósito de Fn en los glomérulos de ratones UG^{-/-}. Después los autores de la presente invención compararon la proteína Fn en plasma, riñones, e hígado de ratones UG^{-/-} y UG^{+/+} mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras, y transferencia Western. En el plasma, los riñones y el hígado de los ratones de tipo salvaje solamente se pudieron detectar especies de Fn de 220 kD; no obstante, mientras el producto lisado de plasma e hígado de los ratones UG^{-/-} tenía la banda de Fn de 220 kD, los productos lisados de riñón contenían otra banda de Fn distinta multimérica, unida covalentemente (Figura 4A).

Ejemplo 8 Actividad PLA_{2} elevada en suero en ratones UG^{-/-}

Basándose en los conceptos actuales, se piensa que las etapas críticas en el ensamblaje en la matriz de Fn y la fibrilogénesis, al menos en la superficie celular, implican la activación de la integrina y la auto-agregación de Fn. Debido a que UG es un potente inhibidor de la fosfolipasa soluble A_{2} (sPLA_{2}), una enzima clave en la ruta inflamatoria, la carencia de mUG en ratones UG^{-/-} puede contribuir al desarrollo de glomerulonefritis, una enfermedad renal inflamatoria. De este modo, los autores de la presente invención midieron la actividad PLA_{2} en el suero de ratones UG^{+/+} (n=3) y UG^{-/-} de edad, sexo y peso similares. Los animales se sacrificaron y se midieron las actividades PLA_{2} de cada muestra por triplicado utilizando un kit de análisis de PLA_{2} (Cayman Chemical) según las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de proteína en suero se determinaron mediante análisis de Bradford (Bio Rad) y se calcularon las actividades específicas de PLA_{2}. Las actividades específicas (\mumoles/min/mg de proteína) de PLA_{2} en suero de ratones UG^{-/-} [36+3,3 (ETM)] eran significativamente superiores (p<0,05) que los de los ratones UG^{+/+} [18+2,8 (ETM)]. Estos resultados aumentaban la posibilidad de que una actividad PLA_{2} superior pueda conducir a un aumento de la producción de ácido lisofosfatídico (LPA) y por consiguiente promover la activación de la integrina y la auto-agregación de Fn en ratones UG^{-/-}.

Ejemplo 9 Interacción de uteroglobina y fibronectina in vitro

Para comprender adicionalmente cómo la uteroglobina puede evitar el auto-ensamblaje de Fn, se determinó la capacidad de rhUG para desorganizar la interacción mFn-Fn in vitro. Se incubaron concentraciones equimolares de rhUG y mFn para permitir cualquier unión de proteínas u otras interacciones, después se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-Fn, y los productos inmunoprecipitados se resolvieron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras. La transferencia Western, como se ha descrito previamente, con anticuerpo para mFn o mUG detectó cada proteína, respectivamente. Los resultados muestran que la fibronectina inmunuprecipita simultáneamente con rhUG (Figura 4B). Para confirmar estos resultados, se incubó rhUG-I^{125} con mFn y los complejos se resolvieron mediante electroforesis, utilizando un gel de poliacrilamida al 6% en condiciones no desnaturalizantes y no reductoras (Figuras 4C). La detección de un heterómero Fn-UG en el autorradiograma (calle 2) demostró que la Fn soluble interacciona con UG in vitro. Para averiguar si la heteromerización Fn-UG tiene lugar in vivo, se inmunoprecipitó plasma de ratones UG^{+/+} y UG^{-/-} con un anticuerpo anti-mFn que no presenta reacción cruzada con rhUG (Figura 4D). El anticuerpo anti-mFn precipitó simultáneamente tanto con mFn como con rhUG del plasma de ratones UG^{+/+}, pero no de UG^{-/-}, sugiriendo que los heterómeros de Fn-UG están presentes en el plasma de ratones UG^{+/+}. Por lo tanto, el complejo Fn-UG no es simplemente un artefacto formado in vitro sino que existe naturalmente en el suero.

Para determinar la especificidad y afinidad de la unión de UG a Fn, los autores de la presente invención incubaron Fn-I^{125} con Fn no marcada en presencia y ausencia de UG. Cualquiera de los complejos presentaba entrecruzamiento por afinidad con suberato de disuccinimidilo (DSS). Utilizando placas de 24 pocillos recubiertas con Fn humana (hFn) (Collaborative Biomedical Products), se incubaron 3 \mul de Fn-I^{125} (Sp. Act. 6 mCi/mg: ICN Biomedicals) en ausencia y en presencia de UG o Fn (10^{-12}-10^{-6} M) en 500 \mul de HBSS a la temperatura ambiente durante 2 horas. La SDS-PAGE y la transferencia Western de toda la Fn con anticuerpo para UG no lograron detectar ninguna contaminación con UG. El complejo radiomarcado se lavó dos veces con PBS, se solubilizó en NaOH 1N, se neutralizó con HCl 1N, y se midió la radiactividad mediante un contador gamma. En un experimento separado, se incubó hFn-I^{125} (3 \mul) con 20 \mul (1 mg/ml) de Fn de ratón en 40 \mul de HBSS, pH 7,6 en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de rhUG reducida (5-500 \mug) a la temperatura ambiente durante 2 horas. Las muestras se entrecruzaron con DSS 0,20 mM a la temperatura ambiente durante 20 minutos, se hirvieron en tampón de muestra para SDS durante 5 minutos, se sometieron a electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida al 4-20% y se sometieron a autorradiografía. En ausencia de UG, Fn-I^{125} formaba un complejo radiactivo de elevado peso molecular, con Fn no marcada, pero en presencia de UG la formación de productos agregados Fn-Fn se inhibió de una manera dependiente de la concentración de UG (Figura 4E).

Para determinar si hay diferencia entre las afinidades de unión de Fn por UG y Fn por sí misma, se realizaron experimentos de unión en los que Fn-I^{125} se incubó con Fn no marcada y se inmovilizó sobre placas de múltiples pocillos junto con concentraciones variables de UG. En experimentos por separado, también se realizaron estudios de unión de Fn-I^{125} con Fn no marcada inmovilizada utilizando diversas concentraciones de Fn soluble no marcada. Los análisis Scatchard de los datos de ambos tipos de experimentos de unión produjeron líneas directas con constantes de disociación (kds) de 13 nM para la unión de UG a Fn y de 176 nM para la unión de Fn consigo misma. Estos resultados sugieren que, debido a una afinidad de unión relativamente superior de UG por Fn, la UG contrarresta eficazmente la auto-agregación de Fn. Los experimentos de entrecruzamiento por afinidad en los que se incubó colágeno I-(I^{125}) marcado con yodo radiactivo con Fn no marcada en ausencia o presencia de UG, también se realizaron como se ha descrito antes para Fn. Se incubaron 15 \mul de colágeno I-I^{125} no desnaturalizado (Sp. Act. 65,4 mCi/mg) con Fn en presencia o ausencia de UG reducida (250 \mug), se sometieron a entrecruzamiento por afinidad, se sometieron a electroforesis y se sometieron a autorradiografía. Los resultados indican que UG contrarresta la formación de agregados de colágeno-I^{125}-Fn de elevado peso molecular (Figura 4F).

Ejemplo 10 Inhibición in vivo del depósito de hFn glomerular por rhUG

Para someter a ensayo si rhUG protege los glomérulos renales de la acumulación de Fn, se administró intravenosamente Fn humana soluble (hFn) sola, o hFn mezclada con concentraciones equimolares de rhUG a camadas UG^{+/+} y UG^{-/-} aparentemente sanas.

Se administró Fn humana (500 \mug/150 \mul de PBS) en la vena de la cola de ratones UG^{+/+} y UG^{-/-} aparentemente sanos de dos meses de edad, con un peso de aproximadamente 22 g. De un modo similar, se inyectó a los ratones de control una mezcla de 500 \mug de hFn o bien a concentraciones equimolares de rhUG o bien albúmina en 150 \mul de PBS. Veinticuatro horas después de la última inyección, los ratones se sacrificaron y los diversos órganos se fijaron en formalina tamponada. Las secciones histológicas de los riñones y otros órganos se examinaron mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-Fn monoespecífico (GIBCO BRL; clon 1) e IgG anti-ratón de conejo conjugada con FITC (Cappel). En un experimento por separado, se inyectó 1 mg de hFn sola en 150 \mul de PBS diariamente durante 3 días consecutivos, en ratones UG^{+/+}.

La base lógica para inyectar Fn humana era poder discriminar entre la Fn de ratón endógena y la hFn administrada. Se ha descrito el método de administración intravenosa y detección inmunohistoquímica de hFn en diversos tejidos.

La inmunofluorescencia de Fn humana en glomérulos de ratones UG^{+/+} de tipo salvaje a los que se había inyectado una mezcla de hFn y rhUG (razón molar 1:1) o hFn sola era similar (Figuras 5A y 5B). No obstante, los ratones UG^{-/-} a los que se había inyectado una mezcla de hFn y UG mostraron una pequeña inmunofluorescencia específica de hFn en glomérulos (Figura 5C), mientras aquellos que recibieron Fn sola mostraron una intensidad de inmunofluorescencia mayor (Figura 5D). La administración de una mezcla de hFn y BSA, como control, no produjo efecto protector.

Para determinar si este efecto protector de UG podía ser superado inyectando cantidades mayores de Fn en ratones UG^{+/+}, los autores de la presente invención inyectaron 1 mg de hFn por animal diariamente durante tres días consecutivos. Aunque la administración intravenosa de hFn a ratones UG^{+/+} a dosis más bajas (500 \mug/animal) no fue eficaz al causar un depósito glomerular apreciable (Figura 5A), la administración de dosis más altas (3 mg/animal) condujo a una acumulación apreciable. De este modo, la UG previene el depósito de Fn glomerular, y los ratones UG^{+/+} en oposición a los UG^{-/-} tienen un umbral más alto para la acumulación de Fn soluble, debido a la presencia de UG endógena.

Ejemplo 11 Inhibición de la fibrilogénesis y ensamblaje en la matriz de Fn por rhUG en células de cultivo de tejidos

Para determinar si la UG previene la fibrilogénesis de Fn y el ensamblaje en la matriz en un análisis de cultivo de tejidos in vitro típico, se cultivaron fibroblastos embrionarios de ratón en medio que contenía hFn soluble sola o una mezcla de concentraciones equimolares de hFn y rhUG. El ensamblaje en la matriz de Fn y la fibrilogénesis en células cultivadas (CRL6336, ATCC) se determinaron como se ha descrito. El nivel de fibrilogénesis observado en las células de los cultivos tratados con hFn sola fue mucho mayor (Figura 5E) en comparación con el de aquellas que recibieron una mezcla de hFn y rhUG (Figura 5F).

Ejemplo 12 Detección de complejos UG-Fn en muestras clínicas

La detección de complejos UG-Fn en muestras clínicas de fluidos corporales tales como suero, fluidos BAL, y esputo es importante en la determinación del papel de este complejo en las enfermedades humanas. Se desarrolla un análisis diagnóstico en fase de solución para la detección de complejos UG-Fn y el formato del análisis se muestra en la Figura 6. El anticuerpo de captura, anclado covalentemente a un soporte sólido, es un anticuerpo policlonal de conejo monoespecífico originado contra la proteína humana. El soporte sólido puede ser una cuenta, tal como una cuenta magnética, un tubo, o una placa de ELISA. El soporte sólido permite la flexibilidad de realizar etapas de lavado después de cada reacción de unión con el fin de obtener resultados más consistentes con una variedad de tipos de muestras. El anticuerpo de detección es específico para Fn, y está disponible en numerosas fuentes comerciales. Después se utiliza un anticuerpo anti-IgG, conjugado con una enzima tal como peroxidasa de rábano picante (HRP), para detectar la IgG anti-Fn en el extremo de la cadena molecular en una reacción enzimática normalizada en la que el sustrato de la enzima se convierte en un compuesto cromogénico o fluorogénico que es cuantificado con un espectrofotómetro o un fluorómetro (Amersham). El límite de detección para este análisis es de 500 \mug de complejo UG-Fn por ml de fluido de muestra.

Ejemplo 13 Deficiencias de uteroglobina

Una deficiencia transitoria pero aguda de hUG es creada por la técnica de limpieza de la sangre conocida como diálisis clínica, incluyendo hemodiálisis, diálisis peritoneal y diálisis continua (CRRT). Todas las formas de diálisis clínica implican el uso de una membrana semi-permeable para filtrar los productos de desecho corporales tóxicos, incluyendo metabolitos químicos tales como urea, y pequeñas proteínas tales como beta2-microglobulina, de la sangre.

La UG es una proteína extremadamente compacta, conocida por su migración anómala en SDS-PAGE, correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 10-13 kDa, a pesar de que su verdadero peso molecular es de 15,7 kDa. Por lo tanto, se esperaba que el dímero de UG se comportara como una proteína de 10-13 kDa en los experimentos de diálisis. Sorprendentemente, se encontró que el dímero es tan compacto que pasa a través de una membrana de diálisis de 8,0 kDa MWCO. La UG también pasaba a través de una membrana de diálisis de 14,0 kDa MWCO.

La composición de las membranas de diálisis utilizadas en estos ejemplos es similar, si no idéntica, a la composición de la mayoría de las membranas fabricadas y utilizadas para la diálisis clínica. Estas consisten en celulosa regenerada o acetato de celulosa.

Para este experimento, se sometieron a diálisis alícuotas de 1,0 ml de dos productos lisados de células con rhUG (uno puro en >90% y uno puro aproximadamente en 70%), sin aditivos de tampón, frente a 1.000 ml de acetato de amonio 50 mM no tamponado, utilizando tres tamaños de tubos de diálisis: 3,5 kDa, 8,0 kDa, y 14,0 kDa (Spectra/Por; Thomas Scientific). Hubo cuatro cambios de tampón para cada muestra a lo largo de un período de tiempo de 48 horas, todos realizados a la temperatura ambiente (aproximadamente 25-27ºC). La apariencia de cada muestra de diálisis cambiaba de amarillo claro a un líquido incoloro, transparente. El tubo de diálisis se verificó en cuanto a pérdidas al principio y al final del proceso mediante una breve aplicación de presión directamente al tubo (retorciendo) y observación de cualquier pérdida, de las cuales no hubo ninguna. El tubo se cerró doblemente con abrazaderas en cualquier extremo para asegurarlo adicionalmente frente a pérdidas.

La Figura 7 muestra el análisis SDS-PAGE de estos resultados. La muestra de pre-diálisis pura en 90% se muestra en la calle 7 y 8 próxima a las tres muestras de post-diálisis en las calles 1, 2, y 3. El dímero de UG ya no estaba presente en las calles que representan las muestras sometidas a diálisis con membranas de 8,0 kDa MWCO. Estos resultados se confirmaron más tarde con diferentes lotes de preparaciones de UG parcialmente purificada.

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<110> Pilon, Aprile et al.

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<120> USE IF RECOMBINANT HUMAN UTEROGLOBIN IN TREATMENT OF INFLAMMATORY AND FIBROTIC CONDITIONS

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<130> LISTADO DE SECUENCIAS

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<140> 08/864,357

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<141> 1997-05-28

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<160> 13

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 70

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: uteroglobina humana

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: uteroglobina de conejo

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: uteroglobina de rata

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<400> 3

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: uteroglobina de ratón

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador R

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tctgagccag ggttgaaagg c

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 9

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atcagagtct ggttatgtgg catcc

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25

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<210> 10

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 10

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ggcatcgaag gtggaagagt

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20

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<210> 11

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 11

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atggccttcc gtgttcctac

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20

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<210> 12

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

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<400> 12

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gaaggtggtg aagcaggcat ctgagg

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26

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<210> 13

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de uteroglobina de ratón

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<400> 13

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8

Claims (24)

1. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de unión a fibronectina de uteroglobina humana recombinante (rhUG) o un derivado de la misma, con la condición de que el derivado conserve la actividad biológica de la molécula parental, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

2. El uso de una cantidad eficaz de unión a fibronectina de uteroglobina (UG) humana nativa o recombinante o un derivado de la misma, con la condición de que el derivado conserve la actividad biológica de la molécula parental, en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir una afección fibrótica en un paciente que necesite semejante tratamiento.

3. El uso de una cantidad compensatoria de uteroglobina (UG) humana nativa o recombinante o un derivado de la misma, con la condición de que el derivado conserve la actividad biológica de la molécula parental, en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir una afección fibrótica caracterizada por una deficiencia de uteroglobina endógena.

4. El uso de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, donde dicha afección fibrótica es la fibrosis pulmonar, la fibrosis renal o la fibrosis vascular.

5. El uso de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, donde dicha composición farmacéutica es para el tratamiento de una afección fibrótica caracterizada por una deficiencia de uteroglobina endógena, donde dicha afección se selecciona del grupo que consiste en displasia broncopulmonar neonatal, complicaciones de hemodiálisis, pulmón con bleomicina, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y glomerulopatía heredada.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, donde dicha UG tiene una pureza entre aproximadamente 75% y aproximadamente 100%, preferiblemente entre aproximadamente 90% y aproximadamente 100%, muy preferiblemente al menos 95%.

7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, donde dicha UG es recombinante (rhUG), teniendo sustancialmente la misma secuencia que la uteroglobina humana nativa.

8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde dicha UG va a ser administrada asociada con un tensioactivo pulmonar.

9. El uso de la reivindicación 8, donde dicho tensioactivo pulmonar está presente en una cantidad de aproximadamente 20% a aproximadamente 80% en peso.

10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, donde dicha UG va a ser administrada por ruta endotraqueal, oftálmica, intravenosa, generalizada, intraperitoneal, intramuscular, u oral.

11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, donde dicha UG va a ser administrada en forma de un líquido o semi-aerosol vía un tubo traqueal.

12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, donde dicha UG va a ser administrada combinada con un agente activo seleccionado del grupo que consiste en esteroides, agentes antiinflamatorios no esteroideos, agentes quimioterapéuticos, analgésicos, anticuerpos, antiparasitarios, antivirales, antibióticos, antifúngicos, vacunas, vacunas tumorales, inmunosupresores, factores de crecimiento hematopoyéticos, antitrombóticos, fármacos cardiovasculares, una o más vitaminas y suplementos minerales, y fármacos de fertilidad.

13. Un análisis para cuantificar los complejos de uteroglobina-fibronectina en una muestra clínica, donde

(a) se pone en contacto una muestra clínica que se sospecha que contiene uno o más complejos de uteroglobina-fibronectina con un agente para la captura de antígenos,

(b) se añade un agente de detección de antígenos a dicha muestra, y

(c) se detecta la presencia de cualquier complejo unido a dicho agente de captura utilizando un anticuerpo secundario que se une al agente de detección de antígenos y se conjuga con un radical que es susceptible de ser detectado mediante la adición de un compuesto que reacciona con dicho radical.

14. El análisis de la reivindicación 13, donde dicho agente para la captura de antígenos es un anticuerpo policlonal de conejo monoespecífico, inmovilizado sobre un soporte insoluble.

15. El análisis de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, donde el anticuerpo secundario es un anticuerpo anti-IgG, el radical al que se conjuga es una enzima, y el compuesto que reacciona con el radical es un sustrato para la enzima que se convierte en un compuesto cromogénico o fluorogénico tras la reacción con la enzima.

16. El análisis de la reivindicación 15, donde la enzima es peroxidasa de rábano picante.

17. El análisis de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, donde el agente para la detección de antígenos es un anticuerpo específico para fibronectina.

18. El uso de una cantidad eficaz de unión a fibronectina de uteroglobina (UG) humana nativa o recombinante o un derivado de la misma, con la condición de que el derivado conserve la actividad biológica de la molécula parental, en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir la fibrilogénesis en un paciente que necesita semejante tratamiento.

19. El uso de la reivindicación 18, donde dicha UG tiene una pureza entre aproximadamente 75% y aproximadamente 100%, preferiblemente entre aproximadamente 90% y aproximadamente 100%, muy preferiblemente al menos 95%.

20. El uso de la reivindicación 18 o la reivindicación 19, donde dicha UG es recombinante (rhUG), teniendo sustancialmente la misma secuencia que la uteroglobina humana nativa.

21. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, donde dicha UG va a ser administrada asociada con un tensioactivo pulmonar.

22. El uso de la reivindicación 21, donde dicho tensioactivo pulmonar está presente en una cantidad de aproximadamente 20% a aproximadamente 80% en peso.

23. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, donde dicha UG va a ser administrada por ruta endotraqueal, oftálmica, intravenosa, generalizada, intraperitoneal, intramuscular, u oral.

24. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, donde dicha UG va a ser administrada en forma de un líquido o semi-aerosol vía un tubo intratraqueal.