ES2294598T3 - Panel de marcadores para la diabetes de tipo 1 y 2. - Google Patents
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Abstract
Método para diagnosticar si un paciente diabético sufre microangiopatía o tiene el riesgo de padecerla, que comprende las etapas de a) medir in vitro el nivel del factor de crecimiento placentario (PlGF) o de una de sus variantes PlGF-1 (149 amino-ácidos), PlGF-2 (170 aminoácidos) o PlGF-3 (221 aminoácidos) en una muestra de sangre, de suero sanguíneo o de plasma sanguíneo del paciente, b) diagnosticar la microangiopatía o el riesgo de padecerla, comparando el nivel medido con el(los) nivel(es) conocido(s) correspondientes a la microangiopatía o su riesgo.
Description
Panel de marcadores para la diabetes de tipo 1 y
2.
La presente invención se refiere a la
estratificación del riesgo de los pacientes afectados de
diabetes.
Actualmente los pacientes diabéticos se tratan
en general como un grupo homogéneo, dividiéndose solo en pacientes
con diabetes de tipo 1 y tipo 2. En realidad la diabetes constituye
un grupo muy heterogéneo. Muchos padecen enfermedades concomitantes
como trastornos cardiovasculares o inflamatorios. Se requieren
regímenes de tratamiento más personalizados para adaptarse a las
necesidades de estos pacientes. No obstante, un requisito previo
para el tratamiento personalizado es el diagnóstico seguro de
cualquier enfermedad concomitante o de cualquier manifestación
específica o predominante implicada en el pronóstico patológico o
indicativa de complicaciones derivadas de una determinada
enfermedad en un paciente concreto.
Los recursos diagnósticos corrientes son
insuficientes para estos fines. Por ejemplo, la enfermedad
cardiovascular es frecuentemente mal diagnosticada por médicos de
medicina general (Svendstrup Nielsen, L. y otros (2003). Precursor
del péptido natriurético cerebral N-terminal para
discriminar entre disnea cardiaca y no cardiaca. The European
Journal of Heart Failure [Revista europea del fallo cardiaco]). Por
lo tanto hacen falta herramientas diagnósticas sencillas y fiables,
sobre todo para médicos de medicina general y/o especialistas en
diabetes.
Ya es conocido el uso de marcadores bioquímicos
o moleculares para diagnosis. Sin embargo la diabetes altera muchas
funciones corporales y por lo tanto también muchos niveles de los
marcadores bioquímicos o moleculares potenciales. No se sabe qué
marcador(es) aportan información valiosa sobre el estado
fisiológico o patológico de un paciente de diabetes.
Khaliq y otros (1998) describieron por
inmunohistoquímica que se había observado factor de crecimiento
placentario (PlGF) en vasos superficiales de la retina diabética
adyacentes a membranas neovasculares prerretinianas. La
localización de PlGF era débil o inexistente en retina diabética sin
signos de proliferación neovascular (Khaliq, A., Foreman, D.,
Ahmed, A., Weich, H. y otros (1998). Expresión aumentada del factor
de crecimiento placentario en la retinopatía diabética
proliferativa. Laboratory Investigation [Investigación de
laboratorio], vol. 78(1), p. 109-116). En el
mismo estudio se describió que había PlGF en muestras de vítreo de
pacientes diabéticos, pero que no podía detectarse en muestras de
control. No se ha mencionado la medición de mayores niveles en
sangre.
Se ha intentado determinar si el péptido
natriurético cerebral (BNP) puede utilizarse como marcador
bioquímico en pacientes diabéticos. Yano y otros (1999) encontraron
que el BNP puede ser una señal de complicaciones renales en
pacientes diabéticos de tipo 2 (Yano Y., Katsuki A. y otros (1999).
Niveles de péptido natriurético cerebral en plasma de pacientes
diabéticos normotensivos no dependientes de insulina con
microalbuminuria. The Journal of Clinical Endocrinology &
Metabolism [Revista de endocrinología clínica y metabolismo], vol.
84(7), p. 2353-2356). Este hallazgo ha sido
cuestionado por Isotani y otros (2000), que supusieron que el
aumento de BNP en plasma es más bien un síntoma de disfunción
cardiaca (Isotani H., Kameoka K. y otros (2000). Niveles de péptido
natriurético cerebral en el plasma de pacientes normotensivos con
diabetes de tipo 2 sin enfermedad cardiaca. Diabetes Care [Cuidado
de la diabetes], vol. 23(6), p.859-860).
Siebenhofer y otros (2002) afirman que los estudios en pacientes
normotensivos con diabetes de tipo 2 no eran concluyentes respecto a
los niveles elevados de BNP en pacientes con microalbuminuria.
Siebenhofer y otros (2002) hallaron mayores niveles de
NT-proBNP en pacientes diabéticos de tipo 1 con
albuminuria. Los autores dedujeron que el papel del
NT-proBNP en pacientes con nefropatía diabética y
otras enfermedades concomitantes no estaba claro.
La patente WO 2004/046722 (Zeiher, A.M. y otros)
describe un papel del factor de crecimiento placentario (PlGF) como
marcador de inflamación. No se menciona ninguna relación entre PlGF
y microangiopatía. De manera similar se describe el factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF) como marcador de necrosis
miocárdica. No se menciona en ninguna parte una relación entre VEGF
y microangiopatía.
Mitamura, Y. y otros describen mayor
inmunorreactividad de PlGF y VEGF en muestras de vítreo de pacientes
diabéticos (Mitamura, Y., Tashimo, A., Nakamura, Y. y otros (2002)
Niveles de factor de crecimiento placentario y de factor de
crecimiento endotelial vascular en el vítreo de pacientes con
retinopatía diabética proliferativa. Diabetes Care [Cuidado de la
diabetes], vol. 25(6), p. 2352). No se ha mencionado la
medición de mayores niveles en sangre.
Las complicaciones cardiovasculares quedan con
frecuencia inadvertidas, porque los diabéticos suelen padecer
neuropatía e insensibilidad al dolor. P.ej., los pacientes
diabéticos pueden estar enfermos del corazón sin experimentar el
síntoma característico de dolor pectoral.
Además algunos fármacos contra la diabetes
pueden tener efectos cardiotóxicos (debido p.ej. al incremento del
volumen sanguíneo) y solamente deberían administrarse a pacientes
que no sufrieran o tuvieran el riesgo de sufrir una complicación
cardiovascular.
Por lo tanto un objeto de la presente invención
es proporcionar métodos y medios para estratificar el riesgo y/o
identificar enfermedades concomitantes, sobre todo complicaciones
cardiovasculares, en los pacientes diabéticos.
En una primera forma de ejecución el problema se
remedia con un método para diagnosticar si un paciente diabético
sufre microangiopatía o está en riesgo de contraerla, el cual
comprende las etapas de
- a)
- medir in vitro el(los) nivel(es) de al menos un factor de crecimiento placentario (PlGF), un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o variante(s) de los mismos en una muestra de sangre, de suero sanguíneo o de plasma sanguíneo del paciente,
- b)
- diagnosticar la microangiopatía o el riesgo de contraerla, comparando el(los) nivel(es) medido(s) con el(los) nivel(es) conocido(s) correspondientes a la microangiopatía o su riesgo.
La presente invención es particularmente
ventajosa para los médicos de medicina general, los médicos
especialistas y las salas, departamentos o clínicas especializadas
en el tratamiento de la diabetes, ya que no suelen tener acceso a
exámenes cardiológicos exhaustivos practicados por cardiólogos. La
presente invención facilita a los no cardiólogos métodos para un
chequeo simple y fiable de los pacientes diabéticos que corren el
riesgo de sufrir microangiopatía.
La presente invención proporciona métodos
simples para detectar microangiopatía en los pacientes diabéticos,
incluyendo los que padecen neuropatía. La detección es posible en
las fases tempranas de la microangiopatía, antes de que se hayan
producido daños irreversibles.
La presente invención saca partido de los
marcadores bioquímicos o moleculares. Los términos factor de
crecimiento placentario (PlGF) o variantes del mismo como
PlGF-1, PlGF-2 o
PlGF-3, "marcador bioquímico" y "marcador
molecular" son conocidos del especialista en la materia.
Concretamente, los marcadores bioquímicos o moleculares son
productos de expresión genética que se expresan diferencialmente
(p.ej. superregulada o infrarregulada) en presencia o ausencia de
cierta condición, enfermedad o complicación. Normalmente un marcador
molecular se define como un ácido nucleico (como por ejemplo un
ARNm), mientras que un marcador bioquímico es una proteína o un
péptido. El nivel de un marcador bioquímico o molecular apropiado
puede indicar la presencia o ausencia de la condición, enfermedad o
complicación, permitiendo así el diagnóstico.
La diabetes según la presente invención se
refiere a todas las formas de diabetes mellitus, incluyendo las de
tipo 1 y 2 y la diabetes gestacional. Sobre todo se refiere a las
diabetes de tipo 1 y 2. Las definiciones de diabetes mellitus son
conocidas del especialista en la materia y los criterios
diagnósticos han sido establecidos por la Organización mundial de
la salud (OMS) en 1985 y 1999, y también por la American Diabetes
Association (ADA) en 1997. Cualquier paciente que cumple los
criterios según una o varias de estas definiciones se considera un
diabético. Preferentemente el paciente de diabetes se define según
los criterios de la OMS de 1999.
La diabetes de tipo 1 también se conoce como
diabetes juvenil o diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM). La
diabetes de tipo 1 puede tener causa inmunológica (subtipo A) o
idiopática (subtipo B). La diabetes de tipo 2 también se conoce
como diabetes del adulto o diabetes mellitus no insulinodependiente
(NIDDM). La diabetes de tipo 2 puede estar acompañada de obesidad
(tipo 2a) o no (tipo 2b). Otros tipos de diabetes son debidos p.ej.
a defectos genéticos, enfermedades del páncreas exocrino,
endocrinopatías e influencias de fármacos químicos o productos
farmacéuticos.
La diagnosis según la presente invención
comprende la determinación, control, confirmación, subclasificación
y predicción de la enfermedad, complicación o riesgo relevante. La
determinación se refiere al conocimiento de la enfermedad,
complicación o riesgo. El control se refiere al seguimiento de una
enfermedad o complicación ya diagnosticada, p.ej. al análisis de la
progresión de la enfermedad o de la influencia de un tratamiento
concreto en la progresión de la enfermedad o de la complicación. La
confirmación se refiere al refuerzo o comprobación de un
diagnóstico ya hecho, utilizando otros indicadores o marcadores. La
subclasificación se refiere a un diagnóstico más avanzado según los
diferentes subtipos de la enfermedad diagnosticada, p.ej. una
definición conforme a las formas suaves y severas de la enfermedad.
La predicción se refiere al pronóstico de una enfermedad o
complicación antes de que otros síntomas o marcadores se pongan de
manifiesto o se alteren de manera importante.
Según la presente invención, el término
"paciente" se refiere a una persona que padece diabetes.
Concretamente se trata de un paciente que sufre diabetes de tipo 1,
de tipo 2 y/o nefropatía diabética o que recibe tratamiento por
ello. De manera más exacta, el paciente no tiene ninguna historia
conocida de complicación cardiovascular y/o no está en tratamiento
por una complicación cardiovascular.
La presente invención permite diagnosticar si un
diabético padece microangiopatía o tiene riesgo de sufrirla. Según
la presente invención "padecer microangiopatía" también incluye
el deterioro de una microangiopatía ya existente.
La presente invención saca partido del PlGF o de
sus variantes PlGF-1, PlGF-2 o
PlGF-3 como marcadores bioquímicos y
moleculares.
En un primer aspecto de la presente invención se
ha encontrado que, como marcadores bioquímicos y moleculares, el
PlGF o sus variantes PlGF-1, PlGF-2
o PlGF-3 son altamente indicativos de
microangiopatía en pacientes diabéticos. También se ha encontrado
que los marcadores de microangiopatía son indicativos de mortalidad
por enfermedad cardiovascular en pacientes diabéticos.
\newpage
Por tanto la presente invención se refiere a la
medición del nivel de PlGF o de una de sus variantes
PlGF-1,
PlGF-2 o PlGF-3 para diagnosticar el riesgo de sufrir micro-angiopatía.
PlGF-2 o PlGF-3 para diagnosticar el riesgo de sufrir micro-angiopatía.
Así pues la presente invención permite
diagnosticar la "microangiopatía" en un paciente diabético. La
microangiopatía es una consecuencia frecuente de la diabetes y
también se conoce como microangiopatía diabética. La microangiopatía
se manifiesta mayormente en el riñón y en la retina. La
microangiopatía renal puede conducir a nefropatía diabética, que se
caracteriza por proteinuria (mayor excreción de albúmina por vía
urinaria), hipertonía e insuficiencia renal progresiva debida a
glomérulosclerosis. La microangiopatía retinal puede causar
proliferación de vasos sanguíneos en la retina, hemorragias
retinianas y ceguera. Otra consecuencia de la
micro-angiopatía es la hipoxia de las extremidades
(conocida típicamente como "pie diabético") que puede producir
gangrena y requerir la amputación de la extremidad.
Por tanto el PlGF o una de sus variantes
PlGF-1, PlGF-2 o
PlGF-3 también permite diagnosticar nefropatía
diabética, retinopatía diabética o hipoxia de las extremidades.
Los marcadores de angiogénesis conforme a la
presente invención son el PlGF o una de sus variantes
PlGF-1, PlGF-2 o
PlGF-3. El marcador de angiogénesis más preferido es
el PlGF.
En este contexto, el término "variantes" se
refiere a péptidos que son básicamente similares a los péptidos
mencionados. El término "básicamente similar" es bien entendido
por la persona especialista en la materia. Una variante puede ser
concretamente un isoformo o alelo que tenga aminoácidos permutados
respecto a la secuencia aminoácida del isoformo peptídico
predominante en la población humana. La secuencia de un péptido
básicamente similar tiene con preferencia una analogía de al menos
un 80%, preferiblemente de al menos un 85%, con mayor preferencia
de al menos un 90%, sobre todo de al menos un 95%, con el isoformo
peptídico predominante. También son básicamente similares los
productos de degradación, p.ej. los productos de degradación
proteolítica, que aún son reconocidos por los medios diagnósticos o
por ligandos dirigidos específicamente contra el correspondiente
péptido de longitud completa.
Se conocen ejemplos de variantes. P.ej. se han
descrito variantes concretas de NT-proANP y NT-
proBNP y métodos para su medición (Ala-Kopsala, M.,
Magga, J., Peuhkurinen, K. y otros (2004): La heterogeneidad
molecular como principal impacto en la medición de fragmentos
N-terminales circulantes de los péptidos
natriuréticos de tipo A y tipo B. Clinical Chemistry, vol.
50(9), 1576-1588).
En el presente contexto el término
"variante" también se refiere a las variantes obtenidas por
corte y empalme. Por ejemplo, las variantes conocidas de corte y
empalme del PlGF son PlGF-1 (de 149 aminoácidos),
PlGF-2 (de 170 aminoácidos) y PlGF-3
(de 221 aminoácidos) (ver p.ej. Cai, J., Ahmad, S., Jiang, W.G.,
Huang, J. y otros (2003). La activación del receptor 1 del factor de
crecimiento endotelial vascular favorece la angiogénesis y la
expresión de
Bcl-2 en células endoteliales mediante el sistema fosfatidilinositol 3-quinasa. Diabetes, vol. 52, p. 2959-2968).
Bcl-2 en células endoteliales mediante el sistema fosfatidilinositol 3-quinasa. Diabetes, vol. 52, p. 2959-2968).
El término "variante" también se refiere a
un péptido modificado postranslacionalmente - por ejemplo
glicosilado o fosforilado. Una "variante" también es un
péptido que se ha modificado después de recoger la muestra, por
ejemplo mediante la unión covalente o no covalente de un marcador -
sobre todo un marcador radioactivo o fluorescente - al péptido.
En otra forma de ejecución la presente invención
se refiere a la medición del nivel de PlGF o de una de sus
variantes PlGF-1, PlGF-2 o
PlGF-3, y además a la medición del nivel de una
hormona cardiaca y/o de un marcador de la activación de las
plaquetas.
En el marco de la presente invención se ha
encontrado que, como marcadores bioquímicos o moleculares, las
hormonas cardiacas - particularmente la NT-proBNP -
son indicativas en gran medida de una complicación cardiovascular,
sobre todo de una enfermedad cardiaca, en pacientes diabéticos.
Los pacientes afectados de enfermedades
cardiacas pueden sufrir una angina de pecho estable (SAP) o
síndromes coronarios agudos (ACS). Los pacientes de ACS pueden
presentar una angina de pecho estable inestable (UAP) o puede
tratarse de personas que ya han padecido un infarto de miocardio
(MI). El MI puede ser con o sin elevación ST. Un MI puede ir
seguido de una disfunción ventricular izquierda (LVD). Por último
los pacientes con LVD sufren un fallo cardiaco congestivo (CHF),
que tiene una tasa de mortalidad de aproximadamente un 15%.
Las enfermedades cardiacas se han clasificado
según un sistema funcional de la New York Heart Association (NYHA).
Los pacientes de clase I no tienen ningún síntoma evidente de
enfermedad cardiaca. Su actividad física no está limitada y la
actividad física normal no causa excesiva fatiga, palpitaciones o
disnea (respiración deficiente). Los pacientes de clase II tienen
una ligera limitación de la actividad física. Se encuentran bien en
reposo, pero la actividad física normal les produce fatiga,
palpitaciones o disnea. Los pacientes de clase III presentan una
marcada limitación de la actividad física. Están bien en reposo,
pero una actividad inferior a la ordinaria les produce fatiga,
palpitaciones o disnea. Los pacientes de clase IV son incapaces de
desarrollar cualquier actividad física sin malestar. Presentan
síntomas de insuficiencia cardiaca en reposo. Si intentan cualquier
esfuerzo físico aumenta el malestar.
Por consiguiente los pacientes puede dividirse
en personas que no muestran ningún síntoma clínico y personas con
síntomas (p.ej. disnea).
Otra característica de las enfermedades
cardiacas puede ser la "fracción de eyección ventricular
izquierda" (LVEF), también conocida como "fracción de
eyección". Las personas con el corazón sano suelen tener una LVEF
inalterada, generalmente superior al 50%. La mayoría de personas
con insuficiencia cardiaca sistólica sintomática tienen en general
una LVEF inferior al 40% o menos. Como consecuencia de una LVEF
disminuida pueden aparecer complicaciones secundarias, p.ej.
congestión pulmonar o pulmón congestivo.
La enfermedad cardiaca también puede ser
resultado de una macroangiopatía diabética. La macroangiopatía
diabética es similar a la arteriosclerosis del paciente no
diabético. Sin embargo es más fuerte y se manifiesta antes y con
mayor frecuencia. Por tanto la "enfermedad cardiaca" también
está relacionada con la macroangiopatía diabética.
"Enfermedad cardiaca" se refiere en
concreto a insuficiencia cardiaca coronaria, SAP, ACS, UAP, MI, MI
con elevación ST, MI sin elevación ST, LVD o CHF.
"Enfermedad cardiaca" se refiere más en
concreto a ACS, UAP, MI, MI con elevación ST, MI sin elevación ST,
LVD o CHF.
Una enfermedad cardiaca puede originar síntomas,
particularmente síntomas conforme a las clases NYHA
II-IV, sobre todo conforme a las clases NYHA
III-IV.
Una enfermedad cardiaca puede estar relacionada
con una LVEF del 40% o menos.
Una enfermedad cardiaca puede ser
"compensada" o "descompensada". Compensada significa que
aún pueden satisfacerse las necesidades corporales de oxígeno
normales, mientras que descompensada indica que ya no se satisfacen
las necesidades corporales de oxígeno normales.
Las hormonas cardiacas según la presente
invención comprenden péptidos natriuréticos, urotensina y variantes
de las mismas. En concreto las hormonas cardiacas según la presente
invención son péptidos natriuréticos. En el marco de la presente
invención también se tiene en cuenta el aprovechamiento de las
combinaciones de cualquier hormona cardiaca o péptido natriurético
como marcadores bioquímicos.
Los péptidos natriuréticos según la presente
invención incluyen los de tipo ANP y BNP y variantes de los mismos
(ver p.ej. Bonow, R.O. (1996). Nuevos conocimientos sobre los
péptidos natriuréticos cardiacos. Circulation 93:
1946-1950).
1946-1950).
Los péptidos del tipo ANP incluyen
pre-proANP, proANP, NT-proANP, ANP y
variantes de los mismos.
Los péptidos del tipo BNP incluyen
pre-proBNP, proBNP, NT-proBNP, BNP y
variantes de los mismos.
El término "variantes" debe entenderse tal
como se ha definido anteriormente en esta descripción.
El pre-propéptido (de 134
aminoácidos en el caso del pre-proBNP) comprende un
péptido señal corto que se escinde enzimáticamente, liberando el
propéptido (de 108 aminoácidos en el caso del proBNP). El propéptido
se divide a su vez en un propéptido N-terminal
(NT-propéptido, de 76 aminoácidos en el caso del
NT-proBNP) y la hormona activa (de 32 aminoácidos
en el caso del BNP, de 28 aminoácidos en el caso del ANP).
Los péptidos natriuréticos preferidos según la
presente invención son NT-proANP, ANP,
NT-proBNP, BNP y sus variantes. ANP y BNP son las
hormonas activas y tienen una vida media menor que sus complementos
inactivos
NT-proANP y NT-proBNP.
NT-proANP y NT-proBNP.
Por lo tanto, en función del lapso de tiempo que
sea de interés, puede resultar ventajosa la medición de las formas
activas o inactivas. Los péptidos natriuréticos máximamente
preferidos según la presente invención son los del tipo BNP y sus
variantes, sobre todo el NT-proBNP y sus
variantes.
Tal como se ha mencionado arriba, la presente
invención se refiere a la medición del nivel de PlGF, o de una de
sus variantes PlGF-1, PlGF-2 o
PlGF-3, y además a la medición del nivel de una
hormona cardiaca y/o de un marcador de la activación de
plaquetas.
Así pues, la presente invención también se
refiere a la medición adicional del nivel de un marcador de la
activación de plaquetas, para diagnosticar una complicación
cardiovascular, sobre todo para diagnosticar la activación de
plaquetas.
Así pues, la presente invención también se
refiere a la "activación de plaquetas". Según la presente
invención "activación de plaquetas" se refiere a cualquier
episodio trombótico, incluyendo activación de plaquetas, agregación
de plaquetas, formación y propagación de trombos. Estos mecanismos
biológicos son representativos del riesgo de que una placa
fragilizada se rompa, causando una oclusión vascular reversible
(UAP) o una oclusión vascular irreversible (AMI) capaz de provocar
una disfunción ventricular izquierda (LVD), un fallo cardiaco
congestivo (CHF) y la muerte.
\newpage
Por tanto los marcadores de la activación de
plaquetas también permiten diagnosticar la agregación de plaquetas,
la formación y propagación de trombos, el riesgo de rotura de una
placa que se haya vuelto vulnerable, UAP y AMI.
Los marcadores preferidos de la activación de
plaquetas son el sCD40L (ligando soluble del CD40), vWF (factor de
von Willebrand) y variantes de los mismos. El marcador
principalmente preferido para la activación de plaquetas es el
sCD40L y sus variantes. El término "variantes" debe entenderse
tal como se ha definido anteriormente en esta descripción.
El sCD40L (y sus variantes) puede ser
"libre" o estar unido a trombocitos. En el suero sanguíneo se
mide tanto el libre sCD40L como el que va unido a los trombocitos,
pero en el plasma sanguíneo solo se mide sCD40L "libre". En la
presente invención se prefiere medir el nivel de sCD40L libre.
Preferiblemente el PlGF, o una de sus variantes
PlGF-1, PlGF-2 o
PlGF-3, y/o el(los) marcador(es) de la
activación de plaquetas se miden en combinación con una hormona
cardiaca. La medición de los distintos tipos de marcadores puede
ayudar a confirmar el diagnóstico de una complicación cardiovascular
y permite clasificarla como enfermedad cardiaca, microangiopatía o
caracterizada por activación de plaquetas.
Así pues, la presente invención y sus varias
formas de ejecución no solo permiten diagnosticar la
microangiopatía, sino también clasificar la insuficiencia cardiaca
o la activación de plaquetas.
El especialista en la materia ya sabe que
"enfermedad cardiaca", "microangiopatía" y "activación
de plaquetas" no son desarreglos completamente independientes,
sino que están interrelacionados. Así, por ejemplo, la activación
de plaquetas puede provocar eventualmente oclusión arterial e
insuficiencia cardiaca. Por tanto la presente invención se refiere
al diagnóstico de la característica predominante, estado y/o
gravedad de la microangiopatía.
Los métodos de la presente invención también
pueden ir acompañados por la medición de uno o más marcadores
escogidos del grupo formado por CRP, hsCRP, IL-6 o
sus variantes respectivas, glucosa, HbAlc, CML
(N-\varepsilon-(carboximetil)-lisina) y AGEs (productos finales de la glicosilación avanzada).
(N-\varepsilon-(carboximetil)-lisina) y AGEs (productos finales de la glicosilación avanzada).
La CRP (proteína C reactiva), la hsCRP (proteína
C reactiva de alta sensibilidad), la IL-6
(interleucina-6) y sus respectivas variantes
indican la presencia de inflamación en general. Los mayores niveles
de estos marcadores en el suero sanguíneo también son indicativos
de procesos inflamatorios en el sistema cardiovascular. Así pues,
los niveles elevados de estos marcadores indican la presencia o el
riesgo de complicaciones cardiovasculares. Por consiguiente la
medición de CRP, hsCRP, IL-6 o de una de sus
variantes puede utilizarse en combinación con otros marcadores
conformes a la presente invención, para diagnosticar la
microangiopatía o el riesgo de padecerla.
Los mayores niveles de glucosa, HbAlc, AGEs o
CML indican principalmente que el paciente necesita un mejor
control del nivel de azúcar en sangre.
La medición del nivel de glucosa se emplea
rutinariamente para determinar el nivel real de azúcar en la sangre
de un paciente diabético.
Midiendo HbAlc, CML o AGEs se puede obtener
información sobre el control de azúcar en sangre a medio o corto
plazo.
La HbAlc es una forma glicosilada de la
hemoglobina. Cuanto menor es el nivel de HbAlc mejor es nivel de
azúcar en sangre del paciente diabético controlado.
El producto de glicoxidación CML
(N-\varepsilon-(carboximetil)-lisina)
es el resultado de incubar largo tiempo proteínas con glucosa. De
manera análoga a la HbAlc, un bajo nivel de CML indica un buen
control de azúcar en sangre del paciente diabético controlado.
Los AGEs (productos finales de glicosilación
avanzada) también son el resultado de la incubación de proteínas
con glucosa durante un tiempo prolongado. De modo similar a HbAlc y
CML, un bajo nivel de AGEs indica un buen control del nivel de
azúcar en la sangre del paciente diabético. Además se ha sugerido
que los niveles altos de AGEs están relacionados con la
insuficiencia cardiaca coronaria en paciente con diabetes de tipo 2
(Kilhovd, B.K. otros (1999). Los niveles en suero de productos
finales de glicosilación avanzada son mayores en los pacientes con
diabetes de tipo 2 e insuficiencia cardiaca coronaria. Diabetes Care
[Cuidado de la diabetes], vol. 22(9), p.
1543-1548). Por tanto la medición de los AGEs puede
usarse en combinación con otros marcadores según la presente
invención, para diagnosticar la microangiopatía o el riesgo de
padecerla.
Asimismo los métodos de la presente invención
pueden ir acompañados por la medición de uno o más marcadores
escogidos del grupo formado por: proteína plasmática A asociada al
embarazo (PAPP-A), IL-8,
IL-10, interleucina-18
(IL-18/IL-18b), albúmina modificada
por isquemia (IMA), troponina cardiaca I (cTnI), troponina cardiaca
T (cTnT), ICAM-1 (molécula de adhesión
intercelular-1), VCAM-1 (molécula de
adhesión vascular-1), proteína ligadora de ácido
graso (FABP), E-selectina,
P-selectina, fibrinógeno, amiloide sérico A (SAA),
CK-MB (creatina kinasa
muscular-cerebral), MPO (mieloperoxidasa), LpPLA2
(fosfolipasa A2 asociada a lipoproteínas), GP-BB
(glucógeno fosforilasa isoenzima BB), IL1RA, TAFI (inhibidor de
fibrinólisis activado por trombina), fibrina soluble,
anti-oxLDL (anticuerpos contra lipoproteína de baja
densidad oxidada), MCP-1 (proteína-1
quimiotrópica de monocitos), factor tisular procoagulante (TF),
MMP-9 (metaloproteinasa matricial),
Ang-2 (angiopoyetina-2), bFGF
(factor de crecimiento fibroblástico básico), VLDL (lipoproteína de
muy baja densidad), PAI-1
(inhibidor-1 del activador del plasminógeno).
El método según la presente invención incluye la
etapa de diagnóstico de riesgo, comparando el nivel medido con los
niveles conocidos (niveles de referencia) asociados a diferentes
grados de riesgo en un paciente.
La persona experimentada en la materia es capaz
de determinar los niveles conocidos de marcadores relacionados con
la "presencia" o "riesgo" de padecer microangiopatía.
Estos niveles pueden ser determinados por métodos bien conocidos,
tal como se expone p.ej. en los ejemplos 1 y 2 o en las fig. 1 a 7.
Por ejemplo, la mediana de los niveles medidos en una población de
pacientes, en concreto de pacientes diabéticos, puede utilizarse
para distinguir entre un paciente sin
micro-angiopatía y otro que la sufre o corre el
riesgo de sufrirla. La valoración de los niveles en más pacientes,
p.ej. en estudios de cohortes, puede ayudar a refinar los niveles
de referencia (es decir, los niveles conocidos) y a distinguir entre
diferentes grados de gravedad de la microangiopatía o diferentes
grados de riesgo, tales como "alto" o "muy alto".
Según la presente invención, el término
"presencia" se refiere en este contexto a la probabilidad de
existencia de microangiopatía en un paciente dado. El término
"riesgo" se refiere a la probabilidad de que un paciente
contraiga micro-angiopatía en el futuro. "Sin
riesgo" significa que aparentemente no hay peligro de padecer
microangiopatía en el futuro.
Los niveles de referencia abajo indicados solo
pueden servir como pauta inicial para diagnosticar el riesgo de un
paciente. Por ejemplo, el riesgo de un determinado paciente también
depende de la capacidad sobrante de bombeo del corazón del paciente
en concreto.
La persona experimentada en la materia también
es capaz de determinar otros niveles de referencia, partiendo de
los ejemplos mostrados más adelante.
El valor de un nivel de referencia también
depende de la sensibilidad o especificidad deseada para el
diagnóstico. A mayor sensibilidad, menor especificidad del
diagnóstico y viceversa. Por ejemplo, un elevado nivel de referencia
de NT-proBNP incrementará la especificidad, pero
puede llevar a una merma de sensibilidad del diagnóstico de la
presencia o del riesgo de padecer microangiopatía.
Característicamente, un nivel de PlGF en plasma
menor de 10 pg/ml, sobre todo menor de 5 pg/ml, está relacionado
con la ausencia del riesgo de padecer microangiopatía.
Característicamente, un nivel de PlGF en plasma
mayor de 10 pg/ml, en concreto mayor de 15 pg/ml, sobre todo mayor
de 20 pg/ml, está relacionado con un riesgo de padecer
micro-angiopatía.
Cuanto mayor sea el nivel de PlGF medido mayor
será el riesgo del paciente. P.ej. un nivel mayor de 25 pg/ml indica
un alto riesgo y un nivel mayor de 30 pg/ml indica un riesgo muy
alto.
Característicamente, un nivel de
NT-proBNP en plasma menor de 33 pg/ml, en concreto
menor de 20 pg/ml, sobre todo menor de 15 pg/ml, está relacionado
con la ausencia de riesgo de padecer microangiopatía.
Característicamente, un nivel de
NT-proBNP en plasma mayor de 33 pg/ml, en concreto
mayor de 125 pg/ml, sobre todo mayor de 500 pg/ml, está relacionado
con un riesgo de padecer microangiopatía.
Cuanto mayor es el nivel de
NT-proBNP medido mayor es el riesgo del paciente.
P.ej. un nivel mayor de
1000 pg/ml indica un alto riesgo y un nivel mayor de 5000 pg/ml indica un riesgo muy alto.
1000 pg/ml indica un alto riesgo y un nivel mayor de 5000 pg/ml indica un riesgo muy alto.
Una vez diagnosticado, el riesgo puede tener
consecuencias para el tratamiento subsiguiente, tal como se describe
más adelante. En concreto la presente invención permite
individualizar el tratamiento según la característica o
manifestación predominante de la diabetes. Por lo tanto la presente
invención es valiosa para los métodos de tratamiento. En este
contexto "tratamiento" se refiere a cualquier medida capaz de
alterar el estado patofisiológico de una persona e incluye, por
ejemplo, la administración de fármacos y la intervención
quirúrgica.
Cuando un método según la presente invención no
indica riesgo, el tratamiento puede continuarse del modo
planeado.
Cuando un método según la presente invención
indica un riesgo se puede adaptar el tratamiento. Preferiblemente,
el tratamiento iría acompañado de la medición ulterior del nivel de
los marcadores de la presente invención y del diagnóstico posterior
por medio de electrocardiografía, ecocardiografía o cualquier otro
método adecuado y conocido del especialista en la materia. La
adaptación del tratamiento puede incluir asimismo medidas tales
como la limitación de la ingesta de sal, ejercicio normal moderado,
evitación de fármacos antiinflamatorios no esteroides, inmunización
gripal y neumocócica, tratamiento quirúrgico (p.ej.
revascularización, dilatación con balón, colocación de cánula
vascular, cirugía bypass), administración de fármacos tales como
diuréticos (incluyendo la coadministración de más de un diurético),
inhibidores de ACE (enzima convertidora de angiotensina),
bloqueadores adrenérgicos \beta, antagonistas de aldosterona,
antagonistas de calcio (bloqueadores del canal de calcio),
bloqueadores del receptor de angiotensina, digitalis, y cualquier
otra medida conocida y considerada apropiada por la persona
experimentada en la materia.
Si un método según la presente invención indica
que hay enfermedad cardiaca, entonces el tratamiento estaría
enfocado a la terapia cardiaca, concretamente a la administración de
inhibidores de ACE y de bloqueadores adrenérgicos \beta. Además
sería deseable evitar la medicación cardiotóxica y el incremento del
volumen sanguíneo. También se puede considerar la terapia de
revascularización (p.ej. PCTI (intervención terapéutica
percutánea), dilatación con balón, implantación de cánula vascular,
cirugía bypass).
Los inhibidores de ACE son conocidos del
especialista. Como ejemplos cabe citar benazepril, captopril,
cilazapril, enalapril, fosinopril, lisinopril, moexipril,
perindopril, quinapril, ramipril, espirapril y trandolapril.
Los inhibidores de ACE también pueden tener la
capacidad de ralentizar la progresión de la nefropatía
diabética.
Los bloqueadores adrenérgicos \beta (no
selectivos y selectivos \beta_{1}) son conocidos del
especialista en la materia. Como ejemplos cabe mencionar
acetobutolol, alprenolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol,
bupranolol, carazolol, carteolol, carvedilol, celiprolol,
metipranolol, metoprolol, nadolol, nebivolol, oxprenolol,
penbutolol, pindolol, propranolol, sotalol, tanilolol y
timolol.
En este contexto "medicación cardiotóxica"
se refiere en concreto a la administración de fármacos que pueden
aumentar el volumen sanguíneo, p.ej. tiazolidinedonas como
glitazona, mediona, pioglitazona, rosiglitazona, troglitazona.
Cuando un método según la presente invención
indica que hay microangiopatía, el enfoque del tratamiento será la
medicación con fármacos "reductores de lípidos" (p.ej.
estatinas) y/o antiinflamatorios. También puede considerarse la
administración de inhibidores o antagonistas del receptor de
glicoproteína IIb/IIIa plaquetaria.
Los fármacos reductores de lípidos son conocidos
de la persona experta en la materia. Como ejemplos pueden citarse
los fibratos (p.ej. bezofibrato, clofibrato, etofibrato, clofibrato
de etofilina, fenofibrato, gemfibrozil), ácido nicotínico y
análogos (p.ej. ácido nicotínico, acipimox), estatinas (p.ej.
simvastatina, lovastatina, pravastatina, fluvastatina,
atorvastatina, cerivastatina), resinas de intercambio iónico (p.ej.
colestiramina, colestipol), probucol y sitosterol. En este contexto
como fármacos reductores de lípidos se prefieren las estatinas.
Es importante observar que varios fármacos
reductores de lípidos, en particular las estatinas, también tienen
efectos antiinflamatorios, con lo cual resultan adecuados para
tratar la microangiopatía o la activación de plaquetas.
Los inhibidores o antagonistas del receptor de
glicoproteína IIb/IIIa plaquetaria son conocidos del especialista
en la materia. Como ejemplos cabe citar anticuerpos monoclonales o
policlonales, tirofiban, eptifibatide y similares. Según una forma
de ejecución preferida de la presente invención el inhibidor del
receptor de glicoproteína IIb/IIIa es un anticuerpo, concretamente
el anticuerpo conocido como abciximab. El abciximab es un fragmento
Fab de anticuerpo que se puede adquirir de Centocor Europe BV con la
denominación ReoPro.
Cuando un método según la presente invención
indica que hay activación de plaquetas, el enfoque del tratamiento
será la medicación con inhibidores de la agregación de trombocitos y
fármacos reductores de lípidos (p.ej. estatinas).
Los inhibidores de la agregación de trombocitos
son conocidos del especialista en la materia y comprenden fármacos
capaces de inhibir la agregación de trombocitos (plaquetas). Como
ejemplos cabe citar los inhibidores de ciclooxigenasa, en concreto
COX-1 (p.ej. ácido acetilsalicílico); los
inhibidores de ADP (que inhiben la fijación de adenosín fosfato a
sus receptores sobre los trombocitos, p.ej. ticlopidin o
clopidogrel); los inhibidores o antagonistas del receptor de la
glicoproteína IIb/IIIa plaquetaria (véase arriba); dipiridamol;
sulfinpirazona; dextrano 40.
Cuando un método según la presente invención
indica que el nivel de azúcar en sangre no está suficientemente
controlado, el paciente podrá ser tratado según cualquier método de
control de azúcar en sangre conocido y considerado apropiado en el
estado técnico. Como ejemplos cabe mencionar la administración de
fármacos que aumenten la absorción del azúcar de la sangre por el
tejido objetivo o la administración de fármacos que estimulen la
secreción de insulina por las células pancreáticas beta. Como
ejemplos bien conocidos de estos fármacos cabe citar la insulina y
las tiazolidinedonas.
Como se ha dicho anteriormente la diabetes puede
manifestarse de diversas formas, entendiendo como manifestación que
la enfermedad se hace evidente por una complicación o una
característica especial, p.ej. complicación cardiovascular,
insuficiencia cardiaca, microangiopatía, activación de plaquetas,
inflamación o control insuficiente del nivel de azúcar en sangre.
Debido a diferencias individuales como las de tipo genético, a
distintos estilos de vida (p.ej. abuso del alcohol o de la
nicotina) o a un diferente historial de la enfermedad, la diabetes
puede manifestarse mediante distintas complicaciones o
características en cada paciente. Por ejemplo, un determinado
paciente puede sufrir microangiopatía o nefropatía diabética,
mientras que otro paciente puede sufrir insuficiencia cardiaca.
Poniendo otro ejemplo, puede ser que un paciente cuyo nivel de
azúcar en sangre esté insuficientemente controlado no sufra
microangiopatía por no haber padecido diabetes durante mucho tiempo,
mientras que un paciente diabético desde hace muchos años puede
sufrir microangiopatía aunque su nivel de azúcar en sangre esté
relativamente bien controlado.
Por tanto un método según la presente invención
permite diagnosticar adicionalmente una manifestación - sobre todo
la manifestación predominante de la diabetes - perteneciente al
grupo formado por complicación cardiovascular, insuficiencia
cardiaca, microangiopatía, activación de plaquetas, inflamación y
control insuficiente del nivel de azúcar en sangre.
De lo anterior es evidente que la presente
invención se refiere también a un método para determinar
manifestaciones, sobre todo la manifestación predominante de la
diabetes en un paciente, que comprende las siguientes etapas:
- a)
- medir in vitro el nivel o los niveles de al menos el PlGF o de una de sus variantes PlGF-1, PlGF-2 o PlGF-3 en una muestra del paciente, y
- b)
- con preferencia medir adicionalmente el nivel o los niveles de al menos una hormona cardiaca o de una variante de la misma en una muestra del paciente, y
- c)
- con preferencia medir adicionalmente el nivel o los niveles de al menos un marcador de la activación de plaquetas o de una variante del mismo en una muestra del paciente, y
- d)
- con preferencia medir adicionalmente el nivel o los niveles de al menos un marcador escogido del grupo formado por CRP, hsCRP, IL-6 o una variante del mismo en una muestra del paciente, y
- e)
- con preferencia medir adicionalmente el nivel o los niveles de al menos un marcador escogido del grupo formado por glucosa, HbAlc, CML y AGE en una muestra del paciente, y
- f)
- diagnosticar la manifestación, comparando el nivel o los niveles medidos con los niveles conocidos asociados a la manifestación, de modo que
- g)
- el nivel del marcador o de los marcadores según las etapas a) hasta c) indica que la manifestación es una complicación cardiovascular o el riesgo de padecerla, y
- h)
- el nivel del marcador o de los marcadores según la etapa a) indica que la manifestación es microangiopatía o el riesgo de padecerla, y
- i)
- el nivel del marcador o de los marcadores según la etapa b) indica que la manifestación es insuficiencia cardiaca o el riesgo de padecerla, y
- j)
- el nivel del marcador o de los marcadores según la etapa c) indica que la manifestación es activación de plaquetas o el riesgo de padecerla, y
- k)
- el nivel del marcador o de los marcadores según la etapa d) indica que la manifestación es inflamación o el riesgo de padecerla, y
- l)
- el nivel del marcador o de los marcadores según la etapa e) indica que la manifestación es control insuficiente del nivel de azúcar en sangre.
Tal como se ha dicho anteriormente el nivel del
marcador o de los marcadores según la etapa a) también indica que la
manifestación es nefropatía diabética, retinopatía diabética,
hipoxia de las extremidades o el riesgo de padecerlas.
Asimismo, tal como se ha dicho anteriormente, el
nivel del marcador o de los marcadores según la etapa c) también
indica que la manifestación es agregación de plaquetas, formación de
trombos, propagación de trombos, riesgo de rotura de una placa que
se haya vuelto vulnerable, UAP, AMI o riesgo de tener agregación de
plaquetas, formación de trombos, propagación de trombos, peligro de
rotura de una placa que se haya vuelto vulnerable, UAP o AMI.
La determinación será mejor cuanto mayor sea el
número de marcadores medidos según las etapas preferidas
b) hasta e) del método anterior.
b) hasta e) del método anterior.
La diagnosis conforme a la presente invención se
realiza preferentemente con el uso de medios diagnósticos. Un medio
diagnóstico es cualquier medio que permite medir el nivel, la
cantidad o la concentración de una sustancia de interés,
concretamente de un péptido o polipéptido de interés.
Los péptidos o polipéptidos de interés según la
presente invención son los marcadores bioquímicos indicados en esta
descripción de patente.
Métodos y medios diagnósticos significa que,
para determinar los niveles de los respectivos péptidos, se pueden
usar aquellos que son conocidos del especialista. Estos métodos
incluyen los basados en ELISA-microplaca, los
inmunoensayos totalmente automatizados o robotizados (que pueden
adquirirse por ejemplo a Elecsys® analizadores), el CBA (un ensayo
enzimático de fijación de cobalto, que puede adquirirse por ejemplo
a Roche-Hitachi® analizadores) y los ensayos de
aglutinación con látex (que se pueden adquirir por ejemplo a
Roche-Hitachi® analizadores).
\global\parskip0.900000\baselineskip
El especialista en la materia también está
familiarizado con distintos métodos de medición del nivel de un
péptido o polipéptido. El término "nivel" refiere a la cantidad
o concentración de un péptido o polipéptido en un paciente o en una
muestra extraída del paciente.
Según la presente invención el término
"medición" se refiere a la determinación - preferiblemente
semicuantitativa o cuantitativa - de la cantidad o de la
concentración del ácido nucleico, péptido, polipéptido u otra
sustancia de interés. La medición puede hacerse directa o
indirectamente. Medición indirecta incluye la determinación de
respuestas celulares, de ligandos fijados, de marcadores o de
productos de reacción enzimática.
En el contexto de la presente invención cantidad
también se refiere a concentración. Evidentemente la concentración
de una sustancia de interés se puede calcular partiendo de su
cantidad total en una muestra de tamaño conocido y viceversa.
La medición se puede hacer por cualquier método
conocido del estado técnico, como por ejemplo ensayos celulares,
ensayos enzimáticos o ensayos basados en la fijación de ligandos.
Los métodos preferidos se describen a continuación.
Según otra forma de ejecución preferida, el
método para medir el nivel de un péptido o polipéptido de interés
comprende las etapas de (a) poner en contacto un péptido o
polipéptido con un substrato adecuado durante un periodo adecuado
de tiempo, (b) medir la cantidad de producto.
Según otra forma de ejecución preferida, el
método para medir el nivel de un péptido o polipéptido de interés
comprende las etapas de (a) poner en contacto un péptido o
polipéptido con un ligando de fijación específica, (b) eliminar el
ligando no fijado (opcionalmente), (c) medir la cantidad de ligando
fijado.
Preferiblemente el péptido o polipéptido está
contenido en una muestra, especialmente en un fluido corporal o en
una muestra de tejido, y la cantidad del péptido o polipéptido se
mide en la muestra.
Los péptidos o los polipéptidos (proteínas) se
miden en sangre, suero sanguíneo o plasma sanguíneo in
vitro.
La muestra es de sangre, de suero sanguíneo o de
plasma sanguíneo.
Si es preciso las muestras se pueden seguir
procesando. En concreto los ácidos nucleicos, los péptidos o
polipéptidos pueden purificarse a partir de la muestra según los
métodos conocidos del estado técnico, incluyendo los de filtración,
centrifugación o extracción, como por ejemplo la extracción con
cloroformo/fenol.
Otros métodos de medición preferidos pueden
incluir la determinación de la cantidad de un ligando que se fija
específicamente al péptido o polipéptido de interés. Conforme a la
presente invención, la fijación incluye tanto la de tipo covalente
como la no covalente.
Según la presente invención un ligando puede ser
cualquier péptido, polipéptido, ácido nucleico u otra sustancia que
se fije al péptido o polipéptido de interés. Es bien sabido que los
péptidos o polipéptidos obtenidos o purificados a partir del cuerpo
humano o animal pueden ser modificados, p.ej. mediante
glicosilación. Un ligando adecuado conforme a la presente invención
puede fijarse al péptido o polipéptido por tales sitios.
Es preferible que el ligando se fije
específicamente al péptido o polipéptido objeto de la medición.
"Fijación específica" significa según la presente invención
que el ligando no debe fijarse sustancialmente a otro péptido,
polipéptido o sustancia existente en la muestra investigada
("reacción cruzada"). Preferentemente, la proteína o isoforma
específicamente unida debería fijarse con una afinidad al menos 3
veces mayor, preferiblemente al menos 10 veces mayor, sobre todo al
menos 50 veces mayor, que con cualquier otro péptido o polipéptido
relevante.
La fijación no específica puede tolerarse, sobre
todo cuando el péptido o polipéptido investigado aún puede
distinguirse y medirse inequívocamente, p.ej. por separación según
su tamaño (p.ej. por electroforesis) o por su mayor abundancia
relativa en la muestra.
La fijación del ligando se puede medir por
cualquier método conocido del estado técnico. El método es
preferentemente semicuantitativo o cuantitativo. Los métodos
adecuados se describen a continuación.
La fijación del ligando se puede medir primero
directamente, p.ej. por RMN o resonancia de plasmón superficial.
En segundo lugar, si el ligando también sirve de
substrato de una actividad enzimática del péptido o polipéptido de
interés, se puede medir un producto de reacción enzimática (p.ej. la
cantidad de una proteasa puede medirse determinando la cantidad de
substrato dividido, p.ej. en un ensayo Western Blot).
Para medir los productos de una reacción
enzimática la cantidad de substrato es preferiblemente saturante.
También se puede marcar el substrato antes de la reacción con un
marcador detectable. Preferentemente, la muestra se pone en
contacto con el substrato durante un periodo de tiempo adecuado, lo
cual hace referencia al tiempo necesario para dar lugar a una
cantidad de producto detectable, preferiblemente medible. En vez de
medir la cantidad de producto se puede determinar el tiempo
necesario para la aparición de una cantidad de producto dada (p.ej.
detectable).
\global\parskip1.000000\baselineskip
En tercer lugar, el ligando se puede acoplar de
forma covalente o no covalente a un marcador, permitiendo la
detección y medición del ligando.
El marcaje puede hacerse por métodos directos o
indirectos. El marcaje directo supone el acoplamiento (covalente o
no covalente) del marcador directamente al ligando. El marcaje
indirecto implica la fijación (covalente o no covalente) de un
ligando secundario al primer ligando. El ligando secundario debe
fijarse específicamente al primer ligando. Dicho ligando secundario
puede acoplarse a un marcador adecuado y/o constituir la diana
(receptor) de la fijación de un ligando terciario al ligando
secundario. El uso de un ligando secundario, terciario o incluso de
mayor orden es frecuente para incrementar la señal. Como ligandos
secundarios y de mayor orden cabe citar los anticuerpos, los
anticuerpos secundarios y el sistema bien conocido
estreptavidina-biotina (de Laboratorios Vector
Inc.).
El ligando o el substrato también se pueden
"etiquetar" con una o más etiquetas, como es sabido del estado
técnico. Estas etiquetas pueden ser luego dianas de ligandos de
orden superior. Como etiquetas apropiadas cabe mencionar: biotina,
digoxigenina, His-Tag,
glutatión-S-transferasa, FLAG, GFP,
myc-tag, hemaglutinina del virus gripal A (HA),
proteína de unión a maltosa y similares. En el caso de un péptido o
polipéptido la etiqueta está acoplada al extremo
N-terminal y/o C-terminal.
Como marcadores son adecuados todos aquellos que
puedan detectarse por un método apropiado. Como marcadores típicos
cabe citar: partículas de oro, gotas de látex, acridan éster,
luminol, rutenio, marcadores enzimáticamente activos, marcadores
radiactivos, marcadores magnéticos (p.ej. "perlas magnéticas",
incluyendo marcadores paramagnéticos y superparamagnéticos) y
marcadores fluorescentes.
Los marcadores enzimáticamente activos
comprenden p.ej. la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa
alcalina, la beta-galactosidasa, la luciferasa y
derivados de las mismas. Como substratos adecuados para la detección
cabe mencionar: di-amino-benzidina
(DAB),
3,3'-5,5'-tetrametilbenzidina,
NBT-BCIP (azul de 4-nitro tetrazolio
cloruro y
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato,
disponible como solución lista para el uso, de la firma Roche
Diagnostics),
CDP-Star® (Amersham Biosciences), ECF® (Amersham Biosciences). Una combinación adecuada enzima-substrato puede dar como resultado un producto de reacción coloreado, una fluorescencia o una quimioluminiscencia, que pueden medirse con los métodos conocidos del estado técnico (empleando p.ej. un film fotosensible o un sistema de cámara adecuado). Para evaluar la reacción enzimática se aplican de manera análoga los criterios indicados anteriormente.
CDP-Star® (Amersham Biosciences), ECF® (Amersham Biosciences). Una combinación adecuada enzima-substrato puede dar como resultado un producto de reacción coloreado, una fluorescencia o una quimioluminiscencia, que pueden medirse con los métodos conocidos del estado técnico (empleando p.ej. un film fotosensible o un sistema de cámara adecuado). Para evaluar la reacción enzimática se aplican de manera análoga los criterios indicados anteriormente.
Los típicos marcadores fluorescentes incluyen
proteínas fluorescentes (como GFP y sus derivados), Cy3, Cy5, rojo
de Texas, fluoresceína y colorantes de Alexa (p.ej. Alexa 568).
Otros marcadores fluorescentes pueden adquirirse p.ej. de la firma
Molecular Probes (Oregon). También está contemplado el uso de puntos
cuánticos como marcadores fluorescentes.
Los típicos marcadores radiactivos incluyen
^{35}S, ^{125}I, ^{32}P, ^{33}P y similares. Un marcador
radiactivo puede detectarse por cualquier método conocido y
adecuado, p.ej. un film fotosensible o un equipo de escáner
"phosphor imager".
Los métodos de medición adecuados según la
presente invención también comprenden la precipitación
(concretamente la inmunoprecipitación), la electroluminiscencia
(quimioluminiscencia generada eléctricamente), RIA
(radioinmunoanálisis), ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas), inmunoensayos enzimáticos sandwich, inmunoensayos
quimioluminiscentes sandwich (ECLIA), fluoroinmunoensayo de
disociación aumentada por lantánidos (DELFIA), ensayo de centelleo
por proximidad (SDPA), turbidimetría, nefelometría, turbidimetría o
nefelometría amplificada por látex, inmunoensayos de fase sólida, y
espectrometrías de masas tales como SELDI-TOF,
MALDI-TOF o la electroforesis
capilar-espectrometría de masas
(CE-MS). Otros métodos conocidos del estado técnico
(como electroforesis de gel, electroforesis de gel 2D,
electroforesis en gel de
poli-acrilamida-SDS
(SDS-PAGE), Western Blot) pueden usarse solos o
combinados con el marcaje o con otros métodos de detección
descritos anteriormente.
Como ligandos preferidos cabe citar:
anticuerpos, ácidos nucleicos, péptidos o polipéptidos y aptámeros,
p.ej. aptámeros que se fijan a ácidos nucleicos o a péptidos. Los
métodos para dichos ligandos son bien conocidos en el estado
técnico. Por ejemplo, los proveedores comerciales también ofrecen la
identificación y producción de anticuerpos o aptámeros apropiados.
El especialista en la materia está familiarizado con métodos para
desarrollar derivados de estos ligandos con gran afinidad o
especificidad. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones
aleatorias en los ácidos nucleicos, en los péptidos y en los
polipéptidos. Luego puede ensayarse la fijación de estos derivados
mediante los procedimientos de selección conocidos del estado
técnico, p.ej. librerías de exposición en fago.
Del modo empleado aquí, el término
"anticuerpo" incluye los de tipo policlonal y los de tipo
monoclonal, y también fragmentos de los mismos, como Fv, Fab y
F(ab)_{2}, capaces de fijar antígenos o
haptenos.
En otra forma de ejecución preferida el ligando,
elegido preferentemente del grupo formado por ácidos nucleicos,
péptidos, polipéptidos y con mayor preferencia del grupo formado por
ácidos nucleicos, anticuerpos o aptámeros, se encuentra en una
matriz.
Esta matriz contiene al menos un ligando
adicional que puede dirigirse contra un péptido, un polipéptido o
un ácido nucleico de interés. Dicho ligando adicional también se
puede dirigir contra un péptido, un polipéptido o un ácido nucleico
que no sea de especial interés en el contexto de la presente
invención. La matriz contiene preferiblemente ligandos para al
menos tres, con preferencia al menos cinco, sobre todo al menos ocho
péptidos o polipéptidos de interés en el contexto de la presente
invención.
El término "matriz" se refiere a un soporte
sólido o de consistencia gelatinosa sobre el cual se ligan o se
fijan al menos dos compuestos según una distribución uni-, bi- o
tridimensional. Estas matrices (incluyendo los "chips
genéticos", los "chips proteicos", las matrices de
anticuerpos y similares) son en general conocidas del experto en la
materia y suelen formarse sobre portaobjetos de vidrio de
microscopio especialmente recubiertos, por ejemplo de policatión,
nitrocelulosa o biotina, sobre cubreobjetos y sobre membranas, por
ejemplo membranas a base de nitrocelulosa o de nylon.
La matriz puede incluir un ligando unido o al
menos dos células que expresen respectivamente como mínimo un
ligando.
También se contempla el empleo de "matrices
suspendidas" (Nolan JP, Sklar LA. (2002). Tecnología de la matriz
suspendida: evolución del paradigma de la matriz plana. Trends
Biotechnol. [Tendencias en biotecnología]
20(1):
9-12). En estas matrices suspendidas el soporte, p.ej. una microperla o una microesfera, se halla en suspensión. La matriz está formada por diversas microperlas o microesferas, posiblemente marcadas, que llevan diferentes ligandos.
9-12). En estas matrices suspendidas el soporte, p.ej. una microperla o una microesfera, se halla en suspensión. La matriz está formada por diversas microperlas o microesferas, posiblemente marcadas, que llevan diferentes ligandos.
Los métodos para producir dichas matrices,
basados por ejemplo en la química de fase sólida y en grupos
protectores fotolábiles, son conocidos en general (patente US
5,744,305). Estas matrices también se pueden poner en contacto con
sustancias o librerías de sustancias y analizar su interacción, por
ejemplo para fijación o cambio de confirmación. Por tanto las
matrices que incluyen un péptido o polipéptido, tal como se ha
definido anteriormente, pueden utilizarse para identificar ligandos
que se fijan específicamente a dichos péptidos o polipéptidos.
La fig. 1 muestra un gráfico
Kaplan-Meier del tiempo hasta el primer evento
cardiovascular en pacientes diabéticos de tipo 2 con línea basal de
concentraciones de NT-proBNP en plasma por debajo
(línea de trazos) o encima de la mediana en toda la cohorte. Valor
de P calculado con la prueba de rango logarítmico. Prop. w/o e.,
proporción sin eventos; t, tiempo (meses); NAR, total en riesgo;
bel.med., por debajo del grupo medio; ab.med., por encima del grupo
medio.
La fig. 2 muestra un gráfico
Kaplan-Meier del tiempo hasta la muerte por
insuficiencia cardiaca o hasta el primer ingreso por fallo cardiaco
congestivo en pacientes diabéticos de tipo 2 con línea basal de
concentraciones de
NT-proBNP en plasma por debajo (línea de trazos) o encima de la mediana en toda la cohorte. Valor de P calculado con la prueba de rango logarítmico. Prop. w/o e., proporción sin eventos; t, tiempo (meses); NAR, total en riesgo; bel.med., por debajo del grupo medio; ab.med., por encima del grupo medio.
NT-proBNP en plasma por debajo (línea de trazos) o encima de la mediana en toda la cohorte. Valor de P calculado con la prueba de rango logarítmico. Prop. w/o e., proporción sin eventos; t, tiempo (meses); NAR, total en riesgo; bel.med., por debajo del grupo medio; ab.med., por encima del grupo medio.
La fig. 3 muestra niveles medios de
NT-proBNP en plasma durante el seguimiento en
pacientes con NT-proBNP en plasma por debajo (línea
de trazos) o por encima de la mediana en la cohorte de 160 pacientes
diabéticos de tipo 2 en el estudio Steno-2. conc.,
concentración; t, tiempo (años); ab.med., por encima del grupo
medio; bel.med., por debajo del grupo medio.
La fig. 4 muestra curvas
Kaplan-Meier de mortalidad por todas las causas en
pacientes con nefropatía diabética y una concentración de
NT-proBNP por encima y por debajo del valor mediana
(110 ng/l) - prueba de rango logarítmico, p < 0,0001. Como
comparación se indica en línea delgada la curva para los pacientes
normoalbuminúricos. Prop.d., proporción de muertos; t, periodo de
seguimiento (años); nephrop., nefropatía; normalb.,
normoalbuminuria, NAR, total en riesgo.
La fig. 5 muestra curvas
Kaplan-Meier de mortalidad cardiovascular en
pacientes con nefropatía diabética y una concentración de
NT-proBNP por encima y por debajo del valor mediana
(110 ng/l) - prueba de rango logarítmico,
p < 0,0001. Como comparación se indica en línea delgada la curva para los pacientes normoalbuminúricos. Prop. CVD, proporción de muerte cardiovascular; t, periodo de seguimiento (años); nephrop., nefropatía; normalb., normoalbuminuria, NAR, total en riesgo.
p < 0,0001. Como comparación se indica en línea delgada la curva para los pacientes normoalbuminúricos. Prop. CVD, proporción de muerte cardiovascular; t, periodo de seguimiento (años); nephrop., nefropatía; normalb., normoalbuminuria, NAR, total en riesgo.
La fig. 6 muestra un gráfico
Kaplan-Meier de mortalidad por cualquier causa en la
nefropatía diabética de tipo 1 según PlGF en plasma. Los datos se
recogieron durante el estudio Steno-1 tal como se
describe en el ejemplo 2. 1 - c.s.,
uno menos supervivencia cumulativa; t, tiempo de seguimiento (años).
uno menos supervivencia cumulativa; t, tiempo de seguimiento (años).
La fig. 7 muestra un gráfico
Kaplan-Meier de mortalidad causada por enfermedad
cardiovascular en la nefropatía diabética de tipo 1 según PlGF en
plasma. Los datos se recogieron durante el estudio
Steno-1, tal como se describe en el ejemplo 2. 1 -
c.s. CVD, uno menos supervivencia cumulativa de la mortalidad
causada por enfermedad cardiovascular; t, tiempo de seguimiento
(años).
El fin y los resultados principales del estudio
Steno-1 han sido previamente reportados en detalle
(Gaede, P., Vedel, P., Larsen, N. y otros (2003). Intervención
multifactorial y enfermedad cardiovascular en pacientes diabéticos
de tipo 2. New England Journal of Medicine, vol. 348 (5), p.
383-93). En suma, 160 pacientes diabéticos de tipo
2 microalbuminúricos se dividieron aleatoriamente (n = 80) en un
grupo con tratamiento convencional y otro con tratamiento
multifactorial intensivo centrado en varios factores concomitantes
de riesgo. Los pacientes del grupo de terapia intensiva se trataron
con una introducción gradual de intervenciones farmacológicas o en
el estilo de vida, pensadas para mantener los valores de hemoglobina
glucosilada por debajo del 6,5%, la presión sanguínea inferior a
130/80 mm Hg, los niveles séricos de colesterol total en ayunas por
debajo de 175 mg/dl y los niveles séricos de triglicéridos en
ayunas por debajo de 150 mg/dl. Las intervenciones recomendadas en
el estilo de vida consistieron en disminuir la ingesta de grasa
dietética, practicar con regularidad ejercicio ligero o moderado y
dejar de fumar. A todos los participantes en el grupo de terapia
intensiva se les recomendó tomar pequeñas dosis de aspirina y un
inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), sin tener
en cuenta el nivel de presión sanguínea. El seguimiento promedio
fue de 7,8 años. Durante todo el periodo del estudio el grupo de
tratamiento intensivo tuvo valores marcadamente inferiores de
HbA_{lc}, de los niveles séricos de colesterol total, colesterol
LDL y triglicéridos en ayunas, de la presión sanguínea sistólica y
diastólica, y de la tasa de excreción de albúmina en orina (Gæde,
arriba citado). Estos cambios fueron relacionados con importantes
disminuciones del riesgo de enfermedad macrovascular y microvascular
(53% de reducción relativa del riesgo de enfermedad cardiovascular,
61% de la progresión a nefropatía, 58% de la progresión a
retinopatía y 63% de la progresión a neuropatía autonómica) (Gæde,
arriba citado).
Todos los 160 participantes fueron reclutados
del Steno Diabetes Center durante 1992-93. La
microalbuminuria se definió como una tasa de excreción de albúmina
en orina (AER) de 30-300 mg/24 h en cuatro de seis
muestras de orina de 24 h. La diabetes se definió según los
criterios de la OMS de 1985.
Los criterios de exclusión fueron una edad mayor
de 65 o menor de 40 años; una concentración sérica estimulada de
péptido C menor de 600 pmol/l a los 6 minutos de la inyección
intravenosa de 1 mg glucagón; insuficiencia pancreática o diabetes
causada por pancreatitis; abuso de alcohol; enfermedad renal no
diabética; malignidad; o enfermedad potencialmente mortal con
probabilidad de muerte dentro de 4 años. Se obtuvo el consentimiento
informado de todos los participantes. El expediente cumplía la
declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité ético del
Condado de Copenhage.
En el presente análisis post-hoc
los pacientes se clasificaron en dos grupos, dependiendo de que la
línea basal de NT-proBNP en plasma estuviera por
debajo de la mediana o por encima de los valores medios de la
cohorte.
El principal punto final del estudio era un
conjunto de enfermedades cardiacas, incluyendo mortalidad
cardiovascular, infarto de miocardio no fatal, apoplejía no fatal,
intervenciones coronarias percutáneas, puente arterial coronario
con injerto, cirugía vascular y amputaciones. También se examinó un
punto final secundario, que incluía la mortalidad cardiovascular y
el ingreso por fallo cardiaco congestivo.
Todas las muestras de sangre se tomaron a las 8
h tras un ayuno nocturno. Los pacientes no tomaron sus medicamentos
en la mañana del día de las extracciones de sangre.
Después de haber permanecido los pacientes
reposando en posición supina durante al menos 20 minutos, se tomaron
las muestras de sangre para analizar NT-proBNP en
plasma, se centrifugaron y el plasma se conservó a -80ºC hasta el
análisis. Las concentraciones de NT-proBNP en plasma
se midieron por un inmunoensayo sandwich en un Elecsys 2010 (Roche
Diagnostics, Alemania). La escala analítica abarca de 5 hasta 35000
pg/ml y el coeficiente total de variación es < 0,061 en el
conjunto de muestras de plasma. Para pasar de pg/ml a pmol/l se
multiplica por 0,118. Las muestras de sangre se tomaron al inicio y
a los dos, cuatro y ocho años del seguimiento.
Los grupos se compararon en la línea basal por
análisis de varianza unidireccional o prueba de
Mann-Whitney, siempre que fuera apropiado para
variables numéricas. Para comparar las variables categóricas se
empleó la prueba ji-cuadrado o la prueba exacta de
Fischer.
Como los dos grupos originales de tratamiento
diferían bastante en cuanto al riesgo de enfermedad cardiovascular,
en cada uno de estos grupos se analizó por separado el papel del
NT-proBNP en plasma como marcador de riesgo de las
enfermedades cardiovasculares, empleando la mediana en cada uno de
los grupos originales de tratamiento como valor de corte entre el
grupo situado por debajo de la mediana y el grupo situado por encima
de la mediana, y también en un grupo combinado.
Las curvas correspondientes al tiempo hasta el
primer evento para los puntos finales principales y secundarios se
basaron en el análisis de Kaplan-Meier, y los dos
grupos se compararon usando la prueba de rango logarítmico. Los
índices de riesgo, con intervalos de confianza del 95%, se
calcularon mediante el modelo de regresión de Cox. Los resultados
se presentan tanto desajustados, como formando dos modelos con
ajustes para los factores de riesgo de enfermedad cardiovascular en
los pacientes diabéticos de tipo 2; el modelo 1 con ajustes para la
duración conocida de la diabetes, la enfermedad cardiovascular
conocida en la línea basal, el género y la edad, tal como se ha
indicado previamente, y el modelo 2 con ajustes extras para la
presión sanguínea sistólica y diastólica, la hemoglobina
glucosilada A1c, el contenido sérico de colesterol total, colesterol
HDL, colesterol LDL y triglicéridos en ayunas y la tasa de
excreción de albúmina en orina. Los resultados de la cohorte
combinada también se ajustaron a la asignación del tratamiento
original. Los cambios del nivel de NT-proBNP en
plasma a través del tiempo en cada uno de los dos grupos de
tratamiento se compararon mediante la prueba de Wilcoxon.
\vskip1.000000\baselineskip
El intervalo de los niveles en ayunas del
NT-proBNP en plasma para la línea basal fue de 5
(mínimo valor detectable) hasta 1290 pg/ml, con una mediana de 33,5
pg/ml en toda la cohorte Steno-2, mientras que los
valores del grupo original de terapia intensiva fueron de 5 hasta
1290 (mediana 35,3) pg/ml y en el grupo de terapia convencional de
5 hasta 1134 (mediana 32,0) pg/ml. En la tabla 1 se muestran las
características de la línea basal de ambos grupos. El nivel alto en
la línea basal de NT-proBNP en plasma se relacionó
con mayor duración de la diabetes, mayor edad, mayor presión
sanguínea sistólica y función renal dañada. Análogamente, una
elevada proporción de pacientes del grupo por encima de la mediana
se trató en la línea basal con antagonistas de calcio (tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\hskip0,5cm * Media (ES), \dagger mediana
(intervalo)
Para convertir los valores del colesterol a
mmol/l hay que multiplicar por 0,02586. Para convertir los valores
de los triglicéridos a mmol/l hay que multiplicar por 0,01129. Para
convertir los valores del NT-proBNP a mmol/l hay que
multiplicar por 0,118.
Durante un tiempo medio de seguimiento de 7,8
años se observaron 12 eventos cardiovasculares notables en el grupo
con NT-proBNP en plasma por debajo del valor de la
mediana, en comparación con 54 eventos en el grupo por encima de la
mediana, p < 0,0001 (fig. 1). Análogamente, esta significativa
correlación entre la enfermedad cardiovascular y el nivel de
NT-proBNP en plasma también fue observada en cada
uno de los grupos originales de tratamiento del estudio
Steno-2, como se muestra en la tabla 1. El ajuste de
los factores de riesgo de enfermedad cardiovascular en la diabetes
de tipo 2 no alteró la importancia de la correlación en ninguno de
los modelos de ajuste (tabla 2). La tabla 2 muestra el porcentaje de
riesgo (IC 95%) para los puntos finales principal y secundario en
los pacientes diabéticos de tipo 2 con unos niveles de
NT-proBNP en plasma por encima de la mediana, en
comparación con los pacientes con niveles en plasma por debajo de la
mediana (panel A), o usando un nivel de corte de 125 pg/ml (panel
B). El modelo 1 está ajustado para la enfermedad cardiovascular
conocida en la línea basal, la duración conocida de la diabetes, la
edad y el género. El modelo 2 está ajustado para las variables del
modelo 1 y asimismo para la presión sanguínea sistólica y
diastólica, la hemoglobina glucosilada A1c, el contenido sérico de
lípidos en ayunas y la tasa de excreción de albúmina en orina.
\vskip1.000000\baselineskip
El porcentaje de riesgo para el punto final
secundario también estaba correlacionado significativamente con el
nivel de NT-proBNP en plasma de la línea basal,
ajustado o no según los clásicos factores de riesgo (fig. 2). Sin
embargo, aunque se observaron porcentajes de riesgo de magnitud
semejante en cada uno de los dos grupos originales de tratamiento
analizados, el ajuste diluyó la importancia del
NT-proBNP en plasma como marcador de riesgo
(tabla 2).
(tabla 2).
Al utilizar un nivel de corte de
NT-proBNP en plasma de 125 pg/ml no varió
sustancialmente la importancia y el tamaño del riesgo para los
puntos finales principal y secundario, en comparación con el nivel
de corte más bajo en esta presente cohorte (tabla 2).
Al medirlos dos años después del inicio del
estudio los niveles de NT-proBNP en plasma habían
aumentado significativamente en la cohorte combinada a 14,9 pg/ml,
p < 0,0001, y se vio un resultado similar en los grupos de
terapia intensiva y convencional (11,7 pg/ml, p = 0,001, y 18,2
pg/ml, p < 0,0001, respectivamente). El nivel medio del
NT-proBNP en plasma continuó aumentando en los dos
grupos, tanto por debajo como por encima de la mediana, durante el
seguimiento, tal como indica la figura 3. También resultó así cuando
el grupo original de terapia intensiva y el grupo de terapia
convencional se analizaron por separado.
Las variaciones de NT-proBNP en
plasma durante los dos primeros años de intervención se relacionaron
significativamente con el riesgo de eventos cardiovasculares
durante el resto del periodo de seguimiento. Una disminución de 10
pg/ml del nivel de NT-proBNP en plasma en la cohorte
combinada fue asociada a un notable descenso relativo del riesgo de
un 1%, tanto para el punto final principal como para el punto final
secundario, en la cohorte intensiva, convencional y combinada (p
< 0,001 en todos los casos). En un total de 42 pacientes el nivel
de NT-proBNP en plasma descendió durante los dos
primeros años de seguimiento, con una disminución de la mediana de
12 pg/ml. 18 pacientes clasificados respecto a la línea basal por
encima de la mediana alcanzaron el nivel inferior de la mediana a
los dos años de la intervención, pero esto no fue relacionado con un
menor riesgo de enfermedad cardiovascular en comparación con los
pacientes que no alcanzaron el nivel (proporción de riesgo 0,45
(0,12-1,65, p = 0,23)).
Después de dos años, la correlación entre el
nivel de NT-proBNP en plasma y el riesgo de
enfermedad cardiovascular durante el resto del periodo de
seguimiento continuaba siendo significativa para ambos puntos
finales, tanto el principal como el secundario.
En el presente análisis post-hoc
del estudio Steno-2 hemos demostrado que hay una
correlación notable e independiente entre los niveles de
NT-proBNP en plasma y el riesgo futuro de enfermedad
cardiovascular, y también en punto final secundario, que incluye la
mortalidad cardiovascular y el ingreso por fallo cardiaco congestivo
en pacientes con diabetes de tipo 2 y microalbuminuria.
En conclusión, en los pacientes con diabetes de
tipo 2 el contenido de NT-proBNP en plasma tiene un
importante papel como marcador del riesgo de enfermedad
cardiovascular y fallo cardiaco congestivo.
En 1993 todos los pacientes diabéticos de tipo 1
con nefropatía diabética (n = 242) que acudían al ambulatorio del
centro de diabetes Steno - donde este mismo año se les había medido
la tasa de filtración glomerular - fueron invitados a participar en
un estudio caso-control (Tarnow, L., Cambien, F., y
otros (1995). El polimorfismo de inserción/supresión en el gen del
enzima convertidor de angiotensina I está relacionado con enfermedad
cardiaca coronaria en pacientes IDDM con nefropatía diabética.
Diabetologica, vol. 38, p. 798-803). Se reclutó un
total de 199 pacientes que cumplían los criterios clínicos de la
nefropatía diabética (macroalbuminuria persistente (> 300 mg/24
h) en al menos dos de tres recolecciones consecutivas de 24 horas de
orina, en presencia de retinopatía diabética y en ausencia de otra
enfermedad renal o del tracto urinario (Parving H-H,
\diametersterby R, Ritz E. Nefropatía diabética. En Brenner BM,
ed. El riñón, p. 1777-818. Filadelfia: WB Saunders,
2003)). Un grupo de 192 pacientes afectados durante mucho tiempo de
diabetes de tipo 1 y con normoalbuminuria persistente sirvió de
control. El NT-proBNP en plasma se midió en 198
pacientes con nefropatía y en 188 pacientes con
normoalbuminuria.
Mediante un estudio de observación prospectiva
se hizo el seguimiento de los pacientes hasta el 1 de febrero de
2003 o hasta la muerte (n = 62) o emigración (n = 3). El estudio fue
aprobado por el comité ético local conforme a la declaración de
Helsinki y todos los pacientes dieron por escrito su consentimiento
informado.
Las investigaciones se realizaron a la mañana
siguiente de una noche en ayunas. A un 24% de los pacientes con
nefropatía y a un 88% de los pacientes normoalbuminúricos nunca se
les había prescrito medicación antihipertensiva. A todos los
pacientes restantes se les pidió que cesaran sus tratamientos
antihipertensivos y diuréticos 8 días antes del examen. Como no
todos los pacientes accedieron a ello, un 34% y un 4% de pacientes
en el grupo de nefropatía y normoalbuminuria, respectivamente,
habían tomado medicación antihipertensiva hasta el día del
examen.
Se midió la presión sanguínea arterial dos veces
con un brazalete adecuado tras un mínimo de 10 minutos de reposo en
posición supina. La concentración de albúmina urinaria se midió
mediante un inmunoensayo enzimático (Feldt-Rasmussen
B, Dinesen B, Deckert M. Inmunoensayo enzimático: determinación
perfeccionada de albúmina urinaria en diabéticos con nefropatía
incipiente. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1985;
45:539-44) en orina recogida durante
24-h. La concentración en suero de creatinina se determinó mediante un método Jaffé cinético. La tasa de filtración glomerular se determinó en pacientes con nefropatía diabética tras una única inyección de 3,7 MBq de ^{51}Cr-EDTA, controlando la radiactividad en muestras de sangre venosa extraídas 180, 200, 220 y 240 minutos después de la inyección En los pacientes normoalbuminúricos la tasa de filtración glomerular se estimó mediante la ecuación de modificación de la dieta en la enfermedad renal (MDRD) (Levey AS, Bosch JP, Lewis JB, Greene T, Rogers N, Roth D y otros. Un método más exacto para estimar la tasa de filtración glomerular a partir de la creatinina sérica: una nueva ecuación predictora. Ann. Intern. Med. 1999; 130:461-70). La retinopatía diabética se determinó en todos los pacientes por fotografía de fondo tras la dilatación papilar y se clasificó como nula, simple o proliferativa. Los pacientes fueron entrevistados de acuerdo con el cuestionario cardiovascular de la OMS. Los principales eventos cardiovasculares fueron diagnosticados como un historial de apoplejía y/o de infarto de miocardio. Fueron definidos como fumadores las personas que fumaban uno o más cigarrillos/cigarros/pipas diarios, todos los demás se clasificaron como no fumadores.
24-h. La concentración en suero de creatinina se determinó mediante un método Jaffé cinético. La tasa de filtración glomerular se determinó en pacientes con nefropatía diabética tras una única inyección de 3,7 MBq de ^{51}Cr-EDTA, controlando la radiactividad en muestras de sangre venosa extraídas 180, 200, 220 y 240 minutos después de la inyección En los pacientes normoalbuminúricos la tasa de filtración glomerular se estimó mediante la ecuación de modificación de la dieta en la enfermedad renal (MDRD) (Levey AS, Bosch JP, Lewis JB, Greene T, Rogers N, Roth D y otros. Un método más exacto para estimar la tasa de filtración glomerular a partir de la creatinina sérica: una nueva ecuación predictora. Ann. Intern. Med. 1999; 130:461-70). La retinopatía diabética se determinó en todos los pacientes por fotografía de fondo tras la dilatación papilar y se clasificó como nula, simple o proliferativa. Los pacientes fueron entrevistados de acuerdo con el cuestionario cardiovascular de la OMS. Los principales eventos cardiovasculares fueron diagnosticados como un historial de apoplejía y/o de infarto de miocardio. Fueron definidos como fumadores las personas que fumaban uno o más cigarrillos/cigarros/pipas diarios, todos los demás se clasificaron como no fumadores.
Después de haber permanecido los pacientes
reposando al menos 20 minutos en posición supina se recogieron
muestras de sangre para determinar NT-proBNP en
plasma, se centrifugaron y el plasma se conservó a -80ºC hasta el
análisis. Las concentraciones de NT-proBNP en plasma
se midieron mediante un inmunoensayo sandwich en un Elecsys 2010
(Roche Diagnostics, Basilea, Suiza). La variación intraensayo es
inferior al 3,0% y el coeficiente de variación total oscila entre
2,2 y 5,8% en los intervalos inferior y superior de
NT-proBNP.
Durante el verano de 2003 se realizó el
seguimiento de todos los pacientes a través del registro nacional.
De los pacientes fallecidos antes del 1 de febrero de 2003 se
registró la fecha del óbito y la causa de la muerte se obtuvo del
certificado de defunción. Todos los certificados de defunción fueron
revisados independientemente por dos observadores y se registró la
causa principal de muerte, incluyendo la información adicional
disponible de los informes de las necropsias. Todas las muertes se
clasificaron como cardiovasculares, a no ser que se hubiera
señalado inequívocamente una causa no cardiovascular (Pfeffer MA,
Swedberg K, Granger CP, Held P, McMurray JJV, Michelson EL y otros.
Efectos del candesartan en la mortalidad y morbididad de pacientes
con fallo cardiaco crónico: el programa CHARM completo. Lancet
2003; 362:759-66).
Las variables de distribución normal se
expresaron como medias \pm DE y aquellas cuya distribución no lo
era se convirtieron logarítmicamente y se indicaron como medianas
(intervalo). La comparación entre grupos se realizó empleando una
prueba t-Student no pareada o ANOVA. Se empleó un
ji-cuadrado para comparar las variables no
continuas. Los análisis de la relación en la línea basal entre
NT-proBNP y la presencia/ ausencia de nefropatía o
de enfermedad cardiovascular importante se ajustaron según sexo,
edad, presión sanguínea sistólica y tasa de filtración glomerular.
Se consideró estadísticamente significativo un valor p de dos colas
\leq 0,05.
Todas las variables
"tiempo-hasta-muerte" se
analizaron mediante la prueba de rango logarítmico y se
representaron en gráficos de Kaplan-Meier, según la
presencia de nefropatía o la situación de los niveles de
NT-proBNP por encima o debajo del valor de la
mediana. En los pacientes con nefropatía los modelos de regresión de
Cox adaptados a las covariables se ajustaron con las siguientes
covariables preespecificadas en la línea base: sexo, edad, tasa de
filtración glomerular, condición de fumador, historia de enfermedad
cardiovascular importante, medicación antihipertensiva en curso al
tomar la muestra de sangre y log_{10} NT-proBNP o
NT-proBNP por encima o debajo del valor de la
mediana (110 ng/l). No se realizaron más ajustes, para evitar una
sobreadaptación del modelo. Los resultados se expresan como
proporciones de riesgo con intervalos de confianza del 95%, sin o
con ajuste para otros factores que pudieran afectar al
pronóstico.
Todos los cálculos se efectuaron con un programa
disponible comercialmente (SPSS para Windows, versión 10.0).
Los pacientes diabéticos de tipo 1 con y sin
nefropatía diabética se armonizaron cuidadosamente según sexo, edad
y duración de la diabetes. En comparación con los pacientes de
normoalbuminuria los pacientes de nefropatía diabética tenían
presión sanguínea elevada, HbA1c aumentada, mayor colesterol en
suero y menor tasa de filtración glomerular, p < 0,0001. En
promedio, la tasa de filtración glomerular estaba bien mantenida en
los pacientes con nefropatía diabética (tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos son n, medias (DE) y medianas
(intervalos). Algunos pacientes de albuminuria previa persistente
que recibían medicación antihipertensiva tenían una tasa de
excreción de albúmina en orina < 300 mg/24 h.
\global\parskip0.900000\baselineskip
En pacientes con nefropatía diabética, la
concentración de NT-proBNP en plasma era alta (110
(5-79.640) ng/l (mediana (intervalo)) frente a 27
(5-455) ng/l en pacientes normoalbuminúricos, p <
0,0001. Esta diferencia persistía después del ajuste a las
diferencias en la tasa de filtración glomerular y otras covariables,
p < 0,0001. La concentración de NT-proBNP aumentó
pronto en la nefropatía diabética (40 (5-3111)
ng/l), mientras que la tasa de filtración glomerular aún se mantenía
dentro del intervalo normal (> 100 ml/min.).
En el grupo de nefropatía la concentración de
NT-proBNP en plasma no difería de manera
significativa entre hombres y mujeres diabéticos de tipo 1 (p =
0,28), pero aumentó con la edad (r = 0,42, p < 0,0001) y con la
presión sanguínea sistólica (r = 0,53, p < 0,0001) y disminuyó
con la tasa de filtración glomerular (r = -0,60, p < 0,0001) y
con la hemoglobina (r = -0,52, p < 0,0001). No se observó
ninguna relación entre NT-proBNP y glucosa en
sangre, HbA_{1c} o colesterol en suero. No se encontró ninguna
relación entre retinopatía diabética y NT-proBNP.
Entre los pacientes con nefropatía diabética, las concentraciones de
NT-proBNP circulante eran mayores en los pacientes
que estaban tomando medicación antihipertensiva en el momento del
muestreo, aunque esta diferencia desaparecía tras el ajuste para la
tasa de filtración glomerular.
En los pacientes con normoalbuminuria se
estableció una débil relación inversa entre la tasa de filtración
glomerular estimada (mediana 92 ml/min./1,73 m^{2} (intervalo:
45-170)) y NT-proBNP en plasma (r =
-0,22, p = 0,002).
El predominio de eventos cardiovasculares
importantes difería entre pacientes con y sin nefropatía diabética,
11% (IC 95%: 8-14) y 2% (0-4)
respectivamente, p < 0,0001. En los pacientes con nefropatía, el
contenido en plasma de NT-proBNP en la línea basal
fue notablemente alto en pacientes con un historial de infarto de
miocardio y/o de apoplejía no fatales (671
(34-12.418) ng/l, p < 0,0001) en comparación con
aquellos pacientes sin un historial de enfermedades cardiovasculares
importantes (97 (5-79.640) ng/l). Después de los
ajustes para posibles desórdenes, un incremento de diez veces en
NT-proBNP confirió una mayor probabilidad de eventos
cardiovasculares importantes (3,1 (IC 95% 1,2-7,8),
p = 0,02.
Durante el seguimiento murieron 51 (26%)
pacientes con y 11 (6%) pacientes sin nefropatía, p < 0,0001.
Debido al bajo número de eventos en el grupo normoalbuminúrico los
análisis siguientes se limitaron a los pacientes con nefropatía. En
el grupo nefropático el valor mediana de NT-proBNP
en plasma fue 110 ng/l, y 39 (39%) pacientes con valores superiores
y 12 (12%) pacientes con valores inferiores a dicho valor murieron
por cualquier otra causa. La proporción de riesgo sin ajustar fue de
3,86 (IC 95% 2,02-7,37), p < 0.0001, y la
proporción de riesgo ajustado a las covariables 2,28
(1,04-4,99), p = 0,04 - Fig. 4. Esta menor
mortalidad era atribuible a las escasas muertes causadas por
enfermedades cardiovasculares: 31 (31%) y 7 (7%) por encima y debajo
respectivamente del nivel de la mediana de
NT-proBNP (proporción de riesgo sin ajustar 5,25
(2,31-11,92), p < 0,0001, y ajustado a las
covariables 3,81 (1,46-9,94), p = 0,006 - Fig. 5).
El efecto del NT-proBNP en plasma en la mortalidad
cardiovascular y por cualquier causa siguió siendo significativa
tras los ajustes por diferencias en la tasa de filtración
glomerular. Además, la interacción entre NT-proBNP y
tasa de filtración glomerular no era significativa, indicando así
que el efecto de la concentración de NT-proBNP en la
mortalidad y en la mortalidad cardiovascular no depende del nivel de
la tasa de filtración glomerular. Los sucesivos ajustes para el
colesterol sérico y para la presión sanguínea sistólica no alteraron
sustancialmente las proporciones de riesgo y los resultados
continuaron siendo significativos.
La mortalidad global (en la prueba de rango
logarítmico p = 0,06) y cardiovascular (p = 0,07) en los pacientes
con nefropatía cuyo nivel de NT-proBNP en plasma era
inferior a 110 ng/l no resultaron estadísticamente diferentes del
grupo normoalbuminúrico (figuras 2 y 3).
Al aplicar el valor de corte de 125 ng/l de
NT-proBNP recomendado en USA las proporciones de
riesgo ajustadas a las covariables para la mortalidad cardiovascular
y por cualquier causa solo variaron ligeramente: 4,09
(1,61-10,41), p = 0,003 y 2,68
(1,24-5,79), p = 0,01, respectivamente.
Los análisis de regresión de Cox, incluyendo la
concentración de NT-proBNP como variable continua,
revelaron una proporción de riesgo no ajustada de mortalidad por
cualquier causa de 3,39 (2,38-4,82), p < 0,0001,
para cada 10 veces de incremento del NT-proBNP, y de
2,67 (1,62-4,42), p < 0,0001 ajustada a las
covariables. Por tanto la proporción de riesgo no ajustada de
mortalidad cardiovascular fue de 3,58 (2,40-5,36), p
< 0,0001, para cada 10 veces de aumento en
NT-proBNP, y de 3,32 (1,90-5,81), p
< 0,0001 ajustada a las covariables.
En conclusión, un alto NT-proBNP
circulante es un predictor independiente del exceso de mortalidad
total y cardiovascular en la nefropatía diabética. La medición de
NT-proBNP aporta información adicional al pronóstico
según los métodos disponibles y puede contribuir a guiar el
tratamiento de los pacientes diabéticos de tipo 1 con nefropatía
diabética.
En los pacientes diabéticos de tipo 1 con
nefropatía se halló que el PlGF no estaba relacionado con edad,
sexo, HbA1c y tasa de filtración glomerular. La correlación con la
excreción de albúmina en orina era débil. En los pacientes
diabéticos de tipo 1 con nefropatía el PlGF se correlacionó con la
mortalidad por cualquier causa y con la mortalidad por enfermedad
cardiovascular (fig. 6 y 7).
\global\parskip1.000000\baselineskip
La tabla 4 muestra un análisis de PlGF en
pacientes del estudio Steno-2. El planteamiento
general del estudio ha sido descrito en el ejemplo 1.
Un paciente de 55 años de edad con diabetes de
tipo 2 acude a su médico de medicina general. Se mide el
NT-proBNP (357 pg/ml), el PlGF (11 pg/ml) y el sCD40L libre (es decir, no unido a trombocitos) (1,2 pg/ml). El paciente no se queja de dolor de pecho. El valor de NT-proBNP indica la presencia de enfermedad cardiaca. El paciente es remitido a un cardiólogo para un examen cardiaco a fondo. El ECG y la troponina T cardiaca son normales. Se reduce la dosis de medicación con rosiglitazona y se inicia tratamiento con inhibidores de ACE y diuréticos. Después, el NT-proBNP se controla a intervalos bisemanales y queda a un nivel de 177 pg/ml al cabo de dos meses. Además se controla regularmente el nivel de troponina cardiaca T.
NT-proBNP (357 pg/ml), el PlGF (11 pg/ml) y el sCD40L libre (es decir, no unido a trombocitos) (1,2 pg/ml). El paciente no se queja de dolor de pecho. El valor de NT-proBNP indica la presencia de enfermedad cardiaca. El paciente es remitido a un cardiólogo para un examen cardiaco a fondo. El ECG y la troponina T cardiaca son normales. Se reduce la dosis de medicación con rosiglitazona y se inicia tratamiento con inhibidores de ACE y diuréticos. Después, el NT-proBNP se controla a intervalos bisemanales y queda a un nivel de 177 pg/ml al cabo de dos meses. Además se controla regularmente el nivel de troponina cardiaca T.
Una mujer diabética de tipo 2 de 62 años de edad
acude a su especialista en diabetes. Se mide
NT-proBNP
(37 pg/ml), PlGF (27 pg/ml) y sCD40L libre (1,0 pg/ml). El NT-proBNP y el PlGF indican la existencia de riesgo de complicación cardiovascular con una característica predominante de microangiopatía. La medición del VEGF confirma el diagnóstico. La determinación de CML y HbA1c (7,7%) indica insuficiente control de azúcar en sangre. Se recomienda al paciente hacer ejercicio regular e inspeccionar diariamente sus extremidades para ver si aparecen pequeñas heridas o signos de hipoxia. Se inicia medicación con estatinas y glitazonas. El NT-proBNP se mide a intervalos cortos para detectar si el tratamiento con glitazonas incrementa el riesgo de enfermedad cardiaca. Se mide mensualmente PlGF, AGE CML y HbA1c para controlar el éxito del tratamiento.
(37 pg/ml), PlGF (27 pg/ml) y sCD40L libre (1,0 pg/ml). El NT-proBNP y el PlGF indican la existencia de riesgo de complicación cardiovascular con una característica predominante de microangiopatía. La medición del VEGF confirma el diagnóstico. La determinación de CML y HbA1c (7,7%) indica insuficiente control de azúcar en sangre. Se recomienda al paciente hacer ejercicio regular e inspeccionar diariamente sus extremidades para ver si aparecen pequeñas heridas o signos de hipoxia. Se inicia medicación con estatinas y glitazonas. El NT-proBNP se mide a intervalos cortos para detectar si el tratamiento con glitazonas incrementa el riesgo de enfermedad cardiaca. Se mide mensualmente PlGF, AGE CML y HbA1c para controlar el éxito del tratamiento.
Claims (14)
1. Método para diagnosticar si un paciente
diabético sufre microangiopatía o tiene el riesgo de padecerla, que
comprende las etapas de
- a)
- medir in vitro el nivel del factor de crecimiento placentario (PlGF) o de una de sus variantes PlGF-1 (149 amino-ácidos), PlGF-2 (170 aminoácidos) o PlGF-3 (221 aminoácidos) en una muestra de sangre, de suero sanguíneo o de plasma sanguíneo del paciente,
- b)
- diagnosticar la microangiopatía o el riesgo de padecerla, comparando el nivel medido con el(los) nivel(es) conocido(s) correspondientes a la microangiopatía o su riesgo.
2. El método según la reivindicación 1, en que
el marcador de angiogénesis es PlGF.
3. El método según la reivindicación 2, en que
el nivel de PlGF conocido es un nivel en plasma superior a 10
pg/ml.
4. El método según una de las reivindicaciones 1
a 3, en que el paciente sufre diabetes de tipo 1.
5. El método según una de las reivindicaciones 1
a 4, en que el paciente sufre diabetes de tipo 2.
6. El método según una de las reivindicaciones 1
a 5, en que el paciente sufre nefropatía diabética.
7. El método según una de las reivindicaciones 1
a 6, en que además se mide el nivel de al menos un marcador
perteneciente al grupo de las hormonas cardiacas.
8. El método según la reivindicación 7, en que
la hormona cardiaca es un péptido natriurético o una variante del
mismo.
9. El método según la reivindicación 8, en que
la hormona cardiaca es NT-proBNP o una variante del
mismo.
10. El método según una de las reivindicaciones
1 a 8, en que adicionalmente se mide el nivel de al menos un
marcador perteneciente al grupo de los marcadores de la activación
de plaquetas.
11. El método según la reivindicación 10, en que
el marcador de la activación de plaquetas es la sCD40L o una
variante de la misma.
12. El método según la reivindicación 10, en que
miden los niveles de PlGF, NT-proBNP y sCD40L.
13. El método según una de las reivindicaciones
1 a 12, en que se mide adicionalmente el nivel de al menos un
marcador elegido del grupo formado por CRP, hsCRP,
IL-6 o una variante de la misma, glucosa, HbA1c, CML
y AGE.
14. El método según una de las reivindicaciones
1 a 13, que comprende el diagnóstico de una manifestación de la
diabetes perteneciente al grupo formado por complicación
cardiovascular, enfermedad cardiaca, activación de plaquetas,
inflamación e insuficiente control del nivel de azúcar en
sangre.
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