ES2294321T3 - Conjunto manual de construccion de micromatrices tisulares. - Google Patents

Abstract

Conjunto manual de construcción de micromatrices tisulares (TMA) que comprende un extractor de punzonado (14) de núcleos de tejido y un molde de bloque TMA (1), el molde de bloque TMA (1) tiene una pieza inferior (2), teniendo esta pieza inferior (2) unos mandriles (4) en ángulos rectos con relación a la unidad de base dispuesta en el centro en líneas y columnas, caracterizado porque el molde de bloque TMA (1) es completado por una pieza superior (3), teniendo la pieza superior (3) una hendidura (6) que contiene un margen (7), que recibe los mandriles (4) cuando el molde de bloque TMA (1) está ensamblado, el margen (7) y el tamaño de la hendidura (6) encajan con la forma y el tamaño del portabloque (12) de parafina y las piezas superior (3) e inferior (2) están conectadas entre sí por unos tetones direccionales (5) y unos brazos roscados (9) fijados horizontalmente.

Description

Conjunto manual de construcción de micromatrices tisulares.

El objeto de nuestra invención es un conjunto de aparato manual de preparación de micromatrices tisulares (TMA), el cual incluye un extractor de núcleos tisulares y un molde de bloque de una TMA con unas piezas inferior y superior.

El aparato manual de preparación de micromatrices tisulares es apropiado para fabricar series de TMA, lo que posibilita la preparación rápida y precisa "casera" de series de TMA perfectamente ajustadas a las condiciones habituales tradicionales de los laboratorios histológicos.

La tecnología TMA puede aplicarse para la determinación de marcadores diagnósticos así como a los parámetros sobre la agresividad y otras características de los tumores malignos.

La TMA es muy útil en estudios retrospectivos, esto es en la investigación de miles de marcadores biológicos moleculares en miles de especímenes histológicos almacenados en laboratorios de patología.

Similar al elemento de código del ADN, el cual permite el análisis de las mutaciones del genoma y de las expresiones genéticas anormales, las micromatrices tisulares posibilitan el procesamiento paralelo de las muestras biológicas. Utilizando una TMA, los investigadores tienen la oportunidad del examen comparativo simultáneo de diversos parámetros moleculares (técnicas biológicas moleculares del ADN, ARN e Inmunohistoquímica/Inmunocitoquímica de antígenos) en especímenes histológicos de diversos tejidos tumorales malignos.

Numerosos anticuerpos monoclonales, los cuales determinan el genoma y el fenotipo de las células sanas y patológicas (principalmente malignas), y que son específicos en determinantes de antígenos novedosos, están siendo desarrollados e introducidos en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas (inmunomorfología). Las medidas diagnósticas basadas en procedimientos genéticos, los cuales puede identificar determinados segmentos del ADN y/o del ARN, están alcanzando un uso creciente (biología molecular). Diversos laboratorios están implicados en la evaluación de su reactividad tisular y su aplicabilidad potencial en los tumores más frecuentes.

Como consecuencia de ello, esa técnica diagnóstica efectivamente parece haber adquirido un gran desarrollo.

En la técnica diagnóstica, las muestras histológicas procedentes de tejidos tumorales diferentes son incluidos en conjuntos adecuadamente dispuestos en parafina para la preparación de la TMA. El bloque TMA es cortado para obtener los diversos tumores como elementos a modo de puntos en las secciones histológicas de microscópico óptico. Dado que cada bloque TMA puede producir cientos de secciones en serie paralelas con un grosor de 3 a 4 Dm, cientos de parámetros moleculares pueden ser examinados sobre la misma micromatriz. Varios marcadores tumorales pueden ser analizados en semanas, mientras que ello llevaría meses por espécimen de tejido utilizando el procedimiento tradicional.

De acuerdo con nuestro conocimiento actual, las reacciones llevadas a cabo sobre secciones histológicas de tamaño estándar (a partir de tejidos congelados y/o incluidos fijos), y de muestras citológicas (frotis, sedimentos, impresiones; citocentrifugados, etc.) son útiles para la identificación de marcadores de identificación o moleculares de tumores y para la predicción de la progresión de enfermedades. Al mismo tiempo, solo un número de muestras limitado puede ser examinado debido a razones técnicas y financieras, la evaluación lleva tiempo en realizarse y tanto los exámenes comparativos como los reproducibles entre los diferentes laboratorios son difíciles de llevar a cabo. En primer término, la falta de reproducibilidad es la desventaja de la llamada técnica de "bloque multitejido" que contiene partes procedentes de diversos bloques/tejidos en un único bloque histológico. Además, la distribución de los marcadores moleculares individuales dentro del tejido maligno es a menudo bastante heterogénea y, por tanto, una parte diminuta de tejido no representa adecuadamente las características biológicas de la entera población celular
tumoral.

La aplicación de la técnica con reminiscencias de o decididamente basada en la tecnología de los "elementos de código", esto es, las micromatrices tisulares, posibilita la investigación de cientos o miles de muestras de tejido.

Se está multiplicando el conocimiento en el campo de la investigación básica de la biotecnología médica, y su empleo confirma tanto las medidas diagnósticas como terapéuticas. No obstante, la investigación aplicada relacionada, investigación y desarrollo (I & D), así como los procedimientos de ensayo clínicos requieren años o incluso una década y los correspondientes medios financieros. Nuestra invención, el conjunto manual de construcción de TMA acorta la necesaria fase de ensayo de una forma precisa y rentable.

La información de la Patente estadounidense No. 4,820,504 representa un procedimiento bien conocido y ampliamente utilizado, el cual sirve para la preparación de una muestra que contiene múltiples especímenes de tejido. Sus ventajas incluyen el ser un procedimiento sencillo que puede ser aplicado en casi todos los laboratorios equipados con instalaciones de investigación y de pruebas sistemáticas, bajos costes, y que no necesitan la aportación de nuevos dispositivos. Sin embargo, la desventaja de la técnica es que las muestras de tejido incluidas lado con lado, consecutivas, están situadas de forma aleatoria, no organizadas en líneas y columnas, lo que hace que la evaluación sea bastante difícil, y que el procesamiento automático (análisis de imágenes) sea casi imposible o complicado y lento; el tamaño de las muestras de tejido individuales es solo aproximadamente similar uno de otro. Los nuevos instrumentos no pertenecen a la descripción del procedimiento.

Nuestro procedimiento y el objeto de nuestra invención se dirige a dar respuesta a estas desventajas.

La Patente estadounidense No. 5,200,377 es un instrumento que organiza las muestras de tejido en líneas y columnas regulares, y de esta forma proporciona un bloque de tejido múltiple. El titular de la patente es el mismo que el del instrumento anterior el cual es un experto bien conocido en este campo, a pesar de que esta técnica no se ha extendido ampliamente. Su ventaja evidente es que la aplicación de este instrumento posibilita la preparación y la inclusión de muestras de tejido de tamaño regular, casi idéntico. No obstante, su desventaja reside en que las columnas de tejido individuales pueden ser, aunque solo ligeramente, modificadas durante la preparación del bloque. Las desventajas mayores del instrumento son: su incompatibilidad con los instrumentos de laboratorio más frecuentemente utilizados y mejor conocidos (dispositivos y aparatos semifijos) y, por otro lado, la necesidad de tres herramientas adicionales y de considerable destreza manual en su aplicación. El primer instrumento incluye múltiples placas de corte paralelas, las cuales pueden cortar columnas de tejido de muestras de tejido, pero pueden ser aplicadas exclusivamente sobre especímenes grandes. Los otros dos componentes permiten la inclusión de columnas de tejido cortado en un bloque único de parafina.

La Patente No. 6,103,518 es un dispositivo de mesa que proporciona unas micromatrices de tejido útiles. El procedimiento se basa en la técnica bien orientada de los espacios receptores del bloque de parafina y del muestreo de los puntos seleccionados de los bloques donadores (núcleos de tejido). Además de sus ventajas anteriormente mencionadas, su alto precio, los complicados instrumentos mecánicos y la necesidad de preparación de uno en uno de los orificios receptores del bloque receptor representan serios inconvenientes en la práctica diaria.

El documento de publicación No. WO 01/51910 presenta un procedimiento de construcción de bloque de parafina único que puede utilizarse para la preparación de series de micromatrices tisulares en el cual ha sido formado un molde compuesto de varios elementos. Al utilizar el molde es moldeado un cuerpo básico que tiene unas aberturas regularmente dispuestas dentro de las cuales son a continuación colocadas las muestras de tejido. Después de ello, el cuerpo básico que contiene las muestras de tejido es calentado hasta el límite de la temperatura de ablandamiento para que el cuerpo básico sea capaz de combinarse con la parafina líquida vertida sobre una de las superficies en la fase siguiente del procedimiento y para de esta forma constituir una sola unidad con ella. Esta capa de parafina líquida sirve para ayudar en la fijación del portabloque de parafina al bloque de parafina que contiene los orificios cilíndricos y las muestras de tejido contenidas en ellos.

Sin embargo, una desventaja considerable de esta solución es que el bloque de parafina que contiene los cilindros con las muestras de tejidos dentro de ellos es sometido a un efecto de calor considerable. Debido al efecto de calor y al recalentamiento de la parafina los cilindros de tejido se desplazan, lo que puede provocar problemas al completar las secciones. Otra desventaja del efecto de calor subsecuente es que la cantidad de calor requerida para ablandar la parafina puede dañar los cilindros con la muestra de tejido, lo que puede provocar un daño irreversible desde el punto de vista de la tinción inmunitaria, en cuanto ello provoca un cambio en los antígenos a base de proteína y puede provocar que la muestra sea inutilizable.

Otra desventaja considerable de la invención es que en el bloque de parafina vertido en dos fases, debido a las fuerzas de cizalla que tienen lugar al producirse el corte del bloque de parafina puede separarse al nivel de la frontera entre las dos capas hechas en dos puntos separados al tiempo, como resultado de lo cual el bloque de parafina puede separarse del portabloque haciendo con ello imposible llevar a cabo los cortes deseados de los cilindros de tejido.

Ejemplos apropiados para la producción de los bloques de parafina utilizados en la producción de muestras de tejido pueden también encontrarse en la memoria descriptiva de la Patente norteamericana con el número de registro 6,383,801 y, así mismo, en los documentos de publicación con los números WO 01/98525, WO 99/44063, WO 01/22086 y WO 01/42796.

El objetivo de nuestra invención es eliminar las desventajas de los procedimientos anteriormente mencionados para diseñar un conjunto de aparato manual de preparación de micromatrices que sea simple, barato y compatible con los materiales fijos y semifijos de laboratorios histológicos. El principio de aplicar el aparato manual es que la preparación del bloque receptor se lleva a cabo de un modo separado respecto de la operación de muestreo; por consiguiente, las muestras pueden ser previamente preparadas y almacenadas en cualquier parte, y a continuación ser introducidas en el bloque receptor. El aparato manual requiere poco espacio, es fácil de limpiar, básicamente no se necesita mantenimiento, cada parte es resistente a las influencias externas físicas y químicas, y el bloque receptor puede ser preparado en una etapa.

Nuestra invención se basa en el reconocimiento de que el conjunto de aparato manual de preparación de micromatrices tisulares debe fabricarse a partir de elementos que se acoplen entre sí en cuanto a su tamaño y que puedan aplicarse junto con los elementos utilizados en condiciones de trabajo sistemático de los tradicionales laboratorios histológicos. El conjunto de aparato manual de preparación de micromatrices tisulares fue creado para contener un extractor de núcleos de tejido y un molde de bloque de una TMA con unas piezas inferior y superior, y los tradicionales portabloque de parafina, más frecuentemente utilizados bien acoplados a este último. El extractor de núcleos de tejido es una solución técnica bien conocida, esto es, se basa en la punción. La punta de punción está hecha como un tubo punzonante con un diámetro interno de 1 a 2 mm. Este tubo punzonante recibe el cilindro de tejido (núcleo) tomado de un lugar determinado de una muestra (bloque donador), el cual puede ser manualmente extraído de la punta de punzonado mediante la ayuda de una sonda de aguja a modo de pistón empujada hacia atrás por un resorte helicoidal situado dentro del instrumento. El diámetro exterior de la sonda de aguja es comparable al diámetro interior de la punta de punzonado, pero debido a su tamaño puede deslizarse libremente por el interior de la punta de punzonado.

El molde de bloque de TMA está compuesto por dos elementos principales: las piezas inferior y superior. La pieza inferior está equipada con unos mandriles de 1 o 2 mm de ancho, idénticos al diámetro del tubo de punzonado, organizados en líneas y columnas. Dado que las piezas inferior y superior son ensambladas entre sí durante el moldeo del bloque de parafina y que la parafina es vertida dentro del orificio formado por la parte superior, debe haberse preparado allí un margen, el cual es idéntico en cuanto a tamaño y forma al tamaño y forma del portabloque de parafina habitualmente utilizado.

La formación del margen crea la oportunidad de fijar el propio portabloque de parafina al bloque de parafina vacío en una etapa al moldear el bloque de parafina. Esto, más tarde, hace innecesario llevar a cabo el tratamiento de calor subsecuente, el cual es esencial en los procedimientos conocidos, y de esta forma resuelve las consecuencias desventajosas expuestas anteriormente derivadas del tratamiento con calor.

En la parte inferior hay al menos, instalados en la unidad de base, dos tetones direccionales, lo que asegura la retirada paralela e intacta del bloque de parafina cuando el aparato manual de molde es apartado. La retirada igual de los dos elementos situados en la abertura de las partes inferior y superior del molde de una sola pieza de TMA se asegura mediante al menos dos brazos roscados dispuestos en diagonal.

La eliminación de las desventajas anteriormente expuestas queda asegurada mediante un instrumento de preparación de micromatrices tisulares con las siguientes características: un extractor de punzonado de núcleos tisulares ya de por sí conocido y un molde de bloque de una TMA, teniendo este último una pieza inferior y una pieza superior; la pieza superior está organizada en su parte media en líneas y columnas, montada con mandriles en ángulos rectos respecto de la unidad de base; la pieza superior está preparada con una hendidura que contiene un margen, la cual recibe los mandriles cuando el molde de bloque de TMA es ensamblado formando un todo; el margen y el tamaño de la hendidura encajan con la forma y el tamaño del portabloque de parafina; las piezas inferior y superior están conectadas entre sí con los tetones direccionales y con los brazos roscados fijados horizontalmente; la pieza inferior del molde de bloque de TMA tiene al menos dos tetones direccionales, los cuales se unen de forma separable verticalmente hacia el interior de los orificios de calibre de la pieza superior; en la pieza superior del molde de bloque de TMA hay al menos dos orificios de calibre de tránsito diagonales, los cuales reciben los brazos roscados y los extremos de los brazos roscados se asientan sobre la pieza inferior cuando el molde bloque de TMA es ensamblado formando un todo.

La presente invención, el conjunto manual de construcción TMA es presentado en detalle por medio de los dibujos.

Figura 1. Delineación asonométrica del molde de bloque de TMA.

Figura 2. Delineación axonométrica del molde de bloque y del portabloque de parafina del instrumento de construcción TMA.

Figura 3. Bloque de parafina terminado con el extractor de punzonado de núcleos de tejido.

El molde de bloque de TMA 1 mostrado en la Figura 1 está compuesto por dos elementos principales, esto es, la pieza inferior 2 y la pieza superior 3. La pieza inferior 2 tiene unos mandriles 4 de 1 o 2 mm de diámetro dispuestos en líneas y columnas. El diámetro del mandil 4 es idéntico al diámetro del tubo de punzonado 8 del extractor 14 de punzonado de núcleos de tejido. Sobre la pieza inferior 2 hay 5 tetones verticales en ángulo recto con la pieza inferior, lo que asegura la retirada paralela e intacta del bloque de parafina cuando el bloque TMA 1 es desarmado. El tamaño de la pieza superior 3 es idéntica al de la pieza inferior 2 y en la parte media tiene un margen 7 que contiene la hendidura 6, la cual recibe los mandriles 4. El margen 7 de la hendidura 6 está constituida para recibir el portabloque de parafina 12 comercialmente disponible mostrado en la Figura 2. Sobre la pieza inferior 2 hay 5 tetones direccionales, los cuales se unen con los orificios de calibre 10 de tránsito situados sobre la pieza superior 3. Además, los orificios de calibre adicionales 11 de tránsito situados sobre la pieza superior 3 reciben los brazos roscados 9, los cuales aseguran la uniforme y paralela apertura de las dos piezas del instrumento ensamblado moldeado con el bloque de parafina.

La retirada igual de los dos elementos en la apertura de las piezas inferior 2 y superior 3 del molde de bloque TMA 1 se asegura mediante al menos 2 brazos roscados 9 dispuestos en diagonal. Los extremos del extractor 14 de punzonado de núcleos de tejido termina en un tubo de perforación 8 con un diámetro interior de 1 o 2 mm.

El extractor bien conocido 14 de punzonado de núcleos de tejido recibe el cilindro de tejido tomado de un lugar determinado de la muestra (bloque donador), la cual puede ser manualmente extraída del tubo de punzonado 8 mediante la ayuda de una sonda de aguja a modo de pistón impulsada hacia atrás por un resorte helicoidal situado dentro del instrumento.

El diámetro exterior de la sonda de aguja es comparable al diámetro interior del tubo de punzonado 8, pero debido a su tamaño puede libremente deslizarse por el interior de la punta de punzonado 8.

Al preparar el bloque de parafina, el molde de bloque TMA 1 es llenado con parafina a través de la hendidura 6. Después de que la parafina es secada al enfriarse y retirada del instrumento, proporciona un bloque de parafina 13 (bloque receptor) que contiene unos orificios cilíndricos de 1 o 2 mm de ancho con los ejes longitudinales paralelos organizados en líneas y columnas regulares. Estos orificios reciben los núcleos de tejido que tienen el mismo diámetro adoptado por los bloques donadores por el extractor 14 de punzonado de núcleos de tejido, produciendo finalmente el bloque de TMA.

Como puede apreciarse a partir de la descripción expuesta, nuestro objetivo se consiguió mediante el desarrollo de nuestra invención. El conjunto manual de construcción de TMA es un instrumento manual barato y sencillo, que es fácil de manejar y limpio, respetuoso con el medio ambiente, y que posibilita la preparación rápida y precisa de las TMA bajo las condiciones tradicionales de trabajo sistemático de los laboratorios histológicos.

Una ventaja adicional es que, debido a la formación particular del conjunto manual es posible producir el bloque de parafina con el portador en una etapa sin ningún tratamiento térmico subsecuente, lo que no solo reduce el tiempo de producción requerido sino que tiene también un efecto favorable en las características mecánicas de la pieza terminada, que incluye también la resistencia a la fuerza de cizalla.

Lista de referencias

1.

molde de bloque TMA

2.

pieza inferior

3.

pieza superior

4.

mandril

5.

tetones direccionales

6.

hendidura

7.

márgen

8.

tubo de punzonado

9.

brazo roscado

10.

orificios de calibre de tránsito

11.

orificios de calibre de tránsito (adicionales)

12.

portabloque de parafina

13.

bloque de parafina (bloque receptor)

14.

extractor de punzonado de núcleos de tejido

Claims (3)

1. Conjunto manual de construcción de micromatrices tisulares (TMA) que comprende un extractor de punzonado (14) de núcleos de tejido y un molde de bloque TMA (1), el molde de bloque TMA (1) tiene una pieza inferior (2), teniendo esta pieza inferior (2) unos mandriles (4) en ángulos rectos con relación a la unidad de base dispuesta en el centro en líneas y columnas, caracterizado porque el molde de bloque TMA (1) es completado por una pieza superior (3), teniendo la pieza superior (3) una hendidura (6) que contiene un margen (7), que recibe los mandriles (4) cuando el molde de bloque TMA (1) está ensamblado, el margen (7) y el tamaño de la hendidura (6) encajan con la forma y el tamaño del portabloque (12) de parafina y las piezas superior (3) e inferior (2) están conectadas entre sí por unos tetones direccionales (5) y unos brazos roscados (9) fijados horizontalmente.

2. El conjunto de aparato manual de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la piezas inferior (2) del molde de bloque TMA (1) presenta al menos dos tetones direccionales verticales (5) que se unen a los orificios de calibre (10) de la pieza superior (3) y son libremente móviles en la dirección vertical.

3. El conjunto de aparato manual de acuerdo con la reivindicación (1), caracterizado porque la pieza superior (3) del molde de bloque TMA (1) presenta al menos dos orificios de calibre (11) de transmisión diagonales que reciben los brazos roscados (9) situados sobre la pieza superior (2) cuando el molde de bloque TMA (1) está ensamblado.