ES2293162T3 - Metodo para aumentar la concentracion de moleculas de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo dicho procedimiento: (a) formar microcápsulas a partir de una emulsión de agua en aceite, incluyendo dichas microcápsulas ácido nucleico, una solución acuosa que comprende los componentes necesarios para realizar la amplificación del ácido nucleico y un tensioactivo basado en silicona químicamente inerte; y (b) amplificar dicho ácido nucleico en las microcápsulas para formar copias amplificadas del ácido nucleico; aumentando de este modo la concentración de dicho ácido nucleico en las microcápsulas.
Description
Método para aumentar la concentración de
moléculas de ácidos nucleicos.
La presente invención se refiere, entre otras
cosas, a emulsiones adecuadas para compartimentalización de
moléculas de ácido nucleico y a procedimientos que usan tales
emulsiones. En particular, las emulsiones son útiles en
procedimientos para aumentar la concentración de moléculas de ácido
nucleico.
Se han desarrollado recientemente procedimientos
de compartimentalización basados en emulsiones de agua en aceite
para usar en procedimientos de selección de repertorio (Tawfik y
Griffiths 1998, Ghadessy y col 2001). La compartimentalización
segrega genes individuales y sus productos codificados
(administrados mediante células (Ghadessy y col., 2001) o
expresados in situ (Tawfik y Griffiths, 1998)) en
compartimentos acuosos individuales físicamente separados,
asegurando de este modo la unión de genotipo y fenotipo durante el
procedimiento de selección.
El documento WO99/02671 describe un
procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos que
codifican un producto génico que tiene una actividad deseada. Los
elementos genéticos se compartimentalizan primero en microcápsulas,
que se forman preferentemente por emulsión, y que después se
transcriben y/o se traducen para producir sus productos génicos
respectivos (ARN o proteína) dentro de las microcápsulas. Como
alternativa, los elementos genéticos pueden estar contenidos en
microcápsulas de la emulsión y la transcripción y/o la traducción
(expresión) del producto génico puede tener lugar usando la
maquinaria celular. Los elementos genéticos que producen un
producto génico que tiene una actividad deseada pueden clasificarse
posteriormente. Por ejemplo, en algunos casos la clasificación
puede deberse a que la actividad deseada induce un cambio en la
microcápsula. En otros casos, la clasificación puede deberse a que
la actividad deseada induce un cambio en el elemento genético.
El procedimiento descrito en el documento
WO99/02671 funciona bien con bacterias. Aunque en principio el
procedimiento de subcompartimentalización celular puede extenderse
para incluir células eucariotas, por ejemplo, células de levadura,
de insecto o de mamífero, para algunas aplicaciones sería deseable
proporcionar directamente una expresión in situ en
microcápsulas usando un sistema de transcripción/traducción
eucariota in vitro.
Se ha informado de la expresión previa de una
enzima procariota con éxito, la metilasa Hae, usando
extractos de S30 bacterianos en emulsión (Tawfik D. y Griffiths
A.D. 1998). Sin embargo, tales procedimientos no son adecuados para
algunas proteínas de interés, por ejemplo, grandes proteínas y
ribonucleoproteínas multidominio que con frecuencia no pueden
expresarse en forma funcional usando extractos bacterianos.
Por lo tanto, puede observarse que un
procedimiento que permita directamente la expresión in situ
en microcápsulas usando un sistema de transcripción/traducción
eucariota in vitro, aportará una contribución a la
técnica.
La invención proporciona un procedimiento para
aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico,
comprendiendo dicho procedimiento: (a) formar microcápsulas a partir
de una emulsión de agua en aceite, incluyendo dichas microcápsulas
ácido nucleico, una solución acuosa que comprende los componentes
necesarios para realizar la amplificación de ácido nucleico y un
tensioactivo basado en silicona químicamente inerte; y (b)
amplificar dicho ácido nucleico en las microcápsulas para formar
copias amplificadas del ácido nucleico; aumentando de este modo la
concentración de dicho ácido nucleico en las cápsulas.
En el contexto de la presente invención, se
considera que un tensioactivo es "químicamente inerte" si está
sustancialmente libre de especies oxidantes, tales como peróxidos y
aldehídos, y de especies desnaturalizantes de proteínas. Se
consideran "sustancialmente libres" de especies oxidantes y de
especies desnaturalizantes tensioactivos que tienen 40%,
preferentemente 50%, más preferentemente 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o
98% menos de especies oxidantes y especies desnaturalizantes de
proteínas que uno cualquiera de los emulsionantes convencionales
monooleato de sorbitán (Span^{TM} 80; ICI) y monooleato de
polioxietilensorbitán (Tween^{TM} 80; ICI).
Se usan en este documento los términos
"aislamiento", "clasificación" y "selección", así
como variaciones de los mismos. El término aislamiento, según la
presente invención, se refiere al procedimiento de separar una
entidad de una población heterogénea, por ejemplo una mezcla, de tal
forma que esté libre de al menos una sustancia con la que estuviera
asociada antes del procedimiento de aislamiento. En una realización
preferida, el aislamiento se refiere a la purificación de una
entidad esencialmente hasta la homogeneidad. La clasificación de
una entidad se refiere al procedimiento de aislar de manera
preferencial entidades deseadas sobre entidades no deseadas. En
tanto en cuanto se refieran al aislamiento de las entidades
deseadas, los términos "aislamiento" y " clasificación"
son equivalentes. El procedimiento de la presente invención permite
la clasificación de elementos genéticos deseados a partir de
combinaciones (bibliotecas o repertorios) de elementos genéticos
que contienen el elemento genético deseado. El término selección se
usa para referirse al procedimiento (incluyendo el procedimiento de
clasificación) de aislar una entidad según una propiedad particular
de la misma.
En realizaciones preferidas de los
procedimientos de la invención, la clasificación de elementos
genéticos puede realizarse mediante una de esencialmente cuatro
técnicas, que se detallan en el documento WO99/02671.
(I) En una primera realización, las
microcápsulas se clasifican según una actividad del producto génico
o de un derivado del mismo que hace que la microcápsula sea
detectable como un todo. Por consiguiente, la invención proporciona
un procedimiento según el segundo aspecto de la invención en el que
un producto génico con la actividad deseada induce un cambio en la
microcápsula, o una modificación de una o más moléculas en el
interior de la microcápsula, que permite que se clasifique la
microcápsula que contiene el producto génico y el elemento genético
que lo codifica. En esta realización, por lo tanto, las
microcápsulas se clasifican físicamente entre sí según la actividad
del(de los)
producto(s) génico(s) expresados a partir del(de los) elemento(s) genético(s) contenidos en las mismas, lo que hace posible enriquecer de manera selectiva a favor de microcápsulas que contienen productos génicos con la actividad deseada.
producto(s) génico(s) expresados a partir del(de los) elemento(s) genético(s) contenidos en las mismas, lo que hace posible enriquecer de manera selectiva a favor de microcápsulas que contienen productos génicos con la actividad deseada.
(II) En una segunda realización, los elementos
genéticos se clasifican después de la combinación de las
microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta
realización, un producto génico que tiene la actividad deseada
modifica al elemento genético que lo codifica (y que se encuentra en
la misma microcápsula) de tal manera que lo hace seleccionable en
una etapa posterior. Se detienen las reacciones y después se rompen
las microcápsulas de manera que se combina todo el contenido de las
microcápsulas individuales. La selección a favor de los elementos
genéticos modificados permite el enriquecimiento de los elementos
genéticos que codifican el(los) producto(s)
génico(s) que tienen la actividad deseada. Por consiguiente,
la invención proporciona un procedimiento según el segundo aspecto
de la invención, en el que en la etapa (b) el producto génico que
tiene la actividad deseada modifica al elemento genético que lo
codifica para permitir el aislamiento del elemento genético. Debe
entenderse, por supuesto, que la modificación puede ser directa, en
el sentido de que se provoca por la acción directa del producto
génico sobre el elemento genético, o indirecta, en la que una serie
de reacciones, una o más de las cuales implican al producto génico
que tiene la actividad deseada, conducen a la modificación del
elemento genético.
(III) En una tercera realización, los elementos
genéticos se clasifican después de la combinación de las
microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta
realización, un gen con una actividad deseada induce un cambio en
la microcápsula que contiene el producto génico y el elemento
genético que lo codifica. Este cambio, cuando se detecta,
desencadena la modificación del gen en el interior de la
microcápsula. Se detienen las reacciones y después se rompen las
microcápsulas de manera que se combina todo el contenido de las
microcápsulas individuales. La selección a favor de los elementos
genéticos modificados permite el enriquecimiento de los elementos
genéticos que codifican el(los) producto(s)
génico(s) que tienen la actividad deseada. Por consiguiente,
la invención proporciona un procedimiento según el segundo aspecto
de la invención, en el que en la etapa (b) el producto génico que
tiene la actividad deseada induce un cambio en la microcápsula que
se detecta y que desencadena la modificación del elemento genético
en el interior de la microcápsula para permitir su aislamiento. Debe
entenderse que el cambio detectado en la microcápsula puede
provocarse por la acción directa del producto génico o por acción
indirecta, en la que una serie de reacciones, una o más de las
cuales implican al producto génico que tiene la actividad deseada,
conducen al cambio detectado.
(IV) En una cuarta realización, los elementos
genéticos pueden clasificarse mediante un procedimiento multietapa
que implica al menos dos etapas, por ejemplo, para permitir la
exposición de los elementos genéticos a condiciones que permitan
que se produzcan al menos dos reacciones separadas. Como será obvio
para los expertos en la materia, la primera etapa de
microencapsulación de la invención debe dar lugar a condiciones que
permitan la expresión de los elementos genéticos -ya sea
transcripción, transcripción y/o traducción, replicación o
similares. En estas condiciones, puede no ser posible seleccionar a
favor de una actividad de un producto génico particular, por
ejemplo, porque el producto génico puede no ser activo en estas
condiciones o porque el sistema de expresión contenga una actividad
interferente. La invención proporciona, por lo tanto, un
procedimiento según el segundo aspecto de la presente invención en
el que la etapa (b) comprende expresar los elementos genéticos para
producir sus respectivos productos génicos en el interior de las
microcápsulas, unir los productos génicos con los elementos
genéticos que los codifican y aislar los complejos así formados.
Esto permite que se aíslen de las microcápsulas los elementos
genéticos y sus productos génicos asociados antes de que se produzca
la clasificación según la actividad del producto génico. En una
realización preferida, los complejos se someten a una etapa de
compartimentalización adicional antes de aislar los elementos
genéticos que codifican un producto génico que tiene la actividad
deseada. Esta etapa de compartimentalización adicional, que
ventajosamente tiene lugar en las microcápsulas, permite la
realización de reacciones adicionales, en condiciones diferentes, en
un entorno en el que los elementos genéticos y sus productos
génicos respectivos están físicamente unidos. La clasificación final
de elementos genéticos puede realizarse según las realizaciones (I),
(II) o (III) anteriores.
La "encapsulación secundaria" puede
realizarse también con elementos genéticos unidos a productos
génicos por otros medios, tales como mediante presentación en fago,
presentación en polisomas, fusión de ARN-péptido o
fusión de péptido represor lac.
El(los) elemento(s)
genético(s) seleccionado(s) pueden someterse también a
posteriores, posiblemente más rigurosas rondas de selección en
etapas repetidas de manera reiterada, volviendo a aplicar el
procedimiento de la invención en su totalidad o solamente en etapas
seleccionadas. Adaptando las condiciones de la manera apropiada,
pueden aislarse elementos genéticos que codifiquen productos
génicos que tengan una actividad más optimizada después de cada
ronda de selección.
Además, los elementos genéticos aislados después
de una primera ronda de selección pueden someterse a mutagénesis
antes de repetir la selección mediante repeticiones reiteradas de
las etapas del procedimiento de la invención como se ha expuesto
anteriormente. Después de cada ronda de mutagénesis, algunos
elementos genéticos se habrán modificado de tal manera que se
potencia la actividad de los productos génicos.
Además, los elementos genéticos seleccionados
pueden clonarse en un vector de expresión para permitir la
caracterización adicional de los elementos genéticos y de sus
productos. Los expertos en la materia conocen una multitud de
vectores adecuados. Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores
de virus, plásmidos o fagos provistos de un origen de replicación,
opcionalmente un promotor para la expresión del elemento genético y
opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden
contener un gen marcador seleccionable, por ejemplo, el gen de
resistencia a neomicina para un vector de mamíferos.
La Figura 1 muestra emulsiones formadas
mezclando una fase oleosa con un lisado de reticulocitos de conejo
(RRL) durante 1,5 min y fotografiadas en el espectro visible después
de una incubación de 15 min a 30ºC. De izquierda a derecha: 1)
mezcla de CSR, 2) mezcla de CSR + DDT, 3) Span80 a 1,5% en aceite
mineral, 4) Span80 a 1,5% en aceite mineral + DTT, 5) Abil
EM90^{TM} a 4%, 6) Abil EM90^{TM} a 4% + DTT.
La Figura 2 muestra una imagen de una emulsión
de Abil EM90 a 4% en aceite mineral tomada en modo de contraste de
fases. La distancia entre las barras es de 10 \mum.
La Figura 3 muestra los resultados de la
expresión de telomerasa:
Panel A (no emulsionado): Carril 1, hTERT (75
ng); Carril 2, hTR (75 ng); Carril 3, hTERT + hTR; Carril 4, sin
construcción; Carril 5, construcción WT de expresión en tándem (150
ng); Carril 6, construcción mutante de deleción en tándem (150
ng)
Panel B: En emulsión, mismas anotaciones en los
carriles que en el panel A.
Las emulsiones son sistemas heterogéneos de dos
fases líquidas inmiscibles con una de las fases dispersa en la otra
como gotitas de tamaño microscópico o coloidal (Becher, 1957;
Sherman, 1968; Lissant, 1984). Las emulsiones de la invención deben
permitir la formación de microcápsulas.
Las emulsiones pueden producirse a partir de
cualquier combinación adecuada de líquidos inmiscibles. La emulsión
de la presente invención tiene una fase hidrófila (que contiene los
componentes bioquímicos) como la fase presente en forma de gotitas
finamente divididas (la fase dispersa, interna o discontinua) y un
líquido hidrófobo inmiscible (un "aceite") como matriz en la
que están suspendidas estas gotitas (la fase no dispersa, continua
o externa). Tales emulsiones se denominan "de agua en aceite"
(W/O). Esto tiene la ventaja de que la fase acuosa que contiene los
componentes bioquímicos se compartimentaliza en su totalidad en
gotitas discretas (la fase interna). La fase externa, que es un
aceite hidrófobo, generalmente no contiene ninguno de los
componentes bioquímicos y es, por lo tanto,
inerte.
inerte.
La creación de una emulsión requiere
generalmente la aplicación de energía mecánica para forzar que se
junten las fases. Hay una variedad de maneras de hacer esto que
utilizan una variedad de dispositivos mecánicos, incluyendo
agitadores (tales como barras de agitación magnética, agitadores de
hélice y de turbina, dispositivos de paletas y batidores),
homogeneizadores (incluyendo homogeneizadores
rotor-estator, homogeneizadores de válvula de alta
presión y homogeneizadores de propulsión), molinos coloidales,
dispositivos de ultrasonido y "de emulsión de membranas"
(Becher, 1957; Dickinson, 1994).
Es deseable que la emulsión sea estable durante
la incubación a 30ºC durante al menos una hora. En algunos casos,
se prefiere que también sea estable a mayores temperaturas,
especialmente si se usan ciclos de temperatura durante PCR u otros
procedimientos de amplificación.
Las emulsiones de la invención se estabilizan
por adición de uno o más agentes surfactantes (tensioactivos).
Estos tensioactivos se denominan agentes emulsionantes y actúan en
la interfase agua/aceite para evitar (o al menos retrasar) la
separación de las fases. Pueden usarse muchos aceites y muchos
emulsionantes para la generación de emulsiones de agua en aceite;
una recopilación reciente enumeraba más de 16.000 tensioactivos,
muchos de los cuales se usan como agentes emulsionantes (Ash y Ash,
1993).
Sin embargo, como se describe en los ejemplos,
los tensioactivos usados convencionalmente en aplicaciones de
emulsiones tales como tensioactivos no iónicos (Schick, 1966), por
ejemplo, monooleato de sorbitán (Span^{TM} 80; ICI) y monooleato
de polioxietilensorbitán (Tween^{TM}80;ICI) no son adecuados para
la expresión eucariota eficaz in vitro con el lisado de
reticulocitos de conejo.
Sin embargo, como se describe en este documento,
tal expresión puede mantenerse cuando se usan tensioactivos basados
en silicona químicamente inertes.
Preferentemente, el tensioactivo basado en
silicona químicamente inerte de la emulsión es un copolímero de
silicona.
Más preferentemente, el tensioactivo comprende
un copolímero de
polisiloxano-policetil-polietilenglicol
(Cetyl Dimethicone Copolyol), por ejemplo, Abil.® EM90
(Goldschmidt).
El tensioactivo basado en silicona químicamente
inerte puede proporcionarse como el único tensioactivo en la
composición de emulsión, o puede proporcionarse como uno de varios
tensioactivos. Por ejemplo, puede usarse una mezcla de diferentes
tensioactivos.
En realizaciones preferidas, el tensioactivo se
proporciona a una concentración v/v en la fase oleosa de la emulsión
de 0,5 a 20%, preferentemente de 1 a 10%, más preferentemente de
3-5%.
En una realización muy preferida, el
tensioactivo se proporciona a una concentración v/v en la fase
oleosa de 4%.
En una realización muy preferida de la
invención, la emulsión se realiza añadiendo una fase acuosa gota a
gota a una fase oleosa en presencia de un tensioactivo que comprende
aproximadamente 3-5% (v/v) de copolímero de
polisiloxano-policetil-polietilenglicol
en aceite mineral, preferentemente a una proporción de fase aceite:
agua de 2,5:1.
El tensioactivo puede estar presente al
principio con la composición hidrófoba. Por lo tanto, una
composición que comprende el tensioactivo y la composición
hidrófoba representa un aspecto adicional de la presente
invención.
Como alternativa, el tensioactivo puede añadirse
en una etapa posterior, por ejemplo, durante o después de mezclar
las fases hidrófoba e hidrófila.
En esta realización el tensioactivo puede
proporcionarse en un kit, junto con una composición hidrófoba. El
kit puede incluir también opcionalmente un sistema de expresión
eucariota tal como lisado de reticulocitos de conejo y/o un
dispositivo para mezclar las fases hidrófoba e hidrófila. Puede
incluir además instrucciones para su uso para proporcionar una
emulsión de la presente invención.
Como alternativa, el tensioactivo puede estar
presente al principio con la composición hidrófila.
El término "microcápsula" es sinónimo de
"compartimento" y los términos se usan de manera
intercambiable. En esencia, una microcápsula es un compartimento
artificial cuyos bordes limitantes restringen el intercambio de los
componentes de los mecanismos moleculares descritos en este
documento, que permiten la clasificación de elementos genéticos
según la función de los productos génicos que codifican.
Las microcápsulas formadas mediante la emulsión
requieren propiedades físicas apropiadas para permitir el
funcionamiento en la invención. En particular, el contenido de cada
microcápsula debe aislarse del contenido de las microcápsulas
circundantes.
Preferentemente, las microcápsulas que se usan
en los procedimientos de la presente invención podrán producirse en
un número muy grande y, de este modo, compartimentalizar una
biblioteca de elementos genéticos que codifican un repertorio de
productos génicos. La función de la microcápsula es permitir la
co-localización del ácido nucleico y del
polipéptido correspondiente codificado por el ácido nucleico. Esto
se consigue preferentemente mediante la capacidad de la
microcápsula de restringir sustancialmente la difusión de cadenas de
molde y de producto a otras microcápsulas.
En segundo lugar, los procedimientos de la
presente invención requieren que haya solamente un número limitado
de elementos genéticos por microcápsula formada en la emulsión. Esto
asegura que el producto génico de un elemento genético individual
se aislará de otros elementos genéticos. Por lo tanto, la unión
entre elemento genético y producto génico será muy específica. El
factor de enriquecimiento es mayor con uno o menos elementos
genéticos por microcápsula por término medio, o con dos o más copias
de un único elemento genético por microcápsula, siendo la unión
entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico
codificado tan estrecha como sea posible, ya que el producto génico
de un elemento genético individual se aislará de los productos de
otros elementos genéticos. Sin embargo, aunque no se use la
situación teóricamente óptima de, por término medio, un único
elemento genético o menos por microcápsula, se ha demostrado que es
beneficiosa una proporción de 5, 10, 50, 100 ó 1000 o más elementos
genéticos por microcápsula al clasificar una gran biblioteca. Rondas
posteriores de clasificación, incluyendo una encapsulación renovada
con diferente distribución de elementos genéticos, permitirán una
clasificación más rigurosa de los elementos genéticos.
Preferentemente, hay un solo menos por microcápsula.
En tercer lugar, la formación y la composición
de las microcápsulas no debe suprimir la función de la maquinaria
para la expresión de los elementos genéticos y la actividad de los
productos génicos usando sistemas de expresión eucariotas in
vitro.
Por consiguiente, las microcápsulas formadas
mediante la emulsión deben cumplir estos tres requerimientos. La
emulsión apropiada puede variar dependiendo de la naturaleza exacta
de los requerimientos en cada aplicación de la invención, como será
obvio para un experto en la materia.
El tamaño de microcápsula preferido variará
dependiendo de los requerimientos exactos de cualquier procedimiento
de selección individual que se vaya a realizar según la presente
invención. En todos los casos, la consideración principal es la
necesidad de la concentración requerida de los componentes en los
compartimentos individuales para conseguir una
transcripción/traducción eficaz. Esto puede equilibrarse con otros
requerimientos que pueden referirse al tamaño de la biblioteca de
genes, al enriquecimiento o a los procedimientos de
clasificación.
Si se proporcionan microcápsulas pequeñas,
pueden proporcionarse un número muy grande de microcápsulas
separadas en un volumen pequeño de emulsión. Además, el sumistro de
microcápsulas pequeñas aumenta la selectividad aumentando la
probabilidad de que solamente se produzca un tipo de producto génico
en el interior de una microcápsula dada. Por lo tanto, se prefiere
que, por término medio, no exista más de un elemento genético que
vaya a transcribirse y/o traducirse por compartimento para mantener
la unión entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico
codificado tan estrecha como sea posible. Sin embargo, aunque no se
use la situación teóricamente óptima de, por término medio, un
único elemento genético o menos por microcápsula, se ha demostrado
que es beneficiosa una proporción de 5, 10, 50, 100 ó 1000 o más
elementos genéticos por microcápsula al clasificar una gran
biblioteca. Rondas posteriores de clasificación, incluyendo una
encapsulación renovada con diferente distribución de elementos
genéticos, permitirán una clasificación más rigurosa de los
elementos genéticos. Preferentemente, no hay más de un único
elemento genético por microcápsula por término medio.
Es deseable que el volumen medio de las
microcápsulas sea menor de 5,2 x 10^{-16} m^{3} (que se
corresponde con una microcápsula esférica de diámetro menor de 10
\mum), más deseable que sea menor de 6,5 x 10^{-17} m^{3}
(que se corresponde con una microcápsula esférica de diámetro menor
de 1 \mum) y es aún más deseable un volumen de aproximadamente
4,2 x 10^{-18} m^{3} (que se corresponde con una microcápsula
esférica de diámetro de aproximadamente 2 \mum).
La concentración real de ADN o de ARN en las
microcápsulas puede aumentarse artificialmente por diversos
procedimientos que conocerán bien los expertos en la materia. Éstos
incluyen, por ejemplo, la adición de compuestos químicos de
exclusión de volumen tales como polietilenglicoles (PEG) y una
variedad de técnicas de amplificación de genes, incluyendo
transcripción usando ARN polimerasas incluyendo las de bacterias
tales como E. coli (Roberts, 1969; Blattner y Dahlberg,
1972; Robertsy col., 1975; Rodsenbergy col., 1975), las de
eucariotas, por ejemplo (Weily col., 1979; Manleyy col., 1983) y
las de bacteriófagos tales como T7, T3 y SP6 (Meltony col., 1984);
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saikiy col., 1988);
amplificación de replicasa Q\beta (Mieley col., 1983; Cahilly
col., 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaevy col., 1995); la
reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegreny col., 1988;
Barany, 1991); y sistemas de replicación autosostenida de secuencia
(Fahyy col., 1991) y amplificación por desplazamiento de cadena
(Walkery col., 1992). Pueden usarse ventajosamente técnicas de
amplificación de genes usando ciclos de temperatura (tales como PCR
y LCR) si las emulsiones y los sistemas de transcripción in
vitro o de transcripción-traducción acopladas
son termoestables.
Aumentar la concentración local eficaz de ácido
nucleico permite que las microcápsulas se usen más eficazmente. Por
lo tanto, pueden usarse microcápsulas que tienen volúmenes de hasta
sólo aproximadamente 5,2 x 10^{-16} m^{3} (que se corresponden
con una esfera de 10 \mum de diámetro) para muchos fines, aunque,
por supuesto, pueden usarse microcápsulas con volúmenes mayores si
se desea.
El tamaño de la microcápsula debe ser
suficientemente grande para contener todos los componentes
requeridos por las reacciones bioquímicas que se necesita que se
produzcan en el interior de la microcápsula. Por ejemplo, in
vitro, tanto las reacciones de transcripción como las reacciones
de transcripción-traducción acopladas requieren con
frecuencia una concentración total de nucleósidos trifosfato de
aproximadamente 2 mM.
Puede señalarse también que, para transcribir un
gen en una molécula pequeña de ARN sencillo de 500 bases de
longitud, se requerirá un mínimo de 500 moléculas de nucleósido
trisfosfato por microcápsula (8,33 x 10^{-22} moles). Para
constituir una solución 2 mM, este número de moléculas debe estar
contenido en una microcápsula de 4,17 x 10^{-19} litros (4,17 x
10^{-22} m^{3}) de volumen, que, si es esférica, tendría un
diámetro de 93 nM.
Además, particularmente en el caso de reacciones
que implican traducción, debe señalarse que los ribosomas
eucariotas necesarios para que se produzca la traducción tienen un
diámetro de aproximadamente 30 nm. Por lo tanto, el límite inferior
preferido para las microcápsulas es un diámetro de aproximadamente
0,1 \mum (100 nm).
Por lo tanto, el volumen de la microcápsula es
preferentemente del orden entre 5,2 x 10^{-22} m^{3} y 5,2 x
10^{-16} m^{3}, que se corresponde con una esfera de diámetro
entre 0,1 \mum y 10 \mum, más preferentemente entre 5,2 x
10^{-19} m^{3} y 6,5 x 10^{-17} m^{3} (1 \mum y 5
\mum).
Aunque se prefieren microcápsulas pequeñas para
ciertas aplicaciones, como en los procedimientos descritos en el
documento WO99/02671, es importante señalar que la presente
invención no se limita de ningún modo al suministro de
microcápsulas pequeñas y que los sistemas de transcripción y de
traducción también funcionan en microcápsulas grandes.
El tamaño de las microcápsulas en emulsión puede
variarse simplemente adaptando las condiciones de emulsión usadas
para formar la emulsión según los requerimientos del sistema de
selección.
El tamaño del compartimento puede variarse
(dentro de los límites de estabilidad de la emulsión y de
inactivación del RRL) mediante 1) un tiempo de mezcla aumentado, 2)
diferentes proporciones W/O y 3) diferentes concentraciones de
tensioactivo.
La distribución de tamaños de microcápsulas en
las emulsiones puede determinarse por cualquier procedimiento
conocido por un experto en la materia. Por ejemplo, la distribución
de tamaños puede evaluarse usando difracción de láser (por ejemplo,
usando un Coulter LS230 Particle Size Analyser) o mediante examen
microscópico.
El término "expresión", como se usa en este
documento, se usa en su sentido más amplio, para referirse a que un
ácido nucleico contenido en el elemento genético se convierte en su
producto génico. Por lo tanto, cuando el ácido nucleico es ADN, la
expresión se refiere a la transcripción del ADN en ARN; cuando el
ARN codifica una proteína, la "expresión" puede referirse
también a la traducción del ARN en una proteína. Cuando el ácido
nucleico es ARN, la "expresión" puede referirse a la
replicación de este ARN en copias de ARN adicionales, a la
transcripción inversa del ARN en ADN y, opcionalmente, a la
transcripción de este ADN en molécula(s) de ARN
adicional(es), así como, opcionalmente, a la traducción de
cualquiera de las especies de ARN producidas en proteínas.
Preferentemente, por lo tanto, la "expresión" se realiza
mediante uno o más procedimientos seleccionados del grupo
constituido por transcripción, transcripción inversa, replicación y
traducción.
La "expresión" del elemento genético puede
referirse, por lo tanto, a ADN, ARN o proteína, o a un ácido
nucleico o proteína que contiene bases o aminoácidos no naturales
(el producto génico) en el interior de la microcápsula de la
invención, de manera que el producto génico está confinado dentro de
la misma microcápsula que el elemento genético.
Puede usarse cualquier sistema de expresión
eucariota in vitro apropiado en la emulsión de la invención
con tal que incluya los componentes que se necesitan para la
transcripción y/o traducción. Si se desea glicosilación, entonces
pueden estar presentes también una o más glicosilasas, según sea
apropiado, para conseguir un patrón de glicosilación deseado.
El sistema de expresión puede, por ejemplo,
comprender todo o parte de un lisado o extracto celular. Por
ejemplo, puede usarse extracto de germen de trigo (Andersony col.,
1983) y está disponible en el mercado en Promega. Es deseable, sin
embargo, que el lisado celular sea un lisado celular de mamífero.
Puede ser un lisado de reticulocitos. Un lisado de reticulocitos
preferido es un lisado de reticulocitos de conejo (un "RRL").
El sistema RRL está bien caracterizado (véase, por ejemplo, Pelham
y Jackson, 1976) y está disponible en el mercado en Promega.
Sin embargo, puede usarse cualquier sistema de
expresión eucariota conveniente preparado a partir de otros
extractos celulares. Los extractos deben contener todos los
componentes que se requieren para la traducción del ARN (por
ejemplo, ribosomas, ARNt, aminoacil-ARNt sintetasas,
factores de inicio, de elongación y de terminación, etc), con los
extractos preferentemente suplementados con aminoácidos, ATP, GTP,
creatina fosfato y creatina fosfoquinasa, y otros cofactores tales
como Mg^{2+}.
Usando emulsiones de la presente invención es
posible obtener una expresión apreciable de un elemento genético
y/o actividad de un producto génico usando un sistema de expresión
eucariota in vitro presente en una emulsión. La expresión
y/o actividad está deseablemente a un nivel de al menos 1% de la que
se consigue para el producto génico con el sistema de expresión
antes de la formación de la emulsión. Más preferentemente, es de al
menos 10%, 20% o 30% de dicho nivel y/o actividad.
Un "elemento genético" es una molécula o
construcción molecular que comprende un ácido nucleico. Los
elementos genéticos de la presente invención pueden comprender
cualquier ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN o cualquier análogo,
natural o artificial de los mismos).
Pueden usarse ácido nucleicos que codifican
cualquier producto génico apropiado en los sistemas de transcripción
y/o traducción in vitro. Además de las secuencias
codificantes, los ácidos nucleicos pueden, por ejemplo, comprender
promotores, operadores, potenciadores, secuencias de inicio y de
terminación transduccional y transcripcional, secuencias de
poliadenilación, sitios de corte y empalme, regiones reguladoras
cadena arriba y cadena abajo, etc., según se requieran para la
transcripción y/o traducción. En algunos casos, puede preferirse
usar promotores inducibles y/o sensibles a temperatura para
asegurar que la expresión se produce solamente en una etapa
particular.
El componente de ácido nucleico del elemento
genético puede unirse además, covalentemente o no covalentemente, a
una o más moléculas o estructuras, incluyendo polipéptidos,
péptidos, entidades y grupos químicos, soportes de fase sólida
tales como perlas magnéticas, y similares. En los procedimientos de
la invención, estas estructuras o moléculas pueden diseñarse para
facilitar la clasificación y/o aislamiento del elemento genético que
codifica un producto génico con la actividad deseada.
Como se deducirá de lo siguiente, en muchos
casos, el polipéptido u otro grupo o construcción molecular es un
ligando o sustrato que se une directa o indirectamente o que
reacciona con el producto génico para marcar al elemento genético.
Esto permite la clasificación del elemento genético según la
actividad del producto génico.
El ligando o sustrato puede unirse con el ácido
nucleico mediante una disversidad de medios que serán obvios para
los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Hermanson, 1996).
Cualquier señal será suficiente para permitir la posterior
selección del elemento genético. La clasificación puede ser por
cualquier procedimiento que permita la separación, amplificación o
supervivencia preferencial del elemento genético marcado. Los
ejemplos incluyen la selección mediante unión (incluyendo técnicas
basadas en separación magnética, por ejemplo, usando
Dynabeads^{TM}) y mediante resistencia a la degradación (por
ejemplo, mediante nucleasas, incluyendo endonucleasas de
restricción):
Una manera en la que puede unirse una molécula
de ácido nucleico con un ligando o sustrato es mediante
biotinilación. Esto puede realizarse mediante amplificación por PCR
con un cebador de biotinilación en 5' tal que la biotina y el ácido
nucleico se unan covalentemente. Puede unirse un ácido nucleico
biotinilado con una microperla de poliestireno (0,035 a 0,2 \mum
de diámetro) que esté revestida con avidina o estreptavidina, por lo
que se unirá con el ácido nucleico con una afinidad muy alta. Esta
perla puede modificarse con sustrato o con ligando por cualquier
procedimiento adecuado tal como añadiendo sustrato biotinilado o
mediante unión covalente.
Como alternativa, puede unirse un ácido nucleico
biotinilado con avidina o estreptavidina que estén formando un
complejo con una gran molécula proteica tal como tiroglobulina (669
kD) o ferritina (440 kD). Este complejo puede modificarse con
sustrato o con ligando, por ejemplo, mediante unión covalente con el
grupo \alpha-amino de lisinas o mediante una
interacción no covalente tal como biotina-avidina.
El sustrato puede estar presente en forma no unida al elemento
genético pero conteniendo una "señal" inactiva que requiere una
etapa adicional para activarse, tal como fotoactivación (por
ejemplo, un análogo de biotina "enjaulado" (Sundbergy col.,
1995; Pirrung y Huang, 1996)). Después, el catalizador a
seleccionar convierte el sustrato en producto. Entonces la
"señal" puede activarse, y el sustrato "marcado" y/o el
producto unido mediante una molécula de unión a señal (por ejemplo,
avidina o estreptavidina) formar un complejo con el ácido nucleico.
La proporción de sustrato con respecto a producto unido con el
ácido nucleico mediante la "señal" reflejará, por lo tanto, la
proporción del sustrato y del producto en la solución.
Una alternativa es unir el ácido nucleico con un
anticuerpo específico de producto (u otra molécula específica de
producto). En esta situación, el sustrato (o uno de los sustratos)
está presente en cada microcápsula no unido con el elemento
genético, pero tiene una "señal" molecular (por ejemplo,
biotina, DIG o DNP). Cuando un catalizador a seleccionar convierte
el sustrato en producto, el producto retiene la "señal" y,
después, se captura en la microcápsula por el anticuerpo específico
de producto. De esta manera, el elemento genético solamente se
asocia con la "señal" cuando codifica o produce una enzima
capaz de convertir el sustrato en producto.
Cuando se detienen todas las reacciones y se
combinan las microcápsulas, los elementos genéticos que codifican
enzimas activas pueden enriquecerse usando un anticuerpo u otra
molécula que se una o que reaccione específicamente con la
"señal". Aunque tanto sustrato como producto tienen la señal
molecular, sólo los elementos genéticos que codifiquen el producto
génico activo se co-purificarán.
En una aplicación muy preferida, los
procedimientos de la presente invención son útiles para clasificar
bibliotecas de elementos genéticos. La invención, por consiguiente,
proporciona un procedimiento según los aspectos precedentes de la
invención, en el que los elementos genéticos se aíslan de una
biblioteca de elementos genéticos que codifican un repertorio de
productos génicos. En este documento, los términos
"biblioteca", "repertorio" y "combinación" se usan
según su significado común en la técnica, de manera que una
biblioteca de elementos genéticos codifica un repertorio de
productos génicos. En general, las bibliotecas se construyen a
partir de combinaciones de elementos genéticos y tienen propiedades
que facilitan la clasificación.
La selección inicial de un elemento genético de
una biblioteca de elementos genéticos usando la presente invención
requerirá en la mayoría de los casos la clasificación de un gran
número de variantes de elementos genéticos. Pueden generarse
bibliotecas de elementos genéticos de una variedad de maneras
diferentes, incluyendo las siguientes.
Pueden clonarse combinaciones de elementos
genéticos de origen natural a partir de ADN genómico o de ADNc
(Sambrooky col., 1989); por ejemplo, se ha demostrado que las
bibliotecas de anticuerpos de fagos, generadas mediante
amplificación por PCR de repertorios de genes de anticuerpos de
donantes inmunizados o no inmunizados, son fuentes muy eficaces de
fragmentos de anticuerpos funcionales (Wintery col., 1994;
Hoogenboom, 1997). Pueden generarse también bibliotecas de genes
codificando la totalidad (véase, por ejemplo, Smith, 1985; Parmley
y Smith, 1988) o parte de los genes (véase, por ejemplo, Lowmany
col., 1991) o combinaciones de genes (véase, por ejemplo, Nissimy
col., 1994) mediante un oligonucleótido sintético aleatorio o
dopado. También pueden generarse bibliotecas introduciendo
mutaciones en un elemento genético o en una combinación de elementos
genéticos "aleatoriamente" mediante una variedad de técnicas
in vivo, incluyendo; uso de "cepas mutantes" de
bacterias tales como E. coli mutD5 (Liao y col.,
1986, Yamagishiy col., 1990; Lowy col., 1996); uso del sistema de
hipermutación de anticuerpos de linfocitos B (Yelamosy col., 1995).
Pueden introducirse también mutaciones aleatorias tanto in
vivo como in vitro mediante mutágenos químicos e
ionización o irradiación UV (véase Friedbergy col., 1995), o
incorporación de análogos de bases mutagénicos (Freese, 1959;
Zaccoloy col., 1996). También pueden introducirse mutaciones
"aleatorias" en genes in vitro durante la
polimerización, por ejemplo, usando polimerasas con tendencia a
cometer errores (Leungy col., 1989).
Puede introducirse diversificación adicional
usando recombinación homóloga in vivo (véase Kowalczykowskiy
col., 1994) o in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b)
La presente invención puede usarse, por lo
tanto, para producir productos génicos deseados específicos o para
producir una serie de productos génicos diversos (que pueden ser
parcialmente o totalmente desconocidos) con fines de
clasificación.
El término "producto génico" se usa
en este documento en su sentido más amplio para incluir no sólo
polipéptidos sino también productos génicos de ARN. Por lo tanto,
incluye los productos de la transcripción en solitario, así como los
productos tanto de transcripción como de traducción.
Son productos génicos preferidos polipéptidos de
origen natural en células eucariotas (especialmente células de
mamíferos o humanas) pero no en células procariotas, o formas
mutantes de tales polipéptidos que tienen una o más modificaciones
de aminoácidos en relación con el polipéptido eucariota de tipo
natural. Las formas mutantes son útiles para generar diversidad,
por ejemplo con fines de investigación. Sin embargo, si se realizan
modificaciones de aminoácidos se prefiere que se limiten a un número
de tales modificaciones, por ejemplo, que se modifiquen menos de
50, menos de 25, menos de 10 o menos de 5 aminoácidos en relación
con el polipéptido de tipo natural. Las formas mutantes pueden
actuar, por ejemplo, como antagonistas o agonistas de una o más
actividades biológicas de un polipéptido de tipo silvetre. Por lo
tanto, pueden ser útiles para estudiar las relaciones entre
estructura y función, en investigación, en programas de desarrollo
de fármacos, etc. Pueden introducirse mutaciones en ácidos
nucleicos mediante cualquier procedimiento apropiado. Por ejemplo,
puede generarse una secuencia de ácido nucleico que incorpore un
cambio de secuencia deseado mediante mutagénesis dirigida. Éste
puede usarse después para permitir la expresión de un ARN o de un
polipéptido que tenga el correspondiente cambio en su secuencia.
Como alternativa, puede sintetizarse un ácido nucleico que incluya
una mutación dada. También pueden proporcionarse mutaciones usando
agentes mutágenos y/o irradiación.
Para ciertas aplicaciones el sistema de
expresión puede usarse para expresar un producto génico útil en la
replicación, reparación, mantenimiento o replicación de un ácido
nucleico de una célula eucariota, preferentemente de una célula de
mamífero o humana. El producto génico puede, por lo tanto, tener
actividad como polimerasa, transcriptasa inversa, ligasa o
telomerasa, por ejemplo. Puede tener más de una de estas
actividades. Si esta implicado en la reparación de ácidos
nucleicos, puede tener actividad exonucleasa.
Pueden producirse productos génicos en los
compartimentos formados por la fase hidrófila de la emulsión y que
contengan el sistema de expresión.
Los procedimientos pueden configurarse para
seleccionar moléculas de producto génico de ARN, ADN o proteína con
actividad catalítica, reguladora o de unión.
En el caso de la selección de un producto génico
con afinidad por un ligando específico, el elemento genético puede
unirse al producto génico en la microcápsula a través del ligando.
Sólo los productos génicos con afinidad por el ligando se unirán,
por lo tanto, al elemento genético en sí y, por lo tanto, sólo los
elementos genéticos que produzcan producto activo se conservarán en
la etapa de selección. En esta realización, el elemento genético
comprenderá, por lo tanto, un ácido nucleico que codifica el
producto génico unido a un ligando para el producto génico.
En esta realización, todos los productos génicos
a seleccionar contienen un supuesto dominio de unión por el que van
a seleccionarse y una característica común -una señal. El elemento
genético en cada microcápsula está físicamente unido al ligando. Si
el producto génico producido a partir del elemento genético tiene
afinidad por el ligando, se unirá a él y estará físicamente unido
al mismo elemento genético que lo codificó, dando lugar a que el
elemento genético esté "marcado". Al final de la reacción, se
combinan todas las microcápsulas y se combinan todos los elementos
genéticos y productos génicos en un entorno. Los elementos genéticos
que codifiquen productos génicos que presenten la unión deseada
pueden seleccionarse mediante purificación de afinidad usando una
molécula que se una específicamente, o que reaccione específicamente
con la "señal".
En una realización alternativa, pueden
clasificarse elementos genéticos basándose en que el producto
génico, que se une al ligando, simplemente oculta al ligando de,
por ejemplo, parejas de unión adicionales. Ante esta eventualidad,
el elemento genético, en lugar de retenerse durante la etapa de
purificación de afinidad, puede eluirse selectivamente mientras que
otros elementos genéticos quedan unidos.
En una realización alternativa, la invención
proporciona un procedimiento según el segundo aspecto de la
invención, en el que en la etapa (b) los productos génicos se unen
a elementos genéticos que los codifican. Los productos génicos
junto con los elementos genéticos unidos se clasifican después como
resultado de la unión de un ligando a los productos génicos que
tienen la actividad deseada. Por ejemplo, todos los productos
génicos pueden contener una región invariable que se una
covalentemente o no covalentemente al elemento genético, y una
segunda región que esté diversificada para generar la actividad de
unión deseada.
La clasificación por afinidad es dependiente de
la presencia de dos miembros de una pareja de unión en tales
condiciones que pueda producirse la unión. Cualquier pareja de unión
puede usarse para este fin. Como se usa en este documento, el
término pareja de unión se refiere a cualquier pareja en moléculas
capaz de unirse entre sí. Los ejemplos de parejas de unión que
pueden usarse en la presente invención incluyen un antígeno y un
anticuerpo o fragmento del mismo capaz de unirse con el antígeno, la
pareja biotina-avidina/estreptavidina (Savagey
col., 1994), un polipéptido de unión dependiente de calcio y un
ligando del mismo (por ejemplo, calmodulina y un péptido de unión a
calmodulina (Stofkoy col., 1992, Montigianiy col., 1996)), parejas
de polipéptidos que se ensamblan para formar una cremallera de
leucina (Tripety col., 1996), histidinas (normalmente péptidos de
hexahistidina) y Cu^{2+}, Zn^{2+} y Ni^{2+} quelados (por
ejemplo, Ni-NTA; Hochuliy col., 1987), proteínas de
unión a ARN y de unión a ADN (Klug, 1995) incluyendo las que
contienen motivos de dedos de zinc (Klug y Schwabe, 1995) y ADN
metiltransferasas (Anderson, 1993) y sus sitios de unión a ácidos
nucleicos.
Sin embargo, la utilidad de ciertos
procedimientos de selección basados en afinidad puede ser limitada.
Especialmente con interacciones de baja a media afinidad, la
semivida de las interacciones puede ser con frecuencia demasiado
corta en comparación con el tiempo que se requiere para detectar las
interacciones.
Por lo tanto, en una realización de la presente
invención, los procedimientos de selección se basan en aumentar la
afinidad de las interacciones intermoleculares permitiendo que se
produzcan interacciones multivalentes. El aumento aparente de
afinidad resultante que se consigue con una interacción
multivalente, también denominada avidez, se debe al hecho de que
tienen lugar dos o más interacciones de unión en el mismo complejo
molecular, ya que el coste entrópico adicional de la segunda o más
interacciones es muy pequeño. Esto es porque ya se han perdido la
mayoría de los grados de libertad con la inmovilización del ligando
multivalente mediante la unión con el primer sitio de unión. Sin
embargo, la avidez puede tener efectos particularmente drásticos
sobre la cinética de disociación (k_{off}), ya que tienen que
romperse todas las interacciones antes de que pueda producirse la
disociación.
Por lo tanto, en esta realización, pueden
seleccionarse moléculas que interactúen permitiendo que se produzcan
interacciones multivalentes entre las moléculas, aumentando por lo
tanto la estabilidad de cualquier complejo que se forme en
comparación con una interacción monovalente correspondiente.
Preferentemente, la primera y/o segunda molécula
de interacción, por ejemplo, el producto génico y la molécula de
ligando a la que se une, se han modificado para aumentar su
valencia. Preferentemente, existen uno o más grupos reactivos en
las moléculas de producto génico o de ligando, o en ambas, de manera
que las moléculas de producto génico (y/o de ligando) se asocian
entre sí para formar complejos de producto génico multivalentes y/o
complejos de moléculas de ligando multivalentes. Los complejos
multivalentes pueden seleccionarse después para la unión según la
invención. Preferentemente, los grupos reactivos forman un enlace
covalente en la interacción.
El término "complejo multivalente", como se
usa en este documento, se refiere a un complejo molecular que
comprende (i) al menos dos moléculas de producto génico o al menos
un molécula de un producto génico multivalente y (ii) una molécula
de ligando multivalente, en el que las al menos dos moléculas de
producto génico interactúan con la molécula de ligando o la al
menos una molécula de un producto génico multivalente interactúa con
la molécula de ligando mediante al menos dos valencias.
En tales procedimientos de selección de avidez,
la molécula de ligando es preferentemente multivalente. Por
ejemplo, cuando la molécula de ligando es un polipéptido, la
molécula de ligando puede ser multivalente en virtud de que se
exprese como proteína de fusión a un tercer polipéptido con el que
multimeriza.
Las moléculas de producto génico y/o de ligando
pueden comprender una señal, por ejemplo, una señal o resto de
biotina o de un epítopo myc, para facilitar la purificación de los
complejos formados entre ellos, y/o para facilitar la recuperación
de las moléculas de producto génico y/o de ligando para su análisis
e identificación.
La molécula de ligando es normalmente un
multímero, tal como un dímero, o capaz de formar un homomultímero
en las condiciones de reacción usadas en los procedimientos de la
invención. Como alternativa, la molécula de ligando puede ser un
heteromultímero. Se prefiere usar moléculas de ligando que sean
polipéptidos que hayan sido fabricados para que sean multiméricos
pero cuyas subunidades constituyentes no forman normalmente
multímeros. Esto puede conseguirse mediante unión química de dos o
más moléculas para formar un multímero unido covalentemente. Como
alternativa, en el caso de moléculas de ligando que son polipéptidos
y que se unen a productos génicos que son polipéptidos, las
moléculas pueden expresarse como fusión a un tercer polipéptido,
formando el tercer polipéptido homomultímeros que producen
eficazmente la multimerización de la secuencia polipeptídica del
ligando fusionado. Un ejemplo de un tercer polipéptido adecuado
(denominado en este documento polipéptido "gancho") es la
glutatión-S-transferasa (GST), que
forma dímeros. Los polipéptidos gancho preferidos proporcionan
buenos niveles de expresión de productos solubles. En una
realización, se prefieren polipéptidos gancho que sean adecuados
para secretarse en el periplasma bacteriano (por ejemplo, GST
después de la eliminación de los 3 residuos Cys de la superficie
(Tudyka y Skerra, 1997)). La molécula de ligando puede
proporcionarse como una pluralidad de moléculas de ligando.
En una realización particularmente preferida de
la invención, los productos génicos son polipéptidos codificados
por primeros polinucleótidos y los polinucleótidos se asocian con
los polipéptidos correspondientes de manera que cuando se
selecciona un primer polipéptido durante los procedimientos de
investigación de la presente invención, la secuencia
polinucleotídica que codifica el polipéptido seleccionado está
físicamente unida, o en estrecha proximidad, y puede recuperarse
fácilmente y, por ejemplo, secuenciarse para determinar la identidad
del polipéptidos seleccionado. Para conseguir esto, la pluralidad
de primeros polinucleótidos en un compartimento debe ser tal que,
por término medio, haya un único polinucleótido por uso en la
emulsión de la presente invención.
Se describen detalles adicionales de
procedimientos de selección basados en avidez, que pueden usarse en
los procedimientos de la presente invención, en la solicitud de
Patente de Gran Bretaña en tramitación 0114856.8.
Cuando la selección es por catálisis, el
elemento genético en cada microcápsula puede comprender el sustrato
de la reacción. Si el elemento genético codifica un producto génico
capaz de actuar como catalizador, el producto génico catalizará la
conversión del sustrato en el producto. Por lo tanto, al final de la
reacción, el elemento genético está físicamente unido al producto
de la reacción catalizada. Cuando se combinan las microcápsulas y
se combinan los reactivos, los elementos genéticos que codifican
moléculas catalíticas pueden enriquecerse seleccionando a favor de
cualquier propiedad específica del producto.
Por ejemplo, el enriquecimiento puede ser
mediante purificación de afinidad usando una molécula (por ejemplo,
un anticuerpo) que se une específicamente al producto. Así mismo, el
producto génico puede tener el efecto de modificar un componente de
ácido nucleico del elemento genético, por ejemplo, por metilación (o
por desmetilación) o por mutación del ácido nucleico,
convirtiéndolo en resistente o susceptible al ataque por nucleasas,
tales como endonucleasas de restricción.
Como alternativa, puede realizarse una selección
indirectamente acoplando una primera reacción a reacciones
posteriores que tengan lugar en la misma microcápsula. Existen dos
formas generales en las que esto puede realizarse. En primer lugar,
el producto de la primera reacción puede hacerse reaccionar con, o
unirse a, una molécula que no reaccione con el sustrato de la
primera reacción. En segundo lugar, la reacción acoplada sólo se
desarrollará en presencia del producto de la primera reacción.
Después, un elemento genético activo puede purificarse mediante
selección por las propiedades del producto de la segunda
reacción.
Como alternativa, el producto de la reacción que
se está seleccionando puede ser el sustrato o cofactor de una
segunda reacción catalizada por enzimas. La enzima que cataliza la
segunda reacción puede traducirse in situ en las
microcápsulas o incorporarse en la mezcla de reacción antes de la
microencapsulación. Sólo cuando se lleva a cabo la primera
reacción, la enzima acoplada generará un producto seleccionable.
Este concepto de acoplamiento puede
desarrollarse para incorporar múltiples enzimas, usando cada una
como sustrato el producto de la reacción previa. Esto permite la
selección de enzimas que no reaccionarán con un sustrato
inmovilizado. También puede diseñarse para proporcionar una
sensibilidad aumentada mediante la amplificación de la señal si un
producto de una reacción es un catalizador o un cofactor para una
segunda reacción o serie de reacciones que conducen a un producto
seleccionable (por ejemplo, véase Johannson y Bates, 1988;
Johannsson, 1991). Además, un sistema de cascada enzimática puede
basarse en la producción de un activador para una enzima o en la
destrucción de un inhibidor de enzimas (véase Mizey col., 1989). El
acoplamiento tiene también la ventaja de que puede usarse un
sistema de selección común para un grupo completo de enzimas que
generan el mismo producto, y permite la selección de
transformaciones químicas complejas que no puede realizarse en una
sola etapa.
Por lo tanto, tal procedimiento de acoplamiento
permite la evolución de nuevas "rutas metabólicas" in
vitro de manera gradual, seleccionando y mejorando primero una
etapa y después la siguiente. La estrategia de selección se basa en
el producto final de la ruta, de manera que todas las etapas
anteriores pueden evolucionarse de manera independiente o
secuencialmente sin que tenga que establecerse un nuevo sistema de
selección para cada etapa de la reacción.
Expresado de una manera alternativa, se
proporciona un procedimiento de aislamiento de uno o más elementos
genéticos que codifican un producto génico que tiene una actividad
catalítica deseada, que comprende las etapas de:
(1) expresar elementos genéticos para dar sus
productos génicos respectivos;
\newpage
(2) permitir que los productos génicos catalicen
la conversión de un sustrato en un producto, que puede ser o no
directamente seleccionable, según la actividad deseada;
(3) opcionalmente, acoplar la primera reacción
con una o más reacciones posteriores, estando controlada cada
reacción por el producto de las reacciones previas, y conduciendo a
la generación de un producto final seleccionable;
(4) unir el producto seleccionable de la
catálisis a los elementos genéticos mediante:
- (a)
- acoplamiento de un sustrato con los elementos genéticos de tal manera que el producto permanezca asociado con los elementos genéticos, o
- (b)
- reacción o unión del producto seleccionable con los elementos genéticos mediante una "señal" molecular adecuada unida al sustrato que permanece sobre el producto, o
- (c)
- acoplamiento del producto seleccionable (pero no del sustrato) a los elementos genéticos por medio de una reacción específica de producto o de una interacción con el producto;
(5) seleccionar el producto de la catálisis
junto con el elemento genético al que está unido por medio de una
reacción específica o de una interacción con el producto, o mediante
purificación de afinidad usando una "señal" molecular adecuada
unida al producto de la catálisis; en el que en las etapas (1) a (4)
cada elemento genético y su producto génico respectivo están
contenidos dentro de una microcápsula formada a partir de una
emulsión de la invención.
Puede usarse un sistema similar para seleccionar
por propiedades reguladoras de enzimas.
En el caso de la selección a favor de una
molécula reguladora que actúa como activador o como inhibidor de un
procedimiento bioquímico, los componentes del procedimiento
bioquímico pueden traducirse in situ en cada microcápsula o
pueden incorporarse en la mezcla de reacción antes de la
microencapsulación. Si el elemento genético que se está
seleccionado va a codificar un activador, puede realizarse la
selección para el producto de la reacción regulada, como se ha
descrito anteriormente en relación con la catálisis. Si se desea un
inhibidor, la selección puede ser por una propiedad química
específica del sustrato de la reacción regulada.
Por lo tanto, se proporciona un procedimiento de
clasificación de uno o más elementos genéticos que codifican un
producto génico que presenta una actividad reguladora deseada, que
comprende las etapas de:
(1) expresar los elementos genéticos para dar
sus productos génicos respectivos;
(2) permitir que los productos génicos activen o
inhiban una reacción bioquímica o una secuencia de reacciones
acopladas según la actividad deseada, de manera tal que permitan la
generación o la supervivencia de una molécula seleccionable;
(3) unir la molécula seleccionable con los
elementos genéticos mediante:
- (a)
- teniendo la molécula seleccionable o el sustrato del que deriva unido a los elementos genéticos, o
- (b)
- reacción o unión del producto seleccionable con los elementos genéticos por medio de una "señal" molecular adecuada unida al sustrato que permanece sobre el producto, o
- (c)
- acoplamiento del producto de la catálisis (pero no del sustrato) a los elementos genéticos por medio de una reacción específica de producto o por interacción con el producto;
(4) seleccionar el producto seleccionable junto
con el elemento genético al que está unido por medio de una reacción
específica o por interacción con el producto seleccionable, o
mediante purificación de afinidad usando una "señal" molecular
adecuada unida al producto de la catálisis;
en el que en las etapas (1) a (4) cada elemento
genético y su producto génico respectivo están contenidos en el
interior de una microcápsula formada mediante una emulsión de la
invención.
La invención proporciona la clasificación de
microcápsulas intactas cuando lo permiten las técnicas de
clasificación que se estén empleando. Las microcápsulas pueden
clasificarse como tales cuando el cambio inducido por el producto
génico deseado se produce o se manifiesta en la superficie de
microcápsula o es detectable desde el exterior de la microcápsula.
El cambio puede estar causado por la acción directa del producto
génico, o por una acción indirecta, en la que una serie de
reacciones, una o más de las cuales implican el producto génico que
tiene la actividad deseada, conducen al cambio. Por ejemplo, la
microcápsula puede estar configurada de tal manera que el producto
génico se presente en su superficie y, de este modo, sea accesible a
reactivos. Cuando la microcápsula es una microcápsula membranosa,
el producto génico puede dirigirse o puede dirigir una molécula a
la membrana de la microcápsula. Esto puede conseguirse, por ejemplo,
empleando una secuencia de localización de membrana, como las que
derivan de proteínas de membrana, que favorecerá la incorporación
de una molécula fusionada o unida en la membrana de la microcápsula.
Como alternativa, cuando la microcápsula se forma por separación de
fases, tal como con emulsiones de agua en aceite, una molécula que
tenga partes que sean más solubles en la fase extracapsular se
colocará de tal manera que estas partes se sitúen en los límites de
la microcápsula.
En un aspecto preferido de la invención, sin
embargo, se aplica una clasificación de microcápsulas por sistemas
de clasificación que se basan en un cambio en las propiedades
ópticas de la microcápsula, por ejemplo, características de
absorción o de emisión de las mismas, por ejemplo, alteración de las
propiedades ópticas de la microcápsula como resultado de una
reacción que conduce a cambios en la absorbancia, luminiscencia,
fosforescencia o fluorescencia asociada con la microcápsula. Todas
estas propiedades se incluyen en el término "ópticas". En tal
caso, las microcápsulas pueden clasificarse por clasificación
activada por luminiscencia, fluorescencia o fosforescencia. En una
realización muy preferida, se emplea la clasificación activada por
fluorescencia para clasificar microcápsulas en las que la
producción de un producto génico que tiene una actividad deseada se
acompaña de la producción de una molécula fluorescente en la
cápsula. Por ejemplo, el propio producto génico puede ser
fluorescente, por ejemplo, una proteína fluorescente tal como GFP.
Como alternativa, el producto génico puede inducir o modificar la
fluorescencia de otra molécula, tal como uniéndose a ella o
reaccionando con ella.
Pueden identificarse las microcápsulas en virtud
de un cambio inducido por el producto génico deseado que o se
produce o se manifiesta en la superficie de la microcápsula o es
detectable desde el exterior como se ha descrito en la sección (iv)
(Clasificación de microcápsulas). Este cambio, cuando se identifica,
se usa para desencadenar la modificación del gen en el interior del
compartimento. En un aspecto preferido de la invención, la
identificación de microcápsulas se basa en un cambio en las
propiedades ópticas de la microcápsula que resulta de una reacción
que conduce a luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia en el
interior de la microcápsula. La modificación del gen en el interior
de las microcápsulas se desencadenará mediante la identificación de
luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia. Por ejemplo, la
identificación de luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia
puede desencadenar el bombardeo del compartimento con fotones (u
otras particulas u ondas) que conduce a la modificación del
elemento genético. Se ha descrito anteriormente un procedimiento
similar para la clasificación rápida de células (Keijy col., 1994).
La modificación del elemento genético puede ser el resultado de,
por ejemplo, el acoplamiento de una "señal" molecular,
enjaulada por un grupo protector fotolábil con los elementos
genéticos: el bombardeo con fotones de una longitud de onda
apropiada conduce a la eliminación de la jaula. Después, se
combinan todas las microcápsulas y se combinan los elementos
genéticos juntos en un entorno. Los elementos genéticos que
codifican productos génicos que presentan la actividad deseada
pueden seleccionarse mediante purificación de afinidad usando una
molécula que se una específicamente a o que reacciona
específicamente con la "señal".
Se apreciará también que, según la presente
invención, no es necesario que todos los procedimientos de
transcripción/replicación y/o traducción y selección se desarrollen
en una única etapa, y que todas las reacciones tengan lugar en una
microcápsula. El procedimiento de selección puede comprender dos o
más etapas. En primer lugar, la transcripción/replicación y/o la
traducción de cada elemento genético de una biblioteca de elementos
genéticos puede tener lugar en una primera microcápsula. Cada
producto génico se une después al elemento genético que lo codifica
(que se encuentra en la misma microcápsula). Después, las
microcápsulas se rompen y los elementos genéticos unidos a sus
productos génicos respectivos se purifican opcionalmente. Como
alternativa, los elementos genéticos pueden unirse a sus productos
génicos respectivos usando procedimientos que no se basan en la
encapsulación. Por ejemplo, presentación en fagos (Smith, G. P.,
1985), presentación en polisomas (Matteheakkisy col., 1994), fusión
de ARN-péptido (Roberts y Szostak, 1997) o fusión de
péptido represor lac (Cull,y col., 1992).
En la segunda etapa del procedimiento, cada
elemento genético purificado unido a su producto génico se coloca
en una segunda microcápsula que contiene los componentes de la
reacción a seleccionar. Después, se inicia esta reacción. Después
de finalizar las reacciones, las microcápsulas se rompen de nuevo y
se seleccionan los elementos genéticos modificados. En el caso de
reacciones multietapa complejas en las que están implicados muchos
componentes y etapas de reacción individuales, pueden realizarse una
o más etapas intermedias entre la etapa inicial de generación y de
unión del producto génico al elemento genético, y la etapa final de
generación del cambio seleccionable en el elemento genético.
El sistema puede configurarse de manera que la
actividad de unión, catalítica o reguladora deseada codificada por
un elemento genético conduzca, directa o indirectamente, a la
activación de la expresión de un "gen informador" que esté
presente en todas las microcápsulas. Sólo los productos génicos con
la actividad deseada activan la expresión del gen informador. La
actividad resultante de la expresión del gen informador permite la
selección del elemento genético (o del compartimento que lo
contiene) mediante cualquiera de los procedimientos descritos en
este documento.
Por ejemplo, la activación del gen informador
puede ser el resultado de la actividad de unión del producto génico
de manera análoga al "sistema de dos híbridos" (Fields y Song,
1989). La activación también puede ser resultado del producto de
una reacción catalizada por un producto génico deseable. Por
ejemplo, el producto de la reacción puede ser un inductor
transcripcional del gen informador. Por ejemplo, puede usarse
arabinosa para inducir la transcripción del promotor araBAD. La
actividad del producto génico deseable puede producir también la
modificación de un factor de transcripción, dando como resultado la
expresión del gen informador. Por ejemplo, si el producto génico
deseado es una quinasa o fosfatasa, la fosforilación o
desfosforilación de un factor de transcripción puede conducir a la
activación de la expresión del gen informador.
Según aspectos adicionales de los procedimientos
de la presente invención, los procedimientos pueden comprender la
etapa adicional de amplificar los elementos genéticos. Puede usarse
la amplificación selectiva como un medio para enriquecer a favor de
los elementos genéticos que codifican el producto génico
deseado.
En todas las configuraciones anteriores, puede
amplificarse el material genético contenido en los elementos
genéticos y repetirse el procedimiento en etapas reiteradas. La
amplificación puede ser mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (Saikiy col., 1988) o usando una de una variedad de otras
técnicas de amplificación de genes incluyendo: amplificación de
replicasa Q\beta (Cahill, Foster y Mahan, 1991; Chetverin y
Spirin, 1995; Katanaev, Kumasov y Spirin, 1995); la reacción en
cadena de la ligasa (LCR) (Landegreny col., 1988; Barany, 1991); el
sistema de replicación autosostenida de la secuencia (Fahy, Kwoh y
Gingeras, 1991) y amplificación con desplazamiento de cadena
(Walkery col., 1992).
Se usó una formulación de fase oleosa que
comprendía 4,5% v/v de monooletado de sorbitán (Span 80, Fluka;
85548) y 0,4% v/v de monooleato de polioxietilensorbitán (Tween 80,
Sigma Ultra; P-8074) y 0,05% v/v de
t-octilfenoxipolietoxietanol
(Triton-X 100, Sigma) en aceite mineral (Sigma;
M-3516) ("mezcla original de CSR") para
emulsionar una reacción de expresión de RRL. Todas las reacciones
de RRL se realizaron usando el sistema rápido de
transcripción/traducción acopladas TNT T7 (Promega) que expresa
luciferasa de luciérnaga a partir de un molde plasmídico. Se preparó
en hielo una reacción de expresión de 50 \mul que comprendía RRI
a 80%, (v/v), metionina 0,02 mM y molde plasmídico de luciferasa (1
\mug). Se emulsionó una alícuota de 40 \mul de esta reacción
mediante la adición gota a gota (1 gota por 5 segundos) a 100
\mul de fase oleosa enfriada en hielo con agitación constante
(1000 rpm). Después de
la adición de la última gota (aproximadamente 20 segundos), se continuó agitando durante 3-4 minutos adicionales.
la adición de la última gota (aproximadamente 20 segundos), se continuó agitando durante 3-4 minutos adicionales.
Las reacciones emulsionadas se incubaron a 30ºC
durante 1 hora y se extrajeron usando éter como se ha descrito
anteriormente. Se midió la actividad de luciferasa en un lector de
placas de 96 pocillos usando reactivo de ensayo de luciferasa
(Promega). La reacción no emulsionada se extrajo también con éter
para permitir una correcta comparación de las actividades. Esto
demostró que los niveles de expresión en la emulsión eran
normalmente muy bajos, 0,1% de los de la reacción no
emulsionada.
Usando una formulación de fase oleosa
"reducida", que comprendía 1,5% (v/v) de Span 80 (SIGMA) en
aceite mineral (SIGMA), se observaron rendimientos ligeramente
mejorados de hasta 0,7%, especialmente con la adición de DTT a 20
\muM. La inclusión de DTT usando la mezcla oleosa de CSR original
fue extremadamente perjudicial para la formación de la emulsión. Se
ensayaron varias proporciones de fase acuosa en fase oleosa y se
variaron los tiempos de mezcla. Las condiciones descritas
anteriormente proporcionaran la mayor actividad con mantenimiento de
la integridad de la emulsión durante el periodo de incubación.
Por lo tanto, la emulsión de una reacción de RRL
usando las formulaciones de emulsión "clásicas" basadas en
Span80 solo o junto con Tween80 y TritonX-100 dio
como resultado una pérdida completa de la actividad de traducción
in vitro (< 1% según la expresión fuera de la emulsión
(Tabla 2)) a juzgar por la expresión de la enzima de luciferasa de
luciérnaga.
Además se observó un cambio de color del
componente de hemina del RRL de un color rosa oscuro a un marrón
oxidado en cuestión de minutos después de la emulsión (véase la Fig.
1), indicando la oxidación de la hemina, presumiblemente atribuible
a un componente de la fase oleosa.
La traducción en mamíferos está regulada, entre
otras cosas, por la familia de las quinasas
eIF-2\alpha en respuesta a estrés celular (véase
la revisión por Dever (1999), TIBS, 24, 398-403).
Las quinasas eIF-2\alpha contienen un dominio
sensor y un dominio quinasa eIF-2 conservado. Su
función es fosforilar eIF-2\alpha (lo que detiene
la traducción) en respuesta a estímulos recibidos a través del
dominio sensor. Esto sirve para proteger a la célula de malgastar
recursos en circunstancias de estrés celular (la traducción de
proteínas consume grandes cantidades de energía celular) o como
defensa antiviral, evitando la expresión del genoma viral. Se
conocen cuatro quinasas diferentes que responden a distintos tipos
de señales de estrés (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se dedujo que una de las razones de la detención
completa de la traducción (dada la decoloración de la hemina en el
RRL) era el estrés oxidativo causado por la difusión de especies
oxidantes de la fase oleosa a la fase acuosa.
Se identificó que el componente responsable de
la decoloración y de la inhibición de la traducción estaba contenido
tanto en el tensioactivo Span80 como en el Tween80, pero no en el
aceite mineral.
Se trató de tamponar el cambio del potencial
redox proporcionando compuestos antioxidantes o reductores en la
fase oleosa (BDH, BDA) y/o en la fase acuosa (DTT, ácido ascórbico).
Además, se trató de retirar las especies oxidantes de la fase
oleosa haciendo reaccionar la fase oleosa (mezcla de tensioactivo y
aceite mineral) o el Span80 solo con perlas de borohidruro de
(poliestirilmetil)trimetilamonio (Novabiochem) o con DTT
antes de la emulsión. Aunque ralentizaba la decoloración (Fig. 1),
esto producía solamente ligeras mejoras en las eficacias de
traducción (Tabla 2). Además, el tratamiento de la fase oleosa con
perlas de borohidruro parecía reducir las propiedades emulsionantes
del tensioactivo/fase oleosa, conduciendo a emulsiones más
desestabilizadas.
Sólo el DTT (a una concentración final de 20
\muM) produjo una mejora ligera pero uniforme en los niveles de
expresión en la emulsión en comparación con la reacción no
emulsionada (Tabla 2)). Niveles mayores de DTT demostraron ser
perjudiciales para el sistema de expresión de RRL (no se muestran
los datos). En general, el DTT también demostró desestabilizar las
emulsiones.
\vskip1.000000\baselineskip
También se intentó una inhibición directa de la
ruta de las eIF2 quinasas usando AMPc o
2-aminopurina (2-AP). Aunque el
AMPc produjo una pequeña mejora cuando se usó en solitario, no
demostró ser aditiva a los efectos beneficiosos del DTT (no se
muestran los datos). Tanto el AMPc como el 2-AP son
inhibidores muy inespecíficos de las eIF2 quinasas (en la
actualidad no existen inhibidores específicos disponibles) y
presumiblemente interfieren con otros procedimientos en el sistema
de traducción del RRL.
\vskip1.000000\baselineskip
El hecho de que ni siquiera altas
concentraciones de DTT consigan recuperar más que una actividad de
traducción residual, sugiere que otros factores aparte de la
oxidación deben estar contribuyendo la inhibición de la traducción.
Una posibilidad era una desnaturalización proteica debida al
procedimiento de emulsión, es decir, a la mezcla enérgica de una
fase acuosa hidrófila y una fase oleosa hidrófoba. De hecho, se sabe
desde hace algún tiempo que la adición de BSA (presumiblemente
conteniendo alguna proteína desnaturalizada por la
congelación-descongelación) produce una detención
de la traducción (Matts y col (1993), Biochemistry, 32,
7323-7328), incluso sin emulsión. Se confirmaron
los resultados de Matts en 1993 con y sin emulsión. También se
intentó tamponar el efecto suplementando los lisados de RRL con
chaperonas, en particular con HSP70 y HSP90 (SIGMA). De nuevo, esto
produjo sólo pequeñas mejoras (no aditivas) (no se muestran los
datos), que podían igualarse o superarse mediante la adición de
pequeñas cantidades (5%) de glicerol (no se muestran los datos), que
se sabe que protege a las proteínas de la desnaturalización.
Dado este bajo nivel de actividad, se llevaron a
cabo intentos para identificar una nueva formulación de fase oleosa
con un menor potencial de causar estrés oxidativo o
desnaturalización proteica durante el procedimiento de emulsión.
Después de que los intentos de mejorar la
actividad con emulsiones basadas en Span80 no tuvieran éxito, se
ensayaron nuevos tensioactivos.
Se realizaron las reacciones de emulsión como se
ha descrito en el Ejemplo 1, pero sustituyendo los tensioactivos
usados en esa reacción (Span80, Tween80 y Triton) con tensioactivos
basados en silicona. De éstos, se descubrió que los tensioactivos
basados en silicona químicamente inerte tenían éxito.
El copolímero de
polixiloxano-policetil-polietilenglicol
(ABIL EM90^{TM}) (Goldschmidt) usado a 4% (v/v) en aceite mineral
proporcionó mejoras significativas. Emulsionando como se ha descrito
en el Ejemplo 1, con la excepción de un tiempo de agitación
reducido (1,5 minutos), los niveles de expresión aumentaron
drásticamente hasta 39% (Tabla 2) de los de la reacción no
emulsionada. Esta emulsión era estable a lo largo del periodo de
incubación, y la visualización microscópica reveló que la mayoría de
los compartimentos tenían diámetros en el intervalo de
2-5 micrómetros
(Fig. 2).
(Fig. 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Los telómeros son estructuras de ADN específicas
que se encuentran en los extremos de los cromosomas en eucariotas.
Se añaden al extremo 3' (que queda libre después de retirarse el
cebador de ARN usado para la replicación de ADN) mediante una
enzima telomerasa especializada que comprende un componente de ARN y
un componente proteico. En humanos, la enzima comprende ARN
telomérico humano (hTR) y el polipéptido de telomerasa humano
(hTERT) y añade copias repetidas de una repetición hexomérica
(TTAGGG) en los extremos de los cromosomas. La actividad telomerasa
se ha implicado tanto en el desarrollo como en la progresión de
tumores, así como en la senescencia y en la muerte celular
programada.
Hasta ahora la telomerasa no se ha expresado con
éxito de manera funcional en procariotas, presumiblemente porque
requiere chaperonas especializadas (por ejemplo, HSP 90) y factores
accesorios tanto para su ensamblaje como para su función. Pero
puede expresarse en células eucariotas y también en el sistema de
traducción in vitro del lisado de reticulocitos de conejo
(Weinrich y col (1997), Nat. Genet., 17, 498-502/
Beattie y col (1998, 8, 177-180).
La fase oleosa del ejemplo 5 se ensayó para
determinar la expresión de la telomerasa humana funcional en RRL.
Se prepararon moldes lineales dirigidos por T7 que codificaban hTERT
wt y hTR en tándem clonados cadena abajo del IRES de pCITE4a
(Novagen) o hTERT clonado en pCITE4a con hTR clonado por separado en
una variante del pCITE4a (en la que se ha delecionado el IRES
(pCITE-E)) o un mutante de deleción inactivo de
telomerasa mediante amplificación por PCR usando los plásmidos
parentales y cebadores CITET7ba
(5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAA-3')
(ID SEC Nº: 1) y CITEterfo
(5'-CCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGC-3') (ID
SEC Nº:2) respectivos.
Las reacciones de expresión (50 \mul)
comprendían RRL (80% v/v), construcción de telomerasa (véase la
leyenda de la Figura 3), metionina (1 mM), sustrato de telomerasa
(TS (sustrato de telomerasa) cebador
(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')
(Intergen) 1 \muM), potenciador de PCR (Promega) (3 \mul), dNTP
(25 \muM), DTT (20 \muM). Se formaron las emulsiones en
condiciones refrigeradas (en hielo) exactamente como se ha descrito
anteriormente y se incubaron a 30ºC durante 1,5 horas. Después, las
emulsiones se extrajeron con 200 \mul de
cloroformo-alcohol isoamilico, seguido de la
extracción de la fase acuosa con 1 volumen de
fenol-cloroformo.
Los productos de reacción de telomerasa se
precipitaron con etanol y se resuspendieron en 20 \mul de agua
estéril. Después, se usó un ensayo TRAP basado en PCR (Kim 94)
(Intergen) para detectar productos de extensión de la telomerasa
formados en la emulsión. La actividad telomerasa produce una escala
característica (con 6pb de separación para cada repetición) (véase
fig. 3).
Los resultados indicaron expresión de telomerasa
funcionalmente activa a partir del molde WT en emulsión. Los
experimentos de control omitiendo la adición del gen de telomerasa o
usando un mutante de deleción inactivo, dieron resultados negativos
(Fig. 3).
<110> Consejo de Investigación Médica
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIÓN DE LA EMULSIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
21465-204-019
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttttcccag tcacgacgtt gtaa
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Cebador
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggatatag ttcctccttt cagc
\hfill24
Claims (18)
1. Un procedimiento para aumentar la
concentración de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo dicho
procedimiento:
(a) formar microcápsulas a partir de una
emulsión de agua en aceite, incluyendo dichas microcápsulas ácido
nucleico, una solución acuosa que comprende los componentes
necesarios para realizar la amplificación del ácido nucleico y un
tensioactivo basado en silicona químicamente inerte; y
(b) amplificar dicho ácido nucleico en las
microcápsulas para formar copias amplificadas del ácido
nucleico;
aumentando de este modo la concentración de
dicho ácido nucleico en las microcápsulas.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la emulsión de agua en aceite comprende una proporción de
agua en aceite de 1 a 2,5.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que dicho tensioactivo se proporciona a
una concentración v/v en la fase oleosa de la emulsión de 0,5 a
20%.
4. Un procedimiento según la reivindicación 1,
la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que dicho
tensioactivo basado en silicona comprende un copolímero de
silicona.
5. Un procedimiento según la reivindicación 1,
la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que dicho
tensioactivo basado en silicona comprende un copolímero de
polisiloxano-policetil-polietilenglicol.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5,
en el que dicho tensioactivo es Abil EM90^{TM}.
7. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que dicha emulsión es
termoestable.
8. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que dicho ácido nucleico es ADN
genómico o ADNc.
9. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente que comprende además unir dicho ácido
nucleico a un soporte sólido en dichas microcápsulas.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9,
en el que dicho soporte sólido comprende perlas.
11. Un procedimiento según la reivindicación 10,
en el que las perlas comprenden perlas de poliestireno o
magnéticas.
12. Un procedimiento según la reivindicación 10
o la reivindicación 11, en el que dichas perlas comprenden un
revestimiento seleccionado entre avidina, estreptavidina,
anticuerpos anti-digoxigenina y anticuerpos
anti-2,4-dinitrofenilo.
13. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que dicho ácido nucleico comprende
una señal seleccionada entre biotina, digoxigenina y
2,4-dinitrofenilo.
14. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 13, que comprende además clasificar o aislar el
ácido nucleico amplificado.
15. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que cuando se forman una pluralidad
de microcápsulas, cada una contiene por término medio una o menos de
una molécula de ácido nucleico.
16. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que cuando se forman una pluralidad
de microcápsulas cada una contiene por término medio entre 5 y 1000
moléculas de ácido nucleico.
17. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que dicha amplificación de ácido
nucleico se realiza mediante amplificación de replicasa Q\beta,
reacción en cadena de la ligasa, replicación autosostenida de la
secuencia o amplificación con desplazamiento de cadena.
18. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que dicha amplificación de ácido
nucleico se realiza usando la reacción en cadena de la
polimerasa.
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