ES2292207T3 - Tratamiento de neoplasmas con virus clonales, sensibles al interferon. - Google Patents
Tratamiento de neoplasmas con virus clonales, sensibles al interferon. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2292207T3 ES2292207T3 ES98949797T ES98949797T ES2292207T3 ES 2292207 T3 ES2292207 T3 ES 2292207T3 ES 98949797 T ES98949797 T ES 98949797T ES 98949797 T ES98949797 T ES 98949797T ES 2292207 T3 ES2292207 T3 ES 2292207T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- virus
- use according
- cells
- interferon
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
- A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18151—Methods of production or purification of viral material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
- G01N2800/7028—Cancer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
Abstract
Uso de un virus clonal con RNA, competente en replicación y sensible a interferón, para la fabricación de un medicamento para tratar un neoplasma en un mamífero.
Description
Tratamiento de neoplasmas con virus clonales,
sensibles al interferón.
La presente invención se refiere a virus
clonales que son capaces de replicarse en, y causar la muerte de,
células neoplásicas que presentan una deficiencia en la respuesta
antiviral mediada por interferón (IFN). La invención también se
refiere al uso de estos virus para el tratamiento de enfermedades
neoplásicas que incluyen cáncer y tumores
grandes.
grandes.
La enfermedad neoplásica, que incluye el cáncer,
es una de las causas principales de muerte en seres humanos. Hay
más de 1,3 millones de casos nuevos de cáncer diagnosticados cada
año en los Estados Unidos y de 550.000 muertes. La detección
temprana del cáncer, antes de que el cáncer se propague a
localizaciones secundarias del organismo, aumenta enormemente las
posibilidades de supervivencia del hospedador. Sin embargo, la
detección temprana del cáncer no siempre es posible, e incluso
cuando lo es, los tratamientos no son satisfactorios, especialmente
en casos de cánceres muy malignos. Los tratamientos contra el
cáncer, que incluyen quimioterapia y radiación, son mucho menos
efectivos en fases más tardías, especialmente cuando los
crecimientos neoplásicos tiene un tamaño grande y/o constituyen una
carga tumoral alta. (Véase, Hillard Stanley, Cancer Treat.
Reports, Vol. 61, No. 1, enero/febrero de 1977, págs.
29-36, Tannock, Cancer Research, 42,
4921-4926, diciembre de 1982).
Se ha informado sobre la regresión de tumores
asociada con la exposición a diferentes virus. La mayoría de los
virus descritos son patógenos en seres humanos e incluyen los virus
de la parotiditis y del sarampión. También se ha descrito el efecto
de otros virus específicos sobre tipos particulares de células
cancerosas. Smith y col., (1956) Cancer, 9, 1, 211 (efecto
de adenovirus sobre el carcinoma de cuello de útero); Hoizaepfel y
col., (1957) Cancer, 10, 557 (efecto de adenovirus sobre
tumores epiteliales); Taylor y col., (1970) J. Natl. Cancer
Inst. 44, 515 (efecto del enterovirus-1 bovino
sobre el sarcoma-1); Shingu y col., (1991) J.
General Virology, 72, 2031 (efecto del enterovirus
MZ-468 bovino sobre células leucémicas
F-647a); Suskind y col., (1957) PSEBM, 94, 309
(efecto del coxsackievirus B3 sobre células tumorales HeLa);
Rukavishnikova y col., (1976) Acta Virol., 20, 387 (efecto de
la cepa A del virus de la gripe sobre tumores ascíticos).
Las primeras referencias bibliográficas
describieron la regresión parcial de tumores en pacientes tratados
con vacunas de virus vivos atenuados con la finalidad de vacunarles
contra la viruela o la rabia. Véanse, DePace, N.G. (1912)
Ginecología, 9, 82-88; Salmon, P. y Baix
(1922) Compt. Rend. Sec. Biol., 86, 819-820.
También se ha observado la regresión parcial de tumores y la
regresión de leucemias durante infecciones naturales de sarampión.
Véanse, Pasquinucci, G. (1971) Lancet, 1, 136; Gross, S.
(1971) Lancet, 1, 397-398; Bluming, A.Z. y
Ziegler, J.L. (1971) Lancet, 2, 105-106. En
un estudio de 90 pacientes con cáncer, intencionadamente infectados
con virus vivos de la parotiditis, se observó una regresión parcial
de los tumores en 79 casos. Véase, Asada (1994) Cancer, 34,
1907-1928. Aunque los efectos secundarios de estos
virus fueron temporales, las graves secuelas de la infección con
estos patógenos de seres humanos constituye un problema
importante.
Los virus se clasifican de la siguiente manera
[véase, Murphy A. y Kingsbury D.W., 1990, En: Virology, 2ª
Edición (Redactor: Fields, B.N.), Raven Press, Nueva York,
págs. 9-35].
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Incluidas en la familia Herpesviridae (o
de los Herpesvirus, están las subfamilias de los
Alphaherpesvirus (que incluye el género Varicellavirus
y el género Simplexvirus), Betaherpesvirus y
Gammaherpesvirus.
El virus de la enfermedad de Newcastle
("NDV") (del inglés, " Newcastle Disease
Virus") es miembro de la Paramyxoviridae (o de
los Paramyxovirus). Los hospedadores naturales del NDV son
los pollos y otras aves. El NDV típicamente se une a determinadas
moléculas sobre la superficie de células hospedadoras animales, se
fusiona con la superficie celular e inyecta su material genético en
el hospedador. El NDV es un virus citocida. Una vez dentro de la
célula, los genes virales dirigen a la célula hospedadora para que
haga copias de virus, lo que conduce a la muerte de la cepa
hospedadora, que libera las copias del NDV que infectan a otras
células. A diferencia de ciertos virus, no se tiene conocimiento de
que el NDV produzca alguna enfermedad grave en seres humanos. A
diferencia de otras clases de virus (p. ej., HTLV-1,
virus de la Hepatitis B), los Paramyxovirus no se conoce que
sean carcinogénicos.
Se ha informado sobre la regresión temporal de
tumores en un número pequeño pacientes expuestos al NDV. Véase,
Csatary, L.K. (1971) Lancet 2, 825. Csatary observó la
regresión de un cáncer gastrointestinal en un granjero criador de
pollos, durante una epidemia de la enfermedad de Newcastle en sus
pollos. En un informe anecdótico similar, Cassel, W.A. y Garrett,
R.E. (1965) Cancer, 18, 863-868, observaron
la regresión de un cáncer primario de cuello de útero, que se
habían propagado a los ganglios linfáticos, en una paciente después
de la inyección de NDV en el interior del tumor de cuello de útero.
Ya que se pensaba que el mecanismo de la actividad tumoricida era
inmunológico, no se llevó a cabo ningún trabajo que dirigiera la
citotoxicidad del virus directamente contra el tumor. En lugar de
ello, los trabajos se centraron en los efectos inmunomoduladores del
NDV. Véanse, por ejemplo, Murray, D.R., Cassel, W.A., Torbin, A.H.,
Olkowski, Z.L. y Moore, M.E. (1977) Cancer, 40, 680; Cassel,
W.A., Murray, D.R. y Phillips, H.S. (1983) Cancer, 52, 856;
Bohle, W., Schlag, P.J., Liebrich, W., Hohenberger, P.,
Manasterski, M., Miller, P. y Schirrmacher, V. (1990) Cancer,
66, 1517-1523.
La selección de un virus específico para la
represión de tumores se basó en la serendipidad o sistema de ensayo
y error en las anteriores citas bibliográficas. Sólo recientemente,
se han desarrollado estrategias racionales basadas en mecanismos,
para el uso de virus en el tratamiento contra el cáncer, usando
virus con DNA. Ejemplos de este tipo de estrategia se encuentran en
el desarrollo de vectores adenovirales recombinantes que se replican
únicamente en tumores de un origen tisular específico (Rodriguez,
R. y col., 1997 Cancer Res., 57:2559-2563),
o de vectores que carecen de determinadas proteínas reguladoras
clave (Bischoff, J.R. y col., 1996 Science,
274:373-376). Otra estrategia reciente ha sido el
uso de un vector adenoviral recombinante, incompetente en
replicación, para restablecer una función crítica de una proteína,
perdida en algunas células tumorales (Zhang, W.W. y col., 1994
Cancer gene therapy, 1:5-13). Finalmente, el
virus del herpes simple ha sido también manipulado por ingeniería
genética para que se replique preferentemente en las células en
división rápida que caracterizan a los tumores (Mineta, T. y col.,
1994 Cancer Res, 54:3963-3966).
El documento WO 94/25627 describe el uso del NDV
o de otros Paramyxovirus en el tratamiento del cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Una de las estrategias comunes para el
tratamiento del cáncer con terapéutica viral ha sido el uso de
vectores virales para el suministro de determinados genes a la masa
tumoral.
Adenovirus recombinantes, virus adenoasociados,
virus de la viruela vacuna y retrovirus han sido todos ellos
modificados para que expresen un gen de interferón, solo o en
combinación con otros genes de citoquinas.
En Zhang y col. ((1996) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93:4513-4518), un adenovirus
recombinante que expresa un gen consenso (es decir, sintético) de
interferón humano, se usó para tratar xenotrasplantes de cáncer de
mama humano (y otros cánceres) en ratones carentes de sistema
inmunológico. Los autores concluyeron que "...una combinación de
una oncólisis viral con un virus de baja patogenicidad, que es de
por sí resistente a los efectos IFN y de una terapia con genes de
IFN, pudiera ser una estrategia fructífera para el tratamiento de
una diversidad de tumores diferentes, en particular de cáncer de
mama". En contraste con la presente invención que se refiere a
virus sensibles a interferón, Zhang y col. (1966) enseñan el uso de
un adenovirus resistente a interferón en el tratamiento de
tumores.
En Zhang y col. ((1996) Cancer Gene
Ther., 3:31-38), un virus adenoasociado (AAV)
que expresa un IFN consenso se usó para la transducción de células
tumorales humanas in vitro, seguida de su inyección a ratones
carentes de sistema inmunológico. Los tumores transducidos, o no
formaron tumores, o crecieron más lentamente que los controles no
transducidos. Asimismo, la inyección de una célula tumoral humana
transducida en la masa tumoral de otro tumor no transducido, produjo
una pequeña disminución del tamaño.
En Peplinski y col., ((1996) Ann. Surg.
Oncol., 3:15-23), el IFN gamma (y otras
citoquinas, expresadas solas o en combinación) se ensayaron en un
modelo de cáncer de mama de ratones. Los ratones se inmunizaron con
células tumorales, viralmente modificadas con un virus recombinante
de la viruela vacuna. Cuando fueron de nuevo estimulados
inmunológicamente con las células tumorales, los ratones inmunizados
con células viralmente modificadas presentaron una mejoría
estadísticamente demostrada en el tiempo de supervivencia sin
enfermedad.
Gastl y col., ((1992) Cancer Res.,
52:6229-6236), usaron vectores retrovirales que
expresan IFN-gamma para transducir células de
carcinoma renal in vitro. Se demostró que estas células
producían cantidades más altas de varias proteínas importantes para
la función del sistema inmunológico.
Restifo y col., ((1992) J. Exp. Med.,
175:1423-1431) usaron vectores retrovirales que
expresan IFN-gamma para transducir una línea de
células de sarcoma murino, lo que permite que la línea de células
tumorales presente de manera más eficiente antígenos virales a las
células T CD8+.
Howard y col., ((1994) Ann. NY Acad.
Sci., 716:167-187) usaron vectores retrovirales
que expresan IFN-gamma para transducir células
tumorales de melanoma humano y melanoma murino. Se observó que estas
células aumentaban la expresión de proteínas importantes para la
función inmunológica. Estas células fueron también menos
tumorigénicas en ratones que la línea parental no transducida y
produjeron la activación de una respuesta de los CTL específica de
tumor, in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a las conocidas propiedades estimuladoras
del sistema inmunológico que tiene el IFN, varios estudios han
investigado el uso de la proteína IFN en combinación con otras
terapias de vacunas virales contra el cáncer.
En Kirchner y col. ((1995) World J.
Urol., 13:171-173), se inmunizaron 208 pacientes
con células tumorales de carcinoma de células renales, autólogas,
modificadas con NDV e irradiadas letalmente, y se cotrataron con
una dosis baja de IL-2 o IFN-alfa.
Los autores afirmaron que este régimen de tratamiento produce una
mejoría en la evolución natural de los pacientes con carcinoma de
células renales localmente avanzado. La dosis fue aproximadamente
desde 3,3 x 10^{3} PFU/kg hasta 2,2 x 10^{5} PFU/kg. Esta
terapia fue una terapia local, en contraposición a una estrategia
sistémica, con el objetivo de inducir una inmunorrespuesta
anti-tumoral.
Tanaka y col. ((1994) J. Immunother. Emphasis
Tumor Immunol., 16:283-293), coadministraron
IFN-alfa y un virus recombinante de la viruela
vacuna como modelo de terapia vacunal contra el cáncer en ratones.
Este estudio reveló una mejoría estadísticamente demostrada en la
capacidad de supervivencia de los ratones que habían recibido IFN,
en comparación con los que no lo habían recibido. Los autores
atribuyeron la eficacia del IFN a la inducción de células T CD8
positivas en esos animales.
Arroyo y col. (1990) Cancer Immunol.
Immunother., 31:305-311) usaron un modelo en
ratones de cáncer de colon para ensayar el efecto de una coterapia
con IFN-alfa y/o IL-2 sobre la
eficacia de un tratamiento contra el cáncer usando un oncolisado de
colon que contiene el virus de la viruela vacuna (VCO). Encontraron
que este triple tratamiento de VCO + IL-2 + IFN era
sumamente eficaz en este modelo murino. Esta estrategia está basada
en la inmunización como mecanismo de actividad antitumoral.
Se usó IFN en estos estudios para aumentar la
capacidad de las células cancerosas para ser reconocidas por el
sistema inmunológico.
Intervirology (1993) 36/4
(193-214) proporciona una revisión de terapias
virales contra el cáncer.
Proceedings of the American Association for
Cancer Research Annual, Vol. 36, 1995, página 439, proporciona
una comparación entre cepas oncolíticas del Virus de la Enfermedad
de Newcastle.
El documento WO 96/26285 describe métodos y
composiciones para administrar vectores de terapia génica.
DChemical Abstract Service, DN 116:104333
y CN 1054192 A, describe un procedimiento para preparar e inducir
interferón de un organismo humano.
Nature, 23 de agosto de 1969, Vol. 223,
págs. 844-845, describe interferón exógeno e
inductores de interferón en el tratamiento de ratones Balb/c
inoculados con células tumorales RC19.
Es un objetivo de esta invención proporcionar
virus para el tratamiento de enfermedades que incluyen cáncer.
Es otro objetivo de esta invención proporcionar
virus para el tratamiento de enfermedades neoplásicas que incluyen
cáncer.
Es otro objetivo de esta invención proporcionar
un medio mediante el que se seleccionan virus candidatos y/o se
someten a escrutinio para usar en la terapia de enfermedades
neoplásicas.
Es otro objetivo de esta invención proporcionar
asesoramiento en la manipulación de virus por ingeniería genética
con el fin de aumentar su utilidad terapéutica en el tratamiento de
enfermedades neoplásicas.
Es otro objetivo de esta invención proporcionar
un medio con el que realizar el escrutinio de células diana
potenciales para una terapia viral, con el objetivo de evaluar la
sensibilidad de las células diana candidatas a ser destruidas por el
virus.
Es otro objetivo más de esta invención
proporcionar asesoramiento en el manejo de la terapia viral.
Es un objetivo de esta invención proporcionar
tratamiento para tumores grandes.
Es otro objetivo de esta invención proporcionar
un virus purificado y métodos para obtenerlo.
La presente invención proporciona el uso de un
virus clonal con RNA, competente en replicación y sensible a
interferón, para la fabricación de un medicamento para tratar un
neoplasma en un mamífero.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención se refiere por lo tanto a un
método para infectar un neoplasma de un mamífero con un virus, que
comprende el uso de un virus clonal competente en replicación y
sensible a interferón, seleccionado entre el grupo que consiste en
virus con RNA y las familias de virus con DNA de Adenovirus,
Parvovirus, Papovavirus e Iridovirus, para la
fabricación de un medicamento.
Esta invención también se refiere a la infección
de un neoplasma de un mamífero con un virus, que comprende
administrar a un mamífero por vía sistémica un virus clonal
competente en replicación y sensible a interferón.
Esta invención también se refiere al tratamiento
de un neoplasma, que incluye cáncer, en un mamífero, que comprende
el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un virus clonal
competente en replicación y sensible a interferón, seleccionado
entre el grupo que consiste en virus con RNA y las familias de virus
con DNA de Adenovirus, Parvovirus, Papovavirus
e Iridovirus, para la fabricación de un medicamento.
Esta invención también se refiere a un método
para infectar un neoplasma en un mamífero con un virus, que
comprende el uso de un virus clonal de la viruela vacuna, competente
en replicación y sensible a interferón, que contiene una o más
mutaciones en uno o más genes virales implicados en el bloqueo de
la actividad antiviral del interferón, seleccionados entre el grupo
que consiste en K3L, E3L y B18R, para la fabricación de un
medicamento.
La invención también se refiere al uso, para la
fabricación de un medicamento para tratar un neoplasma, que incluye
cáncer, en un mamífero, de una cantidad terapéuticamente efectiva de
un virus de la viruela vacuna, competente en replicación y sensible
a interferón, que contiene una o más mutaciones en uno o más genes
virales implicados en el bloqueo de la actividad antiviral del
interferón, seleccionados entre el grupo que consiste en K3L, E3L y
B18R.
La invención también se refiere a la infección
de un neoplasma de al menos 1 cm de tamaño, con un virus, en un
mamífero, que comprende el uso de un virus clonal sensible a
interferón, seleccionado entre el grupo que consiste en (1) virus
con RNA; (2) Hepadenavirus; (3) Parvovirus; (4)
Papovavirus; (5) Poxivirus; y (6) Iridovirus,
para la fabricación de un medicamento.
La invención también se refiere al uso, para la
fabricación de un medicamento para tratar un neoplasma en un
mamífero, de una cantidad terapéuticamente efectiva de un virus
clonal sensible a interferón, seleccionado entre el grupo que
consiste en (1) virus con RNA; (2) Hepadenavirus; (3)
Parvovirus; (4) Papovavirus; (5) Poxivirus; y
(6) Iridovirus, en el que el neoplasma tiene al menos 1
centímetro de tamaño.
La invención también se refiere al uso, para la
fabricación de un medicamento para tratar un tumor en un mamífero,
de una cantidad terapéuticamente efectiva de un virus clonal con
RNA, sensible a interferón y citocida para el tumor, en el que el
mamífero tiene una carga tumoral que comprende al menos el 1,5% del
peso total del cuerpo.
La invención también describe un método de
escrutinio de células tumorales o de un tejido recién extirpado del
paciente, para determinar la sensibilidad de las células o del
tejido a ser destruidos por un virus, que comprende someter a las
células o al tejido a un ensayo diferencial de citotoxicidad usando
un virus sensible a interferón.
La invención también describe un método para
identificar un virus con actividad antineoplásica en un mamífero,
que comprende a) usar el virus del ensayo para infectar i) células
deficientes en actividad antiviral mediada por IFN, y ii) células
competentes en actividad antiviral mediada por IFN, y b) determinar
si el virus del ensayo destruye las células deficientes en
actividad antiviral mediada por IFN, de manera preferente con
respecto a las células competentes en actividad antiviral mediada
por IFN.
La invención también describe un método para
preparar virus para usar en terapias antineoplásicas, que comprende:
a) modificar un virus ya existente disminuyendo o suprimiendo un
mecanismo viral para la inactivación de los efectos antivirales del
IFN, y opcionalmente b) crear una mutación atenuante que produce
como resultado una virulencia menor que la de dicho virus ya
existente.
La invención también describe un método para
controlar la replicación viral en un mamífero tratado con un virus
seleccionado entre el grupo que consiste en virus con RNA,
Adenovirus, Poxivirus, Iridovirus, Parvovirus, Hepadnavirus y
Varicellavirus, que comprende administrar un compuesto
antiviral.
Esta invención también se refiere al tratamiento
o a la infección de un neoplasma de un mamífero, que comprende
someter una muestra (p. ej., suero, células tumorales, tejido
tumoral, sección de un tumor) procedente del mamífero, a un
inmunoensayo para detectar la cantidad de receptor de virus
presente, para determinar si el neoplasma permitirá al virus unirse
a él y producir citólisis y, si el receptor está presente, usar un
virus clonal competente en replicación y sensible a interferón, que
se une al receptor, para la fabricación de un medicamento.
La invención también se refiere a la infección
de un neoplasma de un mamífero con un virus, que comprende
administrar al mamífero por vía sistémica una dosis desensibilizante
de un virus clonal competente en replicación y sensible a
interferón.
La invención también se refiere a la infección
de un neoplasma de un mamífero con un virus, que comprende
administrar al mamífero un virus clonal competente en replicación y
sensible a interferón, durante el transcurso de al menos 4
minutos.
La invención también se refiere a la infección
de un neoplasma de un mamífero con un virus, que comprende
administrar un virus clonal competente en replicación, seleccionado
entre el grupo que consiste en la cepa MK107 del virus de la
enfermedad de Newcastle, la cepa NJ Roakin del virus de la
enfermedad de Newcastle, el virus Sindbis y el virus de la
estomatitis vesicular.
Están incluidos en la invención:
i) un Paramyxovirus purificado mediante
ultracentrifugación sin formación de sedimento;
ii) un Paramyxovirus purificado hasta un
nivel de al menos 2 x 10^{9} PFU por mg de proteína;
iii) un Paramyxovirus purificado hasta un
nivel de 1 x 10^{10} PFU por mg de proteína;
iv) un Paramyxovirus purificado hasta un
nivel de al menos 6 x 10^{10} PFU por mg de proteína;
v) un virus con RNA purificado hasta un nivel de
al menos 2 x 10^{9} PFU por mg de proteína;
vi) un virus con RNA purificado hasta un nivel
de al menos 1 x 10^{10} PFU por mg de proteína;
vii) un virus con RNA purificado hasta un nivel
de al menos 6 x 10^{10} PFU por mg de proteína;
viii) un virus citocida con DNA que es sensible
a interferón y que está purificado hasta un nivel de al menos 2 x
10^{9} PFU por mg de proteína;
ix) un virus de la viruela vacuna, competente en
replicación, que contiene a) una o más mutaciones en uno o más de
los genes K3L, E3L y B18R, y b) una mutación atenuante en uno o más
de los genes que codifican timidina-quinasa,
rebonucleótido-reductasa, factor de crecimiento
derivado del virus de la viruela vacuna,
timidilato-quinasa, DNA-ligasa,
dUTPasa;
x) un virus de la viruela vacuna, competente en
replicación, que contiene una o más mutaciones en dos o más genes
seleccionados entre el grupo que consiste en K3L, E3L y B18R;
xi) un Herpesvirus que contiene una
modificación en la expresión del análogo (2'-5')A
que hace que el Herpesvirus tenga aumentada la sensibilidad a
interferón; y
(xii) un Reovirus que contiene una
mutación atenuante en omega 3 que hace que dicho virus se vuelva
sensible a interferón.
\vskip1.000000\baselineskip
También se incluyen en la invención los
siguientes métodos:
i) un método para purificar un virus con RNA,
que comprende las etapas de a) generar un virus clonal; y b)
purificar dicho virus clonal mediante ultracentrifugación sin
formación de sedimento; o c) purificar dicho virus clonal mediante
filtración en flujo tangencial con o sin una posterior cromatografía
de permeabilidad en gel, y
ii) un método para purificar un
Paramyxovirus, que comprende purificar el virus mediante
ultracentrifugación sin formación del sedimento, o mediante
filtración en flujo tangencial con o sin una posterior cromatografía
de permeabilidad en gel.
La invención también se refiere al tratamiento
de una enfermedad en un mamífero, en el que las células afectadas
presentan defectos en una respuesta antiviral mediada por
interferón, que comprende administrar al mamífero una cantidad
terapéuticamente efectiva de un virus clonal competente en
replicación y sensible a interferón.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra el efecto de un anticuerpo
anti-interferón-beta sobre la
expresión de antígenos virales y sobre el título infeccioso en
células NHEK (del inglés " Normal Human
Epithelial Keratinocytes") (queratinocitos
epiteliales humanos normales).
La Figura 2 muestra el efecto del
interferón-beta sobre la expresión de antígenos
virales en diferentes células (fibroblastos normales
CCD922-sk de piel humana y dos tipos de células de
carcinoma de cabeza y cuello (células KB y células Hep2).
La Figura 3A muestra el efecto de interferón
sobre la expresión de antígenos virales en células
CCD922-sk, y
La Figura 3B muestra el efecto de interferón
sobre la expresión de antígenos virales en células KB.
La Figura 4 muestra las curvas de supervivencia
de ratones atímicos que portan células humanas de carcinoma ovárico
ES-2 y que fueron tratados con disolución salina o
con la cepa PPMK107 de NDV.
La Figura 5 muestra la capacidad de respuesta
del interferón de varias líneas celulares de tumores humanos y de
células normales humanas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere al
descubrimiento de un mecanismo nuevo mediante el cual la replicación
viral destruye selectivamente células neoplásicas deficientes en
una respuesta anti-viral mediada por interferón
(IFN). Esta invención también proporciona métodos para la selección,
diseño, purificación y uso de virus para el tratamiento de
enfermedades neoplásicas que incluyen cáncer y tumores grandes. Los
virus de la invención se replican selectivamente en células
neoplásicas y las destruyen sobre la base de la deficiencia
selectiva en estas células de una respuesta antiviral mediada por
IFN. La administración de la dosificación apropiada de virus da
como resultado la muerte de las células neoplásicas, mientras que
las células normales, que poseen intacta la respuesta antiviral
mediada por IFN, limitan la replicación del virus y no son
destruidas.
Incluido en el asunto de la invención está el
uso de Paramyxovirus tales como el NDV, y de otros virus,
para usar en el tratamiento de enfermedades que incluyen
enfermedades neoplásicas tales como cáncer. La invención también
ilustra sobre el escrutinio y la manipulación por ingeniería
genética de otros virus adecuados para usar como terapéutica de
enfermedades neoplásicas. Otra realización de la invención implica
un método para identificar tejidos tumorales que son candidatos
para una terapia viral. Finalmente, la invención también describe la
preparación de virus altamente purificados.
\vskip1.000000\baselineskip
NDV demuestra ejercer una destrucción
selectiva de células tumorales.
El virus de la enfermedad de Newcastle produce
efectos citotóxicos selectivos contra muchas células tumorales
humanas, produciendo notablemente menos efectos sobre la mayoría de
las células humanas normales. En un ensayo diferencial de
citotoxicidad se descubrió que células cancerosas humanas derivadas
de sarcomas, melanomas, carcinomas de mama, carcinomas de ovario,
carcinomas de vejiga, carcinoma de colon, carcinoma de próstata,
carcinomas de células pequeñas y de células no pequeñas de pulmón y
glioblastomas, eran aproximadamente de 3 a 4 órdenes de magnitud
más sensibles al NDV que muchas células humanas normales (células de
epitelio renal, fibroblastos, queratinocitos, melanocitos y células
endoteliales (véase el Ejemplo 1). El ensayo diferencial de
citotoxicidad se puede también aplicar a materiales aislados recién
obtenidos, procedentes de las células o de tejido tumoral de los
pacientes.
Se usó un ensayo in vitro para definir la
actividad tumoricida de NDV según se describe en el Ejemplo 1. El
ensayo mide la cantidad de virus requerida para matar el 50% del
cultivo celular sometido al ensayo, en un período de tiempo de
cinco días. Los Ejemplos 2 y 3 muestran los resultados de
experimentos in vivo en los que el virus se administró a
ratones atímicos que portaban xenotrasplantes de tumores humanos,
por vía intratumoral (Ejemplo 2) o por vía intravenosa (Ejemplo 3).
Estos resultados demuestran que NDV es capaz de producir regresión
de diversos tipos de tumores humanos en un modelo animal estándar
para el ensayo de agentes quimioterapéuticos potenciales.
La evidencia de que NDV se replica de manera
específica dentro del tumor se demostró mediante tinción
inmunohistoquímica con respecto a un antígeno viral (Ejemplo 2). A
los 30 minutos de una inyección intratumoral de virus, el tejido
tumoral fue negativo con respecto a antígeno viral. Sin embargo, en
el día 2 después del tratamiento, se observó una intensa
inmunotinción con respecto al antígeno viral dentro del tumor, que
indicaba la replicación del virus en el interior del tumor. Es
importante destacar que la replicación del virus fue específica del
tejido tumoral ya que el tejido conjuntivo y la piel circundantes
dieron resultado negativo con respecto al antígeno viral.
Es importante destacar que una replicación
eficiente de NDV es crucial para la habilidad del virus para
destruir las células infectadas, como se demuestra en estudios que
usan virus no clonales, inactivados con luz UV (Lorence, R. y col.,
1994, J. Natl. Cancer Inst.
86:1288-1233).
El NDV puede también producir la regresión de
tumores grandes después de su administración intratumoral o
intravenosa (Ejemplos del 4 al 9). El tratamiento intratumoral con
NDV de xenotrasplantes intradérmicos grandes del melanoma humano
A375 (\geq 10 mm de dimensión máxima; volumen del tumor \geq 300
mm^{3}) en ratones atímicos, dio lugar a altas tasas de regresión
del tumor (Ejemplos del 4 al 8). El tratamiento intravenoso con NDV
de xenotrasplantes subcutáneos grandes del fibrosarcoma humano
HT1080 (\geq 10 mm de dimensión máxima) en ratones atímicos dio
lugar a una regresión del tumor parcial o completa en cinco de los
seis ratones (Ejemplo 9).
La familia de citoquinas de los interferones
de clase I son importantes moduladores negativos de la función
viral.
Los interferones de la clase I consisten en el
IFN\alpha, que se encuentra principalmente en células de origen
hematopoyético, y en el IFN\beta que se encuentra principalmente
en fibroblastos y células epiteliales [Joklik, W.K. 1990.
Interferons, págs. 383-410. Virology,
segunda edición, redactores: B.N. Fields, D.M. Knipe y col.,
Raven Press Ltd., Nueva York: and Sreevalsan, T. 1995.
Biological Therapy with Interferon -\alpha y -\beta.
Preclinical Studies. págs. 347-364.
Biologic Therapy of Cancer, Segunda edición, redactores:
V.T. DeVita, Jr., S. Hellman y S.A. Rosenberg, J.B. Lippincott
Company, Philadelphia]. Ambos tipos de IFN actúan a través de
un mecanismo de acción aparentemente común que incluye la
degradación de los intermediarios de la replicación viral de tipo
RNA bicatenario, y la inhibición de la traducción celular a través
de la actividad de una proteína-quinasa activada por
RNA bicatenario (Joklik, W.K. 1990. Interferons, págs.
383-410. Virology, Segunda edición,
redactores: B.N. Fields, D.M. Knipe y col., Raven Press Ltd.,
Nueva York; y las referencias bibliográficas contenidas en ellos).
Varios virus (de la gripe, EBV, SV40, adenovirus, de la viruela
vacuna) han desarrollado mecanismos mediante los cuales una o más
rutas del sistema de los IFN están inactivadas, permitiendo con
ello la eficiente replicación del virus (Katze, M.G. 1995. Trends
in Microbiol. 3:75-78).
Una amplia variedad de células tumorales son
deficientes en la capacidad para limitar una infección viral a
través de un mecanismo dependiente de IFN.
Las células de carcinoma celular humano (HeLa)
fueron más de trescientas veces menos sensibles en la inhibición de
la replicación del virus de la estomatitis vesicular después de un
pretratamiento con IFN, que una línea celular de control de
fibroblastos no transformados (Maheshwari R.K., 1983. Biochem.
Biophys. Res. Comm. 17:161-168). Los autores de
la presente invención han descubierto que la infección de un
cocultivo de células tumorigénicas de carcinoma humano de cabeza y
cuello (KB) y de fibroblastos normales de piel humana
(CCD922-sk) da como resultado la replicación viral,
inicialmente en ambos tipos de células, seguida por una limitación
de la infección en las células normales frente a una replicación
continuada y destrucción de las células tumorales (Ejemplo 10).
Además, aunque las células normales secretaban IFN en el medio de
cultivo, las células tumorales no fueron capaces de responder a IFN
a las concentraciones en las que se estaba produciendo para
establecer un estado antiviral. Otra evidencia más del papel del
IFN en la sensibilidad diferencial de las células tumorales frente
a la de las células normales para ser destruidas por NDV, se obtuvo
en dos experimentos independientes en los que se demostró que
fibroblastos normales (CCD922-sk) o queratinocitos
epiteliales normales (NHEK) se volvían más sensibles a la infección
con NDV en presencia de un anticuerpo neutralizador de IFN (Ejemplos
11 y 12). Por último, una infección paralela de fibroblastos
normales (CCD922-sk) y de células tumorales humanas
(KB) en presencia de IFN, reveló que las células normales fueron al
menos 100 veces más sensibles a los efectos antivirales de IFN
añadido que las células tumorales (Ejemplos 13 y 14). Ensayos
similares de diversas líneas de células tumorales (de un total de
9) revelaron una clara correlación entre la sensibilidad relativa de
una línea celular para ser destruida por NDV y entre una falta de
capacidad de la línea celular para manifestar una respuesta
antiviral mediada por interferón (Ejemplo 26).
Existen varias especies de interferón (IFN) que
incluyen formas naturales y recombinantes de
\alpha-IFN, \beta-IFN,
\omega-IFN y \gamma-IFN así como
formas consenso sintéticas (p. ej., como las descritas en Zhang y
col., (1996) Cancer Gene Therapy 3:31-38).
Además de las actividades antivirales que conducen a su
descubrimiento, actualmente se sabe que el IFN desempeña un
importante papel en la regulación normal del crecimiento y
diferenciación celulares. El IFN se considera como un regulador
negativo del crecimiento y se ha demostrado que varias proteínas
clave implicadas en la función y regulación de la actividad de IFN
actúan como proteínas supresoras de tumores en células normales
(Tanaka y col., 1994 Cell 77:829-839).
Además, otras varias proteínas conocidas por antagonizar la
actividad antiviral de IFN, se ha demostrado que poseen un potencial
oncogénico cuando se expresan de manera inapropiada (véase más
adelante, Barber, G.N., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:4278-4282). Se ha demostrado que células
derivadas de varios cánceres humanos tienen delecionados los genes
que codifican IFN (James, CD y col., 1991, Cancer Res.,
51:1684-1688) y se ha observado una pérdida parcial
o completa de la función de IFN en células de carcinoma de cuello de
útero humano (Petricoin, E. y col., 1994, Mol. Cell. Biol.,
14:1477-1486), células de leucemia linfocítica
crónica (Xu, B. y col., 1994, Blood,
84:1942-1949) y células de melanoma maligno (Linge,
C. y col., 1995, Cancer Res.,
55:4099-4104).
La proteína-quinasa (p68)
inducible por IFN se ha demostrado que es un importante regulador de
la síntesis de proteínas virales. Ha aparecido una correlación que
asocia la expresión o la actividad de la quinasa p68 con el estado
de diferenciación de las células. Así, células escasamente
diferenciadas, como las que están presentes en muchos cánceres, son
deficientes en la función de p68 (Haines, G.K. y col., 1993,
Virchows Arch. B Cell Pathol. 63:289-295).
Las células que carecen de actividad de p68 son generalmente
sensibles a ser destruidas por virus debido a que la quinasa p68 es
un efector importante del estado antiviral inducible por IFN. La
actividad antiviral de p68 puede ser antagonizada a través de una
interacción directa con una proteína celular identificada como p58.
Cuando se clona y sobreexpresa en células NIH3T3, p58 hace que las
células exhiban un fenotipo transformado y un crecimiento
independiente de anclaje (Barber GN y col. 1994, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91:4278-4382) y se ha demostrado
que varias líneas celulares de leucemia humana sobreexpresan la
proteína p58 (Korth M.J. y col., 1996 Gene
170:181-188). La sensibilidad a ser destruidas por
virus en células indiferenciadas se puede revertir a través de la
inducción de un fenotipo más diferenciado (Kalvakolanu, D.V.R. y
Sen, G.C., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:3167-3171).
Células competentes en una respuesta
antiviral mediada por interferón. Según aquí se usa, la
expresión "células competentes en una respuesta antiviral mediada
por interferón" se refiere a células que responden a niveles
bajos (p. ej., 10 unidades por ml) de interferón exógeno
disminuyendo significativamente (al menos 10 veces, más
ventajosamente al menos 100 veces, más ventajosamente al menos 1.000
veces y lo más ventajosamente al menos 10.000 veces) la replicación
de un virus sensible a interferón, en comparación con su respuesta
en ausencia de interferón. El grado de replicación del virus se
determina midiendo la cantidad de virus (p. ej., de un virus
infeccioso, de un antígeno viral, de un ácido nucleico viral). Los
fibroblastos normales CCD922 son células competentes en una
respuesta antiviral mediada por interferón.
Células deficientes en una respuesta
antiviral mediada por interferón. Según aquí se usa, la
expresión "células deficientes en una respuesta antiviral mediada
por interferón" se refiere a células que no satisfacen los
criterios anteriormente listados para las células competentes en una
respuesta antiviral mediada por interferón, es decir, no responden
a niveles bajos (p. ej., 10 unidades por ml) de interferón exógeno
disminuyendo significativamente la replicación de un virus sensible
a interferón, en comparación con su respuesta en ausencia de
interferón. Las células KB de carcinoma de la cavidad oral son
células deficientes en una respuesta antiviral mediada por
interferón.
Clonal. El uso del término "clonal"
se define de aquí en adelante como un virus derivado de una única
partícula infecciosa y del que los clones moleculares individuales
poseen una homología significativa en la secuencia de ácido
nucleico. Por ejemplo, la homología en la secuencia es tal que al
menos ocho clones moleculares individuales procedentes de la
población de viriones poseen una homología en las secuencias mayor
que el 95%, más ventajosamente mayor que el 97%, más ventajosamente
mayor que el 99%, y lo más ventajosamente una homología del 100%, a
lo largo de 300 nucleótidos contiguos.
Citocida. Según aquí se usa, la expresión
virus "citocida" se refiere a un virus que infecta células
causándoles la muerte.
Dosis desensibilizante. Según aquí se
usa, la frase "dosis desensibilizante" se refiere a la cantidad
de virus requerida para disminuir los efectos secundarios de dosis
posteriores del virus.
Ensayo diferencial de citotoxicidad.
Según aquí se usa, la frase "ensayo diferencial de
citotoxicidad" para el escrutinio de células o tejidos tumorales
usando un virus, se refiere a: (a) la infección viral de las
células tumorales y de una o más células o tejidos de control; (b)
la determinación de la supervivencia o de la muerte celular de cada
una de las muestras (por ejemplo, mediante el uso de un colorante
indicador de viabilidad celular, según se detalla en el Ejemplo 1)
pasados uno o más días después de la infección, y (c) sobre la base
de los resultados, una estimación de la sensibilidad (por ejemplo,
mediante determinación de la IC50 según se detalla en el Ejemplo 1)
de la muestra hacia el virus en comparación con el
control(es).
Infección de un neoplasma. Según aquí se
usa, la expresión "infección de un neoplasma" se refiere a la
entrada del ácido nucleico viral en las células o tejidos
neoplásicos.
Sensible a interferón. Según aquí se usa,
la frase virus "sensible a interferón" (p. ej., NDV) significa
un virus que se replica significativamente menos (al menos 10 veces
menos, ventajosamente al menos 100 veces menos, más ventajosamente
al menos 1.000 veces menos y lo más ventajosamente al menos 10.000
veces menos), en presencia de interferón que en ausencia de
interferón. Esto se determina midiendo la cantidad de virus (p.
ej., de un virus infeccioso, de un antígeno viral, de un ácido
nucleico viral) obtenido a partir de células competentes en una
respuesta antiviral mediada por interferón, en presencia o ausencia
de niveles bajos de interferón exógeno (p. ej., 10 unidades por
ml).
Neoplasma y enfermedad neoplásica. Según
aquí se usa, "neoplasma" significa crecimiento nuevo de un
tejido, e incluye tumores, crecimientos benignos (p. ej.,
condilomas, papilomas) y crecimientos malignos (p. ej. cáncer).
Según aquí se usa, "enfermedad neoplásica" se refiere a una
enfermedad manifestada por la presencia de un neoplasma.
Competente en replicación. Según aquí se
usa, la expresión virus "competente en replicación" se refiere
a un virus que produce una progenie infecciosa en células
neoplásicas.
Sustancialmente libre de proteínas de huevo
contaminantes. La expresión "sustancialmente libre de
proteínas de huevo contaminantes" se refiere a un nivel de
pureza del virus en el que la ovoalbúmina no es detectable en una
transferencia Western realizada por un experto en la técnica, (1)
usando 1,7 x 10^{9} PUF de virus por pocillo (de 3,3 cm de
ancho), que se hacen correr sobre un gel de SDS-PAGE
(electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de
dodecilsulfato sódico) (grosor de 1 mm); (2) transfiriendo las
proteínas virales desde el gel hasta una membrana de nitrocelulosa;
y (3) realizando una inmunotinción con respecto a ovoalbúmina usando
un anticuerpo anti-ovoalbúmina procedente de conejo
[fracción IgG procedente de conejo, en una dilución 1:200 de una
concentración de anticuerpo de 4 mg/ml (procedente de Cappel,
Inc.) o un anticuerpo policlonal equivalente].
Cantidad terapéuticamente efectiva. Según
aquí se usa, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva"
cuando se refiere al tratamiento de una enfermedad neoplásica, se
refiere a una cantidad de virus que produce el efecto deseado, p.
ej., el cese del crecimiento neoplásico, la regresión del tumor, la
mejoría del cuadro clínico o un aumento de la supervivencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa un diverso grupo de virus para matar
selectivamente a las células neoplásicas. Los virus naturales o los
manipulados son capaces de actuar como agente antineoplásico. Estos
virus i) infectan a células neoplásicas produciendo su muerte; ii)
son competentes en replicación en las células neoplásicas; y iii)
están restringidos en cuanto a destruir células normales debido a
los efectos antivirales del interferón.
En una realización ventajosa de la invención,
los virus que poseen las tres características anteriormente
mencionadas [(i) infectan a células neoplásicas produciendo su
muerte; (ii) son competentes en replicación en las células
neoplásicas; y (iii) están restringidos en cuanto a destruir células
normales debido a los efectos antivirales del interferón], también
inducen a interferón.
En otra realización ventajosa de la invención,
los virus que poseen las tres características anteriormente
mencionadas también ocasionan la regresión de neoplasmas humanos;
y/o no son neutralizados en la población humana diana debido a la
presencia de una inmunidad pre-existente.
En otra realización ventajosa, los virus que
poseen las tres características anteriormente mencionadas son
citocidas para las células tumorales.
Un Paramyxovirus (según aquí se usa,
"Paramyxivirus" se refiere a un miembro de
Paramyxoviridae) se puede usar conforme a la presente
invención para tratar un neoplasma, incluyendo un tumor grande, o
para tratar a un hospedador que presenta una carga tumoral elevada.
La familia Paramyoviridae comprende tres géneros: (1) los
paramyxovirus; (2) virus relacionados con el virus del sarampión
(los morbilivirus); y (3) virus respiratorios sincitiales (los
pneumovirus). Estos virus contienen un genoma con RNA. El uso de
virus pertenecientes a Paramyxoviridae que son citocidas,
especialmente los paramyxovirus, p. ej., el virus de la enfermedad
de Newcastle ("NDV") y otros paramyxovirus aviares tales como
el paramyxovirus aviar de tipo 2, constituye un método ventajoso
para la práctica de la invención. Las cepas atenuadas de estos virus
son especialmente útiles para el tratamiento de neoplasmas de
acuerdo con la presente invención.
El NDV es un virus especialmente ventajoso
conforme a la presente invención. El NDV se clasifica en tres clases
diferentes conforme a sus efectos en pollos y en embriones de
pollo. Las cepas de "baja virulencia" se denominan cepas
lentogénicas y tardan de 90 a 150 horas en matar a los embriones de
pollo a la dosis letal mínima (MLD); las cepas de "virulencia
moderada" se denominan cepas mesogénicas y tardan de 60 a 90
horas en matar a los embriones de pollo a la MDL. Las cepas de
"alta virulencia" se denominan cepas velogénicas y tardan de 40
a 60 horas en matar a los embriones de pollo a la MDL. Véanse, p.
ej., Hanson y Brandly, 1955 (Science,
122:156-157) y Dardiri y col., 1961 (Am. J. Vet.
Res., 918-920). Las tres clases son útiles y son
ventajosamente útiles las cepas mesogénicas del NDV tales como la
cepa MK107, la cepa NJ Roakin y la cepa
Connecticut-70726 (véanse los Ejemplos
21-23). Véase, p. ej., Schloer y Hanson, 1968 (J.
Virol., 2:40-47) para obtener un listado de
otras cepas mesogénicas.
Es conveniente obtener un virus clonal para
asegurar o aumentar la homogeneidad genética de una cepa viral
particular y para retirar las partículas defectuosas interferentes.
La retirada de las partículas defectuosas interferentes por medio
de clonación proporciona una mayor pureza del producto final, según
se determina por el número de partículas virales totales por cada
partícula infecciosa (p. ej., el número de partículas por PFU).
Un virus clonal se puede producir conforme a
cualquiera de los métodos disponibles para el profesional experto.
Por ejemplo, la purificación a partir de una placa de lisis se
utiliza de manera rutinaria para obtener virus clonales. Véase, p.
ej., Maassab y col., en: Plotkin y Mortimer, redactores.
Vaccines. Philadelphia: W.B. Saunders Co., 1994, páginas
78-801. La purificación por el método de la triple
placa de lisis es especialmente conveniente, y en él en cada ronda
de purificación se selecciona una placa de lisis que presenta las
características deseadas, tales como el tamaño, forma y aspecto
preferidos, o las características representativas de la cepa
parental. Otros medios para generar un virus clonal es mediante
técnicas de DNA recombinante, aplicables por un experto en la
técnica. Otro medio para obtener un virus clonal emplea la técnica
de la dilución límite (p. ej., añadiendo diluciones de la muestra
del virus hasta obtener una media de una o menos partículas
infecciosas del virus por cada pocillo que contiene una monocapa de
un tipo de célula susceptible).
En una realización ventajosa de la invención, el
virus purificado se usa para tratar enfermedades neoplásicas. Un
método ventajoso para la purificación de virus derivados de huevo es
el siguiente (el virus no es sedimentado en ninguna de las etapas de
estos métodos):
\newpage
a) generar un virus clonal (p. ej., mediante
purificación en placa de lisis)
b) inocular huevos con el virus clonal
c) incubar los huevos
d) enfriar los huevos
e) recoger el fluido alantoico de los huevos
f) retirar los restos celulares del fluido
alantoico
g) ultracentrifugación del fluido alantoico sin
sedimentación (p. ej., usando un gradiente discontinuo de
sacarosa).
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización de la invención, pasos
adicionales, añadidos después de la retirada de los restos celulares
(del fluido alantoico) y antes de la ultracentrifugación, consisten
en:
* congelar y después descongelar el fluido
alantoico,
* retirar el material contaminante de la
suspensión que contiene el virus (p. ej., por medio de
centrifugación).
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización de la invención, la
ultracentrifugación se lleva a cabo por medio de una ultracentrífuga
de flujo continuo.
Una de las realizaciones de la invención se
refiere a un método para purificar un virus con RNA y competente en
replicación, que comprende las etapas de:
a) generar un virus clonal y
b) purificar dicho virus clonal mediante
ultracentrifugación sin sedimentación.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización de la invención implica un
método para purificar un paramyxovirus (p. ej., NDV) que comprende
purificar el virus mediante ultracentrifugación sin
sedimentación.
Opcionalmente, la etapa de purificación
comprende adicionalmente antes de la ultracentrifugación:
a) purificar a partir de una placa de lisis para
generar un virus clonal,
b) inocular huevos con el virus clonal,
c) incubar los huevos,
d) enfriar los huevos,
e) recoger el fluido alantoico de los huevos
y
f) retirar los restos celulares del fluido
alantoico.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización de la invención implica un
método para purificar un virus clonal competente en replicación, a
partir de huevos o de un cultivo celular, que comprende la etapa de
ultracentrifugación sin una etapa en la que el virus es
sedimentado.
Otra realización de la invención implica un
método para purificar un paramyxovirus (p. ej., NDV) que comprende
purificar el virus mediante filtración secuencial en flujo
tangencial (TFF).
Opcionalmente, el virus se puede purificar
adicionalmente mediante cromatografía de permeabilidad en gel, en
cuyo caso cada una de estas etapas tiene lugar en presencia de un
tampón estabilizante (Ejemplo 15):
a) purificar a partir de una placa de lisis para
generar un virus clonal,
b) inocular huevos con el virus clonal,
c) incubar los huevos,
d) enfriar los huevos,
e) recoger el fluido alantoico de los huevos y
diluir el fluido alantoico con tampón,
f) retirar los restos celulares del fluido
alantoico mediante TFF,
g) purificar el virus mediante TFF y
h) purificar el virus mediante cromatografía de
permeabilidad en gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Opcionalmente, el virus obtenido en la etapa de
permeabilidad en gel se puede concentrar usando TFF.
Otra realización de la invención implica un
método para purificar un virus clonal competente en replicación, a
partir de huevos o de un cultivo celular, que comprende la etapa de
purificar el virus mediante filtración secuencial en flujo
secuencial (TFF), seguida opcionalmente por cromatografía de
permeabilidad en gel, seguida opcionalmente por TFF para concentrar
el virus.
\vskip1.000000\baselineskip
El uso de estos métodos permite la purificación
de un virus clonal [que incluye Paramyxovirus (p. ej., NDV)]
hasta al menos 2 x 10^{9} PFU/mg de proteína, ventajosamente hasta
al menos 3 x 10^{9} PFU/mg de proteína, más ventajosamente hasta
al menos 5 x 10^{9} PFU/mg de proteína, más ventajosamente hasta
al menos 1,0 x 10^{10} PFU/mg de proteína, más ventajosamente
hasta al menos 2 x 10^{10} PFU/mg de proteína, más ventajosamente
hasta al menos 3 x 10^{10} PFU/mg de proteína, más ventajosamente
hasta al menos 4 x 10^{10} PFU/mg de proteína, más ventajosamente
hasta al menos 5 x 10^{10} PFU/mg de proteína y lo más
ventajosamente hasta al menos a 6 x 10^{10} PFU/mg.
El uso de estos métodos permite la purificación
de un virus clonal [que incluye Paramyxovirus (p. ej., NDV)]
hasta un nivel en el que el número de partículas virales por PFU es
menor que 10, más ventajosamente menor que 5, más ventajosamente
menor que 3, más ventajosamente menor que 2 y lo más ventajosamente
menor que 1,2. (Cantidades menores de partículas virales por PFU
indican un grado mayor de pureza).
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, estos métodos permiten la
purificación (hasta los niveles anteriormente citados para los
virus clonales) de un virus con RNA [que incluye (a) un virus
citocida con RNA; (b) un virus con RNA monocatenario, no segmentado
y sin envoltura; (c) un virus con RNA monocatenario, segmentado y
con envoltura; (d) un virus con RNA bicatenario, segmentado y sin
envoltura; (e) y un virus con RNA monocatenario, no segmentado y con
envoltura (p. ej., Paramyxovirus (p. ej., NDV) y p. ej.,
Retrovirus].
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, estos métodos permiten la
purificación (hasta los niveles anteriormente citados para los virus
clonales) de un virus citocida y sensible a interferón, seleccionado
entre el grupo que consiste en (a) virus con DNA bicatenario y con
envoltura (que incluyen los poxivirus); (b) virus con DNA
monocatenario y sin envoltura; y (c) virus con DNA bicatenario y sin
envoltura.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, estos métodos permiten la
purificación de virus derivados de huevo hasta un nivel
sustancialmente libre de proteínas de huevo contaminantes. Se
prefiere limitar la cantidad de proteínas de huevo en preparaciones
de virus para uso terapéutico en seres humanos, debido a que las
principales proteínas de huevo, como la ovoalbúmina, son
alergenos.
En la Tabla 1 se muestran virus útiles en el
tratamiento de enfermedades neoplásicas, que incluyen cáncer. Estos
virus opcionalmente se someten a escrutinio con respecto a
variaciones presentes en la naturaleza (determinadas cepas o
materiales aislados) que dan como resultado una producción de IFN
alterada con respecto a la de la cepa parental.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización de esta invención, los virus
candidatos, tanto presentes en la naturaleza como manipulados por
ingeniería genética, se ensayan con respecto a su capacidad para
proporcionar una utilidad terapéutica en el tratamiento de
neoplasmas. En una de las realizaciones, la cantidad del virus
candidato requerida para matar al 50% de las células deficientes en
una respuesta antiviral mediada por interferón, p. ej., células KB
de carcinoma de cabeza y cuello, se compara con la cantidad de virus
requerida para matar al 50% de un número similar de células
competentes en una respuesta antiviral mediada por interferón, por
ejemplo, fibroblastos normales de la piel. La cantidad de muerte
celular se cuantifica mediante cualquiera de diversos medios, que
incluyen el ensayo de exclusión con azul tripán o el ensayo con MTT
(véase el Ejemplo 1). Una disminución significativa (p. ej., de al
menos 5 veces) en la cantidad de virus requerida para matar a las
células deficientes en una respuesta antiviral mediada por
interferón, con respecto a la cantidad necesaria para matar a las
células competentes en una respuesta antiviral mediada por
interferón, indica que el virus del ensayo exhibe la actividad
requerida para la utilidad terapéutica en el tratamiento de
neoplasmas. Otros virus NDV y el virus Sindbis son de esos virus
presentes en la naturaleza que presentan la característica de
producir muerte celular selectiva de tumor (véanse los Ejemplos
21-23 y 25).
Un conocimiento de los factores implicados en el
establecimiento de un estado antiviral permite la creación de un
ensayo de escrutinio de tumores que es probable que respondan a una
terapia viral. En principio, un tejido tumoral procedente de un
paciente, obtenido por biopsia, se somete a escrutinio con respecto
a la expresión de la quinasa p68, la quinasa p58 u otros factores
implicados en la regulación de un estado antiviral o de una
diferenciación celular. Otros factores incluyen, pero no se limitan
a, factor-1 de respuesta de interferón
(IRF-1), factor génico 3 estimulador de interferón
(ISGF-3) (del inglés, " Interferon
Stimulatory Gene
Factor-3"), c-Myc,
c-Myb y receptores para IFN. En el caso de
c-Myc, c-Myb o p58 un alto nivel de
expresión indica que el tejido o las células tumorales son
candidatos a tratamiento para una terapia viral. En el caso de p68,
IRF-1, ISGF-3 y receptores para IFN,
un nivel bajo de expresión indica que el tejido o las células
tumorales son candidatos de tratamiento para una terapia viral.
En otra realización de esta invención, tejidos o
células del tumor primario, obtenidos procedentes de biopsias del
paciente, se expanden en cultivo y se ensayan con respecto a su
sensibilidad a ser destruidas por medio de una terapia viral
adecuada. En una de las realizaciones, la cantidad del virus
candidato para matar al 50% del cultivo de tejido tumoral se
compara con la cantidad de virus requerida para matar al 50% de un
cultivo de células normales, como se ha descrito en lo que antecede
para el escrutinio de los virus candidatos. Un aumento de diez
veces o mayor en la sensibilidad de las células tumorales en
comparación con la de las células normales para ser destruidas por
el agente viral, indica que las células tumorales son
específicamente sensibles al efecto citocida del tratamiento viral.
En una realización más de la invención, la capacidad de las células
tumorales a las que se dirige el tratamiento, para responder al IFN
suministrado por vía endógena o por vía exógena, se determina
llevando a cabo el escrutinio anteriormente mencionado en presencia
de IFN (de la forma \alpha o \beta, usando p. ej., 10 unidades
por ml, véase el
Ejemplo 27).
Ejemplo 27).
Un conocimiento de los receptores celulares
requeridos para la unión o entrada del virus, permite un escrutinio
adicional de tumores que tienen una elevada expresión de receptores
y por ello una mayor sensibilidad frente al virus sensible a
interferón. Este es un nivel de escrutinio adicional con respecto a
pacientes que es probable que respondan a una terapia con virus. De
manera ventajosa para una terapia con un virus sensible a
interferón, el tumor del paciente es resistente a interferón y
presenta también un alto nivel de expresión del receptor celular
para el virus. En principio, el suero, células tumorales, tejidos o
secciones de tejidos derivados del paciente, se someten a
escrutinio mediante inmunoensayo o inmunotinción con respecto a la
cantidad de receptor para el virus presente en el suero o en las
células tumorales o en el tejido tumoral. Por ejemplo, el virus
Sindbis utiliza el receptor de alta afinidad para laminina para
infectar células de mamíferos (Wang y col., 1992, J. Virol.,
66, 4992-5001). Se sabe que este mismo receptor se
expresa en mayores cantidades en muchos tipos diversos de cáncer
metastásico. La línea celular PANC-1 de cáncer renal
y la línea celular SW620 de adenocarcinoma de colon se sabe que
expresan un nivel alto del mRNA del receptor de alta afinidad para
laminina (Campo y col., 1992, Am. J. Pathol.
141:1073-1083; Yow y col., (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci., 85, 6394-6398) y son muy sensibles
al virus Sindbis (Ejemplo 25). Por el contrario, la línea celular
SW1423 de adenocarcinoma de recto se sabe que expresa niveles muy
bajos del mRNA del receptor de alta afinidad para laminina (Yow y
col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., 85,
6394-6398) y es más de 4 órdenes de magnitud más
resistente a ser destruida por el PPSINDBIS-Ar339
que las células SW620.
Las cepas existentes de NDV o de otros virus,
que incluyen virus con RNA y virus con DNA, se someten a escrutinio
o se manipulan por ingeniería genética con respecto a respuestas a
IFN alteradas (p. ej., de manera ventajosa, respuestas aumentadas a
IFN) en células normales. Además de la capacidad para provocar una
potente respuesta a IFN, otras características virales son objeto
de escrutinio o se introducen mediante ingeniería genética dentro
del virus. Los virus con una especificidad para receptor alterada
(p. ej., el virus Sindbis PPSINDBIS-Ar339, véase el
Ejemplo 25) o con una neurovirulencia baja, están incluidos en la
materia de la invención (p. ej., el virus PPNJROAKIN de NDV, véase
el Ejemplo 24). De manera ventajosa, los virus de la invención
poseen la capacidad de propagarse a través de un contacto directo
célula a célula.
La invención que aquí se describe incluye un
amplio grupo de virus (véase la Tabla 1) que son útiles para el
tratamiento de neoplasmas de una manera análoga a la que se ha
indicado para NDV). Además, virus que en su manera natural no
serían candidatos para ser usados, debido a la presencia de un
mecanismo(s) que inactiva la respuesta a IFN en células
normales, son opcionalmente manipulados por ingeniería genética para
soslayar las restricciones anteriormente mencionadas. Si se dejan
sin modificar, los virus que poseen mecanismos para inactivar la
respuesta a interferón serían más tóxicos para las células normales
que los virus a los que se les has quitado ese mecanismo. La
presente invención proporciona (1) el desarrollo de un vector que
puede ser fácilmente manipulado; y (2) la creación de un grupo de
virus terapéuticos. Las manipulaciones incluyen la adición de un
gen de IFN para permitir la expresión viral de un transgén que
expresa IFN, o de otros activadores de la ruta de las respuestas a
IFN. Permutaciones adicionales, incluyen la expresión obtenida
mediante ingeniería genética de enzimas activadoras de profármacos,
tales como la timidina-quinasa o la
citosina-desaminasa de Herpesvirus (Blaese
R.M. y col., 1994. Eur. J. Cancer 30A:
1190-1193) y la expresión de un antígeno marcador
adecuado que permite el direccionamiento hacia las células tumorales
por parte del sistema inmunológico. Una permutación adicional
incluye la expresión obtenida mediante ingeniería genética de
ligandos de receptores para células diana que poseen esos
receptores [p. ej., la expresión de receptores para otros virus para
dirigir el tratamiento a células infectadas con esos virus (véase
Mebastsion y col., 1997, Cell 90:841-847; y
Schnell MI y col., 1997, Cell
90:849-857].
Varias cepas del virus de la enfermedad de
Newcastle demuestran ejercer una destrucción selectiva de células
tumorales. En un ensayo diferencial de citotoxicidad usando una
segunda cepa de un virus mesogénico de la enfermedad de Newcastle,
se encontró que las células tumorales eran 3 órdenes de magnitud más
sensibles que las células normales en cuanto a ser destruidas por
el virus (Ejemplo 21). De manera adicional, cuando una tercera cepa
de un virus mesogénico de la enfermedad de Newcastle se usó en un
ensayo diferencial de citotoxicidad, se encontró que las células
tumorales eran de 80 a 5.000 veces más sensibles que las células
normales en cuanto a ser destruidas por el virus (Ejemplo 22).
Estas dos cepas de virus mesogénicos de la enfermedad de Newcastle
produjeron también la regresión del crecimiento del tumor después de
su administración intratumoral a ratones atímicos que portaban
xenotrasplantes de tumores humanos (Ejemplo 23).
En experimentos independientes, la inocuidad de
tres cepas diferentes del virus de la enfermedad de Newcastle se
estudió después de su inoculación intracerebral en ratones atímicos
y en ratones inmunocompetentes. Los resultados de este estudio
mostraron que las tres cepas de virus fueron bien toleradas en los
ratones que tenían un sistema inmunológico intacto. La inoculación
intracerebral en los cerebros de los ratones atímicos reveló que
uno de los virus era tolerado significativamente mejor que los otros
dos (Ejemplo 24). Estos resultados demuestran que dentro de una
familia concreta de virus se pueden presentar diferencias
importantes en las propiedades virales y éstas pueden ser
explotadas terapéuticamente para obtener una mayor eficacia o una
inocuidad incrementada.
Otro medio mediante el que se puede obtener una
mayor eficacia y una menor toxicidad después del tratamiento con
virus oncolíticos es a través del uso de virus sensibles a
interferón que requieren receptores de superficie celular
específicos que se expresan preferentemente sobre células tumorales.
El virus Sindbis proporciona un ejemplo de este tipo de
restricción. El virus Sindbis infecta las células de mamífero usando
el receptor de alta afinidad para laminina ((Wang y col., (1992)
J. Virol. 66, 4992-5001). Cuando células
normales y células tumorales se infectan con el virus Sindbis en un
ensayo diferencial de citotoxicidad, se encontró que las células
que eran tumorigénicas y que expresaban el receptor de alta afinidad
para laminina eran más sensibles a ser destruidas por este virus
que otras células (Ejemplo 25). Los queratinocitos normales expresan
el receptor de alta afinidad para laminina (Hand y col., (1985)
Cancer Res., 45, 2713-2719) pero fueron
resistentes a la destrucción por el virus Sindbis en este
ensayo.
El virus de la estomatitis vesicular (VSV) (del
inglés, " Vesicular Stomatitis
Virus") proporciona una evidencia de la destrucción
selectiva de tumor por acción de virus oncolíticos, es decir, una
deficiencia inherente en la capacidad de respuesta a interferón en
células tumorales hace a estas células sensibles a ser destruidas
por virus sensibles a interferón y competentes en replicación,
cuando el VSV se usa para infectar células WISH humanas, no
tumorigénicas, y células HT1080 o células KB tumorigénicas en
presencia de interferón exógeno.
Más adelante se encuentra una lista de virus que
cuando se modifican para suprimir las actividades
anti-interferón presentes en la naturaleza, son
útiles en una terapia viral contra el cáncer (véase la Tabla 2).
Virus modificados (de manera ventajosa, pero no necesariamente,
virus atenuados, además de llevar la modificación
anti-interferón, véase la Tabla 3), en los que se
han destruido o disminuido las actividades
anti-interferón endógenas, son útiles para una
terapia contra el cáncer. Esta lista incluye, pero no se limita a,
los virus que se describen más adelante. Debido a la similitud
entre virus pertenecientes a una clase común, los mecanismos
identificados para cada uno de los virus listados más adelante,
están también presentes en otros miembros de esa clase de virus
como mecanismos idénticos o funcionalmente análogos. El grupo más
amplio de virus se añade en paréntesis. Los virus, tales como los
que se listan más adelante, que presentan una pérdida funcional de
actividad anti-interferón, producida a través de
alguno de los medios para ello, que incluyen mutaciones aparecidas
en la naturaleza así como deleciones o mutaciones puntuales
producidas por ingeniería genética, son útiles en los métodos de la
presente invención.
Los virus que usan más de un único mecanismo se
modifican opcionalmente para que contengan mutaciones en una,
algunas o todas las actividades. Las mutaciones de algunas de las
actividades descritas se encuentran a disposición de la comunidad
científica general.
Materiales aislados de virus presentes en la
naturaleza o de virus manipulados por ingeniería genética que son
de crecimiento más lento en comparación con la velocidad de
crecimiento del virus de tipo salvaje, son particularmente
ventajosas debido a que una velocidad más lenta del crecimiento del
virus permitirá a una célula o a una población de células
competentes en una respuesta a interferón, establecer un estado
antiviral eficiente antes de que la replicación viral sea capaz de
matar a la célula o a la población de células.
La desactivación de las actividades virales
anti-interferón, como alteración específica del
carácter viral que da como resultado el incremento de la respuesta
de interferón en una célula infectada, pero que aún permite la
replicación viral en células neoplásicas, está incluida en la
presente invención.
La Tabla 2 muestra virus existentes, manipulados
por ingeniería genética para suprimir la actividad
anti-interferón.
La Tabla 3 es un listado de virus manipulados
por ingeniería genética para atenuar su virulencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La presente invención se refiere a una terapia
viral de neoplasmas, especialmente en animales con cáncer. En una
realización ventajosa, la invención se refiere al tratamiento de
tumores que tienen 1 centímetro (cm) o más del tamaño, medido en su
dimensión mayor. Según aquí se usa, "tumor de 1 cm" indica que
al menos una de las dimensiones del tumor es de 1 cm de longitud.
Esos tumores son más sensibles de lo esperado a una terapia viral,
a menudo al menos tan sensibles al virus, si no más sensibles, que
tumores que tienen un tamaño menor. En un aspecto más ventajoso de
la invención, se tratan tumores mayores que 1 cm, p. ej., tumores
que tienen 2 cm o más, tumores desde aproximadamente 2 cm hasta
aproximadamente 5 cm, y tumores mayores que 5 cm.
La presente invención también que se puede
utilizar para tratar hospedadores con una carga tumoral alta. Según
aquí se usa, la frase "carga tumoral" se refiere a la cantidad
total de tumor en el organismo, expresada en forma de porcentaje
con respecto al peso corporal. La terapia viral del hospedadores que
tienen una carga tumoral, por ejemplo, desde aproximadamente el 1%
hasta aproximadamente el 2% del peso corporal total, es
sorprendentemente efectiva, p. ej., produciendo la regresión del
tumor y una reducción de la carga tumoral global. Esto es
especialmente inesperado ya que una carga tumoral de aproximadamente
el 2% del peso corporal total (p. ej., 1 kg de tumor en un
individuo humano de 60 kg) es aproximadamente la masa máxima de
cáncer máxima compatible con la vida. Véase, p. ej., Cotran y col.,
En Robbins Pathological Basis of Disease, 4ª Edición, WB
Saunders, 1989, página 252. En los Ejemplos, volúmenes de hasta 397
mm^{3} de un cáncer de melanoma (p. ej., A375) en un hospedador
ratón, mostró una regresión completa en respuesta al tratamiento con
un virus de la enfermedad de Newcastle (p. ej., un virus purificado
por el sistema de triple placa de lisis). Suponiendo que un tejido
de 1.000 m^{3} equivale a 1 gramo, un tumor con un volumen de 397
mm³ comprende aproximadamente el 2% del peso corporal total
en el caso de un ratón de 20 g.
Según se muestra más adelante en los Ejemplos
del 4 al 9, la regresión del tumor se consiguió con tumores de al
menos 1 cm de tamaño, mientras que los animales de control no
tratados comenzaron a morir a consecuencia de la carga tumoral en
el plazo de algunas semanas. Por lo tanto, esos animales enfermos
fueron tratados con éxito a pesar de encontrarse a dos semanas de
la muerte. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, un
animal que está casi en estado terminal a consecuencia de su carga
tumoral, puede ser tratado de manera efectiva con una terapia
viral. Por consiguiente, la presente invención se puede usar para
tratar pacientes que no han respondido a una terapia convencional,
p. ej., una quimioterapia tal como con metotrexato,
5-fluorouracilo, y radioterapia.
La eficacia del NDV en el tratamiento del cáncer
después de su administración por vía intraperitoneal ha sido
también investigada. Usando un modelo de prevención de ascitis de
cáncer de ovario, la inyección intraperitoneal de NDV en ratones
que albergan tumores ováricos ES-2 de seres humanos,
produjo un aumento de la supervivencia comparada con la de ratones
tratados con disolución salina (Ejemplo 16). Cuando se usaron
células ES-2 en un modelo de tumor de cáncer de
ovario, iniciándose el tratamiento una vez formada la ascitis, la
producción de fluido ascítico disminuyó notablemente en los
animales tratados con virus, comparados con los controles tratados
con disolución salina (Ejemplo 17).
En otra realización de la invención,
administración de virus produce 1) el alivio de los síntomas
relacionados con el tumor, tales como, pero sin limitarse a, una
tasa disminuida de la producción de fluido ascítico, alivio del
dolor y alivio de la enfermedad obstructiva, y 2) la prolongación de
la vida.
Veintitrés pacientes han recibido el material
aislado de NDV purificado en placa de lisis, por vía intravenosa
(Ejemplo 20). Las respuestas al tratamiento incluyen la regresión de
un tumor palpable, la estabilización de la enfermedad en el 47% de
los pacientes y una disminución de la medicación analgésica.
\vskip1.000000\baselineskip
En una de las realizaciones de la invención, las
células o tejidos tumorales se someten escrutinio in vitro
para determinar los pacientes con tumores sensibles al virus. Las
células tumorales extraídas de los pacientes (mediante métodos
tales como aspiración con aguja fina en el caso de tumores sólidos o
mediante paracentesis en el caso de tumores ascíticos ovario) se
hacen crecer in vitro y se incuban con el virus. En esta
realización de la invención, los pacientes se seleccionan para
terapia si el virus tiene una actividad alta frente a las células
tumorales de los mismos.
En una realización ventajosa de la invención, la
cantidad de virus administrada produce la regresión del tumor o de
los tumores. Según aquí se usa, el término "regresión"
significa que tumores se encoge, por ejemplo, de tamaño, masa o
volumen. El encogimiento en el tamaño del tumor se demuestra
mediante distintos métodos, que incluyen el examen físico, placa de
tórax u otras radiografías, ecografía, barrido CT, MRI o un
procedimiento de barrido con radioisótopos.
Distintos tipos de neoplasmas que incluyen
cánceres son tratables de acuerdo con la invención. Los virus de la
presente invención son útiles para tratar diversos cánceres, que
incluyen pero que no se limitan a, carcinomas de pulmón, carcinoma
de mama, carcinoma de próstata, adenocarcinoma de colon, carcinoma
de cuello de útero, carcinoma endometrial, carcinoma ovárico,
carcinoma de vejiga, tumor Wilm, fibrosarcoma, osteosarcoma,
melanoma, sarcoma sinovial, neuroblastoma, linfoma, leucemia,
cáncer de cerebro que incluye glioblastoma, carcinoma
neuroendocrino, carcinoma renal, carcinoma de cabeza y cuello,
carcinoma de estómago, carcinoma esofágico, carcinoma vulvar,
sarcoma, cáncer de piel, cáncer de tiroides y páncreas y
mesotelioma. Los virus de la presente invención son también útiles
para tratar diversos tumores benignos, que incluyen, pero que no se
limitan a, condilomas, papilomas, meningiomas y adenomas.
Una cantidad terapéuticamente efectiva de virus
se administra a un hospedador que tiene un neoplasma. Los expertos
en la técnica saben que la dosis de virus administrada variará
dependiendo del virus seleccionado, del tipo de neoplasma, de la
extensión del crecimiento de las células neoplásicas o de
metástasis, de la localización biológica o del compartimento
corporal del neoplasma(s), de la cepa de virus, de la vía de
administración, de la pauta de administración, del modo de
administración y de la identidad de todos los demás fármacos o
tratamientos que están siendo administrados al mamífero, tales como
tratamiento con radiación, quimioterapia o tratamiento quirúrgico.
Estos parámetros se definen a través de la determinación de la dosis
máxima tolerada en modelos animales y se ajustan a la dosificación
humana en función de la superficie corporal o de la masa corporal
relativas. Se entiende también que en determinadas circunstancias,
se administra más de una única dosis del virus. El intervalo óptimo
entre esas múltiples dosis del virus se puede determinar
empíricamente y está dentro de la experiencia en la técnica. El NDV
generalmente se administra en una dosis desde aproximadamente 3 x
10^{6} hasta aproximadamente 5 x 10^{12} PFU de virus. En caso
de administración local (por ejemplo, directamente en el tumor),
típicamente se usan cantidades totales desde aproximadamente 3 x
10^{6} hasta aproximadamente 5 x 10^{10} PFU de virus. En caso
de administración sistémica, se usan cantidades desde
aproximadamente 1 x 10^{8} hasta aproximadamente 4 x 10^{11} PFU
de virus por metro cuadrado de superficie corporal. En caso de
administración intravenosa, se usan las pautas de dosificación de
una vez por semana, dos veces por semana y tres veces por semana.
Un virus de acuerdo con la presente invención, opcionalmente junto
con un agente quimioterapéutico, se puede administrar por diferentes
vías, p. ej., entérica, parenteral, oral, nasal, rectal,
intratecal, intravenosa (p. ej., usando un catéter), subcutánea,
intratumoral (directamente dentro del tejido tumoral o de los vasos
que lo perfunden), peritumoral, local, sublingual, bucal, tópica,
intramuscular, mediante inhalación, percutánea, vaginal,
intra-arterial, intracraneal, intradérmica,
epidural, sistémica, tópica, intraperitoneal, intrapleural, etc. En
el caso de los tumores de pulmón, se puede usar un vía bronquial
(p. ej., administración bronquial). También se pueden usar
inyecciones endoscópicas de tumores gastrointestinales, así como el
tratamiento con supositorios de tumores rectales cuando
convenga.
Estudios de toxicidad en múridos con NDV han
indicado que la toxicidad aguda después de la administración
intravenosa del virus es probable que esté causada por reacciones
mediadas por citoquinas. Se sabe que las respuestas de las
citoquinas a estímulos repetidos son desensibilizadas o reguladas
por disminución después de un evento de inducción inicial
(Takahashi y col., (1991) Cancer Res. 51,
2366-2372). Ratones a los que se les inyectó por
vía intravenosa una dosis desensibilizante de virus, fueron capaces
de tolerar aproximadamente 10 veces más virus en una segunda dosis
que los ratones que habían recibido sólo vehículo en la primera
inyección (Ejemplo 18). La velocidad de administración de virus por
vía intravenosa puede afectar significativamente la toxicidad. Dos
grupos de ratones atímicos se trataron por vía intravenosa con dosis
idénticas de NDV, el cual se administró o bien lentamente (0,2 ml a
lo largo de 4 minutos) o bien rápidamente (0,2 ml a lo largo del 30
segundos). La comparación de la pérdida de peso máxima en cada uno
de los grupos reveló una pérdida de peso del 50% en el grupo había
recibido la inyección lenta frente al que había recibido una
inyección rápida (Ejemplo 19).
En una cohorte de un estudio clínico, los
pacientes recibieron tres inyecciones del material aislado de NDV
purificado en placa de lisis, a lo largo de una semana (Ejemplo 20).
En estas condiciones, un efecto desensibilizante de la dosis
inicial redujo la toxicidad asociada con la segunda y la tercera
dosis. Estos datos se asemejan a los obtenidos con los estudios
realizados en animales, mostrados en el Ejemplo 18. Un problema
relacionado con el uso de virus oncolíticos en el tratamiento del
cáncer es el efecto inhibidor potencial que la inmunorrespuesta
humoral puede ejercer sobre la terapia. En el estudio clínico, los
pacientes que presentan una enfermedad estable transcurrido 1 mes
son elegibles para una segunda tanda de tratamiento que se
administra a continuación en presencia de anticuerpos
neutralizantes dirigidos a NDV. No obstante, el virus infeccioso se
pudo encontrar en la orina de los pacientes siete días después de
haber recibido la dosis de la segunda ronda de tratamiento,
evidenciando que la administración de dosis altas de virus es capaz
de superar el efecto de los anticuerpos neutralizantes y de
establecer una infección en el paciente.
En una realización ventajosa en la invención,
una dosis desensibilizante se administra antes de administrar dosis
posteriores más altas. Para la desensibilización, se usan dosis de
virus desde 1 x 10^{8} hasta 2,4 x 10^{10} PFU/m^{2}. Después
de la desensibilización, se usan dosis adicionales de virus desde 3
x 10^{8} hasta 4 x 10^{12} PFU/m^{2}. El margen de tiempo
entre las dosis, que incluye el margen de tiempo entre la dosis
desensibilizante y la siguiente dosis, es de 1 a 14 días,
ventajosamente de 1 a 7 días. La dosis desensibilizante se puede
administrar por diversas vías, p. ej., intravenosa, entérica,
parenteral, oral, nasal, rectal, intratecal, intravenosa,
subcutánea, intratumoral, peritumoral, local, sublingual, bucal,
tópica, intramuscular, mediante inhalación, percutánea, vaginal,
intra-arterial, intracraneal, intradérmica,
epidural, sistémica, tópica, intraperitoneal, intrapleural,
endoscópica, intrabronquial, etc. Las dosis posteriores se pueden
administrar mediante la misma vía que la dosis desensibilizante o
mediante otra vía, p. ej., intravenosa, entérica, parenteral, oral,
nasal, rectal, intratecal, intravenosa, subcutánea, intratumoral,
peritumoral, local, sublingual, bucal, tópica, intramuscular,
mediante inhalación, percutánea, vaginal,
intra-arterial, intracraneal, intradérmica,
epidural, sistémica, tópica, intraperitoneal, intrapleural,
endoscópica, intrabronquial, etc.
Opcionalmente, se puede usar más de una única
vía de administración ya sea de una manera secuencial o de una
manera concurrente. Las vías para una administración o concurrente o
secuencial incluyen, pero no se limitan a, la vía intravenosa,
entérica, parenteral, oral, nasal, rectal, intratecal, intravenosa,
subcutánea, intratumoral, peritumoral, local, sublingual, bucal,
tópica, intramuscular, mediante inhalación, percutánea, vaginal,
intra-arterial, intracraneal, intradérmica,
epidural, sistémica, tópica, intraperitoneal, intrapleural,
endoscópica, intrabronquial, etc. Un ejemplo sería la
administración de una dosis desensibilizante intravenosa seguida de
una dosis intraperitoneal.
En otra realización ventajosa de la invención,
el virus se administra mediante infusión lenta, que incluye usar
una bomba intravenosa o una inyección lenta durante el transcurso de
4 minutos a 24 horas.
Un virus, y opcionalmente uno o más agentes
quimioterapéuticos, se administra a través de una única inyección,
a través de inyecciones múltiples, o de una manera continuada. El
virus se administra antes, al mismo tiempo, o después de la
administración de agentes quimioterapéuticos (tales como, pero sin
limitarse a: busulfano, ciclofosfamida, metotrexato, citarabina,
bleomicina, cisplatino, doxorrubicina, melfalán, mercaptopurina,
vinblastina, 5-fluorouracilo, taxol y ácido
retinoico). La terapia viral de acuerdo con la presente invención,
se combina opcionalmente con otros tratamientos, que incluyen,
cirugía, radiación, quimioterapia (véase, por ejemplo, Current
Medical Diagnosis and Treatment, Tierney y col. redactores,
Appleton y Lange, 1997, especialmente en las páginas
78-94) y terapia biológica. El virus se administra
antes, al mismo tiempo, o después de la administración de agentes
biológicos tales como (1) otros agentes oncolíticos [tales como,
pero sin limitarse a: adenovirus con uno de sus genes bajo el
control transcripcional de un elemento de respuesta específico de
células prostáticas (véase Rodriques, R. y col.,, 1997, Cancer
Res., 57:2559-2563;); adenovirus que no
codifican un polipéptido E1b capaz de unirse a p53 (véase Bischoff,
J.R. y col., 1996, Science 274:373-376)); un
virus del herpes simple que es incapaz de expresar un producto
funcional del gene gamma 34.5 (véase Mineta, T. y col., 1995,
Nature Medicine, 1:938-943)]; (2) citoquinas
(tales como, pero sin limitarse a: factores estimuladores de
colonias, tales como GM-CSF; factor de necrosis
tumoral e interleuquinas tales como IL-1,
IL-2, IL-6 de
IL-10); (3) vectores virales [tales como, pero sin
limitarse a, adenovirus que codifican p53 (véase Zhang, W.W. y
col., 1994, Cancer Gene Therapy, 1:5-13)); y
(4) vacunas contra el cáncer. En una de las realizaciones de la
invención, la terapia consiste en el tratamiento seriado con virus
antigénicamente diferentes que son citotóxicos y selectivos de
tumor a través del mecanismo del IFN. Esta realización posibilita
la terapia viral a lo largo de un período de tiempo prolongado sin
interferencia inmunológica.
Otra realización implica el tratamiento de
pacientes con interferón IFN (p. ej., \alphaIFN, \betaIFN o
\gammaIFN) antes de, de manera concurrente con, o después de la
administración de NDV (o de otros virus). El IFN se selecciona
entre la clase I (alfa, beta y omega) y la clase 2 (gamma) del
grupo, y sus versiones recombinantes y sus análogos según se trata
detalladamente en, por ejemplo, Sreevalsoun, T., 1995 (En:
Biologic Therapy of Cancer, segunda edición, redactores:
V.T. DeVita, Jr., S. Hellman y S.A. Rosenberg, J.B. Lippincott
Company, Philadelphia, págs. 347-364). Las
células normales responden al pretratamiento con IFN con una
respuesta de IFN aumentada a la infección viral, proporcionando una
inocuidad aún mayor a estas células. Las células tumorales
deficientes en la ruta de señalización de IFN permanecen sensibles a
la destrucción por el virus. Esto permite que se usen dosis aún
mayores de terapia viral. El IFN se administra de acuerdo con las
directrices clínicas estándar para dosis y regímenes conocidos y se
sabe que son efectivos para tratar infecciones virales. En otra
realización de la invención, otros fármacos, que se sabe que afectan
a la ruta de respuesta de IFN, se usan también opcionalmente para
aumentar la sensibilidad de las células tumorales, o para aumentar
la resistencia de las células normales a los efectos citocidas de la
infección viral. Esta clase de fármacos incluye, pero no se limita
a, inhibidores de tirosina-quinasa, cimetidina e
inhibidores mitocondriales. Se sabe también que la hipoxia y la
hipertermia modulan la capacidad de respuesta de interferón.
En otra realización de la invención, con el
virus se administran inmunosupresores tales como ciclosporina A,
azatiaprima y leflunomida, diferentes preparaciones de
corticoesteroides y anticuerpos anti-ligando
CD-40 (Foy, T.M. y col., 1993, J. Exp. Med.
178:1567-1575). Como alternativa, Como alternativa,
un compuesto inmunoestimulador, p. ej., lipopéptidos, se puede
administrar con el virus.
Un mecanismo independiente mediante el cual la
cantidad interferón producida en respuesta a una infección viral se
incrementa través del uso de nucleósidos (Machida, H., 1979.
Microbiol. Immunol. 23:643-650), precursores
de nucleósidos, o fármacos que aumentan la concentración celular de
uno o más nucleósidos, se usará opcionalmente como ayudante para la
terapia viral.
Determinados análogos de nucleósidos de purina,
p. ej., 2-clorodesoxiadenosina y
2'-desoxicoformicina, disminuyen la producción de
interferón in vivo. Esos compuestos se usarán para la EFFECT
marcar aún más las diferencias entre las sensibilidades a
interferón de las células tumorales frente a las células normales y
se usan opcionalmente como adyuvante de la terapia viral.
En uno de los aspectos, una cantidad efectiva de
virus se pueden subdividir en unidades de dosis más pequeñas y se
puede inyectar al mismo tiempo en diferentes lugares de mismo tumor.
En el caso de una administración continua, el agente(s)
conveniente se administra a través de una minibomba implantada o se
impregna en un polímero conveniente y después se trasplanta en un
lugar conveniente (p. ej., directamente en el tumor) para obtener
una liberación lenta o retardada.
Un virus de la presente invención se formula en
forma de una preparación farmacéutica llevándola a una forma de
dosificación adecuada, junto con al menos un excipiente o agente
auxiliar, y si se desea, junto con uno o más de otros compuestos
activos. Los excipientes adecuados incluyen, p. ej., sustancias
orgánicas e inorgánicas que son apropiadas para la administración
entérica o parenteral, p. ej., agua, disolución salina, medios para
cultivo de tejidos, tampones, lisina, citrato, triacetato de
glicerol y otros glicéridos de ácidos grasos, gelatina, lecitina de
soja, carbohidratos tales como manitol, sacarosa, lactosa o almidón,
estearato de magnesio, talco, celulosa o proteínas transportadoras,
o una combinación de los anteriores compuestos, tal como
manitol/lisina, o manitol/lisina/sacarosa. Las preparaciones se
esterilizan y/o contienen aditivos, tales como conservantes y
estabilizantes. Para la administración parenteral, p. ej., una
inyección sistémica o una inyección local, se formula una
preparación del virus, p. ej., en forma de suspensión acuosa o de
emulsión.
La invención también se refiere a un método para
tratar una enfermedad en un mamífero, en el que las células
afectadas presentan defectos en la respuesta antiviral mediada por
interferón, que comprende administrar al mamífero una cantidad
terapéuticamente efectiva de un virus clonal, sensible a interferón
y competente en replicación. Por ejemplo, células infectadas con
muchos virus similares al de la hepatitis B que inactivan la
respuesta de interferón, son susceptibles a los virus de esta
invención. Existe evidencia de que el virus de inmunodeficiencia
humana (HIV) inactiva la respuesta de interferón. Los virus
sensibles a interferón de esta invención son útiles en el
tratamiento de infecciones virales crónicas, tales como las causadas
por el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C, HIV,
virus de Epstein-Barr, virus del papiloma humano y
herpesvirus.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero
no limitativos, de los métodos y composiciones de la presente
invención. Otras modificaciones y adaptaciones convenientes de
varias de las condiciones y parámetros normalmente encontrados en
terapia clínica, que son obvios para los expertos en la técnica,
están dentro del alcance de esta invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Células tumorales y células normales humanas se
hicieron crecer hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente
el 80% en placas de 24 pocillos para cultivo de tejidos. El medio de
crecimiento se retiró y se añadió PPMK107 en diluciones de razón 10
veces que variaban desde 10^{6} unidades formadoras de placa
(PFU)/pocillo hasta 10^{-1} PFU/pocillo. En cada placa se
incluyeron pocillos de control sin virus añadido. El virus se dejó
adsorber durante 90 minutos sobre una plataforma oscilatoria a 37ºC.
Al final del período de incubación, las diluciones virales se
retiraron y se sustituyeron por 1 ml de medio de cultivo. Las placas
se incubaron a continuación durante 5 días a 37ºC, en CO_{2} al
5%, después se evaluaron cualitativamente con respecto a la
cantidad de efecto citopático (CPE). La citotoxicidad se cuantificó
usando un ensayo colorimétrico con MTT (bromuro de
2-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio)
(Cell Titer 96, n.º catálogo G4000, Promega
Corporation, Madison WI 53711) con detección a 570 nm, que
detecta actividad de enzimas mitocondriales (Mosman, T., 1983,
J. Immunol. Methods 65:55). La viabilidad de los pocillos
tratados con virus se expresó en forma de un porcentaje de la
actividad encontrada en los pocillos de control no tratados. Los
datos se representaron gráficamente en forma de PFU/pocillo frente
a la viabilidad expresada como un porcentaje del control. La IC50
se calculó como la cantidad de virus expresada en PFU/pocillo que
produce una reducción del 50% en la cantidad de células viables.
Los resultados se proporcionan en las Tablas 4,
5 y 6. PPMMK107 mostró un alto grado de actividad citotóxica frente
a un grupo diverso de células cancerosas humanas, presentando 30 de
un total de 39 líneas malignas un valor de IC50 menor que 1.000 en
comparación con la insensibilidad relativa de los tipos de células
humanas normales. La mayoría de las células cancerosas humanas
presentó valores de IC50 que fueron de 2 a 3 órdenes de magnitud más
bajos que los de los tipos de células humanas normales.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones atímicos recibieron inyecciones por vía
intradérmica de 10 millones de células tumorales humanas. Una vez
que los tumores alcanzaron un intervalo de tamaños entre 5 mm y 10
mm, se les administró una inyección única de PPMK107 (a una dosis
de 3 x 10^{8} PFU) o de disolución salina. Casi todos los tipos de
tumor exhibieron una tasa de regresión completa o parcial del 50%
al 100% (véase la Tabla 7) en los ratones tratados con PPMK107. La
única excepción es el caso del experimento U87MG (experimento I):
Aunque solamente uno de los 9 tumores tratados con PPMK107
experimentó regresión completa, dos tumores más tratados con el
virus mostraron una regresión del 32% y del 20% y dos tumores más
tratados con virus presentaron un crecimiento más lento que los 8
tumores tratados con el control de disolución salina. La regresión
de tumores estuvo virtualmente ausente en los tumores tratados con
el control de disolución salina: En todos estos experimentos (desde
el A hasta el I, listados en la Tabla 7) solamente uno de los 73
tumores de control mostró regresión. Estos resultados indican que
los diversos tipos de tumor mostraron respuestas al tratamiento
intratumoral con PPMK107.
Para estudiar la replicación de los virus en el
interior del tumor, se realizó una tinción inmunohistoquímica del
antígeno viral (usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la
proteína P de NDV) usando el modelo del fibrosarcoma HT1080
subcutáneo. Dentro de los 30 minutos después de la inyección
intratumoral de 3 x 10^{8} PFU de PPMK107, el tejido tumoral fue
negativo con respecto al antígeno viral. Sin embargo, en el día 2
después del tratamiento, una intensa inmunotinción con respecto al
antígeno viral se observó dentro del tumor, indicando la
replicación del virus en el interior del tumor. Es importante
destacar que la replicación del virus fue específica para el tejido
tumoral ya que el tejido conjuntivo y la piel adyacentes fueron
negativos con respecto al antígeno viral.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones atímicos recibieron inyecciones
intradérmicas de 10 millones de células del fibrosarcoma HT1080
humano. Una vez que los tumores alcanzaron un intervalo de tamaños
entre 5 mm y 8 mm, se les administró una inyección (inyecciones)
intravenosa de PPMK107 o de disolución salina. Como se muestra en la
Tabla 8, al nivel más alto de dosis de virus (1 x 10^{9} PFU) se
observó una regresión completa del tumor en los siete ratones. Las
inyecciones únicas de 3 x 10^{8} PFU y 6 x 10^{7} PFU produjeron
unas tasas de regresión de más del 90%. Mientras que una inyección
única por vía IV de 3 x 10^{8} proporcionó solamente una tasa de
regresión del tumor del 55%, tres inyecciones por vía IV de este
nivel de dosis proporcionaron una tasa de respuesta del 100%. Los
ratones tratados con disolución salina por vía IV, no exhibieron
evidencia de regresión del tumor. Estos resultados indican que los
tumores HT1080 subcutáneos dan una buena respuesta al tratamiento
por vía IV con PPMK107.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones atímicos recibieron inyecciones
intradérmicas de 10 millones de células del melanoma A375 humano.
Diez días más tarde, tumores de diferentes tamaños se trataron con
una sola inyección de PPMK107 (dosis de 3 x 10^{8}, 9 x 10^{8}
y 1,5 x 10^{9} PFU) o de disolución salina. De los tumores con su
dimensión más grande de 10 mm a 11 mm, los nueve experimentaron
regresión completa en respuesta al tratamiento intratumoral con
estas dosis de PPMK107, mientras que de los tumores con su dimensión
más grande de 8 mm a 9,5 mm, doce de los 24 tumores experimentaron
regresión completa en respuesta a la terapia viral (P < 0,008;
Tabla 9, sección A). No se observó regresión de los tumores en
ninguno de los ratones tratados con disolución salina.
Estos mismos tumores, cuando se clasificaron por
el volumen del tumor, también evidenciaron un alto porcentaje de
regresión completa en aquellos tumores con mayor volumen tumoral. En
respuesta a estas dosis de PPMK107, la regresión completa tuvo
lugar en 14 de un total de 17 tumores con volúmenes > 300
mm^{3} (intervalo de 304 mm^{3} a 397 mm^{3}) y en 7 de un
total de 16 tumores con volúmenes < 300 mm^{3} (intervalo de
144 mm^{3} a 295 mm^{3}; P < 0,023; Tabla 9, sección B).
Estos resultados indican que los tumores de al
menos 1 cm de longitud o 300 mm^{3} de volumen son por lo menos
igual de sensibles, si no más sensibles, al tratamiento intratumoral
con PPMK107 que los tumores más pequeños.
Los tumores se establecieron de la misma manera
que en el Ejemplo 4 diez días después de la inoculación de las
células tumorales. El tratamiento consistió en distintas dosis de
PPMK107 (3 x 10^{6} PFU, 3 x 10^{7} PFU, 3 x 10^{8} PFU y 1,5
x 10^{9} PFU) o de disolución salina. En el caso de los tumores
con de 10 mm a 11,5 mm en su dimensión más grande, tuvo lugar una
regresión completa o parcial (al menos del 50%) en los 28 tumores
tratados con PPMK107 usando estas dosis, en contraste con la
ausencia de regresión en todos los ratones tratados con disolución
salina (Tabla 10, sección A).
Cuando estos mismos tumores se clasificaron por
volumen tumoral, los 26 tumores mayores que 300 mm^{3} (intervalo:
de 309 mm^{3} a 525 mm^{3}) experimentaron una regresión
completa o parcial de al menos el 50% en respuesta a PPMK107 en
contraste con ninguno de los ratones tratados con disolución
salina.
Estos resultados confirman que los tumores de al
menos 1 cm de longitud o 300 mm^{3} de volumen son sensibles al
tratamiento intratumoral con PPMK107.
Los tumores se establecieron de la misma manera
que en el Ejemplo 4 diecinueve días después de la inoculación de
las células tumorales. El tratamiento consistió en distintas dosis
de PPMK107 (3 x 10^{8} PFU, 3 x 10^{6} PFU, 3 x 10^{5} PFU, 3
x 10^{4} PFU, 3 x 10^{3} PFU, 3 x 10^{2} PFU) o de disolución
salina. En el caso de los tumores con de 12,5 a 14 mm en su
dimensión más grande (intervalo de volúmenes: de 632 mm^{3} a 787
mm^{3}; volumen medio 698 mm^{3}), tuvieron lugar regresiones
tumorales de al menos el 50%) en dos de los tres ratones tratados
con 3 x 10^{8} PFU, en contraste con la ausencia de regresión en
los dos ratones tratados con disolución salina (Tabla 11). Usando
la misma dosis de PPMK107 (3 x 10^{8} PFU) para tratar tumores
con su dimensión más grande de 10 mm a 12 mm (intervalo de
volúmenes: de 320 mm^{3} a 600 mm^{3}; volumen medio: 411
mm^{3}), siete de ocho ratones exhibieron una regresión de la
menos el 25% (P < 0,001 para una regresión de al menos el 25% en
comparación con los ratones tratados con disolución salina que no
exhibieron regresiones, Tabla 11). También se observaron regresiones
de al menos el 25% en tumores de 10 mm a 12 mm de longitud, en
ratones tratados con 3 x 10^{6} PFU, 3 x 10^{5} PFU, 3 x
10^{4} PFU y 3 x 10^{3} PFU, pero no en ratones tratados con 3
x 10^{2} PFU o con disolución salina (Tabla 11).
Estos resultados confirman que los tumores de al
menos 1 cm de longitud o 300 mm^{3} de volumen son sensibles al
tratamiento intratumoral con PPMK107.
\newpage
Se establecieron tumores de 10 mm a 12 mm de
dimensión más grande, de la misma manera que en el Ejemplo 4, trece
días después de la inoculación de las células tumorales. El
tratamiento intratumoral consistió en una única inyección de 3 x
10^{8} PFU de PPMK107 o de disolución salina. Los volúmenes de los
tumores tratados con PPMK107 variaron desde 295 mm^{3} hasta 600
mm^{3} (volumen medio de los tumores de 437 mm^{3}). Los grupos
de ratones de cada uno de los grupos de tratamiento se sacrificaron
con eutanasia en los días 0, 2, 3, 4, 7 y 14 para el estudio
histológico del tumor. En el caso de los ratones observados durante
un mínimo de 4 días, 11 de un total de 12 ratones tratados con
PPMK107 exhibieron una regresión de al menos el 25% en comparación
con ninguno de los 8 ratones del grupo tratado con disolución salina
(P < 0,0001, Tabla 12). A los 2 días después del tratamiento con
PPMK107, dos tumores exhibieron ya signos de regresión pero el grado
de regresión fue de menos del 25%.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los tumores de mayor dimensión, de 10 mm a 12
mm, se establecieron de la misma manera que en el Ejemplo 4 veinte
días después de la inoculación de las células tumorales. El
tratamiento intratumoral consistió en una única inyección de 3 x
10^{8} PFU de PPMK107 o de disolución salina. Los volúmenes de los
tumores tratados con PPMK107 variaron desde 361 mm^{3} hasta 756
mm^{3} (volumen medio de los tumores de 551 mm^{3}). Nueve de
un total de 10 ratones tratados con PPMK107 exhibieron una regresión
de al menos el 25% en comparación con ninguno de los 10 ratones del
grupo tratado con disolución salina (P < 0,0001, Tabla 13).
\vskip1.000000\baselineskip
A ratones atímicos se les inyectaron por vía
subcutánea 10 millones de células del fibrosarcoma humano HT1080.
Seis días después, los tumores se trataron con una inyección única
de PPMK107 (a una dosis de 1,5 x 10^{9} PFU) o de disolución
salina. En el caso de los tumores de 10 a 11 mm en su dimensión más
grande, cinco de un total de seis tumores mostraron una regresión
completa o parcial en respuesta a una inyección intravenosa única
de PPMK107 en comparación con ninguno de los tumores tratados con
disolución salina (Tabla 14, P < 0,025). Estos resultados
indican que los tumores de al menos 1 cm de longitud son sensibles
al tratamiento intravenoso con PPMK107.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Con el fin de estudiar el mecanismo de
destrucción específica de tumor por acción de la cepa PPMK107 de
NDV, se escogieron células tumorales representativas sobre la base
de los siguientes criterios: a) capacidad para generar tumores en
forma de xenotrasplantes en ratones atímicos; b) los trasplantes
tumorales son destruidos de manera específica in vivo
después de la administración de PPMK107; c) las células tumorales
manifiestan ser destruidas por PPMK107 in vitro a
concentraciones de virus que están a varios log por debajo de la
concentración necesaria para matar a las células normales
resistentes; y d) las células tumorales se deben distinguir con
facilidad de las células normales cuando se encuentran en forma de
cocultivo. Los tumores de los xenotrasplantes que comprenden
células KB de carcinoma de cabeza y cuello exhiben en el 83% una
regresión parcial o completa en respuesta a una única inyección
intratumoral de PPMK107, son más de cuatro veces más sensibles a
ser destruidos por PPMK107 in vitro que fibroblastos
primarios normales de la piel (CCD922-sk) y se
distinguen fácilmente de las células CCD922-sk
cuando se encuentran en forma de cocultivo.
Por consiguiente, cocultivos de células KB y
células CCD922-sk se infectaron a una multiplicidad
de infección (m.o.i. (del inglés, " multiplicity
of infection"), proporción de virus añadido por
célula) de 0,0005, y el transcurso de la infección se siguió
durante 5 días mediante tinción inmunohistoquímica con respecto a
un antígeno viral (la proteína P de NDV). La infección de las
células normales tuvo su máximo en el día 2, con una muerte celular
escasa o no evidenciada, según se determinó mediante inspección
visual de la monocapa de células. En el tercer día después de la
infección, la cantidad de expresión viral de las células normales
disminuyó significativamente, mientras que la infección de las
células tumorales se evidenció claramente. La cantidad de antígeno
viral prácticamente desapareció en las células normales en los días
4 y 5, mientras que la infección de las células tumorales progresó
rápidamente por toda la población de células tumorales, dando como
resultado la destrucción de la mayoría de las células tumorales
presentes en el cocultivo.
Así, las células normales fueron infectadas y
eliminaron la infección fácilmente en conformidad con los efectos
anti-virales de IFN. Las células tumorales no fueron
capaces de establecer un estado anti-viral como
respuesta y fueron destruidas por el crecimiento viral constante, a
pesar de la presencia de concentraciones fisiológicamente efectivas
del IFN secretado en el medio por las células normales.
Se hizo un ensayo para comprobar la hipótesis de
que el interferón mediaba la capacidad de las células
CCD922-sk para eliminar la infección de las células
PPMK107. Anticuerpos policlonales neutralizantes, dirigidos contra
el interferón-\alpha humano o contra el
interferón-\beta humano, usados solos o en
combinación, se añadieron diariamente a cultivos de células
CCD922-sk infectadas con PPMK107 a una m.o.i. de
0,0005 y el avance de la infección se siguió durante tres días. La
cantidad de antígeno viral presente en las células aumentó en
proporción a la concentración del anticuerpo neutralizante, siendo
más marcado el efecto del anticuerpo
anti-interferón-\beta que el del
anticuerpo anti-interferón-\alpha;
en conformidad con los informes de que los fibroblastos producen de
manera predominante la forma beta de interferón.
La capacidad para hacer a las células
normalmente insensibles, más susceptibles a la infección con PPMK107
a través de la adición de un anticuerpo neutralizante dirigido
contra interferón, apoya la hipótesis de que una diferencia clave
entre la sensibilidad de las células normales y de las células
tumorales a ser destruidas por PPMK107 reside en la capacidad de
las células normales, pero no de las tumorales, para establecer una
respuesta anti-viral mediada por interferón.
En este experimento, se determinó que otro tipo
de células normales (NHEK, células epiteliales humanas normales),
que se sabe que son bastantes resistentes a ser destruidas por
PPMK107, se hicieron más sensibles a través de la adición de un
anticuerpo policlonal
anti-interferón-\beta a un cultivo
de células infectadas. Las células NHEK (queratinocitos epiteliales
humanos normales) se infectaron a una m.o.i. o de 0,0005 o de 0,05 y
se les añadió anticuerpo diariamente durante cinco días.
En los cultivos infectados a la m.o.i baja
(0,0005), el aumento de la expresión de antígeno viral, dependiente
de anticuerpo, fue claro a los cinco días después de la infección,
pero fue menos claro en las primeras fases del experimento. La
adición de anticuerpo a los cultivos infectados con PPMK107 a una
m.o.i. de 0,05 dio como resultado un aumento marcado de antígeno
viral en los días 4 y 5 después de la infección. En los días 2 y 3
después de la infección,
la adición de anticuerpo neutralizante dio como resultado una menor acumulación de antígeno viral (Fig. 1).
la adición de anticuerpo neutralizante dio como resultado una menor acumulación de antígeno viral (Fig. 1).
Los sobrenadantes de los cultivos de las
muestras de m.o.i. alta, se titularon con respecto a la cantidad de
virus infeccioso presente, mediante ensayo en placa de lisis sobre
células tumorales de fibrosarcoma HT1080 humano; sistema de ensayo
estándar del laboratorio de los autores de la invención. Los
resultados obtenidos de este análisis demostraron que a los cinco
días después de la infección había un aumento de 19 veces de la
cantidad de virus infeccioso en los cultivos tratados con anticuerpo
en relación con los controles que recibieron un tratamiento simulado
(Fig. 1).
Estos resultados sugieren un mecanismo general
mediante el cual las células normales están protegidas de ser
destruidas por PPMK107 a través de un mecanismo relacionado con
interferón.
Se realizó una comparación del efecto del
interferón-\beta añadido de manera exógena sobre
la infección de células normales (CCD922-sk) y de
células tumorales de sensibilidad alta (células KB) o de
sensibilidad intermedia (células HEp2) a PPMK107. Cultivos
independientes de los tres tipos de células se trataron con
interferón-\beta, a 20.000 unidades/ml o a 2.000
unidades/ml, 1 día antes de la infección y 2 días después de la
infección a una m.o.i. de 0,0005.
En el día 3 después de la infección, el bajo
nivel de expresión de antígeno viral presente en las células
normales fue eliminado a todas las dosis de interferón usadas. Por
el contrario, la adición de interferón a las células tumorales KB
altamente sensibles, a concentraciones de 2 unidades/ml o 200
unidades/ml, disminuyó los niveles relativos de expresión de
antígeno viral 2 veces, con una supresión completa a una
concentración de interferón de 1.000 unidades/ml. Las células
HEp-2 de sensibilidad intermedia, respondieron al
interferón exógeno eliminando la expresión de antígeno viral a
todas las dosis de interferón usadas (Fig. 2).
El patrón de sensibilidad de las células KB y de
las células CCD922-sk a los efectos antivirales del
interferón-\beta añadido de manera exógena, fue
inversamente proporcional a la sensibilidad de estas células a ser
destruidas por PPMK107. La capacidad de las células
HEp-2 para responder a los efectos de interferón
indica que estas células son capaces de utilizar eficientemente las
concentraciones de interferón usadas en este experimento. De manera
similar, la respuesta de las células KB a las altas dosis de
interferón sugiere que la incapacidad para establecer una respuesta
antiviral mediada por interferón, no es el resultado de un defecto
absoluto en la ruta del interferón sino de una insensibilidad
relativa en comparación con las células normales.
En este experimento, células normales
(CCD922-sk) y células tumorales (KB) se trataron con
concentraciones bajas de interferón-\beta (0,2
unidades/ml, 2 unidades/ml y 20 unidades/ml) 1 día antes y 2 días
después de la infección con PPMK107 a una m.o.i. de 0,05.
\newpage
En estas condiciones, las células normales
experimentaron una disminución de la cantidad de antígeno viral,
dependiente de la dosis, mientras que los niveles relativos de
antígeno viral de las células tumorales no se vio afectada por la
adición de interferón exógeno (Fig. 3).
Método
A
El PPMK107 derivó de la cepa mesogénica
Mass-MK107 del virus de la enfermedad de Newcastle
mediante el método de purificación en triple placa. Aproximadamente
1.000 PFU (unidades formadoras de placa) de PPMK107 vivos se
inocularon en la cavidad de fluido alantoico de cada uno de 10
huevos de pollo embrionados que contenían embriones de 10 días.
Después de una incubación a 36ºC durante 46 horas, los huevos se
enfriaron y a continuación se recogió el fluido alantoico. Las
células y los restos celulares se separaron del fluido alantoico
mediante centrifugación a 1.750 x g durante 30 minutos. El fluido
alantoico clarificado (el sobrenadante que contiene el virus) se
extendió a continuación a lo largo de un gradiente discontinuo de
sacarosa al 20%/55% y se centrifugó a aproximadamente 100.000 x g
durante 30 minutos. El virus purificado se recogió en la interfase
de las concentraciones al 20%/55% y se dializó frente a disolución
salina para retirar la sacarosa.
Método
B
En otra realización ventajosa, el fluido
alantoico clarificado se congeló a -70ºC. Después de descongelado,
el fluido se mantuvo a de 1ºC a 4ºC durante la noche y luego el
material se separó de la suspensión del virus por medio de
centrifugación (1.750 x g durante 30 minutos). Este material fue
posteriormente procesado usando el gradiente discontinuo de
sacarosa en la ultracentrífuga según lo expuesto en lo que
antecede.
Método
C
En otra realización ventajosa, la
ultracentrifugación en el gradiente discontinuo de sacarosa se llevó
a cabo con una ultracentrífuga de flujo continuo.
Método
D
En otra realización ventajosa, el fluido
alantoico recogido se diluye con un tampón que contiene manitol al
5% y l-lisina al 1,0%, pH 8,0 (tampón ML) y se
somete a clarificación e intercambio con tampón ML mediante
filtración en flujo tangencial (TFF) a través de filtros con un
tamaño de poro nominal de 0,45 \mum. La fracción permeabilizada
que contiene el virus clarificado en tampón ML se recoge y el virus
se purifica mediante TFF a través de filtros con un valor de
exclusión nominal de 300.000 dalton en tampón ML. El virus
concentrado y purificado en tampón ML se recoge como la fracción
retenida en esta etapa y se diluye de nuevo con tampón ML antes de
ser aplicado a una columna de permeabilidad en gel Sephacryl
S500 (Pharmacia) equilibrada con tampón ML. Las
fracciones que contienen el virus purificado se recogen, se reúnen y
se pueden concentrar de nuevo mediante TFF a través de filtros con
un valor de exclusión nominal de 300.000 dalton con tampón ML.
Después de generar PPMK107 mediante purificación
en placas de lisis, se encontró que ocho clones moleculares
individuales procedentes de la población de viriones tenían una
secuencia idéntica (p. ej., una homología del 100%) de más de 300
nucleótidos contiguos contenidos en el gen de la proteína de fusión
de NDV. PPMK107 es un virus clonal con un alto grado de homogeneidad
genética.
Uno de los medios cuantitativos para medir la
pureza es mediante determinación de las PFU/mg de proteína. Los
valores más altos indican un nivel de pureza más alto. Usando el
Método A, se obtuvieron valores de PFU/mg de proteína de al menos
4,8 x 10^{10} (véase la Tabla 15). Usando el método C, se
obtuvieron valores de PFU/mg de proteína de al menos 2,0 x
10^{10}. En el caso de una cepa mesogénica de NDV, no se ha
encontrado en la literatura un valor para esta medida de pureza. La
mejor estimación para una cepa mesogénica de NDV es la preparación
del virus (NDV MassMK107, lote RU2, preparado como se describe en
Faaberg KS y Peeples, ME, 1988, J. Virol. 62:586; y Bratt,
MA y Rubin, H. 1967, Virology 33:598-608). Se
encontró que este lote RU2 tenía un valor de PFU/mg de 1,3 x
10^{9} PFU/mg de proteína. Los valores de pureza conseguidos con
el Método A son aproximadamente 40 veces mejores que lo conseguido
con el método de Peeples (véase la Tabla 15).
\newpage
Otro de los medios cuantitativos para medir la
pureza es mediante la determinación de la proporción de partículas
por PFU. Los valores más bajos indican un nivel mayor de pureza. El
recuento de partículas se realizó mediante microscopía electrónica
usando métodos estándar. Usando el Método A o el Método B, se
obtuvieron valores de partículas por PFU cercanos a uno (Tabla
15).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las preparaciones de virus usando los Métodos A
y C también permiten la purificación de NDV hasta un nivel
sustancialmente libre de proteínas de huevo contaminantes. En el
caso del lote 7 de PPMK107 usando el Método A, la ovoalbúmina no
fue detectable en una transferencia Western usando (1) 1,7 x
10^{9} PFU del virus purificado por pocillo (3,3 cm de ancho),
procesadas en un gel de SDS-PAGE (electroforesis en
gel (de 1 mm de grosor) de poliacrilamida en presencia de
dodecilsulfato sódico); (2) una membrana de nitrocelulosa para la
transferencia; y (3) anticuerpo anti-ovoalbúmina
procedente de conejo (fracción de IgG de conejo Cappel, a una
dilución 1:200 de una concentración de anticuerpo de 4 mg/ml). En
el caso de preparaciones de PPMK107 usando el Método D y analizadas
mediante SDS-PAGE seguida de tinción con plata, no
se observó ninguna banda correspondiente a ovoalbúmina.
\vskip1.000000\baselineskip
En este experimento, a todos los ratones
atímicos (hembras, NCR nu/nu, de 8 semanas de edad) se les
administró una inyección intraperitoneal de 10^{6} células
ES-2. Siete días más tarde, antes de que las ascitis
se desarrollasen, los ratones recibieron un tratamiento
intraperitoneal con disolución salina o con PPMK107 (a 1 x 10^{9}
PFU). Como se muestra en la Figura 4, se produjo una supervivencia
notablemente mejorada en los animales tratados con PPMK107 en
comparación con los tratados con disolución salina. La mayoría de
los ratones del grupo tratado con disolución salina habían
desarrollado ascitis a los siete días después del tratamiento y en
el día 38 todos estos animales habían muerto. En marcado contraste,
el 92% de los ratones tratados con PPMK107 seguían vivos en el día
38 y el 25% de estos animales fueron supervivientes de largo plazo
(> 120 días de supervivencia).
En este experimento, a todos los ratones
atímicos (hembras, NCR nu/nu, de 8 semanas de edad) se les
administró una inyección intraperitoneal de 10^{6} células
ES-2. Catorce días más tarde, cuando la mayoría de
los ratones habían desarrollado ascitis, los ratones sin ascitis se
excluyeron y los ratones con ascitis se repartieron aleatoriamente
en 7 grupos de tratamiento intraperitoneal (PPMK107 - un único
tratamiento en el día 0; PPMK107 - dos tratamientos durante la
primera semana; PPMK107 - un tratamiento cada semana; PPMK107 - dos
tratamientos cada semana; disolución salina - un único tratamiento
en el día 0; disolución salina - dos tratamientos durante la
primera semana; disolución salina - dos tratamientos cada semana);
Una dosis de 1 x 10^{9} PFU/ratón se usó para cada uno de los
tratamientos con virus. A todos los ratones antes del primer
tratamiento y de cualquiera de los tratamientos adicionales, se les
vació de fluido ascítico. El día 0 se refiere al día del primer
tratamiento.
El grado de ascitis de cada uno de los ratones
se cuantificó y se anotó de la siguiente manera:
Como se muestra en la Tabla 16, todos los
animales tratados con disolución salina tuvieron ascitis más
avanzadas que los animales tratados con PPMK107 tanto en el día 7
como en el día 10. En el día 7 después del tratamiento inicial,
cada uno de los grupos tratados con disolución salina tuvo
puntuaciones medias de las acitis por encima de 3,5, mientras que
todos los grupos tratados con PPMK107 tuvieron puntuaciones medias
de ascitis de 3,0 o por debajo. De manera similar, en el día 10
después del tratamiento inicial, cada uno de los grupos tratados
con disolución salina presentó puntuaciones medias de ascitis por
encima de 4,5 mientras que todos los grupos tratados con PPMK107
tuvieron puntuaciones medias de ascitis de 4,1 o inferiores. Estos
resultados indican que la producción de fluido ascítico estaba
marcadamente disminuida en animales tratados con virus en
comparación con los controles tratados con disolución salina.
A ratones C57BL/6 (de siete semanas de edad) se
les inyectó por vía intravenosa en el día 0 o disolución salina o
una dosis desensibilizante de PPMK107 (3 x 108 PFU/ratón). Dos días
más tarde, cada uno de los grupos de ratones se subdividió más en
grupos correspondientes a una dosificación intravenosa con
disolución salina o con PPMK107 (a dosis de 1 x 10^{8}, 2,5 x
10^{9} y 1 x 10^{10} PFU/ratón). Como se muestra en la Tabla
17, cuando se usó disolución salina para el pretratamiento de los
ratones, se registraron muertes en los ratones a los que
posteriormente se les habían administrado dosis de 2,5 x 10^{9}, 5
x 10^{9} y 1 x 10^{10} PFU). Las dosis de 5 x 10^{9} y 1 x
10^{10} PFU fueron letales al 100% para los ratones pretratados
con disolución salina. Por lo contrario, no se observaron muertes
en ningún grupo de ratones a los que se les había administrado una
dosis desensibilizante de PPMK107 en el día 0, seguida de una
inyección de PPMK107 dos días más tarde a unos niveles de dosis de
1 x 10^{10} PFU. Estos datos indican que PPMK107 se puede usar
para prevenir la letalidad de posteriores dosis usando el mismo
agente. Además, la dosis máxima tolerada de PPMK107 se puede elevar
en un orden de magnitud cuando se usa este virus como agente de
desensibilización.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Veintidós ratones atímicos (de 8 semanas de
edad) fueron anestesiados con una combinación de ketamina/xilacina
y se colocaron dentro de un aparato de sujeción para que ayudara a
inhibir sus movimientos durante el procedimiento de las inyecciones
con el fin de permitir una inyección lenta o una inyección rápida de
PPMK107. En el grupo de la inyección lenta, se inyectaron 0,2 ml de
4 x 10^{9} PFU de PPMK107 en disolución salina, por vía
intravenosa, a lo largo de un período de 4 minutos, administrándose
0,01 ml cada de 10 a 15 segundos. El grupo de la inyección rápida
recibió la misma dosis y el mismo volumen pero durante un período de
30 segundos. Como se muestra en la Tabla 18, los animales que
recibieron sus dosis de PPMK107 a lo largo de 4 minutos presentaron
una pérdida de peso de como mucho la mitad de la pérdida de peso
máxima (registrada en el día 2 después de recibir la dosis) de los
animales que habían recibido la misma dosis por vía I.V. a lo largo
de 30 segundos. Estos resultados indican que PPMK107 tiene menos
toxicidad y es más inocuo para administración intravenosa cuando se
inyecta a esas velocidades más lentas.
\vskip1.000000\baselineskip
PPMK107 se ha ensayado por vía I.V. en un
estudio clínico en fase I en EE.UU. Veintitrés pacientes con
tumores sólidos avanzados, que ya no respondían a las terapias
establecidas, han sido tratados con PPMK107. Diecisiete de estos
pacientes han recibido una única dosis de la tanda inicial del
tratamiento. Otros seis pacientes reciben tres dosis por semana
durante una semana de la tanda inicial del tratamiento. El
seguimiento de los tamaños de cada uno de los tumores de los
pacientes se realizó una vez al mes. Los pacientes con la enfermedad
cuanto menos estable (aumento menor que el 25% y descenso menor que
el 50% en la suma de los productos de todos los tumores medibles en
ausencia de lesiones nuevas) se eligieron cada mes para las tandas
adicionales de tratamiento.
Una anciana de 68 años con carcinoma de colon,
presentaba un tumor abdominal palpable entre sus metástasis
generalizadas. Después de un tratamiento único por vía I.V. con
PPMK107, esta paciente experimentó una regresión del 91% de este
tumor individual de pared abdominal en el transcurso de dos semanas
(Tabla 19). Las medidas del tumor un día después de recibir la
dosis (3,75 x 3 cm) fueron similares a las medidas de referencia de
4 x 3 cm. Sin embargo, en el día 7 después de recibir la dosis, el
tumor había disminuido de tamaño a 2 x 2 cm y continuó disminuyendo
de tamaño hasta alcanzar 1,5 x 1,5 cm en el día 14 después de
recibir la dosis de PPMK107. Antes del tratamiento con PPMK107,
esta masa de tumor había estado creciendo rápidamente, con un
aumento del 1.065% en el volumen del tumor, en las dos semanas
anteriores a recibir la dosis de PPMK107. Esta paciente dejó el
estudio porque el crecimiento del tumor aumentaba en otro lugar.
\vskip1.000000\baselineskip
Otros ocho pacientes, todos los cuales habían
presentado previamente progresión de los tumores con las terapias
convencionales contra el cáncer, experimentaron un beneficio en
forma de la estabilización de su cáncer avanzado después de recibir
la dosis de PPMK107. Estos pacientes con la enfermedad en situación
estable, representan pacientes con diversos tipos de cáncer que
incluyen cáncer renal, cáncer pancreático, cáncer de mama y cáncer
de pulmón. Después de tres meses de tratamiento con PPMK107, un
anciano de 67 años, con cáncer renal avanzado y metástasis
generalizadas, en el momento del estudio presentaba la enfermedad en
situación estable, con ausencia de indicaciones de crecimiento
nuevo y sin indicación de aumento del tamaño del tumor. Ha habido
una proporción mayor de beneficio en los casos de enfermedad en
situación estable usando dosis más altas de PPMK107: Dos de 6
pacientes con la enfermedad en situación estable (el 33% de los
pacientes), a los dos primeros niveles de las dosificaciones únicas
(5,9 y 12 billones de PFU por m^{2}) y 4 de 5 pacientes (el 80% de
los pacientes) con la enfermedad en situación estable, al nivel más
alto de la dosis única (24 billones de PFU por m^{2} (Tabla
20).
\vskip1.000000\baselineskip
Uno de los pacientes tratado con el nivel de
dosis de una dosis única de 5,9 billones de PFU/m^{2}, se
benefició del tratamiento con PPMK107 en forma de un alivio
sintomático del dolor asociado al cáncer, según se manifiesta por la
disminución de la medicación narcótica contra el dolor.
\vskip1.000000\baselineskip
Un claro efecto desensibilizante desde la
primera dosis (de 5,9 billones de PFU/m^{2}) se observa en las
dosis posteriores (también de 5,9 billones de PFU/m^{2}) dentro de
la misma semana. En general, los efectos secundarios descritos,
resultantes de la segunda y tercera dosis, han sido muchos menos.
Por ejemplo, los primeros 4 pacientes de este régimen de
tratamiento multidosis (tres dosis por semana durante una semana)
presentaron fiebre después de la primera dosis a pesar de haber
recibido tratamiento antipirético profiláctico con acetaminofeno e
ibuprofeno. La mayoría de estos pacientes no presentaron fiebre
después de haber recibido la segunda y la tercera dosis, incluso en
los casos en los que no recibieron antipiréticos. Esto indica que
la administración de la primera dosis en el programa de tres veces
por semana, disminuye la toxicidad de las dosis segunda y
tercera.
Usando el intervalo de dosis de este estudio de
fase I (\geq 5,9 billones de PFU/m^{2}), hay también una clara
señal de que se pueden suministrar virus de manera efectiva a
pacientes, aun cuando los pacientes hayan generado anticuerpos
neutralizantes. Una anciana de 72 años con cáncer pancreático, al
nivel de una dosis única de 12 billones de PFU/m^{2}, ha
presentado la enfermedad en situación estable durante 2 meses desde
el comienzo del tratamiento con PPMK107. Una segunda tanda de
tratamiento (consistente en una única dosis de PPMK107 por vía
I.V.) se administró un mes después de la primera dosis, cuando la
paciente había producido anticuerpos neutralizantes en su suero.
Siete días después de esta segunda tanda de tratamiento, su orina
dio positivo con respecto a PPMK107 a un título de al menos 40 PFU
por ml. Este resultado indica que los anticuerpos neutralizantes,
dirigidos contra PPMK107, presentes en el suero de esta paciente, no
fueron capaces de inhibir completamente al virus con esta segunda
tanda de tratamiento.
Células tumorales y células normales humanas se
hicieron crecer hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente
el 80% en placas de 24 pocillos para cultivo de tejidos. El medio de
crecimiento se extrajo y se añadió PPNJROAKIN, un clon purificado
en placa de lisis, de la cepa mesogénica New Jersey
Roakin-1946 del virus de la enfermedad de
Newcastle, en diluciones de razón 10 veces que variaban desde
10^{7} unidades formadoras de placa (PFU)/pocillo hasta 1
PFU/pocillo. En cada placa se incluyeron pocillos de control sin
virus añadido. El virus se dejó adsorber durante 90 minutos sobre
una plataforma oscilatoria a 37ºC. Al final del período de
incubación, las diluciones virales se extrajeron y se sustituyeron
por 1 ml de medio de cultivo. Las placas se incubaron a continuación
durante 5 días a 37ºC, en CO_{2} al 5%. Se cuantificó la
citotoxicidad usando un ensayo colorimétrico con MTT (bromuro de
2-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio)
(Cell Titer 96, n.º catálogo G4000, Promega
Corporation, Madison WI 53711) con detección a 570 nm, que
detecta actividad de enzimas mitocondriales (Mosman, T., 1983,
J. Immunol. Methods 65:55). La viabilidad de los pocillos
tratados con virus se expresó en forma de porcentaje de la
actividad encontrada en los pocillos de control no tratados. Los
datos se representaron gráficamente en forma de PFU/pocillo frente
a la viabilidad expresada como porcentaje del control. La IC50 se
calculó como la cantidad de virus expresada en PFU/pocillo que
produce una reducción del 50% en la cantidad de células viables.
Estos resultados (Tabla 21) muestran que
PPNJROAKIN manifiesta efectuar una destrucción selectiva de tumor,
de al menos dos tipos diferentes de células tumorales humanas
(HT1080 y KB) en relación con la que manifiesta frente a
fibroblastos de la piel normales. Los valores de IC50 con respecto a
las dos líneas de células tumorales son entre 800 y 5.000 veces más
bajos que los correspondientes para las células normales.
Células tumorales y células normales humanas se
hicieron crecer hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente
el 80% en placas de 24 pocillos para cultivo de tejidos. El medio de
crecimiento se extrajo y se añadió PPCONN70726, un clon purificado
en placa de lisis, de la cepa mesogénica Connecticut
70726-1946 del virus de la enfermedad de Newcastle,
en diluciones de razón 10 veces que variaban desde 10^{7} unidades
formadoras de placa (PFU)/pocillo hasta 1 PFU/pocillo. En cada
placa se incluyeron pocillos de control sin virus añadido. El virus
se dejó adsorber durante 90 minutos sobre una plataforma
oscilatoria a 37ºC. Al final del período de incubación, las
diluciones virales se extrajeron y se sustituyeron por 1 ml de
medio de cultivo. Las placas se incubaron a continuación durante 5
días a 37ºC, en CO_{2} al 5%. Se cuantificó la citotoxicidad
usando un ensayo colorimétrico con MTT (bromuro de
2-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio)
(Cell Titer 96, n.º catálogo G4000, Promega
Corporation, Madison WI 53711) con detección a 570 nm, que
detecta actividad de enzimas mitocondriales (Mosman, T., 1983,
J. Immunol. Methods 65:55). La viabilidad de los pocillos
tratados con virus se expresó en forma de un porcentaje de la
actividad encontrada en los pocillos de control no tratados. Los
datos se representaron gráficamente en forma de PFU/pocillo frente
a la viabilidad expresada como un porcentaje del control. La IC50
se calculó como la cantidad de virus expresada en PFU/pocillo que
produce una reducción del 50% en la cantidad de células viables.
Estos resultados (Tabla 22) muestran que
PPCONN70726 manifiesta efectuar una destrucción selectiva de tumor,
de al menos tres tipos diferentes de células tumorales humanas (KB,
U87MG y U373MG) en relación con la que demuestra frente a
fibroblastos de la piel normales. Los valores de IC50 con respecto a
las dos líneas de células tumorales son entre 80 y 5.000 veces más
bajos que los correspondientes para las células normales.
En este experimento, los ratones atímicos
(hembras, NCR nu/nu, de 5 a 6 semanas de edad) recibieron una
inyección subcutánea de 10^{7} células tumorales HT1080. Cuatro
días más tarde, cuando los tumores alcanzaron un intervalo de
tamaños de 6 mm a 8,5 mm, los ratones recibieron un tratamiento
intraperitoneal con disolución salina, con PPMK107 (a 1 x 10^{8}
PFU), PPNJROAKIN (a 1 x 10^{8} PFU) o PPCONN70726 (a 1 x 10^{8}
PFU). Como se muestra en la Tabla 23, se percibió una regresión de
los tumores en los ratones tratados con estos tres virus (PPMK107,
PPNJROAKIN y PPCONN70726). Después de tratar a 12 ratones con
PPMK107, cuatro ratones experimentaron la regresión completa del
tumor y seis ratones experimentaron una regresión parcial. Después
de tratar a 12 ratones con PPNJROAKIN, un ratón experimentó la
regresión completa del tumor y dos ratones experimentaron una
regresión parcial. Después de tratar a 12 ratones con PPCONN70726,
tres ratones experimentaron la regresión completa del tumor y dos
ratones experimentaron una regresión parcial. No se percibió ninguna
regresión de los tumores en ninguno de los animales tratados con
disolución salina. Estos resultados muestran que las tres cepas
mesogénicas de NDV son capaces de producir la regresión de los
tumores.
A 56 ratones atímicos (nu/nu) y a 56 ratones
heterozigotos (nu/+) inmunocompetentes se les administraron
inyecciones intracerebrales estereotácticas de disolución salina,
PPMK107, PPNJROAKIN o PPCONN70726. Ocho ratones adicionales de cada
uno de los tipos se usaron como controles no tratados. Los virus se
usaron a uno de estos dos niveles de dosis (2 x 10^{4} PFU/ratón
o 3,5 x 10^{6} PFU/ratón). Como se muestra en la Tabla 24, todos
los ratones heterozigotos nu/+ tratados con cada uno de los tres
virus, a esos dos niveles de dosis, sobrevivieron hasta el día 39 a
excepción de uno de los ratones tratado con el nivel más bajo de
dosis de PPCONN70726, que fue sacrificado con eutanasia por
presentar síntomas no neurológicos. Los animales atímicos nu/nu
tratados con PPMK107 o con PPCONN70726 presentaron una
supervivencia significativamente menor que los heterozigotos. Esto
se cumplió especialmente en el caso de la dosis más alta de 3,5 x
10^{6} PFU/ratón, de los virus PPMK107 o PPCONN70726, en el que
solamente el 13% (1 de cada 8) de los animales atímicos de cada uno
de los grupos de virus sobrevivió hasta el día 39. Por contraste,
se produjo una supervivencia del 75% de los ratones atímicos
tratados con PPNJROAKIN a este mismo nivel de dosis (3,5 x 10^{6}
(PFU/ratón). Estos datos indican que PPNJROAKIN se tolera mejor en
los cerebros de los ratones atímicos que las otras dos cepas de
virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Células tumorales y células normales humanas se
hicieron crecer hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente
el 80% en placas de 24 pocillos para cultivo de tejidos. El medio de
crecimiento se extrajo y se añadió el PPSINDBIS
Ar-339, en diluciones de razón 10 veces que variaban
desde 10^{7} unidades formadoras de placa (PFU)/pocillo hasta 1
PFU/pocillo. En cada placa se incluyeron pocillos de control sin
virus añadido. El virus se dejó adsorber durante 90 minutos sobre
una plataforma oscilatoria a 37ºC. Al final del período de
incubación, las diluciones virales se extrajeron y se sustituyeron
por 1 ml de medio de cultivo. Las placas se incubaron a
continuación durante 5 días a 37ºC, en CO_{2} al 5%. Se cuantificó
la citotoxicidad usando un ensayo colorimétrico con MTT (bromuro de
2-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio)
(Cell Titer 96, n.º catálogo G4000, Promega
Corporation, Madison WI 53711) con detección a 570 nm, que
detecta actividad de enzimas mitocondriales (Mosman, T., 1983,
J. Immunol. Methods 65:55). La viabilidad de los pocillos
tratados con virus se expresó en forma de un porcentaje de la
actividad encontrada en los pocillos de control no tratados. Los
datos se representaron gráficamente en forma de PFU/pocillo frente
a la viabilidad expresada como un porcentaje del control. La IC50
se calculó como la cantidad de virus expresada en PFU/pocillo que
produce una reducción del 50% en la cantidad de células
viables.
viables.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El receptor celular para el virus Sindbis en
células de mamífero es el receptor de alta afinidad para laminina,
que se expresa principalmente en células del linaje epitelial, pero
que frecuentemente es sobreexpresado en muchas células de cánceres
metastásicos, como la línea Panc-1 de carcinoma
pancreático y la línea celular SW620 de adenocarcinoma de colon
(Campo y col., 1992, Am. J. Pathol.
141:1073-1083; Yow y col., (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci., 85, 6394-6398). Por el contrario, la
línea celular SW1423 de adenocarcinoma de recto se sabe que expresa
niveles muy bajos del mRNA del receptor de alta afinidad para
laminina (Yow y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., 85,
6394-6398) y es en más de 4 órdenes de magnitud más
resistente a ser destruida por el PPSINDBIS-Ar339
que las células SW620. Estos resultados (Tabla 25) demuestran que
las células que son tumorigénicas y que expresan niveles altos del
receptor de alta afinidad para laminina son más sensibles a ser
destruidas por el Clon PPSINDBIS-Ar339 del virus
Sindbis que otras células tumorales o normales.
\newpage
En placas de 96 pocillos se sembraron células KB
y células HT1080 tumorigénicas (3 x 10^{3} células por pocillo) y
células WISH no tumorigénicas (2,5 x 10^{4} células/pocillo) en
presencia de interferón-\alpha diluido de manera
seriada en el intervalo desde 2.800 Unidades/ml hasta 22 Unidades/ml
y se dejaron incubar 24 horas a 37ºC. Las células se infectaron
luego con el virus de la estomatitis vesicular (VSV, del inglés,
" Vesicular Stomatitis Virus", cepa
Indiana) a una m.o.i. de 10. Se incluyeron controles de células sin
interferón y de células sin interferón ni virus. Las células se
incubaron a 37ºC durante 24 horas. La citotoxicidad se cuantificó
usando un ensayo colorimétrico con MTT (bromuro de
2-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio)
(Cell Titer 96, n.º catálogo G4000, Promega
Corporation, Madison WI 53711) con detección a 570 nm, que
detecta actividad de enzimas mitocondriales (Mosman, T., 1983, J.
Immunol. Methods 65:55). La viabilidad de los pocillos tratados
con el virus se expresó en forma de un porcentaje de la actividad
encontrada en los pocillos de control que no habían recibido
virus.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados (Tabla 26) demuestran que VSV
es capaz de destruir de manera selectiva a células tumorales
deficientes en su capacidad de respuesta al interferón (véase el
Ejemplo 27). Las células (células humanas de amnios) son una línea
celular establecida, de uso en los bioensayos de interferón por su
capacidad para responder eficientemente a interferones.
\vskip1.000000\baselineskip
Líneas celulares individuales se hicieron crecer
hasta casi alcanzar la confluencia en placas de microtitulación de
96 pocillos y se trataron con IFN\alphaA entre 5 U/ml y 5.000 U/ml
durante 24 horas. Los cultivos se infectaron luego con PPMK107 a
una m.o.i. de 1,0 y se cultivaron durante 24 horas adicionales.
Después de una fijación química, la cantidad de expresión del virus
se cuantificó mediante inmunohistoquímica usando un colorante
indicador soluble. La cantidad de crecimiento del virus se
representa en forma de porcentaje de antígeno P expresado en
relación con las células de control no tratadas con interferón
(Figura 5). En este ensayo, las células que responden a interferón
manifiestan al menos una disminución del 50% en el antígeno viral
en respuesta a interferón. En la Figura 5 las células que son
sensibles a PPMK107 están indicadas por las líneas continuas; las
células menos sensibles están indicadas por las líneas
discontinuas.
Los resultados de este experimento muestran una
fuerte correlación entre la resistencia de la línea celular a los
efectos antivirales del interferón exógeno y la sensibilidad
relativa de la célula a ser destruida por PPMK107 (indicada por el
valor de IC50 mostrado entre paréntesis al lado del nombre de la
línea celular en la leyenda de la gráfica, véase la Figura 5). Por
ejemplo, después de un pretratamiento con una cantidad de
interferón de 5 U/ml, 6 de 7 (el 86%) de las líneas celulares que no
responden a interferón, son sensibles a la destrucción por acción
de PPMK107; cuando fueron pretratadas con una dosis de 500 U/ml de
interferón, todas las líneas celulares (4 de 4) que no responden a
interferón, son sensibles a la destrucción por acción de PPMK107.
Los anteriores datos también representan un ejemplo de un ensayo de
escrutinio para identificar células candidatas que es probable que
sean sensibles a la destrucción por acción de PPMK107 o de otros
virus sensibles a interferón. Por ejemplo, las células infectadas
que expresan antígeno viral en cantidad importante (p. ej., más que
el 50% de los controles) después del pretratamiento con interferón
exógeno, se considerarían deficientes en relación con interferón y
por lo tanto sensibles a una oncólisis viral.
Lo expuesto en lo que antecede tiene la
intencionalidad de ser ilustrativo de la presente invención, pero
no limitativo. Se pueden efectuar numerosas variaciones y
modificaciones sin que se aparten del auténtico alcance de la
invención.
Claims (42)
1. Uso de un virus clonal con RNA, competente
en replicación y sensible a interferón, para la fabricación de un
medicamento para tratar un neoplasma en un mamífero.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho virus con RNA se replica al menos 100 veces menos en presencia
de interferón que en ausencia de interferón.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho medicamento es una formulación sistémica.
4. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho neoplasma es un cáncer.
5. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho mamífero es un ser humano.
6. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho virus clonal se purifica en placa de lisis.
7. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho virus clonal es de origen clonal recombinante.
8. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho virus con RNA es un Paramyxovirus.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que
dicho Paramyxovirus se purifica hasta un nivel de al menos 2
x 10^{9} PFU por mg de proteína; preferiblemente hasta un nivel de
al menos 1 x 10^{10} PFU por mg de proteína; más preferiblemente
hasta un nivel de al menos 6 x 10^{10} PFU por mg de proteína.
10. Uso según la reivindicación 8, en el que
dicho Paramyxovirus se purifica hasta un nivel en el que la
proporción de partículas por PFU es no mayor que 5; preferiblemente
hasta un nivel en el que la proporción de partículas por PFU es no
mayor que 3; más preferiblemente hasta un nivel en el que la
proporción de partículas por PFU es no mayor que 1,2.
11. Uso según la reivindicación 8, en el que
dicho Paramyxovirus se selecciona entre el grupo que consiste
en un Paramyxovirus aviar de tipo 2, NDV, virus de la
parotiditis y virus paragripal humano.
12. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho neoplasma es un cáncer seleccionado entre el grupo que
consiste en cáncer de pulmón, colón, próstata, mama y cerebro.
13. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho neoplasma es un tumor sólido.
14. Uso según la reivindicación 12, en el que
dicho cáncer de cerebro es un glioblastoma.
15. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho virus contiene un gen que codifica interferón para permitir la
expresión viral de interferón, o un gen que codifica una enzima que
activa un profármaco.
16. Uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento es adecuado para administrar en combinación con IFN, el
cual se administra antes, durante o después de la administración de
dicho medicamento.
17. Uso según la reivindicación 16, en el que
dicho interferón se selecciona entre el grupo que consiste en
\alpha-IFN, \beta-IFN,
\omega-IFN, \gamma-IFN y formas
consenso sintéticas de IFN.
18. Uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento es adecuado para administrar en combinación con un
inhibidor de tirosina-quinasa, el cual se administra
antes, durante o después de la administración de dicho
medicamento.
19. Uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento es adecuado para administrar en combinación con un
compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en un análogo
nucleosídico de purina, un inhibidor de
tirosina-quinasa, cimetidina y un inhibidor
mitocondrial.
20. Uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento es adecuado para administrar en combinación con un
agente quimioterapéutico que se administra antes, durante o después
de la administración de dicho medicamento.
21. Uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento es adecuado para administrar en combinación con una
citoquina o un inmunosupresor que se administra antes, durante o
después de la administración de dicho virus.
22. Uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento es adecuado para administrar en combinación con una
cantidad que controla la replicación viral, de un compuesto
seleccionado entre el grupo que consiste en IFN, ribavirina,
aciclovir y ganciclovir.
23. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho medicamento es una formulación intravenosa o intratumoral.
24. Uso de un virus clonal, sensible a
interferón, seleccionado entre el grupo que consiste en (1) virus
con RNA; (2) Hepadenavirus; (3) Parvovirus; (4)
Papovavirus; (5) Poxivirus; y (6) Iridovirus,
en la fabricación de un medicamento para tratar un neoplasma de al
menos 1 cm de tamaño, en un mamífero.
25. Uso según la reivindicación 24, en el que
dicho neoplasma tiene al menos 300 mm^{3} de volumen.
26. Uso según la reivindicación 24, en el que
dicho virus con RNA en un Paramyxovirus, preferiblemente
NDV.
27. Uso según la reivindicación 24, en el que
dicho mamífero es un ser humano.
28. Uso según la reivindicación 24, en el que
dicho medicamento es una formulación intravenosa o intratumoral.
29. Uso según la reivindicación 24, en el que
dicho Paramyxovirus se purifica hasta un nivel de al menos 2
x 10^{9} PFU por mg de proteína.
30. Uso según la reivindicación 26, en el que
dicho NDV es mesogénico.
31. Uso según la reivindicación 24, en el que
dicho neoplasma es canceroso.
32. Uso de una cantidad terapéuticamente
efectiva de un virus clonal con RNA, sensible a interferón, en la
fabricación de un medicamento para tratar un tumor en un mamífero,
en el que dicho virus es citocida para dicho tumor y en el que dicho
mamífero posee una carga tumoral que comprende al menos el 1,5% del
peso corporal total de dicho mamífero.
33. Uso según la reivindicación 32, en el que
dicho tumor no responde a quimioterapia.
34. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho virus se selecciona entre el grupo que consiste en la cepa
MK107 del virus de la enfermedad de Newcastle, la cepa NJ Roakin del
virus de la enfermedad de Newcastle, el virus Sindbis y el virus de
la estomatitis vesicular.
35. Uso de un virus clonal, sensible a
interferón, seleccionado entre el grupo que consiste en la cepa
MK107 del virus de la enfermedad de Newcastle, la cepa NJ Roakin del
virus de la enfermedad de Newcastle, el virus Sindbis y el virus de
la estomatitis vesicular, para la fabricación de un medicamento para
tratar un neoplasma en un mamífero.
36. Uso según la reivindicación 1, en el que el
tratamiento comprende administrar dicho medicamento en más de una
única dosis.
37. Uso según la reivindicación 36, en el que
la primera dosis es una dosis desensibilizante.
38. Uso según la reivindicación 37, en el que
dicha primera dosis se administra por vía intravenosa y una dosis
posterior se administra por vía intravenosa.
39. Uso según la reivindicación 37, en el que
dicha primera dosis se administra por vía intravenosa y una dosis
posterior se administra por vía intraperitoneal.
40. Uso según la reivindicación 37, en el que
dicha primera dosis se administra por vía intravenosa y una dosis
posterior se administra por vía intra-arterial.
41. Uso de un virus clonal competente en
replicación y sensible a interferón, que se une a un receptor
presente en un mamífero, para la fabricación de un medicamento para
tratar un neoplasma en un mamífero, en el que el tratamiento
comprende además someter una muestra procedente de dicho mamífero a
un inmunoensayo para detectar la presencia del receptor del
virus.
42. Uso según la reivindicación 1, en el que el
tratamiento comprende la administración del medicamento durante el
transcurso de al menos 4 minutos.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US94824497A | 1997-10-09 | 1997-10-09 | |
| US948244 | 1997-10-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2292207T3 true ES2292207T3 (es) | 2008-03-01 |
Family
ID=25487533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98949797T Expired - Lifetime ES2292207T3 (es) | 1997-10-09 | 1998-10-09 | Tratamiento de neoplasmas con virus clonales, sensibles al interferon. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1032269B1 (es) |
| JP (3) | JP2001519175A (es) |
| CN (2) | CN101618049A (es) |
| AT (1) | ATE371372T1 (es) |
| AU (1) | AU9603898A (es) |
| CA (1) | CA2305269C (es) |
| DE (1) | DE69838340T2 (es) |
| ES (1) | ES2292207T3 (es) |
| HU (1) | HUP0003911A3 (es) |
| IL (1) | IL135507A0 (es) |
| NZ (4) | NZ553508A (es) |
| WO (1) | WO1999018799A1 (es) |
Families Citing this family (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6136307A (en) | 1997-08-13 | 2000-10-24 | Oncolytics Biotech Inc. | Reovirus for the treatment of cellular proliferative disorders |
| US6110461A (en) | 1997-08-13 | 2000-08-29 | Oncolytics Biotech Inc. | Reovirus for the treatment of neoplasia |
| US6565831B1 (en) | 1999-02-24 | 2003-05-20 | Oncolytics Biotech Inc. | Methods for preventing reovirus recognition for the treatment of cellular proliferative disorders |
| US20030044384A1 (en) | 1997-10-09 | 2003-03-06 | Pro-Virus, Inc. | Treatment of neoplasms with viruses |
| US7470426B1 (en) | 1997-10-09 | 2008-12-30 | Wellstat Biologics Corporation | Treatment of neoplasms with viruses |
| US7780962B2 (en) | 1997-10-09 | 2010-08-24 | Wellstat Biologics Corporation | Treatment of neoplasms with RNA viruses |
| AU9603898A (en) * | 1997-10-09 | 1999-05-03 | Pro-Virus, Inc. | Treatment of neoplasms with viruses |
| CA2370187C (en) * | 1999-04-15 | 2011-08-02 | Pro-Virus, Inc. | Treatment of neoplasms with viruses |
| CA2375189C (en) * | 1999-05-28 | 2010-02-09 | The Government Of The United States Of America | A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector |
| ES2320239T3 (es) * | 1999-09-17 | 2009-05-20 | Wellstat Biologics Corporation | Virus oncolitico. |
| US8147822B1 (en) | 1999-09-17 | 2012-04-03 | Wellstat Biologics Corporation | Oncolytic virus |
| DE19951795A1 (de) * | 1999-10-27 | 2001-05-10 | Knebel Doeberitz Magnus Von | Verwendung von Parvoviren zur Verbesserung des Allgemeinzustandes bei Tumorpatienten oder Patienten mit chronischen oder konsumierenden Erkrankungen |
| CA2388807C (en) | 1999-11-12 | 2013-08-06 | Matthew C. Coffey | Viruses for the treatment of cellular proliferative disorders |
| AUPQ425699A0 (en) * | 1999-11-25 | 1999-12-23 | University Of Newcastle Research Associates Limited, The | A method of treating a malignancy in a subject and a pharmaceutical composition for use in same |
| US8491884B2 (en) | 2000-05-03 | 2013-07-23 | Oncolytics Biotech Inc. | Virus clearance of neoplastic cells from mixed cellular compositions |
| AR028039A1 (es) | 2000-05-03 | 2003-04-23 | Oncolytics Biotech Inc | Remocion de reovirus de celulas neoplasticas intermediadas por ras a partir de composiciones celulares mixtas |
| US7306902B2 (en) * | 2002-06-28 | 2007-12-11 | Oncolyties Biotech Inc. | Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms |
| DE60110593T2 (de) | 2000-06-26 | 2006-01-19 | Wellstat Biologics Corp. | Entfernung von zellen mit viren |
| AR035227A1 (es) | 2001-02-20 | 2004-05-05 | Oncolytics Biotech Inc | Uso de un agente quimioterapeutico para la manufactura de un medicamento para la sensibilizacion de celulas neoplasicas resistentes a agentes quimioterapeuticos con reovirus |
| WO2002076468A1 (en) * | 2001-03-27 | 2002-10-03 | New York University | Tumor therapy with alphavirus-based and high affinity laminin receptor-targeted vectors |
| CN1332712C (zh) | 2001-05-11 | 2007-08-22 | 沃尔斯泰特生物制剂公司 | 肿瘤消解病毒疗法 |
| US20140088177A1 (en) * | 2001-07-11 | 2014-03-27 | University Of Miami | Recombinant vsv for the treatment of tumor cells |
| CA2374388C (en) | 2002-02-28 | 2005-07-12 | Matthew C. Coffey | The use of ribozymes in the detection of adventitious agents |
| US20040005546A1 (en) | 2002-02-28 | 2004-01-08 | Oncolytics Biotech Inc. | Use of ribozymes in the detection of adventitious agents |
| SI1505992T1 (sl) * | 2002-05-09 | 2009-02-28 | Oncolytics Biotech Inc | Postopek za zmanjšanje bolečine z uporabo onkolitičnih virusov |
| EP1944035A1 (en) * | 2002-05-09 | 2008-07-16 | Oncolytics Biotech Inc. | Method for reducing pain using oncolytic viruses |
| KR101083450B1 (ko) | 2002-05-27 | 2011-11-16 | 페르 손네 홀름 | 아데노바이러스 및 그를 코딩하는 핵산의 신규 용도 |
| NZ537255A (en) * | 2002-06-21 | 2009-04-30 | Wellstat Biologics Corp | Administration of therapeutic viruses |
| KR20130012595A (ko) | 2002-08-12 | 2013-02-04 | 제네렉스, 인코포레이티드 | 폭스바이러스 및 암과 관련된 방법 및 조성물 |
| AU2002953436A0 (en) | 2002-12-18 | 2003-01-09 | The University Of Newcastle Research Associates Limited | A method of treating a malignancy in a subject via direct picornaviral-mediated oncolysis |
| CA2517147C (en) | 2003-03-07 | 2011-06-14 | Robarts Research Institute | Use of myxoma virus for the therapeutic treatment of cancer and chronic viral infection |
| US7731974B2 (en) | 2003-03-27 | 2010-06-08 | Ottawa Hospital Research Institute | Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof |
| AU2004289953B2 (en) | 2003-06-18 | 2008-09-25 | Genelux Corporation | Modified recombinant vaccina viruses and other microorganisms, uses thereof |
| AU2004249802B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-06-28 | Microbix Biosystems Inc. | Improvements in virus production |
| CA2575591A1 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Yuji Shino | A pharmaceutical composition for treatment of cancers |
| WO2005051430A1 (de) | 2003-11-14 | 2005-06-09 | Per Sonne Holm | Neue verwendung von adenoviren und dafür codierenden nukleinsäuren |
| WO2005111200A1 (en) * | 2004-05-17 | 2005-11-24 | Universite De Montreal | Novel strains of reoviruses and methods of uses thereof |
| FI20040704A0 (fi) * | 2004-05-21 | 2004-05-21 | Ari Hinkkanen | Replikatiivisen viruksen tai sen rekombinantin käyttö terapiassa |
| NZ577283A (en) | 2005-03-07 | 2010-11-26 | Robarts Res Inst | Use of a Myxoma virus that does not express functional M135R |
| US7303898B2 (en) | 2005-03-29 | 2007-12-04 | New York University | Defective sindbis viral vectors |
| US10668119B2 (en) | 2005-08-01 | 2020-06-02 | Virocure, Inc. | Attenuated reovirus |
| US10260049B2 (en) | 2005-08-01 | 2019-04-16 | Virocure, Inc. | Attenuated reovirus |
| EP1933857A2 (en) | 2005-09-07 | 2008-06-25 | Jennerex Biotherapeutics ULC | Systemic treatment of metastatic and/or systemically-disseminated cancers using gm-csf-expressing poxviruses |
| US8980246B2 (en) | 2005-09-07 | 2015-03-17 | Sillajen Biotherapeutics, Inc. | Oncolytic vaccinia virus cancer therapy |
| TWI531652B (zh) | 2005-12-02 | 2016-05-01 | 美國紐約大學西奈山醫學院 | 表現非原生表面蛋白質之嵌合病毒及其用途 |
| KR101385927B1 (ko) * | 2006-04-20 | 2014-04-24 | 와이어쓰 엘엘씨 | 정제된 소포성 구내염 바이러스를 세포 배양물로부터 단리하기 위한 정제 방법 |
| NZ572893A (en) | 2006-06-01 | 2011-06-30 | Robarts Res Inst | Myxoma virus mutants for cancer treatment |
| EP2064229B1 (en) * | 2006-09-15 | 2015-08-12 | Ottawa Hospital Research Institute | Oncolytic rhabdovirus |
| US20090098529A1 (en) | 2006-10-16 | 2009-04-16 | Nanhai Chen | Methods for attenuating virus strains for diagnostic and therapeutic uses |
| US10369171B2 (en) | 2007-03-13 | 2019-08-06 | Virocure, Inc. | Attenuated reoviruses for selection of cell populations |
| WO2009011924A1 (en) * | 2007-07-18 | 2009-01-22 | Genelux Corporation | Use of a chemotherapeutic agent in the preparation of a medicament for treating or ameliorating an adverse side effect associated with oncolytic viral therapy |
| MX2010003556A (es) * | 2007-10-22 | 2010-04-21 | Oncolytics Biotech Inc | Regimen de tratamiento para trastornos proliferantes. |
| JP5748656B2 (ja) * | 2008-05-22 | 2015-07-15 | ジェ イル ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | 過剰増殖細胞の腫瘍抑制因子に基づいた腫瘍崩壊ウイルスに対する感受性を判定する方法 |
| TW200950777A (en) * | 2008-05-27 | 2009-12-16 | Oncolytics Biotech Inc | Abrogating proinflammatory cytokine production during oncolytic reovirus therapy |
| US8691212B2 (en) * | 2008-09-16 | 2014-04-08 | Genomldea Inc. | Therapeutic/prophylactic agent for prostate cancer |
| ES2550179T3 (es) | 2009-02-05 | 2015-11-05 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Virus quiméricos de la enfermedad de Newcastle y usos de los mismos |
| EP2477499B1 (en) | 2009-09-14 | 2018-04-11 | SillaJen Biotherapeutics, Inc. | Oncolytic vaccinia virus combination cancer therapy |
| DK2327764T3 (da) * | 2009-11-30 | 2012-04-02 | United Cancer Res Inst | Ny klon af Newcastle disease-virus, dens fremstilling og dens anvendelse ved medicinsk behandling af cancer |
| KR101942237B1 (ko) | 2011-01-04 | 2019-01-25 | 신라젠(주) | 종양 항원에 대한 항체의 생산 및 종양용해 우두 바이러스의 투여에 의한 종양 특이적 보체 의존적 세포독성의 생산 |
| ES2733211T3 (es) | 2011-04-15 | 2019-11-28 | Genelux Corp | Cepas clonales de virus vaccinia atenuados y métodos de uso de las mismas |
| US20140328798A1 (en) * | 2011-11-17 | 2014-11-06 | Deutsches Krebsforschung-Szentrum | Co-Administration of a Parvovirus and a Cytokine for Therapy of Pancreatic Cancer |
| US20130129678A1 (en) * | 2011-11-17 | 2013-05-23 | Zahari Raykov | Co-administration of a parvovirus and a cytokine for therapy of pancreatic cancer |
| NZ711946A (en) | 2013-03-14 | 2020-05-29 | Icahn School Med Mount Sinai | Newcastle disease viruses and uses thereof |
| BR112015030881A2 (pt) * | 2013-06-14 | 2017-10-24 | Psioxus Theraupeutics Ltd | regime de dosagem e formulações para adenovírus de tipo b |
| EP3831398A1 (en) | 2013-10-25 | 2021-06-09 | PsiOxus Therapeutics Limited | Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes |
| US10238700B2 (en) | 2014-01-02 | 2019-03-26 | Genelux Corporation | Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity |
| CA2940570A1 (en) | 2014-02-27 | 2015-09-03 | Viralytics Limited | Combination method for treatment of cancer |
| AU2016369485B2 (en) | 2015-12-17 | 2024-02-01 | Akamis Bio Limited | Group B adenovirus encoding an anti-TCR-complex antibody or fragment |
| CA3033267A1 (en) | 2016-08-29 | 2018-03-08 | Psioxus Therapeutics Limited | Adenovirus armed with bispecific t cell engager (bite) |
| GB201713765D0 (en) | 2017-08-28 | 2017-10-11 | Psioxus Therapeutics Ltd | Modified adenovirus |
| JOP20190256A1 (ar) | 2017-05-12 | 2019-10-28 | Icahn School Med Mount Sinai | فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها |
| GB201801614D0 (en) | 2018-01-31 | 2018-03-14 | Psioxus Therapeutics Ltd | Formulation |
| WO2020037215A1 (en) | 2018-08-17 | 2020-02-20 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Recombinant newcastle disease viruses and uses thereof for the prevention of rsv disease or human metapneumovirus disease |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5833975A (en) * | 1989-03-08 | 1998-11-10 | Virogenetics Corporation | Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence |
| CN1054192A (zh) * | 1990-02-26 | 1991-09-04 | 张炳团 | 人体内诱导干扰素的制造方法 |
| CA2051289C (en) * | 1990-09-14 | 2002-11-26 | Robert L. Martuza | Viral mediated destruction of neoplastic cells |
| US5602023A (en) * | 1992-03-24 | 1997-02-11 | Csatary; Laszlo K. | Pharmaceutical product containing live, stabilized virus for the therapy of viral and malignant diseases and process for preparing the same |
| DZ1706A1 (fr) * | 1992-08-07 | 2002-02-17 | Merck & Co Inc | Vaccin contre le virus de l'hepatite a. |
| FR2699082B1 (fr) * | 1993-02-22 | 1995-05-05 | Pasteur Institut | Composition pour le traitement de tumeurs et l'immunisation d'organismes à l'encontre de tumeurs. |
| EP1486211B1 (en) * | 1993-04-30 | 2008-10-22 | Wellstat Biologics Corporation | Compositions for treating cancer using viruses |
| US5585096A (en) | 1994-06-23 | 1996-12-17 | Georgetown University | Replication-competent herpes simplex virus mediates destruction of neoplastic cells |
| DE69635513T2 (de) * | 1995-02-10 | 2006-08-17 | The Regents Of The University Of California, Oakland | Menschliche Pancreas Zelllinien: Entwicklungen und Anwendungen |
| PT811073E (pt) * | 1995-02-24 | 2007-03-30 | Univ Pennsylvania | Utilização de moduladores imunitários para preparar medicamentos que inibem as respostas imunitárias contra vírus recombinantes co-administrados |
| AU9603898A (en) * | 1997-10-09 | 1999-05-03 | Pro-Virus, Inc. | Treatment of neoplasms with viruses |
-
1998
- 1998-10-09 AU AU96038/98A patent/AU9603898A/en not_active Abandoned
- 1998-10-09 ES ES98949797T patent/ES2292207T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-09 WO PCT/US1998/021230 patent/WO1999018799A1/en not_active Ceased
- 1998-10-09 NZ NZ553508A patent/NZ553508A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-10-09 EP EP98949797A patent/EP1032269B1/en not_active Revoked
- 1998-10-09 DE DE69838340T patent/DE69838340T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-09 CA CA2305269A patent/CA2305269C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-09 NZ NZ518945A patent/NZ518945A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-10-09 IL IL13550798A patent/IL135507A0/xx unknown
- 1998-10-09 CN CN200910147515A patent/CN101618049A/zh active Pending
- 1998-10-09 JP JP2000515443A patent/JP2001519175A/ja not_active Withdrawn
- 1998-10-09 NZ NZ550147A patent/NZ550147A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-10-09 AT AT98949797T patent/ATE371372T1/de active
- 1998-10-09 NZ NZ503664A patent/NZ503664A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-10-09 HU HU0003911A patent/HUP0003911A3/hu not_active Application Discontinuation
- 1998-10-09 CN CN98812019A patent/CN1281336A/zh active Pending
- 1998-10-09 EP EP07016086A patent/EP1905304A3/en not_active Withdrawn
-
2009
- 2009-04-09 JP JP2009095352A patent/JP2009161558A/ja active Pending
-
2013
- 2013-07-16 JP JP2013147584A patent/JP2013213058A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HK1028935A1 (en) | 2001-03-16 |
| EP1905304A2 (en) | 2008-04-02 |
| EP1032269A1 (en) | 2000-09-06 |
| AU9603898A (en) | 1999-05-03 |
| EP1032269B1 (en) | 2007-08-29 |
| IL135507A0 (en) | 2001-05-20 |
| CN101618049A (zh) | 2010-01-06 |
| HUP0003911A2 (hu) | 2001-02-28 |
| JP2009161558A (ja) | 2009-07-23 |
| DE69838340D1 (de) | 2007-10-11 |
| CN1281336A (zh) | 2001-01-24 |
| WO1999018799A1 (en) | 1999-04-22 |
| JP2013213058A (ja) | 2013-10-17 |
| CA2305269C (en) | 2012-07-03 |
| CA2305269A1 (en) | 1999-04-22 |
| EP1905304A3 (en) | 2008-08-13 |
| NZ553508A (en) | 2008-11-28 |
| HUP0003911A3 (en) | 2007-11-28 |
| JP2001519175A (ja) | 2001-10-23 |
| NZ503664A (en) | 2002-08-28 |
| DE69838340T2 (de) | 2008-05-21 |
| ATE371372T1 (de) | 2007-09-15 |
| EP1032269A4 (en) | 2001-09-19 |
| NZ518945A (en) | 2007-03-30 |
| NZ550147A (en) | 2008-09-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2292207T3 (es) | Tratamiento de neoplasmas con virus clonales, sensibles al interferon. | |
| US8105578B2 (en) | Treatment of neoplasms with viruses | |
| US8043612B2 (en) | Infection and treatment of neoplasms with vesicular stomatitis virus | |
| US7780962B2 (en) | Treatment of neoplasms with RNA viruses | |
| PT1486211E (pt) | Composições para tratamento do cancro utilizando vírus | |
| JP2001519175A5 (es) | ||
| US20140030229A1 (en) | New clone of newcastle disease virus, its manufacture and its application in the medical treatment of cancer | |
| US7470426B1 (en) | Treatment of neoplasms with viruses | |
| AU2005237176B2 (en) | Treatment of neoplasms with viruses | |
| AU2005201079B2 (en) | Treatment of neoplasms with viruses | |
| AU2002325406B2 (en) | Treatment of Neoplasms with Viruses | |
| MXPA00003467A (es) | Tratamiento de neoplasmas con virus | |
| Wirth et al. | Immunological elimination of infected cells as the candidate mechanism for tumor protection in polyomavirus-infected mice | |
| HK1112815A (en) | Treatment of neoplasms with viruses | |
| HK1028935B (en) | Treatment of neoplasms with interferon-sensitive, clonal viruses | |
| Horvath | Newcastle disease virus: its oncolytic properties | |
| HK1067983A (en) | Compositions for treating cancer using viruses |