ES2291750T3 - Uso de nicotinamida-n-metiltransferasa como marcador de cancer colorrectal. - Google Patents
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Abstract
Un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que consta de los pasos siguientes: a) proporcionar una muestra líquida, extraída de un individuo, b) poner en contacto dicha muestra con un agente de fijación específico de la NNMT en condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho agente de fijación y la NNMT y c) establecer la correlación existente entre la cantidad de complejo formado en b) y el diagnóstico del cáncer colorrectal.
Description
Uso de
nicotinamida-N-metiltransferasa como
marcador de cáncer colorrectal.
La presente invención se refiere al diagnóstico
del cáncer colorrectal. Describe el uso de la
nicotinamida-N-metiltransferasa (=
NNMT) para el diagnóstico del cáncer colorrectal. Además se refiere
en especial a un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal
a partir de una muestra líquida, derivada de un individuo, por
medición de la NNMT en dicha muestra. La medición de la NNMT puede
utilizarse p.ej. para la detección o el diagnóstico precoz del
cáncer colorrectal.
El cáncer continúa siendo un reto importante
para la salud pública a pesar de los progresos realizados en la
detección y la terapia. Entre los diversos tipos de cáncer, el
cáncer colorrectal (= CRC) es uno de los tipos más frecuentes en el
mundo occidental.
Cuanto antes se detecte o diagnostique el
cáncer, tanto mayor será la probabilidad de supervivencia total.
Esto es verdad en concreto para el CRC. El pronóstico en los
estadios avanzados del tumor es pobre. Más de un tercio de los
pacientes fallecerá por el avance de la enfermedad en un plazo de
cinco años después del diagnóstico, equivalentes a un grado de
supervivencia del 40% para los cinco años. El tratamiento actual
cura solamente a una fracción de los pacientes y es obvio que tiene
un efecto óptimo en aquellos pacientes que se han diagnosticado en
un estadio precoz de la enfermedad.
En lo que respecta al CRC como problema de la
salud pública, es esencial que se desarrollen más exploraciones
eficaces y se adopten más medidas preventivas para el cáncer
colorrectal.
Los procedimientos de detección precoz
actualmente disponibles para el cáncer colorrectal incluyen el uso
de ensayos para la sangre fecal o de procedimientos endoscópicos.
Sin embargo, antes de que se pueda detectar la sangre fecal, es
normal que el tumor haya alcanzado un tamaño significativo. La
sensibilidad de los ensayos de sangre oculta en las heces, basados
en el guayaco, es \approx del 26%, lo cual significa que el 74%
de los pacientes que sufren lesiones malignas queda sin detectar
(Ahlquist, D.A., Gastroenterol. Clin. North Am. 26,
41-55, 1997). La visualización de las lesiones
precancerosas y cancerosas constituye la mejor estrategia de la
detección precoz, pero la colonoscopia es invasiva y conlleva
costes, riesgos y complicaciones significativos (Silvis, S.E. y
col., JAMA 235, 928-930, 1976; Geenen, J.E. y
col., Am. J. Dig. Dis. 20, 231-235, 1975;
Anderson, W.F. y col., J. Natl. Cancer Institute 94,
1126-1133, 2002).
En los últimos años se ha publicado una cantidad
tremenda de genes llamados específicos del colon o incluso
específicos del cáncer colorrectal. La gran mayoría de los
correspondientes artículos de investigación o solicitudes de
patente se basan datos obtenidos por análisis de modelos de
expresión del RNA en tejido (canceroso) de colon por comparación
con otros tejidos diferentes y tejido normal adyacente,
respectivamente. Tales estrategias pueden resumirse como técnicas
diferenciales de visualización del mRNA.
Como ejemplo de datos disponibles de las
técnicas de visualización del mRNA cabe mencionar y debatir el
documento WO 01/96390. Esta solicitud describe y reivindica más de
doscientos polinucleótidos aislados y los polipéptidos
correspondientes como tales, así como su utilización para la
detección del CRC. Sin embargo, es conocido en general que las
diferencias del nivel del mRNA no se reflejan en el nivel de las
proteínas correspondientes. Una proteína codificada por un mRNA
raro puede encontrarse en grandes cantidades, mientras que una
proteína codificada por un mRNA abundante puede ser difícil de
detectar, si es que llega a encontrarse. Esta falta de correlación
entre el nivel de mRNA y el nivel de proteína se debe a razones
tales como la estabilidad del mRNA, la eficacia de la traducción,
la estabilidad de la proteína, etc.
Existen también estudios recientes que
investigan las diferencias en los modelos de proteínas entre los
diferentes tejidos o entre tejido sano y tejido enfermo con el fin
de identificar las moléculas de marcadores propuestas que puedan
utilizarse para el diagnóstico del CRC. , G. y col., Cancer Research
62, 2437-2442, 2002, han identificado siete
proteínas estructurales nucleares, que parecen ser más abundantes en
el tejido del CRC que en tejido normal adyacente. No se indican las
muestras líquidas extraídas de un individuo.
En WO 02/078636 se describen nueve manchas
asociadas con el cáncer colorrectal, encontradas desorción e
ionización láser de superficie ampliada (SELDI). Estas manchas son
más frecuentes en sueros obtenidos de pacientes con CRC que en
sueros obtenidos de individuos sanos de control. Sin embargo, la
identidad de la o de las moléculas contenidas en dicha mancha,
p.ej. su o sus secuencias, es desconocida.
A pesar de la lista abundante o incluso
creciente de marcadores proteicos propuestos en el ámbito del CRC,
actualmente no se conoce la utilidad clínica/diagnóstica de estas
moléculas. Para que tenga utilidad clínica, un nuevo marcador
diagnóstico en su condición de marcador único deberá tener por lo
menos la eficacia del mejor marcador individual ya conocido de la
técnica. O bien, un nuevo marcador debería conducir a un avance en
la sensibilidad y/o especificidad diagnóstica, tanto si se emplea
solo como en combinación con uno o más marcadores adicionales,
respectivamente. La sensibilidad y/o especificidad diagnóstica de un
ensayo se evalúa de la mejor forma posible por sus características
de funcionamiento del receptor, que se describen con detalle a
continuación.
Actualmente se dispone solamente de ensayos
diagnósticos de la sangre para detectar el antígeno
carcinoembriónico (CEA), una glucoproteína asociada al tumor, para
asistir al diagnóstico en el campo del CRC. El CEA experimenta un
aumento del 95% en muestras de tejido extraídas de pacientes de
cáncer colorrectal, gástrico o pancreático y de la mayor parte de
carcinomas de mama, de pulmón y de cabeza y cuello (Goldenberg, D.M.
y col., J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57,
11-22, 1976). Se ha publicado también que en
pacientes de enfermedades no malignas existen niveles elevados de
CEA, mientras que muchos pacientes de cáncer colorrectal tienen
niveles normales de CEA en suero, en especial durante el estadio
temprano de la enfermedad (Carriquiry, L.A. y Pineyro, A., Dis.
Colon Rectum 42, 921-929, 1999; Herrera, M.A.
y col., Ann. Surg. 183, 5-9, 1976; Wanebo,
H.J. y col., N. Engl. J. Med. 299, 448-451,
1978). Se ha publicado que utilidad, que tiene el CEA cuando se mide
a partir del suero o del plasma para detectar las recurrencias, es
controvertida y que todavía no se ha aplicado a gran escala
(Martell, R.E. y col., Int. J. Biol. Markers 13,
145-149, 1998; Moertel, C.G. y col., JAMA
270, 943-947, 1993).
A la luz de los datos disponibles, la
determinación del CEA en el suero no presenta sensibilidad ni
especificidad que permita su utilización como ensayo de exploración
del cáncer colorrectal en una población asintomática (Reynoso, G. y
col., JAMA 220, 361-365, 1972; Sturgeon, C.,
Clinical Chemistry 48, 1151-1159, 2002).
La sangre total, el suero o el plasma son las
fuentes más utilizadas para muestras en el trabajo clínico
rutinario. La identificación de un marcador de tumor CRC precoz que
permita una detección fiable del cáncer o proporcione una
información temprana conduciría a un ensayo diagnóstico que ayudaría
en gran manera al diagnóstico y a la gestión o control de esta
enfermedad. Por lo tanto, existe una demanda clínica urgente de
mejora del diagnóstico del CRC a partir de muestras de sangre. Es
especialmente importante mejorar el diagnóstico precoz del CRC, ya
que los pacientes diagnosticados precozmente tienen probabilidades
de supervivencia mucho mayores que las que tienen los enfermos
diagnosticados en un estadio avanzado de la enfermedad.
El cometido de la presente invención es
investigar si puede identificarse un nuevo marcador que pueda ayudar
en el diagnóstico del CRC.
De modo sorprendente se ha encontrado que el uso
de la proteína NNMT permite superar por lo menos parcialmente los
problemas ya conocidos del estado de la técnica.
La presente invención se refiere, pues, a un
método de diagnóstico del cáncer colorrectal, que consiste en los
pasos de a) proporcionar una muestra líquida, extraída de un
individuo, b) poner en contacto dicha muestra con un agente de
fijación específico de la NNMT en condiciones apropiadas para la
formación de un complejo entre dicho agente de fijación y la NNMT y
c) establecer la correlación existente entre la cantidad de complejo
formado en b) y el diagnóstico del cáncer colorrectal.
Por tanto, es preferido que el método consista
en la utilización de una muestra líquida extraída de un individuo
en el paso (a).
Otra forma preferida de ejecución de la
invención es un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal
que consiste en los pasos de a) poner en contacto una muestra
líquida extraída de un individuo con un agente de fijación
específico de la NNMT en condiciones apropiadas para la formación de
un complejo entre dicho agente de fijación y la NNMT y b)
establecer la correlación existente entre la cantidad de complejo
formado en a) y el diagnóstico del cáncer colorrectal.
La proteína
nicotinamida-N-metiltransferasa
(NNMT) (Swiss-PROT: P40261) se caracteriza por la
secuencia descrita en la SEQ ID NO: 1. La NNMT tiene un peso
molecular aparente de 29,6 kDa y un punto isoeléctrico de 5,56.
La NNMT cataliza la N-metilación
de la nicotinamida y de otras piridinas. Esta actividad es
importante para la biotransformación de muchos fármacos y
compuestos xenobióticos. Se ha publicado que esta proteína se
expresa de modo predominante en el hígado y se localiza en el
citoplasma. La NNMT se ha clonado a partir del cDNA de hígado
humano y contiene un marco de lectura abierto de 792 nucleótidos que
codifica a una proteína de 264 aminoácidos, que tiene una masa
molecular calculada de 29,6 kDa (Aksoy, S. y col., J. Biol. Chem.
269, 14835-14840, 1994). En la bibliografía
técnica apenas hay referencias sobre el rol potencial de esta enzima
en el cáncer humano. En un artículo se describe una mayor actividad
enzimática de la NNMT hepática como marcador de la caquexia
cancerosa en los ratones (Okamura, A. y col., Jpn. J. Cancer Res.
89, 649-656, 1998). En un estudio reciente
se ha demostrado la regulación decreciente del gen de la NNMT en
respuesta a la radiación en líneas celulares sensibles a la
radiación (Kassem, H. y col., Int. J. Cancer 101,
454-460, 2002).
Como es obvio para los expertos en la materia,
la presente invención no se ha pensado para limitarse a la proteína
NNMT de longitud completa de la SEQ ID NO: 1. También están
comprendidos dentro de la presente invención los fragmentos
fisiológicos o artificiales de la NNMT, las modificaciones
secundarias de la NNMT, así como las variantes alélicas de la NNMT.
Los fragmentos artificiales comprenden con preferencia un péptido
producido artificialmente o por técnicas recombinantes, que
contiene por lo menos un epítope de interés diagnóstico, que
contiene por lo menos 6 aminoácidos contiguos derivados de la
secuencia descrita en la SEQ ID NO: 1. Tal fragmento puede
utilizarse con ventaja para la generación de anticuerpos o como
patrón de un inmunoensayo. El fragmento artificial contiene con
mayor preferencia por lo menos dos epítopes de interés, apropiados
para efectuar un inmunoensayo de tipo sandwich.
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En las formas preferidas de ejecución, el nuevo
marcador NNMT puede utilizarse para fines de seguimiento y también
de exploración.
Cuando se emplea en pacientes, el seguimiento
del método diagnóstico de la presente invención puede ayudar a
evaluar la carga tumoral, la eficacia del tratamiento y la
recurrencia tumoral en el seguimiento de los pacientes. Los niveles
elevados de NNMT guardan una correlación directa con la carga
tumoral. Después de la quimioterapia, un incremento a corto plazo
(de pocas horas a 14 días) de la NNMT puede servir como indicador
de la muerte de las células tumorales. En el seguimiento de los
pacientes (de 3 meses a 10 años), un incremento de la NNMT puede
utilizarse como indicador de la recurrencia tumoral.
En una forma preferida de ejecución, el método
diagnóstico según la presente invención se emplea para fines
exploratorios, es decir, se emplea para evaluar el CRC en sujetos
sin diagnóstico previo, para ello se mide el nivel de la NNMT y se
establece la correlación entre el nivel medido y la presencia o la
ausencia del CRC.
El cáncer colorrectal progresa con mucha
frecuencia a partir de adenomas (pólipos), transformándose en
carcinomas. Los diferentes estadios de CRC se suelen clasificar con
arreglo a los estadios de A a D de Dukes.
La clasificación del cáncer en estadios consiste
en puntuar una enfermedad en términos de extensión, progresión y
severidad. Agrupa a los pacientes de modo que se pueden hacer
generalizaciones acerca del pronóstico y la elección de la
terapia.
Actualmente, el sistema TNM es el más empleado
para la clasificación de la extensión anatómica del cáncer.
Constituye un sistema de clasificación en estadios uniforme y
aceptado internacionalmente. Hay tres variables básicas: T (la
extensión del tumor primario), N (el estado de los nódulos
linfáticos regionales) y M (la presencia o ausencia de metástasis
distantes). Los criterios TNM se han publicado por la UICC (Unión
Internacional contra el Cáncer), Sobin, L.H., Wittekind, Ch.
(coordinadores), TNM Classification of Malignant Tumours, quinta
edición, 1997).
Lo que es especialmente importante es que la
diagnosis precoz del CRC se traduzca en un diagnóstico mucho mejor.
Los tumores malignos del colon-recto surgen a partir
de tumores benignos, es decir, de un adenoma. Por lo tanto, los
pacientes que se diagnostican en el estadio del adenoma tienen un
mejor pronóstico. Los pacientes diagnosticados tan pronto como
pueda ser un estadio T_{is}, N0, M0 o en el T1-3;
N0; M0, si se tratan adecuadamente tienen más de un 90% de
probabilidades de sobrevivir 5 años al diagnóstico, si se comparan
con la probabilidad de sobrevivir 5 años que tiene solamente el 10%
de los pacientes diagnosticados, cuando ya están presentes
metástasis distantes.
En el sentido de la presente invención, un
diagnóstico precoz del CRC indica un diagnóstico del estado
premaligno (adenoma) o de un estadio tumoral, en el que no existe
ningún tipo de metástasis (ni próximas ni distantes), es decir, en
el que están presente el adenoma en el estadio T_{is}, N0, M0 o en
el T1-4; N0; M0. T_{is} indica un carcinoma
"in situ".
En una forma preferida de ejecución, la NNMT se
emplea para el diagnóstico del CRC de un modo tan precoz como pueda
ser el estadio del adenoma.
Es preferido además que el CRC se diagnostique
cuando todavía no haya crecido plenamente a través de la pared del
intestino, por tanto cuando todavía no ha perforado el peritoneo
visceral ni ha invadido otros órganos o estructuras, es decir, el
diagnóstico se efectúa en cualquier estadio de T_{is}; N0; M0
hasta T3; N0; M0 ( = T_{is}-3; N0; M0).
El método diagnóstico de la presente invención
se basa en una muestra líquida que se extrae de un individuo. A
diferencia de los métodos conocidos de la técnica, la NNMT se mide
específicamente a partir de esta muestra líquida mediante el uso de
un agente de fijación específico.
Un agente de fijación específico es, p.ej., un
receptor de la NNMT, una lectina que se fije sobre la NNMT o un
anticuerpo contra la NNMT. Los expertos en la materia podrán
apreciar que el término específico se emplea para indicar que otras
biomoléculas presentes en la muestra no se fijan de modo
significativo sobre el agente de fijación específico de la NNMT. Un
nivel de reactividad cruzada inferior al 5% no se considera
significativo.
Un agente de fijación específico es con
preferencia un anticuerpo reactivo con la NNMT. El término
anticuerpo indica un anticuerpo policlonal, un anticuerpo
monoclonal, fragmentos de tales anticuerpos, así como los
constructos genéticos que contienen el dominio de fijación de un
anticuerpo.
Los anticuerpos se general por procedimientos
del estado de la técnica, p.ej. los descritos en Tijssen (Tijssen,
P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11, el libre entero,
pero en especial las páginas 43-78; Elsevier,
Amsterdam, 1990). Además, los expertos en la materia conocen bien
los métodos basados en inmunosorbentes, que pueden utilizarse para
el aislamiento específico de anticuerpos. Con estos medios se puede
mejorar la calidad de los anticuerpos policlonales y, de este modo,
su acción en los inmunoensayos (Tijssen, P., lugar citado, páginas
108-115). Para los fines descritos en la presente
invención pueden utilizarse anticuerpos policlonales cultivados en
conejos. Sin embargo, está claro que también pueden utilizarse
anticuerpos policlonales de otras especies, p.ej. de ratas o de
cobayas, así como anticuerpos monoclonales. Dado que los anticuerpos
monoclonales pueden producirse en cualquier cantidad requerida y
con propiedades constantes, constituyen una herramienta ideal para
el desarrollo de ensayos del trabajo clínico rutinario. La
generación y el uso de anticuerpos monoclonales contra la NNMT en
un método según la presente invención constituyen otra forma de
ejecución preferida.
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Dado que los expertos en la materia pueden
apreciar ahora, que la NNMT se ha identificado como marcador útil
para la diagnosis del CRC, pueden utilizarse métodos alternativos
para generar anticuerpos. Estas estrategias consisten entre otras
en utilizar para la inmunización de péptidos sintéticos, que
representen un epítope de la NNMT. Como alternativa puede
recurrirse también a la inmunización de DNA, también conocida como
vacunación de DNA.
Para la medición se incuba la muestra líquida
extraída de un individuo con un agente de fijación específico de la
NNMT en condiciones apropiadas para la formación de un complejo de
agente de fijación-NNMT. No es necesario específica
cuáles son estas condiciones, porque los expertos en la materia
conocen perfectamente cuales son las condiciones idóneas para la
incubación, sin necesidad de efectuar trabajos experimentales
innecesarios.
Como paso final del método descrito en la
presente invención se mide la cantidad del complejo y se establece
la correlación de la misma con el diagnóstico del CRC. Los expertos
en la materia podrán apreciar que existen numerosos métodos para
medir la cantidad del complejo del agente de fijación específico con
la NNMT, todos ellos se describen con detalle en los manuales
importantes (véase p.ej. Tijssen, P., lugar citado; o Diamandis y
col., coord., Immunoassay, Academic-Press, Boston,
1996).
La NNMT se detecta con preferencia en un ensayo
de formato sandwich. En tal ensayo, en primer lugar para capturar
la NNMT se emplea un primer agente de fijación específico y en
segundo lugar un segundo agente de fijación específico, que está
marcado para poderse detectar directa o indirectamente.
Tal como se ha mencionado antes, ahora se ha
encontrado de modo sorprendente que la NNMT puede medirse en una
muestra líquida extraída de un individuo. No se requiere muestra de
tejido ni biopsia para aplicar el marcador NNMT en la diagnosis del
CRC.
En una forma de ejecución preferida, el método
según la presente invención se lleva a la práctica tomando suero
como material de muestra líquida.
En otra forma de ejecución según la invención,
el método según la presente invención se lleva a la práctica
tomando plasma como material de muestra líquida.
En otra forma de ejecución según la invención,
el método según la presente invención se lleva a la práctica
tomando sangre total como material de muestra líquida.
Además, los expertos en la materia ya saben que
también se pueden preparar las heces de varias maneras para obtener
una muestra líquida. Tal muestra líquida, derivada de las heces,
constituye también una forma preferida de ejecución de la presente
invención.
La aplicación de métodos rutinarios de Proteome
a las muestras de tejidos conduce a la identificación de muchos
marcadores potenciales, propuestos para el tejido seleccionado,
mientras que los inventores de la presente invención han sido
capaces de modo sorprendente de detectar la proteína NNMT en una
muestra corporal líquida. Es incluso más sorprendente que hayan
sido capaces de demostrar que la presencia de la NNMT en tal muestra
líquida, extraída de un individuo, puede guardar correlación con el
diagnóstico del cáncer colorrectal.
Los anticuerpos contra la NNMT pueden utilizarse
con gran ventaja en los procedimientos establecidos, p.ej. para
detectar células de cáncer colorrectal "in situ", en
biopsias o en procedimientos inmunohistológicos.
Un anticuerpo contra la NNMT se utiliza con
preferencia en un inmunoensayo cualitativo (se determina si la NNMT
está presente o ausente) o cuantitativo (se determina la cantidad de
la NNMT).
Se ha demostrado que la determinación del nivel
de la proteína NNMT es muy ventajosa en el ámbito del CRC. Por lo
tanto, en otra forma preferida de ejecución, la presente invención
se refiere al uso de la proteína NNMT como molécula marcadora en el
diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de una muestra líquida
extraída de un individuo.
El término molécula marcadora se emplea para
indicar que un nivel más elevado del analito NNMT, medido a partir
del líquido corporal de un individuo, apunta hacia la existencia de
un CRC.
Es especialmente preferido el uso del nuevo
marcador NNMT en el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal.
El uso de la proteína NNMT constituye en sí
mismo un progreso significativo en el ámbito retador del diagnóstico
del CRC. La combinación de las mediciones de la NNMT con las de
otros marcadores conocidos, por ejemplo el CEA, o con otros
marcadores del CRC todavía por descubrir, conducirá a nuevas
mejoras. Por lo tanto, en otra forma preferida de ejecución, la
presente invención se refiere al uso de la NNMT como molécula
marcadora para el cáncer colorrectal en combinación con otra
molécula marcadora del cáncer colorrectal en el diagnóstico del
cáncer colorrectal a partir de una muestra líquida extraída de un
individuo. Los marcadores CRC adicionales elegidos, que pueden
combinarse con la medición de la NNMT, son el CEA, el CA
19-9, el CA 72-4 y/o el CA 242.
La resolución de un ensayo se describe del mejor
modo posible con sus características de funcionamiento de receptor
(ROC) (véase en especial Zweig, M.H. y Campbell, G., Clin. Chem.
39, 561-577, 1993). La gráfica ROC es una
gráfica de todos los pares de sensibilidad/especificidad resultantes
de la variación continua del umbral de decisión a lo largo del
intervalo completo de datos observados.
La eficacia clínica de un ensayo de laboratorio
depende de su resolución diagnóstica, o de la capacidad de
clasificar correctamente los sujetos en subgrupos clínicamente
relevantes. La resolución diagnóstica mide la capacidad de un
ensayo por distinguir correctamente entre dos condiciones diferentes
de los sujetos investigados. Tales condiciones son por ejemplo
salud y enfermedad o enfermedad benigna y maligna.
En cada caso, la gráfica ROC representa el
solape entre dos distribuciones mediante el trazado de un gráfico
de la sensibilidad frente a 1 - especificidad para la totalidad del
intervalo de los umbrales de decisión. En el eje y se representa la
sensibilidad, o la fracción positiva verdadera [definida como (el
número de resultados positivos verdaderos del ensayo) (número de
resultados positivos verdaderos + número de resultados negativos
falsos)]. Esto se ha llamado también carácter positivo en presencia
de una enfermedad o estado patológico. Se calcula solamente a
partir del subgrupo afectado. En el eje x se representa la fracción
falsamente positiva o bien 1 - especificidad [definida como (el
número de resultados positivos falsos)/(número de resultados
negativos verdaderos + número de positivos falsos)]. Es un índice
de la especificidad y se calcula enteramente a partir del subgrupo
no afectado. Dado que las fracciones positivo verdadero y falso se
calculan totalmente por separado, empleando los resultados de
ensayo de dos subgrupos diferentes, la gráfica ROC es independiente
de la prevalencia de la enfermedad en la muestra. Cada punto de la
gráfica ROC representa un par de sensibilidad/especificidad
correspondiente a un umbral particular de decisión. Un ensayo con
una discriminación perfecta (sin solape de las dos distribuciones
de resultados) da lugar a una gráfica ROC que pasa por el ángulo
superior izquierdo, en el que la fracción de positivos verdaderos
es 1,0 o bien del 100% (sensibilidad perfecta) y la fracción de
positivos falsos es de 0 (especificidad perfecta). La gráfica
teórica de un ensayo sin discriminación (distribuciones idénticas
de los resultados de los dos grupos) es una línea diagonal de 45º
desde el ángulo inferior izquierdo hacia el ángulo superior
derecho. La mayoría de las gráficas se sitúan entre estos dos
extremos. (Si la gráfica ROC se sitúa por complejo por debajo de la
diagonal de 45º, esto se remedia fácilmente invirtiendo los
criterios de "carácter positivo" de "mayor que" a
"menor que" y viceversa.) En sentido cualitativo, cuanto más
cercana esté la gráfica al ángulo superior izquierdo, tanto mayor
será la resolución global del ensayo.
Un objetivo conveniente para cuantificar la
resolución del diagnóstico en un ensayo de laboratorio consiste en
expresar su eficacia con un solo número. La medición global más
frecuente es el área albergada debajo de la gráfica ROC. Por
convención, esta área es siempre \geq 0,5 (si no lo es, se puede
invertir la regla de decisión para que lo sea). El intervalo de
valores comprendido entre 1,0 (separación perfecta de los valores
del ensayo en dos grupos) y 0,5 (sin aparente diferencia
distribucional entre los dos grupos de valores obtenidos en el
ensayo). El área no depende solamente de una porción concreta de la
gráfica, por ejemplo el punto más próximo a la diagonal o la
sensibilidad para el 90% de especificidad, sino de la gráfica
completa. Esta es una expresión cuantitativa, descriptiva, de la
proximidad que tiene la gráfica ROC con la que sería la gráfica
perfecta (área = 1,0).
La utilidad clínica del nuevo marcador NNMT se
ha evaluado por comparación con y en combinación con el marcador ya
establecido, el CEA, empleando un análisis de curva de
operador-receptor (ROC; Zweig, M.H. y Campbell, G.,
Clin. Chem. 39, 561-577, 1993). Este análisis
se ha basado en conjuntos de pacientes bien definidos, que constan
de 50 muestras cada uno, extraídas de pacientes que se hallan en
T-1; N0; M0, en un tumor más avanzado, es decir, T4
y/o varios grados de severidad de metástasis (N+ y/o M+) y
individuos sanos de control, respectivamente.
El método diagnóstico basado en la medición de
la NNMT sola en comparación con el marcador establecido CEA solo se
ha encontrado que tiene por lo menos una resolución diagnóstica
igual de buena (perfil de sensibilidad/especificidad), como lo
demuestra el área albergada debajo de la curva.
La figura 1 representa un ejemplo típico de un
gel 2D cargado con una muestra tumoral (lado izquierdo) y un gel
cargado con una muestra de control adaptado (lado derecho), obtenida
de la mucosa adyacente sana. El círculo de la sección ampliada de
estos geles indica la posición de la proteína NNMT. El peso
molecular aparente y el punto isoeléctrico de la NNMT corresponden
a los valores teóricos de 29,6 kDa y 5,56, respectivamente. Esta
proteína no es detectable por el mismo método en la mucosa sana.
La figura 2 representa un ejemplo típico de un
"western blot". Se carga el gel con lisados de tejido tumoral
colorrectal y del tejido de control sano adyacente de 4 pacientes
(sujeto 27: recto ca, Dukes B; sujeto 29: recto ca, Dukes A; sujeto
39: colon ca, Dukes A; y sujeto 40: colon ca, Dukes B). Se ensaya la
presencia de la NNMT en las muestra empleando un suero de
anticuerpo policlonal de conejo anti-NNMT. Las
pistas que contienen lisados tumorales se indican con "T", las
pistas que contienen tejido de control normal se indican con
"N". La pista del marcador que contiene un patrón de proteína
de peso molecular se indica con "M". La flecha indica la
posición de la banda de NNMT en el gel. Todas las muestras tumorales
dan una señal intensa en la posición de la NNMT, mientras que
apenas se detecta señal en los lisados del tejido de control normal
adyacente. Esta fuerte sobreexpresión de la NNMT en el tejido
tumoral de pacientes de cáncer colorrectal se observa en 14 de los
14 sujetos sometidos al ensayo.
- ABTS:
- 2,2'-azino-di-[3-etilbenzotiazolina-sulfonato (6)], sal de diazonio
- BSA:
- albúmina de suero bovino
- cDNA:
- DNA complementario
- CHAPS:
- (3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano-sulfonato)
- DMSO:
- sulfóxido de dimetilo
- DTT:
- ditiotreitol
- EDTA:
- ácido etilendiaminotetraacético
- ELISA:
- ensayo inmunosorbente ligando a enzima
- HRP:
- peroxidasa de rábano rusticano
- IAA:
- yodoacetamida
- IgG:
- inmunoglobulina G
- IEF:
- enfoque isoeléctrico
- IPG:
- gradiente de pH inmovilizado
- LDS:
- dodecil-sulfato de litio
- MALDI-TOF:
- espectrometría de masas llamada "matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight"
- MES:
- mesitilo, 2,4,6-trimetilfenilo
- OD:
- densidad óptica
- PAGE:
- electroforesis en gel de poliacrilamida
- PBS:
- solución salina tamponada con fosfato
- PI:
- punto isoeléctrico
- RTS:
- sistema de traducción rápida
- SDS:
- dodecil-sulfato sódico
Con el fin de identificar las proteínas
específicas de tumores como marcadores diagnósticos potenciales del
cáncer colorrectal se realizan tres tipos diferentes de ensayos
empleando métodos de Proteome.
Se analizan en total muestras de tejido de 10
pacientes que sufren cáncer colorrectal. De cada paciente se
recogen tres tipos diferentes de tejido obtenidos en resecciones
terapéuticas: tejido tumoral (>80% de tumor) (T), tejido sano
adyacente (N) y mucosa descortezada de la mucosa sana adyacente (M).
Los dos últimos tipos de tejido sirven como muestras de control
sano adaptado. Inmediatamente después de la resección, los tejidos
se congelan rápidamente y se almacenan a -80ºC antes de procesarlos.
Los tumores se diagnostican con arreglo a criterios
histopatológicos.
Se introducen en un mortero
0,8-1,2 g de tejido congelado y se congelan por
completo con nitrógeno líquido. Se pulveriza el tejido en el
mortero, se disuelve en un volumen 10 veces mayor (p/v) del tampón
de lisis (citrato Na 10 mM, MgCl_{2} 5 mM, 1% de Genapol
X-080, 0,02% de azida sódica, Complete® sin EDTA
[Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, nº de cat. 1 873 580])
y a continuación se homogeneíza en un homogeneizador de vidrio
Wheaton® (20 x ajuste flojo, 20 x ajuste fuerte). Se someten 3 ml
del material homogeneizado a una centrifugación de densidad en
sucrosa (10-60% de sucrosa) a 4500 x g durante 1 h.
Después de este paso de centrifugación se obtienen tres fracciones.
La fracción de la parte superior del gradiente contiene proteínas
solubles y se utiliza para el análisis posterior.
Para el IEF se mezclan 3 ml de la suspensión con
12 ml del tampón de muestra (urea 7 M, tiourea 2 M, 2% de CHAPS,
0,4% de tampón IPG, pH = 4-7, 0,5% de DTT) y se
incuban durante 1 h. Se concentran las muestras en un aparato
Amicon® Ultra-15 (Millipore GmbH, Schwalbach,
Alemania) y se determina la concentración de proteínas empleando un
ensayo Bio-Rad® (nº de cat.
500-0006; Rio-Rad Laboratories GmbH,
Múnich, Alemania) con arreglo al manual del fabricante. A un
volumen equivalente a 1,5 mg de muestra de proteína se le añade
tampón hasta un volumen final de 350 \mul. Se emplea esta
solución para rehidratar las tiras de IPG de pH =
4-7 (Amersham Biosciences, Friburgo, Alemania)
durante una noche. Se realiza el IEF empleando el siguiente método
de gradiente: 1.) 1 minuto a 500 V; 2.) 2 h a 3500 V; 3.) 22 h a
3500 V constantes, que dan lugar a 82 kVh. Después del IEF se
almacenan las tiras a -80ºC o bien se utilizan directamente para el
SDS-PAGE.
Antes del SDS-PAGE se incuban
las tiras en tampón de equilibrado (urea 6 M, Tris/HCl 50 mM, pH =
8,8, 30% de glicerina, 2% de SDS), para la reducción se añade el
DTT (15 min, + 50 mg DTT/10 min) y para la alquilación se añade la
IAA (15 min, +235 mg de yodoacetamida/10 ml). Se colocan las tiras
sobre geles de poliacrilamida del 12,5% y se someten a
electroforesis a 1 W/gel durante 1 h y después a 17 W/gel. A
continuación se fijan los geles (50% de metanol, 10% de acetato) y
se tiñen durante una noche con el kit llamado Novex^{TM}
Colloidal Blue Staining Kit (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, nº de
cat. LC6025,45-7101).
Cada paciente se analiza por separado por
métodos de análisis por la imagen con el programa informático
Proteome Weaver® (Definiens AG, Múnich, Alemania). Además se
recortan todas las manchas del gel con un robot clasificador y se
identifican las proteínas presentes en las manchas por
espectrometría de masas MALDI-TOF (Ultraflex^{TM}
Tof/Tof, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Para cada paciente
se comparan 4 geles de la muestra de tumor con 4 geles tanto de
mucosa adyacente normal como de mucosa descortezada y se analizan
las manchas distintivas, correspondientes a las proteínas de
expresión diferencial. De este modo se encuentra que la proteína
NNMT se expresa específicamente o se sobreexpresa intensamente en
tejido tumoral y no es detectable en tejido sano de control. Por lo
tanto, entre otras muchas proteínas, queda calificada como marcador
candidato para el uso en el diagnóstico del cáncer colorrectal.
Se generan los anticuerpos policlonales contra
la NNMT, proteína marcadora del cáncer colorrectal, para el uso
posterior como anticuerpos para la medición de los niveles de la
NNMT en suero, plasma y sangre por ensayos de inmunodetección,
p.ej. "western blot" y ELISA.
Con el fin de generar anticuerpos contra la NNMT
se realiza la expresión recombinante de la proteína para obtener
inmunógenos. La expresión se realiza aplicando una combinación del
sistema de expresión RTS 100 y E. coli. En un primer paso se
analiza la secuencia de DNA y se obtienen recomendaciones de
rendimiento elevado de variantes mutacionales silentes de cDNA y
secuencias del correspondiente cebador de PCR empleando el sistema
"ProteoExpert RTS E. coli HY". Este es un servicio
comercial basado en una página de Internet (www.proteoexpert.com).
Empleando los pares de cebadores recomendados se utiliza el sistema
"RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set,
His-tag" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania, nº de cat. 3186237) para generar moldes de PCR lineales a
partir del cDNA y para la transcripción "in vitro" y la
expresión de la secuencia de nucleótido que codifica a la proteína
NNMT. Para la detección por "western blot" y posterior
purificación, la proteína expresada contiene un
His-tag. Se identifica la mejor variante de
expresión. Todos los pasos, desde la PCR hasta la expresión y la
detección se realizan con arreglo a las instrucciones del
fabricante. Se clona el correspondiente producto de la PCR, que
contiene todas las regiones reguladores T7 necesarias (promotor,
sitio de fijación ribosómica y terminador T7) en un vector pBAD
TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, nº de cat. K 4300/01)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la expresión
empleando las secuencias reguladoras T7 se transforma el constructo
en E. coli BL 21 (DE 3) (Studier, F.W. y col., Methods
Enzymol. 185, 60-89, 1990) y se cultivan las
bacterias transformadas en 11 lotes para la expresión de la
proteína.
Se realiza la purificación de esta proteína de
fusión His-NNMT con arreglo a procedimientos
estándar en una columna de quelato de Ni. Resumiendo, se
centrifugan 11 de los cultivos bacterianos que contienen el vector
de expresión para la proteína de fusión His-NNMT
para obtener culotes. Se suspende de nuevo el culote celular en
tampón de lisis, que contiene fosfato, pH = 8,0, cloruro de guanidio
7 M, imidazol y tioglicerina, después se homogeneíza empleando un
Ultra-Turrax®. Se centrifuga el material insoluble a
alta velocidad y se introduce el líquido sobrenadante en una
columna cromatográfica de quelato de Ni. Se lava la columna con
varios volúmenes de lecho de tampón de lisis y después se lava con
tampón que contiene fosfato, pH = 8,0, y urea. Finalmente se eluye
el antígeno fijado empleando tampón fosfato que contiene SDS, en
condiciones ácidas.
Se inmunizan inicialmente ratones A/J de 12
semanas de edad por vía intraperitoneal con 100 \mug de NNMT.
Siguen después de 6 semanas otras dos inmunizaciones
intraperitoneales a intervalos mensuales. En este proceso se
administran a cada ratón 100 \mug de NNMT adsorbida sobre
hidróxido de aluminio y 10^{9} gérmenes de la Bordetella
pertussis. A continuación se realizan las dos últimas
inmunizaciones por vía intravenosa en los días 3º y 2º antes de la
fusión, empleando 100 \mug de la NNMT en tampón PBS para cada una
de ellas.
Se fusionan células de bazo de los ratones
inmunizados con arreglo al apartado a) con células de mieloma según
Galfre, G. y Milstein, C., Methods in Enzymology 73,
3-46, 1981. En este proceso se mezclan aprox. 1 x
10^{8} células de bazo de ratones inmunizados con 2x10^{7}
células de mieloma (P3X63-Ag8-653,
ATCC CRL 1580) y se centrifugan (a 300 g y 4ºC durante 10 min).
Después se lavan las células una vez con medio RPMI 1640 sin suero
fetal bovino (FCS) y se centrifugan de nuevo a 400 g en un tubo
cónico de 50 ml. Se descarta el líquido sobrenadante, se deshace
suavemente el sedimento celular con golpecitos, se añade 1 ml de PEG
(peso molecular = 4000, Merck, Darmstadt) y se mezcla por pipeteo.
Después de 1 min en un baño de agua a 37ºC se añaden por goteo a
temperatura ambiente durante un período de 4-5 min 5
ml de RPMI 1640 sin FCS. Después se añaden 5 ml de RPMI 1640 que
contienen un 10% de FCS en aprox. 1 min, se mezclan a fondo, se
completa hasta 50 ml con medio (RPMI 1640 + 10% de FCS) y después
se centrifuga a 400 g y 4ºC durante 10 min. Se recogen las células
sedimentadas en medio RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS y se
siembra en un medio de selección de
hipoxantina-azaserina (100 mmoles/l de hipoxantina,
1 \mug/ml de azaserina en RPMI 1640 + 10% de FCS). Como factor de
crecimiento se añade al medio la interleucina 6 a razón de 100
U/ml.
Pasados unos 10 días se ensayan los anticuerpos
específicos de los cultivos primarios. Se clonan los cultivos
primarios positivos de NNMT en placas de cultivo celular de 96 hoyos
mediante un clasificador celular activado por fluorescencia. Como
aditivo de crecimiento, en este proceso se añade de nuevo al medio
la interleucina 6 a razón de 100 U/ml.
Se siembran las células de hibridoma obtenidas
en una densidad de 1x10^{5} células por ml en medio RPMI 1640 que
contiene un 10% de FCS y se dejan proliferar en un fermentador
(Thermodux Co., Wertheim/Main, modelo MCS-104XL, nº
de cat. 144-050) durante 7 días. En promedio se
obtienen concentraciones de 100 \mug de anticuerpo monoclonal por
ml de líquido sobrenadante del cultivo. La purificación de este
anticuerpo del líquido sobrenadante del cultivo se efectúa por
métodos convencionales de la química proteica (p.ej. con arreglo a
Bruck, C. y col., Methods in Enzymology 121,
587-695, 1986).
Para la inmunización se prepara una emulsión
reciente de una solución de proteína (100 \mug/ml de la proteína
NNMT) y adyuvante complejo de Freund en proporción 1:1. Se inmuniza
cada conejo con 1 ml de la emulsión en los días 1, 7, 14, 30, 60 y
90. Se extrae sangre y se emplea el suero anti-NNMT
resultante para los ensayos posteriores del modo descrito en los
ejemplos 3 y 4.
Se diluye un volumen de suero de conejo con 4
volúmenes de tampón acetato (60 mM, pH = 4,0). Se ajusta el pH a
4,5 con Tris-base 2 M. Se añade por goteo el ácido
caprílico (25 \mul/ml de muestra diluida) con agitación vigorosa.
Después de 30 min se centrifuga la muestra (13 000 x g, 30 min,
4ºC), se descarta el culote y se recoge el líquido sobrenadante. Se
ajusta el pH del líquido sobrenadante a 7,5 por adición de
Tris-base 2 M y se filtra (0,2 \mum).
Se precipita la inmunoglobulina del líquido
sobrenadante con agitación vigorosa por adición por goteo de una
solución 4 M de sulfato amónico hasta una concentración final de 2
M. Se recoge la inmunoglobulina precipitada por centrifugación
(8000 x g, 4ºC, 15 min).
Se descarta el líquido sobrenadante. Se disuelve
el culote en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH = 7,5, NaCl 30 mM y
se dializa exhaustivamente. Se centrifugan los líquidos dializados
(13 000 x g, 4ºC, 15 min) y se filtran (0,2 \mum).
La IgG policlonal de conejo se lleva a una
concentración de 10 mg/ml en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH =
7,5, NaCl 30 mM. Por cada ml de solución de IgG se añaden 50 \mul
de biotina-N-hidroxisuccinimida (3,6
mg/ml en DMSO). Después de 30 min a temperatura ambiente se
cromatografía la muestra en columna Superdex® 200
(NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH = 7,5, NaCl 30 mM). Se recoge la
fracción que contiene la IgG biotinilada. Se biotinilan los
anticuerpos monoclonales con arreglo al mismo procedimiento.
La IgG policlonal de conejo se lleva a una
concentración de 10 mg/ml en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, NaCl 30
mM, pH = 7,5. Por cada ml de solución de IgG se añaden 50 \mul del
éster N-hidroxisuccinimida del ácido
digoxigenina-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocaproico
(Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania, nº de cat. 1 333 054) (3,8
mg/ml en DMSO). Después de 30 min a temperatura ambiente se
cromatografía la muestra en columna Superdex® 200
(NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH = 7,5, NaCl 30 mM). Se recogen las
fracciones que contienen la IgG digoxigenilada. Se marcan los
anticuerpos monoclonales con digoxigenina por el mismo
procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan lisados de tejido a partir de
muestras tumorales y muestras sanas de control del modo descrito en
el ejemplo 1, "preparación de tejido".
Se realizan la SDS-PAGE y el
"western blot" empleando reactivos y equipo de Invitrogen,
Karlsruhe, Alemania. Por cada muestra de tejido que se ensaya se
diluyen 10 \mug de lisado de tejido en NuPAGE® reductor
(Invitrogen) tampón de muestra SDS y se calientan a 95ºC durante 10
min. Se pasan las muestras por geles NuPAGE® del
4-12% (Tris-glicina) en el sistema
de tampón de elución MES. Se pincha la mezcla de proteínas separada
en el gel sobre membranas de nitrocelulosa empleando el módulo
llamado Invitrogen XCell^{TM} II Blot Module (Invitrogen) y el
sistema de tampón de transferencia NuPAGE®. Se lavan las membranas 3
veces en PBS/Tween 20 del 0,05% y se bloquean con tampón
Roti®-Block (A151.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania) durante 2
h. Se diluye el anticuerpo primario, el suero policlonal de conejo
anti-NNMT (generación descrita en el ejemplo 2) en
proporción 1:10.000 en tampón de bloqueo Roti®-Block y se incuba
con la membrana durante 1 h. Se lavan las membranas 6 veces en
PBS/Tween 20 del 0,05%. Se marca el anticuerpo primario de conejo
fijado específicamente con un anticuerpo IgG policlonal de cabra
anticonejo conjugado con POD, diluido hasta 10 mU/ml en 0,5 x tampón
de bloqueo Roti®-Block. Después de una incubación de 1 hora se
lavan las membranas 6 veces con PBS/Tween 20 del 0,05%. Para la
detección del anticuerpo anticonejo conjugado con POD que se ha
fijado, se incuba la membrana con sustrato de "western blot"
del tipo Lumi-Light^{PLUS} (nº de cat. 2015196,
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y se expone sobre una
película autorradiográfica.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de la NNMT en suero o en
plasma humanos se desarrolla un ensayo ELISA sandwich. Para la
captura y detección del antígeno se conjugan partes alícuotas del
anticuerpo policlonal anti-NNMT (ver ejemplo 2) con
biotina y digoxigenina, respectivamente.
Se incuban las placas de microvaloración de 96
hoyos, recubiertos con estreptavidina, con 100 \mul de anticuerpo
policlonal anti-NNMT biotinilado durante 60 min en
una concentración de 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH = 7,4, BSA
del 1%, NaCl del 0,9% y Tween 20 del 0,1%. Después de la incubación
se lavan las placas tres veces con NaCl del 0,9%, Tween 20 del
0,1%. A continuación se incuban los hoyos durante 2 h con una serie
de diluciones de la proteína recombinante (ver ejemplo 2) como
antígeno estándar o bien con muestras de plasma diluido de los
pacientes. Después de la fijación de la NNMT se incuban los hoyos
con 100 \mul de anticuerpo policlonal anti-NNMT
digoxigenilado durante 60 min a razón de 10 \mug/ml en fosfato 10
mM, pH = 7,4, BSA del 1%, NaCl del 0,9% y Tween 20 del 0,1%. A
continuación se lavan las placas tres veces para eliminar el
anticuerpo sin fijar. En el paso siguiente se incuban los hoyos con
20 mU/ml de conjugado de
anti-digoxigenina-POD (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, nº de cat. 1633716) durante 60
min en fosfato 10 mM, pH = 7,4, BSA del 1%, NaCl del 0,9% y Tween
20 del 0,1%. Seguidamente se lavan las placas tres veces en el mismo
tampón. Para la detección de los complejos de
antígeno-anticuerpo se incuban los hoyos con 100
\mul de solución de ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania, nº de catálogo 11685767) y se determina la OD después de
30-60 min a 405 nm con un lector de ELISA.
Se evalúa la resolución analizando muestras
líquidas individuales obtenidas de conjuntos de pacientes bien
caracterizados, es decir, 50 pacientes que se han sometido a
colonoscopia y se han encontrado libres de adenoma o de CRC, 50
pacientes diagnosticados y clasificados como T1-3,
N0, M0 del CRC y 50 pacientes diagnosticados de CRC avanzado, que
tienen por lo menos infiltración tumoral por lo menos en un nódulo
linfático próximo o formas más severas de metástasis,
respectivamente. Se mide el CEA con el ensayo que es producto
comercial (Roche Diagnostics, ensayo CEA, nº de cat. 1 173 1629
para el sistema analizador de inmunoensayo Elecsys®) y se mide la
NNMT del modo descrito anteriormente. Los dos se cuantifican en el
suero extraído de cada uno de estos individuos. Se efectúan
análisis ROC con arreglo a Zweig, M.H. y Campbell, lugar citado. El
poder discriminatorio para diferenciar a los pacientes del grupo
T1-3, N0, M0 de los individuos sanos se mide por el
área albergada debajo de la curva y se encuentra que es por lo menos
igual de bueno para la NNMT que el obtenido con el marcador ya
establecido, el CEA.
Los datos preliminares indican que la NNMT puede
ser también muy útil para el seguimiento de los pacientes después
de la intervención quirúrgica.
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\global\parskip0.900000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Roche Diagnostics GmbH
\hskip1cmF. Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Uso de la proteína NNMT como
marcador del cáncer colorrectal
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21548
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 02028715.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-12-20
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 264
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Rasgos diversos
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
Nicotinamida-N-metiltransferasa
(Swiss-PROT: P40261)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (9)
1. Un método para el diagnóstico del cáncer
colorrectal que consta de los pasos siguientes:
a) proporcionar una muestra líquida, extraída de
un individuo,
b) poner en contacto dicha muestra con un agente
de fijación específico de la NNMT en condiciones apropiadas para la
formación de un complejo entre dicho agente de fijación y la NNMT
y
c) establecer la correlación existente entre la
cantidad de complejo formado en b) y el diagnóstico del cáncer
colorrectal.
2. El método según la reivindicación 1,
caracterizado además porque la muestra es suero.
3. El método según la reivindicación 1,
caracterizado además porque la muestra es plasma.
4. El método según la reivindicación 1,
caracterizado además porque la muestra es sangre total.
5. Uso de la proteína NNMT como molécula
marcadora para el diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de
una muestra líquida extraída de un individuo.
6. Uso de la proteína NNMT como molécula
marcadora para el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal a partir
de una muestra líquida obtenida de un individuo.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que el
diagnóstico precoz se realiza con una muestra derivada de pacientes
de CRC en el estadio de adenoma.
8. Uso según la reivindicación 6, en el que el
diagnóstico precoz se realiza con una muestra de pacientes de CRC
en el estadio T_{is}-3; N0; M0.
9. Uso de la proteína NNMT como molécula
marcadora del cáncer colorrectal en combinación con otra molécula
marcadora del cáncer colorrectal para el diagnóstico del cáncer
colorrectal a partir de una muestra líquida obtenida de un
individuo.
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