ES2288770T3 - Region c-terminal de proteina de transcrito relacionado con aguti (art). - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las ID SEC Nº 1-3, 10-12, 15 y 16.
Description
Región C-terminal de proteína de
transcrito relacionado con agutí (ART).
No aplicable.
No aplicable.
La presente invención está dirigida a
polipéptidos derivados de la región C-terminal de la
proteína de transcrito relacionado con agutí (ART) y a usos de
dichos polipéptidos, incluyendo el uso de inhibidores de la unión
de hormonas estimulantes de melanocito a receptores de
melanocortina, y al uso para identificar inhibidores de la unión de
la proteína ART a receptores de melanocortina.
La ART (transcrito relacionado con agutí) se
descubrió originalmente como un ARNm que está regulado positivamente
en el hipotálamo de ratones ob/ob y db/db. El gen ART se ha clonado
tanto de ratones como de seres humanos y codifica una proteína de
131 aminoácidos en ratones y 132 aminoácidos en seres humanos
(Shutter y col., 1997, Genes and Development, 11:
593-602). Se ha mostrado que la proteína ART
producida recombinantemente es un antagonista funcional del
receptor de melanocortina 3 (MC3R) y del receptor de melanocortina 4
(MC4R) (Fong y col., 1997, Biochem. Biophys. Res. Comm. 237:
629-631; Ollman y col., 1997, Science 278:
135-138).
MC3R y MC4R pertenecen a una clase de receptores
acoplados a proteína G conocida como receptores de melanocortina,
puesto que estos receptores activan la adenililo ciclasa en
respuesta a ligandos conocidos como melanocortinas (por ejemplo,
adrenocorticotrofina (ACTH) y las hormonas estimulantes de
melanocito \alpha, \beta y \gamma). MC3R y MC4R son
receptores de melanocortina neurales, expresándose MC3R en el
hipotálamo y el sistema límbico del cerebro y expresándose MC4R
ampliamente en el cerebro. En particular, se ha encontrado la
expresión de MC4R en una serie de sitios hipotalámicos, incluyendo
los núcleos ventromedial, lateral, dorsomedial y paraventricular
(Mountjoy y col., 1994, Mol. Endocrinol. 8:
1298-1308), regiones que han mostrado desempeñar un
papel en el comportamiento de alimentación (Bray, 1987, Nutr.
Rev. 45: 33-43). Los experimentos de
reconocimiento génico han mostrado que el MC4R tiene un papel
importante en el control del comportamiento de alimentación y la
obesidad. Los ratones con deleción génica que carecen de MC4R
desarrollan un síndrome de obesidad caracterizado por hiperfagia,
hiperinsulinemia e hiperglucemia (Huszar y col., 1997, Cell
88: 131-141).
A la vista de esto, existe un gran interés en la
proteína ART, que parece ser un regulador natural de MC3R y MC4R en
seres humanos. Se cree que la proteína ART es probable que sea un
regulador natural de la obesidad humana que funciona antagonizando
MC3R o MC4R. En consecuencia, es deseable la identificación de
sustancias que inhiban la unión de la proteína ART a MC3R o MC4R,
puesto que es probable que dichos inhibidores sean valiosos en el
control de la obesidad. También es probable que las sustancias que
potencian el efecto de la proteína ART sobre MC3R o MC4R sean
valiosas en el control del peso corporal.
La presente invención proporciona polipéptidos
novedosos de la región C-terminal de las proteínas
ART humana y de ratón. Se proporcionan también secuencias de ADN
que codifican los péptidos C-terminales novedosos.
Los polipéptidos C-terminales novedosos pueden
utilizarse para inhibir la unión de hormonas estimulantes de
melanocito a receptores de melanocortina. Se proporcionan también
procedimientos de identificación de inhibidores del efecto de la
proteína ART sobre la unión de hormonas estimulantes de melanocito a
receptores de melanocortina.
La Figura 1 muestra la cuantificación de
c-ART-b a partir de células
COS-7 mediante el uso de un ELISA que utiliza un
anticuerpo que reconoce el epítopo myc en
c-ART-b. Se muestra la curva patrón
generada utilizando cantidades conocidas de péptido myc. Para la
preparación de c-ART-b realizada a
partir de células COS-7, una dilución 10x de la
muestra proporcionó una absorbancia de 0,079, correspondiente a 10
nM en la curva patrón anterior. Por lo tanto, la preparación de
c-ART-b tenía una concentración 100
nM.
La Figura 2 muestra la afinidad de unión de
c-ART por MC3R humano. Se muestra la inhibición de
125I-[Tyr2][Nle4,D-Phe7]-hormona
estimulante de melanocito \alpha
(125I-NDP-\alpha-MSH)
a MC3R humano por c-ART-b.
La Figura 3 muestra la afinidad de unión de
c-ART por MC4R humano. Se muestra la inhibición de
la unión de
125I-NDP-\alpha-MSH
a MC4R humano por c-ART-b.
La presente invención proporciona polipéptidos
C-terminales derivados de la proteína de transcrito
relacionado con agutí (ART) y secuencias de ADN que codifican esos
polipéptidos. Los polipéptidos C-terminales de la
proteína ART se designan en la presente memoria como
"polipéptidos ART". En ciertas realizaciones, los polipéptidos
ART están presentes en una secuencia polipeptídica contigua,
concretamente, una proteína de fusión que incorpora generalmente en
la terminación C de la proteína de fusión una o más secuencias de
aminoácidos no derivadas de la proteína ART. Dichas secuencias de
proteína no ART pueden ser, por ejemplo, "marcajes" tales como
un sitio de proteína quinasa A (para un marcaje radioisotópico más
sencillo) o una secuencia antigénica (por ejemplo, un epítopo myc)
para cuantificación por ELISA. Son conocidos otros marcajes en la
técnica y se incluyen en la presente invención polipéptidos ART que
incorporan dichos otros marcajes. En otras realizaciones, los
polipéptidos ART están presentes en una proteína de fusión con otra
proteína que da lugar a una señal fácilmente detectable, por
ejemplo, fosfatasa alcalina (ART-AP) o luciferasa
(ART-luc). Las proteínas de fusión tales como
ART-AP o ART-luc son útiles en
ensayos de unión puesto que su presencia y/o concentración pueden
detectarse sin el uso de radiactividad.
En particular, la presente invención incluye los
siguientes polipéptidos ART:
c-ART-a: Este
polipéptido contiene, de terminación N a C: (1) un péptido secuencia
señal de levadura; (2) los aminoácidos 76-132 de la
proteína ART humana; (3) un sitio de trombina; (4) un epítopo myc;
(5) un sitio de proteína quinasa A (PKA); y (6) un marcaje de
hexahistidina. La secuencia de aminoácidos de
c-ART-a es:
c-ART-b: Este
polipéptido contiene, de terminación N a C: (1) los aminoácidos
1-26 de la proteína ART humana; (2) los aminoácidos
76-132 de la proteína ART humana; (3) un sitio de
trombina; (4) un epítopo myc; y (5) un marcaje de hexahistidina. La
secuencia de aminoácidos de c-ART-b
es:
c-ART-c: Este
polipéptido contiene, de terminación N a C: (1) los aminoácidos
1-26 de la proteína ART humana; (2) los aminoácidos
76-132 de la proteína ART humana; (3) un sitio de
trombina; (4) un sitio PKA; (5) un epítopo myc; y (6) un marcaje de
hexahistidina. La secuencia de aminoácidos de
c-ART-c
es:
ART-AP: Este
polipéptido contiene, de terminación N a C: (1) los aminoácidos
1-132 de la proteína ART humana; (2) un sitio de
trombina; (3) la proteína fosfatasa alcalina; (4) un epítopo myc; y
(5) un marcaje de hexahistidina. La secuencia de aminoácidos de
ART-AP
es:
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\newpage
ART-luc: Este
polipéptido contiene, de terminación N a C: (1) los aminoácidos
1-132 de la proteína ART humana; (2) un sitio de
trombina; (3) la proteína luciferasa; (4) un epítopo myc; y (5) un
marcaje de hexahistidina. La secuencia de aminoácidos de
ART-luc
es
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que contiene los aminoácidos 1-26 y
76-132 de la proteína ART humana que tiene la
siguiente secuencia polipeptídica:
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\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que contiene los aminoácidos 76-132
de la proteína ART humana que tiene la siguiente secuencia
polipeptídica:
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La presente invención incluye también un
polipéptido ART que contiene los aminoácidos 1-26 y
75-131 de la proteína ART de ratón que tiene la
siguiente secuencia polipeptídica:
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\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que contiene los aminoácidos 75-131
de la proteína ART de ratón que tiene la siguiente secuencia
polipeptídica:
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\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que tiene la siguiente secuencia, de terminación N
a C: (1) un péptido secuencia señal de levadura; (2) los aminoácidos
75-131 de la proteína ART de ratón; (3) un sitio de
trombina; (4) un epítopo myc; (5) un sitio PKA; y (6) un marcaje de
hexahistidina. La secuencia de aminoácidos de este polipéptido ART
es:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que tiene la siguiente secuencia, de terminación N
a C: (1) los aminoácidos 1-26 de la proteína ART de
ratón; (2) los aminoácidos 75-131 de la proteína ART
de ratón; (3) un sitio de trombina; (4) un epítopo myc; y (5) un
marcaje de hexahistidina. La secuencia aminoácidos de este
polipéptido ART es:
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\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que tiene la siguiente secuencia, de terminación N
a C: (1) los aminoácidos 1-26 de la proteína ART de
ratón; (2) los aminoácidos 75-131 de la proteína ART
de ratón; (3) un sitio de trombina; (4) un sitio PKA; (5) un
epítopo myc; y (6) un marcaje de hexahistidina. La secuencia de
aminoácidos de este polipéptido ART es:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que tiene la siguiente secuencia, de terminación N
a C: (1) los aminoácidos 1-131 de la proteína ART de
ratón y (2) la proteína fosfatasa alcalina. La secuencia de
aminoácidos de este polipéptido es:
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que tiene la siguiente secuencia, de terminación N
a C: (1) los aminoácidos 1-131 de la proteína ART de
ratón y (2) la proteína luciferasa. La secuencia de aminoácidos de
este polipéptido es:
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\newpage
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que tiene la siguiente secuencia, de terminación N
a C: (1) los aminoácidos 1-26 de la proteína ART
humana; (2) los aminoácidos 76-132 de la proteína
ART humana; (3) un sitio de trombina; (4) la proteína fosfatasa
alcalina; (5) un epítopo myc; y (6) un marcaje de hexahistidina. La
secuencia de aminoácidos de este polipéptido es:
\vskip1.000000\baselineskip
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La presente invención incluye también un
polipéptido ART que tiene la siguiente secuencia: de terminación N
a C: (1) los aminoácidos 1-26 de la proteína ART
humana; (2) los aminoácidos 76-132 de la proteína
ART humana; (3) un sitio de trombina; (4) la proteína luciferasa;
(5) un epítopo myc; y (6) un marcaje de hexahistidina. La secuencia
de aminoácidos de este polipéptido es:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que tiene la siguiente secuencia, de terminación N
a C: (1) los aminoácidos 1-132 de la proteína ART
humana; y (2) la proteína fosfatasa alcalina. La secuencia de
aminoácidos de este polipéptido es:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que tiene la siguiente secuencia, de terminación N
a C: (1) los aminoácidos 1-132 de la proteína ART
humana; y (2) la proteína luciferasa. La secuencia de aminoácidos
de este polipéptido es:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que tiene la siguiente secuencia, de terminación N
a C: (1) los aminoácidos 1-26 de la proteína ART
humana; (2) la proteína fosfatasa alcalina; (3) los aminoácidos
27-132 de la proteína ART humana. La secuencia de
aminoácidos es:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La presente invención incluye también un
polipéptido ART que tiene la siguiente secuencia, de terminación N
a C: (1) los aminoácidos 1-26 de la proteína ART
humana; (2) la proteína luciferasa; (3) los aminoácidos
27-132 de la proteína ART humana. La secuencia de
aminoácidos es:
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos ART de la presente invención
pueden estar en una forma que esté sustancialmente libe de otros
polipéptidos. "Sustancialmente libre de otros polipéptidos"
significa al menos 90%, preferiblemente 95%, más preferiblemente
99% y aún más preferiblemente 99,9% libre de otras proteínas. Por
tanto, una preparación de polipéptido ART que esté sustancialmente
libre de otros polipéptidos contendrá, como porcentaje de sus
polipéptidos totales, no más de 10%, preferiblemente no más de 5%,
más preferiblemente no más de 1% y aún más preferiblemente no más
de 0,1% de polipéptidos no ART. Puede determinarse si una
preparación de polipéptido ART está sustancialmente libre de otros
polipéptidos mediante técnicas convencionales tales como, por
ejemplo, electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio
(PAGE-SDS) combinada con procedimientos de tinción
apropiados, por ejemplo, tinción con plata.
Es posible modificar muchos de los aminoácidos
de los polipéptidos ART de la presente invención y seguir reteniendo
sustancialmente la misma actividad biológica poseída por el
polipéptido ART no modificado. Un polipéptido ART modificado tiene
"sustancialmente la misma actividad biológica" que un
polipéptido ART no modificado si el polipéptido modificado tiene un
valor de CI_{50} para la inhibición de la unión de
NDP-\alpha-MSH marcada con
^{125}I a MCR3R o MC4R que no sea más de 5 veces mayor que el
valor de CI_{50} del polipéptido ART no modificado para la
inhibición de la unión de
NDP-\alpha-MSH marcada con
^{125}I a MC3R o MC4R.
Por tanto, la presente invención incluye
polipéptidos ART modificados que tienen deleciones, adiciones o
sustituciones de aminoácidos pero que siguen reteniendo
sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido ART
no modificado del que derivan. Está generalmente aceptado que las
sustituciones de aminoácidos individuales en posiciones no críticas
habitualmente no alteran la actividad biológica de una proteína o
polipéptido (véase, por ejemplo, "Molecular Biology of the
Gene", Watson y col., 1987, 4ª edición, The Benjamin/Cummings
Publishing Co., Inc., página 226; y Cunningham & Wells, 1989,
Science 244: 1081-1085). En consecuencia, la
presente invención incluye polipéptidos modificados en los que se
ha hecho una sustitución de aminoácido en las ID SEC Nº
1-20, en la que los polipéptidos modificados siguen
reteniendo sustancialmente la misma actividad biológica que los
polipéptidos ART no modificados. La presente invención incluye
también polipéptidos modificados en los que se han hecho dos
sustituciones de aminoácidos en las ID SEC Nº 1-20,
en las que los polipéptidos siguen reteniendo sustancialmente la
misma actividad biológica que los polipéptidos ART no modificados.
Más generalmente, la presente invención incluye polipéptidos
modificados en los que se han hecho sustituciones de aminoácidos en
regiones de los polipéptidos que no son críticas, concretamente, en
regiones en que las modificaciones dan como resultado un
polipéptido con esencialmente la misma actividad biológica que el
polipéptido no modificado.
En particular, la presente invención incluye
realizaciones en las que las sustituciones anteriormente descritas
son sustituciones conservativas. Una "sustitución de aminoácido
conservativa" designa el reemplazo de un residuo de aminoácido
por otro residuo de aminoácido químicamente similar. Los ejemplos de
dichas sustituciones conservativas son: sustitución de un residuo
hidrófobo (isoleucina, leucina, valina o metionina) por otro; la
sustitución de un residuo polar por otro residuo polar de la misma
carga (por ejemplo, arginina por lisina; ácido glutámico por ácido
aspártico).
La presente invención incluye también secuencias
de ADN que codifican polipéptidos que tienen las secuencias de
aminoácidos de ID SEC Nº 1-20, con la condición de
que en el caso de que las secuencias de ADN codifiquen las ID SEC
Nº 6-9, las secuencias de ADN no codifiquen ninguna
extensión contigua de aminoácidos de la proteína ART distinta de
las ID SEC Nº 6-9.
Las secuencias de ADN de la presente invención
pueden estar en una forma que esté sustancialmente libre de otros
ácidos nucleicos. "Sustancialmente libre de otros ácidos
nucleicos" significa al menos 90%, preferiblemente 95%, más
preferiblemente 99%, y aún más preferiblemente 99,9% libre de otros
ácidos nucleicos. Por tanto, una preparación de secuencias de ADN
que codifican un polipéptido ART que está sustancialmente libre de
otros ácidos nucleicos contendrá, como porcentaje de sus ácidos
nucleicos totales, no más de 10%, preferiblemente no más de 5%, más
preferiblemente no más de 1% y aún más preferiblemente no más de
0,1% de ácidos nucleicos distintos de las secuencias de ADN que
codifican los polipéptidos ART. Puede determinarse si una
preparación dada de secuencias de ADN que codifican un polipéptido
ART está sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos mediante
técnicas convencionales tales como, por ejemplo, electroforesis en
gel de agarosa combinada con procedimientos de tinción apropiados,
por ejemplo, tinción con bromuro de etidio.
Las secuencias de ADN de la presente invención
que codifican polipéptidos ART pueden ligarse con otras secuencias
de ADN, por ejemplo, secuencias de ADN a las que las secuencias de
ADN que codifican la proteína ART no están naturalmente ligadas,
formando "moléculas de ADN recombinante" que codifican
polipéptidos ART. Dichas otras secuencias pueden incluir secuencias
de ADN que controlan la transcripción o traducción tales como, por
ejemplo, secuencias de iniciación de la traducción, promotores de
ARN polimerasa II, secuencias de terminación de la transcripción o
traducción, secuencias potenciadoras, secuencias que controlan la
replicación en microorganismos o que confieren resistencia a
antibióticos. Las secuencias de ADN de la presente invención pueden
insertarse en vectores tales como plásmidos, cósmidos, vectores
víricos o cromosomas artificiales de levadura.
Se incluyen en la presente invención secuencias
de ADN que hibridan con las secuencias de ADN que codifican
polipéptidos ART en condiciones rigurosas. A modo de ejemplo y no de
limitación, un procedimiento que utiliza condiciones de alto rigor
es como sigue: se lleva a cabo la prehibridación de filtros que
contienen ADN durante 2 h a una noche a 65ºC en tampón compuesto
por 6x SSC, 5x disolución de Denhardt y ADN de esperma de salmón
desnaturalizado 100 \mug/ml. Se hibridan los filtros durante 12 a
48 horas a 65ºC en mezcla de prehibridación que contiene ADN de
esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml y
5-20 x 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P.
Se realiza el lavado de filtros a 37ºC durante 1 h en una disolución
que contiene 2 x SSC, 0,1% de SDS. Esto es seguido por un lavado de
0,1x SSC, 0,1% de SDS a 50ºC durante 45 min, antes de
autorradiografía. Otros procedimientos que utilizan condiciones de
alto rigor incluirían una hibridación llevada a cabo en 5x SSC, 5x
disolución de Denhardt, 50% de formamida a 42ºC durante 12 a 48
horas o una etapa de lavado llevada a cabo en 0,2x SSPE, 0,2% de
SDS a 65ºC durante 30 a 60 minutos.
Los reactivos mencionados en los procedimientos
anteriores para llevar a cabo hibridación de alto rigor son bien
conocidos en la técnica. Los detalles de la composición de estos
reactivos pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch y
Maniatis, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª
edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Además de las
anteriores, son bien conocidas en la técnica otras condiciones de
alto rigor que pueden utilizarse.
Otro aspecto de la presente invención incluye
células huésped que se han modificado por ingeniería genética para
contener y/o expresar secuencias de ADN que codifican polipéptidos
ART. Dichas células huésped recombinantes pueden cultivarse en
condiciones adecuadas para producir polipéptidos ART. Puede
utilizarse un vector de expresión que contiene ADN que codifica
polipéptidos ART para la expresión de polipéptidos ART en una célula
huésped recombinante. Las células huésped recombinantes pueden ser
procarióticas o eucarióticas incluyendo, pero sin limitación,
bacterias tales como E. coli, células fúngicas tales como
levadura, células de mamífero incluyendo, pero sin limitación,
líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, de mono y
roedor, y células de insecto incluyendo, pero sin limitación,
líneas celulares derivadas de Drosophila y gusano de seda.
Las líneas celulares derivadas de especies de mamíferos que son
adecuadas para la expresión recombinante de polipéptidos ART y que
están comercialmente disponibles incluyen, pero sin limitación,
células L L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L
L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Rajl (ATCC
CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1
(ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651),
CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3
(ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26) y
MRC-5 (ATCC CCL 171).
Pueden utilizarse una variedad de vectores de
expresión de mamífero para expresar polipéptidos ART en células de
mamífero. Los vectores de expresión de mamífero comercialmente
disponibles que son adecuados incluyen, pero sin limitación,
pMC1neo (Stratagene), pSG5 (Stratagene), pcDNAI y pcDNAIamp, pcDNA3,
pcDNA3.1, pCR3.1 (Invitrogen),
EBO-pSV2-neo (ATCC 37593),
pBPV-1(8-2) (ATCC 37110),
pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC
37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRS-Vneo (ATCC 37198)
y pSV2-dhfr (ATCC 37416). Después de la expresión en
células recombinantes, los polipéptidos ART pueden purificarse
mediante técnicas convencionales a un nivel que esté sustancialmente
libre de otras proteínas.
La presente invención incluye un procedimiento
de determinación de si una sustancia es un inhibidor de la unión de
un polipéptido ART a un receptor de melanocortina. Dichas sustancias
son probablemente útiles en el control del peso corporal. El
procedimiento aprovecha el hecho de que los polipéptidos ART inhiben
la unión de hormonas estimulantes de melanocito a receptores de
melanocortina uniéndose ellos mismos al receptor. Por tanto, una
sustancia que antagonice el efecto inhibidor de los polipéptidos ART
sobre la unión de hormonas estimulantes de melanocito a receptores
de melanocortina es probable que actúe inhibiendo la unión del
polipéptido ART mismo al receptor de melanocortina. El
procedimiento comprende:
- (a)
- proporcionar células que expresan el receptor de melanocortina;
- (b)
- exponer las células a una concentración elegida de hormona estimulante de melanocito en ausencia del polipéptido ART y en ausencia de la sustancia, y medir la cantidad de unión de hormona estimulante de melanocito a las células para obtener un primer valor de unión de hormona estimulante de melanocito;
- (c)
- exponer las células a la concentración elegida de hormona estimulante de melanocito en presencia de una concentración elegida del polipéptido ART y en ausencia de la sustancia, y medir la cantidad de unión de hormona estimulante de melanocito para obtener un segundo valor de unión de hormona estimulante de melanocito, en el que el segundo valor para unión de hormona estimulante de melanocito indica que ha ocurrido menos unión de hormona estimulante de melanocito en comparación con el primer valor para la unión de hormona estimulante de melanocito;
- (d)
- exponer las células a la concentración elegida de hormona estimulante de melanocito en presencia de la concentración elegida de polipéptido ART y en presencia de la sustancia, y medir la cantidad de unión de hormona estimulante de melanocito para obtener un tercer valor de unión de hormona estimulante de melanocito;
en el que, si el tercer valor de
unión de hormona estimulante de melanocito es mayor que el segundo
valor, entonces la sustancia es un inhibidor de la unión del
polipéptido ART al receptor de
melanocortina.
En una realización particular, las células que
expresan el receptor de melanocortina son células que expresan
naturalmente el receptor de melanocortina. En otra realización, las
células que expresan el receptor de melanocortina no expresan
naturalmente el receptor de melanocortina, sino que se han
transfectado con un vector de expresión que dirige la expresión del
receptor de melanocortina. Se pretende que la transfección incluya
cualquier procedimiento conocido en la técnica para la introducción
del vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina en las células. Por ejemplo, la transfección incluye
transfección mediada por fosfato de calcio o cloruro de calcio,
lipofección, infección con un constructo retrovírico que contiene el
receptor de melanocortina y electroporación.
En una realización particular, el receptor de
melanocortina se selecciona del grupo constituido por: el receptor
de melanocortina 3 (MC3R) y el receptor de melanocortina 4 (MC4R).
En una realización particular del procedimiento anteriormente
descrito, el receptor de melanocortina no es un receptor de
melanocortina de Xenopus.
Las células que se han transfectado con un
vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina pueden ser células procarióticas o eucarióticas. En
una realización particular, las células que se han transfectado con
un vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina se seleccionan del grupo constituido por: células de
levadura, células de mamífero, células bacterianas y células de
insecto. En una realización particular, las células que se han
transfectado con un vector de expresión que dirige la expresión del
receptor de melanocortina se seleccionan del grupo constituido por:
células humanas, células de ratón, células de rata, células
bovinas, células porcinas, células de hámster y células de mono. En
una realización particular, las células que se han transfectado con
un vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina se seleccionan del grupo constituido por: células L
L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L
L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Rajl (ATCC
CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1
(ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651),
CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3
(ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26) y
MRC-5 (ATCC CCL 171). En una realización particular,
las células no son células de melanóforo de Xenopus.
En una realización particular, la hormona
estimulante de melanocito se selecciona del grupo constituido por:
hormona estimulante de melanocito \alpha, hormona estimulante de
melanocito \beta y hormona estimulante de melanocito
\gamma.
En una realización particular, el polipéptido
ART tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
constituido por ID SEC Nº 1-19 y 20.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, el procedimiento se practica in
vitro y las condiciones en las que se practica el procedimiento
son condiciones que se utilizan típicamente en la técnica para el
estudio de interacciones proteína-proteína: por
ejemplo, pH fisiológico, condiciones salinas tales como las
representadas por tampones utilizados habitualmente tales como PBS o
en medios de cultivo de tejido, una temperatura de aproximadamente
4ºC a aproximadamente 55ºC.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, la concentración elegida de la hormona
estimulante de melanocito es de 0,05 nM a 2,0 nM, preferiblemente de
0,1 nM a 1,0 nM, y más preferiblemente de 0,2 nM a 0,5 nM.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, la concentración elegida del polipéptido
ART es de 10^{-12} M a 10^{-7} M.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, el procedimiento se practica in
vitro y la hormona estimulante de melanocito está marcada, por
ejemplo, enzimática, radiactivamente o similar, y la cantidad de
unión de la hormona estimulante de melanocito al receptor de
melanocortina se mide determinando la cantidad de marcador unido a
las células que contienen el receptor de melanocortina.
Las etapas (b), (c) y (d) del procedimiento
anteriormente descrito pueden modificarse en que, en lugar de
exponer células intactas a la hormona estimulante de melanocito, el
polipéptido ART o la sustancia, pueden prepararse membranas a
partir de las células y las membranas pueden exponerse a la hormona
estimulante de melanocito, el polipéptido ART o la sustancia. Dicha
modificación que utiliza membranas en lugar de células intactas en
procedimientos similares a los descritos anteriormente, aunque
dirigida a las interacciones de unión de otros ligandos y
receptores, es bien conocida en la técnica y se describe, por
ejemplo, en Hess y col., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm.
184: 260-268.
Como modificación adicional del procedimiento
anteriormente descrito, puede prepararse ARN que codifica el
receptor de melanocortina como, por ejemplo, mediante transcripción
in vitro utilizando un plásmido que contiene secuencias
nucleotídicas que codifican el receptor de melanocortina bajo el
control del promotor del bacteriófago T7, y el ARN puede
microinyectarse en oocitos de Xenopus para provocar la
expresión del receptor de melanocortina en los oocitos. Estos
oocitos toman después el lugar de las células en el procedimiento
anteriormente descrito.
Una vez se ha identificado una sustancia como
inhibidor de la unión del polipéptido ART al receptor de
melanocortina, esa sustancia puede ensayarse para determinar si es
también un agonista del receptor de melanocortina. Dicho ensayo
implicaría exponer células que expresan el receptor de melanocortina
a la sustancia en ausencia de hormona estimulante de melanocito y
proteína ART o polipéptidos ART, y determinar si el receptor de
melanocortina se activa así por la sustancia. De este modo, puede
identificarse un inhibidor del efecto de la proteína ART sobre MC3R
o MC4R que tiene poca o ninguna actividad agonista de MC3R o MC4R
pero que aplaca la inhibición de la actividad del receptor MC3R o
MC4R producida por la proteína ART. De manera similar, puede
determinarse si la sustancia es un antagonista del receptor de
melanocortina.
La presente invención incluye también un
procedimiento para determinar si una sustancia es un inhibidor de
la unión de un polipéptido ART a un receptor de melanocortina, en el
que el procedimiento comprende:
- (a)
- proporcionar células que expresan un receptor de melanocortina;
- (b)
- exponer las células a un polipéptido ART en presencia y en ausencia de la sustancia en condiciones tales que, si la sustancia no estuviera presente, el polipéptido ART se uniría al receptor de melanocortina;
- (c)
- medir la cantidad de unión del polipéptido ART al receptor de melanocortina en presencia y en ausencia de la sustancia;
en el que una reducción en la
cantidad de unión del polipéptido ART al receptor de melanocortina
en presencia, comparado con en ausencia, de la sustancia indica que
la sustancia es un inhibidor de la unión del polipéptido ART al
receptor de
melanocortina.
En una realización particular, las células que
expresan el receptor de melanocortina son células que expresan
naturalmente el receptor de melanocortina. En otra realización, las
células que expresan el receptor de melanocortina no expresan
naturalmente el receptor de melanocortina, sino que se han
transfectado con un vector de expresión que dirige la expresión del
receptor de melanocortina. Se pretende que la transfección incluya
cualquier procedimiento conocido en la técnica para la introducción
del vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina en las células. Por ejemplo, la transfección incluye
transfección mediada por fosfato de calcio o cloruro de calcio,
lipofección, infección con un constructo retrovírico que contiene el
receptor de melanocortina y electroporación.
En una realización particular, el receptor de
melanocortina se selecciona del grupo constituido por: el receptor
de melanocortina 3 (MC3R) y el receptor de melanocortina 4 (MC4R).
En una realización particular del procedimiento anteriormente
descrito, el receptor de melanocortina no es un receptor de
melanocortina de Xenopus.
Las células que se han transfectado con un
vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina pueden ser células procarióticas o eucarióticas. En
una realización particular, las células que se han transfectado con
un vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina se seleccionan del grupo constituido por: células de
levadura, células de mamífero, células bacterianas y células de
insecto. En una realización particular, las células que se han
transfectado con un vector de expresión que dirige la expresión del
receptor de melanocortina se seleccionan del grupo constituido por:
células humanas, células de ratón, células de rata, células
bovinas, células porcinas, células de hámster y células de mono. En
una realización particular, las células que se han transfectado con
un vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina se seleccionan del grupo constituido por: células L
L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L
L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Rajl (ATCC
CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1
(ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651),
CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3
(ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26) y
MRC-5 (ATCC CCL 171). En una realización particular,
las células no son células de melanóforo de
Xenopus.
Xenopus.
En una realización particular, el polipéptido
ART tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
constituido por: ID SEC Nº 1-19 y 20. En
realizaciones particulares del procedimiento anteriormente descrito,
el polipéptido ART se utiliza en una concentración de 10^{-12} M
a 10^{-7} M.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, se practica el procedimiento in
vitro y las condiciones son condiciones que se utilizan
típicamente en la técnica para el estudio de interacciones
proteína-proteína, por ejemplo: pH fisiológico,
condiciones salinas tales como las representadas por tampones
usados habitualmente tales como PBS o en medios de cultivo de
tejido, una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente
55ºC.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, el procedimiento se practica in
vitro y el polipéptido ART está marcado, por ejemplo,
enzimática, radiactivamente o similar, y la cantidad de unión del
polipéptido ART al receptor de melanocortina se mide determinando la
cantidad de marcador unido al receptor de melanocortina. El
polipéptido ART se marcará radiactivamente con ^{32}P, ^{33}P o
^{125}I (por ejemplo, para
c-ART-a o
c-ART-c) o se marcará no
radiactivamente (por ejemplo, ART-AP,
ART-luc, c-ART-AP o
c-ART-luc). En el caso de estos
últimos polipéptidos ART, los polipéptidos ART pueden detectarse
detectando la actividad enzimática de los restos fosfatasa alcalina
o luciferasa de los polipéptidos.
La etapa (b) del procedimiento anteriormente
descrito puede modificarse en que, en lugar de exponer las células
a un polipéptido ART en presencia y en ausencia de la sustancia,
pueden prepararse membranas a partir de las células y las membranas
pueden exponerse a un polipéptido ART en presencia y en ausencia de
la sustancia. Dicha modificación que utiliza membranas en lugar de
células en procedimientos similares a los descritos anteriormente,
aunque dirigida a las interacciones de unión de otros ligandos y
receptores, es bien conocida en la técnica y se describe, por
ejemplo, en Hess y col., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm.
184: 260-268.
Como modificación adicional del procedimiento
anteriormente descrito, puede prepararse ARN que codifica un
receptor de melanocortina como, por ejemplo, mediante transcripción
in vitro utilizando un plásmido que contiene secuencias
nucleotídicas que codifican el receptor de melanocortina bajo el
control del promotor del bacteriófago T7, y el ARN puede
microinyectarse en oocitos de Xenopus para provocar la
expresión del receptor de melanocortina en los oocitos. Estos
oocitos toman después el lugar de las células en el procedimiento
anteriormente descrito.
Una vez se ha identificado una sustancia como
inhibidor de la unión del polipéptido ART a un receptor de
melanocortina, esa sustancia puede ensayarse para determinar si es
también un agonista del receptor de melanocortina. Dicho ensayo
implicaría exponer células que expresan el receptor de melanocortina
a la sustancia en ausencia de proteína ART o polipéptidos ART, y
determinar si el receptor de melanocortina se activa así por la
sustancia. De este modo, puede identificarse un inhibidor de la
unión de la proteína ART a MC3R o MC4R que tiene poca o ninguna
actividad agonista de MC3R o MC4R pero que aplaca la inhibición de
la actividad del receptor MC3R o MC4R producida por la proteína
ART.
La presente invención incluye también un
procedimiento para determinar si una sustancia es un potenciador
alostérico de la unión de un polipéptido ART a un receptor de
melanocortina, en el que el procedimiento comprende:
- (a)
- proporcionar células que expresan un receptor de melanocortina,
- (b)
- exponer las células a un polipéptido ART en presencia y en ausencia de la sustancia en condiciones tales que, si la sustancia no estuviera presente, el polipéptido ART se uniría al receptor de melanocortina;
- (c)
- medir la cantidad de unión del polipéptido ART al receptor de melanocortina en presencia y en ausencia de la sustancia;
en el que un aumento en la cantidad
de unión del polipéptido ART al receptor de melanocortina en
presencia, comparado con en ausencia, de la sustancia indica que la
sustancia es un potenciador alostérico de la unión del polipéptido
ART al receptor de
melanocortina.
En una realización particular, las células que
expresan el receptor de melanocortina son células que expresan
naturalmente el receptor de melanocortina. En otra realización, las
células que expresan el receptor de melanocortina no expresan
naturalmente el receptor de melanocortina, sino que se han
transfectado con un vector de expresión que dirige la expresión del
receptor de melanocortina. Se pretende que la transfección incluya
cualquier procedimiento conocido en la técnica para la introducción
del vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina en las células. Por ejemplo, la transfección incluye
transfección mediada por fosfato de calcio o cloruro de calcio,
lipofección, infección con un constructo retrovírico que contiene el
receptor de melanocortina y electroporación.
En una realización particular, el receptor de
melanocortina se selecciona del grupo constituido por: el receptor
de melanocortina 3 (MC3R) y el receptor de melanocortina 4 (MC4R).
En una realización particular del procedimiento anteriormente
descrito, el receptor de melanocortina no es un receptor de
melanocortina de Xenopus.
Las células que se han transfectado con un
vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina pueden ser células procarióticas o eucarióticas. En
una realización particular, las células que se han transfectado con
un vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina se seleccionan del grupo constituido por: células de
levadura, células de mamífero, células bacterianas y células de
insecto. En una realización particular, las células que se han
transfectado con un vector de expresión que dirige la expresión del
receptor de melanocortina se seleccionan del grupo constituido por:
células humanas, células de ratón, células de rata, células
bovinas, células porcinas, células de hámster y células de mono. En
una realización particular, las células que se han transfectado con
un vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina se seleccionan del grupo constituido por: células L
L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L
L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Rajl (ATCC
CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1
(ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651),
CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3
(ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127l (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26) y
MRC-5 (ATCC CCL 171). En una realización particular,
las células no son células de melanóforo de Xenopus.
En una realización particular, el polipéptido
ART tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
constituido por: las ID SEC Nº 1-19 y 20. En
realizaciones particulares del procedimiento anteriormente descrito,
el polipéptido ART se utiliza en una concentración de 10^{-12} M
a 10^{-7} M.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, el procedimiento se practica in
vitro y las condiciones son condiciones que se utilizan
típicamente en la técnica para el estudio de interacciones
proteína-proteína: por ejemplo, pH fisiológico,
condiciones salinas tales como las representadas por tampones
utilizados habitualmente como PBS o en medios de cultivo de tejido,
una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 55ºC.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, el procedimiento se practica in
vitro y el polipéptido ART está marcado, por ejemplo,
enzimática, radiactivamente o similar, y la cantidad de unión del
polipéptido ART al receptor de melanocortina se mide determinando la
cantidad de marcador unido al receptor de melanocortina.
La etapa (b) del procedimiento anteriormente
descrito puede modificarse en que, en lugar de exponer las células
a un polipéptido ART en presencia y en ausencia de la sustancia,
pueden prepararse membranas a partir de las células y las membranas
pueden exponerse a un polipéptido ART en presencia y en ausencia de
la sustancia. Dicha modificación que utiliza membranas en lugar de
células en procedimientos similares a los descritos anteriormente,
aunque dirigida a las interacciones de unión de otros ligandos y
receptores, es bien conocida en la técnica y se describe, por
ejemplo, en Hess y col., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm.
184: 260-268.
Como modificación adicional del procedimiento
anteriormente descrito, puede prepararse ARN que codifica un
receptor de melanocortina como, por ejemplo, mediante transcripción
in vitro utilizando un plásmido que contiene secuencias
nucleotídicas que codifican el receptor de melanocortina bajo el
control del promotor del bacteriófago T7, y el ARN puede
microinyectarse en oocitos de Xenopus para provocar la
expresión del receptor de melanocortina en los oocitos. Estos
oocitos toman después el lugar de las células en el procedimiento
anteriormente descrito.
Los receptores de melanocortina son receptores
acoplados a proteína G que estimulan G_{a}, conduciendo a la
producción de AMPc (Cone y col., 1996, Recent Prog. Hormone
Res., 51: 287-318). Por tanto, los polipéptidos
ART de la presente invención pueden utilizarse en un procedimiento
para determinar si una sustancia es un inhibidor funcional del
efecto antagonista de un polipéptido ART sobre un receptor de
melanocortina, en el que el procedimiento comprende:
- (a)
- proporcionar células que expresan un receptor de melanocortina;
- (b)
- exponer las células a una hormona estimulante de melanocito, activando así el receptor de melanocortina y conduciendo a la producción de AMPc mediada por el receptor de melanocortina;
- (c)
- exponer las células a un polipéptido ART en presencia y en ausencia de la sustancia en condiciones tales que, si la sustancia no estuviera presente, el polipéptido ART inhibiría la producción de AMPc mediada por el receptor de melanocortina;
- (d)
- medir la cantidad de AMPc producida en presencia y en ausencia de la sustancia;
en el que un aumento en la cantidad
del AMPc producido en presencia, comparado con en ausencia, de la
sustancia indica que la sustancia es un inhibidor funcional del
efecto antagonista del polipéptido ART sobre el receptor de
melanocortina.
En una realización particular, las células que
expresan el receptor de melanocortina son células que expresan
naturalmente el receptor de melanocortina. En otra realización, las
células que expresan el receptor de melanocortina no expresan
naturalmente el receptor de melanocortina, sino que se han
transfectado con un vector de expresión que dirige la expresión del
receptor de melanocortina. Se pretende que la transfección incluya
cualquier procedimiento conocido en la técnica para la introducción
del vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina en las células. Por ejemplo, la transfección incluye
transfección mediada por fosfato de calcio o cloruro de calcio,
lipofección, infección con un constructo retrovírico que contiene el
receptor de melanocortina y electroporación.
En una realización particular, el receptor de
melanocortina se selecciona del grupo constituido por: el receptor
de melanocortina 3 (MC3R) y el receptor de melanocortina 4 (MC4R).
En una realización particular del procedimiento anteriormente
descrito, el receptor de melanocortina no es un receptor de
melanocortina de Xenopus.
Las células que se han transfectado con un
vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina pueden ser células procarióticas o eucarióticas. En
una realización particular, las células que se han transfectado con
un vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina se seleccionan del grupo constituido por: células de
levadura, células de mamífero, células bacterianas y células de
insecto. En una realización particular, las células que se han
transfectado con un vector de expresión que dirige la expresión del
receptor de melanocortina se seleccionan del grupo constituido por:
células humanas, células de ratón, células de rata, células
bovinas, células porcinas, células de hámster y células de mono. En
una realización particular, las células que se han transfectado con
un vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina se seleccionan del grupo constituido por: células L
L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L
L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Rajl (ATCC
CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1
(ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651),
CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3
(ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127l (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26) y
MRC-5 (ATCC CCL 171). En una realización particular,
las células no son células de melanóforo de Xenopus.
En una realización particular, la hormona
estimulante de melanocito se selecciona del grupo constituido por:
hormona estimulante de melanocito \alpha, hormona estimulante de
melanocito \beta y hormona estimulante de melanocito
\gamma.
En una realización particular, el polipéptido
ART tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
constituido por ID SEC Nº 1-19 y 20.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, el procedimiento se practica in
vitro y las condiciones son condiciones que se utilizan
típicamente en la técnica para el estudio de interacciones
proteína-proteína: por ejemplo, pH fisiológico,
condiciones salinas tales como las representadas por tampones
utilizados habitualmente como PBS o en medios de cultivo de tejido,
una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 55ºC.
Una vez se ha identificado una sustancia como
inhibidor funcional del efecto antagonista de un polipéptido ART
sobre un receptor de melanocortina, esa sustancia puede ensayarse
para determinar si es también un agonista del receptor de
melanocortina. Dicho ensayo implicaría exponer células que expresan
el receptor de melanocortina a la sustancia en ausencia de proteína
ART o polipéptidos ART, y determinar si el receptor de melanocortina
se activa así por la sustancia. De este modo, puede desarrollarse
un inhibidor de la unión de la proteína ART a MC3R o MC4R que tiene
poca o ninguna actividad agonista de MC3R o MC4R pero que aplaca la
inhibición de la actividad del receptor MC3R o MC4R producida por
la proteína ART. De manera similar, puede determinarse si la
sustancia es un antagonista del receptor de melanocortina.
Los polipéptidos ART de la presente invención
pueden utilizarse también en un procedimiento de determinación de
si una sustancia es un inhibidor del efecto de un polipéptido ART
que hace uso de un ensayo que utiliza una línea celular de
melanóforo de Xenopus (véase, por ejemplo, Quillan y col.,
1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2894; Potenza &
Lerner, 1992, Pigment Cell Res. 5: 372; Ollman y col., 1997,
Science 278: 135-138). Dicho procedimiento
comprende:
- (a)
- proporcionar una línea celular de melanóforo de Xenopus;
- (b)
- exponer la línea celular de melanóforo de Xenopus a una concentración elegida de una hormona estimulante de melanocito en ausencia del polipéptido ART y en ausencia de la sustancia, y medir la cantidad de dispersión de pigmento para obtener un primer valor de dispersión de pigmento;
- (c)
- exponer la línea celular de melanóforo de Xenopus a la concentración elegida de hormona estimulante de melanocito \alpha en presencia del polipéptido ART y en ausencia de la sustancia, y medir la cantidad de dispersión de pigmento para obtener un segundo valor de dispersión de pigmento, en el que el segundo valor de dispersión de pigmento indica que se ha dispersado menos pigmento en comparación con el primer valor de dispersión de pigmento;
- (d)
- exponer la línea celular de melanóforo de Xenopus a la concentración elegida de hormona estimulante de melanocito \alpha en presencia del polipéptido ART y en presencia de la sustancia, y medir la cantidad de dispersión de pigmento para obtener un tercer valor de dispersión de pigmento;
en el que si el tercer valor de
dispersión de pigmento indica que se ha dispersado más pigmento
comparado con el segundo valor, entonces la sustancia es un
inhibidor del efecto del polipéptido
ART.
En una realización particular, la hormona
estimulante de melanocito se selecciona del grupo constituido por:
hormona estimulante de melanocito \alpha, hormona estimulante de
melanocito \beta y hormona estimulante de melanocito
\gamma.
En una realización particular, el polipéptido
ART tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
constituido por: ID SEC Nº 1-19 y 20.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, las condiciones son condiciones que se
utilizan típicamente en la técnica para el estudio de interacciones
proteína-proteína, por ejemplo: pH fisiológico,
condiciones salinas tales como las representadas por tampones usados
habitualmente tales como PBS o en medios de cultivo de tejido, una
temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 55ºC.
Una vez se ha identificado una sustancia como
inhibidor del efecto de un polipéptido ART, esa sustancia puede
ensayarse para determinar si es también un agonista del receptor de
melanocortina de Xenopus. Dicho ensayo implicaría exponer
células de melanóforo que expresan el receptor de melanocortina de
Xenopus a la sustancia en ausencia de proteína ART o
polipéptidos ART, y determinar si el receptor de melanocortina se
activa así por la sustancia. De este modo, puede identificarse un
inhibidor de la unión de proteína ART al receptor de melanocortina
de Xenopus que puede utilizarse como guía para desarrollar
inhibidores de la unión de ART a MC3R o MC4R humanos que tienen
poca o ninguna actividad agonista de MC3R o MC4R, pero que aplacan
la inhibición de la actividad del receptor MC3R o MC4R producida
por la proteína ART. De manera similar, puede determinarse si la
sustancia es un antagonista del receptor de melanocortina.
La presente invención incluye un procedimiento
de determinación de si una sustancia es un inhibidor de la unión de
un polipéptido ART a un receptor de melanocortina que comprende:
- (a)
- proporcionar células que expresan el receptor de melanocortina;
- (b)
- exponer las células a una concentración elegida de hormona estimulante de melanocito y una concentración elegida del polipéptido ART en presencia y en ausencia de la sustancia, y medir la cantidad de unión de hormona estimulante de melanocito a las células en presencia y en ausencia de la sustancia;
en el que un aumento en la cantidad
de unión de hormona estimulante de melanocito en presencia de la
sustancia indica que la sustancia es un inhibidor de la unión de un
polipéptido ART a un receptor de
melanocortina.
\newpage
En una realización particular, las células que
expresan el receptor de melanocortina son células que expresan
naturalmente el receptor de melanocortina. En otra realización, las
células que expresan el receptor de melanocortina no expresan
naturalmente el receptor de melanocortina, sino que se han
transfectado con un vector de expresión que dirige la expresión del
receptor de melanocortina. Se pretende que la transfección incluya
cualquier procedimiento conocido en la técnica para la introducción
del vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina en las células. Por ejemplo, la transfección incluye
transfección mediada por fosfato de calcio o cloruro de calcio,
lipofección, infección con un constructo retrovírico que contiene el
receptor de melanocortina y electroporación.
En una realización particular, el receptor de
melanocortina se selecciona del grupo constituido por: el receptor
de melanocortina 3 (MC3R) y el receptor de melanocortina 4 (MC4R).
En una realización particular del procedimiento anteriormente
descrito, el receptor de melanocortina no es un receptor de
melanocortina de Xenopus.
Las células que se han transfectado con un
vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina pueden ser células procarióticas o eucarióticas. En
una realización particular, las células que se han transfectado con
un vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina se seleccionan del grupo constituido por: células de
levadura, células de mamífero, células bacterianas y células de
insecto. En una realización particular, las células que se han
transfectado con un vector de expresión que dirige la expresión del
receptor de melanocortina se seleccionan del grupo constituido por:
células humanas, células de ratón, células de rata, células
bovinas, células porcinas, células de hámster y células de mono. En
una realización particular, las células que se han transfectado con
un vector de expresión que dirige la expresión del receptor de
melanocortina se seleccionan del grupo constituido por: células L
L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L
L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Rajl (ATCC
CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1
(ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651),
CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3
(ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127l (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26) y
MRC-5 (ATCC CCL 171). En una realización particular,
las células no son células de melanóforo de Xenopus.
En una realización particular, la hormona
estimulante de melanocito se selecciona del grupo constituido por:
hormona estimulante de melanocito \alpha, hormona estimulante de
melanocito \beta y hormona estimulante de melanocito
\gamma.
En una realización particular, el polipéptido
ART tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
constituido por: ID SEC Nº 1-19 y 20.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, el procedimiento se practica in
vitro y las condiciones en las que se practica el procedimiento
son condiciones que se utilizan típicamente en la técnica para el
estudio de interacciones proteína-proteína: por
ejemplo, pH fisiológico, condiciones salinas tales como las
representadas por tampones utilizados habitualmente como PBS o en
medios de cultivo de tejido, una temperatura de aproximadamente 4ºC
a aproximadamente 55ºC.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, la concentración elegida de la hormona
estimulante de melanocito es de 0,05 nM a 2,0 nM, preferiblemente de
0,1 nM a 1,0 nM, y más preferiblemente de 0,2 nM a 0,5 nM.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, la concentración elegida del polipéptido
ART es de 10^{-12} M a 10^{-7} M.
En realizaciones particulares del procedimiento
anteriormente descrito, el procedimiento se practica in
vitro y la hormona estimulante de melanocito está marcada, por
ejemplo, enzimática, radiactivamente o similar, y la cantidad de
unión de la hormona estimulante de melanocito al receptor de
melanocortina se mide determinando la cantidad de marcador unido a
las células que contienen el receptor de melanocortina.
La etapa (b) del procedimiento anteriormente
descrito puede modificarse en que, en lugar de exponer células
intactas a la hormona estimulante de melanocito, el polipéptido ART
o la sustancia, pueden prepararse membranas a partir de las células
y las membranas pueden exponerse a la hormona estimulante de
melanocito, el polipéptido ART o la sustancia. Dicha modificación
que utiliza membranas en lugar de células intactas en procedimientos
similares a los descritos anteriormente, aunque dirigida a las
interacciones de unión de otros ligandos y receptores, es bien
conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Hess y col.,
1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 184:
260-268.
Como modificación adicional del procedimiento
anteriormente descrito, puede prepararse ARN que codifica el
receptor de melanocortina como, por ejemplo, mediante transcripción
in vitro utilizando un plásmido que contiene secuencias
nucleotídicas que codifican el receptor de melanocortina bajo el
control del promotor del bacteriófago T7, y el ARN puede
microinyectarse en oocitos de Xenopus para provocar la
expresión del receptor de melanocortina en los oocitos. Estos
oocitos toman después el lugar de las células en el procedimiento
anteriormente descrito.
Una vez se ha identificado una sustancia como
inhibidor de la unión del polipéptido ART al receptor de
melanocortina, esa sustancia puede ensayarse para determinar si es
también un agonista del receptor de melanocortina. Dicho ensayo
implicaría exponer células que expresan el receptor de melanocortina
a la sustancia en ausencia de hormona estimulante de melanocito y
proteína ART o polipéptidos ART, y determinar si el receptor de
melanocortina se activa así por la sustancia. De este modo, puede
identificarse un inhibidor del efecto de la proteína ART sobre MC3R
o MC4R que tiene poca o ninguna actividad agonista de MC3R o MC4R
pero que aplaca la inhibición de la actividad del receptor MC3R o
MC4R producida por la proteína ART. De manera similar, puede
determinarse si la sustancia es un antagonista del receptor de
melanocortina.
Comparados con la proteína ART completa, los
polipéptidos ART de la presente invención son menores, y por lo
tanto más fáciles de producir y menos probable que se degraden. Con
respecto a dichas realizaciones de la invención como, por ejemplo,
c-ART-b, las secuencias de
aminoácidos de proteína no ART añadidas a la terminación C de las
secuencias ART no perjudican la unión o la actividad funcional, y
permiten el marcaje con ^{32}P o ^{33}P sin necesidad de marcar
la secuencia de ART. Los polipéptidos de fusión tales como, por
ejemplo, ART-AP o ART-luc, permiten
el uso de procedimientos no radiactivos para detectar polipéptidos
ART en ensayos de unión.
Es sorprendente que los polipéptidos ART de la
presente invención que tienen secuencias de aminoácidos de
proteínas no ART en su terminación C sean funcionales. La
terminación C de la proteína ART es homóloga con la terminación C
de la proteína de agutí, teniendo tanto la proteína ART como la
proteína de agutí un patrón característico de residuos de cisteína
en esta región. Se ha encontrado un patrón similar de residuos de
cisteína en ciertos bloqueantes de canal iónico de toxinas de araña
y caracol. Se ha propuesto que este patrón de cisteínas da como
resultado la formación de puentes disulfuro específicos que limitan
las toxinas a una estructura tridimensional característica que es
responsable de la actividad biológica de las toxinas (Kim y col.,
1995, J. Mol. Biol. 250: 659-671; en
adelante "Kim"). Aunque los aminoácidos
C-terminales extremos de la toxina estudiados por
Kim no eran parte de esta estructura tridimensional, estos
aminoácidos C-terminales extremos eran sin embargo
"crucialmente importantes" puesto que alterarlos daba como
resultado una pérdida de actividad. Véase la página 665, columna
derecha de Kim: "Estos resultados sugieren que el segmento
C-terminal de
\omega-AGA-IVA es crucialmente
importante para su acción de bloqueo sobre el canal de calcio de
tipo P expresado en células de Purkinje cerebelares de rata".
Por tanto, se esperaría que alterar la terminación C de la proteína
ART, por ejemplo, ligándola a secuencias de una proteína no ART,
habría dado como resultado un polipéptido de fusión ART que
carecería de la actividad de la proteína ART completa, o al menos
que mostraría sustancialmente menos actividad. La presente
invención demuestra que no es así.
Se presentan los siguientes ejemplos no
limitantes para mejor ilustrar la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se construyó el plásmido de expresión para
c-ART-b modificando el plásmido de
expresión de ART que se generó insertando el ADNc de ART en los
sitios EcoRI y BamHI de
pcDNA3.1-Myc-His-A
(Fong y col., 1997, Biochem. Biophys. Res. Comm. 237:
629-631; en adelante "Fong"). La secuencia de
c-ART-b difiere de la de ART
recombinante como se describe por Fong en que los residuos
27-75 se eliminaron de ART. Para conseguir esto, se
llevó a cabo una primera PCR utilizando el plásmido de expresión de
ART como molde y dos oligonucleótidos
(GGGCTCGGCGGTCCTGCAGGGCCAAGCCCATCTGGGC (ID SEC Nº 21) y el cebador
T7 TAATACGACT
CACTATAGGG (ID SEC Nº 22)) para amplificar el fragmento de ADN que codifica los restos 1-26 de ART seguido inmediatamente por los restos 76-81. Se llevó a cabo una segunda PCR utilizando el plásmido de expresión de ART como molde y otros dos oligonucleótidos (CTGCAGGACCGCGAGCCC (ID SEC Nº 23) y el cebador pcDNA3.1A GTCGACGGCGCTATTCAG (ID SEC Nº 24)) para amplificar el fragmento de ADN que codifica los restos 76-132 de ART. Se llevó a cabo después una tercera PCR utilizando el primer y segundo productos de PCR como molde y dos oligonucleótidos (el cebador T7 y el cebador pcDNA3.1A) para amplificar el ADNc de c-ART-b. Se escindió el producto PCR final mediante las enzimas de restricción EcoRI y BamHI y se ligó al vector pcDNA3.1-Myc-His-A escindido de forma similar por EcoRI y BamHI. La secuencia del sitio de trombina se basó en el sitio de trombina de pET-34b (Novagen, Milwaukee, WI). La secuencia del epítopo Myc y la secuencia de hexahistidina estaban contenidas en el vector pcDNA3.1-Myc-His-A (Invitrogen, Carlsbad, CA).
CACTATAGGG (ID SEC Nº 22)) para amplificar el fragmento de ADN que codifica los restos 1-26 de ART seguido inmediatamente por los restos 76-81. Se llevó a cabo una segunda PCR utilizando el plásmido de expresión de ART como molde y otros dos oligonucleótidos (CTGCAGGACCGCGAGCCC (ID SEC Nº 23) y el cebador pcDNA3.1A GTCGACGGCGCTATTCAG (ID SEC Nº 24)) para amplificar el fragmento de ADN que codifica los restos 76-132 de ART. Se llevó a cabo después una tercera PCR utilizando el primer y segundo productos de PCR como molde y dos oligonucleótidos (el cebador T7 y el cebador pcDNA3.1A) para amplificar el ADNc de c-ART-b. Se escindió el producto PCR final mediante las enzimas de restricción EcoRI y BamHI y se ligó al vector pcDNA3.1-Myc-His-A escindido de forma similar por EcoRI y BamHI. La secuencia del sitio de trombina se basó en el sitio de trombina de pET-34b (Novagen, Milwaukee, WI). La secuencia del epítopo Myc y la secuencia de hexahistidina estaban contenidas en el vector pcDNA3.1-Myc-His-A (Invitrogen, Carlsbad, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se transfectaron transitoriamente células
COS-7 en matraces T-175 con el
plásmido de expresión c-ART-b (24
\mug) mediante lipofectamina (Gibco), y se hicieron crecer en
medio Opti-mem (Gibco) suplementado con 1% de suero
bovino fetal. Dos días después de la transfección, se recogieron los
medios de cultivo, se centrifugaron para eliminar las células
residuales, se concentraron aproximadamente 100 veces en
Centriprep-3 (Amicon) y se almacenaron a 4ºC en
presencia de EGTA 2,5 mM, leupeptina 4 mg/ml y fosforamidón 0,01 mM.
Después de la determinación de la concentración de
c-ART-b, se añadió NaN_{3} al
0,02%. La determinación de la concentración de
c-ART-b, que contiene la secuencia
Myc, se basó en una curva patrón de ELISA. Brevemente, se recubrió
la placa de microvaloración con 0,2 \mug de un péptido Myc
(c-Myc humano 408-439) durante una
noche, se lavó, se bloqueó y se siguió la incubación con conjugados
mAb-HRP anti-Myc (Invitrogen) en
presencia de concentraciones variables del péptido Myc libre
durante 2 horas. Se detectó el mAb-HRP unido
utilizando el sustrato colorimétrico tetrametilbencidina (BioRad).
Para la determinación de la concentración de
c-ART-b, una muestra de
c-ART-b reemplazó al péptido
Myc
libre.
libre.
\newpage
Ejemplo
3
Se realizaron ensayos de unión de la misma
manera que se describe en Fong y col., 1997, Biochem. Biophys.
Res. Comm. 237: 629-631. Se llevaron a cabo
ensayos de unión utilizando membranas preparadas a partir de células
L o células CHO que expresan establemente MC3R, MC4R o MC5R
humanos. La mezcla de ensayo de unión contenía
^{125}I-[Tyr^{2}]Nle^{4},
D-Phe^{7}]-hormona estimulante de
melanocito \alpha 0,2 nM
(^{125}I-NDP-\alpha-MSH),
concentraciones variables de c-ART o proteína ART
completa y una cantidad apropiada de membranas de modo que el
radioligando unido total fuera menor del 10% del radioligando
añadido. Se incubó la mezcla anterior en tampón de unión (Tris 50
mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, KCl 5 mM, pH 7,2) a
temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de filtración a
través de papel GFC. Se cuantificó el ligando unido en un contador
\gamma. Se calcularon los valores de CI_{50} como se describe
anteriormente (Fong y col., 1996, Mol. Pharmacol. 50:
1605-1611). Se muestran los resultados en la Figura
2. A partir de la Figura 2, puede observarse que
c-ART-b inhibe la unión de
^{125}I-NDP-\alpha-MSH
a MC3R.
Se realizó un experimento similar para
determinar si c-ART-b inhibe la
unión de NDP-\alpha-MSH marcado
con ^{125}I a MC4R. Los resultados se muestran en la Figura 3. A
partir de la Figura 3, puede observarse que
c-ART-b inhibe la unión de
^{125}I-NDP-\alpha-MSH
a hMC4R.
Se realizaron experimentos similares con
proteína ART humana completa. Se realizaron también experimentos
similares con proteína ART completa y con
c-ART-b para el receptor de
melanocortina 5 (MC5R). A partir de estos experimentos, a partir de
los resultados mostrados en las Figuras 2 y 3 y a partir de
experimentos similares, pueden determinarse los siguientes valores
de CI_{50} para la inhibición de la unión de
NDP-\alpha-MSH marcado con
^{125}I a MC3R, MC4R y MC5R por la proteína ART completa y por
c-ART-b.
Los valores de CI_{50} mostrados en la Tabla 1
se dan en nM. Los números entre paréntesis representan el número de
experimentos efectuados. Los resultados mostrados en la Tabla 1
indican que, sorprendentemente,
c-ART-b es esencialmente
funcionalmente equivalente, aunque le falte una cantidad
significativa de secuencia de la terminación N de la proteína ART,
a la proteína ART completa. Además,
c-ART-b es funcional a pesar de
tener una cantidad significativa de secuencias no ART en su
terminación C (un sitio de trombina, un epítopo myc y un marcador
de hexahistidina).
Ejemplo
4
La capacidad de
c-ART-b de inhibir la producción de
AMPc mediante hormona estimulante de melanocito actuando a través
de MC3R o MC4R puede demostrarse preincubando células L que expresan
establemente MC3R o MC4R humanos con
c-ART-b durante 10 minutos, seguido
de incubación con hormona estimulante de melanocito \alpha 20 nM
durante 45 minutos. El tampón de incubación contiene también
disolución salina equilibrada de Earle, HEPES 10 mM, MgCl_{2} 5
mM, BSA 1 mg/ml e IBMX 0,5 mM. Después de la incubación, se lisan
las células hirviendo durante 4 minutos. Se mide la concentración
de AMPc intracelular mediante RIA (Huang y col., 1997, J.
Receptor Signal Transduc. Res. 17: 599-607)
utilizando anticuerpo anti-AMPc y
^{125}I-AMPc como se modifica en el formato de
ensayo de centelleo por proximidad (Amersham).
La presente invención no está limitada en su
alcance por las realizaciones específicas descritas en la presente
memoria. Es más, resultarán evidentes para los expertos en la
materia diversas modificaciones de la invención, además de las
descritas en la presente memoria, a partir de la descripción
anterior.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Merck & Co., Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: REGIÓN C-TERMINAL DE PROTEÍNA DE TRANSCRITO RELACIONADO CON AGUTÍ (ART)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- REMITENTE: Merck & Co., Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: P.O. Box 2000, 126 E. Lincoln Ave.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Rahway
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NJ
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 07065-0900
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Windows
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ para Windows versión 2.0b
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 60/069.747
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 de diciembre de 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Coppola, Joseph A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 38.413
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 20146 PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELÉFONO: 732-594-6734
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TELEFAX: 732-594-4720
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- TÉLEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 121 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 654 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 715 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 83 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 83 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 117 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 620 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 13:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 683 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 605 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 666 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 621 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 684 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 621 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 684 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCTCGGCG GTCCTGCAGG GCCAAGCCCA TCTGGGC
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATACGACT CACTATAGGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCAGGACC GCGAGCCC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGACGGCG CTATTCAG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Merck & Co., Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: REGIÓN C-TERMINAL DE PROTEÍNA DE TRANSCRITO RELACIONADO CON AGUTÍ (ART)
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- REMITENTE: Merck & Co., Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: P.O. Box 2000, 126 E. Lincoln Ave.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Rahway
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NJ
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 07065-0900
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Windows
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ para Windows versión 2.0b
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 60/069.747
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 de diciembre de 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- NOMBRE: Coppola, Joseph A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- NÚMERO DE REGISTRO: 38.413
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 20146 PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELÉFONO: 732-594-6734
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TELEFAX: 732-594-4720
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- TÉLEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 121 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 654 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 715 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 83 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 83 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 117 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 620 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 13:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 683 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 605 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 666 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 621 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 684 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 621 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 684 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xii)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCTCGGCG GTCCTGCAGG GCCAAGCCCA TCTGGGC
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATACGACT CACTATAGGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCAGGACC GCGAGCCC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGACGGCG CTATTCAG
\hfill18
Claims (13)
1. Una proteína de fusión que tiene una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las
ID SEC Nº 1-3, 10-12, 15 y 16.
2. Una secuencia de ADN que codifica la proteína
de fusión de la reivindicación 1.
3. Un procedimiento de determinación de si una
sustancia es un inhibidor de la unión de un polipéptido ART a un
receptor de melanocortina, en el que el procedimiento comprende:
- (a)
- proporcionar células que expresan el receptor de melanocortina;
- (b)
- exponer las células a una concentración elegida de hormona estimulante de melanocito en ausencia del polipéptido ART y en ausencia de la sustancia, y medir la cantidad de unión de hormona estimulante de melanocito a las células para obtener un primer valor de unión de hormona estimulante de melanocito;
- (c)
- exponer las células a la concentración elegida de hormona estimulante de melanocito en presencia de una concentración elegida del polipéptido ART y en ausencia de la sustancia, y medir la cantidad de unión de hormona estimulante de melanocito para obtener un segundo valor de unión de hormona estimulante de melanocito, en el que el segundo valor para unión de hormona estimulante de melanocito indica que ha ocurrido menos unión de hormona estimulante de melanocito en comparación con el primer valor para la unión de hormona estimulante de melanocito;
- (d)
- exponer las células a la concentración elegida de hormona estimulante de melanocito en presencia de la concentración elegida de polipéptido ART y en presencia de la sustancia, y medir la cantidad de unión de hormona estimulante de melanocito para obtener un tercer valor de unión de hormona estimulante de melanocito;
en el que, si el tercer valor de unión de
hormona estimulante de melanocito es mayor que el segundo valor,
entonces la sustancia es un inhibidor de la unión del polipéptido
ART al receptor de melanocortina;
en el que el polipéptido ART es la proteína de
fusión de la reivindicación 1.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que el receptor de melanocortina se selecciona del grupo
constituido por: el receptor de melanocortina 3 (MC3R) y el receptor
de melanocortina 4 (MC4R).
5. Un procedimiento para determinar si una
sustancia es un inhibidor de la unión de un polipéptido ART a un
receptor de melanocortina, en el que el procedimiento comprende:
- (a)
- proporcionar células que expresan un receptor de melanocortina;
- (b)
- exponer las células a un polipéptido ART en presencia y en ausencia de la sustancia en condiciones tales que, si la sustancia no estuviera presente, el polipéptido ART se uniría al receptor de melanocortina;
- (c)
- medir la cantidad de unión del polipéptido ART al receptor de melanocortina en presencia y en ausencia de la sustancia;
en el que una reducción en la cantidad de unión
del polipéptido ART al receptor de melanocortina en presencia,
comparado con en ausencia, de la sustancia indica que la sustancia
es un inhibidor de la unión del polipéptido ART al receptor de
melanocortina;
en el que el polipéptido ART es la proteína de
fusión de la reivindicación 1.
6. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que el receptor de melanocortina se selecciona del grupo
constituido por: el receptor de melanocortina 3 (MC3R) y el receptor
de melanocortina 4 (MC4R).
7. Un procedimiento para determinar si una
sustancia es un potenciador alostérico de la unión de un polipéptido
ART a un receptor de melanocortina, en el que el procedimiento
comprende:
- (a)
- proporcionar células que expresan un receptor de melanocortina,
- (b)
- exponer las células a un polipéptido ART en presencia y en ausencia de la sustancia en condiciones tales que, si la sustancia no estuviera presente, el polipéptido ART se uniría al receptor de melanocortina;
- (c)
- medir la cantidad de unión del polipéptido ART al receptor de melanocortina en presencia y en ausencia de la sustancia;
en el que un aumento en la cantidad de unión
del polipéptido ART al receptor de melanocortina en presencia,
comparado con en ausencia, de la sustancia indica que la sustancia
es un potenciador alostérico de la unión del polipéptido ART al
receptor de melanocortina;
en el que el polipéptido ART es la proteína de
fusión de la reivindicación 1.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en
el que el receptor de melanocortina se selecciona del grupo
constituido por: el receptor de melanocortina 3 (MC3R) y el receptor
de melanocortina 4 (MC4R).
9. Un procedimiento para determinar si una
sustancia es un inhibidor funcional del efecto antagonista de un
polipéptido ART sobre un receptor de melanocortina, en el que el
procedimiento comprende:
- (a)
- proporcionar células que expresan un receptor de melanocortina;
- (b)
- exponer las células a una hormona estimulante de melanocito seleccionada del grupo constituido por: hormona estimulante de melanocito \alpha, hormona estimulante de melanocito \beta y hormona estimulante de melanocito \gamma para activar el receptor de melanocortina, conduciendo a la producción de AMPc;
- (c)
- exponer las células a un polipéptido ART en presencia y en ausencia de la sustancia en condiciones tales que, si la sustancia no estuviera presente, el polipéptido ART inhibiría la producción de AMPc mediada por el receptor de melanocortina;
- (d)
- medir la cantidad de AMPc producida en presencia y en ausencia de la sustancia;
en el que un aumento en la cantidad del AMPc
producido en presencia, comparado con en ausencia, de la sustancia
indica que la sustancia es un inhibidor funcional del efecto
antagonista del polipéptido ART sobre el receptor de
melanocortina;
en el que el polipéptido ART es la proteína de
fusión de la reivindicación 1.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que el receptor de melanocortina se selecciona del grupo
constituido por: el receptor de melanocortina 3 (MC3R) y el receptor
de melanocortina 4 (MC4R).
11. Un procedimiento de determinación de si una
sustancia es un inhibidor del efecto de un polipéptido ART que
comprende:
- (a)
- proporcionar una línea celular de melanóforo de Xenopus;
- (b)
- exponer la línea celular de melanóforo de Xenopus a una concentración elegida de hormona estimulante de melanocito \alpha en ausencia del polipéptido ART y en ausencia de la sustancia, y medir la cantidad de dispersión de pigmento para obtener un primer valor de dispersión de pigmento;
- (c)
- exponer la línea celular de melanóforo de Xenopus a la concentración elegida de hormona estimulante de melanocito \alpha en presencia del polipéptido ART y en ausencia de la sustancia, y medir la cantidad de dispersión de pigmento para obtener un segundo valor de dispersión de pigmento, en el que el segundo valor de dispersión de pigmento indica que se ha dispersado menos pigmento en comparación con el primer valor para dispersión de pigmento;
- (d)
- exponer la línea celular de melanóforo de Xenopus a la concentración elegida de hormona estimulante de melanocito \alpha en presencia del polipéptido ART y en presencia de la sustancia, y medir la cantidad de dispersión de pigmento para obtener un tercer valor de dispersión de pigmento;
en el que si el tercer valor para dispersión de
pigmento indica que se ha dispersado más pigmento comparado con el
segundo valor, entonces la sustancia es un inhibidor del efecto del
polipéptido ART;
en el que el polipéptido ART es la proteína de
fusión de la reivindicación 1.
12. Un procedimiento de determinación de si una
sustancia es un inhibidor de la unión de un polipéptido ART a un
receptor de melanocortina, que comprende:
- (a)
- proporcionar células que expresan el receptor de melanocortina;
- (b)
- exponer las células a una concentración elegida de hormona estimulante de melanocito y una concentración elegida de polipéptido ART en presencia y en ausencia de la sustancia, y medir la cantidad de unión de hormona estimulante de melanocito a las células en presencia y en ausencia de la sustancia;
en el que un aumento en la cantidad de unión a
hormona estimulante de melanocito en presencia o en ausencia de la
sustancia indica que la sustancia es un inhibidor de la unión de un
polipéptido ART a un receptor de melanocortina;
en el que el polipéptido ART es la proteína de
fusión de la reivindicación 1.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que el receptor de melanocortina se selecciona del grupo
constituido por: el receptor de melanocortina 3 (MC3R) y el receptor
de melanocortina 4 (MC4R).
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