ES2288550T3 - Compuestos autoinductores y sus utilizaciones. - Google Patents

Abstract

Aditivo de alimento para animal que comprende uno o más compuestos autoinductores, en el que el compuesto autoinductor es una acil homoserina lactona, una acil homocisteína lactona, una acil tiolactona o un péptido señal.

Description

Compuestos autoinductores y sus utilizaciones.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos autoinductores, también conocidos como moléculas sensibles al quórum, y a sus usos, en particular como aditivos para alimentación animal para mejorar el rendimiento del animal.

Antecedentes de la invención

Se ha observado que las bacterias en cultivos tanto individuales como mixtos tienen posibilidades de obtener una ventaja significativa de la capacidad de coordinar su dinámica de población (Shapiro, 1988). "Sensible a quórum", tal como se conoce este mecanismo, es la capacidad de las bacterias para unir la expresión génica con la densidad de población. Las señales producidas por el organismo se expresan en su medio y tras la señalización de quórum crítico, a continuación se activa un regulador de respuesta. Esto permite que las células individuales interaccionen con otras de su misma o diferente especie. De esta manera, las bacterias pueden coordinar su producción de sustancias químicas de defensa, diferenciación, reproducción y migración.

Hasta el momento, las aplicaciones más estudiadas de los compuestos de señal sensibles a quórum han sido en la preparación de diagnósticos y la estimulación in vitro de compuestos antibióticos en otros casos disponibles de forma transitoria. Ahora se cree que muchas especies bacterianas utilizan este proceso de transducción de señal mediante un rango pequeño de moléculas sencillas que funcionan como autoinductores de virulencia y otras características. La primera molécula que se identificó fue N-(3-oxohexanoil) homoserina lactona (OHHL) como el inductor de bioluminiscencia en Vibrio fisheri en 1981 (Eberhard et al., 1981).

En especies Vibrio, la producción de OHHL depende de la transcripción de genes lux dependientes de la densidad activada por una proteína LuxR. El producto Lex1 se une con LuxR y OHHL para activarse. Esto es pues el proceso de modelo general para la coordinación de varias expresiones de fenotipo. Posteriormente se observó que la OHHL era parte de un grupo de compuestos, las acil homoserina lactosas (AHLs), muchas de ellas (tanto naturales como sintéticas) con capacidad de señalización. Entre otras moléculas que son conocidas por ser señales sensibles a quórum o autoinductores se incluyen varios péptidos, tales como el "péptido de señalización de competencia" en Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae.

De las AHLs, N-(3-hidroxibutanoil) homoserina lactona; N-hexanoil homoserina lactona; N-butanoil homoserina lactona; N-(3-oxooctanoil) homoserina lactona; N-octanoil homoserina lactona; N-(3-oxodecanoil) homoserina lactona; N-octanoil homoserina lactona; 7,8-cis-N-(hidroxitetradecanoil) homoserina lactona y otros análogos también han demostrado que son activas. Otras señales sensibles a quórum son conocidas por ser utilizadas por ciertos organismos incluyendo el éster metílico del ácido 3-hidroxipalmítico.

Las AHLs parecen utilizarse sólo en las bacterias Gram negativa, mientras que las bacterias Gram positiva parecen utilizarse moléculas de tiolactona para la señalización de péptidos y otros fragmentos de oligopéptidos para la señalización celular.

La manipulación de la microbiología del rumen y tripa se ha realizado hasta ahora mediante la utilización de antibióticos, incluyendo antimicrobianos, tales como virginiamicina. En el pasado, se han utilizado muchos tipos diferentes de compuestos naturales y artificiales, incluyendo sulfonamidas, tetraciclinas y penicilina. Su función principal ha sido modificar las poblaciones microbianas del rumen de una manera tal que se reducen las bacterias indeseables y se favorecen las bacterias beneficiosas.

Sin embargo, existe una preocupación creciente sobre las consecuencias a largo plazo de la utilización de estos compuestos en concentraciones subterapéuticas con temores de que la resistencia a estos fármacos puede ahora extenderse.

El complejo trabajo realizado en el retículo del rumen para convertir celulosa, hemicelulosa y ligninas en energía disponible, mientras a la vez se proporciona al animal huésped una fuente continua de proteína, se consigue mediante una comunidad de especies bacterianas. Esta comunidad es intensamente competitiva. Los sistemas del rumen productores bajos en metano que son buenos productores de propionatos son mejoras en el suministro de energía al animal. La optimización del rumen para este fin ha sido el eterno objetivo de fármacos y la intervención nutricional. Por lo tanto, el principal objetivo es maximizar la producción de proteína microbiana y la degradación de compuestos de tipo celulosa/lignina, a la vez que se minimiza los aspectos negativos del crecimiento microbiano no deseado. Los organismos que consumen o degradan proteína e incrementan la producción de metano (que consume energía) no son recíprocos en su relación con el huésped o privan al animal de almidón disponible y, por tanto, se consideran perjudiciales para la fermentación óptima del rumen.

La dificultad en la utilización de aditivos de alimento u otros tratamientos bioactivos es la especificidad, ya que muchas sustancias tienen múltiples efectos en la comunidad microbiana. La reducción de la proteólisis y la actividad de desaminación son parcialmente responsables del aumento de rendimiento del animal. El control de la población microbiana también puede influir positivamente en la producción de ácidos grasos volátiles y reducir la producción de metano. La manipulación combinada de estos parámetros da lugar a un mejor rendimiento del animal, algunas veces por márgenes muy sustanciales.

WO97/27851 (Universidad Johns-Hopkins) describe que el crecimiento de Mycobacteria se puede inhibir a través de la administración de homoserina o una homoserina lactona.

La solicitud sugiere que estos compuestos se utilizan en el diagnóstico y el tratamiento de una infección por M. tuberculosis en humanos.

La Patente de Estados Unidos No. 5.591.872 (Universidad de Iowa) describe que la N-(3-oxododecanoil) homoserina lactona es un autoinductor que regula la expresión génica en Pseudomonas aeruginosa y dice que los análogos o inhibidores de este autoinductor se pueden utilizar en el tratamiento o prevención de una infección por este microorganismo.

WO01/74801 (Universidad de Nottingham) describe una familia de N-acil homoserina lactonas y su utilización como inmunosupresores.

Descripción resumida de la invención

De manera amplia, la presente invención se refiere a la síntesis y utilización de moléculas sensibles a quórum o autoinductores en dietas animales, particularmente en alimentos para rumiantes y animales monogástricos. Los cambios legislativos recientes han hecho que la utilización de la mayoría de antibióticos sea ilegal en muchos países occidentales y se han buscado nuevas soluciones para mejorar la fermentación utilizando más antimicrobianos naturales. Sin embargo, muchos de estos productos naturales tienen registros de eficacia poco fiables y tienen posibilidades de ser examinados por las autoridades reguladoras. Por lo tanto, es deseable un enfoque completamente nuevo a la optimización de la fermentación. La utilización de compuestos autoinductores o señales sensibles al quórum en el alimento para animales tal y como se describe en la presente invención, proporciona una nueva manera de controlar la dinámica de la flora del rumen utilizando los propios compuestos que la población microbiana natural produce.

En la presente invención, los términos "molécula sensible al quórum" y "compuesto autoinductor" se utilizan de manera indistinta. Algunos ejemplos de estos compuestos se indican a continuación.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un aditivo de alimento para animal que comprende uno o más compuestos autoinductores. Opcionalmente, el compuesto autoinductor está mezclado con un portador inerte para darle volumen antes de mezclarse con los ingredientes del alimento del animal, se proporciona como una solución para la administración en forma de brebaje o para pulverizarse sobre el alimento del animal, o se formula en forma de comprimido, de nuevo con un portador inerte. Algunos ejemplos de portadores inertes incluyen talco, sílice y agua.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un alimento para animal que comprende un componente de alimento para animal y uno o más compuestos autoinductores. Algunos ejemplos de componentes de alimento para animal incluyen una o una combinación de proteínas, azúcares, grasas y fibra. Habitualmente, los componentes de alimento para animal provienen de cereales u otro material vegetal.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento no terapéutico de mejora del rendimiento animal que comprende la administración de un compuesto autoinductor al animal.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la utilización de un compuesto autoinductor para la administración a un animal con el objetivo de mejorar el rendimiento del animal.

Algunos ejemplos de compuesto o compuestos autoinductores incluyen acil homoserina lactosas, acil homocisteína lactonas, acil tiolactonas, péptidos señal y furanosas y quinolinas señal, tales como 2-heptil-3-hidroxi-4-quinolina. Preferiblemente, las acil lactosas son acil lactosas C_{1-20}.

Algunos ejemplos de acil homoserina lactonas preferidas incluyen compuestos, tales como N-oxobutanoil homoserina lactona, N-oxopentanoil homoserina lactona, N-oxohexanoil homoserina lactona, N-oxoheptanoil homoserina lactona, N-oxooctanoil homoserina lactona, N-oxononanoil homoserina lactona, N-oxodecanoil homoserina lactona, N-butanoil homoserina lactona, N-pentanoil homoserina lactona, N-hexanoil homoserina lactona, N-heptanoil homoserina lactona, N-octanoil homoserina lactona, N-nonanoil homoserina lactona, N-decanoil homoserina lactona, y 7,8-cis-N-(3-hidroxitetradecanoil) homoserina lactona. Las N-oxoacil homoserina lactonas son preferiblemente N-(3-oxoacil) homoserina lactonas. La síntesis de más ejemplos de acil homoserina lactosas se describe en WO01/74801.

Algunos ejemplos de acil homocisteína lactonas preferidas incluyen compuestos, tales como N-oxobutanoil homocisteína lactona, N-oxopentanoil homocisteína lactona, N-oxohexanoil homocisteína lactona, N-oxoheptanoil homocisteína lactona, N-oxooctanoil homocisteína lactona, N-oxononanoil homocisteína lactona, N-oxodecanoil homocisteína lactona, N-butanoil homocisteína lactona, N-pentanoil homocisteína lactona, N-hexanoil homocisteína lactona, N-heptanoil homocisteína lactona, N-octanoil homocisteína lactona, N-nonanoil homocisteína lactona, y N-decanoil homocisteína lactona.

Algunos ejemplos de acil tiolactonas preferidas incluyen compuestos, tales como N-oxobutanoil tiolactona, N-oxopentanoil tiolactona, N-oxohexanoil tiolactona, N-oxoheptanoil tiolactona, N-oxooctanoil tiolactona, N-oxononanoil tiolactona, N-oxodecanoil tiolactona, N-butanoil tiolactona, N-pentanoil tiolactona, N-hexanoil tiolactona, N-heptanoil tiolactona, N-octanoil tiolactona, N-nonanoil tiolactona, y N-decanoil tiolactona.

En otras realizaciones, los compuestos autoinductores están representados por una de las fórmulas:

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en las que X e Y se seleccionan independientemente entre O, S o NH y Z es una cadena de acilo C_{1} a C_{20} sustituida o no sustituida. La cadena de acilo puede ser ramificada o no ramificada, insaturada, parcialmente saturada o saturada. Algunos ejemplos de sustituyentes de cadena de acilo incluyen sustituyentes ceto, hidroxilo, alquenilo o fenilo. El compuesto autoinductor puede estar parcial o completamente halogenado.

En realizaciones en las que el compuesto autoinductor es quiral, puede estar presente como un enantiómero único o cualquier mezcla de isómeros ópticos.

Además del compuesto autoinductor, el aditivo de alimento para animal o el alimento para animal puede contener otros ingredientes, tales como antibióticos, tales como Tilsina, tetraciclina, gentamicina, batracina-metileno-disalicilato y valnemulina o coccidiostatos, tales como salinomicina.

En la presente invención, el término "mejorar el rendimiento del animal" incluye mejorar la velocidad de crecimiento del animal, mejorar el peso del animal a una determinada edad, mejorar la proporción de conversión de alimento, mejorar el rendimiento o la calidad de un producto producido por o derivado del animal (por ejemplo, carne (por ejemplo, de ganado, aves de corral o pescado), leche de ganado lactante o huevos de aves de corral), todos ellos definidos en relación con animales de control que no se tratan con el compuesto autoinductor. Estas comparaciones pueden ser realizadas fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, la proporción de conversión del alimento se puede calcular en base al alimento consumido/peso total de los animales en una muestra.

Sin pretender estar unido por ninguna teoría específica, los solicitantes creen que la inclusión de compuestos autoinductores en la dieta del animal tiene un efecto beneficioso en las poblaciones de bacterias en el tracto digestivo de los animales. Este efecto puede estar en la regulación de la expresión génica en bacterias de las tripas de los animales in vivo, en la inducción a la producción de tensoactivo por la flora de la tripa, ya que los tensoactivos puede ayudar en la emulsificación del contenido en grasas o lípidos del alimento haciéndolo más fácilmente disponible para el animal, en la inducción de virulencia en las bacterias específicas del fluido del rumen o en la producción de antibióticos mediante bacterias de la tripa monogástrica.

Los compuestos autoinductores se pueden administrar a animales, tales como pájaros, ganado, animales marinos o animales domésticos o de compañía. Entre los ejemplos de estos animales se incluyen aves de corral, vacas, cerdos, ovejas, conejos, caballos, perros y gatos, y peces, por ejemplo, en granjas acuáticas.

Preferiblemente, el autoinductor se administra directa o indirectamente a un animal en una dosis equivalente de 1 a 100.000 nanomoles por tonelada de alimento, más preferiblemente de 100 a 10.000 nanomoles por tonelada de alimento, y aún más preferiblemente aproximadamente 1.000 nanomoles por tonelada de alimento.

El compuesto autoinductor se puede proporcionar al animal mediante un amplio grupo de rutas. Como aditivo de alimento para animal se puede formular como un polvo seco (por ejemplo, para mezclar con alimentos de animales), un líquido (por ejemplo para pulverizar sobre alimentos de animales o agua de bebida para animales), o se puede formular para la aplicación directa en alimentos de animales. Alternativamente, el compuesto autoinductor se puede suministrar premezclado con un alimento para animal o se puede administrar directamente al animal como un suplemento. Adicional o alternativamente, una composición que comprende el compuesto autoinductor puede estar en forma de una cápsula o comprimido, formulada como un brebaje o puede estar en forma de un bolo para la ingestión por un animal. En estas realizaciones, el compuesto autoinductor se puede formular mezclándolo con un portador inerte, por ejemplo, un disolvente, tal como agua o un portador sólido, tal como talco de sílice, para hacer la dosificación más sencilla en el campo.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de fabricación de un alimento para animal, comprendiendo el procedimiento la mezcla de uno o más componentes del alimento para animal con uno o más compuestos autoinductores. El procedimiento puede comprender etapas adicionales en el procesado del alimento, por ejemplo, la granulación.

En algunas realizaciones, los compuestos autoinductores pueden fabricarse mediante técnicas de química sintética. Alternativamente, los compuestos pueden derivar de extractos o concentrados de material vegetal, algas, micótico o bacteriano. Como alternativa adicional, los compuestos autoinductores pueden derivar de organismos modificados genéticamente que sobreexpresan los compuestos autoinductores, de manera natural o porque han sido transformados. Entre los ejemplos de organismos transformados se incluyen bacterias o células vegetales transformadas con ácido nucleico que codifica compuestos autoinductores, tales como el gen o grupo de genes de acil homoserina, homocisteína o tiolactona lactona cintaza o con ácido nucleico que codifica un péptido señal. A continuación, las células huésped transformadas pueden inducirse a expresar el compuesto autoinductor que opcionalmente se puede entonces purificar del cultivo celular y formular tal y como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, un alimento para animal o aditivo de alimento para animal se puede fabricar directamente a partir de las bacterias o las células vegetales, por ejemplo, fabricando un alimento para animal a partir de una planta que ha sido diseñada genéticamente para sobreexpresar uno o más de los compuestos autoinductores.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de compuestos de acil homoserina lactona, comprendiendo el procedimiento el reflujo de amino butirolactona con un compuesto de acetato para producir la acil homoserina lactona. En este procedimiento, preferiblemente el disolvente utilizado es tolueno, xileno o etilbenceno, y más preferiblemente el disolvente es tolueno. Las condiciones de reacción preferidas son el reflujo de la mezcla de reacción a presión atmosférica.

Preferiblemente, el compuesto de acetato es butanoato de etilo, pentanoato de etilo, hexanoato de etilo, heptanoato de etilo, octanoato de etilo, nonanoato de etilo, decanoato de etilo, 3-oxobutanoato de etilo, 3-oxopentanoato de etilo, 3-oxohexanoato de etilo, 3-oxoheptanoato de etilo, 3-oxooctanoato de etilo, 3-oxononanoato de etilo o 3-oxodecanoato de etilo.

El procedimiento puede comprender la etapa adicional de purificación de la acil homoserina lactona producida en la reacción. En una realización, esto se puede conseguir mediante la evaporación del producto, redisolución en metanol al 5% en diclorometano y purificación mediante cromatografía en columna.

A modo de ejemplo y no limitativo, a continuación se describirán las realizaciones de la presente invención con más detalle.

Descripción detallada

Ejemplo 1

Efecto de lactonas alimenticias en la digestión de silos de hierba mediante cultivos de fluido de rumen de vacas fistuladas sanas alimentadas con hierba

Los compuestos autoinductores, tales como acil homoserina lactonas, pueden tener efectos significativos en los cultivos de bacterias. Por ejemplo, se pueden utilizar para inducir la expresión de antibióticos y enzimas extracelulares. La hexanoil homoserina lactona (OHHL) es la molécula señal para la producción de antibióticos en Chromobacterium violaceum; butanoil homoserina lactona desencadena varios fenotipos en la Pseudomonas aeruginosa que incluyen la producción de varias enzimas y lectinas. Se sabe que la OHHL tiene diferentes efectos en diferentes especies. Por ejemplo, en Erwinia stewartii induce la producción de exopolisacáridos, mientras que en la especie Vibro provoca bioluminiscencia. De este modo, en un cultivo mixto complejo que comprende muchas especies incluyendo ruminobacter sp.., prevotella sp., ruminococcus sp., es difícil predecir los fenotipos específicos que se inducirán mediante la introducción de sólo un compuesto autoinductor. Sin embargo, el efecto global en la fermentación del cultivo mixto en el rumen se puede medir en términos de la eficacia de digestión del pienso. En el siguiente ejemplo, un modelo in vitro de la eficacia del rumen de animal revela el efecto neto en la digestión del pienso utilizando fluido de rumen reciente. Se examinan una muestra de control tratada con agua y cuatro muestras de prueba tratadas con concentraciones nanomolares de OHHL.

El fluido de rumen se recogió de una vaca fistulada sana alimentada con hierba e inmediatamente se dispensó en botellas de 75 ml. Estas botellas se mantuvieron a 37ºC. En cada uno de estos cultivos se suspendió aproximadamente 1 gramo de silos de hierba pesada y secada anteriormente en sobres fabricados de gasas de nylon. En este punto se introdujo AHL [OHHL] señal en concentraciones que proporcionaron concentraciones finales en el fluido del rumen de 0, 200, 500 y 1000 nanomoles. A continuación, éstos se incubaron durante 10 horas. A continuación, se extrajeron las muestras de pienso y se volvieron a secar y a pesar. Cada tratamiento se realizó por triplicado.

Los resultados de los experimentos mostraron que aumentando la cantidad de OHHL presente se aumentaba el porcentaje medio de pérdida de peso para cada tratamiento, indicando que la presencia de compuestos autoinductores conduce a una mejor eficacia en la digestión del alimento del animal.

Cuando se añade al alimento, el nivel de inclusión debería incrementarse desde los niveles superiores para permitir pérdidas durante los procesos de extrusión de alimento. Por esta razón, una tasa de inclusión habitual de 5-5000 nanomoles es normalmente suficiente.

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Ejemplo 2

Síntesis de un compuesto autoinductor

Muy pocos de los compuestos AHL están disponibles comercialmente y los protocolos de síntesis en la literatura implican muchas etapas y bajos rendimientos. De este modo, era importante que se perfeccionara una ruta sintética barata que pudiera servir como ruta modelo para todos los compuestos AHL. Se preparó OHHL que es puro por RMN tal y como se indica a continuación.

A una mezcla agitada de \alpha-amino-\gamma-butirolactona (1,0 eq.) en tolueno (\sim 5 ml/por mmol) se añadió gota a gota trietilamina (1,0 eq.). A continuación, la mezcla se agitó durante 10 minutos. Se añadió gota a gota acetato de etilbutirilo (1,0 eq.) y la mezcla se puso a reflujo durante 2 horas. La mezcla se dejó enfriar y, a continuación, se filtró y se evaporó. La cromatografía en columna con metanol al 5% en diclorometano produce el compuesto con un rendimiento global superior al 30%.

El análisis por RMN confirmó la presencia de OHHL:

Cabezal 5 mm H^{1}; AQ 1,9923444 s; TE 300,00 K 1D RMN parámetros de dibujo: cx 40,0 cm; F1P 10,5 ppm; F2P - 0,500 ppm; 110,03576 Hz/cm

Valores \delta de RMN para OHHL:

7,609 ppm; 4,525 ppm; 4,412 ppm; 4,20 ppm; 3,402 ppm; 2,677 ppm; 2,45 ppm; 2,16 ppm; 1,56 ppm; 0,844 ppm.

Se sabe que los AHLs están presente en el rumen (Erickson et al., 2000). La cromatografía en capa fina de fase inversa del fluido del rumen reveló la presencia de señales "múltiples".

Por lo tanto, está claro que muchas de las especies bacterianas ya poseen una ventaja competitiva de los mecanismos sensibles al quórum.

Tal y como se ha descrito, los compuestos de señales sintéticos se pueden introducir en el rumen en pequeñas dosis a través del alimento del animal para mejorar la eficacia del rumen y, por lo tanto, mejorar el rendimiento del animal. Se sabe que las señales de lactona múltiples regulan la determinantes de virulencia en especies, tales como Pseudomonas sp.. Las quinolonas, tales como 2-heptil-3-hidroxi-4-quinolina también son moléculas señales activas y también se pueden utilizar para mejorar la nutrición y salud del animal.

Las combinaciones de los compuestos AHL se pueden utilizar para manipular adicionalmente los sucesos en el rumen, pero las formulaciones exactas en el alimento dependerán necesariamente de la especie y del alimento en cuestión. Se pueden utilizar la escucha de señales cuando se analizan las señales del rumen optimizado de una vaca que a continuación se reproducen artificialmente y se introducen en otra opción. De forma similar, en monogástricos, las señales sensibles al quórum se pueden utilizar para estimular la producción de antibióticos por la flora de la tripa. Adicionalmente, utilizando esta tecnología también se pueden inducir otros productos bacterianos beneficiosos, tales como enzimas y tensoactivos.

Se pueden utilizar análogos inactivos de moléculas señal para interferir competitivamente con el proceso de señalización ("atasco de señal"). En este escenario, se puede impedir la transcripción de, por ejemplo, genes de virulencia de bacterias de la tripa perjudiciales, y se puede mitigar el daño patogénico. La mejora posterior en la salud del animal contribuirá de este modo al rendimiento general del animal. Puede ser posible recoger moléculas señal de los cultivos en la fermentación in vitro y se pueden preparar mediante manipulación genética péptidos señal (habitualmente las señales sensibles a quórum para bacterias Gram positiva), por ejemplo, para permitir la sobreexpresión de péptidos, tales como los oligopéptidos utilizados por Enterococcus faecilis.

Ejemplo 3

Efecto de lactonas alimenticias en la tasa de crecimiento y la mortalidad de pollos parrilleros desarrollados en corrales en piso Materiales y procedimientos

Este experimento examinó el efecto de N-(3-oxohexanoil)-L-homoserina lactona (OHHL) (CAS #: 143537626, fórmula molecular: C_{10}H_{15}NO_{4}, peso molecular: 213) en la tasa de crecimiento y mortalidad de pollos parrilleros.

Se preparó una solución madre de 1 mM de OHHL (0,213 g/l) tal y como se indica a continuación. Se calentó aproximadamente un 50% del volumen requerido de agua destilada hasta aproximadamente 30-40ºC y se utilizó para disolver la cantidad requerida de polvo de OHHL. La solución se llevó a volumen utilizando agua destilada almacenada a temperatura ambiente. La solución de OHHL (0,213 g/l) se aplicó a alimento desmenuzado tratado a una razón de 3 kg por tonelada. El alimento de control se trató con agua destilada a razón de 3 kg por tonelada. La solución de OHHL se almacenó durante menos de dos días antes de aplicarla al alimento.

El antibiótico BMD®110 se utilizó como control positivo en este estudio. El principio activo es disalicilato metileno de bacitracina. El producto contiene 110 g de actividad de bacitracina por kg y está aprobada para la prevención de enteritis necrótica en pollos parrilleros cuando se administra en una dosis de 55 ppm en el alimento (500 g de BMD®110/tonelada de alimento).

Se utilizó una premezcla al 6% de Coxistac® como ionóforo en todas las dietas de estudio como ayuda en la prevención de la coxidiosis. El producto contenía 60 g de salinomicina por kg y se administró en una dosis de 60 ppm en el alimento (1 kg de premezcla al 6% de Coxistac® por tonelada de alimento).

El experimentó duró 35 días considerando el día de colocación de los pollos parrilleros como día cero. Se asignaron para tratamiento un total de 1200 pollos parrilleros machos (Cobb x Cobb). Las aves se vacunaron para la enfermedad de Marek en el criadero. Se asignaron a los grupos de tratamiento veinticuatro corrales, cada uno con 45 pies cuadrados de espacio del piso. Cada corral tenía un piso concreto y una barrera concreta de 12 pulgadas de alto en la parte frontal y posterior. Los corrales adyacentes se separaron mediante una barrera de plástico sólida de 12 pulgadas a nivel de ave. Se colocó una valla de alambre soldado con aberturas cuadradas de 1 pulgada en la parte superior de las barreras. Cada corral se identificó permanentemente por un número y contenía 50 aves en el día cero. Cada corral contenía cuatro bebedores de tipo tetina que proporcionaban agua de beber limpia ad libitum. El alimento seco se proporcionó ad libitum en comederos de tipo tubo (uno por corral) de 20 kg de capacidad.

El establo se calentó mediante cinco calentadores de gas natural que estaban espaciados por igual y estaban colocados para calentar el aire entrante en la pared norte del edificio. El aire se agotaba mediante ventiladores colocados en la pared sur del edificio. El programa de iluminación, temperatura del establo y otras prácticas de infraestructura eran las habituales de los productores de pollos parrilleros comerciales en Norteamérica. Las aves que estaban moribundas y eran incapaces de alcanzar la comida o el agua se seleccionaron y sacrificaron mediante gas dióxido de carbono.

El peso corporal, el número de corrales y la fecha de la muerte se registraron para cada ave que se había seleccionado o hallado muerto. Las tablas de mortalidad se entregaron al patólogo para determinar la causa aparente de la muerte.

Se utilizó un diseño al azar de bloques completos para estudiar los efectos principales e interactivos de OHHL (0 y 0,639 g/tonelada) y el antibiótico alimenticio (0 y 55 ppm de BMD®110) en una disposición factorial de 2x2. Los tratamientos alimenticios fueron los siguientes.

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Había cuatro corrales por bloque y seis bloques replicados para un total de 24 corrales.

El programa de alimentación se utilizó en el estudio utilizando un tipo de alimentación de entrada en los días 0 a 20 y un tipo de alimentación de crecimiento en los días 21 a 35. La formulación de la dieta era representativa de las dietas comerciales en Norteamérica.

Se fabricó, se granuló y se desmenuzó una dieta de entrada que utilizaba una mezcla básica de dieta de entrada que contenía 0 o bien 55 ppm de BMD. El alimento de entrada envasado se trató con agua destilada (0 g de OHHL por L) o bien solución de OHHL (0,213 g de OHHL por L) utilizando un mezclador de doble brazo horizontal de 100 kg de capacidad. El agua destilada o la solución de OHHL (0,213 g por L) se aplicó al alimento desmenuzado a razón de 3 kg por tonelada de alimento. Las dietas de crecimiento se fabricaron tal y como se ha descritos para las de entrada.

Muestreo del alimento y ensayo: se tomaron un mínimo de 10 muestras representativas de cada lote de alimento de entrada y de crecimiento basal desmenuzado. Las 10 muestras se compusieron y se dividieron en dos muestras para el ensayo de nutrientes y la muestra de retención, respectivamente. Se tomó una muestra compuesta representativa de cada alimento de control y de cada alimento tratado con OHHL. Las muestras por duplicado (analítica y de retención) se guardaron congeladas a -20ºC para el ensayo retrospectivo de OHHL. Se analizó la materia seca, la proteína cruda, el calcio, fósforo y manganeso de una muestra de cada alimento basal desmenuzado.

Los datos recogidos consistían en:

1. Peso corporal en los días 0, 21 y 35.

2. Cantidades de cada alimento (entrada y de crecimiento) consumido.

3. Peso corporal y fecha de la muerte para aves que se seleccionaron o murieron.

4. La proporción de conversión de los alimentos se calculó sobre una base de corral como alimento consumido/[peso total de aves vivas + peso total de aves muertas y seleccionadas + peso total de aves sacrificadas].

5. El peso corporal medio por corral se calculó como el peso total de aves vivas en el momento del pesado/número de aves vivas en el momento del pesado.

6. La ingesta diaria de alimento por ave se calculó sobre una base de corral para los periodos de entrada y de crecimiento como el alimento total consumido dividido por el número de días con aves vivas en el periodo especificado.

7. La causa aparente de la muerte se registró para todas las aves que murieron o se seleccionaron.

8. Se observaron las aves en un grupo base como mínimo una vez diaria y se registraron las observaciones.

9. Causa de la muerte.

Análisis estadístico

El corral fue la unidad experimental para el análisis estadístico. Los datos de mortalidad se transformaron utilizando una transformación de arcseno (Steel y Torrie, 1980) antes del análisis de la varianza. Todos los datos se analizaron mediante el análisis de la varianza utilizando el siguiente modelo:

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Las medias se compararon utilizando un test de variaciones múltiples adecuado (Steel y Torrie, Principles and procedures of statistics, a biometrical approach. McGraw Hill Book Co., NY., 1980).

Resultados y discusión

La administración alimenticia de OHHL mejoró significativamente (P=0,024) el peso corporal de los pollos parrilleros en el día 21 (Tabla 1). No hubo un efecto significativo del BMD alimenticio en el peso corporal.

La administración de OHHL mejoró la eficacia del alimento de parrilleros en el día 21 (P = 0,012) y para el período global de los días 0-35 (P = 0,055). El BMD alimenticio también mejoró la eficacia del alimento para el periodo de los días 21-35 (P < 0,001) y el periodo global de crecimiento (P = 0,014).

Hubo un efecto de interacción OHHL x BMD significativo para la eficacia del alimento durante el periodo de entrada. Sin embargo, esto es atribuible a una baja eficacia del alimento que recibió sólo BMD en el periodo de entrada (eficacia del alimento = 1,422). La respuesta de la eficacia del alimento a OHHL en combinación con BMD era ligeramente superior a la de la respuesta a OHHL solo.

Morbidad y mortalidad

En el presente estudio se utilizaron desperdicios viejos en un intento por crear una estimulación sustancial de las enfermedades. Sin embargo, la mortalidad global fue muy baja en comparación con las normas comerciales del 4 al 5%. En ausencia de BMD, la OHHL redujo la mortalidad desde un 2,0% a un 1,7%. En presencia de BMD, OHHL redujo la mortalidad desde un 3,3% hasta un 2,7% (Tabla 2).

Estos cambios numéricos en la mortalidad no son estadísticamente significativos pero proporcionan una evidencia preliminar de que la administración continua de OHHL no tenía un efecto adverso en la supervivencia del ave.

Los pesos corporales finales y los datos de eficacia del alimento también sugieren un excelente rendimiento de crecimiento y una morbidad del grupo mínima.

A todos los cuerpos muertos se les realizó una necropsia y no se hallaron evidencias de efectos inusuales o adversos de los fármacos en el estudio.

Conclusiones

La administración continua de OHHL a pollos parrilleros mejoró el Día 21 el peso corporal (P = 0,024) y la eficacia global del alimento (P = 0,055).

La mortalidad de los parrilleros tratados con OHHL fue numéricamente inferior que los controles no tratados con OHHL ambos en presencia y ausencia de BMD alimenticio.

No hubo evidencia de ningún efecto adverso de la OHHL en la salud de las aves.

Ejemplo 4

Efecto de lactonas alimenticias en la desaparición de materia seca en el rumen de oveja Materiales y procedimientos

Este experimento examinó el efecto de N-(3-oxohexanoil)-L-homoserina lactona (OHHL) (CAS # 143537626, fórmula molecular: C_{10}H_{15}NO_{4}, peso molecular: 213) en la desaparición in vivo de materia seca en el rumen de oveja.

Se preparó una solución madre de OHHL (0,639 g/l). Se calentó aproximadamente un 50% del volumen requerido de agua destilada hasta aproximadamente 30-40ºC y se utilizó para disolver la cantidad requerida de polvo de OHHL. El matraz volumétrico se llevó a volumen utilizando agua destilada almacenada a temperatura ambiente. La solución de OHHL se aplicó a una ración granulada de las ovejas a una razón de 3 kg por tonelada de alimento. El alimento de control se trató con 3 kg de agua destilada por tonelada.

Se utilizaron un mezclador por cargas y un dispositivo de pulverización adecuado para asegurar la aplicación uniforme de líquido en el alimento. El alimento de control se fabricó primero para evitar la contaminación cruzada con OHHL. Se anticipó que la ración de las ovejas comprendería aproximadamente un tercio del total de la ingesta de materia seca de los animales de estudio en base a una ingesta de materia seca estimada del 2% en peso corporal.

Los intentos iniciales para administrar OHHL mediante la aplicación de una solución acuosa a la parte externa del alimento granulado se modificaron a medida que las ovejas disminuyeron la ingesta de alimento tratado después de varios días. En cambio, la OHHL se administró como un brebaje oral dos veces diarias comenzando en la tarde del Día 11 de cada periodo.

Los animales se acorralaron individualmente para minimizar el daño potencial para la canulación y permitir la alimentación individual. Se proporcionó agua fresca ad libitum.

Se proporcionó una cantidad limitada de ración granulada a razón de aproximadamente 0,5 kg/día (0,25 kg por la mañana y 0,25 kg por la tarde). El acceso al heno se restringió según era necesario para ayudar a asegurar que la ración de las ovejas se había consumido.

En los Días 12 y 13, la ración granulada (0,25 kg/animal) se administró a animales aproximadamente 1 hora antes de la introducción de bolsas en el rumen y de nuevo tras la extracción de la bolsa de 8 horas de cada animal.

Se secó una muestra nueva de silos de maíz hasta peso constante y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente. Se tomó una submuestra representativa para la determinación de la materia seca. La muestra de molió para que pasara por una malla de 1 mm, se mezcló y se muestreó para el ensayo de materia seca. La muestra restante se almacenó para una determinación in situ de la desaparición de materia seca del rumen de la oveja canulada.

En este estudio se utilizaron bolsas de muestreo para el rumen Ankom. Cada bolsa era aproximadamente de 5 cm x 10 cm, adecuada para una muestra de un gramo. El tamaño de poro era de 52 +/- micras. Se pesaron silos de maíz secos y molidos (1,00 +/- 0,01 gramos) en bolsas y se sellaron. Se preparó un grupo de cuatro bolsas por animal por día y se unieron a una cuerda para facilitar la colocación y extracción del rumen. Una quinta bolsa servía como blanco para cada grupo de cuatro bolsas. El blanco no se colocaba en el rumen pero se lavaba, se procesaba y se secaba.

Se colocó quirúrgicamente una cánula en el rumen en cada una de las cinco ovejas (aproximadamente de 3 años de vida). Tras la recuperación de la cirugía, se seleccionaron cuatro de estos animales para utilizar en el estudio. El quinto animal sirvió como reserva para utilizar en el caso de complicaciones post-quirúrgicas en un animal de estudio.

La desaparición de materia seca se midió mediante la extracción de bolsas del rumen a las 4, 8, 12 y 24 horas y se lavaron con agua corriente del grifo fría junto con una correspondiente bolsa de blanco. A continuación, las bolsas se secaron hasta peso constante. La medición de la desaparición de materia seca se completó para cada animal comenzando en la mañana del Día 12 y Día 13 de cada periodo.

Se utilizó un Diseño de Cuadrado Latino para estudiar los efectos de los dos tratamientos:

A: Control: 0 gramos de OHHL por tonelada de ración

B: Tratado con el equivalente de 1,917 gramos de OHHL por tonelada de ración

Cada periodo fue de 14 días de duración. Se pusieron en bloques un total de cuatro animales de estudio en base al peso corporal (2 bloques). A los animales del bloque se les asignó al azar la Secuencia 1 ó 2.

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4

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Análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante un análisis de regresión múltiple que incluía los efectos del tratamiento, animal, periodo, día de estudio y hora.

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Salud Animal

En el Periodo 1, antes de la medición de la desaparición in situ de materia seca, se extrajo una oveja tratada con OHHL del estudio debido a su escaso apetito y se sustituyó por un animal de reserva. El animal sustituido se sacrificó, se le hizo la necropsia y se observó que tenía un absceso hepático desarrollado antes del experimento.

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Desaparición de materia seca

Hubo un efecto significativamente elevado (P<0,0001) del tiempo de incubación en el rumen sobre la desaparición de materia seca, tal y como ya se esperaba. Después de 4 y 24 horas de incubación, aproximadamente un 50% y un 75% de la materia seca había desaparecido de las bolsas Ankom (Tabla 1). La desaparición de materia seca se midió en dos días consecutivos en cada periodo, pero no hubo un efecto significativo (P = 0,97) del día sobre esta variable.

Los promedios de los tratamientos se resumen en las Tablas 3 y 4. La OHHL mejoró (P = 0,105, Tabla 2) la desaparición de materia seca promedio en 1,77 unidades porcentuales. La magnitud de la respuesta variaba considerablemente con los tiempos de incubación, pero esto es en gran parte un reflejo de la variación inherente de dichas medidas.

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Conclusiones

El experimento muestra que la administración de OHHL mejoró (P = 0,105) la desaparición de materia seca del silo de maíz en el rumen de oveja.

TABLA 1 Efectos de OHHL y BMD en el peso corporal y la ingesta de alimentos de pollos parrilleros

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TABLA 2 Efectos de OHHL y BMD en la eficacia del alimento de pollos parrilleros

7

TABLA 3 Efecto de OHHL en la desaparición de materia seca, %

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TABLA 4 Importancia de las variables independientes para la predicción de desaparición de materia seca

9

Referencias

Las referencias mencionadas en la presente invención están todas incorporadas expresamente por referencia.

1.- Shapiro, Bacteria as multicellular organisms, Scientific American 246: 82-89, 1988.

2.- Eberhard et al., Structural identification of autoinducer of photobacterium fisheri luciferase, Biochemistry, 20: 2444-2449, 1981.

3.- Reprod. Nutr. Dev., 40: 189-202, 2000.

4.- Erickson et al., Reprod. Nutr. Dev., 189-202, 2000.

5.- WO01/74801 (Universidad de Nottingham).

Claims (27)

1. Aditivo de alimento para animal que comprende uno o más compuestos autoinductores, en el que el compuesto autoinductor es una acil homoserina lactona, una acil homocisteína lactona, una acil tiolactona o un péptido señal.

2. Aditivo de alimento para animal según la reivindicación 1, en el que el compuesto autoinductor está mezclado con un portador inerte.

3. Alimento para animal que comprende un componente de alimento para animal y uno o más compuestos autoinductores, en el que el compuesto autoinductor es una acil homoserina lactosa, una acil homocisteína lactona, una acil tiolactona o un péptido señal.

4. Alimento para animal según la reivindicación 3, en el que el componente de alimento para animal comprende una o más proteínas, azúcares, grasas o fibras.

5. Alimento para animal según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que los componentes del alimento para animal derivan de cereales u otro material vegetal.

6. Alimento para animal o aditivo de alimento para animal según la reivindicación 6, en los que el compuesto autoinductor es N-oxobutanoil homoserina lactona, N-oxopentanoil homoserina lactona, N-oxohexanoil homoserina lactona, N-oxoheptanoil homoserina lactona, N-oxooctanoil homoserina lactona, N-oxononanoil homoserina lactona, N-oxodecanoil homoserina lactona, N-butanoil homoserina lactona, N-pentanoil homoserina lactona, N-hexanoil homoserina lactona, N-heptanoil homoserina lactona, N-octanoil homoserina lactona, N-nonanoil homoserina lactona, N-decanoil homoserina lactona, N-oxobutanoil homocisteína lactona, N-oxopentanoil homocisteína lactona, N-oxohexanoil homocisteína lactona, N-oxoheptanoil homocisteína lactona, N-oxooctanoil homocisteína lactona, N-oxononanoil homocisteína lactona, N-oxodecanoil homocisteína lactona, N-butanoil homocisteína lactona, N-pentanoil homocisteína lactona, N-hexanoil homocisteína lactona, N-heptanoil homocisteína lactona, N-octanoil homocisteína lactona, N-nonanoil homocisteína lactona, N-decanoil homocisteína lactona, 7,8-cis-N-(3-hidroxitetradecanoil) homoserina lactona, N-oxobutanoil tiolactona, N-oxopentanoil tiolactona, N-oxohexanoil tiolactona, N-oxoheptanoil tiolactona, N-oxooctanoil tiolactona, N-oxononanoil tiolactona, N-oxodecanoil tiolactona, N-butanoil tiolactona, N-pentanoil tiolactona, N-hexanoil tiolactona, N-heptanoil tiolactona, N-octanoil tiolactona, N-nonanoil tiolactona, o N-decanoil tiolactona.

7. Alimento para animal o aditivo de alimento para animal según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que el compuesto inductor está representado por una de las fórmulas:

10

en las que X e Y se seleccionan independientemente entre O, S o NH y Z es una cadena de acilo C_{1} a C_{20} sustituida o no sustituida.

8. Procedimiento no terapéutico de mejora del rendimiento de un animal que comprende la administración de un alimento para animal o aditivo de alimento para animal, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, al animal.

9. Utilización de un alimento para animal o aditivo de alimento para animal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la administración a un animal con el objetivo de mejorar el rendimiento de un animal.

10. Procedimiento o utilización según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en los que la mejora del rendimiento de un animal comprende la mejora de la tasa de crecimiento del animal, la mejora del peso del animal a una edad determinada, la mejora de la proporción de conversión del alimento, la mejora del rendimiento o la calidad de un producto producido por o derivado del animal.

11. Procedimiento o utilización según la reivindicación 10, en los que el producto producido o derivado del animal es huevos, leche o carne.

12. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en los que el alimento para el animal o el aditivo del alimento se administra a aves, ganado, animales domésticos o de compañía o animales marinos.

13. Procedimiento o utilización según la reivindicación 12, en los que los animales son aves de corral, vacas, cerdos, ovejas, conejos, caballos, perros, gatos o peces.

14. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en los que el autoinductor se administra al animal en una dosis equivalente de 1 a 100.000 nanomoles por tonelada de alimento.

15. Procedimiento o utilización según la reivindicación 14 en los que el autoinductor se administra al animal en una dosis equivalente de 100 a 10.000 nanomoles por tonelada de alimento.

16. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en los que el compuesto autoinductor se formula como polvo, un líquido, una cápsula o comprimido, un brebaje o un bolo.

17. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, en los que el compuesto autoinductor se obtiene de material vegetal, algas, micótico o bacteriano.

18. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 17, en los que el compuesto autoinductor se obtiene mediante la transformación de un microorganismo o una célula vegetal, de manera que se sobreexpresa el compuesto autoinductor.

19. Procedimiento o utilización según la reivindicación 18, en los que el compuesto autoinductor se produce en una planta transformada que alimenta al animal o se utiliza en la fabricación del alimento para animal o el aditivo del alimento para animal.

20. Procedimiento de fabricación de un alimento para animal según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, comprendiendo el procedimiento la mezcla de uno o más componentes de alimento para animal con uno o más compuestos autoinductores, donde el compuesto autoinductor es una acil homoserina lactosa, una acil homocisteína lactona, una acil tiolactona o un péptido señal.

21. Procedimiento según la reivindicación 19 o la reivindicación 20, que comprende además la granulación del alimento para animal.

22. Procedimiento de producción de un compuesto acil homoserina lactona, comprendiendo el procedimiento el reflujo de una amino butirolactona con un compuesto acetato para producir la acil homoserina lactona.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que el disolvente es tolueno, xileno o etilbenceno.

24. Procedimiento según la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en el que la reacción se lleva a cabo mediante el reflujo de la mezcla de reacción a presión atmosférica.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que el compuesto acetato es butanoato de etilo, pentanoato de etilo, hexanoato de etilo, heptanoato de etilo, octanoato de etilo, nonanoato de etilo, decanoato de etilo, 3-oxobutanoato de etilo, 3-oxopentanoato de etilo, 3-oxohexanoato de etilo, 3-oxoheptanoato de etilo, 3-oxooctanoato de etilo, 3-oxononanoato de etilo o 3-oxodecanoato de etilo.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 25, que comprende además la etapa adicional de purificación de la acil homoserina lactona.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que la acil homoserina lactona se purifica mediante la evaporación del producto, redisolución en metanol al 5% en diclorometano y purificación mediante cromatografía en columna.