ES2288429B2

ES2288429B2 - Procedimiento de modificacion quimica de superficies polimericas destinadas a la inmovilizacion de moleculas.

Info

Publication number: ES2288429B2
Application number: ES200601802A
Authority: ES
Inventors: Angel Maquieria Catala; Rosa Puchades Pla; Maria Jose Bañuls Polo; Francisco Garcia Piñon
Original assignee: Universidad Politecnica de Valencia
Current assignee: Universidad Politecnica de Valencia
Priority date: 2006-06-28
Filing date: 2006-06-28
Publication date: 2009-10-13
Anticipated expiration: 2026-06-28
Also published as: US8236367B2; ES2288429A1; WO2008000866A1; US20090181442A1

Abstract

Procedimiento de modificación química de superficies poliméricas destinadas a la inmovilización de moléculas.

El procedimiento comprende la modificación química de una superficie polimérica, opcionalmente metalizada, por ejemplo, una superficie de policarbonato o una superficie de polimetacrilato funcionalizada con grupos amino, opcionalmente metalizadas, por tratamiento de dicha superficie polimérica con un ácido mercaptoalcanoico, sus sales o derivados. Las superficies derivatizadas según dicho procedimiento pueden ser utilizadas como soportes sólidos para inmovilizar biomoléculas, tales como ácidos nucleicos, proteínas o membranas.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para la modificación química de superficies poliméricas a base de policarbonato o polimetacrilato, opcionalmente metalizadas; dichas superficies pueden ser utilizadas como soportes sólidos para inmovilizar biomoléculas, tales como ácidos nucleicos o proteínas.

Antecedentes de la invención

La tecnología de micromatrices (microarrays), basada en la interacción receptor-analito, está reemplazando a los ensayos tradicionales que utilizan geles, filtros y columnas, por chips de vidrio capaces de almacenar decenas de miles de sondas (secuencias de ácidos nucleicos), proteínas, etc., que proporcionan información sobre los niveles de expresión génica, síntesis de proteínas, polimorfismos de nucleótido único (single nucleotide polymorphisms o SNPs), etc.

Las superficies empleadas para microarrays deben ser, ventajosamente, planas y uniformes, de modo que permitan el anclaje de un elevado número (e.g., centenares o miles) de moléculas (sondas, proteínas, etc.) espacialmente dispuestas. La detección y cuantificación de resultados se efectúa mediante fluorescencia o colorimetría, y, en menor medida, por espectroscopia de masas, utilizando para ello moléculas funcionalizadas con un marcador adecuado. Los marcadores más frecuentes son fluoróforos con longitudes de onda de excitación próximas a 450 nm y emisiones entre 500 nm y 800 nm.

Debido a su transparencia óptica, baja autofluorescencia, propiedades químicas, estabilidad térmica y precio, el vidrio es el material de referencia empleado como soporte en esta tecnología. Mediante modificación química, vía silanización, se pueden introducir grupos funcionales específicos tales como grupos amino, epóxidos, ácidos carboxílicos o aldehídos (Cheung, VG. y col., Nature Genetics (suppl), 1999, 21, 15-19; Zammatteo, N. y col., J. Analyt. Biochem., 2000, 283, 143-150), que permiten el anclaje covalente de oligonucleótidos o moléculas de ADN de cadena sencilla (ssDNA) para su posterior análisis.

No obstante, el gran interés en el estudio de nuevos soportes y el gran mercado que existe en este área de trabajo, han conducido a la búsqueda de nuevos materiales alternativos. De todos ellos, los materiales poliméricos sintéticos presentan propiedades químicas y mecánicas muy atractivas, buen precio, alta flexibilidad y biocompatibilidad, y buenas propiedades ópticas y mecánicas, así como una fácil fabricación. Además, pueden utilizarse como soportes interactivos ya que aumentan la capacidad de trabajo al poder incorporar el tratamiento de la muestra y la detección de los resultados. Asimismo, pueden utilizarse técnicas de detección diferentes a la fluorescencia que hacen más rápidos y sencillos los ensayos. Por todo ello, los materiales poliméricos se han convertido en una alternativa al vidrio para la fabricación de microarrays.

Por otro lado, el desarrollo de sistemas microelectromecánicos para bioensayos (BioMEMS) centra muchas de sus aplicaciones en la Genómica y en la Proteómica. Este tipo de dispositivos integra la realización de ensayos químicos con la preparación de la muestra y su detección (lectura de resultados). Para su fabricación se emplean materiales poliméricos sintéticos (e.g., policarbonatos, polimetacrilatos, poliestirenos, poliamidas, polisiloxanos, etc.) o materiales naturales (silicio, óxido de silicio, etc.) procedentes, estos últimos, de la industria electrónica, en general.

Los discos compactos de audio/vídeo (CDs) constituyen una prometedora plataforma para la construcción de este tipo de dispositivos (EP 1189062; Kido, H. y col., Analytica Chimica Acta, 2000, 411, 1-11). Un CD estándar se compone de una base de policarbonato donde se imprime la información, recubierta de una capa metálica de aluminio, níquel, oro o plata, o bien de una capa de un colorante fotorreactivo, protegida por una capa de polimetacrilato. Entre las ventajas que presentan los CDs como soportes para microarrays destacan la gran superficie disponible, una baja fluorescencia de fondo, el empleo de materiales de alta calidad óptica y mecánica en su fabricación, su bajo precio y su fácil manipulación. Asimismo, dichos soportes permiten la organización espacial cuadrática, circular o espiral de las sondas y proteínas impresas, ofreciendo información numérica para identificar cada punto, existiendo la posibilidad de utilizar una de las caras del CD para la realización de los ensayos bioquímicos y su detección, y la contraria para grabar la información, leyendo en todos los casos los resultados mediante lectores de CDs modificados (US 6395562 y W02003/087827). Lo mencionado previamente podría aplicarse a DVDs puesto que su composición es igual a la de los CDs.

La modificación química de superficies de polímeros, dirigida a poner a punto soportes para ensayos químicos, está todavía poco desarrollada. Este área de trabajo se ha abordado empleando diferentes estrategias; las técnicas más empleadas se basan en el tratamiento de plasma, llama, descarga eléctrica, grabado superficial, reacción química y deposición de vapor (Chan. CM., Polymer Surface Modification and Characterization, 1993, Munich:Hansen).

Existen trabajos que describen modificaciones superficiales de distintos tipos de polímeros (US2002/0197467). Se ha estudiado la modificación superficial de polimetacrilato de metilo mediante aminolisis del éster metílico con amiduro de litio en diaminas alifáticas y su aplicación en dispositivos para microfluidos (Soper, S.A. y col., Analytica Chimica Acta, 2002, 470, 87-99; Anal. Chem., 2003, 75, 2975-84). Existen también otros ejemplos de modificación superficial de polimetacrilato de metilo basados en la reducción de los grupos éster y posterior tratamiento con diferentes organosilanos (Cheng J-Y., y col., Sensors & Actuators B99, 2004, 186-96). Un inconveniente de estos métodos radica en la necesidad de trabajar con disolventes orgánicos que modifican las propiedades del plástico.

También se han descrito métodos de modificación superficial para el policarbonato. La mayoría de ellos utiliza la oxidación/sulfonación de los anillos o bien la hidrólisis del carbonato (e.g., W099/35499, EPO487854). Sin embargo, estos métodos son poco eficaces.

A pesar de los diferentes procedimientos para la modificación de superficies descritos en el estado de la técnica, existe todavía una gran necesidad de diseñar métodos alternativos de modificación química de polímeros que permitan proporcionar superficies con las propiedades deseadas manteniendo inalteradas las propiedades ópticas y mecánicas del polímero original.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento alternativo para la modificación química de superficies poliméricas a base de policarbonato (PC) o de polimetacrilato (PMMA), opcionalmente metalizadas, mediante el empleo de unos reactivos concretos que permiten desarrollar unos protocolos de derivatización sencillos y rápidos, que proporcionan unas superficies homogéneas, manteniendo al máximo las propiedades ópticas y mecánicas del soporte o superficie derivatizada. Estas características son claves para su posterior aplicación en dispositivos electromecánicos dirigidos al anclaje covalente de biomoléculas, por ejemplo, sondas de ácidos nucleicos, proteínas, membranas, etc., en ensayos genómicos o proteómicos, entre otros. En concreto, la invención permite la inmovilización covalente de las mencionadas biomoléculas sobre dichas superficies poliméricas modificadas con grupos terminales tiol, a través de enlaces disulfuro, o sobre dichas superficies poliméricas, recubiertas con una capa metálica, modificadas con grupos terminales ácido, a través de enlaces amida o éster.

Por tanto, un aspecto de la presente invención se relaciona con un procedimiento para la modificación química de una superficie polimérica, opcionalmente metalizada, seleccionada entre (i) una superficie de PC funcionalizada con grupos amino primarios o con moléculas que comprenden grupos amino primarios terminales, (ii) una superficie de PMMA funcionalizada con moléculas que comprenden grupos amino primarios terminales, (iii) una superficie de PC recubierta con una capa metálica, y (iv) una superficie de PMMA recubierta con una capa metálica, que comprende someter dicha superficie polimérica, opcionalmente metalizada, a tratamiento con un ácido mercaptoalcanoico, sus sales o derivados.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la modificación química de una superficie de PMMA que comprende:

a): hacer reaccionar dicha superficie de PMMA con un agente reductor, en presencia de ciclohexano como disolvente, para proporcionar grupos alcohol; y, a continuación,

b): hacer reaccionar el producto resultante de la etapa a) con un organosilano que comprende un grupo tiol terminal en una disolución alcohólica.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un soporte sólido que comprende una superficie de PC o de PMMA, opcionalmente metalizada, modificada químicamente según cualquiera de los procedimientos proporcionados por esta invención, mencionados previamente. Dicho soporte sólido puede ser utilizado para inmovilizar biomoléculas.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un soporte sólido que comprende una superficie de PC o de PMMA, opcionalmente metalizada, modificada químicamente según cualquiera de los procedimientos proporcionados por esta invención, mencionados previamente, sobre el que se ha fijado, al menos, una biomolécula. En una realización particular, sobre dicho soporte sólido, tratado según el procedimiento de modificación de superficies proporcionado por esta invención, se fijan una pluralidad de biomoléculas en un orden y disposición establecidos constituyendo un array o un microarray.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la inmovilización (anclaje) de biomoléculas en un soporte sólido que comprende poner en contacto dicho soporte sólido que comprende una superficie de PC o de PMMA, opcionalmente metalizada, modificada químicamente según cualquiera de los procedimientos proporcionados por esta invención, mencionados previamente, con, al menos, una biomolécula.

Descripción detallada de la invención

Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se expone el significado de algunos términos y expresiones tal como aquí se utilizan.

El término "superficie de policarbonato (PC)" se refiere a una superficie constituida total o parcialmente por PC; en una realización particular, dicha superficie polimérica de PC es una superficie constituida por PC, dimensional, lisa o sustancialmente plana, y uniforme, susceptible de ser modificada a través de sus anillos aromáticos.

El término "superficie de polimetacrilato (PMMA)" se refiere a una superficie constituida total o parcialmente por PMMA; en una realización particular, dicha superficie polimérica de PMMA es una superficie constituida por PMMA, dimensional, lisa o sustancialmente plana, y uniforme, susceptible de ser modificada a través de sus grupos éster.

Los términos "superficie de PC recubierta con una capa metálica" y "superficie de PMMA recubierta con una capa metálica" se refieren, respectivamente, a una superficie de PC o de PMMA sobre la que se ha depositado una lámina constituida por un material metálico susceptible de reaccionar con compuestos que comprenden grupos tiol terminales.

El término "superficie de PC funcionalizada con grupos amino" se refiere a una superficie de PC en la que se han introducido grupos amino (-NH_{2}) como sustituyentes en la estructura aromática del PC.

El término "superficie de PC funcionalizada con moléculas que comprenden grupos amino primarios terminales" se refiere a una superficie de PC en la que se ha introducido una molécula que comprende un grupo amino (-NH_{2}) terminal en la estructura aromática del PC.

El término "superficie de PMMA funcionalizada con moléculas que comprenden grupos amino primarios terminales" se refiere a una superficie de PMMA en la que se ha introducido una molécula que comprende un grupo amino (-NH_{2}) terminal, a través del grupo éster que compone la estructura del PMMA.

El término "biomolécula" incluye, en general, a toda aquella sustancia molecular originariamente de los seres vivos, que también puede haber sido sintetizada o modificada, parcial o totalmente, por el hombre. Este término incluye ácidos nucleicos, proteínas, sustancias que pueden ser utilizadas en reconocimiento molecular, membranas u otros fragmentos celulares de origen natural o sintético, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de tales biomoléculas incluyen ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos, receptores moleculares, enzimas, hidratos de carbono, membranas celulares (citoplasmática, nuclear, de otros orgánulos celulares, etc.) y otros fragmentos celulares de origen natural o sintético.

El término "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de nucleótidos, natural o sintética, e.g., DNA, gDNA, cDNA, RNA, etc.; en una realización particular, dicho ácido nucleico es una sonda.

El término "proteína" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no covalentes. El término incluye todas las formas de modificaciones post-traduccionales, e.g., glicosilación, fosforilación, acetilación, etc. Asimismo, dicho término incluye proteínas que ejercen unas funciones determinadas, e.g., anticuerpos, enzimas, receptores moleculares, etc.

Las siglas EDC, DCC, NHS y NHSS corresponden a los siguientes compuestos:

: EDC: 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida;

: DCC: diciclohexilcarbodiimida;

: NHS: N-hidroxisuccinimida;

: NHSS: sulfa-N-hidroxisuccinimida

En un aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento, en adelante procedimiento de la invención, para la modificación química de una superficie polimérica, opcionalmente metalizada, seleccionada entre (i) una superficie de PC funcionalizada con grupos amino primarios o con moléculas que comprenden grupos amino primarios terminales, (ii) una superficie de PMMA funcionalizada con moléculas que comprenden grupos amino primarios terminales, (iii) una superficie de PC recubierta con una capa metálica, y (iv) una superficie de PMMA recubierta con una capa metálica, que comprende hacer reaccionar dicha superficie polimérica, opcionalmente metalizada, con un ácido mercaptoalcanoico de fórmula (I)

(I)HS-(CH_{2})_{n}-COOH

donde n es un número entero comprendido entre 3 y 11;

sus sales o derivados.

El término "sales" tal como aquí se utiliza incluye cualquier sal del ácido mercaptoalcanoico de fórmula (I), por ejemplo, aunque sin limitarse a, sales metálicas. El empleo de dichas sales permitiría una interacción electrostática con los grupos NH_{3}^{+} eventualmente presentes en una biomolécula.

El término "derivado" tal como aquí se utiliza incluye cualquier compuesto que se transforma en dicho ácido mercaptoalcanoico de fórmula (I) mediante hidrólisis, por ejemplo, un éster, un haluro de ácido, un anhídrido de ácido, una amida o un nitrilo. El empleo de anhídridos y haluros de ácido facilitaría la formación de la amida mientras que el empleo de ésteres requeriria, en general, hidrolizarlos previamente, por ejemplo, con amidas.

Resultará evidente para un experto en la materia que, prácticamente, cualquier sal o derivado del ácido mercaptoalcanoico de fórmula (I) que no resulte perjudicial para la reacción implicada puede ser utilizado para la puesta en práctica de la invención.

En una realización particular, el procedimiento de la invención comprende el empleo de una superficie de PC funcionalizada con grupos amino. La funcionalización de superficies de PC con grupos amino primarios se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento conocido por un experto en la materia que permita la introducción de grupos aminos en la estructura aromática del PC. En una realización particular, dicha funcionalización se puede realizar mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

(i): nitración de los anillos aromáticos que constituyen la estructura del PC; y

(ii): reducción de los grupos nitro introducidos en la etapa (i) para obtener los grupos amino referidos.

La etapa (i) [nitración] puede llevarse a cabo, en general, haciendo reaccionar dicha superficie de PC con ácido nítrico, mientras que en la etapa (ii) [reducción] los grupos nitro introducidos en la etapa (i) son reducidos mediante el empleo de un agente reductor apropiado, en un disolvente adecuado. Prácticamente cualquier agente reductor capaz de reducir el grupo nitro a un grupo amino puede utilizarse; no obstante, en una realización particular, dicho agente reductor es un hidruro metálico, un derivado de boro, etc., tal como NaBH_{4}, LiAlH_{4}, BH_{3}-THF, DIBAH, Red-Al, etc. Como disolvente puede utilizarse cualquier disolvente inerte apropiado, por ejemplo, un alcohol. En una realización particular, la reducción de los grupos nitro se lleva a cabo utilizando NaBH_{4} en etanol.

En otra realización particular, el procedimiento de la invención comprende el empleo de una superficie de PC funcionalizada con moléculas que comprenden grupos amino primarios terminales. La funcionalización de superficies de PC con moléculas que comprenden un grupo amino terminal se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento conocido por un experto en la materia que permita la introducción en la estructura aromática del PC de una molécula con un grupo amino terminal. En una realización particular, dicha funcionalización se lleva a cabo mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

a): clorometilación de los anillos aromáticos que componen la estructura del PC; y

b): sustitución nucleófila de los grupos cloruro presentes tras la etapa a) por reacción con una diamina alifática.

La clorometilación [etapa a)] se puede llevar a cabo haciendo reaccionar dicha superficie de PC con un agente clorometilante. Prácticamente cualquier agente clorometilante, es decir, capaz de proporcionar grupos clorometilo como sustituyente de los anillos aromáticos del PC puede ser utilizado, por ejemplo, clorometil metil éter/cloruro de zinc, clorometil metil éter/SnCl_{4}, clorometil metil éter/H_{2}SO_{4} fumante, clorometil metil éter/TiCl_{4}, paraformaldehído/ZnCl/HCl, cloruro de metoxi-acetilo/AlCl_{3}, cloruro de metoxiacetilo/SnCl_{4}, etc. La reacción de sustitución nucleófila permite sustituir los grupos cloruro introducidos en la etapa a) por uno de los grupos amino de la diamina alifática, permaneciendo el otro grupo amino como grupo amino terminal de la molécula. Prácticamente cualquier diamina alifática puede ser utilizada; no obstante, en una realización particular, dicha diamina alifática es etilendiamina. Otras diaminas alifáticas que pueden ser utilizadas son propilendiamina o hexaetilendiamina, aunque, como se ha mencionado previamente, cualquier compuesto con estructura de diamina alifática podría ser utilizado.

Una vez que las superficies de PC están funcionalizadas con grupos amino o con moléculas que comprenden un grupo amino terminal, dichas superficies se someten a un proceso de modificación química mediante tratamiento de las mismas con una disolución acuosa de un ácido mercaptoalcanoico de fórmula (I), sus sales o derivados, con el fin de introducir grupos tiol en dichas superficies (tiolización) y obtener una superficie de PC con grupos tiol terminales. En una realización particular, el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre el ácido 3-mercaptopropiónico (n=3) y el ácido 11-mercaptoundecanoico (n=11). Esta reacción de tiolización se lleva a cabo, ventajosamente, en presencia de un agente de acoplamiento que actúa como compuesto activador del grupo ácido para formar la amida, por ejemplo, EDC/NHS, EDC/NHSS, DCC/NHS, etc.

El Esquema 1 muestra un esquema sintético representativo de las diferentes etapas que conducen a la obtención de superficies de PC funcionalizadas con grupos tiol terminales según una realización particular de la presente invención.

\newpage

Esquema 1

1

En otra realización particular, el procedimiento de la invención comprende el empleo de una superficie de PMMA funcionalizada con moléculas que comprenden grupos amino primarios terminales. La funcionalización de superficies de PMMA con moléculas que comprenden grupos amino terminales se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento conocido por un experto en la materia que permita introducir, en la estructura del PMMA, una molécula con un grupo amino terminal a través del grupo éster. En una realización particular, dicha funcionalización se lleva a cabo mediante aminación reductora de los grupos metil éster del PMMA con una diamina alifática. Aunque prácticamente cualquier diamina alifática puede ser utilizada, en una realización particular, dicha diamina alifática es etilendiamina, propilendiamina o hexaetilendiamina, aunque virtualmente cualquier compuesto con estructura de diamina alifática podría ser utilizado.

Una vez que las superficies de PMMA están funcionalizadas con moléculas que comprenden grupos amino primarios terminales, la modificación química de dichas superficies se realiza mediante tratamiento de las mismas con una disolución acuosa de un ácido mercaptoalcanoico de fórmula (I), sus sales o derivados, con lo que se obtiene una superficie de PMMA funcionalizada con grupos tiol terminales. En una realización particular, el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre el ácido 3-mercaptopropiónico (n=3) y el ácido 1l-mercaptoundecanoico (n=11). Ventajosamente, dicha reacción se lleva a cabo en presencia agentes de acoplamiento que actúan como compuestos activadores de ácido, tales como EDC NHS, EDC/NHSS, DCC/NHS, etc.

El Esquema 2 muestra un esquema sintético representativo de las etapas que conducen a la obtención de superficies de PMMA funcionalizadas con grupos tiol terminales según una realización particular de la presente invención.

Esquema 2

2

La presencia de los grupos tiol terminales en las superficies funcionalizadas de PC y PMMA puede comprobarse empleando diferentes ensayos para la detección cualitativa en síntesis en fase sólida (Ellmann's test; Qualitative colorimetric tests for SPS (Solid Phase Sínthesis) "Methods in enzymology", Vo1369, 2003, 21-35), así como mediante técnicas de ATR-FTIR (Alternated Total Reflectance, Fourier Transform Infrared), EPS (Electron Dispersion Spectroscopy), fluorescencia y medida del ángulo de contacto. Los resultados indican que se consigue la derivatización buscada con buen rendimiento en todos los casos, asumiéndose, en general, que la reacción es lo suficientemente efectiva como para generar una densidad de grupos tiol adecuada para asegurar el anclaje covalente de las biomoléculas. Además, la superficie tratada muestra un grado de homogeneidad aceptable.

La presencia de los grupos tiol permite la inmovilización covalente posterior de biomoléculas, tales como ácidos nucleicos (e.g., sondas) o proteínas, a través de enlaces disulfuro.

Las superficies de PC, o de PMMA, recubiertas con una capa metálica son superficies de PC, o de PMMA, sobre las que se ha depositado una capa de un material metálico. Dicha capa de material metálico puede ser depositada mediante cualquier técnica conocida por un experto en la materia, por ejemplo, mediante electrodeposición. En una realización particular, dicha capa metálica que recubre la superficie de PC o de PMMA es una capa de oro. El espesor de la capa metálica puede variar dentro de un amplio intervalo, típicamente entre 100 y 125 nm.

La modificación química de las superficies de PC y PMMA recubiertas con dicha capa metálica se puede llevar a cabo sumergiendo dichas superficies, inmediatamente después de la deposición de la capa metálica, en una disolución alcohólica de dicho ácido mercaptoalcanoico de fórmula (I), sus sales o derivados, con el fin de formar una monocapa orgánica. En una realización particular, dicha disolución alcohólica es una disolución etanólica y el ácido mercaptoalcanoico de fórmula (I) empleado es el ácido 11-mercaptoundecanoico. A continuación, se activan los grupos ácido formados en la superficie metalizada mediante la adición de SDC/NHS, EDC/NHSS o DCC/NHS, lo que permite el posterior anclaje de las biomoléculas a través de sus grupos amino o hidroxilo, formándose un enlace amida o un éster, respectivamente.

El Esquema 3 muestra un esquema sintético representativo de las etapas que conducen a la obtención de superficies de PC o PMMA metalizadas funcionalizadas con grupos ácido según un procedimiento de la presente invención:

Esquema 3

3

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la modificación química de superficies de PMMA que permite la derivatización de dichas superficies con grupos tiol. Dicho procedimiento comprende, inicialmente, el tratamiento de la superficie de PMMA con un agente reductor adecuado, tal como un hidruro metálico, por ejemplo, hidruro de litio y aluminio, borohidruro de litio, etc o un reactivo de Grignard como bromuro de metil magnesio, en un disolvente apropiado, por ejemplo, ciclohexano, de manera que los grupos éster se reducen a grupos alcohol. El uso de ciclohexano como disolvente parece tener gran importancia, dado que permite que tenga lugar la reacción de reducción sin provocar el hinchamiento, deformación o pérdida de transparencia del polímero como lo ocasionan otros disolventes comúnmente empleados en el estado de la técnica, tales como el éter etílico.

Una vez que los grupos éster han sido reducidos, a continuación se efectúa un tratamiento de la superficie con una disolución alcohólica de un organosilano que comprende un grupo tiol terminal de fórmula (II)

(II)HS-(CH_{2})_{m}-Si-(OR)_{3}

donde

R es metilo o etilo; y

m es un número entero comprendido entre 1 y 11.

En una realización particular, el compuesto de fórmula (II) utilizado es (3-mercaptopropil)-trimetoxisilano [HS(CH_{2})_{3}Si(OCH_{3})_{3}] en isopropanol.

El Esquema 4 muestra un esquema sintético representativo de las etapas que conducen a la obtención de superficies de PMMA funcionalizadas con grupos tiol según una realización particular de la presente invención:

\newpage

Esquema 4

4

La presencia de los grupos tiol, tal como se ha mencionado previamente, permite la inmovilización covalente posterior de biomoléculas, e.g., ácidos nucleicos o proteínas, a través de enlaces disulfuro.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un soporte sólido, en adelante soporte sólido funcionalizado de la invención, que comprende una superficie de PC o una superficie de PMMA, opcionalmente metalizada, modificada químicamente según el procedimiento de la invención. El soporte sólido funcionalizado de la invención puede obtenerse a partir de cualquier soporte sólido cuya superficie esté compuesta total o parcialmente por PC o por PMMA, opcionalmente recubierta por una capa metálica. Ventajosamente, dicho soporte sólido funcionalizado permitirá, además, la penetración y reflexión de un haz de luminoso, por ejemplo, un haz de radiación láser, para la detección y lectura de los datos registrados sobre dicho soporte. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos soportes sólidos incluyen chips de PC, chips de PMMA, chips de PC recubiertos con una capa metálica, chips de PMMA recubiertos con una capa metálica, discos compactos de audio, discos compactos de vídeo, discos compactos de audio-vídeo, discos grabables o regrabables del tipo CD, CD-ROM, CR o DVD, que permiten almacenar los datos que pueden ser posteriormente leídos a través de un dispositivo lector mediante penetración y reflexión de un haz luminoso. En una realización particular, dicho soporte sólido es un CD regrabable cuya superficie está recubierta con un recubrimiento de oro. En general, un CD presenta un espesor de 1,2 mm aproximadamente y un diámetro de 120 mm aproximadamente, aunque existen también soportes sólidos más pequeños que pueden adaptarse para aplicaciones específicas. El espesor se puede adaptar según los requerimientos técnicos del soporte a funcionalizar, de la biomolécula a inmovilizar y del método de detección empleado. Así, existen discos comerciales de 6 y de 3 cm de diámetro y en formato rectangular, igual a las tarjetas de crédito. En cuanto a espesor, se pueden utilizar de 1 y de 0,6 mm siendo los primeros de los más divulgados.

Sobre dicho soporte sólido funcionalizado de la invención pueden inmovilizarse una o más biomoléculas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un soporte sólido funcionalizado de la invención que comprende, además, una o más biomoléculas inmovilizadas sobre dicho soporte sólido funcionalizado de la invención. En una realización particular, dicho soporte sólido funcionalizado de la invención comprende una única biomolécula inmovilizada sobre el mismo, mientras que, en otra realización particular, dicho soporte sólido funcionalizado de la invención comprende una pluralidad de biomoléculas inmovilizadas sobre el mismo. Así pues, el número de biomoléculas a inmovilizar puede variar desde una a decenas de miles según el ensayo, la densidad de inmovilización, y el modo de inmovilización.

En una realización particular, dicha biomolécula es una sonda de ácido nucleico, tal como una sonda de ADN o una sonda de RNA (ribosonda) En otra realización particular, dicha biomolécula es una proteína o un anticuerpo o cualquier sustancia que pueda utilizarse bajo el principio de reconocimiento molecular (receptores moleculares, enzimas, hidratos de carbono, etc.).

En una realización particular, dicho soporte sólido comprende una superficie de PC o una superficie de PMMA, opcionalmente metalizada, modificada químicamente según el procedimiento de la invención, que comprende una biomolécula. En una realización particular y ventajosa, dicho soporte permite, además, la penetración y reflexión de un haz de luminoso, por ejemplo, un haz de radiación láser, para la detección y lectura de los datos registrados sobre dicho soporte. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos soportes sólidos incluyen chips de PC, chips de PMMA, chips de PC recubiertos con una capa metálica, chips de PMMA recubiertos con una capa metálica, discos compactos de audio, discos compactos de vídeo, discos compactos de audio-vídeo, discos grabables o regrabables del tipo CD, CD-ROM, CR o DVD, que permiten almacenar los datos que pueden ser posteriormente leídos a través de un dispositivo lector mediante penetración y reflexión de un haz luminoso. En una realización particular, dicho soporte sólido es un CD regrabable cuya superficie está recubierta con un recubrimiento de oro. En general, un CD presenta un espesor de 1,2 mm y un diámetro de 120 mm, aunque existen también soportes sólidos más pequeños que pueden adaptarse para aplicaciones específicas. El espesor se puede adaptar según los requerimientos técnicos de la biomolécula a inmovilizar y el método de detección empleado.

En una realización particular, dicha biomolécula es una sonda de ácido nucleico y sobre el soporte sólido funcionalizado de la invención pueden inmovilizarse covalentemente, por métodos convencionales, una sonda o una pluralidad de sondas. Dichas sondas de ácido nucleico corresponden a fragmentos de material genético seleccionado entre secuencias de oligonucleótidos, ADN genómico (gDNA), ADN complementario (ADNc), que pueden ser naturales o sintéticos, aunque no se limitan exclusivamente a ellos. Las sustancias problema, complementarias de las sondas, generalmente estarán marcadas para su detección directa o indirecta. En una realización particular, dichas sondas se encuentran marcadas con una enzima (e.g., fosfatasa alcalina, peroxidasa, etc.), con un isótopo radiactivo (e.g., ^{33}P, ^{125}I, etc.), con un fluorocromo (e.g., fluoresceína, etc.), o bien con partículas metálicas para su detección directa mediante colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografia respectivamente; o, alternativamente, con un miembro de un par de unión (e.g., biotina, digoxigenina, etc.) y a la muestra se le añade el otro miembro del par de unión conjugado con un fluorocromo o con una enzima para su detección indirecta mediante fluorimetria, (quimio)luminiscencia, etc.

En otra realización particular, dicha biomolécula es una proteína (e.g., una proteína estructural, un anticuerpo, una enzima, un receptor molecular, etc.) y sobre el soporte sólido funcionalizado de la invención pueden inmovilizarse covalentemente, por métodos convencionales, una proteína o una pluralidad de proteínas. Dichas proteínas generalmente estarán marcadas para su detección directa o indirecta. En una realización particular de la invención, dichas proteínas están unidas a un fluorocromo, o a un miembro de un par de unión y a la muestra se le añade el otro miembro del par de unión conjugado con una enzima, o con un fluorocromo, etc., para su detección por métodos colorimétricos o fluorimétricos análogos a los descritos en el párrafo anterior.

En otra realización particular, dicha biomolécula es una membrana celular, tal como una membrana plasmática, una membrana nuclear o una membrana de cualquier orgánulo celular, y sobre el soporte sólido funcionalizado de la invención pueden inmovilizarse covalentemente, por métodos convencionales, una membrana o una pluralidad de membranas celulares. Dichas membrana pueden estar marcadas para su detección directa o indirecta por métodos convencionales.

Dicho soporte sólido funcionalizado de la invención puede ser utilizado, por tanto, como soporte para un array o para un microarray de biomoléculas constituyendo, de ese modo, una matriz bidimensional sobre la que se inmovilizan las biomoléculas deseadas en un orden y disposición establecidos. Dicho array o microarray de biomoléculas permite, entre otras aplicaciones, el análisis comparativo y simultáneo de la expresión de numerosos genes en un sólo experimento, etc.

Las biomoléculas pueden inmovilizarse sobre el soporte sólido funcionalizado de la invención por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un soporte sólido funcionalizado de la invención para la inmovilización de biomoléculas.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la inmovilización de biomoléculas en un soporte sólido que comprende poner en contacto dicho soporte sólido funcionalizado de la invención con una biomolécula. La inmovilización de dichas biomoléculas se puede llevar a cabo mediante condiciones convencionales bien conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al., 9.31-9.58 en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, New Cork (1989)]. Dichas biomoléculas contienen, bien de forma natural o bien mediante un procedimiento de modificación, un grupo químico funcional (amino, sulfhidrilo, aldehído, etc.), que permite su unión e inmovilización sobre la superficie de PC o de PMMA, opcionalmente metalizada, modificada químicamente mediante el procedimiento de la invención. La inmovilización de las biomoléculas a dichas superficies poliméricas modificadas se produce mediante enlace covalente con formación de puentes disulfuro en el caso de utilizar superficies de PC o de PMMA modificadas con grupos tiol. En el caso de utilizar superficies de PC o de PMMA recubiertas con una capa metálica y modificadas con grupos ácido, la inmovilización de las biomoléculas se produce mediante enlace covalente con formación de grupos amido o éster, dependiendo de si la biomolécula se fija a través de un grupo amino o a través de un grupo alcohol.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Modificación química de una superficie de policarbonato (PC)

El procedimiento comprende dos etapas, una primera etapa de aminación, que puede llevarse a cabo según dos métodos diferentes (Métodos A y B), y una segunda etapa de tiolización.

Etapa 1

Aminación

Método A: Nitración + reducción

Chips de policarbonato (es decir, chips cuyas superficies eran de policarbonato) fueron sumergidos en una disolución acuosa de ácido nítrico al 30% durante 1 hora a 80ºC. Durante el proceso se observó un cambio de color de sustancia incolora a amarillo. Los chips fueron lavados con abundante agua destilada. Con la finalidad de reducir los grupos nitro, los chips fueron sumergidos en una disolución etanólica al 10% de NaBH_{4}, y se dejaron durante 16 horas a temperatura ambiente. Finalmente fueron lavados primero con etanol y después con agua destilada.

Método B: Clorometilación

En un matraz de fondo redondo con los chips de policarbonato sumergidos en ciclohexano (80 ml), fueron introducidos 2 g de ZnCl_{2} y 2 ml de clorometil-metil-éter. La mezcla se dejó reaccionar durante 2 horas a 60ºC obteniéndose unas superficies de policarbonato clorometilado que, a continuación, fueron lavadas con agua destilada. Las superficies de policarbonato clorometilado se dejaron reaccionar con etilendiamina 2 M (70 ml) durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, fueron lavadas con agua destilada y secadas. Finalmente, se utilizó el test de la ninhidrina para comprobar que la reacción había transcurrido con éxito.

Etapa 2

Tiolización

Los chips de policarbonato funcionalizado con grupos amino (chips de policarbonato aminado) previamente obtenidos en la Etapa 1 (Métodos A y B) fueron sumergidos en una disolución de EDC 5 mM, NHSS 0,33 mM y ácido 11-mercaptoundecanoico 5 mM, en tampón MES 0,1 M, pH 6,5 (100 ml) y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 3 horas. Los chips fueron lavados con primero con agua, después con etanol y finalmente se secaron. La existencia de grupos tiol en los chips tratados fue detectada mediante el test de Ellman's.

Ejemplo 2 Modificación química de una superficie de polimetacrilato (PMMA)

El procedimiento comprende dos etapas, una primera etapa de aminación, que puede llevarse a cabo según dos métodos diferentes (Métodos A y B), y una segunda etapa de tiolización que se llevó a cabo siguiendo dos métodos diferentes (Métodos I y II).

Etapa 1

Aminación

Método A: Tratamiento con organosilano

Los chips de PMMA (es decir, chips cuyas superficies eran de polimetacrilato) se lavaron a fondo con etanol y se secaron. Después, fueron sumergidos en una mezcla de LiAlH_{4} (0,9 g) en ciclohexano anhidro (30 ml) y se dejaron reaccionar toda la noche a temperatura ambiente y bajo atmósfera seca. El exceso de LiAlH_{4} fue hidrolizado cuidadosamente con metanol y los chips se lavaron con HCl (10%), agua y etanol, y se secaron bajo corriente de aire. Para la incorporación del organosilano, los chips fueron sumergidos en una disolución de (3-aminopropil)-trietoxi-silano en 2-propanol y se dejaron en ultrasonidos (Ultrasons Selecta) durante 1 hora. Después, fueron lavados a fondo con etanol/agua y secados. Para confirmar la presencia de grupos amino en las superficies de PMMA se empleó el test de la ninhidrina.

Método B: Ataque amiduro

En un matraz y bajo atmósfera de argon, se añadieron 3 ml de butil litio 2 M en ciclohexano. La disolución fue enfriada a 0ºC y se añadieron 1,2 ml de etilendiamina I cuidadosamente. La mezcla se dejó durante 3 horas a 0ºC. A continuación, se añadieron 20 ml de ciclohexano y los chips de PMMA, previamente lavados con etanol y secados a fondo, dejándose reaccionar durante 20 minutos. Posteriormente, la mezcla se vertió sobre agua y los chips se lavaron con agua/etanol y se secaron. La presencia de grupos amino se confirmó mediante el test de la ninhidrina.

Etapa 2

Tiolización

Método I: Tratamiento con organosilano

Los chips de PMMA se lavaron a fondo con etanol y se secaron. Después, fueron sumergidos en una mezcla de LiAlH_{4} (0,9 g) en ciclohexano anhidro (30 ml) y se dejaron reaccionar toda la noche a temperatura ambiente y bajo atmósfera seca. El exceso de LiAlH_{4} fue hidrolizado cuidadosamente con metanol y los chips se lavaron con HCl (10%), agua y etanol, y se secaron bajo corriente de aire. Para la incorporación del organosilano, y con la finalidad de obtener superficies de PMMA modificadas mediante grupos tiol, los chips fueron sumergidos en una disolución de (3-mercaptopropil)-trimetoxisilano 10% en propanol y se dejaron en ultrasonidos (Ultrasons Selecta) durante 1 hora. Después, fueron lavados a fondo con etanol/agua y secados. Para confirmar la presencia de grupos tiol en las superficies de PMMA modificadas se empleó el test de Ellman's.

Método II: Acoplamiento con ácido 11-mercaptoundecanoico

Siguiendo el mismo procedimiento descrito para la tiolización del policarbonato aminado (Ejemplo 1, Etapa 2), los chips de PMMA modificado con grupos amino previamente obtenidos (Ejemplo 2, Etapa 1, Métodos A o B) fueron sumergidos en una disolución acuosa que contenía EDC 5 mM, NHSS 0,33 mM y ácido 11-mercaptoundecanoico 5 mM, en tampón MES 0,1 M, pH 6,5. Se dejaron en ultrasonidos durante 3 horas, y, después, se lavaron y secaron. La presencia de grupos tiol libres fue detectada mediante el test de Ellman's.

Ejemplo 3 Generación de grupos aldehído en superficies de policarbonato (PC) y de polimetacrilato (PMMA) mediante entrecruzamiento con glutaraldehído

A partir de los chips de PC y PMMA aminados (es decir, funcionalizados con grupos amino) obtenidos en el Ejemplo 1 (Etapa 1) y en el Ejemplo 2 (Etapa 1), se generaron grupos aldehído tal y como se describe a continuación. Los chips fueron sumergidos en una solución acuosa de glutaraldehído (5% PBS 0,1 M, pH 6,5) y trimetilaminoborano 5% (TMAB), y se dejaron en ultrasonidos durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, fueron lavados a fondo con etanol y secados. Para confirmar la existencia de grupos aldehído se usaron tanto el test de Tollen's como el del anisaldehído. Las superficies así preparadas se emplearon posteriormente en la elaboración de matrices de ADN (DNA arrays).

Ejemplo 4 Modificación de superficies sobre CDs de oro

La modificación de superficies sobre CDs de oro se llevó a cabo mediante un procedimiento que compren de la activación de las superficies y la reducción del grupo ácido.

Etapa 1

Activación de las superficies con ácido mercaptoundecanoico

Para la realización de esta etapa, los CDs de oro fueron activados por inmersión en HNO_{3} concentrado, y, posteriormente lavados con agua y secados bajo corriente de aire. A continuación, los CDs de oro fueron sumergidos en una disolución de ácido 11-mercaptoundecanoico 1 mM en etanol y se dejaron durante 24 horas a temperatura ambiente.

Se procedió de igual modo con placas de PC, sobre las que fue electrodepositada una capa de oro de distinto grosor, en función del tiempo de exposición al oro, que varió en un intervalo de tiempo comprendido entre 30 y 180 s. En todos los casos, la formación de la monocapa de oro fue comprobada por voltamperometría cíclica.

Etapa 2

Reducción del grupo ácido

Las placas obtenidas en la Etapa 1 anterior fueron sumergidas en una disolución de EDC 5 mM y NHSS 0,33 mM en tampón MES 0,1 M, pH 6,5, y se dejaron en ultrasonidos a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, se lavaron a fondo con agua y se secaron.

Ejemplo 5 Inmovilización de oligonucleótidos

Se inmovilizaron oligonucleótidos con grupos amino terminales y oligo-nucleótidos con grupos tiol terminales según los procedimientos que se describen a continuación. La inmovilización de los oligonucleótido se detectó, en ambos casos, mediante un escaner de fluorescencia.

Inmovilización de oligonucleótidos A) Oligonucleótidos con grupos amino terminales

Se prepararon disoluciones de oligonucleótidos marcados con el grupo Cy5 (1 y 10 \muM) empleando diferentes tipos de disolventes: 1x SSC pH 7, 10x SSC pH 7, 1x TC pH 9,6, 10x TC pH 9,6, 1x PBS pH 11 y 10xPBS pH 11. A continuación, se imprimieron por contacto matrices 3x3 con cada una de dichas disoluciones previamente preparadas. Las matrices se dejaron incubar en cámara húmeda a 42ºC durante 2 horas, o bien durante 4 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, fueron sumergidas en una disolución de NaBH_{4} 5% en PBS/EtOH 75/25, pH 6,5, y se dejaron en ultrasonidos durante 10 minutos. Finalmente, las matrices fueron lavadas a fondo con agua y secadas.

\newpage

Las superficies de las matrices ensayadas fueron las siguientes:

-: superficie de PC aminado (Ejemplo 1, Etapa 1, Método A) y tratado con glutaraldehído (Ejemplo 3); y

-: superficie de PMMA aminado por tratamiento con organosilano (Ejemplo 2, Etapa 1, Método A) y tratado con glutaraldehído (Ejemplo 3).

Como controles se emplearon placas sin derivatizar y oligonucleótidos sin funcionalizar.

B) Oligonucleótidos con grupo tiol terminal

La unión del grupo tiol terminal de los oligonucleótidos a las superficies tioladas fue llevada a cabo a través de una capa de mercaptosilano y mediante la reacción de intercambio tiol/disulfuro. Los oligonucleótidos marcados con el grupo Cy5 fueron diluidos a 1 \muM en tampón carbonato 0,1 M pH 9, PBS 1x pH 8, PBS-T 1x pH 8 y 1x SSC pH 4,5. A continuación, se imprimieron por contacto matrices 3x3 con cada una de dichas disoluciones previamente preparadas. Las matrices se dejaron incubar durante 2 horas a temperatura ambiente y posteriormente se lavaron con PBS-T 1x pH 7,5 y se secaron.

Las superficies de las matrices ensayadas fueron las siguientes:

-: superficie de PC modificado con grupos tiol (Ejemplo 1, Etapa 2); y

-: superficie de PMMA modificado con grupos tiol por tratamiento con organosilano (Ejemplo 2, Etapa 2, Método I) y tratado con glutaraldehido (Ejemplo 3).

Detección de la inmovilización de oligonucleótidos

La inmovilización de los oligonucleótidos, en ambos casos, se detectó mediante un escaner de fluorescencia Genepix 4000B, de Axon Instruments (Union City, CA, USA) a \lambda_{exc} 635 nm y \lambda_{em} 670 nm.

En todos los casos se comprobó que la inmovilización covalente de los oligonucleótidos a las matrices (placas) tratadas según el procedimiento de la invención proporcionaba mayor intensidad de fluorescencia y mejor relación señal/ruido que los oligonucleótidos anclados a las placas mediante interacciones inespecíficas (muestras control).

Estos estudios de inmovilización pusieron de manifiesto que las superficies poliméricas tratadas empleadas proporcionan un mejor resultado con respecto a otras superficies (e.g., superficies de vidrio que constituyen las placas). El empleo de superficies de PC y PMMA, opcionalmente metalizadas, pone de manifiesto la posibilidad de aplicar las metodologías de derivatización e inmovilización de biomoléculas sobre discos compactos, ya que son esos polímeros los principales constituyentes de los CDs comerciales.

Al comparar los procedimientos de modificación superficial de la presente invención con otros métodos de recubrimiento como avidina o polilisina, se observa que presentan la ventaja de ofrecer un tipo de unión mucho más fuerte, que resiste mejor los lavados y es más perdurable en el tiempo, sustituyendo las interacciones electrostáticas así como las interacciones hidrófilas/hidrófobas por enlaces de tipo covalente, en la mayoría de los casos irreversibles.

Claims

1. Un procedimiento para la modificación química de una superficie polimérica, opcionalmente metalizada, seleccionada entre (i) una superficie de policarbonato (PC) funcionalizada con grupos amino primarios o con moléculas que comprenden grupos amino primarios terminales, (ii) una superficie de polimetacrilato (PMMA) funcionalizada con moléculas que comprenden grupos amino primarios terminales, (iii) una superficie de PC recubierta con una capa metálica, y (iv) una superficie de PMMA recubierta con una capa metálica, que comprende hacer reaccionar dicha superficie polimérica, opcionalmente metalizada, con un ácido mercaptoalcanoico de fórmula (I)

(I)HS-(CH_{2})_{n} COOH

donde n es un número entero comprendido entre 3 y 11;

sus sales y derivados;

y donde la superficie de PC es funcionalizada mediante una de las reacciones seleccionadas entre

-: nitración de los anillos aromáticos que constituyen la estructura del PC y reducción de los grupos nitro introducidos en la etapa anterior de nitración para obtener los grupos amino referidos; y

-: clorometilación de los anillos aromáticos que componen la estructura del PC y sustitución nucleófila de los grupos cloruro presentes tras la etapa anterior de clorometilación por reacción con una diamina alifática.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el tratamiento con el ácido mercaptoalcanoico se lleva a cabo en presencia de un agente de acoplamiento.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho agente de acoplamiento se selecciona entre

: 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida(EDC)/N-hidroxisuccinimida (NHS);

: EDC/sulfa-N-hidroxisuccinimida (NHSS); y

: Diciclohexilcarbodiimida (DDC)/NHS.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho ácido mercaptoalcanoico se selecciona entre ácido 3-mercaptopropiónico y ácido 11-mercaptoundecanoico.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la nitración de los anillos aromáticos se lleva a cabo con ácido nítrico.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la reducción de los grupos nitro se lleva a cabo con un agente reductor seleccionado entre NaBH_{4}, TMAB, BH_{3}-THF, Red-Al, DIBAH y LiAlH_{4}.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la clorometilación de dichos anillos aromáticos se lleva a cabo con un agente clorometilante.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho agente clorometilante se selecciona entre clorometil metil éter/cloruro de zinc, clorometil metil éter/SnCl_{4}, clorometil metil éter/H_{2}SO_{4}, firmante, clorometil metil éter/TiCl_{4}, paraformaldehído/ZnCl/HCl, cloruro de metoxi-acetilo/AlCl_{3} y cloruro de metoxiacetilo/SnCl_{4}.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha diamina alifática se selecciona entre etilendiamina y propilendiamina y hexaetilendiamina.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la funcionalización de las superficies de PMMA con moléculas que contienen grupos amino primarios terminales comprende la aminación de los grupos metil éster del PMMA con una diamina alifática.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha diamina alifática se selecciona entre etilendiamina y propilendiamina y hexaetilendiamina.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el recubrimiento de las superficies de PC o de PMMA con una capa metálica se realiza mediante electrodeposición.

13. Procedimiento según reivindicación 12, en el que dicha capa metálica que recubre las superficies de PC o de PMMA es de oro.

\newpage

14. Un procedimiento para la modificación química de superficies poliméricas de PMMA que comprende someter dicha superficie a tratamiento con un agente reductor, en presencia de ciclohexano como disolvente, para proporcionar grupos alcohol, y posterior tratamiento con un organosilano que comprende un grupo tiol terminal, en disolución alcohólica.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el agente reductor es un hidruro reductor o un reactivo de Grignard.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el dicho agente reductor se selecciona entre hidruro de litio y aluminio, borohidruro de litio y bromuro de metil magnesio.

17. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el dicho organosilano que comprende un grupo tiol terminal es un compuesto de fórmula (II)

(II)HS-(CH_{2})_{m}-Si-(OR)_{3}

donde

R es metilo o etilo; y

M es un número entero comprendido entre 1 y 11.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho organosilano es (3-mercaptopropil)-trimetoxisilano.

19. Un soporte sólido que comprende una superficie de PC o una superficie de PMMA, opcionalmente metalizada, modificada químicamente según un procedimiento como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

20. Soporte según la reivindicación 19, configurado en la forma de un chip de PC, o de PMMA, opcionalmente metalizados, un disco compacto de audio, un disco compato de video, un disco compacto de audio-video, un disco grabable o un disco regrabable del tipo CD, CD-ROM, CR o DVD.

21. Soporte según la reivindicación 19 ó 20 que comprende, al menos, una biomolécula inmovilizada sobre dicho soporte.

22. Soporte según la reivindicación 21, en el que dicha biomolécula es un ácido nucleico, una proteína, una sustancia que puede ser utilizada en reconocimiento molecular, una membrana o un fragmento celular.

23. Soporte según la reivindicación 22, en el que dicha biomolécula es un ácido nucleico, una proteína, un anticuerpo, un receptor molecular, una enzima, un hidrato de carbono, una membrana celular o un fragmento celular.

24. Soporte según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, que comprende una pluralidad de biomoléculas inmovilizadas sobre dicho soporte.

25. Soporte según la reivindicación 24, en el que dicha pluralidad de biomoléculas están inmovilizadas sobre dicho soporte en un orden y en una disposición establecida.

26. Un procedimiento para la inmovilización de biomoléculas que comprende poner en contacto un soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, con las biomoléculas a inmovilizar bajo condiciones que permiten la inmovilización de dichas biomoléculas sobre dicho soporte.